特許 6283652 単一のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡナノカプセルに基づいた新規ＲＮＡｉ分子送達プラットホーム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6283652

(24)【登録日】2018年2月2日

(45)【発行日】2018年2月21日

(54)【発明の名称】単一のｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡナノカプセルに基づいた新規ＲＮＡｉ分子送達プラットホーム

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/51 20060101AFI20180208BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20180208BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20180208BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20180208BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180208BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20180208BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/51

   A61K47/32

   A61K31/7105

   A61K48/00

   A61P35/00

   A61P35/02

【請求項の数】25

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2015-500671(P2015-500671)

(86)(22)【出願日】2013年3月15日

(65)【公表番号】特表2015-510896(P2015-510896A)

(43)【公表日】2015年4月13日

(86)【国際出願番号】US2013032615

(87)【国際公開番号】WO2013138783

(87)【国際公開日】20130919

【審査請求日】2016年3月8日

(31)【優先権主張番号】61/612,178

(32)【優先日】2012年3月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505088684

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ミン

(72)【発明者】

【氏名】リャン，ミン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，アーヴィン，エス．ワイ．

(72)【発明者】

【氏名】カマタ，マサカズ

(72)【発明者】

【氏名】ウェン，ジン

(72)【発明者】

【氏名】ル，ユンフェン

【審査官】 今村 明子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−１６３３６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Controlled Release，２０１０年，Vol.144，p.251-258

【文献】 The AAPS Journal，２０１０年１２月，Vol.12,No.4，p.492-503，DOI:10.1208/s12248-010-9210-4

【文献】 Nucleic Acid Therapeutics，２０１１年，Vol.21,No.3，p.133-147

【文献】 Expert Opin. Drug Deliv.，２０１１年，Vol.8, No.4，p.521-536

【文献】 Nature Nanotechnology，２０１０年 １月，Vol.5，p.48-53，DOI:10.1038/NNANO.2009.341

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｋ ３３／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

重合体シェルおよびＲＮＡｉ分子を含む重合体ナノカプセルであって、
前記重合体シェルは、
ａ）Ｎ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミド、
Ｎ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、
Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミド、
Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、
Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）アクリルアミド、
Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）メタクリルアミド、
Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）アクリルアミド、
Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）メタクリルアミド、
Ｎ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）アクリルアミド、
Ｎ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）メタクリルアミド、
（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムハイドロクロライド及び
２−アミノエチルメタクリラート、
から成る群から選択される１つまたは複数の正に荷電した単量体、
ｂ）１，３−グリセロールジメタクリラート、
グリセロール１，３−ジグリセロラートジアクリラート、
Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタミン、
ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスフェート、
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド及び
ビスアクリロイル化ポリペプチド
から成る群から選択される１つまたは複数の架橋剤、および、
ｃ）Ｎ−（１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル）アクリルアミド、
アクリルアミド、
Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
２‐ヒドロキシエチルアクリラート及び
２−ヒドロキシエチルメタクリラート、
から成る群から選択される１つまたは複数の中性の単量体
を含み；および、
前記ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ ＤＮＡカセットから成る群から選択される、重合体ナノカプセル。

【請求項2】

前記１つまたは複数の架橋剤は、分解可能な架橋剤対非分解性架橋剤の比を含む、請求項１の重合体ナノカプセル。

【請求項3】

前記分解可能な架橋剤対非分解性架橋剤の比は、１：０、３：２、２：３または１：４を含む比から選択される、請求項１または２の重合体ナノカプセル。

【請求項4】

前記架橋剤の全ては、分解可能な架橋剤である、請求項１の重合体ナノカプセル。

【請求項5】

全ての分解可能な架橋剤は、グリセロール１，３−ジグリセロラートジアクリラートである、請求項４の重合体ナノカプセル。

【請求項6】

前記１つまたは複数の正に荷電した単量体は、アクリル−スペルミンである、請求項１〜５のいずれかの重合体ナノカプセル。

【請求項7】

前記１つまたは複数の正に荷電した単量体は、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムハイドロクロライドである、請求項１〜５のいずれかの重合体ナノカプセル。

【請求項8】

前記１つまたは複数の正に荷電した単量体は、Ｎ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミド、Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）アクリルアミド、Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）メタクリルアミド、Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）アクリルアミド、Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）アクリルアミドおよびＮ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）メタクリルアミドを含む群から選択される、請求項１〜５のいずれかの重合体ナノカプセル。

【請求項9】

前記重合体ナノカプセルは、アクリル−スペルミン、トリス−アクリルアミドおよび、
１，３−グリセロールジメタクリラート、
グリセロール１，３−ジグリセロラートジアクリラート、
Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタミン、
ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスフェート、
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド及び
ビスアクリロイル化ポリペプチド
から成る群から選択される架橋剤を含む、請求項１の重合体ナノカプセル。

【請求項10】

前記１つまたは複数の正に荷電した単量体は、３つのプロトン化可能なアミンを有する、請求項１−８のいずれかの重合体ナノカプセル。

【請求項11】

前記１つまたは複数の正に荷電した単量体は、２つのプロトン化可能なアミンを有する、請求項１〜８のいずれかの重合体ナノカプセル。

【請求項12】

前記１つまたは複数の正に荷電した単量体は、１つのプロトン化可能なアミンを有する、請求項１〜８のいずれかの重合体ナノカプセル。

【請求項13】

前記重合体ナノカプセルは、およそ２０ｎｍから２５０ｎｍの直径である、請求項１〜１２のいずれかの重合体ナノカプセル。

【請求項14】

前記重合体ナノカプセルは、ターゲティング薬剤に抱合される、請求項１〜１３のいずれかの重合体ナノカプセル。

【請求項15】

前記ターゲティング薬剤は、シクロデキストリン、アダマンチン、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ａＨＬＡ、およびトランスフェリンを含む群から選択される、請求項１４の重合体ナノカプセル。

【請求項16】

前記ターゲティング薬剤は、特異的細胞タイプに前記重合体ナノカプセルを送達し、前記細胞タイプは、免疫細胞、血液細胞、心臓細胞、肺細胞、視細胞、肝細胞、腎臓細胞、脳細胞、中枢神経系の細胞、末梢神経系細胞、癌細胞、ウイルスに感染した細胞、幹細胞、皮膚細胞、腸管細胞および／または聴覚性細胞から成る群から選択される、請求項１４または１５の重合体ナノカプセル。

【請求項17】

前記癌細胞は、リンパ腫細胞、固形腫瘍細胞、白血病細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、直腸癌細胞、子宮体癌細胞、腎臓癌細胞、肺癌細胞、メラノーマ細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞および甲状腺癌細胞から成る群から選択される細胞である、請求項１６の重合体ナノカプセル。

【請求項18】

薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜１７のいずれかの重合体ナノカプセル。

【請求項19】

請求項１〜１８のいずれかの１つまたは複数の重合体ナノカプセルを含む医薬組成物。

【請求項20】

遺伝子の過剰発現によって特徴づけられる疾患の治療における使用のための、請求項１９に記載の医薬組成物であって、前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが過剰発現された遺伝子の発現をノックダウンまたは減少し、これにより前記疾患を治療する、医薬組成物。

【請求項21】

前記重合体ナノカプセルは、単一のＲＮＡｉ分子を含む、請求項１〜１８のいずれかの重合体ナノカプセル、あるいは請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

重合体シェルおよびＲＮＡｉ分子を含む重合体ナノカプセルを作製する方法であって、
ａ）ＲＮａｓｅフリー水にＲＮＡｉ分子を溶解すること、
ｂ）１つまたは複数の正に荷電した単量体、１つまたは複数の中性単量体および１つまたは複数の架橋剤を脱酸素化して脱イオン化した水に溶解して単量体混合物を作製すること、
ｃ）工程（ａ）の溶解したＲＮＡｉ分子を工程（ｂ）の単量体混合物と合わせること、
ｄ）過硫酸アンモニウムおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチルエチレンジアミンを工程（ｃ）の生成物に添加すること、および、
ｅ）無血清培地中で工程（ｄ）の生成物をインキュベートすること、
を含み、
１つまたは複数の正に荷電した単量体が、
Ｎ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミド、
Ｎ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、
Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミド、
Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、
Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）アクリルアミド、
Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）メタクリルアミド、
Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）アクリルアミド、
Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）メタクリルアミド、
Ｎ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）アクリルアミド、
Ｎ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）メタクリルアミド、
（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムハイドロクロライド及び
２−アミノエチルメタクリラート、
から成る群から選択され、
１つまたは複数の架橋剤が、
１，３−グリセロールジメタクリラート、
グリセロール１，３−ジグリセロラートジアクリラート、
Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタミン、
ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスフェート、
Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド及び
ビスアクリロイル化ポリペプチド
から成る群から選択され、
１つまたは複数の中性単量体が、
Ｎ−（１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル）アクリルアミド、
アクリルアミド、
Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
２‐ヒドロキシエチルアクリラート及び
２−ヒドロキシエチルメタクリラート、
から成る群から選択される、
方法。

【請求項23】

１つまたは複数の正に荷電した単量体が、Ｎ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミドであり、１つまたは複数の架橋剤が１，３−グリセロールジメタクリラートであり、且つ、１つまたは複数の中性の単量体がＮ−（１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル）アクリルアミドである、請求項１に記載の重合体ナノカプセル。

【請求項24】

重合体シェルおよびｓｉＲＮＡ分子を含む重合体ナノカプセルであって、重合体シェルがＮ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミド、１，３−グリセロールジメタクリラート及びＮ−（１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル）アクリルアミドを含む、重合体ナノカプセル。

【請求項25】

重合体シェルおよびｓｈＲＮＡを含む重合体ナノカプセルであって、重合体シェルがＮ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミド、グリセロール１，３−ジグリセロラートジアクリラート及びアクリルアミドを含む、重合体ナノカプセル。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
この出願は、米国特許法＊１１９（ｅ）の下で２０１２年３月１６日に出願の米国出願番号第６１／６１２，１７８号に対する利益を主張し、その開示は、その全体が参照により援用される。

【0002】

政府権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与された、助成金番号Ａ１０６９３５０；米国国防総省、国防脅威削減局によって授与された助成金番号ＨＤＴＲＡ１−０９−１−０００１の下で政府支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

【0003】

本発明は、新規ナノカプセルの使用による細胞内へのＲＮＡおよびＤＮＡ分子の有効な送達に関する。具体的には、本発明は、ＤＮＡ分子またはｓｉＲＮＡが細胞への送達を容易にするために小さな重合体ナノカプセル内にカプセル化された新規ＤＮＡカセットおよびｓｉＲＮＡナノカプセル技術に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
ＲＮＡ干渉は、特異的遺伝子発現をターゲットする、およびサイレンスするための強力なツールである。「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）という用語は、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）への二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の注射が送達されたｄｓＲＮＡに対して配列が高度に相同的である遺伝子の特異的サイレンシングをまねくという発見後に造り出された（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ＲＮＡｉは、植物における同時抑制および真菌における沈静化の転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）機構に密接に関連する（Ｃａｔａｌａｎｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００；ＣｏｇｏｎｉおよびＭａｃｉｎｏ、１９９９；Ｄａｌｍａｙ ｅｔ ａｌ．， ２０００、ＫｅｔｔｉｎｇおよびＰｌａｓｔｅｒｋ、２０００；Ｍｏｕｒｒａｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００；Ｓｍａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。

【0005】

ＲＮＡｉは、研究者が線虫遺伝子を不活性化するためにアンチセンスＲＮＡを使用することを試みていたときに発見された。研究者は、注射されたセンス鎖ＲＮＡが、遺伝子機能の阻害においてアンチセンスＲＮＡと同程度に有効であることを見いだした（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１：６１１−６２０）。さらなる研究により、活性因子がインビトロＲＮＡ標品に混入した適度な量の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であることが明らかになった。研究者は、さらにエクソン配列が必要とされること、およびイントロンおよびプロモーター配列が、効果がないものの、ＲＮＡｉを損なうようには見えなかったことを決定した。

【0006】

ＲＮＡｉは、全身的に作用することができる。この全身的効力は、ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅによって証明された（１９９８年のＮａｔｕｒｅ ３９５：８５４）。ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅは、単純な実験を行い驚くべき結果を生じた。彼らは、線虫ｕｎｃ−２２遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡを発現するように操作された細菌を線虫に摂食させた。トランスジェニック線虫は、ｕｎｃ−２２突然変異体のものに類似の表現型を現した。線虫およびその他の生物における、この、およびその他の実験の多様な結果は、ＲＮＡｉがＲＮＡプロセシング後に細胞ＲＮＡを不安定化するように作用することを示す。

【0007】

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ショウジョウバエ、線虫、プラナリア、ヒドラ、トリパノゾーム、真菌および植物を含む多数のインビボ状況において遺伝子サイレンシングを引き起こすことができる。さらにまた、望ましくない遺伝子の発現を特異的にノックダウンする独特の能力を有する短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、多様化されたヒト疾患の治療に対して多大な見込みを持つ。実際に、２００９年には、疾患を治療するためにｓｉＲＮＡを使用する１２の進行中の臨床治験があったことが報告された。Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， ２００９， ６（３）：６４９−６５０。１２の進行中の治験のうち、８つの治験は、眼および呼吸器の疾患の局所的治療のために裸のｓｉＲＮＡを使用した。Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｅｓ ａｎｄ ｐｉｔｆａｌｌｓ ｏｆ ＲＮＡ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｎａｔｕｒｅ， ２００９， ４５７（７２２８）：４２６−４３３。２０１３年２月には、国立保健研究所によって報告された２８のｓｉＲＮＡ臨床的治験があった。国立保健研究所臨床試験ウェブサイトを参照されたい。２８の治験の多くは、裸のｓｉＲＮＡを使用するようである。

【0008】

ｓｉＲＮＡの臨床適用は、非効率的な送達系によって制約される。具体的には、安全で、安定で、および効率的である送達媒体の欠如がある。現在まで、種々の送達系が提唱されてきた。このような系は、カチオン性リポソーム、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）およびカチオン性重合体を含む。Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２００９， ６１（９）：７２１−７３１および Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｉａ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２００７， ５９（２−３）：１１５−１２３。

【0009】

リポフェクトアミン（登録商標）および脂質様材料などのカチオン性リポソームおよびカチオン性脂質は、高い有効性でインビトロでの研究のために広く使用されているが；しかし、毒性および低い効率がなおもこれらインビボでの適用を制限する。

【0010】

ＣＰＰに基づいたアプローチについては、ＲＮＡｉ分子が、有意に改善された送達効率で、複合体形成した粒子内にＣＰＰまたはＣＰＰバイオ抱合体と共に組織化される。Ｃｒｏｍｂｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ａ Ｎｅｗ Ｐｏｔｅｎｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００９， １７（１）：９５−１０３および Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ＲＮＡｉ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｆｒｏｍ ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｉＲＮＡ ｖｉａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１０， ４６４（７２９１）：１０６７−Ｕ１４０。それにもかかわらず、このように組織化された構造の形成は、弱い非共有結合性の相互作用によって駆動され、これらの粒子は、一般に、特に血清ヌクレアーゼに対して不安定であったし、これがＲＮＡｉの分解および不十分なターゲティングをまねく。

【0011】

カチオン性重合体に基づいたアプローチのためには、ｓｉＲＮＡは、主に静電的相互作用を介してカチオン性重合体で組織化される。カチオン性重合体の独特のプロトンスポンジ効果は、改善された細胞内送達効率をもつ複合体を形成する。しかし、ＣＰＰに基づいたアプローチに類似して、このように組織化された系は、不安定であり、およびこれらが標的細胞の原形質に到達する前に容易にこれらのｓｉＲＮＡペイロードを分離し、および放出する。

【0012】

したがって、このような集中的な努力にもかかわらず、ｓｉＲＮＡのための有効な送達媒体の設計および合成は、困難なままである。したがって、高度に強く、および有効である新規ｓｉＲＮＡ送達法を開発することに対して、継続した需要がある。この研究の成功は、実用的な治療的適用に対して低毒性および長い細胞内半減期をもつ一般的な送達プラットホームを提供するだろう。

【発明の概要】

【0013】

簡単な発明の概要
一定の態様において、本発明は、重合体シェルおよびＲＮＡｉ分子を含む重合体ナノカプセルを含む。一定の態様において、重合体シェルは、表１から選択される１つまたは複数の正に荷電した単量体、表２から選択される１つまたは複数の架橋剤および表３から選択される１つまたは複数の中性の単量体を含む。一定の態様において、ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ ＤＮＡカセットである。

【0014】

一定の態様において、１つまたは複数の架橋剤は、分解可能な架橋剤対非分解性架橋剤の比を含む。一定の態様において、分解可能な架橋剤対非分解性架橋剤の比は、１：０、３：２、２：３または１：４を含む比から選択される。一定の態様において、架橋剤の全ては、分解可能な架橋剤である。一定の態様において、全ての分解可能な架橋剤は、グリセロール１，３−ジグリセロラートジアクリラートである。

【0015】

一定の態様において、１つまたは複数の正に荷電した単量体は、アクリル−スペルミンである。一定の態様において、１つまたは複数の正に荷電した単量体は、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドハイドロクロライド、ジメチルアミノエチルメタクリラート、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムハイドロクロライドおよび（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムハイドロクロライドを含む群から選択される。一定の態様において、１つまたは複数の正に荷電した単量体は、Ｎ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミド、Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）アクリルアミド、Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）メタクリルアミド、Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）アクリルアミド、Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）アクリルアミドおよびＮ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）メタクリルアミドを含む群から選択される。

【0016】

一定の態様において、重合体ナノカプセルは、アクリル−スペルミン、トリス−アクリルアミドおよび表２から選択される架橋剤を含む。

【0017】

一定の態様において、１つまたは複数の正に荷電した単量体は、３つのプロトン化可能なアミンを有する。一定の態様において、１つまたは複数の正に荷電した単量体は、２つのプロトン化可能なアミンを有する。一定の態様において、１つまたは複数の正に荷電した単量体は、１つのプロトン化可能なアミンを有する。

【0018】

一定の態様において、重合体ナノカプセルは、直径がおよそ２０ｎｍ〜２５０ｎｍである。

【0019】

一定の態様において、重合体ナノカプセルは、ターゲティング薬剤に抱合される。一定の態様において、ターゲティング薬剤は、シクロデキストリン、アダマンチン、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ａＨＬＡおよびトランスフェリンを含む群から選択される。一定の態様において、ターゲティング薬剤は、特定の細胞タイプに重合体ナノカプセルを送達し、細胞タイプは、免疫細胞、血液細胞、心臓細胞、肺細胞、視覚細胞、肝細胞、腎臓細胞、脳細胞、中枢神経系細胞、末梢神経系細胞、癌細胞、ウイルスに感染した細胞、幹細胞、皮膚細胞、腸管細胞および／または聴覚細胞を含む群から選択される。一定の態様において、癌細胞は、リンパ腫細胞、固形腫瘍細胞、白血病細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、直腸癌細胞、子宮体癌細胞、腎臓癌細胞、肺癌細胞、メラノーマ細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞および甲状腺癌細胞を含む群から選択される細胞である。

【0020】

一定の態様において、重合体ナノカプセルは、薬学的に許容される担体をさらに含む。

【0021】

一定の態様において、本発明は、上記した１つまたは複数の重合体ナノカプセルを含む医薬組成物を含む。

【0022】

一定の態様において、本発明は、本明細書において記述したナノカプセルの医薬組成物で遺伝子の過剰発現によって特徴づけられる疾患を治療する方法であって、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが過剰発現された遺伝子の発現をノックダウンし、または減少し、これによって疾患を治療する、方法を含む。

【0023】

一定の態様において、本発明は、ｓｉＲＮＡ重合体ナノカプセルを作製する方法を含む。一定の態様において、ｓｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ−フリー水に溶解される。一定の態様において、表１から選択される１つまたは複数の正に荷電した単量体および表２から選択される１つまたは複数の架橋剤は、脱酸素化され（ｉｎ）、および脱イオン水に溶解されて単量体混合物を生じる。一定の態様において、上記の通りの溶解したｓｉＲＮＡは、単量体混合物と合わせられる。一定の態様において、過硫酸アンモニウムおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンが混合物に添加される。一定の態様において、混合物は、無血清培地においてインキュベートされる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】ＤＮＡカセットナノカプセルの合成および送達の図解を示す：１）ＤＮＡカセットの周りの親水性単量体Ａ、正に荷電した単量体Ｂ、分解性架橋剤Ｃおよび非分解性架橋剤Ｄの自己組織化；２）：インサイチュー重合を介するＤＮＡカセットナノカプセルの形成；３）：送達；ＩＶ）：ＤＮＡカセットの放出およびｓｉＲＮＡの発現。

【図2】単一のｓｉＲＮＡナノカプセルの合成および送達の模式的な図解を示す。模式図の工程Ｉは、負に荷電したｓｉＲＮＡと相互作用する正に荷電した重合性単量体を示す。模式図の工程ＩＩは、それぞれのｓｉＲＮＡ分子を包む重合体ネットワークを作製するための、ｐＨ分解性架橋剤および親水性単量体の重合を示す。模式図の工程ＩＩＩは、コアを持つｓｉＲＮＡを加水分解から保護する架橋シェルを示す。模式図の工程ＩＶは、血清（ｐＨ〜７．４）における重合体ナノカプセルの安定性およびこれらが、原形質にｓｉＲＮＡを放出するシェルの分解によるエンドソームから逸脱する能力を示す。 より具体的には、工程Ｉは、以下を示す：正に荷電した、重合性単量体、アクリル−スペルミン（１）から開始し、静電的相互作用が、負に荷電したｓｉＲＮＡの表面の周りに１を濃縮する。工程ＩＩは、以下を示す：ｐＨ分解性架橋剤（２）および親水性単量体（３）を含む、水性溶液におけるその後の室温重合が、重合体ネットワークの薄いシェルでそれぞれのｓｉＲＮＡ分子を包む。工程ＩＩＩは、以下を示す：架橋されたシェルウェルは、コアを持つｓｉＲＮＡを加水分解から保護する；一方で、１対３の比を調整することにより、表面電荷の精密制御を可能にして重合体ナノカプセルの有効な細胞形質導入を確実にする。工程ＩＶは、以下を示す：（２）は、中性ｐＨにおいて安定であるが、ｐＨ〜５．４の後期エンドソームなどの酸性環境において迅速に分解する。この独特の応答性の設計が、血清（ｐＨ〜７．４）において顕著な安定性をもつ重合体ナノカプセルを提供するだろうと考えられ、一方で、シェルの分解によるエンドソームからのこれらの逸脱を可能にし、細胞質にｓｉＲＮＡを放出する。さらにまた、この合成アプローチは、重合体ナノカプセル表面へのターゲティング成分（たとえば、抗体）の固定を可能にし、ｓｉＲＮＡのターゲットされた送達を可能にする。

【図3】ＤＮＡカセットおよびナノカプセルの画像および写像を示す。図２Ａは、ＤＮＡカセットのゲル電気泳動画像を示す。レーンａは、ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡであり、およびレーンｂは、ＥＧＦＰ ｓｈＲＮＡである。図２Ｂは、ＤＮＡカセットのＴＥＭ画像を示す（スケールバー＝１００ｎｍ）。図３Ｃは、ＤＮＡカセットナノカプセルのＴＥＭ画像を示す（ＤＮＡ対図１および実施例１および実施例２において示した３つの反応物のモル比ｓＡ、Ｂ、Ｃ＝１：７５０：７５０：３０）。

【図4】重合体ナノカプセルおよびこれらが分解を妨げる能力を示す。図４Ａは、ｓｉＲＮＡナノカプセルのＴＥＭ画像を示す。図４Ｂは、ＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡナノカプセルを形質導入したＨＥＫ−２９３ Ｔ細胞の蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）および光学的画像を示す。図４Ｃは、ＣＣＲ５にターゲットしたｓｉ１００５ ｓｉＲＮＡナノカプセルを形質導入されたＨＥＫ−２９３ Ｔ細胞（右）の蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）画像を示し、ＣＣＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質のノックダウンを示す（対照としての対照ｓｉＲＮＡナノカプセル（左））。図４Ｄは、活性ヒト血清の非存在または存在下における、ｓｉＲＮＡナノカプセル（１、３、５、７）およびｓｉＲＮＡ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））（２、４、６、８）によるＣＣＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙノックダウンを示す。

【図5】Ａｌｅｘａ５９２標識ＤＮＡカセットナノカプセルを形質導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を示す。図５Ａは、細胞の光学的画像を示す。図５Ｂは、細胞の蛍光画像を示す。図５Ｃは、細胞のフローサイトメトリーグラフを示す。図５Ｄは、ＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ ＤＮＡカセットナノカプセル（１００μＬ中２．５×１０４細胞当たりＤＮＡ１００ｎｇ）による、ＣＣＲ５−ルシフェラーゼのノックダウンを示す。これらの実験において、細胞に、４時間１００ｎＭにてＡｌｅｘａ５９２標識ＤＮＡカセットナノカプセルを投与した。次いで、ナノカプセルを取り除いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。トリプシン処理後、細胞をＬｅｉｃａ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒで撮影し、およびまた、フローサイトメーターによって解析した。

【図6】Ｄｎａｓｅ Ｉに対するＤＮＡカセットの、並びにヌクレアーゼ（ｎｕｌｃｅａｓｅ）およびヒト血清に対するｓｉＲＮＡの感受性を示す。図６Ａは、Ｄｎａｓｅ Ｉへの天然のＤＮＡカセットおよびＤＮＡナノカプセルの感受性を示す。それぞれ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）と複合体を形成したＤＮＡカセットおよびＤＮＡナノカプセルを、Ｄｎａｓｅ Ｉ無しおよびＤｎａｓｅ Ｉと１時間インキュベートした。試料を、２％アガロースゲルで泳動し、およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００で撮像した。図６Ｂは、ヌクレアーゼ（ｎｕｌｃｅａｓｅ）および血清に対するｓｉＲＮＡの感受性を示す。それぞれ、リポフェクトアミンと複合体を形成したｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡナノカプセルを、ヌクレアーゼ（上）およびヒト血清（下）と１時間インキュベートした。次いで、ｓｉＲＮＡｓを、クロロホルム／０．１％ＳＤＳ−０．５Ｍ塩化ナトリウムでリポフェクトアミンおよびナノカプセルから抽出した。試料を４％アガロースゲルで泳動し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００で撮像した。

【図7】ＣＣＲ５ ＤＮＡカセットナノカプセルを形質導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の生存度を示す。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、無血清培地中、３７℃にて、４時間、０、０．１、０．２および０．４ｐｍｏｌにてＤＮＡカセットナノカプセルで処理した。次いで、培地を、１０％ウシ胎仔血清を伴うＤＭＥＭに変えた。２４時間後、細胞生存度を、９６ウェルプレートリーダーを使用して、ＣｙｔｏＴｏｘＧｌｏｗキットを介して決定した。

【図8】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＣＣＲ５−ルシフェラーゼのノックダウンを示す。図８Ａは、ＣＣＲ５ ＤＮＡカセットナノカプセルを形質導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＣＣＲ５−ルシフェラーゼのノックダウンを示す。図８Ｂは、ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）複合体を形質導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＣＣＲ５−ルシフェラーゼのノックダウンを示す。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を無血清培地中、３７℃にて、４時間、０、０．１、０．２および０．４ｐｍｏｌにてＤＮＡカセットナノカプセルおよび０、５０、１００および２００ｐｍｏｌにてｓｉＲＮＡ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）複合体で処理した。次いで、培地を、１０％ウシ胎仔血清を伴うＤＭＥＭに変えた。４８時間後、ルシフェラーゼ活性を、９６ウェルプレートリーダーを使用して決定した。

【図9A】ＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ ＤＮＡカセットナノカプセル（ｎａｎｏｃｐｓｕｌｅ）の分解速度を示す。図９Ａは、分解性および非分解性架橋剤の混合物で調製したＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ ＤＮＡカセットナノカプセルの分解速度を示す。

【図9B】図９Ｂは、水においてＤＬＳによってモニターしたＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ ＤＮＡカセットナノカプセルの安定性を示す。重合体ナノカプセルの最初のシェルの厚みは、Ｒ_０−Ｒ＊から見積もられ、Ｒ_０は、ＤＮＡナノカプセルの初期直径であり、およびＲ＊は、ＤＮＡ分子の直径（分解後の最終直径）である。分解程度は、［Ｒ_０−Ｒ_ｔ］／［Ｒ_０−Ｒ＊］×１００％として算出され、Ｒ_ｔは、ナノカプセルの直径である。

【図10】分解性架橋剤（グリセロール１，３−ジグリセロラートジアクリラート、ＧＤＧＤＡ）対非分解性架橋剤（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ） 、ＢＩＳ）の異なる比（５：０；３：２；２：３および１：４）でのｓｈ１００５ ＤＮＡカセットナノカプセルによるＨＥＫ２９３細胞におけるＣＣＲ５のダウンレギュレーションを示す。培養０日目において、細胞に、４時間ＤＮＡカセットナノカプセルを形質導入した。培養３、５および９日目において、細胞を抗ＣＣＲ５で標識し、フローサイトメトリーによって解析した。

【図11】表１からの正に荷電した単量体＃１〜＃１４で調製されたナノカプセルがルシフェラーゼを発現するＣＷＲ細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現をノックダウンする能力を示す。図から分かるように、ルシフェラーゼ発現の最善のノックダウンは、正に荷電した単量体＃１、＃２、＃７および＃８で調製されたナノカプセルで達成された。

【図12】表２からの架橋剤＃１〜＃５で調製されたナノカプセルがルシフェラーゼを発現するＣＷＲ細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現をノックダウンする能力を示す。図から分かるように、ルシフェラーゼ発現の最善のノックダウンは、架橋剤＃１（すなわち、２−ヒドロキシエチルメタクリラート）で調製されたナノカプセルで達成された。

【図13】中性単量体がｓｉＲＮＡナノカプセルのサイズに影響を及ぼす能力を示す。図で分かるように、Ｎ−（１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル）アクリルアミドは、最も小さなナノカプセル（２５ｎｍ未満）を生じ、およびアクリルアミドは、最も大きなナノカプセル（２００ｎｍを上回る）を生じた。

【図14】ルシフェラーゼｓｉＲＮＡナノカプセルを使用することによるルシフェラーゼ遺伝子発現のノックダウンを示す。図１４Ａは、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡナノカプセルおよび対照ｓｉＲＮＡナノカプセルを使用する、ＣＷＲ細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現のノックダウンを示す。図１４Ｂは、ｓｉＲＮＡナノカプセル処理後の細胞生存度を示す。ＣＷＲ細胞を無血清培地において３７℃にて４時間、０、２０、５０、１００、２００および３００ｎＭにてｓｉＲＮＡナノカプセルで処理した。次いで、培地を、１０％ウシ胎仔血清を伴うＤＭＥＭに変えた。４８時間後、ルシフェラーゼ活性を、９６ウェルプレートリーダーを使用して決定した。

【図15】ナノカプセルのｐＨ滴定曲線を示し、および重合体ナノカプセルの１つが、ｐＨ ７．３および５．５の間でＰＥＩ２５Ｋの緩衝液能力の約６０％を有することを確認する。ナノカプセルの緩衝能力を酸塩基滴定によって測定した。ｐＨ１０に最初に合わせたナノカプセル溶液（イオン化できる（ｉｏｎｉｚｉａｂｌｅ）アミン基の総モル濃度の点から８．３ｍＭ）を０．０１Ｍ塩酸で滴定した。ｐＨプロフィールを室温にて記録した。

【図16】ＢＳＡ対照ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。これは、ｓｉＲＮＡナノカプセルのものと同じ製剤を使用して合成し、および画像において暗いコアを示さない。ＢＳＡを２０μＭにて２０μＬのＲｎａｓｅフリーの水に溶解した。次いで、０．５ｍＬの脱酸素化して脱イオン化した水に溶解した、アクリル−スペルミン、トリス−アクリルアミドおよびグリセロールジメタクリラート（モル比＝５：５：１）の特定量を、微小遠心管においてＢＳＡと混合した（ＢＳＡ対アクリル−スペルミンの最終的なモル比＝１：２２０）。ＢＳＡの表面からのラジカル重合を２μＬの１％過硫酸アンモニウム溶液および１μＬの５％のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを添加することによって開始した（ＢＳＡ対アクリル−スペルミンの最終的なモル比＝１：２４０）。反応を窒素雰囲気において６０分間進行させた。

【図17】動的光散乱によって決定されたｓｉＲＮＡナノカプセルの１つの表面電荷を示す。

【図18】動的光散乱によって決定されたｓｉＲＮＡナノカプセルの１つのサイズおよびサイズ分布を示す。光散乱によって得た２４．６ｎｍの平均直径は、ＴＥＭによって得た２０ｎｍの平均直径と一致する。

【図19】血清の存在および非存在下におけるｓｉＲＮＡナノカプセルの１つによるルシフェラーゼのノックダウンを示す。

【図20】ｐＨ ５．４またはｐＨ ７．４下でのｓｉＲＮＡナノカプセルの分解プロフィールを示す。

【図21】単量体の自己組織化後のｓｉＲＮＡの吸収変化を示す。ｓｉＲＮＡ（上部）の吸収は、ｓｉＲＮＡ−単量体複合体（下部）の形成後に減少した。

【図22】ＣＤ４受容体を発現する２９３細胞に対するｓｉＲＮＡのターゲティング送達を示す。図２２Ａは、抗ＣＤ４抗体と抱合したＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡナノカプセルと４時間インキュベーション後のＣＤ４受容体を発現する２９３細胞のフローサイトメトリーグラフを示す。図２２Ｂは、抗ＣＤ４抗体と抱合したＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡナノカプセルと４時間インキュベーション後のＣＤ４受容体のない正常２９３細胞のフローサイトメトリーグラフを示す。１ｍｇ／ｍＬにてｐＨ＝８．７ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に溶解した１００μＬの抗ＣＤ４抗体を１ｍｇ／ｍＬにて１０μＬの２−イミノチオラン（Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（Ｔｒｏｕｔ試薬）と３０分間反応させた。次いで、修飾抗ＣＤ４抗体を、一晩１０μＭにて１００μＬのＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡナノカプセルとインキュベートする。

【発明を実施するための形態】

【0025】

定義
便宜のために、明細書、実施例および添付の請求の範囲において使用される一定の用語および句の意味を以下に提供してある。

【0026】

本明細書に使用される、「標的」という用語は、転写のためのマトリックスとして役立つ全ての転写された領域を含むＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の切片に相補的である二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の切片をいう。標的遺伝子、通常センス鎖は、その発現がＲＮＡ干渉を介して選択的に阻害され、またはサイレンスされる遺伝子である。

【0027】

本明細書に使用される、「重合体ナノカプセル」という用語は、「重合体シェル」および「ＲＮＡｉ分子」を含む組成物をいう。

【0028】

本明細書に使用される、「重合体シェル」という用語は、１つまたは複数の正に荷電した重合体単量体、１つまたは複数の架橋剤および任意に１つまたは複数の中性重合体単量体を含むＲＮＡｉ重合体ナノカプセルの重合体部分をいう。正に荷電した単量体、架橋剤および中性単量体の例は、表１、表２および表３に提供してある。

【0029】

本明細書に使用される、「ＲＮＡｉ分子」という用語は、ＲＮＡ干渉において役割を担うＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。具体的には、ＲＮＡｉ分子は、本明細書において開示したとおりのｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをいう。小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現をサイレンスするために使用することができる堅固なヘアピンターンを形成するＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ＤＮＡプラスミド、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを使用して標的細胞に送達することができる。本明細書に使用される、ｓｈＲＮＡは、ＤＮＡカセットを使用して細胞に送達することができる。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、広範なウイルスの群を含む。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、二重鎖ＲＮＡ分子の分類である。ｓｉＲＮＡｓは、短い（一般に長さが約２０−２５塩基対）。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現をサイレンスするために使用することができる。さらにまた、ｓｉＲＮＡは、またウイルスおよびレトロウイルス感染などの、ＲＮＡｉに関連した経路においても作用することができる。

【0030】

本明細書に使用される、「分解性重合体」および「非分解性重合体」という用語は、本明細書において記述した重合体がより小さな断片に分解する能力をいう。本発明の一定の態様において、分解性重合体は、生理的ｐＨにて壊れることができる。一定の態様において、分解性重合体は、およそｐＨ ７．４にて分解することができる。一定の態様において、分解性および非分解性重合体の混合物により、分解性重合体混合物を得ることができる。一定の態様において、分解性および非分解性重合体の混合物は、生理的ｐＨにて分解することができる。一定の態様において、分解性および非分解性重合体の混合物は、およそｐＨ ７．４にて分解することができる。

【0031】

本明細書に使用される、「突然変異体遺伝子」および「標的突然変異体遺伝子」という用語は、対応する正常な、変異されていない細胞の遺伝子（本明細書において「対応する野生型遺伝子」といわれる）に相対的に少なくとも１つの点突然変異を含む遺伝子をいう。突然変異体遺伝子および標的突然変異体遺伝子という用語は、具体的には、その発現が疾患または障害と関連する正常細胞の遺伝子（たとえば、癌遺伝子）また遺伝子断片の任意の変異体を包含する。

【0032】

本明細書に使用される、「抱合体」または「抱合体薬剤」または「表面に抱合されたターゲティング薬剤」または「重合体ナノカプセル抱合体」という用語は、重合体ナノカプセルに抱合され、および特異的細胞タイプの表面に対する重合体ナノカプセルの特異的ターゲティングを提供し、これにより特異的細胞タイプに対するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの送達を指揮するタンパク質またはその有効な部分などの任意の部分をいう。たとえば、接合体薬剤は、細胞特異的な細胞表面受容体に結合し、これにより重合体ナノカプセルを標的細胞のすぐ近くにさせることができる。一定の態様において、重合体ナノカプセルの特異的ターゲティングを達成するために使用される接合体は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ａＨＬＡおよびトランスフェリンを含む。その他の態様において、接合体は、細胞特異的抗体またはその断片であることができる。細胞タイプに特異的にターゲットするために使用される抱合体のさらなる例は、詳細な説明において下に記述してある。

【0033】

「相補的ＲＮＡ鎖」という用語（また本明細書において「アンチセンス鎖」ともいわれる）は、標的遺伝子の発現の間に形成されるｍＲＮＡ転写物またはそのプロセシング産物に相補的であるｄｓＲＮＡの鎖をいう。本明細書に使用される、「相補的ヌクレオチド配列」という用語は、標的突然変異体遺伝子（すなわち、標的遺伝子の「対応するヌクレオチド配列」）のｍＲＮＡ転写物の領域に相補的である相補的ＲＮＡ鎖上の領域をいう。「ｄｓＲＮＡ」は、２つの相補的な、および逆平行の核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子をいう。ｄｓＲＮＡの全てのヌクレオチドが、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を示さなければならないというわけではない。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡで最も短い鎖におけるヌクレオチドの数である。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なるヌクレオチドの数を有してもよい。相補的ＲＮＡ鎖の相補的ヌクレオチド領域は、２５未満、好ましくは１９〜２４、より好ましくは２０〜２４、さらにより好ましくは２１〜２３および最も好ましくは２２または２３ヌクレオチドの長さである。相補的ＲＮＡ鎖は、３０未満、好ましくは２５未満、より好ましくは２１〜２４および最も好ましくは２３ヌクレオチドの長さである。標的突然変異体遺伝子の発現を阻害する際に、この長さの相補的またはアンチセンス鎖（「短鎖干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」として公知）を含むｄｓＲＮＡは、特に効率的である。「に導入すること」は、当業者によって理解されるとおり、細胞における取り込みまたは吸収を意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、細胞プロセスを介して、または補助薬剤もしくは装置によって行うことができる。たとえば、インビボでの送達のためには、ｄｓＲＮＡを組織部位に注射すること、または全身投与することができる。インビトロでの送達は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当該技術分野において公知の方法を含む。

【0034】

本明細書に使用される、「発現の選択的阻害」は、ｄｓＲＮＡが標的突然変異体遺伝子の発現に対して、対応する野生型遺伝子に対するよりも優れた阻害作用を有することを意味する。好ましくは、標的突然変異体遺伝子の発現レベルは、対応する野生型遺伝子の発現レベルの９８％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満である。

【0035】

本明細書に使用され、および当技術分野において公知のとおり、「同一性」という用語は、配列を比較することによって定まる、２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。また、同一性は、一連のこのような配列の間のマッチによって定まる、ポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味する。同一性は、容易に算出することができる（たとえばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９８）および Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）を参照されたい、これらの両方が本明細書において参照により援用される）。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定するための多数の方法が存在するが、本用語は当業者に周知である（たとえば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）； およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ．， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）を参照されたい）。配列間の同一性を決定するために一般に使用される方法は、たとえばＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ． （１９８８） ４８：１０７３に開示されたものを含む。本明細書に使用される、「実質的に同一」は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的遺伝子の対応する部分との間に非常に高い程度の相同性（好ましくは１００％の配列同一性）があることを意味する。しかし、９０％または９５％を上回る配列同一性を有するｄｓＲＮＡを本発明において使用してもよく、およびしたがって、遺伝子突然変異、株多型または進化の多様性のために予想され得る配列変異が許容され得る。１００％の同一性が好ましいが、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡと標的遺伝子との間に単一または複数の塩基対ランダムミスマッチを含んでもよい。

【0036】

本明細書に使用される、「治療」という用語は、疾患、疾患の症候または疾患への素因を、治療する、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、直す、寛解させる、改善する、または影響を及ぼす目的で、障害、たとえば疾患または状態、疾患の症候または疾患への素因を有する、患者に対する治療的薬剤の適用もしくは投与、または患者からの摘出組織もしくは株化細胞に対する治療的薬剤の適用または投与をいう。

【0037】

本明細書に使用される、「医薬組成物」は、ｄｓＲＮＡの薬理学的に有効な量および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に使用される、「薬理学的に有効な量」、「治療的に有効な量」または単に「有効量」は、意図された薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに有効なＲＮＡのその量をいう。たとえば、所与の臨床的治療が、疾患または障害と関連する測定可能なパラメーターにおける少なくとも２５％の減少があるときに有効であるとみなされる場合、その疾患または障害の治療のための薬物の治療的に有効な量は、そのパラメーターにおける少なくとも２５％の減少を生じさせるために必要な量である。

【0038】

「薬学的に許容される担体」という用語は、治療的薬剤の投与のための担体をいう。このような担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合せを含むが、限定されない。本用語は、細胞培養培地を具体的に除外する。経口的に投与される薬物については、薬学的に許容される担体は、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤などの薬学的に許容される賦形剤を含むが、限定されない。適切な不活性希釈剤は、ナトリウムおよび炭酸カルシウム、ナトリウムおよびリン酸カルシウムおよびラクトースを含み、一方で、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸は、適切な崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよびゼラチンを含んでもよく、一方で、平滑剤は、存在する場合、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであるだろう。必要に応じて、錠剤は、胃腸管における吸収を遅延させるためにグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなどの材料で被覆されていてもよい。

【0039】

導入
ＲＮＡ干渉は、特異的遺伝子発現をサイレンスするための強力なツールであり、および様々なＲＮＡｉに基づいた療法がヒト疾患について考慮されている。しかし、ヒトにおける適用のためのＲＮＡｉの有効な使用にとっての主な障害は、細胞へのその有効な送達である。たとえば、レンチウイルスベクターによる造血幹細胞への短鎖ヘアピンｓｈＲＮＡの形質導入は、ｓｉＲＮＡの内因性合成を可能にすることが示されており、持続可能な遺伝子サイレンシングを提供することができる。しかし、移植手順において使用される毒性の骨髄破壊療法および遺伝子修飾された細胞の移植の制限は、現在広い適用を制約する。

【0040】

カチオン性リポソーム、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）およびカチオン性重合体を含む様々な非ウイルスｓｉＲＮＡ送達系が提唱されてきた。リポフェクトアミン（登録商標）および脂質様材料などのカチオン性脂質は、インビトロ研究のために広く使用されており、および特に肝臓におけるインビボ遺伝子サイレンシングための可能性が示されている。ＣＰＰに基づいたアプローチの一例として、ｓｉＲＮＡを複合形成された粒子内にＣＰＰまたはＣＰＰバイオ接合体と共に組織化して、著しく向上された送達効率を生じることができる。それにもかかわらず、このような構造の形成は、弱い非共有性の相互作用によって駆動され、およびこれらの粒子は、一般に、特に血清ヌクレアーゼに対して不安定であった。

【0041】

カチオン重合体に基づいたアプローチのためには、ｓｉＲＮＡを、静電的相互作用を介して主にカチオン性重合体と共に組織化することができる。たとえば、ターゲティング薬剤としてトランスフェリンを伴うカチオン性重合体に基づいたナノ粒子は、ヒトにおいて腫瘍にｓｉＲＮＡ分子を送達し、およびリボヌクレオチド還元酵素サブユニットＲＲＭ２、抗癌標的の発現を減少させることを示した。しかし、ＣＰＰに基づいたアプローチと同様に、このような系は、非共有性の静電的自己組織化に基づいており、これは血流内で電解質およびポリイオンからの競合を有する。したがって、集中的な努力にもかかわらず、ｓｉＲＮＡのための有効な送達媒体の設計および合成は、困難なままである。

【0042】

上で記述した困難にもかかわらず、ｓｉＲＮＡは、特異的遺伝子を調節し、および対応するタンパク質の発現を制御するこれらの独特の能力に起因して、多様なヒト疾患の治療のための広い可能性を持つ最も有望かつ特異的な薬剤候補の１つになった。インビトロにおけるｓｉＲＮＡ送達のための現在の市販の製品は、リポフェクションおよびヌクレオフェクションを含む。これらの２つの方法は、多くの株化細胞において広く（ｗｉｄｌｙ）適用できるが、送達効率および初代細胞における毒性は、大変困難なままである。

【0043】

ｓｉＲＮＡのインビボ送達については、全身投与を介した哺乳類におけるｓｉＲＮＡによって媒介される遺伝子サイレンシングが裸のｓｉＲＮＡを使用して達成された。しかし、この投与は、ヒトに適合性でなく、およびヒトにおける使用のために多くの制限を有する。いくつかの最近の研究は、アルギニンペプチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよびプロタミンのように正に荷電したペプチドまたはタンパク質を使用してマウスモデルおよび非ヒト霊長類において改善されたｓｉＲＮＡ送達を示した。Ｃｒｏｍｂｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ａ Ｎｅｗ Ｐｏｔｅｎｔ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００９， １７（１）：９５−１０３。もう一つの最近の研究は、メラノーマ細胞にターゲットされるｓｉＲＮＡナノ粒子の全身投与を介した、ヒトにおけるＲＮＡｉ機構の存在を証明する。Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ＲＮＡｉ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｆｒｏｍ ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｉＲＮＡ ｖｉａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１０， ４６４（７２９１）：１０６７−１０７０。それにもかかわらず、ターゲティング部位への高度に有効な送達は、なおも主要な障壁として残り続けている。加えて、有害な免疫応答がｓｉＲＮＡによって引き起こされる可能性も解決されないままである。

【0044】

本明細書において記述したとおりの、高度に安定化されたＲＮＡｉ分子重合体ナノカプセル（「重合体ナノカプセル」）は、インサイチュー重合技術を介して作られ、これはデザインされた電荷および特性をもつＲＮＡｉ分子の表面をカバーする保護的な架橋された分解性重合体シェルを導入した。この架橋された重合体シェルは、Ｒｎａｓｅ分解、温度解離および血清不活性化からの保護をＲＮＡｉ分子に提供する。さらにまた、重合体ネットワークの分解性は、ＲＮＡｉ分子に徐放特性を付与し、より少ない細胞内免疫応答を生じる。重合体ナノカプセルの電荷を調整することにより、ヒト細胞へのＲＮＡｉ分子の送達効率が達成された。さらにまた、２９３Ｔ、Ｈｅｌａ、ＣＥＭおよびＰＢＭＣを含む広く多様な細胞への効率的なＲＮＡｉ分子送達は、高度に正に荷電したナノカプセルで達成された。

【0045】

さらにまた、最適化されたナノカプセル上に表面に抱合体形成されたターゲティング薬剤は、Ｔ細胞などの関心対象の細胞内へのＲＮＡｉ分子の良好なターゲットされた送達を提供した。ＲＮＡｉ分子送達に提供された多様化され、かつ制御可能な非ターゲティングおよびターゲティング能力は、任意の所望の遺伝子発現をノックダウンするために、ＲＮＡｉ分子を使用する多くのインビトロ試験および臨床的適用において重要な意味を有するだろう。

【0046】

重合体ナノカプセル
本発明は、架橋された重合体ナノカプセル内にＲＮＡｉ分子をインプリントするための、自己組織化によるおよびインサイチュー重合技術における新規ストラテジーを提供する。一定の態様において、重合体ナノカプセルは、直径がおよそ２０−１００ｎｍである。重合体ナノカプセルの小さな直径は、外部のＲＮａｓｅ攻撃および血清中和からのＲＮＡｉ分子の保護を最大にする。

【0047】

具体的態様において、重合体ナノカプセルは、１０ｎｍ−２０ｎｍ、２０−２５ｎｍ、２５ｎｍ−３０ｎｍ、３０ｎｍ−３５ｎｍ、３５ｎｍ−４０ｎｍ、４０ｎｍ−４５ｎｍ、４５ｎｍ−５０ｎｍ、５０ｎｍ−５５ｎｍ、５５ｎｍ−６０ｎｍ、６０ｎｍ−６５ｎｍ、７０−７５ｎｍ、７５ｎｍ−８０ｎｍ、８０ｎｍ−８５ｎｍ、８５ｎｍ−９０ｎｍ、９０ｎｍ−９５ｎｍ、９５ｎｍ−１００ｎｍまたは１００ｎｍ−１１０ｎｍである。具体的態様において、重合体ナノカプセルは、およそ１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍ、２０ｎｍ、２１ｎｍ、２２ｎｍ、２３ｎｍ、２４ｎｍ、２５ｎｍ、２６ｎｍ、２７ｎｍ、２８ｎｍ、２９ｎｍ、３０ｎｍ、３１ｎｍ、３２ｎｍ、３３ｎｍ、３４ｎｍ、３５ｎｍ、３６ｎｍ、３７ｎｍ、３８ｎｍ、３９ｎｍ、４０ｎｍ、４１ｎｍ、４２ｎｍ、４３ｎｍ、４４ｎｍ、４５ｎｍ、４６ｎｍ、４７ｎｍ、４８ｎｍ、４９ｎｍ、５０ｎｍ、５１ｎｍ、５２ｎｍ、５３ｎｍ、５４ｎｍ、５５ｎｍ、５６ｎｍ、５７ｎｍ、５８ｎｍ、５９ｎｍ、６０ｎｍ、６１ｎｍ、６２ｎｍ、６３ｎｍ、６４ｎｍ、６５ｎｍ、６６ｎｍ、６７ｎｍ、６８ｎｍ、６９ｎｍ、７０ｎｍ、７１ｎｍ、７２ｎｍ、７３ｎｍ、７４ｎｍ、７５ｎｍ、７６ｎｍ、７７ｎｍ、７８ｎｍ、７９ｎｍ、８０ｎｍ、８１ｎｍ、８２ｎｍ、８３ｎｍ、８４ｎｍ、８５ｎｍ、８６ｎｍ、８７ｎｍ、８８ｎｍ、８９ｎｍ、９０ｎｍ、９１ｎｍ、９２ｎｍ、９３ｎｍ、９４ｎｍ、９５ｎｍ、９６ｎｍ、９７ｎｍ、９８ｎｍ、９９ｎｍ、１００ｎｍ、１０１ｎｍ、１０２ｎｍ、１０３ｎｍ、１０４ｎｍ、１０５ｎｍ、１０６ｎｍ、１０７ｎｍ、１０８ｎｍ、１０９ｎｍ、１１０ｎｍ、１１１ｎｍ、１１２ｎｍ、１１３ｎｍ、１１４ｎｍ、１１５ｎｍ、１１６ｎｍ、１１７ｎｍ、１１８ｎｍ、１１９ｎｍまたは１２０ｎｍの直径である。具体的態様において、重合体ナノカプセルは、１２０ｎｍ−１３０ｎｍ、１３０ｎｍ−１４０ｎｍ、１４０ｎｍ−１５０ｎｍ、１５０ｎｍ−１６０ｎｍ、１６０ｎｍ−１７０ｎｍ、１７０ｎｍ−１８０ｎｍ、１８０ｎｍ−１９０ｎｍ、１９０ｎｍ−２００ｎｍ、２００ｎｍ−２１０ｎｍ、２２０ｎｍ−２３０ｎｍ、２３０ｎｍ−２４０ｎｍ、２４０ｎｍ−２５０ｎｍまたは２５０ｎｍより大きい直径である。

【0048】

一定の態様において、本明細書において開示した重合体ナノカプセルのさらなる利点は、非ターゲティングおよびターゲティング能力、より高い効率およびより低い有害な免疫応答を含む。たとえば、より高い効率は、さらなる取り込みおよびより定方向の送達から生じ得る。

【0049】

さらに、保護ナノカプセル内の高度に安定化されたＲＮＡｉ分子は、一旦ナノ構造重合体シェルがエンドソームおよびリソソームにおいて分解されると、完全に放出させることができる。一定の態様において、非ターゲティング重合体にカプセル化されたＲＮＡｉ分子は、リポソーム形質導入によって生じる低効率および高い毒性と比較して、優れた効率および非細胞毒性でインビトロにおいてＰＢＭＣなどの初代細胞に形質導入することができる。

【0050】

重要なことに、適切な重合体電荷を選択し、およびデザインすることによって、具体的目的（本明細書において記述した重合体（ｐｏｌｙｍｎｅｒ）ナノカプセルに部分を抱合することによるターゲティングなど）のためにＲＮＡｉ分子送達の方法を調節することができる。

【0051】

一定の態様において、分解可能な架橋剤対非分解性架橋剤の比は、１：１、１：２、２：１、１：３、２：３、３：１、３：２、４：１、１：４、４：３、３：４、５：１、１：５、２：５、５：２、５：３、３：５、４：５、５：４、６：１、１：６、１：７、７：１、２：７、７：２、３：７、７：３、４：７、７：４、５：７、７：５、６：７、７：６、８：１、１：８、３：８、８：３、５：８、８：５、７：８、８：７、９：１、１：９、２：９、９：２、４：９、９：４、５：９、９：５、７：９、９：７、８：９、９：８、１０：１、１：１０、３：１０、１０：３、７：１０、１０：７、９：１０、１０：９または当業者には使用することがが公知だろう任意のその他の比である。

【0052】

一定の態様において、分解可能な架橋剤は、表２における架橋剤１、２、３、４または６の１つまたは複数である。一定の態様において、非分解性架橋剤は、表２における架橋剤５である。

【0053】

一定の態様において、重合体ナノカプセルは、１時間または２時間または３時間または４時間または５時間または６時間または７時間または８時間または９時間または１０時間または１１時間または１２時間または１３時間または１４時間または１５時間または１６時間または１７時間または１８時間または１９時間または２０時間または２１時間または２２時間または２３時間または１日または２日または３日または４日または５日または６日または１週間または２週間または３週間または１ヵ月またはこれらの任意の組み合わせで分解するようにデザインされる。一定の態様において、重合体ナノカプセルが生理的ｐＨにて上記の割合のいずれかにて分解するようにデザインされている。具体的態様において、重合体ナノカプセルは、その必要のある被験体に対する投与後に上の割合のいずれかにて分解するようにデザインされる。

【0054】

具体的態様において、ＲＮＡｉ分子は、インビボにおいて特異的部位に効率的に送達することができる。一定の態様において、ターゲティング薬剤（すなわち、抱合体または抱合体薬剤）は、重合体ナノカプセルに抱合される。一定の態様において、抱合体は、重合体粒子からのターゲティング薬剤の解離を妨げる。具体的態様において、シクロデキストリンおよびアダマンタンは、ターゲティング薬剤抱合のために使用することができる。

【0055】

一つの態様において、本発明は、インビトロ試験および静脈内注射を経た特異的組織および器官に対するインビボターゲティングに対して高い効率および低い毒性でターゲットされないおよびターゲットされた重合体ナノカプセルＲＮＡｉ分子送達を使用して実践される。

【0056】

また、架橋された重合体に起因するＲＮＡｉ分子の増強された安定性により、それがターゲティング部位に到達する前の体におけるその長期の循環を保証する。全体として、本明細書において記述した新規ＲＮＡｉ分子送達技術は、インビトロおよび予測されるインビボの両方で、顕著な効率、増大された安定性および軽微な毒性を有する。

【0057】

単量体および架橋剤
異なる単量体および架橋剤を、インサイチュー重合によってＲＮＡｉ分子をカプセル化するために、使用することができる。

【0058】

一定の態様において、正の単量体は、以下の構造を有し：

【化1】

式中、
Ｒ^２０は、非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルであり
Ｒ^２１は、以下からなる群より選択され：

【化2】

式中、ｍは、１から５の整数であり；
Ｒ^２２は、Ｈまたは非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはＮＲ^２５Ｒ^２６で置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、式中
Ｒ^２５およびＲ^２６は、Ｈまたは非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはアミノで置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはＮＲ^２７Ｒ^２８で置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルから独立して選択され、式中、
Ｒ^２７およびＲ^２８は、Ｈまたは非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはアミノで置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルから独立して選択され、
Ｒ^２３は、Ｈまたは非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはアミノで置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはＮＲ^２９Ｒ^３０で置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、式中、
Ｒ^２９およびＲ^３０は、Ｈまたは非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはアミノで置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはＮＲ^３１Ｒ^３２で置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルから独立して選択され、式中、
Ｒ^３１およびＲ^３２は、Ｈまたは非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルまたはアミノで置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルから独立して選択され、
およびＲ^２２およびＲ^２３は、任意に結合して５〜７員のヘテロシクロアルキル環を形成し；および
Ｒ^２４は、孤立電子対または非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルである。

【0059】

一定の態様において、架橋剤は、以下の構造を有する：

【化3】

式中Ｒ^１は、非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^４は、非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキルであり、
およびＡは、以下からなる群より選択され：

【化4】

式中Ｒ^１０は、非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキレン；
アミノ酸；
２から１０のアミノ酸からなるペプチドであり；

【化5】

式中Ｒ^１１は、非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキレンであり、およびＲ^１２は、非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキレンであり；

【化6】

式中ｎは、１から１０までである；および

【化7】

式中Ｒ^１３は、非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキレンであり、およびＲ^１４は、非置換のＣ_１−Ｃ_６アルキレンである。

【0060】

一定の態様において、中性単量体は、以下の構造を有する：

【化8】

式中Ｒ１は、非置換のＣ１−Ｃ４アルキルであり、およびＲ２は、アミノまたはヒドロキシ置換されたアルキルで置換されたアミノまたはＯＲ^３であり、式中Ｒ３は、ヒドロキシアルキルである。

【0061】

単量体の非限定的な例を、表１および３に示す。架橋剤の非限定的な例を、表２において見いだすることができる。抗体、ペプチドまたは成長因子などの、ターゲティング薬剤は、下記のように、重合体と共有結合的にまたは非共有結合的に抱合することができる。

【0062】

表１． ＲＮＡｉ分子重合体ナノカプセルのための正に荷電した単量体の非限定的な例（＊単量体は市販ではなく、およびこれらのナノカプセル（ｎａｎｏｃａｓｐｕｌｅ）の製造のために特別に合成した）。

【表1】

【0063】

表２． ＲＮＡｉ分子重合体ナノカプセルのための架橋剤の非限定的な例。

【表2】

【0064】

表３． ＲＮＡｉ分子重合体ナノカプセルのための中性単量体の非限定的な例。

【表3】

【0065】

重合体ナノカプセル抱合体
一定の態様において、細胞へのＲＮＡｉ分子のターゲットされた送達を、最適化したナノカプセルにおいて表面複合ターゲティング薬剤を使用して達成する。特に興味深いのは、重合体ナノカプセル抱合体は、免疫、肺性、肺、眼、肝臓、腎臓、脳、中枢神経系、末梢神経系、心臓、癌、増殖性、ウイルスにまたはレトロウイルスに感染した、幹、皮膚、腸管および／または聴覚の細胞をターゲットするために使用することができる。

【0066】

一定の態様において、重合体ナノカプセルの特異的ターゲティングを達成するために使用される抱合体は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ａＨＬＡおよびトランスフェリンを含む。一定の態様において、重合体ナノカプセルの特異的ターゲティングを達成するために使用される抱合体は、分化のクラスターまたはデジグネーションクラスター（ＣＤ）マーカーのいずれか１つまたは複数を含む。たとえば、ＣＤマーカーは、ＣＤＸを含み、Ｘは１〜３４０のいずれか１つであることができる。本明細書において記述したように、たとえば、「ＣＤ１」という用語は、全てのＣＤ１変異体およびサブタイプを意味する。これは、本明細書において記述した全てのＣＤマーカーに適用される。

【0067】

一定の態様において、重合体ナノカプセルの特異的ターゲティングを達成するために使用される抱合体は、ＡＦＰ、ベータ−カテニン、ＢＭＩ−１、ＢＭＰ−４、ｃ−ｋｉｔ、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ−１、ＣＸＣＲ４、デコリン、Ｅ−カドヘリン、カドヘリン１、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＴＲＯＰ−１、ＦｃイプシロンＲＩ Ａ、ＦＣＥＲ１Ａ、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＭＯ２、Ｎｏｄａｌ、Ｎｏｔｃｈ−１、ＰＤＧＦＲＢ、ポドプラニン、ＰＴＥＮ、ソニックヘッジホッグ、ＳＴＡＴ３、シンデカン−１、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｆｅｒｒｉｎ）およびビメンチンのいずれか１つまたは複数を含む。

【0068】

一定の態様において、重合体ナノカプセルの特異的ターゲティングを達成するために使用される抱合体は、ＡＬＫ、ＡＦＰ、Ｂ２Ｍ、Ｂｅｔａ−ｈＣＧ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、カルシトニン、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＤ２０、クロマグラニン（Ｃｈｒｏｍａｇｒａｎｉｎ）Ａ、サイトケラチンまたはその断片、ＥＧＦＲ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、フィブリン、フィブリノゲン、ＨＥ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩｇＧ変異体、ＫＩＴ、乳酸デヒドロゲナーゼ、核マトリックスタンパク質２２、ＰＳＡ、チログロブリン、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１およびＯｖａ１のいずれか１つまたは複数を含む。

【0069】

本明細書において記述した、または当業者に公知の任意のマーカーは、特異的細胞の所望のターゲティングを達成するために、単独で、または１つまたは複数のさらなるマーカーと組み合わせて使用することができる。

【0070】

当業者に公知の全てのその他の細胞および／または組織特異性マーカーは、参照により本明細書に援用される。

【0071】

ターゲット遺伝子の発現によって生じる疾患を治療する方法
一つの態様において、本発明は、ターゲット突然変異遺伝子の発現によって生じる疾患を有する、または発症するリスクのある被験体を治療する方法に関する。一定の態様において、本明細書において記述した重合体ナノカプセルは、細胞の増殖性および／または分化性障害の１つまたは複数を制御するための新規の治療的薬剤として作用することができる。一定の態様において、重合体ナノカプセルは、１つまたは複数の免疫または免疫不全障害を制御するための新規の治療的薬剤として作用することができる。一定の態様において、重合体ナノカプセルは、ウイルス複製またはウイルス感染を予防するための新規の治療的薬剤として作用することができる。一定の態様において、重合体ナノカプセルは、１つのまたは複数の神経性または神経変性障害を制御するための新規の治療的薬剤として作用することができる。一定の態様において、重合体ナノカプセルは、癌を治療する、または予防するための新規の治療的薬剤として作用することができる。

【0072】

一定の態様において、重合体ナノカプセルは、進行癌、先天性爪肥厚、年齢関連性の黄斑変性症、脈絡膜血管新生、転移性メラノーマ、ＣＮＳ転移のない転移性メラノーマ、慢性骨髄性白血病、固形腫瘍、進行型固形腫瘍、視神経萎縮、非動脈性（ａｒｔｅｒｉｃ）前部虚血性視神経症、膵臓癌、膵管腺癌、糖尿病性（ｄｉａｖｅｔｉｃ）黄斑浮腫、高コレステロール血症、肝臓転移を伴う結腸直腸癌、肝臓転移を伴う膵臓癌、肝臓転移を伴う胃癌、肝臓転移を伴う乳癌、肝臓転移を伴う卵巣癌、子癇前症、神経芽細胞腫、高眼圧、広隅角緑内障、緑内障、眼疼痛、乾性眼症候群、腎臓傷害、急性腎不全、臓器移植後臓器機能障害、腎臓移植の合併症、ＴＢＸ３過剰発現および糖尿病性網膜症を治療するための新規の治療的薬剤として作用することができる。

【0073】

具体的態様において、重合体ナノカプセルは、ウイルス感染を治療するための新規の治療的薬剤として作用することができる。具体的態様において、重合体ナノカプセルは、レトロウイルスのウイルス感染を治療するための新規の治療的薬剤として作用することができる。具体的態様において、重合体ナノカプセルは、ＨＩＶまたはＡＩＤＳ感染症を治療するための新規の治療的薬剤として作用することができる。具体的態様において、重合体ナノカプセルは、レトロウイルスのウイルス感染を抑制するための新規の治療的薬剤として作用することができる。具体的態様において、重合体ナノカプセルは、レトロウイルスまたはウイルス複製を遮断する、妨げる、またはダウンレギュレートするための新規の治療的薬剤として作用することができる。

【0074】

一定の態様において、本明細書において記述した重合体ナノカプセルは、硝子体内注射によって、静脈内に、片足の底面における皮膚硬結への注射によって、経口投与によって、皮下に、および当業者に公知の医薬品投与の任意のその他の様式によって投与することができる。

【0075】

一定の態様において、本方法は、被験体に本発明の医薬組成物を投与することを含み、その結果、ターゲット突然変異遺伝子の発現は、サイレンスされ、またはダウンレギュレートされる。一定の態様において、被験体は、哺乳動物である。一定の態様において、哺乳動物は、ヒトである。これらの高い特異性のため、本発明の重合体ナノカプセルは、本明細書において記述したように、病気にかかった細胞および組織の突然変異遺伝子を特異的にターゲットする。

【0076】

疾患の予防において、ターゲット遺伝子は、疾患の開始もしくは維持のために必要とされたか、またはより高い疾患にかかるリスクと関連するとして同定されたものでもよい。疾患の治療において、重合体ナノカプセルは、疾患を示す細胞または組織と接触することができる。１つの非限定的な例として、重合体ナノカプセルは、癌と関連する変異した遺伝子の全部または一部と実質的に同一であり、または腫瘍細胞において高レベルにて発現したものは、癌性細胞または腫瘍遺伝子と接触する、またはそれに導入しされ得る。もう一つの非限定的な例として、重合体ナノカプセルは、ウイルス性またはレトロウイルス性疾患と関連する変異した遺伝子の全部または一部と実質的に同一である。具体的には、本明細書において記述した重合体ナノカプセルで治療することができるレトロウイルス疾患の非限定的な例は、ＨＩＶである（図３、４および６〜１０を参照されたい）。

【0077】

細胞の増殖性および／または分化性障害の非限定的な例は、癌、たとえば癌腫、肉腫、転移性障害または造血性腫瘍性障害、たとえば白血病を含む。転移性腫瘍は、多数の原発性腫瘍型から生じることができ、前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓起源のものを含むが限定されない。本明細書に使用される、「癌」、「過剰増殖性」および「腫瘍性」という用語は、自律的な成長、すなわち迅速に増殖する細胞成長によって特徴づけられる状況の異常状態に対して能力を有する細胞をいう。これらの用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性の段階にかかわりなく、全てのタイプの癌性成長または発癌性プロセス、転移性組織または悪質に形質転換した細胞、組織もしくは器官を含むことを意味する。また、増殖障害は、造血性腫瘍性障害を含み、造血性起源の過形成性／腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｔｉｃ）の細胞を含む、たとえば骨髄性、リンパ様もしくは赤血球系統またはその前駆細胞から生じる疾患を含む。

【0078】

細胞成長および分化を直接または間接的に制御する細胞の遺伝子における突然変異は、癌の主な原因であると考えられる。およそ３０の遺伝子のファミリーがあり、発癌遺伝子と呼ばれ、ヒト腫瘍形成に関係する。１つのこのようなファミリー、ＲＡＳ遺伝子ファミリーのメンバーは、真核細胞の広い範囲において保有され、およびヒト腫瘍において変異されることが頻繁に見いだされる。本発明の重合体ナノカプセルを使用してこのような癌遺伝子をターゲットし、これらの発現をノックダウンまたは妨げることができる。

【0079】

癌遺伝子に加えて、本発明の方法および組成物は、点突然変異を有するその他の疾患関連ターゲット遺伝子に適用することができる。遺伝子突然変異は、１０００を超える異なるヒト遺伝子において報告されてきた。これらの突然変異およびこれらの関連する表現型についてのデータはまとめられており、２つの主要なデータベースを介してオンラインで利用できる：Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ ｉｎ ＢａｌｔｉｍｏｒｅおよびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ Ｃａｒｄｉｆｆ。たとえば、ヒトゲノムにおける高頻度のＣＧからＴＧまたはＣＡ突然変異は、５’メチルシトシンの脱アミノに起因する。また、２０未満のヌクレオチドの短い欠失または挿入は、ヒトにおける非常に共通の突然変異である。たとえば、Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ， Ｓ． Ｅ．， Ｅｕｒ． Ｐｅｄｉａｔｒ． （２０００） １５９（３）：５１７３−８を参照されたい。

【0080】

さらにまた、Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍらは、１，４２０，０００の単一のヌクレオチド多型を含むヒトゲノム配列変異のマップを記述し、診断および療法のための生物医学的に重要な遺伝子を同定するために有用である（Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （２００１） ４０９（６８２２）：８２１−２ ａｎｄ Ｎａｔｕｒｅ （２００１） ４０９（６８２２）：８２２−３）。マップは、記述された遺伝子およびその他のゲノム特徴を伴う全ての一般公開されているＳＮＰｓを組み込む。ほぼ６０，０００のＳＮＰｓは、エクソン（コードおよび非翻訳領域）内にあり、およびエクソンの８５％は、最も近いＳＮＰの５ｋｂ以内にある。Ｃｌｉｆｆｏｒｄらは、癌ゲノム解剖プロジェクトによって同定された単一ヌクレオチド多型の発現に基づいた遺伝的／物理的なマップを提供する（Ｃｌｉｆｆｏｒｄ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ （２０００） １０（８）：１２５９−６５）。ＳＮＰマップに加えて、Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｍらは、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺または前立腺組織において発現した遺伝子におけるＳＮＰを含むマップを提供する。

【0081】

したがって、本発明のＲＮＡｉ分子重合体ナノカプセルは、このような突然変異遺伝子をターゲットして、これらの発現をノックダウンまたは妨げるために、使用することができる。

【0082】

突然変異遺伝子の発現を阻害する方法
さらにもう一つの側面において、本発明は、被験体における突然変異遺伝子の発現を阻害するための方法に関する。本方法は、被験体に本発明の組成物を投与することを含み、その結果、突然変異遺伝子の発現が、対応する野生型遺伝子と比較してサイレンスされる。一定の態様において、被験体は、哺乳動物である。一定の態様において、哺乳動物は、ヒトである。

【0083】

これらの高い特異性のため、本発明のｓｉＲＮＡナノカプセルは、ターゲット突然変異遺伝子のＲＮＡｓ（初生のまたはプロセシングされたもの）を、および驚くべきことに低投薬量にて特異的にターゲットする。重合体ナノカプセルを使用してターゲット遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書において記述したように行うことができる。

【0084】

一つの態様において、本発明は、重合体ナノカプセルを含む組成物を投与することを含み、重合体ナノカプセルは、実質的にターゲット突然変異遺伝子のＲＮＡ転写物に相補的な、および対応する野生型遺伝子に部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含む。治療された被験体がヒトなどの哺乳動物であるとき、組成物は、以下を含む経口または非経口経路を含むが、限定されない当該技術分野において公知の任意の手段によって投与してもよい：静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、膣および局所投与（頬側および舌下を含む）。好ましい態様において、組成物は、静脈内または非経口内注入または注射によって投与される。

【0085】

ターゲット遺伝子の発現阻害のための方法は、サイレンスしたい任意の突然変異遺伝子に適用でき、これにより選択的にその発現を阻害する。サイレンシングのためにターゲットすることができるヒト遺伝子の非限定的な例は、以下を含む：癌遺伝子サイトカイニン遺伝子、イディオタイプタンパク質遺伝子、プリオン遺伝子、血管形成を誘導する分子を発現する遺伝子、接着分子をコードする遺伝子、細胞表面受容体をコードする遺伝子、転移および／または浸潤プロセスに関与するタンパク質の遺伝子、プロテアーゼの、並びにアポトーシスおよび細胞周期を調節する分子の遺伝子、ＥＧＦ受容体を発現する遺伝子、複数薬物耐性１遺伝子（ＭＤＲ１遺伝子）をコードする遺伝子、ウイルスの取り込みおよび複製を可能にする遺伝子、神経変性障害を生じさせる遺伝子、タンパク質凝集および／または蓄積を生じさせる遺伝子、ホルモンのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを生じさせる遺伝子、神経性障害を生じさせる遺伝子、心臓障害を生じさせる遺伝子および心理的障害を生じさせる遺伝子。当業者であれば、どの遺伝子が上記した例示的な遺伝子の広いカテゴリーに包含されるか理解するだろう。

【0086】

製造の方法
一定の態様において、本明細書において記述した重合体ナノカプセルは、特定のサイズを達成するように、遺伝子ダウンレギュレーションのために特異的部位をターゲットするように、および特異的遺伝子をダウンレギュレートするように製造される。本明細書において記述した重合体ナノカプセルのサイズは、本明細書において記述した重合体：架橋剤の比に基づいて決定することができる。たとえば、ターゲットされた送達は、本明細書において記述した重合体ナノカプセルの外側に付着された（すなわち、抱合された）抱合体薬剤を使用して達成することができる。さらにまた、本明細書において記述した重合体ナノカプセルのＲＮＡｉ分子の特異的遺伝子への特異的結合（これにより、特異的遺伝子発現を減少する）は、当業者に公知の方法を使用してＲＮＡｉ分子をデザインすることによって達成することができる。たとえば、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， “Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｓｉＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，” Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２００７；２（９）：２０６８−７８を参照されたい。さらにまた、重合体ナノカプセルがターゲット部位にＲＮＡｉ分子を送達する能力は、本明細書において記述したように分解性：非分解性重合体の比を調整することによって最適化すること、および決定することができる。

【0087】

投与の方法
本発明によって包含される医薬組成物は、以下を含む経口または非経口経路を含むが、限定されない当該技術分野において公知の任意の手段によって投与されてもよい：静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、膣および局所投与（頬側および舌下を含む）。好ましい態様において、医薬組成物は、静脈内または非経口内注入または注射によって投与される。

【実施例】

【0088】

実施例１． ナノカプセルの製造
高安定化ｓｉＲＮＡ重合体ナノカプセルを、実施例１および図１および２に記載されているように、インサイチュー重合技術を介して作製した。図１に示すｓｉＲＮＡナノカプセルプラットフォームの製造を、正に荷電した単量体Ａ、架橋剤Ｂ、中性コモノマーＣで開始し、および静電的相互作用および水素結合を介して負に荷電したｓｉＲＮＡの表面周辺にこれらの分子を濃縮する。一連の正に荷電した単量体（表１）、架橋剤（表２）および中性コモノマー（表３）を重合体ナノカプセルプラットフォームの製造に使用した。異なる架橋剤、たとえば表２に収載したものを調整可能な組成物、構造、表面特性および官能性をもつ共重合体コーティングを形成するために使用することができる。

【0089】

このインサイチュー重合技術により、デザインされた電荷および特性をもつｓｉＲＮＡの表面上に保護性の架橋された分解性重合体シェル被覆を導入した。この架橋された重合体シェルは、Ｒｎａｓｅ分解、温度解離および血清不活性化からの保護をｓｉＲＮＡに提供する。ｓｉＲＮＡナノカプセルにおいて使用することができる架橋剤の非限定の例を表２に提供してある。

【0090】

実施例２． アクリル−スペルミンを使用するナノカプセルの製造
この実施例では、アクリル−スペルミンの調製をアクリル酸、ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＡＳ）とスペルミンを反応させることによって達成した。簡潔には、それぞれ、スペルミン（１００ｍｇ）およびＮＡＳ（８０ｍｇ）を１ｍＬクロロホルムに溶解した。次いで、ＮＡＳ溶液を激しい撹拌下で室温にて徐々にスペルミン溶液に添加した。一晩の反応後、混合物を濾過して副生成物を除去した。次いで、濾液を回転蒸発によって乾燥し、続いてｄｄＨ２Ｏで再分散した。不溶性物質の除去後、溶液を凍結乾燥した。最後に、アクリル−スペルミンをＴＬＣ処理することによって精製した。当業者であれば、これがアクリル−スペルミンを製造する例示的な方法であり、およびその代わりの方法を同じ結果に到達するために使用することができることを理解するだろう。

【0091】

図２にて図示したように、ナノカプセルの製造は、正に荷電した重合性単量体から開始した。この実施例の目的のためには、正に荷電した重合性単量体は、上記の通りに調製されたアクリル−スペルミンである。重合体ナノカプセルを製造するプロセスの第１の工程は、負に荷電したｓｉＲＮＡの表面周辺に濃縮された静電的相互作用を必要とした。最初の相互作用後、水性溶液におけるその後の室温重合が、ｐＨ分解性架橋剤および親水性単量体で起こった。室温重合の間、それぞれのｓｉＲＮＡ分子は、重合体ネットワークの薄いシェルで包まれた。このような架橋されたシェルは、コアを持つｓｉＲＮＡを加水分解から保護するのに役に立った。アクリル−スペルミンおよび親水性単量体の比の特異的調整により、表面電荷の精密な制御が可能になり、および重合体ナノカプセルの有効な細胞形質導入を確実にした。その上、２は、中性ｐＨにおいて安定であるが、ｐＨ〜５．４である後期エンドソームなどの酸性環境において迅速に分解する。我々は、この独特の反応性の設計が、血清（ｐＨ〜７．４）において顕著な安定性をもつ重合体ナノカプセルを提供し、一方で、シェルの分解によりエンドソームからのこれらの逸脱を可能にし、これが細胞質にｓｉＲＮＡを放出する（工程ＩＶ）と考える。さらにまた、我々の合成アプローチは、重合体ナノカプセル表面へのターゲティング成分（たとえば、抗体）の固定を可能にし、ｓｉＲＮＡのターゲティング送達を可能にする。

【0092】

実施例３． ナノカプセルがカプセル化されたｓｉＲＮＡを保護および送達する能力
本明細書において記述した重合体ナノカプセルの効力を試験するために、ｓｉＲＮＡを効率的に送達する単一のｓｉＲＮＡナノカプセルプラットフォームを生成した。重合体ナノカプセルをどのように作製するかという模式図を図１および図２に示してある。このプラットホームのこれらのナノカプセルを、カプセル化されたｓｉＲＮＡをヌクレアーゼから保護するためにデザインし、および細胞にｓｉＲＮＡを効率的に送達することができる。

【0093】

重合体ナノカプセルがカプセル化されたｓｉＲＮＡを保護し、および細胞に効率的にｓｉＲＮＡを送達する能力を試験するために、周知のｓｉＲＮＡ１００５を重合体ナノカプセルの調製において使用した。ｓｉＲＮＡ１００５は、ＨＩＶ−１コレセプターＣＣＲ５をターゲットする短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡ１００５の十分に特徴づけられた効力は、単一分子ナノカプセル送達技術を適用することによってＣＣＲ５ノックダウンを証明するための理想的な候補とした。ｓｉＲＮＡ１００５を伴うナノカプセルの例示的な画像を図４および図５に示してある。

【0094】

概念の証拠として、ＣＣＲ５ ＲＮＡをｓｉＲＮＡ１００５のナノカプセルによって効率的にノックダウンすることができることを示した。このナノカプセルプラットフォームの１つの独特の利点は、単量体および粒子のサイズ、電荷および反応性の化学的特性を変化させる架橋剤を選択することによって重合体ナノカプセルを修飾する能力である。単量体および架橋剤の非限定的な例は、表１および表２において見いだすることができる。

【0095】

また、重合体ナノカプセルがカプセル化した材料を分解から効率的に保護する能力を、タンパク質をカプセル化することによって証明した。たとえば、ＥＧＦＰ、ＨＲＰおよびカスパーゼ３をカプセル化し、および重合体ナノカプセルで保護した。さらに、また重合体ナノカプセルをカプセル化された量子ドットおよびｓｉＥＧＦＰ、ｓｉルシフェラーゼおよび上記の通りのｓｉ１００５などのｓｉＲＮＡｓに使用した。

【0096】

実施例４． ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを使用するｓｉＲＮＡの送達
ｓｉＲＮＡの送達を、ｓｈＲＮＡ転写ユニットをコードするＤＮＡを使用して達成した。たとえば、プラスミドおよびウイルスのベクターを、これらがｓｉＲＮＡの高レベルおよび長期発現を提供するので、使用した。

【0097】

この実施例では、さらに重合体ナノカプセル技術を、ｓｈＲＮＡ１００５をコードするＤＮＡのナノカプセルに拡張した。実施例３に記載したように、ｓｈＲＮＡ１００５は、ＣＣＲ５ ＲＮＡ発現の発現をターゲットし、およびノックダウンするＲＮＡｉである。このＤＮＡナノカプセル技術は、ＤＮＡ転写ユニットがｓｉＲＮＡより非常に大きいので、上記のＲＮＡｉナノカプセルより困難である。

【0098】

ＤＮＡカセットのカプセル化のための重合体ナノカプセルプラットフォームの配合物を、単量体および粒子のサイズ、電荷および分解性を変化させる架橋剤を調整することによって修飾した。単量体および架橋剤の非限定的な例を表１および表２に提供してある。

【0099】

特に興味深いのは、重合体ナノカプセルを、異なる速度にて分解する架橋剤を使用して遅放のために操作し、数日あるいは数週間にわたって有効なｓｉＲＮＡ活性を可能にした。これは、必要とされる１日あたりの投与である現在の小分子薬物に勝る大きな利点である。

【0100】

実施例５． ＤＮＡ ナノカプセルの合成および送達
図１に図示したように、単量体ＡおよびＢ、架橋剤Ｃから開始し、これらの分子を、静電的相互作用および水素結合を介してＤＮＡカセットの表面に沿って自己組織化した（工程１）。次いで、重合体シェルの薄いネットワークを、その後のインサイチュー重合によってＤＮＡカセット周辺で形成し（工程２）、ＤＮＡを保護する新たな表面特性を効率的に与えた。架橋剤Ｃは、非分解性（ｎｏｎ−ｄｅｇｒａｂｌｅ）架橋剤であった。酸分解性架橋剤Ｄは、中性ｐＨにおいて安定であったが、約ｐＨ ５．４の後期エンドソームなどの酸性環境において迅速に分解した。

【0101】

この独特な反応性の設計は、血清の生理的ｐＨ（ｐＨ〜７．４）において顕著な安定性をもつ重合体ナノカプセルを提供した。また、これは、単量体Ｂの正電荷から生じる「プロトン−スポンジ」効果に起因する有効なエンドソームの逸脱を引き起こし、およびシェルの分解進行により原形質へのＤＮＡカセットの徐放を可能にした。次いで、ＤＮＡカセットは、核に入り、およびｓｉＲＮＡの内因性の生成を可能にした（工程４）。

【0102】

実施例６． 短い直鎖ＤＮＡカセットを組み込むＤＮＡナノカプセル
概念の証拠として、我々は、ｓｈ１００５ ｓｈＲＮＡを発現したＨ１を伴う短い直鎖ＤＮＡカセットを組み込むモデルＤＮＡナノカプセルおよび対照として抗ＥＧＦＰ ｓｈＲＮＡを発現したＨ１をデザインした。ｓｈＲＮＡ転写ユニットおよび抗生物質耐性遺伝子からなる大きなＤＮＡプラスミドの送達は、細胞膜および核膜孔における送達バリアによって妨げられた。したがって、第２のＤＮＡカセットを、ＰＣＲによって産生した３９５塩基対のみの最小化した直鎖ＤＮＡカセットを使用して製造した。３９５塩基対のみのＤＮＡカセットは、より効率的に核膜孔を移動することができた。

【0103】

これらの２つのＤＮＡカセットのゲル電気泳動画像を図３Ａに示した。興味深いことに、タングステン薬剤で染色した裸の直鎖ＤＮＡカセットのＴＥＭ画像は、直径約５０ｎｍで暗い半円弧として現れた。対照的に、ＤＮＡカセットナノカプセルは、およそ３０ｎｍのはるかに小さなサイズで円形形態を有した。これは、おそらく重合体との複合体形成を介したＤＮＡ凝縮の結果である。

【0104】

以前に報告されたプラスミドＤＮＡ（およそ１５０〜３００ｎｍ）を含むナノ粒子と比較して、ＤＮＡカセットナノ粒子のサイズは、著しく１／１０〜１／５のサイズである。この小さなサイズのＤＮＡカセットナノカプセルは、おそらく高い拡散速度を引き起こし、および送達効率を改善する。

【0105】

実施例７． ＤＮＡカセットナノカプセルは、細胞に効率的に送達される
本発明のＤＮＡカセットナノカプセルは、細胞に効率的に送達することができる。Ａｌｅｘａ５９２標識したＤＮＡカセットナノカプセルと４時間インキュベーション後のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の光学および蛍光画像を図４および図５に示してある。強烈な緑の蛍光は、ＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡナノカプセルの送達を証明する（図４および図５）。

【0106】

Ａｌｅｘａ５９２標識されたＤＮＡカセットナノカプセルを形質導入したＨＥＫ−２９３ Ｔ細胞のフローサイトメトリーにより、蛍光イメージングの結果を確認し、蛍光標識されたｓｉＲＮＡナノカプセルの良好な送達を証明した（図５Ｃ）。

【0107】

また、ＣＣＲ５およびＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１００５）を伴うルシフェラーゼレポーター遺伝子配列の融合を発現する２９３Ｔ細胞におけるＤＮＡナノカプセルのＲＮＡｉ活性を調べた（図５Ｄ）。ＣＣＲ５−ｓｈＲＮＡ ＤＮＡナノカプセルは、ＣＣＲ５−ルシフェラーゼ融合ｍＲＮＡのノックアウトを反映する生物発光強度の約８０％をダウンレギュレートし、一方で、対照ＤＮＡカセットナノカプセルで処理した細胞は、ルシフェラーゼ活性における有意な減少を示さなかった。

【0108】

Ｄｎａｓｅ Ｉに対するＤＮＡナノカプセルの感受性を調査するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）と複合体形成したＤＮＡおよびＤＮＡナノカプセルをＤｎａｓｅ Ｉと共に１時間インキュベートした（図６Ａ）。

【0109】

酸処理およびＤＮＡ抽出後、アガロースゲル電気泳動は、このようなナノカプセルが、プロートされ（ｐｒｏｔｅｄ）およびカプセル化されたＤＮＡの完全性を維持できることを示した。対照的に、天然の状態においてカプセル化されていないＤＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）と共に調合された非カプセル化ＤＮＡは、分解した。ＤＮＡナノカプセルは、０．４ｐｍｏｌ以下のＤＮＡカセットの濃度にて、明らかな細胞毒性を示さなかった。０．４ｐｍｏｌにて、ＤＮＡナノカプセルで処理した細胞の生存度は、約８５％までわずかに減少した（図７）。

【0110】

実施例８． ｓｉＲＮＡナノカプセルは、効率的に細胞およびターゲット特異的配列に送達される
図４Ａは、２５ｎｍの平均直径のＣＣＲ５配列３’−ｇａｇｃａｔｇａｃｔｇａｃａｔｃｔａｃ−５’をターゲットする二本鎖ｓｉＲＮＡナノカプセルの代表的なＴＥＭ画像を示す。興味深いことに、それぞれのナノカプセルの中で、直径約５ｎｍの暗いコアが明瞭に観察され、これはＴＥＭ観察のために使用したタングステンを染色する薬剤とのｓｉＲＮＡの好ましい複合体形成に起因する。二本鎖のｓｉＲＮＡ（２１塩基対）は、１２ｋＤａの平均分子量および３〜５ｎｍのサイズを有するので、それぞれの重合体ナノカプセルは、１つのｓｉＲＮＡ分子のみを含むと思われる。図４Ｂは、ＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡと４時間インキュベーション後のＨＥＫ−２９３ Ｔ細胞の蛍光画像を示す。強烈な緑の蛍光は、ｓｉＲＮＡナノカプセルの有効な送達を証明する。

【0111】

概念の証拠として、ＣＣＲ５−ｓｉＲＮＡを使用して、ＣＣＲ５発現をターゲットし、およびダウンレギュレートした。ＣＣＲ５ケモカイン受容体において天然に存在する突然変異を持って生まれた個体が、ＨＩＶ感染症および疾患進行から保護されていることは、十分に証明されてきた。ＣＣＲ５−ｓｉＲＮＡは、ＣＣＲ５発現をダウンレギュレートし、および患者におけるＨＩＶ耐性を発症するための治療的薬物として大きな将来性を持つ。この概念を証明するために、図４Ｃは、ＣＣＲ５配列（図４Ｃにおける画像の左パネル）およびＥＧＦＰ配列（図４Ｃにおける画像の右パネル）にターゲットされるｓｉＲＮＡナノカプセルを形質導入したＨＥＫ２９３細胞の蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）画像を示す。明らかに、ＣＣＲ５−ｓｉＲＮＡナノカプセルの送達は、ＣＣＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質発現を効率的にダウンレギュレートする。これは、ｓｉＲＮＡナノカプセル送達および機能の有効性を証明する。

【0112】

ルシフェラーゼを安定して発現するルシフェラーゼ発現ＣＷＲ細胞を、単一のｓｉＲＮＡナノカプセルの遺伝子−サイレンシング効力を試験するために使用した（図１４Ａ）。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡナノカプセルで処理した細胞は、５０ｎＭを上回った濃度にて特にルシフェラーゼ活性の有意な減少を示し、一方、対照ｓｉＲＮＡナノカプセルで処理した細胞は、ルシフェラーゼ活性の有意な減少を示さなかった。ｓｉＲＮＡナノカプセルは、２００ｎＭ以下のｓｉＲＮＡの濃度にて明らかな細胞毒性を示さなかった。３００ｎＭにて、ｓｉＲＮＡナノカプセルで処理した細胞の生存度は、約７５％までわずかに減少した（図１４Ｂ）。

【0113】

さらにまた、ヒト血清無しで、ナノカプセルおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））は、それぞれ８％および１５％にＣＣＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙ発現をサイレンスした。しかし、ヒト血清の存在下において、ＣＣＲ５ ｓｉＲＮＡナノカプセルは、なおも８５％を超えるＣＣＲ５−ｍＣｈｅｒｒｙ発現をノックダウンし、一方、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）を介して送達されたｓｉＲＮＡは、数を４５％にするだけだった。したがって、ナノカプセルは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）と比較して、ヒト血清ヌクレアーゼの攻撃に対して、中のｓｉＲＮＡに余分の保護および安定化を提供することができる。

【0114】

実施例９． ＤＮＡカセットナノカプセルは、細胞において遺伝子発現を効率的にノックダウンする
ＤＮＡカセットナノカプセルのノックダウン効力を、ＣＣＲ５−ルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ｓｉＲＮＡ形質導入と比較した（図８）。

【0115】

４８時間後、０．１ｐｍｏｌ ｓｈ１００５ ＤＮＡカセットナノカプセルは、４５％までＣＣＲ５−ルシフェラーゼの発現をサイレンスした。全く対照的に、１００ｐｍｏｌ（１０００×量）のｓｉＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）複合体が、４７％にＣＣＲ５−ルシフェラーゼのレベルをノックダウンするために必要であった。モル基準で、ｓｈ１００５ ＤＮＡカセットナノカプセルは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）と調合されたｓｉ１００５ ｓｉＲＮＡより、ＣＣＲ５をダウンレギュレートする際に１０００倍以上有効である（図７および図８）。この結果は、おそらく形質導入された細胞内でのｓｈＲＮＡの新規転写に起因する。

【0116】

実施例１０． 遅放および分解性ナノカプセル
ＤＮＡカセットナノカプセルの高い有効性のため、ＤＮＡカセットナノカプセルを、持続された活性が有益である適用に使用することができる。これを達成するために、ＤＮＡカセットナノカプセルを、異なる速度にて分解する架橋剤を使用して遅放のために操作した。

【0117】

１００％分解性架橋剤（例えば、グリセロール１，３−ジグリセロラートジアクリラート、ＧＤＧＤＡ）（５：０）で調製したＤＮＡナノカプセルは、１０時間後に完全に分解した。分解性架橋剤１対非分解性架橋剤（たとえば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ＢＩＳ）４の混合物で調製したＤＮＡナノカプセルは、１５０時間後に完全に分解した（図９）。分解プロフィールの勾配は、分解性架橋剤の割合と一致して増加する。これは、分解性架橋剤の割合が高いほど、より高い分解速度を引き起こすことを確証させる。

【0118】

１００％の分解性架橋剤を使用することにより、ＣＣＲ５のダウンレギュレーションは、形質導入後、３および５日目にて７０％に達し、９日目にて２３％に減少した（図１０）。

【0119】

分解性架橋剤対非分解性架橋剤の比が３：２であるとき、ＣＣＲ５のノックダウンは、３日目にて５８％から５日目にて７０％に増加し、次いで４２％に減少した。

【0120】

ＤＮＡナノカプセルの非分解性架橋剤対分解性架橋剤の比が２：３にて、ＣＣＲ５のサイレンシング割合は、５３％から６４％に増加し、および更に７３％に増加した。２０％の分解性架橋剤を使用することにより、ＣＣＲ５のダウンレギュレーションは、３日目にて２０％の低さであり、および９日目にて８０％に達した。

【0121】

実施例１１． 視覚化ナノカプセル
重合体ナノカプセルのＩＲスペクトルを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｐａｒａｇｏｎ １０００ ＦＴ−ＩＲスペクトロメーターで得た。ＵＶ可視スペクトルをＧｅｎｅＳｙｓ ６スペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で取得した。蛍光スペクトルをＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で得た。ナノカプセルのＴＥＭ画像を１０００００×にてＰｈｉｌｉｐｓ ＥＭ１２０ ＴＥＭで得た（たとえば、図３、図４および図５を参照されたい）。

【0122】

観察前に、ｓｉＲＮＡナノカプセルをｐＨ ７．０の１％リンタングステン酸（ＰＴＡ）溶液を使用してネガティブ染色した。ゼータ電位および粒子サイズ分布をＭａｌｖｅｒｎ粒子寸法測定器Ｎａｎｏ−ＺＳで測定した。ナノカプセルのＳＥＭ画像をＪＥＯＬ ＪＳＭ−６７００Ｆ ＳＥＭで得た。シリコン表面上の乾燥試料を測定前に金でスパッターコートした。細胞の蛍光画像をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｚ１蛍光顕微鏡またはＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ ＭＰ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで得た。細胞の蛍光強度分布をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで決定した。４８８ｎｍアルゴンレーザーを励起光として使用した。

【0123】

実施例１２． ｓｉＲＮＡ ナノカプセルの合成
インサイチュー重合およびｓｉＲＮＡの異なるタイプおよび比でｓｉＲＮＡナノカプセルの製造プロセスを最適化した。具体的には、正に荷電した単量体、親水性単量体および分解性架橋剤を、ｓｉＲＮＡナノカプセルを最適化するために使用した。

【0124】

ｓｉＲＮＡナノカプセルの形態および収量に対する緩衝液塩、イオン型、イオン性強度および溶媒組成物の効果を評価した。

【0125】

種々のターゲット成分を、ｓｉＲＮＡのターゲットされた送達を達成するために、ｓｉＲＮＡナノカプセルに抱合した。たとえば、これらの実験に使用したターゲティング抱合体は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ａＨＬＡおよびトランスフェリンを含んだ。これらの例示的な抱合体は、重合体ナノカプセルの特異的ターゲティングを達成するために、単独または併用で使用することができる。図２２は、ＣＤ４受容体を発現する２９３細胞へのｓｉＲＮＡのターゲティング送達を示す。
図２２Ａは、抗ＣＤ４抗体と抱合されたＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡナノカプセルと４時間インキュベーション後の、ＣＤ４受容体を発現する２９３細胞のフローサイトメトリーグラフを示す。図２２Ｂは、抗ＣＤ４抗体と抱合されたＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡナノカプセルと４時間インキュベーション後の、ＣＤ４受容体のない通常の２９３細胞のフローサイトメトリーグラフを示す。

【0126】

実施例１３． ナノカプセルの特性付け
ＴＥＭおよび動的光散乱を使用して、単一のｓｉＲＮＡ ナノカプセル（ｎａｎｏｃａｓｐｕｌｅ）のサイズおよびサイズ分布を決定した。さらにまた、電気泳動および電気泳動光散乱を使用して、ｓｉＲＮＡとナノカプセルとの間の表面電荷および相互作用を調査した。具体的には、サイズ、表面電荷およびカプセル化収量を調査した。

【0127】

ヌクレアーゼおよび血清の存在下におけるｓｉＲＮＡおよび単一ｓｉＲＮＡナノカプセルの安定性を比較した。ｓｉＲＮＡナノカプセルの分解性および放出プロフィールをｐＨ ７．４および５．４の緩衝液において調査した。リポフェクトアミンおよびｓｉＲＮＡナノカプセルと複合体を形成したｓｉＲＮＡを、ヌクレアーゼおよびヒト血清と１時間インキュベートした。ＲＮＡ抽出後、アガロースゲル電気泳動は、このようなナノカプセルが中のｓｉＲＮＡの完全性を維持することができることを示し（図６Ｂ）、一方、同時に天然の状態において、またはリポフェクトアミンと調合したときにｓｉＲＮＡを分解する。

【0128】

実施例１４． ｓｉＲＮＡ ナノカプセルの細胞内送達
ｓｉＲＮＡナノカプセルのｓｉＲＮＡ送達効率を広く多様な細胞において試験した。これらの細胞の例は、ＨＥＫ−２９３ Ｔ、Ｈｅｌａ、ＣＥＭ、ＰＢＭＣおよびＭＳＣを含む。

【0129】

蛍光標識したｓｉＲＮＡを、エンドサイトーシス阻害剤を使用してエンドサイトーシス経路を調査するために使用した。ナノカプセルによるｓｉＲＮＡ送達の効率および毒性を、市販のリポソーム薬剤によるものと比較した。ＣＣＲ５、ＥＧＦＰ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを含むｓｉＲＮＡの異なるタイプを、遺伝子サイレンシングの特異性を定量的に評価するために使用した。

【0130】

実施例１５． インビトロでの細胞の内部移行
細胞の内部移行研究を、蛍光顕微鏡技術および蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）によって行った。ＨｅＬａ細胞を１０％ウシ成長血清（ＢＧＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞（２００００細胞／ウェル、２４ウェルプレート）をｓｉＲＮＡナノカプセル添加する前日に播いた。

【0131】

異なる濃度のｓｉＲＮＡナノカプセルを細胞培地に添加した。２〜４時間、３７℃にてインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、および蛍光顕微鏡で視覚化またはトリプシン処理のいずれかをして、遠心分離し、およびＰＢＳに再懸濁し、およびＦＡＣＳによって解析した。

【0132】

実施例１６． 細胞増殖アッセイ
重合体ナノカプセルの毒性を、対照として天然のタンパク質を使用してＭＴＴアッセイによって評価した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（７０００細胞／ウェル）を重合体ナノカプセルへの曝露の前日に９６ウェルプレート上に播いた。異なる濃度のナノカプセルを２〜４時間細胞とインキュベートし、混合物から除去し、および２４時間新鮮な培地でインキュベートした。ＭＴＴ溶液（２０μＬ）をそれぞれのウェルに添加し、３時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、および１００μＬ ＤＭＳＯを細胞上に添加した。プレートを１５０ｒｐｍで５分間振盪テーブル上に置き、徹底的に溶液を混合し、および次いで、吸光度読取りを５６０ｎｍにて測定した。未処理の細胞を１００％細胞増殖対照として使用した。

【0133】

実施例１７． ｓｉＲＮＡ ナノカプセルのための正に荷電した単量体の合成
Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミド、Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）アクリルアミド、Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）アクリルアミド、およびＮ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）アクリルアミド（すなわち、正に荷電した単量体）の調製は、アクリル酸、ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＡＨＳ）とアミン含有前駆体（Ｎ−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン／Ｎ−メチルプロパン−１，３−ジアミン／ピペラジン−１−イルメタンアミン／Ｎ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）エタン−１，２−ジアミン）を反応することによって達成した。簡潔には、それぞれ、アミン含有前駆体およびＡＨＳを０．５ｍｏｌ／Ｌにてクロロホルムに溶解した。次いで、アクリル酸、ヒドロキシスクシンイミドエステルを激しい撹拌下で室温にて徐々に１：１のモル比にて各々のアミン含有前駆体に添加した。一晩の反応後、混合物を濾過して、副生成物を除去した。次いで、濾液を回転蒸発によって乾燥し、続いて水中に再分散した。不溶性物質の除去後、溶液を凍結乾燥した。最後に、生成物を薄層クロマトグラフィーによって精製した。収率は、３７％から６３％であった。^１ＨＮＭＲを、最終生成物を確認するために行った。

【0134】

Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）アクリルアミドについての^１Ｈ ＮＭＲは、４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏにて、以下のピークを産生した：６．４６（ｍ、１Ｈ、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯ）、５．６５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯ）、３．２７（ｍ、２Ｈ、ＣＯＮＨ−ＣＨ_２）、２．７８（ｍ、１０Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２およびＣＨ_２−ＮＨ_２）、１．７５（ｍ、４Ｈ、ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）、１．２３（ｍ、４Ｈ、ＮＨ−ＣＨ_２−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_２−ＮＨ）。

【0135】

Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）アクリルアミドについての^１Ｈ ＮＭＲは、４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏにて、以下のピークを産生した：６．５３（ｍ、１Ｈ、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯ）、５．６９（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯ）、３．９１（ｍ、２Ｈ、ＣＯＮＨ−ＣＨ_２−Ｎ）、２．２８（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２）、２．７５（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２）。

【0136】

Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）アクリルアミドについての^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：６．３９（ｍ、１Ｈ、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯ）、５．５８（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯ）、３．１８（ｍ、２Ｈ、ＣＯＮＨ− ＣＨ_２−Ｎ）、２．５４（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_３）、３．２２（ｍ、３Ｈ、ＮＨ−ＣＨ_３）。

【0137】

Ｎ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）アクリルアミドについての^１Ｈ ＮＭＲは、４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏにて以下のピークを産生した：６．４１（ｍ、１Ｈ、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯ）、５．６２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２＝ＣＨＣＯ）、３．１４（ｍ、２Ｈ、ＣＯＮＨ−ＣＨ_２−Ｎ）、２．４８（ｍ、６Ｈ、Ｎ−（ＣＨ_２）_３）、２．６５（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ_２）。

【0138】

実施例１８． ｓｉＲＮＡ ナノカプセルのための正に荷電した単量体の合成
Ｎ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）メタクリルアミド、Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）メタクリルアミド、およびＮ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）メタクリルアミド（すなわち、正に荷電した単量体）の調製は、メタアクリル酸、ヒドロキシスクシンイミドエステルと、（Ｎ，Ｎ’−（ブタン−１，４−ジイル）ビス（プロパン−１，３−ジアミン）／Ｎ−（３−アミノプロピル）ブタン−１，４−ジアミン／Ｎ−メチルプロパン−１，３−ジアミン／ピペラジン−１−イルメタンアミン／Ｎ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）エタン−１，２−ジアミン）を反応することによって達成した。簡潔には、それぞれ、アミン含有前駆体およびメタクリル酸、ヒドロキシスクシンイミドエステルを０．５ｍｏｌ／Ｌにて１ｍＬクロロホルムに溶解した。次いで、ＭＡＨＳを激しい撹拌下で室温にて徐々に１：１のモル比にてアミン含有前駆体の１つに添加した。一晩の反応後、混合物を濾過して、副生成物を除去した。次いで、濾液を回転蒸発によって乾燥し、続いてｄｄＨ２Ｏで再分散した。不溶性物質の除去後、溶液を凍結乾燥した。最後に、生成物を薄層クロマトグラフィーによって精製した。収率は、３２％から６１％であった。^１ＨＮＭＲを、最終産物を確認するために行った。

【0139】

Ｎ−（３−（（４−（（３−アミノプロピル）アミノ）ブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミドのための^１Ｈ ＮＭＲは、４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏにて、以下のピークを産生した：１．８９（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、５．７２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、３．２７（ｍ、２Ｈ、ＣＯＮＨ−ＣＨ_２）、２．７８（ｍ、１０Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２およびＣＨ_２−ＮＨ_２）、１．７５（ｍ、４Ｈ、ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）、１．２３（ｍ、４Ｈ、ＮＨ−ＣＨ_２−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_２−ＮＨ）。

【0140】

Ｎ−（３−（（４−アミノブチル）アミノ）プロピル）メタクリルアミドのための^１Ｈ ＮＭＲは、４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏにて、以下のピークを産生した：１．９２（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、５．７５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、３．２７（ｍ、２Ｈ、ＣＯＮＨ−ＣＨ_２）、２．７８（ｍ、１０Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２およびＣＨ_２−ＮＨ_２）、１．７５（ｍ、４Ｈ、ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）、１．２３（ｍ、４Ｈ、ＮＨ−ＣＨ_２−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_２−ＮＨ）。

【0141】

Ｎ−（ピペラジン−１−イルメチル）メタクリルアミドのための^１Ｈ ＮＭＲは、４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏにて、以下のピークを産生した：１．９０（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、５．７２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、３．９１（ｍ、２Ｈ、ＣＯＮＨ−ＣＨ_２−Ｎ）、２．２８（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２）、２．７５（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２）。

【0142】

Ｎ−（２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）エチル）メタクリルアミドのための^１Ｈ ＮＭＲは、４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏにて、以下のピークを産生した：１．９４（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、５．６２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、３．１８（ｍ、２Ｈ、ＣＯＮＨ−ＣＨ_２−Ｎ）、２．５４（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_３）、３．２２（ｍ、３Ｈ、ＮＨ−ＣＨ_３）。

【0143】

Ｎ−（２−（ビス（２−アミノエチル）アミノ）エチル）メタクリルアミドのための^１Ｈ ＮＭＲは、４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏにて、以下のピークを産生した：１．９３（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、５．６７（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＯ）、３．１４（ｍ、２Ｈ、ＣＯＮＨ−ＣＨ_２−Ｎ）、２．４８（ｍ、６Ｈ、Ｎ−（ＣＨ_２）_３）、２．６５（ｍ、４Ｈ、ＣＨ_２−ＮＨ２）。

【0144】

実施例１９． ｓｉＲＮＡ ナノカプセルの合成
ｓｉＲＮＡを、２０μＭにて２０μＬのＲｎａｓｅフリーの水に溶解した。次いで、０．５ｍＬの脱酸素化して脱イオン化した水に溶解した正に荷電した単量体、トリス−アクリルアミドおよびグリセロールジメタクリラート（モル比＝５：５：１）の特定量を微小遠心管に添加した。アクリロイル化されたタンパク質の表面からのラジカル重合を、２μＬの脱酸素化して脱イオン化した水および０．４μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンに溶解した０．０２ｍｇの過硫酸アンモニウムを添加することによって開始した。反応を窒素雰囲気において６０分間進行させた。

【0145】

実施例２０． 遺伝子発現のｓｉＲＮＡノックダウンに対する正に荷電した単量体の効果
表１において提供した正に荷電した単量体の効果を試験するため、ｓｉＲＮＡナノカプセルを表１における１４の各々の正に荷電した単量体それぞれと、ルシフェラーゼ遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡで調製した。これらのノックダウン実験をルシフェラーゼ発現ＣＷＲ細胞において行った。

【0146】

重合体ナノカプセルを調製するために、ｓｉＲＮＡを２０μＭにて２０μＬのＲｎａｓｅフリーの水に溶解した。次いで、表１から選択した正に荷電した単量体、トリス−アクリルアミドおよびグリセロールジメタクリラート（正に荷電した単量体のプロトン可能なアミンの総数：トリス−アクリルアミド：グリセロールジメタクリラート＝１５：５：１）の特定量を０．５ｍＬの脱酸素化して脱イオン化した水に溶解し、微小遠心管に添加した。アクリロイル化されたタンパク質の表面からのラジカル重合を、２μＬの脱酸素化して脱イオン化した水および０．４μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンに溶解した０．０２ｍｇの過硫酸アンモニウムを添加することによって開始した。反応を窒素雰囲気において６０分間進行させた。

【0147】

ＣＷＲ細胞を無血清培地において３７℃にて４時間５０ｎＭにてｓｉＲＮＡナノカプセルで処理した。次いで、培地を１０％ウシ胎仔血清でＤＭＥＭに変えた。４８時間後、ルシフェラーゼ活性を、９６ウェルプレートリーダーを使用して決定した（図１１）。

【0148】

実施例２１． 遺伝子発現のｓｉＲＮＡ ノックダウンに対する異なる架橋剤の効果
遺伝子ノックダウンに対する表２において提供された架橋剤の効果を試験するために、ｓｉＲＮＡナノカプセルを１，３−グリセロールジメタクリラート、グリセロール１，３−ジグリセロラートジアクリラート、Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタミン、ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスフェートまたはＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドと、ルシフェラーゼ遺伝子発現に対するｓｉＲＮＡで調製した（表２）。これらのノックダウン実験をルシフェラーゼ発現ＣＷＲ細胞において行った。

【0149】

重合体ナノカプセルを調製するために、ｓｉＲＮＡを２０μＭにて２０μＬのＲｎａｓｅフリーの水に溶解した。次いで、アクリル−スペルミン、トリス−アクリルアミドおよび表２からの架橋剤の特定量（正に荷電した単量体のプロトン可能なアミンの総数：トリス−アクリルアミド：架橋剤＝１５：５：１）を０．５ｍＬの脱酸素化して脱イオン化した水に溶解し、微小遠心管に添加した。アクリロイル化したタンパク質の表面からのラジカル重合を２μＬの脱酸素化して脱イオン化した水および０．４μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンに溶解した０．０２ｍｇの過硫酸アンモニウムを添加することによって開始した。反応を窒素雰囲気において６０分間進行させた。

【0150】

ＣＷＲ細胞を無血清培地において３７℃にて４時間、５０ｎＭにてｓｉＲＮＡナノカプセルで処理した。次いで、培地を１０％ウシ胎仔血清でＤＭＥＭに変えた。４８時間後、ルシフェラーゼ活性を、９６ウェルプレートリーダーを使用して決定した（図１２）。

【0151】

実施例２１． ｓｉＲＮＡ ナノカプセルサイズに対する異なる中性単量体の効果
ナノカプセルサイズに対する表３において提供した中性単量体の効果を試験するために、ｓｉＲＮＡナノカプセルを１Ｎ−（１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル）アクリルアミド、アクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、２‐ヒドロキシエチルアクリラートまたは２−ヒドロキシエチルメタクリラートで調製した（表３）。

【0152】

重合体ナノカプセルを調製するために、ｓｉＲＮＡを２０μＭにて２０μＬのＲｎａｓｅフリーの水に溶解した。次いで、アクリル−スペルミン、表３から選択した中性単量体およびグリセロールジメタクリラートの特定量（アクリル−スペルミンのプロトン可能なアミンの総数：中性のコモノマー：グリセロールデメタクリラート＝１５：５：１）を０．５ｍＬの脱酸素化して脱イオン化した水に溶解し、微小遠心管に添加した。アクリロイル化されたタンパク質の表面からラジカル重合を２μＬの脱酸素化して脱イオン化した水および０．４μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンに溶解した０．０２ｍｇの過硫酸アンモニウムを添加することによって開始した。一旦ｓｉＲＮＡナノカプセルが形成されたら、重合体ナノカプセルのサイズを測定した（図１３）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】