特許 6281837 グリオキサラーゼＩ阻害剤及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6281837

(24)【登録日】2018年2月2日

(45)【発行日】2018年2月21日

(54)【発明の名称】グリオキサラーゼＩ阻害剤及びその利用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/35 20060101AFI20180208BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180208BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180208BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20180208BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20180208BHJP

   C07D 493/04 20060101ALN20180208BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/35

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

   !C07D493/04 106D

【請求項の数】10

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2013-221340(P2013-221340)

(22)【出願日】2013年10月24日

(65)【公開番号】特開2015-81251(P2015-81251A)

(43)【公開日】2015年4月27日

【審査請求日】2016年8月4日

(73)【特許権者】

【識別番号】599002043

【氏名又は名称】学校法人 名城大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000110

【氏名又は名称】特許業務法人快友国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】金田 典雄

(72)【発明者】

【氏名】田中 齊

【審査官】 馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１３−１５９６００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 第１３３回日本薬学会要旨集，２０１３年 ３月２７日，p.112

【文献】 Journal of ETHNOPHARMACOLOGY，１９９４年 １月，Vol.41, No.1-2，p.71-76

【文献】 Planta Medica，２０１２年 ８月，Vol.78, No.12，p.1357-1362，（送付文献はAuthor Manuscriptのp.1-16）

【文献】 Archives of Pharmacal research，２０１０年，Vol.33, No.8，p.1159-1163

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／３５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

Ｃ０７Ｄ ４９３／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ

／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式（１）で表される化合物のみを有効成分として含有する、グリオキサラーゼＩ阻害剤。

【化10】

（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【請求項2】

Ｒ₁〜Ｒ₈、Ｒ₁₀、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は水素原子を表し、Ｒ₉及びＲ₁₁はメチル基を表す、請求項１に記載のグリオキサラーゼＩ阻害剤。

【請求項3】

以下の式（１）で表される化合物のみを有効成分として含む抗腫瘍剤。

【化11】

（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【請求項4】

Ｒ₁〜Ｒ₈、Ｒ₁₀、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は水素原子を表し、Ｒ₉及びＲ₁₁はメチル基を表す、請求項３に記載の抗腫瘍剤。

【請求項5】

以下の式（１）で表される化合物及びその誘導体から選択される被験化合物のグリオキサラーゼＩ害活性を評価する工程、を備える、グリオキサラーゼＩ阻害剤のスクリーニング方法。

【化12】

（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【請求項6】

以下の式（１）で表される化合物及びその誘導体から選択される被験化合物のグリオキサラーゼＩ害活性を評価する工程、を備える、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。

【化13】

（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【請求項7】

さらに、グリオキサラーゼＩ阻害活性を有することが肯定された前記被験化合物についてガン細胞に対する抗増殖活性を評価する工程、を備える、請求項６に記載のスクリーニング方法。

【請求項8】

さらに、グリオキサラーゼＩ阻害活性と抗増殖活性を有することが肯定された前記被験化合物について、当該被験化合物の存在下において前記ガン細胞の分泌するメチルグリオキサール量を評価する工程、を備える、請求項７に記載のスクリーニング方法。

【請求項9】

グリオキサラーゼ活性阻害剤の製造方法であって、
Erythrina poeppingianaに属する植物体又はその一部を原料とする抽出物から、以下の式（１）で表される化合物を分離する工程、
を備える、方法。

【化14】

（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【請求項10】

抗腫瘍剤の製造方法であって、
Erythrina poeppingianaに属する植物体又はその一部を原料とする抽出物から、以下の式（１）で表される化合物を分離する工程、
を備える、方法。

【化15】

（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書の開示は、グリオキサラーゼＩ阻害剤及びその利用に関する。

【背景技術】

【0002】

抗腫瘍活性を示す化合物として、例えば、グリオキサラーゼＩ阻害活性を有する、フラボン化合物が知られている（特許文献１、２）。グリオキサラーゼＩ（GLO I：Glyoxalase I）は、細胞内の嫌気的糖代謝過程で生じるメチルグリオキサール（MG：methylglyoxal）とグルタチオン（GSH：glutathione）からS-D-ラクトイルグルタチオン（S-D-lactoylglutathione）を生成させる酵素である。MGは解糖系の代謝副産物であるが、蓄積することでタンパク質、DNA、RNA等を非可逆的に修飾し、細胞死（アポトーシス）を誘発することが知られている。すなわち、ＭＧは細胞死誘導活性を有していると考えられている。

【0003】

ガン細胞内は、一般に嫌気的環境であるため、エネルギー産生は嫌気的な解糖系に依存しており、このためＭＧが生成する。そして、ガン細胞では、こうして生成したＭＧを解毒するためのＧＬＯＩの発現が亢進している。正常細胞においてはＧＬＯＩ活性が低いため、ＧＬＯＩ阻害剤は、ガン細胞に特異的に作用して、ガン細胞におけるＭＧの蓄積を促進し、ガン細胞のアポトーシスを誘導することが期待される。（特許文献２）

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１１−２１９３８４号公報

【特許文献2】特開２０１３−１６９６００号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

特許文献１、２に開示されるフラボン化合物は、フラボノイドの一種である。フラボノイドは、広く植物界に分布するフェニルクロマン環に近い構造のＣ6−Ｃ3−Ｃ6炭素骨格からなる化合物であり、フラボン、イソフラボン、フラバノール等を始めとする多種多様な骨格及び置換様式を包含している。このため、フラボノイドの有する構造とＧＬＯＩ活性の相関は全く知られておらず、予測することも困難であった。

【0006】

そこで、本明細書の開示は、新たなＧＬＯＩ阻害剤及びその利用を提供することを一つの目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、植物、特にマメ科植物に由来するイソフラボン化合物を対象として、ＧＬＯＩ阻害活性を指標とするスクリーニングを始めとする各種の検討を行ったところ、細胞内においてＧＬＯＩ阻害活性を有するイソフラボン化合物（以下、エリポエギンＫともいう。）を見出した。本明細書の開示は、これらの知見に基づいて提供される。

【0008】

本明細書の開示によれば、以下の式（１）で表される化合物及びこれらの薬学的に許容される塩から選択される１種以上を含むＧＬＯＩ阻害剤が提供される。

【化1】

（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【0009】

また、本明細書の開示によれば、以下の式（１）で表される化合物及びその薬学的に許容される塩から選択される１種以上を含む抗腫瘍剤が提供される。

【化2】

（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【0010】

本明細書の開示によれば、上記グリオキサラーゼＩ阻害剤を有効成分として含有する、医薬組成物が提供される。

【0011】

本明細書の開示によれば、イソフラボノイド骨格を有する化合物である被験化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程、を備える、グリオキサラーゼ阻害剤のスクリーニング方法が提供される。

【0012】

本明細書の開示によれば、イソフラボノイド骨格を有する被験化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程、
を備える、抗腫瘍剤のスクリーニング方法が提供される。

【0013】

本明細書の開示によれば、以下の式（１）で表される被験化合物及びその誘導体から選択される１種以上のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を、備える、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。

【化3】

（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】エリポエギンＫとエリスリニンＣとの溶出を示すクロマトグラムを示す図である。

【図2】ＨＬ−６０培養細胞に対するエリポエギンＫ、エリスリニンＣ及びＢＢＧＣ（コントロール）の抗増殖活性を示す図である。

【図3】ＨＬ−６０培養細胞上清中のＭＧ量の測定結果を示す図である。

【図4】エリポエギンＫによるＨＬ−６０細胞におけるカスパーゼ−３活性化を示す図である。

【図5】カスパーゼ−３阻害剤を添加した際のＨＬ−６０細胞に対するエリポエギンＫの抗細胞増殖活性を示す図である。

【図6】エリポエギンＫの正常リンパ球及びＨＬ−６０細胞の生存率に及ぼす影響を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本明細書の開示は、フラボノイドと総称される化合物群に包含されるイソフラボン骨格を有する化合物（以下、イソフラボン化合物という。）又はその薬学的に許容される塩を含有するＧＬＯＩ阻害剤及びその利用に関する。

【0016】

本明細書に開示されるある種のイソフラボン化合物（以下、本イソフラボン化合物という。）は、ＧＬＯＩ阻害活性を示すことができる。また、本イソフラボン化合物は、好ましくは、ガン細胞に対してＧＬＯＩ阻害活性に基づく抗増殖活性も示すことができる。ＧＬＯＩは正常細胞ではほとんど発現されていないのに対してガン細胞での過剰発現が認められることから、ＧＬＯＩ阻害剤は、ガン細胞に対して高い選択性で作用し細胞死を誘導することができる。

【0017】

以下、本イソフラボン化合物を含むＧＬＯＩ阻害剤、抗腫瘍剤及び医薬組成物並びにＧＬＯＩ阻害剤のスクリーニング方法等について説明する。

【0018】

（ＧＬＯＩ阻害剤）
本イソフラボン化合物は、以下の式（１）で表される。

【化4】

【0019】

式（１）において、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表すことができる。

【0020】

置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。こうしたアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、sec-ブチル基、tert−ブチル基、２，２−ジメトキシエチル基等が挙げられる。好ましくは、エチル基及びプロピル基であり、より好ましくはメチル基及びエチル基であり、さらに好ましくはメチル基である。置換基としては、水酸基、ヒドロキシアルキル基、アルキルエーテル基、アルキルカルボニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、ニトリル基、ハロゲン原子が挙げられる。これら置換基におけるアルキル基は、炭素数１〜４であることが好ましく、より好ましくはメチル基である。

【0021】

式（１）において、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉、Ｒ₁₁、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、これら１１個の置換基のうち、水素原子が５個以上であってもよく、６個以上であってもよく、７個以上であってもよく、８個以上であってもよく、９個以上であってもよく、全てが水素原子であってもよい。Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、これら９個の置換基のうち、水素原子が５個以上であってもよく、６個以上であってもよく、７個以上であってもよく、全てが水素原子であってもよい。

【0022】

また、式（１）において、Ｒ₁〜Ｒ₈、Ｒ₁₀、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、これら１２個の置換基のうち、メチル基が２個以上であってもよく、３個以上であってもよく、４個以上であってもよく、５個以上であってもよく、６個以上であってもよい。また、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は、これら９個の置換基のうち、水酸基が２個以上であってもよく、３個以上であってもよく、４個以上であってもよく、５個以上であってもよく、６個以上であってもよい。

【0023】

式（１）において、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表すことができる。置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基については既に説明したとおりである。Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、これら３つの置換基のうち、上記アルキル基が１個以上であってもよく、２個以上であってもよく、全てが上記アルキル基であってもよい。また、Ｒ₃、Ｒ₆及びＲ₁₀は、これら３つの置換基のうち、水素原子を１個以上３個以下とすることができる。

【0024】

式（１）において、Ｒ₁〜Ｒ₈、Ｒ₁₀、Ｒ₁₂、Ｒ₁₃及びＲ₁₄は水素原子を表し、Ｒ₉及びＲ₁₁はメチル基である化合物は、以下の式（２）で表される。この化合物は、マメ科植物である Erythrina poeppingianaに属する植物の樹皮に存在する天然のイソフラボン化合物であり、以下、Erypoegin (エリポエギン)Kと称する。本イソフラボン化合物はこの天然のイソフラボン化合物エリポエギンＫを含み、エリポエギンＫの構造において、その水素原子部位の水酸基や炭素数１〜４のアルキル基等による置換によって一定範囲内で調節された化合物を包含している。

【0025】

【化5】

【0026】

本イソフラボン化合物は、Erythrina poeppingiana に属する植物の樹皮から取得する式（２）で表される化合物として得られるほか、当該化合物以外の態様は、当該化合物を有機合成的によりあるいは酵素的に適宜修飾して得ることができる。本イソフラボン化合物は、また、全合成によりあるいは天然由来の他の化合物を出発原料として半合成により取得することができる。

【0027】

例えば、式（２）で表される化合物を、Erythrina poeppingiana に属する植物の樹皮から得るには、以下の方法を採用できる。前記樹皮を細切し、アセトンにて冷浸し、その後、溶媒を減圧留去し油状物を得る。この油状物を、例えば、n−ヘキサンの疎水性溶媒で洗浄後、ジクロロメタン等の疎水性溶媒と水とで分配し、疎水性溶媒相を減圧留去して残渣を得る。この残渣を、クロロホルム−アセトン（1→10:1）等を用いシリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば、シリカゲル500g, 10 x 13 cm）に付し、各フラクションを取得する。式（２）で表される化合物が含まれている可能性が高いことが推測されるフラクションをベンゼン−酢酸エチル (5:1) 等にて、繰り返しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば、シリカゲル150g, 4.5 x 24 cmを使用後にシリカゲル10g, 1.0 x 27cmに付す。）により精製する。さらに、ことにより、式（２）で表される化合物を含むフラクションを得ることができる。

【0028】

さらに、このフラクションを逆相ＨＰＬＣで分取することで式（２）で表される化合物を精製することができる。逆相ＨＰＬＣとしては、例えば、逆相ＨＰＬＣカラムとして汎用されるＯＤＳカラムを用い、移動相としては、水：アセトニトリル＝６０〜７０：４０〜３０（体積比）を用いることができる。より具体的には、以下の条件を採用できる。条件Ａは、分離に好適であり、条件Ｂは分取に好適である。

【0029】

Column：STR ODS-II 4.6 ×150 mm (Shinwa Chemical 社)×2本連結
Controller：LC-9A (Shimadzu 社)
Detector：SPD-10A (254nm; Shimadzu 社)
Mobile phase：35% acetonitrile＋65% H₂O
Flow rate：1.0 mL/min
Sample volume：10~100 μL

【0030】

Column：Develosil ODS-10 20 ×250 mm (Nomura Chemical 社)
Controller：LC-9A (Shimadzu 社)
Detector：SPD-10A (254nm; Shimadzu 社)
Mobile phase：30% acetonitrile＋70% H₂O
Flow rate：6.0 mL/min
Sample volume：250 μL

【0031】

本化合物の薬学的に許容される塩は、例えば薬学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。

【0032】

薬学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、薬学的に許容される金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、薬学的に許容されるアンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、薬学的に許容される有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、薬学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。

【0033】

本化合物のＧＬＯＩ阻害活性は、公知の方法で測定することができるほか、後述の実施例に開示される方法で測定することができる。本化合物のＧＬＯＩ阻害活性は、少なくともin vitroにおいて、通常程度に精製されたＧＬＯＩに対する阻害活性を意味している。その活性程度は特に限定しないが、後述する実施例に準じて得られるＩＣ₅₀は、既知のＧＬＯＩ阻害剤であるＳ−ｐ−ブロモ−ベンジルグルタチオン（ＢＢＧ）（式（３）においてＲ＝Ｈである）の５０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上である。

【0034】

【化6】

【0035】

また、本イソフラボン化合物のＧＬＯＩ阻害活性は、さらに、ガン細胞の抗増殖活性を意味していてもよい。ガン細胞の抗増殖活性は、公知の方法を用いて評価できるほか、後述する実施例に準じてヒト白血病細胞株ＨＬ−６０に対する抗増殖活性として評価できる。この方法における抗増殖活性は、ＩＣ₅₀が好ましくは２０μＭ以下、より好ましくは１５μＭ以下、さらに好ましくは１０μＭ以下、一層好ましくは５μＭ以下、より一層好ましくは３μＭ以下である。

【0036】

本化合物は、ＧＬＯＩ阻害剤として使用できるほか、アポトーシス誘導剤（特にガン細胞の）や抗腫瘍剤としても用いることができる。特に、本化合物がＧＬＯＩ阻害活性の一態様としてガン細胞のアポトーシスを誘導し、抗増殖活性を有するときには抗腫瘍剤として有用である。

【0037】

本明細書に開示される抗腫瘍剤及び医薬組成物は、有効成分である本イソフラボン化合物のほか、賦形剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、稀釈剤、担体、溶解助剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤、コーティング剤などの添加成分や水などを含むものであってもよい。

【0038】

本明細書に開示される抗腫瘍剤及び医薬組成物は、経口投与、非経口投与いずれの投与方法をも採用することができ、それぞれに適した医薬製剤の形態とすることができる。医薬製剤としては、例えば、液剤、シロップ剤、注射剤、液状吸入剤、乳剤等の液状剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、軟膏剤、固形吸入剤、座剤等の固形剤などを挙げることができる。

【0039】

本明細書に開示される抗腫瘍剤及び医薬組成物における本イソフラボン化合物の含有量は、用途、剤型、配合目的等によって異なるが、一般的には、組成物全量中１〜１００質量％が好ましく、より好ましくは１０〜５０質量％である。

【0040】

本発明の抗腫瘍剤及び医薬組成物本発明の医薬組成物等の投与量は、投与対象者の年齢、体重、投与方法などに応じて適宜決めればよい。例えば、通常成人１日、体重１ｋｇあたり、本イソフラボン化合物０．００１ｍｇ以上１００ｍｇ以下、好ましくは、０．０１ｍｇ以上１０ｍｇ以下を１日１回又は数回に分けて投与することができる。

【0041】

（スクリーニング方法）
本明細書に開示されるＧＬＯＩ阻害剤のスクリーニング方法は、イソフラボン化合物である被験化合物のＧＬＯＩ阻害活性を評価する工程、を備えることができる。このスクリーニング方法によれば、イソフラボノイド骨格を有するイソフラボン化合物から有用なＧＬＯＩ活性阻害剤をスクリーニングできる。また、抗腫瘍剤のシード化合物をスクリーニングできる。なお、イソフラボン化合物は、天然由来の化合物のほか、合成によって取得されたものでもよい。天然由来の化合物は、マメ科植物を取得源とすることができる。取得源植物は、好ましくはErythrina variegata、Erythrina suberosa、Erythrina poeppigiana、Erythrina x bidwilliiなどのErythrina属植物であり、より好ましくはErythrina poeppingiana である。

【0042】

ＧＬＯＩ阻害活性は、公知の方法のほか、後述する実施例において開示する方法を採用して評価することができる。この評価工程において、ＧＬＯＩ阻害活性は、例えば、コントロールとしてのＢＢＧのＧＬＯＩ阻害活性と対比することで評価することができる。典型的には、ＢＢＧの５０％以上、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上のＧＬＯＩ阻害活性があれば、ＧＬＯＩ阻害活性を有すると肯定的に評価できる。

【0043】

本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、イソフラボン化合物である被験化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を備えることができる。ＧＬＯＩ阻害活性は、ＧＬＯＩ阻害活性に基づく抗腫瘍剤の基本的な活性である。このため、当該評価工程によれば、抗腫瘍剤として可能性のあるイソフラボン化合物（シード化合物）を広くかつ容易にスクリーニングできる。なお、本スクリーニング方法におけるＧＬＯＩ阻害活性は、ＧＬＯＩ阻害活性の評価工程と同様の態様で実施することができる。

【0044】

本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、さらに、ＧＬＯＩ阻害活性を有することが肯定された被験化合物についてガン細胞に対する抗増殖活性を評価する工程を備えることができる。こうした評価工程を備えることで、より実用的な抗腫瘍剤又はそのシード化合物をスクリーニングすることができる。ガン細胞の抗増殖活性は、例えば、ガン細胞に対して被験化合物を供給し、一定時間培養後の生細胞又は死細胞に関する指標を測定することによって行う。より詳細には、被験化合物の添加濃度を異ならせてＩＣ₅₀を測定してもよい。この評価工程において、被験化合物のガン細胞の抗増殖活性を確認できる場合には、抗増殖活性を有すると肯定的に評価できる。

【0045】

なお、本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、ＧＬＯＩ阻害活性とガン細胞抗増殖活性を有すると肯定された被験化合物について、当該被験化合物の存在下において前記ガン細胞の分泌するＭＧ量を評価する工程と、を備えることもできる。ＭＧ量評価工程を備えることで、ガン細胞におけるＧＬＯＩ阻害によってガン細胞の増殖が阻害されていることを確認できる。ＭＧ量の評価は、この種の化合物に対するＨＰＬＣなど公知の方法を採用することができる。例えば、ガン細胞の培養液に対してｏ−フェニレンジアミンを加えてＭＧを２−メチルキノキサリンに変換後、ＨＰＬＣに負荷して検出波長３１５ｎｍで検出することができる。

【0046】

本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、式（１）で表される化合物（本イソフラボン化合物）及びその誘導体である被験化合物から選択される１種以上のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を、備えることができる。このスクリーニング方法によれば、式（１）で表される被験化合物及びその誘導体からシード化合物としてより有用な抗腫瘍剤（リード化合物）をスクリーニングできる。本スクリーニング方法は、既に記載した抗腫瘍剤のスクリーニング方法における各種態様を適用することができる。本イソフラボン化合物の誘導体の範囲は特に限定しないが、例えば、式（１）における各種Ｒにつき、式（１）で規定される以外の置換基への修飾を含むことができる。

【0047】

（ＧＬＯＩ活性阻害剤、抗腫瘍剤の製造方法）
本明細書に開示されるＧＬＯＩ活性阻害剤又は抗腫瘍剤の製造方法は、Erythrina poeppingianaに属する植物体又はその一部を原料とし、式（１）で表される化合物を分離する工程、を備えることができる。この製造方法によれば、植物体を原料として効率的に式（１）で表される化合物又はその原料を得ることができる。

【0048】

前記植物体は、好ましくは、数ミリ程度の細片として原料とすることが好ましい。また、その部位は、樹皮であることが好ましい。式（１）で表される化合物の抽出分離は、当業者であれば適宜実施できるが、例えば、既述したように、アセトンにて冷浸後、溶媒を減圧留去して得た油状物から脂質を除去し、一般的な溶媒分配手法を用いて非極性化合物分画を得た後、シリカなどの極性充填材を用い疎水性移動相を用いる液体クロマトグラフィーを用いて当該分画をさらに分離分画する。さらに、式（２）で表される化合物が含まれている可能性が高いことが推測されるフラクションを繰り返し逆相カラムクロマトグラフィーにより精製することにより、式（２）で表される化合物を得ることができる。

【実施例】

【0049】

以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0050】

（阻害剤候補化合物の取得）
Erythrina poeppingianaの樹皮(8.88 Kg)を細切し、アセトン３６Ｌにて浸漬して軟化し、アセトンを減圧留去し油状物(133.7 g)を得た。この油状物をn−ヘキサン溶解分画、ジクロロエタン溶解分画及び酢酸エチル溶解分解に分配した。ジクロロエタン溶解分画を、移動相としてジクロロエタン・アセトン混液（４０：１、１０：１、１：１）、アセトン及びクロロホルム・メタノール混液（１０：１、１：１）（各５００ｍｌ）で用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０×４４ｃｍ、１．７ｋｇ）にかけて溶出させて３６個のフラクションに分画した（Ａ１〜Ａ３６）。

【0051】

フラクションＡ２８（２７．７ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０×４４ｃｍ、５５０ｇ）にかけてクロロホルム・アセトン混液（１０：１．５、３：１）（各２００ｍｌ）で溶出して、４２個のフラクション（Ｂ１〜Ｂ４２）を得た。

【0052】

フラクションＢ１４〜２１（２．７３ｇ）をシリカゲルクロマトグラフィー（３×２８ｃｍ、８０ｇ）にかけてベンゼン・酢酸エチル混液（５：１）で溶出して２６個のフラクション（Ｃ１〜２６）を得た。

【0053】

フラクションＣ２３及びＣ２４（２５０ｍｇ）を混合して、エリスリニンＣを得るために酢酸エチルから結晶化して粗精製物を得た。当該粗精製物には、少なくともエリスリニンＣを含んでいた。当該粗精製物（乾固物）をDMSOで400倍希釈し、これを以下に示す条件による分析用逆相HPLCにて分析した。

【0054】

〈 測定条件 〉
Column：STR ODS-II 4.6 ×150 mm (Shinwa Chemical 社)×2本連結
Controller：LC-9A (Shimadzu 社)
Detector：SPD-10A (254nm; Shimadzu 社)
Mobile phase：35% acetonitrile＋65% H₂O
Flow rate：1.0 mL/min
Sample volume：10~100 μL

【0055】

分析用逆相ＨＰＬＣの結果（クロマトグラム）を図１に示す。図１に示すように、クロマトグラム上においてエリスリニンＣ以外のピークが確認された。

【0056】

次いで、得られた粗精製物の固形分（２１．８ｍｇ）を、以下に示す条件で調製用逆相ＨＰＬＣを行い、化合物Ｘ（６．６ｍｇ、保持時間１５３分）及びエリスリニンＣ（１５．９ｍｇ、保持時間１６３分）を得た。各ピークをナス型フラスコを用いて分取した後、ロータリーエバポレーターまたはSpeedVac SDP1010 (Thermo SCIENTIFIC社) を用いて濃縮、乾固した。

【0057】

〈測定条件 〉
Column：Develosil ODS-10 20 ×250 mm (Nomura Chemical 社)
Controller：LC-9A (Shimadzu 社)
Detector：SPD-10A (254nm; Shimadzu 社)
Mobile phase：30% acetonitrile＋70% H₂O
Flow rate：6.0 mL/min
Sample volume：250 μL

【実施例2】

【0058】

本実施例では、実施例１で取得した化合物Ｘは、高分解能電子衝撃質量スペクトル法、ＩＲスペクトル分析、ＮＭＲ分析及びＵＶ分析結果より、Ｃ₂₀Ｈ₁₈Ｏ₆（m./z３５４．１１００［Ｍ］⁺）である5-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-8-(2-hydroxypropan-2-yl)-8,9-dihydro-4H-furo[2,3-h]chromen-4-oneであり、以下の構造式（式（２））を有するエリスリニンＣの異性体であることを確認した。なお、エリスリニンＣの構造式も別途以下に示す。

【0059】

【化7】

【0060】

【化8】

【0061】

すなわち、ＩＲスペクトルでは、共役カルボニル（１６５４ｃｍ^-1）及びヒドロキシ（３４３５ｃｍ^-1）を示した。また、ＵＶスペクトル及びＣ−２（δ_H８．１９及びδ_C１５３．９）に関するＮＭＲスペクトルデータからは、イソフラボン誘導体であることがわかった。Ｈ¹−ＮＭＲスペクトルからは、芳香族プロトン（δH 6.22）と、4-ヒドロキシベンゼン部分上のオルト結合芳香族プロトン（δH 6.91及び7.45）のセットと、水素結合ヒドロキシル基（δH13.24 ）を示し、そのほか、3つの脂肪族プロトン（δH 3.27、3.32および4.87 ）と２−（１-ヒドロキシ１−１−メチルエチル）−２．３−ジヒドロフラン置換体上の2つのメチル基（δH 1.26及び1.30 ）のセットを示した。

【0062】

ジヒドロフラン誘導体の存在は、特性ＭＳによるフラグメントピークm/z 295[M -59 ]⁺とのm / z 59（C-2''とC- 4"との間の開裂）を示す特性MSから支持された（Murray RDH, Sutcliffe M, McCabe PH. Claisen rearrangements-IV Oxidative cyclisation of two coumarin o-isoprenylphenols.Tetrahedron 1971; 27: 4901-4906.）

【0063】

ジヒドロフラン環はC-7位及びC-8位の位置に結合していることが１Ｈ−１３Ｃ相関観測（ＨＭＢＣ）スペクトラムによるＨ−３''とC- 8''との相関関係から決定された。４−ジヒドロベンゼン環の位置は、ＨＭＢＣ（Ｈ−２'（Ｈ−６'）とＣ−３との相関）及びＮＯＥＳＹ（ｈ−２’（Ｈ−６’）及びＨ−２とのＮＯＥ相関）から決定された。

【0064】

【化9】

【0065】

以下、エリポエギンＫの物性を記載する。
性状：無色の油状物
[a]_D: ± 0 (c 0.10, Me₂CO)
UV (EtOH): λ_max (log ε) 266 (4.37), 203 (4.41) nm
IR (KBr): ν_max 3435, 1654, 1625, 1558, 1541, 1508, 1398, 1255, 1145 cm^-1
1H-NMR (500 MHz, Me₂CO-d₆): δ 1.26 (3H, s, H-6"), 1.30 (3H, s, H-5"), 3.27 (1H, dd, J = 15.4, 9.5 Hz, H-3''), 3.32 (1H, dd, J = 15.4, 8.1 Hz, H-3''), 3.84 (1H, s, 4'-OH or 4"-OH), 4.87 (1H, dd, J = 9.5, 8.1 Hz, H-2''), 6.22 (1H, s, H-6), 6.91 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3', H-5'), 7.45 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2', H-6'), 8.19 (1H, s, H-2), 8.57 (1H, brs, 4'-OH or 4"-OH), 13.24 (1H, s, 5-OH)
¹³C-NMR (125 MHz, Me₂CO-d₆): δ 181.7 (C-4), 167.7 (C-7), 164.3 (C-5), 158.5 (C-4'), 153.9 (C-2), 153.6 (C-9), 131.2 (C-2', C-6'), 124.0 (C-3), 123.0 (C-1'), 115.9 (C-3', C-5'), 106.2 (C-10), 104.8 (C-8), 94.4 (C-6), 92.7 (C-2"), 71.4 (C-4''), 27.1 (C-3''), 26.0 (C-6''), 25.5 (C-5'') EIMS m/z 354 [M]⁺ (69), 321 (51), 295 (100), 268 (16), 59 (20), 44 (26)
HR-EIMS m/z 354.1100 [M]⁺ (calcd. for C₂₀H₁₈O₆: 354.1103)

【実施例3】

【0066】

（ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０に対する抗増殖活性の評価）
本実施例では、実施例１で取得したエリポエギンＫのＨＬ−６０株に対する抗増殖活性を測定した。なお、本実施例では、ＧＬＯＩの既知の阻害剤であるＢＢＧは細胞膜透過性が乏しく、培養液への添加では効果を示さないと考えられるため、細胞膜透過性を増大させるために、ＢＢＧのシクロペンチルエステル体であるＢＢＧＣを用いて培養細胞に対する効果を評価した。ＢＢＧＣは細胞膜透過後、細胞内でエステル基が加水分解され、ＢＢＧに変換されると考えられる。また、コントロールとしてエリスリニンＣも用いた。

【0067】

ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０細胞を９６ウェルプレート上に播種し (１．２×１０⁴ 個、１００μＬ／ｗｅｌｌ）、３７℃にて２４時間培養した。その後、各濃度に調製したエリポエギンＫ、エリスリニンＣ及びＢＢＧＣ（コントロール）を培地に溶かし、８０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４８時間培養した。なお、化合物の溶解、希釈にはＤＭＳＯを用い、ＤＭＳＯ終濃度が０．２〜０．５％となるように薬液を調製した。

【0068】

次いで、薬液処理後の９６ウェルプレート中の細胞培養液に１ｗｅｌｌあたり、ＭＴＳ試薬(CellTiter 96 Aqueous One Solution reagent; Promega社)３０μＬと培地（１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ）１０μＬを加えた溶液４０μＬを添加し、培養条件下にて２．５時間インキュベートした。その後、生成したｆｏｒｍａｚａｎ色素の４９０ｎｍにおける吸光度をマルチラベルカウンター ( Wallac 1420 ARVOsx 、PerkinElmer社) により測定した。ＭＴＳは生細胞中のミトコンドリアに含まれるデヒドロゲナーゼによって還元されることによって褐色のｆｏｒｍａｚａｎを生成するため、４９０ｎｍにおける吸光度は、生細胞数に比例する。結果を図２に示す。

【0069】

図２に示すように、エリポエギンＫは、ＢＢＧＣ及びエリスリニンＣに比較して強力な細胞増殖抑制活性を有することがわかった。ＨＬ−６０細胞の増殖に対するＢＢＧＣ及びエリポエギンＫのＩＣ₅₀の値は、３．７１μＭ、０．３２μＭであった。また、エリスリニンＣは、抗増殖活性をほとんど示さないこともわかった。

【0070】

以上のことから、エリポエギンＫは、既知のＧＬＯＩ阻害剤であるＢＢＧＣに対して非常に高い抗増殖活性を有していることがわかった。このことから、エリポエギンＫは、培養細胞に対する透過性が高い点からも強力な抗増殖活性を有していることが示唆された。

【実施例4】

【0071】

（ＨＬ−６０細胞培養上清中のＭＧ量の評価）
本実施例では、エリポエギンＫの細胞に対する抗増殖活性がＧＬＯＩ阻害作用に基づくものであることを確認するために、培養上清中のＭＧ量を評価した。

【0072】

（阻害剤候補化合物への細胞の暴露）
ＨＬ−６０細胞を６ｃｍディッシュに播種（１．５×１０^６個、５ｍＬ／ｄｉｓｈ）し、３７℃にて２４時間培養後、各濃度に調製したエリポエギンＫとＢＢＧＣ（コントロール）を終濃度１０μＭとなるよう添加し、さらに２４時間培養した。なお、エリポエギンＫの溶解、希釈にはＤＭＳＯを用い、ＤＭＳＯ終濃度が０．２〜０．５％となるように薬液を調製した。

【0073】

（培養上清中のＭＧの測定）
薬液処理後の培養液を回収後、遠心して得た上清をサンプルとして使用した。回収した上清４．５ｍＬに６０％過塩素酸（ＰＣＡ）４５０μＬを加え（終濃度０．４５Ｍ）、１０分間氷上でインキュベートした。その後、遠心（１２０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して得た上清をＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）ＬｉｇｈｔｔＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社）にアプライした。なお、ｔＣ１８カートリッジは前処理としてアセトニトリル６〜８ｍＬで洗浄後、１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ２．５）を６〜８ｍＬ流したものを使用した。この溶出液にＰＢＳに溶解させたｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ＰＤ）および、内部標準としてＱＷに溶解させた５−メチルキノキサリン（５−ＭＱ）をそれぞれ終濃度２５μＭ（１２５ｎｍｏｌ）、および０．５μＭ（２．５ｎｍｏｌ）となるよう添加し、室温で３．５時間反応させた。ｏ−ＰＤは培養液中のＭＧと反応し、２−メチルキノキサリン（２−ＭＱ）を生成するため、２−ＭＱならびに５−ＭＱをＨＰＬＣ／ＵＶ法によって定量した。

【0074】

反応後のサンプルを再度ｔＣ１８カートリッジを用いて、約１〜２ｍＬ／ｍｉｎのスピードでアプライし、ｔＣ１８カートリッジに２−ＭＱおよび５−ＭＱを保持させた。次に、１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ２．５）でｔＣ１８カートリッジを洗浄した後、２ｍＬのアセトニトリルで目的化合物を溶出した。この溶出液を約１００μＬ程度まで濃縮し(SpeedVacSPD1010；ThermoFisherSCIENTIFIC社)、ＰＶＤＦメンブレンフィルター(0.45μm;MILLIPORE社)でろ過した後、以下の条件でＨＰＬＣ／ＵＶ法によって定量した。結果を図３に示す。

【0075】

〈測定条件〉
Column：Develosil C30-UG-5 4.6 mm i.d.×150 mm
(Nomura Chemical社)
Controller：Jasco PU-980 (日本分光株式会社)
Detector：Jasco UV-1570 (315 nm; 日本分光株式会社)
Mobile phase：20% acetonitrile、80% 10 mM KH₂PO₄ (pH 2.5)
Flow rate：1.5 mL/min
Sample volume：40 μL
〈レコーダー条件〉
Recorder：クロマトパックC-R5A (Shimadzu社)
Chart speed：0.2 cm/ min

【0076】

図３に示すように、コントロール（ＤＭＳＯで処理した細胞）の培養上清中のＭＧ濃度は０．０３８±０．０１０μＭであったのに対し、ポジティブコントロールとして用いたＢＢＧＣは０．１１９±０．０３９μＭであった。エリポエギンＫでは０．３６４±０．０１７μＭのＭＧが検出された。すなわち、ＢＢＧＣの約３倍のＭＧが検出された。

【0077】

以上のことから、エリポエギンＫは、ＨＬ−６０細胞において、ＧＬＯＩ活性を阻害することにより、ＭＧの蓄積を引き起こし、その結果として、細胞増殖抑制を誘導するものと考えられた。

【実施例5】

【0078】

本実施例では、エリポエギンＫによって誘導される細胞死がアポトーシス誘導によるものであるか否かを確認するために、エリポエギンＫで処理したＨＬ−６０におけるカスパーゼ−３活性を測定した。カスパーゼ−３は、アポトーシスによって活性化される。

【0079】

（薬液調製）
ＨＬ−６０細胞を２４ウェルプレート上に播種し（５×１０^５個、５００μｌ／ｗｅｌｌ）、各濃度に調製したエリポエギンＫ及びＢＢＧＣをメディウムと共に添加し、継代培養条件下にてそれぞれ２，４，６時間培養した。なお、天然化合物の溶解、希釈にはＤＭＳＯを用い、培養中のＤＭＳＯ終濃度が０．２〜０．５％となるように薬液を調製した。

【0080】

（カスパーゼ−３の蛍光アッセイ）
カスパーゼ-3の活性測定には、Caspase-3 Fluorometric Assay Kit (R&D SYSTEMS社) を用いた。薬液処理後のＨＬ−６０細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄後、Lysis Bufferを加えて氷上に１０分間放置した。これを遠心して得た上清に等量の2×Reaction Buffer / DTT (2×Reaction Buffer：DTT＝100：1)を添加し、さらに終濃度が5%となるようにCaspase-3 fluorogenic substrate (DEVD-AFC)を添加した。十分に混和した後、蛍光用BLACK 96ウェルプレートに６０μＬ／ｗｅｌｌずつサンプルを添加し、３７℃において１．５時間インキュベートした。その後、生成した蛍光色素である7-amino-4-trifluoromethyl coumarin(AFC)の蛍光強度をWallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンター（励起フィルター：３９０ｎｍ、蛍光フィルター：５１０ｎｍ）により測定した。ＤＥＶＤ-ＡＦＣは青色蛍光を発する色素（λ_ｅｍ＝４００ｎｍ）であり、Ｃａｓｐａｓｅ−３存在下においてＤＥＶＤが切断され、黄緑色の蛍光を発するＡＦＣ（λ_ｅｍ＝５０５ｎｍ）が遊離する。カスパーゼ−３の活性はＡＦＣの蛍光強度に比例する。

【0081】

（タンパク質定量）
上記で得たＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ中のタンパク質量をBCA^TM Protein Assay Kit (PIERCE社) を用いて測定した。まず、Albumin Standard (2 mg/mL) を希釈し、検量線を作成するために０，２．５，５，１０，１５，２０μｇ／ｍＬのタンパク質溶液を調製した。タンパク質量を測定するサンプルは０〜２０μｇ／ｍＬに収まるよう適当に希釈した。次にWorking Reagent (Micro Reagent A (MA)：Micro Reagent B (MB)：Micro Reagent C （ＭＣ）＝５０：４８：２）を調製し、希釈した各タンパク溶液に等量のWorking Reagentを添加した後、６０℃で１時間インキュベートした。その後、室温まで冷却し、分光光度計 (UV-1600; Shimadzu社)で５６２ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0082】

ＢＣＡｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙでは、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）溶液と硫酸銅溶液からなるＷｏｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ中の黄緑色の第二銅イオンが、タンパク質の存在下で第一銅イオンに還元される。第一銅イオンはタンパク質（ペプチド結合）濃度に依存して、試薬中のＢＣＡ２分子とキレートを形成し、５６２ｎｍに吸収をもつ紫色の溶液へと変化する。

【0083】

（カスパーゼ-3 阻害剤を用いた細胞生存活性測定）
ＨＬ−６０細胞を９６ウェルプレート上に播種し（１．２×１０^４細胞／１００μＬ／ｗｅｌｌ）、３７℃にて２４時間培養し、カスパーゼ−３阻害剤(Z-DEVD-FMK; R&D Systems社)を、薬液処理の２時間前に終濃度１００μＭとなるよう添加した。その後、各濃度に調製したエリポエギンＫを培養液でさらに希釈したものを８０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、継代培養条件下にてそれぞれ６、２４、４８時間培養した。

【0084】

（ＭＴＳアッセイ）
薬液処理後の９６ウェルプレート中の細胞培養液に１ｗｅｌｌあたり、ＭＴＳ試薬（CellTiter 96 Aqueous One Solution reagent; Promega社)３０μＬに培養液（１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ）１０μｌを加えた溶液（４０μＬ）を添加し、培養条件下にて２．５時間インキュベートした。その後、生成したホルマザン色素の４９０ｎｍにおける吸光度をマルチラベルカウンター ( Wallac 1420 ARVOsx 、PerkinElmer社) により測定した。

【0085】

ＨＬ−６０細胞にたいするエリポエギンＫによるカスパーゼ−３活性化の確認結果を図４に示し、カスパーゼ−３阻害剤を用いた抗細胞増殖活性の測定結果を図５に示す。

【0086】

図４に示すように、エリポエギンＫ処理後のＨＬ−６０細胞で、処理時間に応じてカスパーゼ−３活性が増大した。このことから、エリポエギンＫで処理した細胞においてカスパーゼ−３の活性化が引き起こされることが明らかとなった。

【0087】

また、図５に示すように、カスパーゼ−３阻害剤を添加して経時的にＭＴＳアッセイを行った結果、阻害剤を添加した細胞と添加しなかった細胞で、細胞の生存率に差が現われたことからも、エリポエギンＫのＨＬ−６０細胞に対する抗増殖活性は、カスパーゼ−３の活性化を介したアポトーシスの誘導によるものであることが示された。

【実施例6】

【0088】

本実施例では、ヒト急性前骨髄球性白血病由来細胞株ＨＬ−６０に対し、強力な抗増殖活性を有することが確認されたエリポエギンＫ について、正常リンパ球の生存率に及ぼす影響を検討した。

【0089】

（薬液処理）
正常ヒトリンパ球を９６ウェルプレート上に播種（１５×１０^４細胞／１００μｌ／ｗｅｌｌ）し、３７℃にて２４時間培養した。その後、各濃度に調製したエリポエギンＫを培養液でさらに希釈したものを８０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４８時間培養した。なお、化合物の溶解、希釈にはＤＭＳＯを用い、培養中のＤＭＳＯ終濃度が０．２〜０．５％となるように薬液を調製した。

【0090】

（ＭＴＳアッセイ）
薬液処理後の９６ウェルプレート中の細胞培養液に１ｗｅｌｌあたり、ＭＴＳ試薬(CellTiter 96 Aqueous One Solution reagent; Promega社) ３０μＬに培養液（１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ）１０μｌを加えた溶液（４０μｌ）を添加し、培養条件下にて２．５時間インキュベートした。その後、生成したホルマザン色素の４９０ｎｍにおける吸光度をマルチラベルカウンター ( Wallac 1420 ARVOsx 、PerkinElmer社) により測定した。結果を図６に示す。

【0091】

図６に示すように、エリポエギンＫをＨＬ−６０細胞および正常リンパ球に添加して４８時間培養した後、生細胞数をＭＴＳアッセイで評価したところ ＨＬ−６０細胞と比較して、正常リンパ球では生存率が高く、エリポエギンＫが正常リンパ球に及ぼす影響は低いことが示された。このことから、エリポエギンＫによる抗増殖作用は、腫瘍細胞に特異的に現われると考えられる。

【0092】

以上の実施例によれば、エリポエギンＫは、ＨＬ−６０細胞に対して非常に強力な抗増殖活性を有することが示された。また、その作用は、ＨＬ−６０細胞内のＧＬＯＩを阻害することにより、ＭＧの蓄積を引き起こし、その結果として細胞増殖抑制を誘導するものと考えられる。さらに、エリポエギンＫによるＨＬ−６０細胞に対する抗増殖活性は、カスパーゼ−３の活性化を介したアポトーシスの誘導によるものであることが示された。また、エリポエギンＫは正常リンパ球に及ぼす影響は低いことが示された。

【0093】

以上の結果から、エリポエギンＫによる抗増殖作用は、腫瘍細胞に特異的に現われると考えられ、エリポエギンＫは抗がん剤としてあるいはその有用なシード化合物になりうると考えられる。

【0094】

以上、本発明の実施形態および実施例について詳細に説明したが、これらは例示に過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。

【0095】

本明細書または図面に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組合せによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組合せに限定されるものではない。また、本明細書または図面に例示した技術は複数目的を同時に達成し得るものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】