特許 6281890 トルラ酵母由来グルコシルセラミドの美白剤としての利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6281890

(24)【登録日】2018年2月2日

(45)【発行日】2018年2月21日

(54)【発明の名称】トルラ酵母由来グルコシルセラミドの美白剤としての利用

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/68 20060101AFI20180208BHJP

   A61K 8/9728 20170101ALI20180208BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20180208BHJP

   A61K 31/7032 20060101ALI20180208BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20180208BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20180208BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/68

   A61K8/9728

   A61Q19/02

   A61K31/7032

   A61P17/16

   A61P17/00

【請求項の数】1

【全頁数】8

(21)【出願番号】特願2012-238742(P2012-238742)

(22)【出願日】2012年10月30日

(65)【公開番号】特開2014-88340(P2014-88340A)

(43)【公開日】2014年5月15日

【審査請求日】2015年10月1日

(73)【特許権者】

【識別番号】312015749

【氏名又は名称】興人ライフサイエンス株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】509349141

【氏名又は名称】京都府公立大学法人

(74)【代理人】

【識別番号】100160978

【弁理士】

【氏名又は名称】榎本 政彦

(72)【発明者】

【氏名】和田 小依里

(72)【発明者】

【氏名】福永 祥子

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 寿哉

(72)【発明者】

【氏名】佐内 勇亮

(72)【発明者】

【氏名】中川 智寛

(72)【発明者】

【氏名】梶 直人

【審査官】 向井 佑

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−０４５７１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−０２６５３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０２２２１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−１０７２４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−２４６２８７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／００

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

酵母エキス抽出後のトルラ酵母菌体からアルコール抽出工程により得られるグルコシルセラミド組成物を含有させる美白剤の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、食経験があり安全性が認められているトルラ酵母を使用し、菌体培養後に酵母エキスを抽出した酵母菌体から抽出し、得られたグルコシルセラミドを利用した美白剤を提供するものである。

【背景技術】

【0002】

グルコシルセラミドとは、スフィンゴイド塩基と脂肪酸がアミド結合したセラミド骨格に、１分子のグルコースが結合したスフィンゴ糖脂質の一種である。動植物や微生物に幅広く分布し、サプリメント等で摂取した場合、肌機能の改善効果や、大腸がんの予防効果があることなどから近年、健康食品素材として注目を集めている。

【0003】

美白剤としてのグルコシルセラミドについては、これまでコメや小麦由来の植物性グルコシルセラミドについて報告があったが、酵母由来のグルコシルセラミドについては報告がなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平０６−１４５０３９号公報

【特許文献2】特開２００１−０２６５３０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

食経験があって安全性が高く、かつ品質、供給、価格が安定している原料を用いて、品質の良いグルコシルセラミド組成物を得ること、及び当該グルコシルセラミド組成物を用いることで、他の植物性グルコシルセラミドに比較して、美白効果に優れた美白剤を提供し、酵母由来グルコシルセラミドを含有した飲食品、皮膚外用剤及び医薬品を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

酵母由来、特にトルラ酵母由来のグルコシルセラミドについてメラニン生成抑制効果を確認したところ、コメやトウモロコシ由来の植物性グルコシルセラミドに比較して、優れた美白効果があることを見出した。

【0007】

つまり、本願発明は、以下のとおりである。
（１）、酵母エキス抽出後のトルラ酵母菌体から抽出されたグルコシルセラミドを含有する美白剤、
（２）、（１）の美白剤を含有する飲食品、
（３）、（１）の美白剤を含有する化粧品、
（４）、（１）の美白剤を含有する皮膚外用剤及び医薬品。

【発明の効果】

【0008】

トルラ酵母から酵母エキスを抽出して得られた酵母菌体からは、夾雑物の少ない高品質のグルコシルセラミド組成物を得ることが可能であり、本発明ではこのようにして得られたトルラ酵母由来グルコシルセラミドについて、マウスB16メラノーマ細胞によるメラニン生成抑制効果を確認したところ、コメやトウモロコシなどの植物を原料とする植物性セラミドに比較して、優れた美白効果が得られることを確認した。また本発明では酵母エキスの残渣であり産業廃棄物である酵母菌体を有効利用できるため、コスト、廃棄物削減の点でも、きわめて有利で安価な美白剤を提供することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は各濃度の酵母セラミドのメラニン生成率

【図2】図２は各種セラミドのメラニン生成率

【図3】図３は、酵母セラミドによりメラノーマ細胞の黒色が退化した写真

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明で使用する酵母は、グルコシルセラミドを含有する酵母であればよい。特に好ましくは、一般名トルラ酵母と称されるCandida utilisである。酵母の培養形式はバッチ培養、あるいは連続培養のいずれかが用いられる。培地には炭素源として、ブドウ糖、酢酸、エタノール、グリセロール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸塩などが使用される。リン酸、カリウム、マグネシウム源も過リン酸石灰、リン酸アンモニウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の通常の工業用原料でよく、その他亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を添加する。その他、ビタミン、アミノ酸、核酸関連物質等を添加したり、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良い。培養温度は21〜37℃、好ましくは25〜34℃で、pHは3.0〜8.0、特に3.5〜7.0が好ましい。培養条件によりアミノ酸や核酸の生産性が変動するため、目的とする酵母エキスの製品仕様に合わせて条件設定を行う。

【0011】

酵母の培養は一般的な培地組成で行う。菌体培養後にエキス抽出を行う。本願では、エキス抽出後の酵母を酵母残渣としている。抽出法は、とくに制限がないが、一般的に、自己消化法、熱水抽出法、酵素抽出法、酸、若しくはアルカリ抽出法、又はこれらの組み合わせにより行うことが可能である。

【0012】

自己消化により酵母エキスを抽出する場合は、例えば、55℃で4時間攪拌する。酵素抽出法であれば、細胞壁溶解酵素又はプロテアーゼ等で攪拌抽出する。酸抽抽出法であれば、硫酸等で酸性に調整後、抽出する。アルカリ抽出法であれば、アルカリに調整後、抽出する。又は、自己消化後（例えば55度で4時間攪拌）に、酵素抽出をする等の組み合わせも可能である。

【0013】

上記の酵母中のエキス抽出により、タンパク質や核酸が抽出除去されると共に、ステロール配糖体など一部の脂溶性夾雑物が除去され、結果としてグルコシルセラミドが富化された酵母残渣が製造される。なお、本願では、夾雑物の除去及びグルコシルセラミドの定性分析をTLCで、定量分析をHPLC-ELSDで行った。

【0014】

エキス抽出後は遠心分離で酵母残渣を回収し、残渣を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄を行う。洗浄後の残渣を必要に応じて、凍結乾燥又は熱風乾燥することも可能である。得られた酵母残渣をトルラ酵母由来グルコシルセラミド原料とする。

【0015】

続いて上記原料を用いてグルコシルセラミドの精製を行う。精製の方法に制限はないが、食品として用いることができる精製法が望ましい。例えば、特開2002-281936に記載されている方法で精製することができる。アルコール抽出を行う場合は、トルラ酵母由来グルコシルセラミド原料に対して2倍量の９０％エタノールを使用し、攪拌によりグルコシルセラミドの抽出を行う。抽出後は抽出液を遠心分離で回収し、濃縮及び凍結乾燥または熱風乾燥させることでグルコシルセラミド組成物が得られる。

【0016】

必要に応じて、グルコシルセラミド組成物をさらに精製することにより、グルコシルセラミド含有量の高い組成物を製造することもできる。精製法は、既知の方法により精製可能であり、例えば、シリカゲルやイオン交換樹脂などのカラム精製等を用いることができる。

【0017】

本発明の組成物には、本発明の効果を維持・促進しうる他の成分を混合してもかまわない。混合可能な物質としては、例えばグルタチオン、ビタミン類、コラーゲン、スクワラン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ナイアシン、ナイアシンアミド、ヒアルロン酸、プラセンタエキス、ソルビトール、キチン、キトサン、及び種々の植物抽出物等が挙げられる。これらの混合量については、本発明の効果を損なわない限り、特に限定されるものではない。

【0018】

本発明は、上記した本発明の組成物を含有することを特徴とする飲食品、化粧品、皮膚外用剤又は医薬品を提供するものである。

【0019】

本発明における飲食品とは、上記組成物を配合した、食料品、飲料品、嗜好品、サプリメント等、経口で摂取するものを指す。その形態は特に限定されるものではなく、パン類、麺類等主菜となりうるもの、チーズ、ハム、ウインナー、魚介加工品等副菜となりうるもの、果汁飲料、炭酸飲料、乳飲料等の飲料、クッキー、ケーキ、ゼリー、プリン、キャンディー、ヨーグルト等の嗜好品等とすることができる。また、サプリメントとしての形態も特に限定されるものではなく、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、栄養ドリンク状の形態をとることもできる。

【0020】

飲食品におけるグルコシル組成物の配合量は特に限定されるものではなく、例えば酵母由来グルコシルセラミドが飲食品の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜１０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜１ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。

【0021】

本発明の化粧品とは、上記組成物を配合した化粧水、乳液、ファンデーション、口紅などを指す。

【0022】

組成物の配合量は特に限定されるものではなく、例えば酵母由来グルコシルセラミドが組成物の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜１０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜１ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。

【0023】

また本発明の皮膚外用剤又は医薬品とは、上記組成物を配合したローション、クリーム、軟膏、スプレー、貼付剤（材）などの形状のものを指すが、その形態は特に限定されるものではなく、本発明の目的とする効果を発揮しうるものであればいかなる形態でもかまわない。

【0024】

皮膚外用剤又は医薬品におけるグルコシル組成物の配合量の配合量は特に限定されるものではなく、例えばグルコシルセラミドが組成物の質量１００ｇに対し１０ｐｇ〜１０ｇ含まれていればよい。中でも１００ｐｇ〜１ｇが好適であり、１０ｎｇ〜５００ｍｇは更に好適である。

【実施例】

【0025】

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0026】

（ＴＬＣ条件）
前処理としてグルコシルセラミド組成物２０ｍｇを２ｍｌの０．４Ｎ ＫＯＨ ＥｔＯＨに溶解し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後は０．４Ｎ ＨＣｌ ＥｔＯＨを２ｍｌ加えて中和し、遠心分離後の上清４μｌをＴＬＣに供した。ＴＬＣはシリカゲルプレート（メルク社製Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、層厚０．２５ｍ）を使用し、クロロホルム：エタノール：水＝６５：１６：２（容量比）で展開した。展開後はシリカゲルプレートを乾燥させ、アニスアルデヒド硫酸試液を噴霧して加熱することで発色させた。

【0027】

（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ条件）
前処理としてグルコシルセラミド組成物２０ｍｇを２ｍｌの０．４Ｎ ＫＯＨ ＥＴＯＨに溶解し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベート後は０．４Ｎ ＨＣＬ ＥＴＯＨを２ｍｌ加えて中和し、塩類をフィルター除去してからＨＰＬＣに供した。カラムにはＧＬサイエンス社製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ １００Ａを用い、グルコシルセラミドの検出は蒸発光散乱検出器（島津製ＥＬＳＤ−ＬＴＩＩ）で行った。溶出溶媒にはクロロホルムとメタノール：水＝９５：５（容量比）のグラジエントを用いた。カラム温度は３５℃、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、ドリフトチューブ温度は４０℃で窒素ガス圧力は３５０ｋＰａであった。

【0028】

（酵母の培養）
キャンディダ・ウチリスＣＳ７５２９株（ＦＥＲＭＰ−３３４０）を予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む三角フラスコで種母培養し、これを３０Ｌ容発酵槽に１８Ｌ培地に１〜２％植菌した。培地組成は、グルコース４％、燐酸一アンモニウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１６１％、塩化カリウム０．１３７％、硫酸マグネシウム０．０８％、硫酸銅１．６ｐｐｍ、硫酸鉄１４ｐｐｍ、硫酸マンガン１６ｐｐｍ、硫酸亜鉛１４ｐｐｍを用いた。培養条件は、ｐＨ４．０、培養温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌６００ｒｐｍで行い、アンモニアを添加しｐＨのコントロールを行った。１６時間菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌し、１８０gの湿潤酵母菌体を得た。

【0029】

（酵母エキスの抽出）
菌体培養後の湿潤酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。洗浄後は湿潤菌体を蒸留水に再度懸濁するか、凍結乾燥または熱風乾燥させた乾燥菌体を蒸留水に懸濁し、以下の条件に調整することでエキス抽出を行った。
自己消化： １Ｎ ＨＣｌでｐＨ５．０に調整後、５５℃で４時間攪拌
酵素抽出：１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７に調整後、細胞壁溶解酵素（ツニカーゼ）或いはプロテアーゼで５５℃、４時間攪拌抽出（再現性確認中）
酸抽出：１Ｎ硫酸でｐＨ２以下に調整後、６５℃で２分間攪拌抽出
アルカリ抽出：２Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１３に調整後、７０℃で２０分間攪拌抽出

【0030】

（美白効果の確認）
以下の手順に従って美白作用を測定した。サンプルとして比較例にコメ及びトウモロコシ由来のグルコシルセラミドを使用し、実施例に酵母由来グルコシルセラミドを用いた。また乳酸ナトリウムはポジティブコントロールとして使用した。

【0031】

（メラニン産生抑制効果の評価）
比較例１〜２の評価（コメ、トウモロコシ）
植物性グルコシルセラミドであるコメ（比較例１）及びトウモロコシ由来グルコシルセラミド（比較例２）について、美白作用を測定した。

【0032】

Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種（５×１０^３／ｗｅｌｌ）し、２４時間前培養した（５％ＣＯ_２ 、３７℃）。培養液は、５％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地を使用した。その後、コメ由来グルコシルセラミド（比較例１）、トウモロコシ由来グルコシルセラミド（比較例２）およびメラニン生成抑制効果が既知となっている乳酸ナトリウム（比較例３）のエタノール溶液を最終濃度が５μｇ／ｍＬとなるように添加した新鮮な培地に交換した。 播種３日目に再度、比較例１、２のサンプルを添加した培地に交換した。播種６日目に細胞を０.２５％トリプシンＥＤＴＡで剥がし、遠心（１００００ｒｐｍ．３ｍｉｎ）操作によりペレット（細胞）を回収した。回収したペレットはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗ったのち、１ｍＬのＰＢＳで細胞浮遊液を調整して０．８ｍＬをメラニン量の測定に、０．２ｍＬをタンパク質の定量に使用した。
メラニン量の測定用に回収したペレットを１５０μＬの１Ｎ ＮaＯＨで融解し（１００℃、１０分）、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。タンパク質の定量用に回収したペレットはＢＣＡ法にてタンパク質の定量を行った。エタノールを添加したものをコントロールとし、コントロールを１００％として時の比較例１、２を添加して培養した細胞のタンパク質あたりのメラニン量をメラニン生成率として求めた。

【0033】

実施例１の評価（酵母）
次に上記製法により得られた酵母由来グルコシルセラミド組成物（実施例１）について、美白作用を測定した。

【0034】

酵母由来グルコシルセラミド（実施例１）をエタノールに溶解させた。マウスメラノーマＢ１６細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種（５×１０^３／ｗｅｌｌ）し、２４時間前培養した（５％ＣＯ_２ 、３７℃）。培養液は、５％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地を使用した。その後、前記で調整した酵母由来グルコシルセラミド（実施例１）を最終濃度が１、２．５、５、７.５、１０、２５μｇ／ｍＬになるように調整して添加した新鮮な培地に交換した。
播種３日目に再度、実施例１の各濃度のサンプルを添加した培地に交換した。播種６日目に細胞を０.２５％トリプシンＥＤＴＡで剥がし、遠心（１００００ｒｐｍ．３ｍｉｎ）操作によりペレット（細胞）を回収した。回収したペレットはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗ったのち、１ｍＬのＰＢＳで細胞浮遊液を調整して０．８ｍＬをメラニン量の測定に、０．２ｍＬをタンパク質の定量に使用した。
メラニン量の測定用に回収したペレットを１５０μＬの１Ｎ ＮaＯＨで融解し（１００℃、１０分）、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。タンパク質の定量用に回収したペレットはＢＣＡ法にてタンパク質の定量を行った。コントロールを１００％としてときの比較例１、２を添加して培養した細胞のタンパク質あたりのメラニン量をメラニン生成率として求めた。

【0035】

比較例１
コメ由来グルコシルセラミドには一般的に市販で入手可能なコメ由来のグルコシルセラミドを使用した。上記のメラニン産生抑制効果の評価法においてコメ由来グルコシルセラミドをグルコシルセラミド濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加したところ、マウスＢ１６メラノーマ細胞におけるメラニン生成率は６４％であった。

【0036】

比較例２
トウモロコシ由来グルコシルセラミドには一般的に市販で入手可能なトウモロコシ由来のグルコシルセラミドを使用した。上記のメラニン産生抑制効果の評価法においてコメ由来グルコシルセラミドをグルコシルセラミド濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加したところ、マウスＢ１６メラノーマ細胞におけるメラニン生成率は５０％であった。

【0037】

実施例１
菌体培養後に洗浄し、熱風乾燥させたトルラ酵母の乾燥菌体５ｋｇを蒸留水５０Ｌに懸濁し、２Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１３．０に調整した後、７０℃で３０分間エキス抽出した。抽出後は遠心分離で酵母残渣を回収し、酵母残渣の蒸留水への懸濁と遠心分離を3回繰り返すことで洗浄した。洗浄後は酵母残渣を真空乾燥することで３．３ｋｇのエキス抽出酵母残渣が得られた。得られた酵母残渣全量を２倍量の９０％エタノールに懸濁し、６０℃で１０時間攪拌してグルコシルセラミドを抽出した。遠心分離により抽出液を回収し、酵母残渣をエタノールで３回洗浄した洗浄液と合わせて濃縮した結果、抽出物３００ｇが得られた。これをグルコシルセラミド含有組成物とし、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤで分析した結果、グルコシルセラミドが２．１％含有されていた。またＴＬＣによる分析の結果、夾雑物のステロール配糖体は確認されなかった。繊維芽細胞促進効果の確認には、上記抽出物１５ｇをさらにシリカカラムで精製することで、グルコシルセラミド含量を３４％含有する組成物１１ｇが得られた。得られた酵母由来グルコシルセラミド粗精製物を使用してメラニン産生抑制効果を評価した。

【0038】

実施例１の結果を図１に示す。縦軸は、メラニン生成率（％ｃｏｎｔｒｏｌ），横軸を酵母由来グルコシルセラミドの濃度（μｇ／ｍｌ）とした。、酵母由来グルコシルセラミドは、濃度依存的にマウスメラノーマＢ１６細胞のメラニン生成を抑制した。サンプル添加量２.５μｇ／ｍＬ以上ではコントロールと比較してタンパク質あたりのメラニン量が有意に低値となり、優れた美白作用を示した。

【0039】

また図２に、実施例１と比較例１、２について、同一濃度で培養した細胞のタンパク質あたりのメラニン量を比較した結果を示した。図２によれば、酵母セラミド（実施例１） のメラニン生成率は３７％であり、比較例１、２のコメやトウモロコシ由来のグルコシルセラミドよりもメラニン生成を効果的に抑制しており、良好な美白作用を示すことが判る。

【0040】

図３には、本願実施例に従って、メラノーマ細胞の黒色の退色を示す写真である。Ｐ．Ｃは、ポジティブコントロールである乳酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌは、本願発明の酵母セラミドの濃度、ｃｏｎｔｒｏｌは、ネガティブコントロールである。

【図1】

【図2】

【図3】