特許 6282789 ＲＯＲ−ガンマ−ｔの阻害に有用な化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6282789

(24)【登録日】2018年2月2日

(45)【発行日】2018年2月21日

(54)【発明の名称】ＲＯＲ−ガンマ−ｔの阻害に有用な化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 495/20 20060101AFI20180208BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20180208BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20180208BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20180208BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20180208BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20180208BHJP

【ＦＩ】

   C07D495/20CSP

   A61K31/506

   A61K45/00

   A61P17/06

   A61P19/02

   A61P37/00

【請求項の数】11

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2017-542876(P2017-542876)

(86)(22)【出願日】2016年9月6日

(86)【国際出願番号】US2016050374

(87)【国際公開番号】WO2017044410

(87)【国際公開日】20170316

【審査請求日】2017年8月15日

(31)【優先権主張番号】62/215,929

(32)【優先日】2015年9月9日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100147131

【弁理士】

【氏名又は名称】今里 崇之

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】モーフィー，ジョン リチャード

【審査官】 三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５１２９２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５１０８７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５１０８５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／１０１９２８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式の化合物

【化1】

またはその医薬的に許容可能な塩。

【請求項2】

以下の式の請求項１に記載の化合物

【化2】

またはその医薬的に許容可能な塩。

【請求項3】

以下の式の請求項１または２に記載の化合物。

【化3】

【請求項4】

請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む、乾癬を治療するための医薬組成物。

【請求項5】

請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む、血清反応陰性脊椎関節症を治療するための医薬組成物。

【請求項6】

請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む、体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎を治療するための医薬組成物。

【請求項7】

一つまたは複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

一つまたは複数のその他の治療薬と併用される、請求項４〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

乾癬の治療のための薬剤の製造における請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用。

【請求項10】

血清反応陰性脊椎関節症の治療のための薬剤の製造における請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用。

【請求項11】

体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎を治療するための薬剤の製造における請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はレチノイン酸受容体関連オーファン受容体ガンマ−ｔ（ＲＯＲγｔ）を阻害するのに有用な化合物、医薬組成物、およびＲＯＲγ活性に関連する疾患を治療する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

レチノイン酸受容体関連オーファン受容体（ＲＯＲ）は、多くの疾患において重要な病理学的制御因子として確認されている核内受容体（ＮＲ）スーパーファミリーのメンバーである。ＲＯＲサブファミリーは、ＲＯＲα、ＲＯＲβおよびＲＯＲγから構成される。マウスおよびヒトＲＯＲγ遺伝子は、γ１とγ２との２つのアイソフォームを生成し、後者はγｔとして言及されることが最も多い。ＲＯＲγｔシグナル伝達は、ＩＬ−２３／ＩＬ−２３シグナル伝達に反応することが多く、ナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ１７と名付けられ、古典的なＴｈ１およびＴｈ２細胞と区別されるＴ細胞のサブセットに分化するのに必要とされ、それらの維持を支持する。Ｔｈ１７細胞はインターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７）およびＩＬ−１７Ｆを産生する。さらにＴｈ１７細胞は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１およびＣＣＬ２０を含む、炎症反応を駆動することで知られるある範囲のその他の因子を産生する。ＮＫ細胞およびリンパ組織誘導（ＬＴｉ）様細胞等の自然リンパ球系細胞は、ＩＬ−２３受容体およびＲＯＲγｔを発現し、刺激およびＩＬ−２３に応答して、ＩＬ−１７を産生する。ＩＬ−２３応答性、ＲＯＲγｔ、およびＩＬ−１７発現細胞が自己免疫疾患（ＡＩ）、炎症性疾患およびがんに関連しているという実質的な証拠がある。したがって、ＲＯＲγｔの標的阻害は、上記の疾患の病態形成を減少させるために重要となりうる。

【0003】

ＡＩ疾患は、現在、治癒が存在しない慢性病態である。ＡＩ疾患の治療は、抗炎症、抗疼痛または免疫抑制薬を投与することによって、疾患のプロセスを制御し、症状を減少させる試みに関係している。残念ながら、抗炎症および抗疼痛薬の使用は、効果がないことがあり、免疫抑制薬の使用は壊滅的な長期の副作用をもたらすことが多い。免疫抑制薬の最も重い副作用は、感染症のリスクの増加および癌発症のより高いリスクである。

【0004】

ＲＯＲγｔに対する自然および合成リガンドが確認されている。ＲＯＲγｔに対する小分子阻害剤が、ＡＩの文献で報告されている。国際特許第２０１５／０１７３３５号および国際特許第２０１４／１７９５６４号を参照のこと。しかしながら、現在の治療薬の非有効性または壊滅的な副作用と結びつくＡＩ疾患の有病率から、患者にとってより多くの治療の選択肢を利用できるようにする必要がある。ＲＯＲγｔを標的とすることは、生体防御を抑制するリスクを最小限にしながら病原体の免疫細胞を標的することによる治療効果を最大にすることによって、現在のＡＩ治療法を上回る利点を提示しうる。

【0005】

本発明はＲＯＲγｔ阻害剤である新規化合物を提供している。当該新規化合物は、ぶどう膜炎、多発性硬化症、関節リウマチ、移植片対宿主病、クローン病、その他の炎症性腸疾患、がん、乾癬、ならびに体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎および乾癬性関節炎等の血清反応陰性脊椎関節症に潜在的、効果的な治療の必要性を導くと考えられる。

【発明を実施するための形態】

【0006】

本発明は以下の式の化合物、

【化1】

またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。

【0007】

本発明はまた、治療を必要とする患者に、本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を投与することを含む、患者の乾癬を治療する方法を提供する。さらに、本発明は、治療を必要とする患者に、本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を投与することを含む、患者の血清反応陰性脊椎関節症を治療する方法を提供する。当該実施形態では、血清反応陰性脊椎関節症は、体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎である。

【0008】

本発明は、一つまたは複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態では、組成物は一つまたは複数のその他の治療薬をさらに含む。さらなる実施形態では、本発明は、一つまたは複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む、乾癬を治療するための医薬組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、一つまたは複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を含む、血清反応陰性脊椎関節症を治療するための医薬組成物を提供する。当該実施形態では、血清反応陰性脊椎関節症は、体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎である。

【0009】

さらに、本発明は、特に乾癬を治療するための治療法に使用される、本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。さらに、本発明は、乾癬の治療に使用される、本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、乾癬を治療するための治療薬を製造するために、本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用を提供する。

【0010】

さらに、本発明は、特に血清反応陰性脊椎関節症を治療するための治療法に使用される、本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。さらに、本発明は、血清反応陰性脊椎関節症の治療に使用される、本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、血清反応陰性脊椎関節症を治療するための治療薬を製造するために、本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用を提供する。前記実施形態では、血清反応陰性脊椎関節症は、体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎である。

【0011】

本発明はまた、本発明の化合物を合成するのに有用な中間体および工程を含む。

【0012】

「治療すること」（または「治療する」もしくは「治療」）という用語は、本明細書で使用するとき、既存の症状、病態または障害の進行または重症度を抑制する、遅延させる、止める、または逆転させることを指す。

【0013】

「脊椎関節症」という用語は、脊椎ならびに靭帯および腱が骨に付着している領域に一般的に関係するいくつかの慢性関節疾患を指す。脊椎関節症（spondylarthropathies）は、脊椎関節症（spondyloarthropathies）、または脊椎関節炎（spondyloarthritis）とも呼ばれることがある。

【0014】

「血清陰性」という用語は、リウマトイド因子が陰性である疾患を指す。

【0015】

本発明の化合物は、医薬的に許容可能な塩を形成するために反応させることができる。医薬的に許容可能な塩およびその一般的な調製方法は、当該技術分野で既知である。例えば、P. Stahl,ら. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 改訂版２版 (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge,ら, “Pharmaceutical Salts,” Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977を参照のこと。

【0016】

当業者は、（Ｉ）に示される本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩が、^＊以下に示される少なくとも２つのキラル中心を含むコアから構成されることを認識している。

【化2】

（Ｉ）

【0017】

本発明は全ての個別のエナンチオマー、およびラセミ体を含む前記化合物のエナンチオマーの混合物を考慮しているが、本発明の好ましい化合物は以下の（ＩＩ）によって示される化合物

【化3】

（ＩＩ）
またはその医薬的に許容可能な塩である。

【0018】

当業者はまた、全てのキラル中心について、カーン・インゴルド・プレローグ順位則（Ｒ）または（Ｓ）方向が、特定の化合物の置換パターンによって変化することを理解している。単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、キラル試薬から始まり、または立体選択的または立体特異的合成手法によって調製することができる。あるいは、単一のエナンチオマーまたはジアステレオマーは、本発明の化合物の合成の任意の都合の良い地点で、標準的なキラルクロマトグラフィーまたは結晶化手法によって、混合物から単離させることができる。本発明の化合物の単一のエナンチオマーが、本発明の好ましい実施形態である。

【0019】

本発明の化合物は、好ましくは、様々な投与経路で投与される医薬組成物として製剤化される。当該医薬組成物および同医薬組成物を調製する工程は、当該技術分野で既知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, ら, eds., 第２１版, Mack Publishing Co., 2005)を参照のこと。より特に好ましくは、以下の式の化合物を含む組成物

【化4】

またはその医薬的に許容可能な塩および一つまたは複数の医薬的に許容可能な担体または希釈剤である。

【0020】

本発明の特に好ましい実施形態は、化合物（５’Ｓ）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｒ）−１−［２−トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３，ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド

【化5】

またはその医薬的に許容可能な塩に関する。

【0021】

本発明の別の特に好ましい実施形態は、以下の化合物に関する。

【化6】

【0022】

本発明の化合物は一般的に、広い投与量範囲で有効である。例えば、１日あたりの投与量は、約１ｍｇ〜１ｇの範囲にある。いくつかの例では、前述の範囲の下限を下回る投与レベルが十二分に適切である場合もあり、他の場合では、好ましいベネフィット／リスク特性を維持しながら、多量の投与量を使用してもよく、したがって、投与量範囲を上回ることは、いかなる場合も本発明の範囲を限定することを意図していない。実際に投与される化合物の量は、治療条件、選択した投与経路、投与される実際の一つまたは複数の化合物、年齢、体重、個々の患者の反応、患者の症状の重症度を含む、関連する状況に照らして、医師によって決定されることは理解される。

【0023】

個別の異性体、エナンチオマーおよびジアステレオマーは、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィー等の方法によって、式Ｉの化合物の合成における通常の地点で、当業者によって分割されたり、溶解されてもよい（例えば、J. Jacques,ら, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981およびE.L. Eliel and S.H. Wilen,” Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994を参照のこと）。「異性体１」および「異性体２」の方向は、それぞれ第一および第二のキラルクロマトグラフィーから溶出する化合物を指し、合成の初期にキラルクロマトグラフィーを開始する場合、同方向は次の中間体および例に適用される。

【0024】

さらに、本明細書に記載の特定の中間体は一つまたは複数の保護基を含んでいてもよい。可変の保護基は、特定の反応条件および実施される特定の変換によって、各出現で同じであっても異なっていてもよい。保護および脱保護条件は当業者に既知であり、文献に記載されている（例えば、“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007を参照のこと。）

【0025】

特定の略語は以下に記載する。「ＡＵＣ」は曲線下の領域を指し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ＣＦＡ」はフロイント完全アジュバントを指し、「ＤＢＡ」はdilute brown non-Agoutiを指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し、「ＤＰＢＳ」はダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を指し、「ＤＭＥＭ」はダルベッコ変法イーグル培地を指し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指し、「ＥＣ_５０」は半数効果濃度（the effective concentration at half the maximal response）を指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「Ｅｔ_２Ｏ」はエチルエーテルを指し、「ＥｔＯＨ」はエチルアルコールまたはエタノールを指し、「ｅｅ」は鏡像体過剰率を指し、「Ｅｘ」は例を指し、「ＦＢＳ」はウシ胎仔血清を指し、「Ｇ」は重力を指し、「ＧＡＬ」はベータガラクトシダーゼＤＮＡ結合領域を指し、「ＧＰＩ」はグルコース−６−リン酸異性化酵素を指し、「ＨＥＣ」はヒドロキシエチルセルロースを指し、「ＨＥＫ」はヒト胎児性腎臓細胞を指し、「ＨＥＰＥＳ」は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を指し、「ＩＣ_５０」は薬剤に可能な最大阻害反応の５０％を作り出す当該薬剤の濃度を指し、「ＩＬ」はインターロイキンを指し、「ＩＰＡ」はイソプロピルアルコールまたはイソプロパノールを指し、「Ｋｄ」は解離定数を指し、「Ｋｉ」は阻害定数を指し、「ＭｅＯＨ」はメチルアルコールまたはメタノールを指し、「ＭＥＭ」は最小必須培地を指し、「ＰＢＭＣ」は末梢血単核球を指し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝食塩水を指し、「Ｐｒｅｐ」は調製を指し、「ＲＡＲ」はレチノイン酸受容体を指し、「ＲＰＭＩ」はロズウェルパーク記念研究所を指す。「Ｒ_ｔ」は保持時間を指し、「ＳＣＸ」は強カチオン交換を指し、「ＳＦＣ」は超臨界流体クロマトグラフィーを指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指す。

【0026】

本発明の化合物またはその塩は、当該技術分野で既知の様々な方法で調製することができ、そのいくつかを以下の調製および実施例で説明する。記載の各経路の特定の合成ステップは、異なる方法で組み合わせて、本発明の化合物またはその塩を調製することができる。以下の各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕および結晶化を含む当該技術分野で既知の通常の方法で回収することができる。当業者は試薬および開始材料を容易に入手することができる。

【0027】

以下の調製および実施例はさらに、本発明を説明し、本発明の化合物の典型的な合成を示している。
本発明は以下を提供する。
［１］
以下の式の化合物

【化1】

またはその医薬的に許容可能な塩。
［２］
以下の式の請求項１に記載の化合物

【化2】

またはその医薬的に許容可能な塩。
［３］
以下の式の請求項１または２に記載の化合物。

【化3】

［４］
一つまたは複数の医薬的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を含む医薬組成物またはその医薬的に許容可能な塩。
［５］
一つまたは複数のその他の治療薬を含む請求項４に記載の医薬組成物。
［６］
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を治療が必要な患者に投与することを含む、乾癬を治療する方法。
［７］
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を治療が必要な患者に投与することを含む、血清反応陰性脊椎関節症を治療する方法。
［８］
体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎を治療するための請求項７に記載の方法。
［９］
治療に使用するための請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［１０］
乾癬の治療に使用するための請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［１１］
血清反応陰性脊椎関節症の治療に使用するための請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［１２］
体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎の治療に使用するための請求項１１に記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩。
［１３］
乾癬の治療のための薬剤の製造における請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用。
［１４］
血清反応陰性脊椎関節症の治療のための薬剤の製造における請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用。
［１５］
体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎を治療するための薬剤の製造のための請求項１４に記載の使用。

【実施例】

【0028】

調製および実施例
調製１
１−（３−チエニル）プロパン−２−オン

【化7】

無水酢酸（８７．９ｍＬ、９１３ｍｍｏｌ）中の２−（３−チエニル）酢酸（２６．５ｇ、１４６．５ｍｍｏｌ）を懸濁し、１−メチルイミダゾール（７．５７ｇ、９１．３ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を窒素下、室温で４時間攪拌する。反応混合物を０℃に冷却し、水（１５０ｍＬ）を添加し、１時間攪拌する。ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で溶液を希釈し、２Ｍ ＮａＯＨ（２００ｍｌを２回）、水（２００ｍＬ）およびブライン（２００ｍＬ）で連続して洗浄する。有機抽出相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発乾固し、黄色の油として標題化合物（２８．１６ｇ、７７％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ ２．１４（ｓ ３Ｈ）、３．７（ｓ、２Ｈ）、６．９４（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．０８（ｂｓ、１Ｈ）、７．２９−７．２６（ｍ、１Ｈ）。

【0029】

調製２
１−（３−チエニル）プロパン−２−オール

【化8】

水素化ホウ素ナトリウム（１．６１ｇ、４１．６７ｍｍｏｌ）に乾燥したＭｅＯＨ（６３ｍＬ）を添加し、ＭｅＯＨを添加しながら反応混合物を−１０℃に冷却する。さらに−２０℃に冷却し、乾燥したＭｅＯＨ（２６．７ｍＬ）中の１−（３−チエニル）プロパン−２−オン（４．９２ｇ、３３．３４ｍｍｏｌ）の溶液を４０分にわたって滴下し、−２０℃で１．５時間攪拌し、その後、室温で１７時間攪拌する。当該溶液を−５℃（内部温度）に冷却し、塩化アンモニウムの飽和溶液（１５ｍｌ）、その後１Ｎ ＨＣｌ（１５ｍＬ）でクエンチする。水（３０ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を添加する。減圧下で混合物を総量の１／３に濃縮する。ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬを２回）で混合物を抽出する。有機抽出物を一つに合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、乾燥濃縮し、標題化合物（４．７４ｇ、１００％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：１２５（Ｍ−ＯＨ＋Ｈ）、１６４．８（Ｍ＋Ｎａ）。

【0030】

代替の調製２ａ
ＭｅＯＨ（２８２ｍＬ）中の１−（３−チエニル）プロパン−２−オン（２８．１６ｇ、１４０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（７．０６ｇ、１８２．８ｍｍｏｌ）を３０分かけて０℃で滴下し、室温で一晩攪拌する。乾燥濃縮し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、塩化アンモニウムの飽和溶液（１５０ｍＬ）で洗浄する。ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬを２回）で水性層を抽出する。有機抽出物を一つに合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。ＭｅＯＨ：ＤＣＭ（０：１００〜５：９５）で溶出するシリカゲルフラッシュゲルクロマトグラフィーによって残渣を精製し、淡赤色の油として標題化合物（１２．８５ｇ、６４％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：１２５（Ｍ−ＯＨ＋Ｈ）。

【0031】

調製３
（２Ｓ）−１−（３−チエニル）プロパン−２−オール

【化9】

無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）およびトルエン（１００ｍＬ）に３−ブロモチオフェン（６．８８ｇ、４２．２ｍｍｏｌ）を溶解する。−７８℃に冷却する。当該溶液にｓｅｃ−ブチルリチウム（シクロヘキサン中１．３ｍｏｌ／Ｌ、３４ｍＬ、４４ｍｍｏｌ）をシリンジで１５分かけて添加する。温度を−６０℃未満に保持し、１０分間攪拌し、その後（２Ｓ）−２−メチルオキシラン（４．９ｇ、８４．４ｍｍｏｌ）を滴下する。５分後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（５．３ｍＬ、４２ｍｍｏｌ）を滴下漏斗で１５分かけて添加する。温度を−５５℃未満に保持する。添加が完了した後、−７８℃で２時間攪拌する。飽和炭酸水素ナトリウムで−７８℃でクエンチし、Ｅｔ_２Ｏを添加し、周囲温度に温める。飽和炭酸水素ナトリウム（２回）で洗浄し、その後飽和ブラインで洗浄する。硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。１５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、標題化合物（３．８５ｇ、６４．２％）を得る。混合した画分を再精製し、無色液体として標題化合物（４．２９ｇ、７１．５％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）δ ７．２８−７．２６（ｄｄ、Ｊ＝２．９、５．０、１Ｈ）、７．０３−７．０１（ｍ、１Ｈ）、６．９６（ｄｄ、Ｊ＝１．２、４．９、１Ｈ）、４．０４−３．９５（ｍ、１Ｈ）、２．８３−２．６８（ｍ、２Ｈ）、１．６３（ｓ、１Ｈ）、１．２２（ｄ、Ｊ＝６．２、３Ｈ）、ＯＲ［α］^２０Ｄ＋２５．５０（ｃ １．００、ＣＨＣｌ_３）。

【0032】

調製４
（５’Ｓ）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］

【化10】

ｔｅｒｔ−ブチル４−オキソピペリジン−１−カルボン酸（６．５０ｇ、３２．６ｍｍｏｌ）および（２Ｓ）−１−（３−チエニル）プロパン−２−オール（４．６４ｇ、３２．６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解する。トリフルオロ酢酸（２０ｍＬ、２６４．５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を周囲温度で１８時間攪拌する。混合物を減圧下で濃縮し、水およびＥｔ_２Ｏを添加する。有機層を水で洗浄し、洗浄した水性層を一つに合わせ、固体の炭酸ナトリウムでｐＨを塩基に調節する。固体の塩化ナトリウムで水性層を飽和し、ＥｔＯＡｃ（５回）で水性層を洗浄する。ＥｔＯＡｃ層を一つに合わせ、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、淡黄色の油として標題化合物（４．６１ｇ、６３％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：２２４．２（Ｍ＋Ｈ）。

【0033】

調製５
ｔｅｒｔ−ブチル（５’Ｓ）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−１−カルボン酸

【化11】

（５’Ｓ）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］（１０．３９ｇ、４６．５３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解する。二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１１．５２ｍＬ、５１．１８ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を周囲温度で１．５時間攪拌する。追加の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２．００ｍＬ、９．１７ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間攪拌し、減圧下で濃縮する。イミダゾール（２．２１ｇ、３２．５ｍｍｏｌ）を添加し、過剰な二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを破壊する（Synthesis、2001、No.4,550）。Ｅｔ_２Ｏを添加し、ブラインで洗浄する。硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。１０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。１５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで再精製し、無色油として標題化合物（１２．９２ｇ、８６％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ、ｄ_６−ＤＭＳＯ）δ ７．３３（ｄ、Ｊ＝５．１、１Ｈ）、６．７７（ｄ、Ｊ＝５．１、１Ｈ）、３．９２−３．７２（ｍ、３Ｈ）、３．１５−２．９１（ｓ、２Ｈ）、２．６２（ｄｄ、Ｊ＝１５．８、３．０、１Ｈ）、２．３０（ｄｄ、Ｊ＝１５．８、１０．６、１Ｈ）、２．１（ｍ、１Ｈ）、１．７６−１．６３（ｍ、２Ｈ）、１．５１−１．４０（ｍ、１Ｈ）、１．３８（ｓ、９Ｈ）、１．２４（ｄ、Ｊ＝６．２、３Ｈ）、ＳＦＣクロマトグラフィーに基づく１００％ ｅｅ、Ｌｕｘ Ａｍｙｌｏｓｅ−２、５ｍＬ／分、２２５ｎｍ、Ｒ_ｔ＝１．７５分、ＯＲ［α］^２０Ｄ＋８２．１（ｃ １．００、ＣＨＣｌ_３）。

【0034】

調製６
ｔｅｒｔ−ブチル−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−１−カルボン酸

【化12】

乾燥ＤＣＭ（１３５ｍＬ）中１−（３−チエニル）プロパン−２−オール（１２．８５ｇ、９０．３５ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル ４−オキソピペリジン−１−カルボン酸（２３．４０ｇ、１１７．５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（３４．１６ｍＬ、４５１．８ｍｍｏｌ）を０℃で滴下し、室温で１７時間攪拌し続ける。混合物を乾燥濃縮し、ＭｅＯＨで残渣を希釈し、その後、減圧下で溶媒を除去する。ＭｅＯＨ中の残渣を取り出し、イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。所望の生成物を含む層を一つに合わせ、減圧下で濃縮し、トルエン（３回）で共蒸着し、淡オレンジ色の固体の粗５−メチルスピロ［４，５−ジヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピラン−７，４’−ピペリジン］を得る。４−ジメチルアミノピリジン（２．２３ｇ、１８．０７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３７．８ｍＬ、２７１．１ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（９０．３５ｍＬ）中の５−メチルスピロ［４，５−ジヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピラン−７，４’−ピペリジン］（２０．１８ｇ、９０．３５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下し、０℃に冷却する。当該溶液に、乾燥ＤＣＭ（２７．１ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（３０．４９ｇ、１３５．５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下する。室温で一晩攪拌する。水（１００ｍＬ）を添加し、水性層をＤＣＭ（１００ｍＬを３回）で抽出し、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で濃縮する。ＥｔＯＡｃ：イソ−ヘキサン（０：１００〜２０：８０）で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。残渣をＤＣＭ（３回）で共蒸着し、白色固体として標題化合物（２７．６４ｇ、９２．７％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３４６（Ｍ＋Ｎａ）。

【0035】

代替の調製６ａ
ｔｅｒｔ−ブチル−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−１−カルボン酸
乾燥ＤＣＭ（１００ｍＬ）中１−（３−チエニル）プロパン−２−オール（４．７４ｇ、３３．３４ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル ４−オキソピペリジン−１−カルボン酸（７．８０ｇ、３８．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（２０．１７ｍＬ、２６６．７２ｍｍｏｌ）を０℃で滴下し、室温で一晩攪拌する。混合物を乾燥濃縮し、残渣をＭｅＯＨで希釈する。イオン交換クロマトグラフィーによって粗物質を精製する。所望の生成物を含む層を一つに合わせ、減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（３回）で共蒸着し、粗５−メチルスピロ［４，５−ジヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピラン−７，４’−ピペリジン］（８．１７ｇ）を得る。４−ジメチルアミノピリジン（０．８３１ｇ、６．６７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（９．２９ｍＬ、６６．６８ｍｍｏｌ）を、０℃に冷却した乾燥ＤＣＭ（６６．７ｍＬ）中の５−メチルスピロ［４，５−ジヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピラン−７，４’−ピペリジン］（８．１７ｇ）の溶液に添加する。当該溶液に、乾燥ＤＣＭ（１６．７ｍＬ）中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルの溶液（１８．１９ｇ、８３．３５ｍｍｏｌ）を滴下する。室温で３日間攪拌する。水（６０ｍＬ）を添加し、水性層をＤＣＭ（５０ｍＬを３回）で抽出し、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、分相器で濾過し、減圧下で濃縮する。ＥｔＯＡｃ：イソ−ヘキサン（０：１００〜２０：８０）で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって残渣を精製する。残渣をＤＣＭ（２回）で共蒸着し、標題化合物（９．４１ｇ、８０％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３４６（Ｍ＋Ｎａ）。

【0036】

調製７
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−２’−カルボン酸

【化13】

ｔｅｒｔ−ブチル−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−１−カルボン酸（７．１６ｇ、２１．７１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０８．５ｍＬ）に溶解し、−７８℃に冷却する。当該溶液にブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、１３ｍＬ、３２．５６ｍｍｏｌ）を２０分かけて滴下し、添加が完了した後、混合物を追加で３０分間攪拌する。カニューレを経由してＣＯ_２中で泡立て、ＣＯ_２を連続して添加しながら１時間、当該温度で攪拌し続ける。反応物をＣＯ_２を連続して添加しながら、２時間かけて０℃に温め、水（８０ｍＬ）で注意深くクエンチする。反応混合物を水に注ぎ、水性層をＥｔ_２Ｏ（１００ｍＬ）で抽出する。有機相を２Ｎ ＮａＯＨ（１５ｍＬを３回）および水（５０ｍＬ）で洗浄する。水性層を２Ｎ ＨＣｌ（３回）でｐＨ＝６に酸性にし、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機抽出物を一つに合わせ、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、灰白色の固体として標題化合物（７．８９ｇ、９７％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３９０（Ｍ＋Ｎａ）。

【0037】

調製８
１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−２’−カルボン酸

【化14】

ｔｅｒｔ−ブチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−１−カルボン酸（J. Med. Chem., 2011, 54, (8), pp 2687-2700および国際特許第２０１１０６００３５号に記載のように調製する）（１０ｇ、３２．３２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解し、−７８℃に冷却する。当該溶液にブチルリチウム（２２．２２ｍＬ、３５．５５ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下し、添加が完了した後、混合物を追加で１５分間攪拌する。カニューレを経由してＣＯ_２中で泡立て、ＣＯ_２を連続して添加しながら混合物を室温に温める。２時間後、混合物を０℃に冷却し、水を添加し、次にＥｔ_２Ｏを添加する。水性層を１Ｎ ＮａＯＨで塩基にし、有機層を１Ｎ ＮａＯＨ（３回）で洗浄する。洗浄した塩基を一つに合わせ、５Ｎ ＨＣｌでｐＨ２に酸性にする。水性層をＥｔＯＡｃ（３回）で洗浄し、有機抽出物を一つに合わせ、ブラインで洗浄する。硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、白色固体として標題化合物（１１．１１ｇ、９７．２７％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３５２．２（Ｍ−Ｈ）。

【0038】

調製９
（５’Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５’−メチル−４’，５’ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−２’−カルボン酸

【化15】

ｔｅｒｔ−ブチル（５’Ｓ）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−１−カルボン酸（１１．１９ｇ、３４．６０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解し、−７８℃に冷却する。ｎ−ブチルリチウム（２１ｍＬ、３４．６４ｍｍｏｌ）を２０分かけて滴下する。添加が完了した後、−７８℃で２０分間攪拌し、カニューレを経由してＣＯ_２ガス中で６０分間泡立てる。ＣＯ_２を連続して添加しながら、混合物を室温に温める。室温で１時間攪拌した後、水（３ｍＬ）でクエンチし、減圧下で２５％の容量まで濃縮する。Ｅｔ_２Ｏおよび水を添加する。水（２回）で洗浄し、洗浄した水性層を一つに合わせる。１Ｎ ＨＣｌでｐＨを酸性に調節する。塩化ナトリウムで水性層を飽和し、ＥｔＯＡｃ（２回）で抽出する。ＥｔＯＡｃ抽出物を一つに合わせ、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、白色の泡として標題化合物（１３．４０ｇ、１００％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：３６６（Ｍ−Ｈ）。

【0039】

調製１０
５−（エチルスルファニル）ピリジン−２−カルボニトリル

【化16】

５−ブロモピリジン−２−カルボニトリル（４９．４２ｇ、２７０．１ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１１３．５ｇ、８２１．２ｍｍｏｌ）を１−メチル−２−ピロリジノン（２８０ｍＬ）に溶解し、温度が５０℃未満になるように、エタンチオール（２６．４ｍＬ、３５６ｍｍｏｌ）を３０分かけて、分けて添加する。反応物を室温に冷却し、一晩攪拌する。ＥｔＯＡｃ（１２００ｍＬ）および水（２２００ｍＬ）で希釈する。有機層を回収し、ブライン（３００ｍＬを３回）で洗浄し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、灰白色の固体として標題化合物（４４．８７ｇ、１００％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ、ｄ_６−ＤＭＳＯ）δ ８．６３（ｓ、１Ｈ）、７．９３（ｓ、２Ｈ）、３．１７（ｑ、Ｊ＝７．３、２Ｈ）、１．２９（ｔ、Ｊ＝７．３、３Ｈ）。

【0040】

調製１１
５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−カルボニトリル

【化17】

無水ＤＣＭ（５４０ｍＬ）に５−（エチルスルファニル）ピリジン−２−カルボニトリル（４４．３６ｇ、２７０．１ｍｍｏｌ）に溶解し、−２０℃に冷却する。内部温度を０℃〜−１０℃に保持しながら、３−クロロペルオキシ安息香酸（１３０ｇ、５６５．０ｍｍｏｌ）を１０〜１２ｇずつ分けて１時間かけて添加する。反応混合物を氷浴で攪拌し、室温に一晩温める。１Ｎ ＮａＯＨ（１Ｌ）、水、１Ｎ ＮａＯＨ（５００ｍＬを２回）およびブラインで洗浄する。硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、白色固体として標題化合物（４９．５２ｇ、９３％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ、ｄ_６−ＤＭＳＯ）δ ９．２０（ｄ、Ｊ＝１．９、１Ｈ）、８．５６（ｄｄ、Ｊ＝２．０、８．１、１Ｈ）、８．３６（ｄ、Ｊ＝８．１、１Ｈ）、３．５２（ｑ、Ｊ＝７．３、２Ｈ）、１．１６（ｔ、Ｊ＝７．５、３Ｈ）。

【0041】

調製１２
１−［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メタンアミン塩酸塩

【化18】

５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−カルボニトリル（４９．５２ｇ、２５２．４ｍｍｏｌ）を、１６．５ｇの３つに分ける。Ｎ_２下、２２５０ｍＬのＰａｒｒボトル中、１０％のＰｄ／Ｃ（１．６５ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）を容器に添加し、ＭｅＯＨ（７５０ｍＬ）で湿らす。当該溶液に、ＭｅＯＨ（７５０ｍＬ）に溶解した５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−カルボニトリル（１６．５ｇ、８４．０９ｍｍｏｌ）を添加する。当該溶液にＨＣｌ（６Ｎ水性、１７．１ｍｌ、１０２．６ｍｍｏｌ）を添加する。ボトルを密封し、Ｎ_２でパージし、Ｈ_２でパージし、室温で３時間６８．９ｋＰａに圧力をかける。Ｎ_２でパージし、その後、混合物を濾過する。残りの分けられた５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−カルボニトリルにも上記のことを繰り返す。濾過物すべてを一つに合わせ、減圧下で濃縮し、ベージュ色の固体として標題化合物（５９．６１ｇ、９９％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：２０１（Ｍ＋Ｈ−ＨＣｌ）。

【0042】

調製１３
ｔｅｒｔ−ブチル ２’−（｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝カルバモイル）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３，ｃ］ピラン］−１−カルボン酸

【化19】

無水ＤＣＭ（５２ｍＬ）に、１−［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メタンアミン塩酸塩（３．１ｇ、１３ｍｍｏｌ）、１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−２’−カルボン酸（３．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）を溶解する。０℃に冷却し、トリメチルアミン（１０ｍＬ、７３ｍｍｏｌ）を滴下し、次にＥｔＯＡｃ中の２，４，６−トリプロピル−１，３，４，２，４，６−トリオキサトリホスホリナン−２，４，６−三酸化物（８．６ｇ、１４ｍｍｏｌ）の１．６７Ｍ溶液を滴下する。混合物を室温に温め、一晩攪拌する。水（５０ｍＬ）を注意深く添加し、室温で１０分間攪拌する。水性層をＤＣＭ（２回）で抽出し、有機抽出物を一つに合わせる。有機抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。５０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで粗物質を精製し、黄色の泡として標題化合物（４．８９ｇ、８３％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：５５０（Ｍ＋Ｈ）。

【0043】

調製１４
ｔｅｒｔ−ブチル（５’Ｓ）−２’−（｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝カルバモイル）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３，ｃ］ピラン］−１−カルボン酸

【化20】

無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）およびジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）に、１−［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メタンアミン塩酸塩（２．８６ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）、（５’Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５’−メチル−４’，５’ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−２’−カルボン酸（３．５０ｇ、９．５２ｍｍｏｌ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．４４ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を溶解する。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．９８ｍＬ、２８．６ｍｍｏｌ）を添加し、次に１−（３−ジメチルアミノプロピ）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を添加し、室温で一晩攪拌する。減圧下で約４０％の容量まで濃縮し、その後、ＥｔＯＡｃを添加する。飽和炭酸水素ナトリウム（２回）、水（２回）、ブライン（２回）で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。８０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンでシリカゲルクロマトグラフィーを行い、灰色の泡として標題化合物（４．５１ｇ、８６％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：５５０（Ｍ＋Ｈ）。

【0044】

調製１５
Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−４’，５’，ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３，ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド二塩酸塩

【化21】

ｔｅｒｔ−ブチル ２’−（｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝カルバモイル）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３，ｃ］ピラン］−１−カルボン酸（０．９５ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解し、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ（４．５ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を添加する。室温で１時間攪拌し、減圧下で濃縮し、白色固体として標題化合物（０．８６ｇ、１００％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４５０（Ｍ＋Ｈ−２ＨＣｌ）。

【0045】

調製１６
（５’Ｓ）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−４’，５’，ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３，ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド二塩酸塩

【化22】

ｔｅｒｔ−ブチル（５’Ｓ）−２’−（｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝カルバモイル）−５’−メチル−４’，５’−ジヒドロ−１Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３，ｃ］ピラン］−１−カルボン酸（１．１４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、１，４ジオキサン（１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解する。ジオキサン中の４Ｍ Ｈｃｌ（５．０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間攪拌する。約１０ｍＬに濃縮し、その後Ｅｔ_２Ｏを添加し、一晩強く攪拌する。ヘキサンを添加し、濾過し、ヘキサンでリンスし、淡黄色の固体として標題化合物（０．９９ｇ、９１％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：４５０（Ｍ＋Ｈ−２ＨＣｌ）。

【0046】

調製１７
１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エタノール

【化23】

２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−カルバルデヒド（１１．３１ｍｍｏｌ、１．９９２ｇ）をＴＨＦ（５６．５６ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、メチルマグネシウム臭化物（Ｅｔ_２Ｏ中の３Ｍ）（３３．９４ｍｍｏｌ、１１．３１ｍＬ）をゆっくりと添加する。反応物を室温に温め、２．５時間攪拌する。反応物を１Ｎ ＨＣｌでクエンチする。ＥｔＯＡｃを添加し、１Ｎ ＨＣｌで洗浄する。硫酸ナトリウムで有機物を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、標題化合物（１．６６３ｇ、７６．５％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：１９３．０（Ｍ＋Ｈ）

【0047】

調製１８
５−（１−ブロモエチル）−２−（トリフルオロメチル）ピリミジン

【化24】

１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エタノール（８．６５５ｍｍｏｌ、１．６６３ｇ）およびトリフェニルホスフィン（１２．９８ｍｍｏｌ、３．４０５ｇ）をＤＣＭ（８６．５５ｍＬ）に溶解し、室温でＮ−ブロモスクシンイミド（１２．９８ｍｍｏｌ、２．３１１ｇ）を添加する。３時間後、反応物を減圧下で濃縮する。得られた残渣を、１０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、標題化合物（１．６４１ｇ、７４．３４％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ、ｄ_６−ＤＭＳＯ）δ ９．２６（ｓ、２Ｈ）、５．６３（ｑ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．０９（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、３Ｈ）。

【0048】

実施例１
Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド

【化25】

Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−４’，５’，ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３，ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド二塩酸塩（１．１２ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１１．６ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（２．４２ｍＬ、１３．９ｍｍｏｌ）に溶解し、５−（１−ブロモエチル）−２−（トリフルオロメチル）ピリミジン（０．７１ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を６０℃で９０分間加熱し、周囲温度に冷却し、減圧下で濃縮する。粗混合物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、５０ｇのＳＣＸカラムに充填する。ＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）でフラッシュし、２Ｎ アンモニア／ＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）で生成物を溶出する。アンモニア／ＭｅＯＨ洗浄物を減圧下で濃縮し、オレンジ色の泡を得る。粗物質に１００％のＤＣＭ〜９５％のＤＣＭ／ＭｅＯＨ勾配で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーを行い、標題化合物（１．５４ｇ、４３％）を得る。質量スペクトル（ｍ／ｚ）：６２４（Ｍ＋Ｈ）。

【0049】

実施例２
（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｓ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド

【化26】

【0050】

実施例３
（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｒ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド

【化27】

【0051】

実施例４
（５Ｒ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド異性体１

【化28】

【0052】

実施例５
（５Ｒ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド異性体２

【化29】

Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド（１．２８ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５８．５ｍＬ）に溶解する。ＳＦＣ［ＡＤ−ＩＣカラム（３０ｘ２５０ｍｍ、５μ）によるキラルクロマトグラフィーによって分離し、５０％のＩＰＡ（２０ｍＭのＮＨ_３）で、４．５ｍＬ（２００ｍｇ）を１２０ｍＬ／分で１０分毎に注入することで溶出し、実施例２の（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｓ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド、実施例３の（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｒ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド、および実施例４の（５Ｒ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド異性体１を含む、実施例５の（５Ｒ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド異性体２および混合留分を得る。混合留分を濃縮し、ＭｅＯＨ（５５．５ｍＬ）に溶解する。ＳＦＣ［ＯＪ−Ｈカラム（３０ｘ２５０ｍｍ、５μ）によるキラルクロマトグラフィーによって混合物を分離し、２２％のＭｅＯＨ（２０ｍＭのＮＨ_３）で、５．０ｍＬを１６０ｍＬ／分で５分毎に注入することで溶出し、実施例４の（５Ｒ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド異性体１ならびに実施例３の（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｒ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミドおよび実施例２の（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｓ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミドの混合物を得る。混合留分を濃縮し、ＭｅＯＨ（３０．０ｍＬ）に溶解する。ＳＦＣ［ＡＤ−Ｈカラム（５０ｘ２５０ｍｍ、５μ）によるキラルクロマトグラフィーによって混合物を分離し、５０％のＩＰＡ（２０ｍＭのＮＨ_３）で、３．０ｍＬを２００ｍＬ／分で３２分毎に注入することで溶出し、実施例２の（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｓ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミドおよび実施例３の（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｒ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミドを得る。各セットの純粋な画分を濃縮し、分離した生成物をアセトニトリル（０．６ｍＬ）に溶解し、水を添加し、−７８℃に凍らせ、凍結乾燥し、実施例２の０．２１４ｇ、１６％、９９．５％ ｅｅ、Ｒ_ｔ＝２．９４分、質量スペクトル（ｍ／ｚ）：６２４（Ｍ＋Ｈ）を得る。実施例３、０．２０３ｇ、１５％、９８．９％ ｅｅ、Ｒ_ｔ＝２．７５分、質量スペクトル（ｍ／ｚ）：６２４（Ｍ＋Ｈ）。実施例４、０．２５１ｇ、１７％、９８．３％ ｅｅ、Ｒ_ｔ＝４．７５分、質量スペクトル（ｍ／ｚ）：６２４（Ｍ＋Ｈ）。実施例５、０．２７２ｇ、１８％、１００％ ｅｅ、Ｒ_ｔ＝４．３３分、質量スペクトル（ｍ／ｚ）：６２４（Ｍ＋Ｈ）。分析条件：ＳＦＣ （２２０ｎｍのＵＶ）、カラム：ＡＤ−ＩＣ ３０ｘ２５０ｍｍ、５μ、移動相：５０％のＩＰＡ（２０ｍＭのＮＨ_３）。キラルＬＣ分析条件：ＳＦＣ（２２５ｎｍのＵＶ）、カラムＣｈｉｒｏｃｅｌ ＯＪ−Ｈ、２０％のＭｅＯＨ（０．２％のイソプロピルアミン）／ＣＯ_２、５ｍＬ／分。

【0053】

実施例２、（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｓ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミドの代替の調製

【化30】

および実施例３、（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｒ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’チエノ［２，３−Ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミドの代替の調製

【化31】

【0054】

（５Ｓ’）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−４’，５’，ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３，ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド二塩酸塩（２８．２８ｇ、５８．１９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２８０ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（５０ｍＬ、２９０．９ｍｍｏｌ）に溶解し、５−（１−ブロモエチル）−２−（トリフルオロメチル）ピリミジン（０．７１ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）を添加し、周囲温度で一晩攪拌する。減圧下で濃縮し、粗混合物をＤＣＭに溶解し、１００％のＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、標題化合物の混合物を得る。キラルクロマトグラフィー［Chiralpak IAカラム（８ｘ４０．５ｃｍ、２２５ｎｍ）で分離し、４０％のアセトニトリル／６０％のイソプロピルアルコール（０．２％のジメチルエチルアミンで）で、４００ｍＬ／分で溶出し、２０ｍＬを注入（２０００ｍｇ）する。減圧下で各ジアステレオマーを濃縮し、熱いエタノール（２５０ｍＬ）に溶解し、熱いエタノールを濾過し、周囲温度に放冷し、冷たいエタノールでリンスする。真空オーブンで５５℃で固体を乾燥させ、実施例２、９．９４ｇ、２７％、９０．８％ ｅｅ、Ｒ_ｔ＝３．９３分、質量スペクトル（ｍ／ｚ）：６２４（Ｍ＋Ｈ）および実施例３、９．４２ｇ、２６％、９８．８％ ｅｅ、Ｒ_ｔ＝９．２５分、質量スペクトル（ｍ／ｚ）：６２４（Ｍ＋Ｈ））を結晶性物質として得る。分析条件：Chiralpak IAカラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、２２５ｎｍ）および４０％のアセトニトリル／６０％のイソプロピルアルコール（０．２％ジメチルエチルアミンで）、１ｍＬ／分で溶出。

【0055】

Ｘ線回折、実施例３
単一の結晶を薄いMiTeGen繊維に２３℃で載せる。ＣｕＫα照射源（λ＝１．５４１７８Å）およびSMART 6000CCD領域検出器（Bruker-AXS.SHELXTL(V2013 6.2)Madison、Wisconsin、USA)を備えたBruker D8に基づく３サイクル角度計回折計を使用してデータを集める。SAINT program V8.32b（Sheldrick、G.M.、(2008)、SHELXS-97、Acta Cryst.A64、112-122）を使用して細胞の精練およびデータ整理を行う。ａ＝１０．１６２４（２）Å、ｂ＝９．９０８０（２）Å、ｃ°＝°１５．１０８５（３）Å、およびα＝９０°、β＝１００．６８７９（１４）°、γ＝９０°の単斜のパラメーターを有する単位胞にインデックスを付ける。結晶構造の細胞重量は１４９４．８７（５）Å３である。構造の計算密度は２３℃で１．３８６ｇ／ｃｍ^３である。直接の方法（Sheldrick、G.M.、(2008)、SHELXS-97、Acta Cryst.A64、112-122）によって構造を解析する。全ての原子パラメーターは独立して精密化した。空間群、すなわちＰ２_１は、最終適合度１．０８８で、Ｆ２（Sheldrick、G.M.、(2013)、SHELXL-2013、Program for crystal structure refinement、Institute fur anorg chemie、Gottingen、Germany）上で完全行列最小二乗精密化を上手く収束させることによって確認する。最終残留率Ｒ１は０．０７７１であり、最終精密化サイクルの後のピークとホールとの最大差分はそれぞれ、０．３１５と０．３３３（ｅ．Ａ−３）であった。絶対構造のパラメーターは０．０７２（１７）に精密化する。

【0056】

実施例３の構造を決定し、その分子構造は実施例３について認められたものと矛盾していない。結晶構造が高品質であり、構造中の重原子（硫黄）の変則的な散乱分布を使用することによって、実施例３のキラル中心の絶対立体化学、（Ｓ）としてのＣ５、piperdine基から離れた（Ｒ）としてのＣ１を確立することに留意されたい。絶対構造は、結晶構造から（５’Ｓ）−Ｎ−｛［５−（エチルスルホニル）ピリジン−２−イル］メチル｝−５’−メチル−１−｛（１Ｒ）−１−［２−（トリフルオロメチル）ピリミジン−５−イル］エチル｝−４’，５’−ジヒドロスピロ［ピペリジン−４，７’−チエノ［２，３−ｃ］ピラン］−２’−カルボキサミド構造へと決定される。

【0057】

生物学的アッセイ
ＲＯＲａ、ｂおよびｇ結合阻害剤
ＨｉｓタグされたヒトＲＡＲ関連オーファン受容体アルファ（ｈＲＯＲａ）、ヒトＲＡＲ関連オーファン受容体ベータ（ｈＲＯＲｂ）、およびヒトＲＡＲ関連オーファン受容体ガンマ（ｈＲＯＲｇ）を受容体リガンド競合結合アッセイに使用し、Ｋ_ｉ値を決定する。典型的な手順は以下の通りである。

【0058】

受容体競合結合アッセイをＤＰＢＳ（１Ｌ）（Hyclone#SH30028.03）、２．２ｇのBSA Fraction v（Roche#9048-46-8）、１００ｍＬのグリセロール（Fischer#56-81-5）および４０ｍＬのＤＭＳＯ（試薬用）から構成されるバッファで実施する。最終ウェルは、２０μｇ／ｍＬのアプロチニンおよび２０μｇ／ｍＬのロイペプチンおよび１０μＭのPefablocを含む。典型的には受容体結合アッセイとして、アルファ結合については７ｎＭの［３Ｈ］−２５−ヒドロキシコレステロール、ベータ結合については２０ｎＭの［３Ｈ］−３−［［４−［［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−イソプロピル−イソオキサゾール−４−イル］メトキシ］−Ｎ，２−ジメチル−アニリノ］メチル］安息香酸、およびガンマ結合については６ｎＭの［３Ｈ］２５−ヒドロキシコレステロール等の放射標識されたリガンド、ならびにウェルあたり０．５μｇのＲＯＲａ受容体、０．０３μｇのＲＯＲｂ受容体、または０．１３μｇのＲＯＲｇ受容体が挙げられる。アッセイは典型的には９６ウェルフォーマットで実施する。競合する試験化合物を約０．４ｎＭ〜２５μＭの範囲の様々な濃度で添加する。非特異的結合を、ＲＯＲａおよびＲＯＲｇ結合については２５０ｎＭの２５−ヒドロキシコレステロール、ＲＯＲｂ結合については２５０ｎＭの３−［［４−［［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−イソプロピル−イソオキサゾール−４−イル］メトキシ］−Ｎ，２−ジメチル−アニリノ］メチル］安息香酸の存在下で決定する。サンプル、標識および受容体の溶液を９６ウェルアッセイプレート（Costar 3632）に合わせ、室温で一晩インキュベートし、その後最終のビーズ濃度を１ｍｇ／ウェルにするために２５μｌのビーズ（Amersham YSi（２〜５ミクロン）銅His-tag Spa Beads、#RPNQ0096）を各反応液に添加する。プレートを室温でオービタルシェーカーで３０分間混合する。４時間のインキュベーションの後、プレートをWallac MICROBETA（登録商標）計測器で読み取る。

【0059】

データを使用して、４パラメーターロジスティック適合を使用してＩＣ_５０を推測する。ＲＯＲａおよびＲＯＲｇについての［３Ｈ］−２５−ヒドロキシコレステロールのＫｄ、ＲＯＲｂ結合についての［３Ｈ］−３−［［４−［［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−イソプロピル−イソオキサゾール−４−イル］メトキシ］−Ｎ，２−ジメチル−アニリノ］メチル］安息香酸のＫｄは、飽和結合によって決定する。化合物についてのＩＣ_５０値はCheng-Prushoff方程式を使用してＫｉに変換する。

【0060】

以下の例示的な化合物の結果を、以下の表２に示す。

【表1】

Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ＳＥＭ＝平均値の標準誤差

【0061】

これらの結果は、表２の化合物がＲＯＲｇ対ＲＯＲａおよびＲＯＲｂに選択的であることを示している。

【0062】

ＨＥＫ２９３ ＲＯＲｇ ＧＡＬ４受容体間アッセイ
インバースアゴニスト作用の指標として、ＲＡＲ関連オーファン受容体ガンマ（ＲＯＲｇ）受容体間アッセイ（ＲＯＲｇ−ＧＡＬ４／ｐＧＬ４．３１）を、ＨＥＫ２９３細胞内で実施する。ＨＥＫ２９３細胞をFugene（商標）試薬を使用して同時導入する。ＧＡＬ４結合領域およびホタルルシフェラーゼ遺伝子の最小のアデノウイルスプロモーター上流を含むレポータープラスミドを、イーストＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域に縮合されたヒトＲＯＲｇリガンド結合領域を構造的に発現するプラスミドと同時導入する。細胞をＦＢＳのないＭＥＭ培地中のＴ１５０ｃｍ^２のフラスコに遺伝子導入する。１８時間のインキュベーションの後、遺伝子導入された細胞をトリプシン処理し、１０％のＦＢＳを含む３：１のＤＭＥＭ−Ｆ１２の培地中の９６ウェルマイクロタイタープレートに播き、４時間インキュベートし、その後、約０．０５ｎＭ〜１０μＭの範囲の様々な濃度の試験化合物に暴露する。化合物で１８時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ作用を標準的手法を使用して定量化する。データを４パラメーターロジスティック適合に適合させ、ＩＣ_５０値を決定する。

【0063】

以下の例示的な化合物の結果を、以下の表３に示す。

【表2】

Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ＳＥＭ＝平均値の標準誤差

【0064】

これらの結果は、表３の化合物が、ヒトＲＯＲｇ受容体についてインバースアゴニストであることを示している。

【0065】

ＰＢＭＣ ＩＬ−１７分泌ＥＬＩＳＡおよびCell TiterGlo生存率測定
ＰＢＭＣを、新鮮なバフィーコートを等量のリン酸緩衝食塩水と最初に合わせることによって、全血バフィーコートから単離する。３５ｍＬのＰＢＳ／バフィーコート溶液を、５０ｍＬの円錐形管中の１５ｍＬのFicoll上でやさしく覆う。５００×ｇ（緩加速および緩減速）で３０分間遠心分離にかけた後、血漿の上層を捨て、Ficoll界面に沿った細胞の層を回収し、保存する。各２５０ｍＬの管を室温のRPMI-1640培地で上部まで充填する。管を５００×Ｇ（緩加速および緩減速）で１０分間遠心分離にかけ、培地を吸引によって取り除き、洗浄ステップを繰り返す。細胞を、氷上のLife Technologies社の氷冷Recovery Cell Culture Freezing Medium（カタログ番号１２６４８−０１０）に再懸濁する。細胞濃度を６６７０万個の細胞／ｍＬに調節する。細胞を１億個の細胞を有するバイアル中で−１℃／分ゆっくりと冷凍し、液体窒素に保管する。

【0066】

ＩＬ−１７分泌の刺激および化合物の添加
ＰＢＭＣを１ｍＬの完全培地（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、３．２５ｍＭのＬ−グルタミン、０．２μＭのベータ−メルカプトエタノールおよび１０％のＦＢＳを含むRPMI-1640）で再懸濁することによって解凍し、次に２ｍＬ、４ｍＬ、８ｍＬおよび１６ｍＬの完全培地をゆっくりと攪拌しながら滴下する。細胞を５分間遠心沈殿し、細胞ペレットを完全培地に再懸濁する。細胞の凝集塊を、２３ゲージの注射器針および４０μＭのストレーナーによって細胞溶液を貫流することによって壊す。ウェルあたり１０万個の細胞を、３８４ウェルのポリスチレン細胞培養で処理された総量３０μＬの平底プレートに添加する。完全培地で調製された抗ヒトＣＤ３抗体、抗ヒトＣＤ２８抗体、ＩＬ−２３および化合物を含む刺激混合物を、総量３０μＬ中の細胞に同時に添加する。添加された刺激混合物の最終濃度は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２３についてそれぞれ、１６０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬおよび５ｎｇ／ｍＬであり、ＤＭＳＯについて０．３％である。プレートをAERASEAL（登録商標）封止フィルムで密封し、３７℃、９５％の湿度、および５％のＣＯ_２で４８時間インキュベートする。

【0067】

インキュベーション期間の後、プレートを２００×ｇで５分間遠心する。上清を等量の１％のＢＳＡ／ＰＢＳで１：１に希釈し、R&D system（カタログ＃Ｄ３１７Ｅ）ヒトＩＬ−１７ ＥＬＩＳＡキットで、キットのプロトコルに従ってＩＬ−１７を試験するが、ただし、例外としてキットが供給する基質の代わりに、比色基質ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、Sigmaカタログ＃Ｐ６９１２）を使用する。４９２ｎｍの吸光度をEnvision multi-labelプレートリーダーで測定する。Ａ４９２値は、以下に示すＩＬ−１７標準曲線に基づいてＩＬ−１７の濃度に変換する。
ｐｇ／ｍＬ ＩＬ−１７＝ＥＣ５０^＊［［（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（Ａ４９２−Ｂｏｔｔｏｍ）］−１］（１／−Ｈｉｌｌ）

【0068】

ＩＬ−１７分泌の阻害についてのＩＣ_５０は、刺激剤も化合物も含まれないウェルの平均値から決定される最大阻害、および刺激剤を単独で含み、化合物が添加されていないウェルの平均値から決定される最小阻害で、標準４パラメーター適合を使用して、変換値に基づいて計算する。

【0069】

等量のCell TITERGLO（登録商標）細胞生存率試験試薬（Promegaカタログ＃Ｇ７５７３）を、プレートに残っている細胞に添加し、室温でやさしく振盪しながら１５分間インキュベーションをした後、発光をEnvision multi-labelプレートリーダーで測定する。細胞の死亡率は、１００％の活性（細胞死）から、ゼロの発光単位、および刺激剤を単独で含み、化合物が添加されていないウェルの平均の発光単位としての最小活性（生存している細胞の最大数）までを設定することによって計算する。標準４パラメーター適合を使用してＩＣ_５０を計算する。

【0070】

以下の例示的な化合物の結果を、以下の表４に示す。

【表3】

Ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ＳＥＭ＝平均値の標準誤差

【0071】

これらの結果は、表４の化合物が、測定可能な細胞毒性がなく、ＰＢＭＣ中の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８／ＩＬ−２３刺激性ＩＬ−１７分泌を阻害することを示している。

【0072】

グルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）誘発性関節炎モデル
ＧＰＩ誘発性関節炎を、K. Iwanamiら Arthritis Rheumatism 58, 754-763, 2008およびD. Schubertら J Immunology 172, 4503-4509, 2004から適用する。マウス（８〜９週齢の雄ＤＢＡ／１マウス）（Harlan）を、免疫化の日（０日目）に集めた体重に基づいて治療群に割り当てる。免疫化の日（０日目）に、組み換えヒトＧＰＩ（ＰＢＳ、Gibco中の４ｍｇ／ｍＬに希釈）とフロイント完全アジュバント（CFA、Sigma）との１：１（ｖ：ｖ）混合物を、高速ホモジナイザー（Omni）で、低温室で４０分間混合する。２ｍｇ／ｍＬのＧＰＩの最終濃度を乳濁液で達成する。マウスの尾の付け根にＧＰＩ乳濁液を注射する（２箇所に、各領域１００μＬを静脈内注射）。免疫化（０日目）と同じ日に、試験化合物の経口投与を開始する。０日目から始まり、足の関節腫脹の重症度に０〜３の評価システムに基づきスコアをつける（K. Iwanamiら Arthritis Rheumatism 58, 754-763, 2008を参照のこと。臨床スコアは４つの足すべての合計スコアを表している（最大スコアは１２））。臨床スコアは０、２、４、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１８および２１日目に評価する。

【0073】

ＡＵＣは、免疫化の日（０日目）から２１日目にわたる経時的な臨床スコアについてトラペゾイド法を適用することによって計算する。試験ｐ値はスチューデントｔ検定に由来する。

【0074】

実施例３（１０００ｍｇ／Ｋｇ）およびビヒクル（精製水中、１％のＨＥＣ、０．２５％のポリソルベート８０、および０．０５％の消泡剤）治療群（ｎ＝８／群）は、０日目に開始し、１日１回経口投与する。実施例３は、ビヒクル群に比べ、足の腫脹を減少させ、低い平均臨床スコアを疾患の経過を通じて維持する。当該効果は結果として、経時的な足の腫脹の累積測定値である臨床スコアＡＵＣを７５％が減少し、表５に示すようにビヒクル群に比べ統計的に有意である。

【表4】

値はＭｅａｎ±ＳＥＭとして示す。^＊ｐ＜０．０５対ビヒクル群（スチューデントｔ検定）。ＳＥＭ＝平均値の標準誤差

【要約】

本発明は新規のＲＯＲガンマ−ｔ阻害剤およびその医薬組成物を提供している。
【化１】

【選択図】なし