特許 6282270 組み換えにより生成されたパエニバシラス・ポリミキサに由来する中性プロテアーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6282270

(24)【登録日】2018年2月2日

(45)【発行日】2018年2月21日

(54)【発明の名称】組み換えにより生成されたパエニバシラス・ポリミキサに由来する中性プロテアーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/52 20060101AFI20180208BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180208BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180208BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/52

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/21

【請求項の数】7

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2015-520928(P2015-520928)

(86)(22)【出願日】2013年7月5日

(65)【公表番号】特表2015-521856(P2015-521856A)

(43)【公表日】2015年8月3日

(86)【国際出願番号】EP2013064271

(87)【国際公開番号】WO2014009276

(87)【国際公開日】20140116

【審査請求日】2016年6月21日

(31)【優先権主張番号】12175563.1

(32)【優先日】2012年7月9日

(33)【優先権主張国】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100157923

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴喰 寿孝

(72)【発明者】

【氏名】グライナー−シュテフェル，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】シェナート，シュテファン

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２６９５２７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特公昭５６−０５１７４７（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】 特表平１１−５０４２２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Bacteriol., 1991, Vol. 173, No. 21, pp. 6820-6825

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

中性プロテアーゼを組み換えにより生成するための方法であって、以下の工程：
（ａ）発現ベクター中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に従うプレプロ酵素をコードしている配列を有するＤＮＡを提供し、宿主生物のバシラス・アミロリケファシエンスの種を該発現ベクターを用いて形質転換し、それにより形質転換された宿主生物を得て；続いて
（ｂ）該形質転換された宿主生物中で該ＤＮＡを発現させ、ここで該形質転換された宿主生物が該中性プロテアーゼを分泌し；続いて
（ｃ）該分泌された中性プロテアーゼを単離する；
を含み、それにより該中性プロテアーゼを組み換えにより生成する、前記方法。

【請求項2】

ＤＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の３４位〜１８９６位の配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程（ｂ）が形質転換された宿主生物を液体培地中で培養することを含み、該形質転換された宿主生物が中性プロテアーゼを液体培地中に分泌する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

工程（ｃ）が分泌された中性プロテアーゼを液体培地から単離することを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

宿主生物がＮｐｒおよびＡｐｒから選択される細胞外プロテアーゼを欠損している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

少なくとも１種類のベクターを含有する、形質転換されたバシラス・アミロリケファシエンスの種である宿主生物であって、
ここで該ベクターはポリヌクレオチドを含有し、
該ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の２８９位〜５９２位のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、該ポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６中の８９８位〜１８１１位の配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）縮重コードの結果としてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の８９８位〜１８１１位のヌクレオチド配列に由来するポリヌクレオチド；
からなる群から選択される、
前記宿主生物。

【請求項7】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の３４位〜１８１１の配列を有する、請求項６に記載の宿主生物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、中性プロテアーゼの前駆体であるパエニバシラス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）プレプロ酵素（ｐｒｅｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）の配列、形質転換された宿主生物中でのその発現、および組み換え手段によるその中性プロテアーゼの生成のための方法を提供する。さらに、その組み換えにより生成された中性プロテアーゼの使用は、特に組織解離の目的で細胞生物学の分野で開示されている。その開示には、他のプロテアーゼとのブレンドも含まれる。さらに、その中性プロテアーゼならびにその断片をコードするヌクレオチド配列が開示される。

【0002】

本発明は、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）としても知られている、組み換えにより発現された酵素的に活性なパエニバシラス・ポリミキサからの中性プロテアーゼを提供するための手段に向けられている。特に、具体的には（そしてそれは特に好都合である）組み換え宿主株の役目を果たす形質転換されたバシラス種中でのその組み換え発現を経た大規模生産に適しているアミノ酸配列を提供する。特定の態様において、組み換えにより発現したパエニバシラス・ポリミキサ中性プロテアーゼが液体培地中に分泌され、それから精製される。

【背景技術】

【0003】

パエニバシラス・ポリミキサ培養物（Ｐ．ポリミキサ；以前はバシラス・ポリミキサまたはＢ．ポリミキサとしても知られており、これら全ての分類学的な名前は本明細書において同義的に用いられている）の濾液または上清から、中性プロテアーゼが単離され、特性付けられた。より最近の文献ではその中性プロテアーゼはしばしば“Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）”と呼ばれ、それは合同酒精株式会社（日本、東京）の登録商標である。フィブロネクチナーゼ（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎａｓｅ）およびＩＶ型コラゲナーゼのタンパク質分解活性のため、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）の技術的有用性は特に動物細胞または組織培養の分野において知られている。従って、組織（細胞集塊または細胞凝集塊が含まれる）の細胞層または単一細胞の均一な懸濁液への解離は、しばしばこの酵素の活性を用いて、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）のみによるかまたはブレンド、すなわち組み合わせられた他のタンパク質分解酵素、特にコラゲナーゼ類、例えば米国特許第5,830,741号において開示されているようなコラゲナーゼ類の構成要素としてのＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）によるかのどちらかで実施される。

【0004】

米国特許第3,930,954号は、受入番号ＡＴＣＣ ２１９９３（その文献においてＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ．４１２とも呼ばれている）を有するＢ．ポリミキサからの中性プロテアーゼを開示している。その文献は特にその細菌株の好気性条件下での炭素源、窒素源および無機塩類を含有する複合液体培地（培養ブロス）中での培養を記載している。その培養ブロス中に存在するタンパク質分解活性を培養の間監視し、これはその細胞によりその液体上清中に分泌された中性プロテアーゼの量を示している。その最大活性に達した際に、その培地を回収し、細菌細胞が含まれる微粒子構成要素をその上清からゲル濾過により分離し、続いてその濾液を減圧下で濃縮した。イソプロパノールを用いたそれ以上指定されない分画工程の後、その培養ブロス中で検出された総タンパク質分解活性の７０％に相当する調製物が得られた。米国特許第3,930,954号において教示されたプロテアーゼ濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の他の方法には、硫酸アンモニウムを用いた塩析およびメタノール、エタノールおよびアセトンを用いた沈殿が含まれ、それぞれが結果として粗製の調製物をもたらす。続いて、さらなる精製工程を適用し、最終的に精製された調製物がもたらされた。超遠心分析により、３５，９００ダルトン（Ｄａ）の分子量が決定され、いくつかの他の生化学的および生物物理学的パラメーターが調べられた。しかし、開示された調製物が均質に精製された単一のプロテアーゼまたは異なるタンパク質の混合物を含有しているかどうかを明らかにする曖昧でないデータは供給されなかった。

【0005】

Stenn, K.S., et al., J. Invest. Dermatol. 93 (1989) 287-290は、中性プロテアーゼ（＝Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標））の基質特異性の分析を開示している。加えて、Ｂ．ポリミキサの培養濾液に由来する精製された物質を用いたその中性プロテアーゼのさらなる生化学的特性付けが示されており、米国特許第3,930,954号に言及している。特に、商業的に入手可能なＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）調製物のタンパク質６００μｇの試料を表すＳＤＳ ＰＡＧＥゲルがその文献において示されている。クーマシーブルー染色されたゲルは、４１ｋＤａにおいて泳動する薄い主要なバンドを示しているが、３０〜２０ｋＤａを泳動する少なくとも２つのかすかなバンド、および２０〜１４．４ｋＤａを泳動するさらにかすかなバンドも示している。

【0006】

Murao, S., et al. (Agric. Biol. Chem. 47 (1979) 941-947)のＢ．ポリミキサ７２株を用いて、Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825の著者は、見たところ中性プロテアーゼの５９０アミノ酸を有するプレプロ酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；一次翻訳産物、分泌前の前駆体分子）をコードするオープンリーディングフレームを有するヌクレオチド配列を含むＢ．ポリミキサのゲノムＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の大腸菌におけるクローニングを記載している。そのアミノ酸組成に基づいて、３０４アミノ酸を含む概念的な（ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ）成熟した（プロセシングされた）分泌タンパク質の分子量は３２，４７７Ｄａであると計算された。大腸菌中でＢ．ポリミキサのゲノム断片から発現させ、破砕した形質転換された大腸菌細胞の上清から分析した中性プロテアーゼは、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルにおいて約３５ｋＤａで泳動することが分かった。

【0007】

比較のため、Takekawa, S., et al.（上記）は培養液からもＢ．ポリミキサの細胞外中性プロテアーゼを精製した。その精製された中性プロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定した。特に、Ｂ．ポリミキサのＮ末端配列であるＡｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）中の最初の３個のアミノ酸残基はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２中に２８７〜３０１位において含まれる予測されるアミノ酸配列と異なっており、それはＡｓｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅであることが分かった。この不一致に関する理由は不明なままであり、それ以上明らかにされなかった。

【0008】

本開示の著者は、パエニバシラス・ポリミキサからの中性プロテアーゼを組み換えにより発現する形質転換された微生物宿主株を生成することを述べる。残念ながら、Takekawa, S., et al.（上記）により開示された配列は適切な発現株を構築するのに適していないことが分かった。さらにもっと驚くべきことに、Ｂ．ポリミキサ ＡＴＣＣ ２１９９３から単離されたＤＮＡは中性プロテアーゼに関する一次翻訳産物のアミノ酸配列をコードしており、それは５９２アミノ酸を含んでいただけでなく、以前に公開された配列と比較した場合に、コードされたポリペプチド中のいくつかの位置において変化を示した。さらに驚くべき結果は、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）はパエニバシラス・ポリミキサに由来する中性プロテアーゼの組み換え生成に関する特に適した宿主生物であることであった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許第5,830,741号

【特許文献2】米国特許第3,930,954号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Stenn, K.S., et al., J. Invest. Dermatol. 93 (1989) 287-290

【非特許文献2】Murao, S., et al. (Agric. Biol. Chem. 47 (1979) 941-947)

【非特許文献3】Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825

【発明の概要】

【0011】

本明細書で開示される全ての態様の第１観点は中性プロテアーゼを組み換えにより生成するための方法であり、その方法は以下の工程を含む：（ａ）発現ベクター中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に従うプレプロ酵素をコードしている配列を有するＤＮＡを提供し、宿主生物をその発現ベクターを用いて形質転換し、それにより形質転換された宿主生物を得て、ここでその宿主生物はグラム陽性原核生物種であり；続いて（ｂ）その形質転換された宿主生物中でそのＤＮＡを発現させ、ここでその形質転換された宿主生物が中性プロテアーゼを分泌し；続いて（ｃ）その分泌された中性プロテアーゼを単離し；それによりその中性プロテアーゼを組み換えにより生成する。

【0012】

本明細書で開示されるような全ての態様の第２観点は、本明細書で開示されるような中性プロテアーゼを組み換えにより生成するための方法を実施することにより得られた中性プロテアーゼである。

【0013】

本明細書で開示されるような全ての態様の第３観点は、以下の工程を含む、インビトロで動物組織から生きた細胞を単離する方法である：（ａ）請求項１〜８のいずれかに記載の方法を実施することにより得られた組み換えにより生成された中性プロテアーゼを提供し、そして（ｂ）その組織をインビトロで工程（ａ）の中性プロテアーゼと共に保温し、ここでその組織の細胞外マトリックスのタンパク質構成要素がタンパク質分解的に分解され、ここで細胞の層または個々の生きた細胞の懸濁液が得られ、それによりインビトロで生きた細胞を動物組織から単離する。

【0014】

本明細書で開示されるような全ての態様の第４観点は、本明細書で開示されるような中性プロテアーゼを組み換えにより生成するための方法を実施することにより得られた中性プロテアーゼの使用であり、その中性プロテアーゼの使用はインビトロでの動物組織からの生きた細胞の単離である。

【0015】

本明細書で開示されるような全ての態様の第５観点は、本明細書で開示されるような中性プロテアーゼを組み換えにより生成するための方法を実施することにより得られた中性プロテアーゼの凍結乾燥物を密封された区画中に含む部分のキットである。

【0016】

本明細書で開示されるような全ての態様の第６観点は、以下の工程を含む、複数のプロテアーゼのブレンドを作製するための方法である：（ａ）本明細書で開示されるような中性プロテアーゼを組み換えにより生成するための方法を実施することにより得られた組み換えにより生成された中性プロテアーゼを提供し、そして（ｂ）工程（ａ）の中性プロテアーゼをさらなるプロテアーゼと混合する。

【0017】

本明細書で開示されるような全ての態様の第７観点は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の２８９位〜５９２位のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、そのヌクレオチド配列は（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６中の８９８位〜１８１１位の配列を有するヌクレオチド配列；（ｂ）縮重コードの結果としてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の８９８位〜１８１１位のヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列からなる群から選択される。

【0018】

本明細書で開示されるような全ての態様の第８観点は、本明細書で開示されるようなヌクレオチド配列を含有するベクターである。
本明細書で開示されるような全ての態様の第９観点は、少なくとも１種類の本明細書で開示されるようなベクターを含有する形質転換された原核グラム陽性宿主生物である。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１ Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825の公開されたアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；図中の“Ｓｅｑ−１”）の本明細書で開示されるＰ．ポリミキサＡＴＣＣ ２１９９３に由来するアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５；図中の“Ｓｅｑ−２”）とのアラインメント。

【発明を実施するための形態】

【0020】

Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）（＝パエニバシラス・ポリミキサ、Ｐ．ポリミキサに由来する中性プロテアーゼ）は、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、およびＩ型コラーゲンを、後者は明らかにより低い程度までであるが切断することができるアミノ−エンドペプチダーゼとして分類される金属酵素である。Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼは、それは細胞膜を損傷しないため、組織解離（＝脱凝集）のために、そして特に継代培養手順のために有用である。本開示に従うＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼは細菌源から生産することができるため、それはマイコプラズマおよび動物ウイルスによる汚染がない。それは温度、ｐＨおよび血清構成要素による影響に関して非常に安定である。Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼの活性は希釈により大きく低減し、これは懸濁培養物を難なく増殖させることを可能にする。Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼは、望ましくない細胞の集塊を防ぐために細胞懸濁培養物に添加することさえできる。

【0021】

本開示に従って組み替えにより調製されたＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼは、多くのタイプの細胞を培養のために調製するために有用である。従って、本明細書で提供されるようなＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼは、均一な細胞層を、すなわち完全な表皮を真皮から、そして培養状態の完全な上皮シートを基層から分離するための迅速、有効であるが穏やかな薬剤である。両方の場合において、それは基底膜領域（ｚｏｎｅ ｒｅｇｉｏｎ）において細胞外マトリックスタンパク質を切断する一方で上皮細胞の生存性を保つことにより、分離に影響を及ぼす。本開示に従う、唯一のプロテアーゼとして用いられるＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼは、上皮細胞を細胞を解離させることなくコンフルエントな完全なシートとして培養皿の表面から脱離させるために有用である。そのような手順は、Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼにより培養支持体から脱離させた皮膚上皮細胞シートの培養およびさらには移植のための使用への道を開く。また、Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼは、正常二倍体細胞および細胞株の回収および移動のために有用である。組織の解離に関するさらなる適用は、Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼおよびコラゲナーゼのようなさらなるプロテアーゼのブレンドを利用する。

【0022】

本開示の著者の驚くべき発見に従って、中性プロテアーゼを組み替えにより生成するための方法が提供され、その方法は以下の工程を含む：（ａ）発現ベクター中でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に従うプレプロ酵素をコードする配列を有するＤＮＡを提供し、宿主生物をその発現ベクターを用いて形質転換し、それにより形質転換された宿主生物を得て、ここでその宿主生物はグラム陽性原核生物種であり；続いて（ｂ）その形質転換された宿主生物中でそのＤＮＡを発現させ、ここでその形質転換された宿主生物が中性プロテアーゼを分泌し；続いて（ｃ）その分泌された中性プロテアーゼを単離し；それによりその中性プロテアーゼを組み換えにより生成する。より詳細には、そのＤＮＡ配列はパエニバシラス・ポリミキサＡＴＣＣ ２１９９３に由来する。

【0023】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に従うプレプロ酵素をコードする配列は、当業者に既知のあらゆる適切な宿主生物中で発現させることができる。特定の宿主生物は、グラム陽性菌、特にバシラス、クロストリジウム、ラクトコッカス、ラクトバシラス、スタフィロコッカスおよびストレプトコッカスからなる群から選択される種である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５によりコードされる中性プロテアーゼを組み替えにより生成する非常に適切な方法は、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）を形質転換される宿主生物として利用する。

【0024】

特定の態様において、ＤＮＡを形質転換された宿主生物中で発現させる工程は、その形質転換された宿主生物を液体培地中で培養することにより実施され、ここでその形質転換された宿主生物は中性プロテアーゼを液体培地中に分泌する。続いて、その分泌された中性プロテアーゼをその液体培地から単離することができる。

【0025】

さらなる利点は、中性プロテアーゼを組み替えにより生成するための方法のいずれかにおいて、細胞外プロテアーゼを欠損した宿主生物を用いることにより達成することができる。Ｂ．アミロリケファシエンスの細胞外プロテアーゼに関する例はＮｐｒおよびＡｐｒであり、それは当業者に周知である。

【0026】

組織解離に関する典型的な作業の流れにおいて、本開示に従って組み替えにより生成されたＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼは凍結乾燥物として提供される。第１工程において、その凍結乾燥物をＭｇ^２＋およびＣａ^２＋イオンを含まない生理学的に適した緩衝液中で、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で溶解させる。次いでそのＰ．ポリミキサ中性プロテアーゼ溶液を、例えば濾過膜（例えば０．２２μｍ孔径）を通す濾過により滅菌する。生きた組織の試料を得る、すなわち動物から取り出す。あるいは、接着細胞を有する培養容器または細胞凝集塊を有する培養容器を提供する（その細胞は本明細書において“組織”とも呼ばれる）。特定の態様において、その組織を機械的手段（例えばハサミまたはメスの使用）により断片化し、その断片を滅菌ＰＢＳ中で洗浄する。続いて、その断片を予め温めたＰ．ポリミキサ中性プロテアーゼ溶液中で保温し、それによりその断片をその溶液で覆う。Ｐ．ポリミキサ中性プロテアーゼとの保温は典型的には生理的温度において、特に３７℃において実施される。

【0027】

所望の組織解離（の度合いまたは程度）に必要な時間は通常は経験的に決定され、ここで典型的にはその溶液中のＰ．ポリミキサ中性プロテアーゼの濃度および／または保温時間は様々である。Ｐ．ポリミキサ中性プロテアーゼ溶液中での保温時間は、その細胞への有害な作用なしで数時間であることができる。その保温した組織を場合により穏やかに攪拌することができる。必要であれば、得られた細胞懸濁液を無菌の網または格子を通過させることにより、分散した細胞をまだ存在する凝集塊（ａｇｇｅｒｇａｔｅｓ）から分離することができる。デカントも解離した細胞を得るための方法である。特にＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼとの保温により下の組織（ｔｉｓｓｕｅ ｕｎｄｅｒｎｅａｔｈ）から脱離した細胞層を分離するためのさらなる技法が当業者には既知である。さらなる脱凝集が望まれる場合、新しいＤｉｓｐａｓｅ溶液を添加することができる。

【0028】

それ以上のタンパク質分解活性を抑制するため、解離させた細胞または細胞層をペレット化することができ、酵素溶液をデカントにより除去することができ、またはそのポリミキサ中性プロテアーゼ溶液を細胞培養培地を用いて希釈する。そのようにするための他の方法が可能である。上記の作業の流れにより得られた細胞を、標準的な手順を用いて撒き、培養することができる。

【0029】

従って、本開示はさらに、以下の工程を含む、インビトロで動物組織から生きた細胞を単離するための方法を提供する：（ａ）請求項１〜８のいずれかに記載の方法を実施することにより得られた組み換えにより生成された中性プロテアーゼを提供し、そして（ｂ）その組織をインビトロで工程（ａ）の中性プロテアーゼと共に保温し、ここでその組織の細胞外マトリックスのタンパク質構成要素がタンパク質分解的に分解され、ここで細胞の層または個々の細胞の懸濁液が得られる。具体的には、その動物組織は脊椎動物に、より具体的にはマウス、モルモット、ハムスター、ラット、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類種、およびヒトから選択される動物種に由来する。

【0030】

別の態様において、インビトロで生きた細胞を動物組織から単離するための方法は、本明細書で開示されるように組み替えにより生成されたＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼが含まれるプロテアーゼブレンドの使用を含む。そのブレンドは、例として、さらなる中性プロテアーゼ、例えばサーモリシンを含む。さらに、Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼのコラゲナーゼとのブレンドは、組織解離に関する大きな利点を提供する。

【0031】

特定の態様において、本明細書で開示されるように組み替えにより生成されたＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼまたは本明細書で開示されるように組み替えにより生成されたＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼが含まれるプロテアーゼのブレンドは、凍結乾燥物として、すなわち凍結乾燥された調製物として提供される。そのような調製物は、延長された時間の間保管することができる。

【0032】

さらに、密封された区画、例えばボトル中に本明細書で開示されるような中性プロテアーゼを組み替えにより生成するための方法を実施することにより得られた中性プロテアーゼの凍結乾燥物を含む部分のキットが提供される。そのキットは、別個の密封された区画中にコラゲナーゼの凍結乾燥された調製物を含有することができる。そのキットは、別個の密封された区画中にサーモリシンの凍結乾燥された調製物を含有することもできる。別の態様は、密封された区画、例えばボトル中に本明細書で開示されるような中性プロテアーゼを組み替えにより生成するための方法を実施することにより得られた中性プロテアーゼの凍結乾燥物を含むキットであり、ここでその中性プロテアーゼはさらなるプロテアーゼ、例えば（それらに限定されないが）コラゲナーゼおよび／またはサーモリシンとブレンドされている。

【0033】

以下の実施例および配列リストは本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は添付された特許請求の範囲において述べられる。本明細書で開示される教示の精神から逸脱することなく述べられた手順において改変を行うことができることは理解されている。

【実施例】

【0034】

実施例１
発現コンストラクト（ＤＮＡ）の構築
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ならびに所望のコードおよび非コードゲノムＤＮＡ鎖の部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に相当するいくつかの合成された一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、人工遺伝子配列が生成された。まず第一に、向かい合う鎖の断片に相当する部分的に重複しているオリゴヌクレオチドの対を鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせ、二本鎖ＤＮＡ分子をポリメラーゼに媒介される鎖の伸長により生成し、続いてＰＣＲ増幅を行った。さらなるＤＮＡ分子を合成により作製した。人工的に生成されたＤＮＡの全ての配列を配列決定により検証した。

【0035】

実施例２
公開された配列情報を用いた発現コンストラクト
Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼを発現させるための最初の試みは、Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825に基づいていた。第１段階として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をコードするオープンリーディングフレームに対応するＣＤＳの部分配列（３４３）．．（２１１５）を、コドン使用頻度を変化させることにより適合させた。コードされるアミノ酸配列は変化しないままであったが、オープンリーディングフレームをバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中での発現のために最適化する中立変異が導入された。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をコードするリーディングフレームを有する人工ＤＮＡを作製し、合成した。それはＰ．ポリミキサの５９０アミノ酸を有するプレプロ酵素のアミノ酸配列、すなわちシグナル配列およびプロペプチドが含まれるアミノ酸配列をコードしていた。その発現コンストラクトにおいて、Ｂ．サチリス特異的リボソーム結合部位がそのオープンリーディングフレームの上流に導入された。そのＤＮＡコンストラクトを、Ｂ．サチリスにおいて液体培地中での増殖の静止期において増殖期特異的プロモーターに駆動される転写を提供する発現ベクター中にクローニングした。結果として得られた選択可能かつ複製能力のある発現プラスミドはｐＬＥ２Ｄ０１ｎｐｒＰｐであった。

【0036】

３個のグリシンおよび６個のヒスチジンをそのプレプロ酵素のアミノ酸配列のＣ末端に融合させることにより派生物を構築し、これは結果として６個の末端ヒスチジンを有する５９９アミノ酸を有するコードされたポリペプチドをもたらした。結果として得られた選択可能かつ複製能力のある発現プラスミドはｐＬＥ２Ｄ０１ｎｐｒＨｉｓＰｐであった。

【0037】

形質転換されたＢ．サチリス株を生成し、標準的な条件下での発現実験を行った；すなわち、検出可能な量の標的タンパク質の発現および分泌を許容することが示されている他の発現標的の場合の条件を適用した。

【0038】

驚くべきことに、両方の発現プラスミド：ｐＬＥ２Ｄ０１ｎｐｒＰｐおよびｐＬＥ２Ｄ０１ｎｐｒＨｉｓＰｐが否定的な結果をもたらした。Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼを発現および分泌させるための両方の試みが失敗であった。

【0039】

プロモーター配列のあらゆる負の影響を排除するため（そのような作用はありそうもないと考えられるが）、上記の２種類のプラスミドのそれぞれにおけるプロモーターを、特定の誘導剤化合物の培養物への添加に依存する発現を駆動する別のプロモーターと交換した。結果として得られた発現プラスミドをｐＬＥ２Ｅ０１ｎｐｒＰｐおよびｐＬＥ２Ｅ０１ｎｐｒＨｉｓＰｐと名づけた。その誘導剤の添加の工程が含まれる発現実験を行った。結果として、これらの改変は変化をもたらさなかった。Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼを発現および分泌させるための両方のさらなる試みは失敗であった。

【0040】

さらなる試みにおいて、そのＢ．サチリス特異的リボソーム結合部位を最初に記載された遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の天然のＰ．ポリミキサリボソーム結合部位と交換した。結果として得られた発現プラスミドをｐＬＥ２Ｄ０１ｎｐｒＲＢＳＰｐおよびｐＬＥ２Ｄ０１ｎｐｒＲＢＳＨｉｓＰｐと名づけた。またも、その否定的な結果を覆すことはできなかった。Ｐ．ポリミキサの中性プロテアーゼを発現および分泌させるための両方の追加の試みは失敗であった。

【0041】

加えて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３において示した配列の不一致に関するアミノ酸位置を、すなわちパエニバシラス・ポリミキサの培養上清から単離された天然の中性プロテアーゼのＮ末端アミノ酸配列により変更／削除する変異実験を行った。

【0042】

驚くべきことに、そして意外にも、バシラス・サチリスにおいてＰ．ポリミキサの中性プロテアーゼを発現させるための上記の直接の試みのいずれも、“空の”発現ベクターを用いて、すなわち挿入された所望のコード配列を一切有しないことを除いて上記で記載した特徴と同じ特徴を含むベクターを用いて形質転換したＢ．サチリス対照株と比較して、バックグラウンドを上回るプロテアーゼ活性をもたらさなかった。Ｂ．アミロリケファシエンスを発現宿主として用いた際、同じ結果が得られた。

【0043】

この点において、Takekawa, S., et al., J. Bacteriology 173 (1991) 6820-6825により公開された配列は大腸菌において、すなわち分類学的に、および進化的な点でＰ．ポリミキサと無関係である微生物においてクローニングおよび選択されたことを特筆する。そのような全く異なる宿主による継代がその外来のＤＮＡの変化につながった可能性があると推測するかもしれない。また、Takekawa, S., et al.（上記）は細胞抽出物を用いて大腸菌における中性プロテアーゼの発現を特性付けた。しかし、陽性のクローンは最初に脱脂乳寒天プレート上でのハローに基づいて同定され、これはその試験の初期段階におけるいくらかの細胞外プロテアーゼ活性をほのめかしていた。

【0044】

なぜTakekawa, S., et al.（上記）の公開された配列が中性プロテアーゼの検出可能な発現をもたらさないのかを説明する正確な理由は、少なくともそのＢ．サチリス系に関する限り、見付かっていない。それでもなお、Takekawa, S., et al.（上記）により記述された配列情報が真のパエニバシラス・ポリミキサの遺伝子に相当していない可能性があるかどうかを解明するためのさらなる試みが行われた。

【0045】

実施例３
パエニバシラス・ポリミキサ株ＡＴＣＣ ２１９９３に関する配列決定の結果
パエニバシラス・ポリミキサ株ＡＴＣＣ ２１９９３から単離された総ゲノムＤＮＡを単離し、その中性プロテアーゼをコードする遺伝子をＰＣＲを用いて増幅した。その増幅されたＤＮＡを配列決定した。驚くべきことに、ＤＮＡ配列レベルでのいくつかの違いが見付かり、その違いはコードされるアミノ酸配列における変化をもたらしている。ＡＴＣＣ ２１９９３株の中性プロテアーゼ遺伝子のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５において示す。

【0046】

アミノ酸配列レベルで、Takekawa, S., et al.（上記）の公開された配列とのアラインメントを図１において示す。そのアラインメントはいくつかのアミノ酸の交換およびさらには欠失および挿入を示している。そのアミノ酸交換の１７個は、これらの場合においてそのアミノ酸は（大きさ、電荷が）類似しておらず著しく異なるため、高次構造が関連している可能性がある。

【0047】

特に、本研究において決定されたアミノ酸配列は、Takegawa S.et al.（上記）によりより早く決定されたＮ末端配列を含有していた。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の２８９〜３０３位は以前に決定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＮ末端配列に対応している。本配列データによれば、分泌の過程の間のＮ末端のタンパク質分解的プロセシングが含まれるタンパク質分解的成熟プロセスの後、ＡＴＣＣ ２１９９３株に由来する細胞外中性プロテアーゼはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の２８９位から５９２位までのアミノ酸配列により与えられるポリペプチドである。

【0048】

実施例４
公開された配列情報を用いた発現コンストラクト
その中性プロテアーゼをコードするＤＮＡを、実施例３において記載されるようにパエニバシラス・ポリミキサＡＴＣＣ ２１９９３株から単離した。実施例２に類似して、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列に基づいて、その中性プロテアーゼをコードするＢ．サチリスにおける発現のためのＤＮＡ配列を異なる発現ベクター中に考案（ｄｅｖｉｓｅｄ）およびクローニングした。前記のパエニバシラス・ポリミキサＡＴＣＣ ２１９９３株の中性プロテアーゼ（プレプロ酵素）のコード配列が含まれるクローニングされた断片のＤＮＡ配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６として示す。典型的なコンストラクトは、そのシグナル配列およびそのプロペプチドが含まれるプレプロ酵素のＰ．ポリミキサのアミノ酸配列をコードしていた。そのＤＮＡコンストラクトを、液体培地中での増殖の静止期におけるＢ．サチリス中での転写を駆動する増殖期特異的プロモーターを提供する発現ベクター中でクローニングする。結果として得られた選択可能かつ複製能力のある発現プラスミドはｐＬＥ２Ｄ０１ＤｉｓｎａｔＰｐであった。

【0049】

さらに、３個の連続するグリシン、続いて６個のヒスチジンのタグ配列をそのプレプロ酵素のアミノ酸配列のＣ末端に融合させることにより、派生物を構築することを試みた。それぞれの形質転換実験は、牛乳寒天プレート上でプロテアーゼ分泌を示すハローを生成するクローンをもたらした。従って、Ｂ．サチリスにおいて中性プロテアーゼの組み換え生成が可能である。

【0050】

形質転換されたＢ．サチリス株をさらに特性付けた。発現プラスミドの配列決定は、驚くべきことに、全てのこれらのクローンが付加されたヒスチジンタグが失われた中性プロテアーゼ特異的なオープンリーディングフレームを含有していることを明らかにした。その特定のＢ．サチリス発現系において、そのＣ末端に付け加えられたＨｉｓタグ構造はそのタンパク質分解的に活性な組み換え中性プロテアーゼ酵素の発現および／または分泌と適合しなかった可能性がある。従って、この試みはそれ以上追求されず、組み換えＨｉｓタグ化中性プロテアーゼを活発に発現するクローンはＢ．サチリス系では生成されなかった。

【0051】

しかし、発現プラスミドｐＬＥ２Ｄ０１ＤｉｓｎａｔＰｐを、バシラス・サチリスだけでなくバシラス・アミロリケファシエンスも含まれるいくつかのバシラス種中に形質転換した。対照形質転換を前に記載したような“空の”発現ベクターを用いて行った。

【0052】

驚くべきことに、液体培養物中で、形質転換されたバシラス・アミロリケファシエンス宿主株は特に高い量の中性プロテアーゼをその培地中に分泌し、一方でバシラス・サチリスでは同じ条件下でその培養上清中で有意な中性プロテアーゼ活性は観察されなかった。その作用はその液体培地の組成物に依存しているようには思われなかった。この意外な観察に関する理由は解明されなかった。

【0053】

形質転換のために用いられた特定の形質転換されたバシラス・サチリス宿主株は、細胞外（分泌型）プロテアーゼをコードする１個以上の内在性遺伝子中に機能喪失変異を含有していた。そのような株は、特に本件において組み替えにより発現および分泌させるべき所望の標的タンパク質がそれ自体プロテアーゼである場合に好都合であると考えられる。特に、形質転換されたＢ．サチリスにおいて、ＡｐｒＥ、ＮｐｒＥ、Ｅｐｒ、およびそれらの組み合わせから選択される宿主のプロテアーゼ遺伝子が変異していた。加えて、これらの遺伝子の３つ全部が変異している株が得られた。

【0054】

バシラス・アミロリケファシエンスに関して、宿主株における好都合な変異には、内在性細胞外プロテアーゼ遺伝子ＮｐｒおよびＡｐｒが含まれていた。それぞれの形質転換体を、２つの前記のプロテアーゼの機能喪失変異の一方または両方を含ませて生成した。

【0055】

実施例５
液体培地中のタンパク質分解活性の決定
ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）プロテアーゼアッセイキットを用いた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅ６６３８）。その直接的な蛍光に基づくアッセイは、金属プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼおよびスルフヒドリルプロテアーゼを検出する。そのアッセイキットは、ｐＨ非感受性緑色蛍光性ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ（Ｅ６６３８）色素で標識されているカゼイン誘導体を含有し、それは結果としてそのコンジュゲートの蛍光のほとんど完全な消光をもたらす。プロテアーゼに触媒される加水分解は蛍光性ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ色素で標識されたペプチドを遊離させる。分光蛍光計、ミニ蛍光計またはマイクロプレートリーダーを用いて測定することができる蛍光におけるそれに伴う増大は、プロテアーゼ活性に比例している。

【0056】

中性プロテアーゼが発現していない試料（“ナル試料”）を用いて対照実験を行った。予め決定された量の商業的に入手可能な中性プロテアーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｍａｎｈｅｉｍ、ドイツ、カタログ番号０４９４２０８６００１）を添加した“ナル試料”が含まれる試料を用いて追加の対照を作製した。

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]