特許 6284651 グルコースポリマーおよびグルコースポリマー加水分解物の生成物を汚染除去するための最適化された方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6284651

(24)【登録日】2018年2月9日

(45)【発行日】2018年2月28日

(54)【発明の名称】グルコースポリマーおよびグルコースポリマー加水分解物の生成物を汚染除去するための最適化された方法

(51)【国際特許分類】

   C08B 30/04 20060101AFI20180215BHJP

   C12P 19/00 20060101ALN20180215BHJP

   C13B 99/00 20110101ALN20180215BHJP

   C13K 1/00 20060101ALN20180215BHJP

【ＦＩ】

   C08B30/04

   !C12P19/00

   !C13B99/00

   !C13K1/00

【請求項の数】3

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2016-554220(P2016-554220)

(86)(22)【出願日】2015年3月20日

(65)【公表番号】特表2017-510674(P2017-510674A)

(43)【公表日】2017年4月13日

(86)【国際出願番号】FR2015050706

(87)【国際公開番号】WO2015140477

(87)【国際公開日】20150924

【審査請求日】2016年9月23日

(31)【優先権主張番号】1452354

(32)【優先日】2014年3月21日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】591169401

【氏名又は名称】ロケット フレール

【氏名又は名称原語表記】ＲＯＱＵＥＴＴＥ ＦＲＥＲＥＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100090398

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 美千栄

(74)【代理人】

【識別番号】100090387

【弁理士】

【氏名又は名称】布施 行夫

(72)【発明者】

【氏名】ピエール ラノ

(72)【発明者】

【氏名】ソフィー デュベ

(72)【発明者】

【氏名】ティエリー デュポン

(72)【発明者】

【氏名】ファブリス アラン

(72)【発明者】

【氏名】マチュー カルパンティエ

(72)【発明者】

【氏名】アニエス デニ

(72)【発明者】

【氏名】エラ アシン−ジェルビ

【審査官】 齋藤 光介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１７８９３１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｂ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

グルコースポリマーまたはその加水分解物からその炎症促進性分子を除去するための方法において、下記の工程：
ａ）グルコースポリマーまたはその加水分解物を準備する工程；
ｂ）工程ａ）で準備された前記グルコースポリマーまたはその加水分解物中の前記炎症促進性分子を検出またはアッセイする工程；
ｃ）下記の精製工程：
ｉ．洗浄性および清澄化性を有する酵素製剤による処理、
ｉｉ．非常に高い吸着能および「マイクロポーラス」多孔性を有する医薬品グレードの活性炭による処理、
ｉｉｉ．「メソポーラス」多孔性を有する第２の活性炭による処理、
ｉｖ．１００オングストロームより大きな多孔性を有するマクロポーラス吸着性ポリマー樹脂上の通過、および
ｖ．５ｋＤａでの連続限外濾過
を実施する工程
を含むことを特徴とする、方法。

【請求項2】

洗浄性および清澄化性を有する前記酵素製剤は、マンナナーゼ活性を有する酵素製剤であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記グルコースポリマーは、イコデキストリンおよび分岐もしくは非分岐マルトデキストリンから選択され、および前記グルコースポリマーの加水分解物は、デキストロース一水和物の完全な加水分解生成物であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グルコースポリマー、より詳細には食品分野（食物繊維の豊富な健康食品成分）および医療分野（腹膜透析）を対象とするグルコースポリマー、またはグルコースポリマー加水分解物、より詳細には医療分野（非発熱性注射用ブドウ糖）を対象とするグルコースポリマー加水分解物の製造または精製のための回路を汚染除去するための最適化された方法の開発に関する。

【背景技術】

【0002】

本出願人企業は、グルコースポリマーまたはグルコースポリマーの加水分解物を製造する回路内において発生する可能性がある微生物起源の汚染物質の危険性が知られている分野において、その発明を開発することを選択してきた。前記汚染物質は：
− 食中毒、
− ヒトの健康に極めて有害な炎症反応
の原因と考えられる。

【0003】

このため、健康安全性へのアプローチと同様に食品安全性へのアプローチに関連して、あらゆる適切な技術的手段、特に：
− 汚染物質の効果的な同定およびアッセイ方法の明確化、
− 適切な精製装置および精製技術を確立することによる安全な製造回路の明確化
により、生細胞の形態および細胞断片の形態の両方において、微生物起源の汚染物質が存在しないことを確認することが重要である。

【0004】

腹膜透析の場合、一定数の成分は最も厳密な純度条件下で調製されなければならない。

【0005】

腹膜透析は、実際上、その目的が、腎臓が血漿から除去して精製することができないか、またはそれ以上は精製することができない尿素、クレアチニン、過剰なカリウムもしくは余水などの老廃物を除去することである透析の一種である。この治療は、末期慢性腎不全の場合に示される。

【0006】

最も一般的に使用される透析液は、酸性ｐＨ（５．２〜５．５）または生理的ｐＨ（７．４）の（乳酸塩または重炭酸塩の）緩衝液で構成され：
− 電解質（ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、塩素）、および特に
− 浸透圧剤、主としてグルコースポリマー、例えばＢＡＸＴＥＲ社により販売されている携行式腹膜透析液ＥＸＴＲＡＮＥＡＬ（登録商標）中に存在する「イコデキストリン」
が添加されている。

【0007】

より特定の連続携行式腹膜透析用のグルコースポリマーの使用分野では、これらのデンプン加水分解物（グルコースとグルコースオリゴマーおよびグルコースポリマーとの混合物）は、そのままでは使用できないことが直ちに明白になった。

【0008】

欧州特許出願の欧州特許第２０７６７６号明細書は、水中で１０％の無色透明溶液を形成する、５，０００〜１００，０００ダルトンの重量平均分子量（Ｍｗ）および８，０００ダルトン未満の数平均分子量（Ｍｎ）を有するグルコースポリマーが好ましいことを教示している。

【0009】

そのようなグルコースポリマーは、さらに好ましくは分子量が５，０００〜５０，０００ダルトンであるグルコースポリマーを少なくとも８０％含み、グルコースまたはＤＰが３（分子量５０４）以下であるグルコースポリマーをほとんどまたは全く含まず、および分子量が１００，０００（ＤＰが約６００）超であるグルコースポリマーをほとんど、または全く含まない。

【0010】

換言すれば、好ましいグルコースポリマーは、低多分散性指数（Ｍｗ／Ｍｎ比を計算することにより得られる値）を有するグルコースポリマーである。

【0011】

デンプン加水分解物から低多分散性指数を有するこれらのグルコースポリマーを得るために、上記の特許出願である欧州特許第２０７６７６号明細書に提案された方法は：
− 水混和性溶媒を用いてマルトデキストリンの分別沈殿を実施する工程、または
− 適切なカットオフまたは排除閾値を有する様々な膜を通して、これと同じマルトデキストリンの分子濾過を実施する工程
のいずれかからなる。

【0012】

これら２つの場合、これらの方法は、極めて高分子量のポリマーと低分子量のモノマーまたはオリゴマーとを両方とも除去することを目的としている。

【0013】

しかし、これらの方法は、それらの実施の観点からも、それらが入手可能にする生成物の収率および品質の観点からも満足できるものではない。

【0014】

優先的に２．５未満の低多分散性指数を有する、好ましくは８，０００ダルトン未満のＭｎを有する、および１２，０００〜２０，０００ダルトンのＭｗを有する完全に水に溶けるグルコースポリマーを製造する方法であって、先行技術の欠点を有しない前記方法を開発するために、本出願人企業は、マルトデキストリンではなく加水分解デンプンから出発することにより、本出願人企業の欧州特許第６６７３５６号明細書においてこの課題を解決すべく努力した。

【0015】

その結果、クロマトグラフィー分画により得られるグルコースポリマーは、好ましくはグルコースおよび３以下のＤＰを有するグルコースポリマーを３％未満、および６００超のＤＰを有するグルコースポリマーを０．５％未満含有している。

【0016】

最終的には、それらの浸透圧能のために使用されるこれらのグルコースポリマーが完全に満足できるものであることは、腹膜透析分野の専門家により今後受け入れられる。

【0017】

汚染のリスク
しかし、腹膜透析を対象とする製剤に微生物汚染のリスクがあることは残念なことである。

【0018】

実際に、グルコースポリマーの製造回路は、微生物により、または前記微生物中に含有される炎症促進性物質により汚染される可能性があることは知られている。

【0019】

例えば、酵母、カビおよび細菌類の微生物による、およびより詳細にはアリシクロバシルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）類の好酸好熱性細菌（回路の高温および酸性ゾーン内で増殖する好極限性細菌）によるトウモロコシデンプンまたはコムギデンプンの汚染がデンプン産業において報告されている。

【0020】

その場合、これらの汚染した製品を受容する患者にとっての深刻なリスクは、腹膜炎で
ある。

【0021】

これらの腹膜炎の発症は、腹腔内細菌感染により引き起こされ、診断は、通常、陽性透析液培養を介して容易に確立される。

【0022】

無菌性腹膜炎、化学性腹膜炎または培養陰性腹膜炎として記載される「無菌性腹膜炎」自体は、通常、化学刺激または異物により引き起こされる。

【0023】

腹膜透析液を調製するためにイコデキストリンが導入されて以来、様々な原因、特に潜在的に存在する炎症促進性物質による誘導に結び付けることのできる無菌性腹膜炎の孤立した症例が報告されている。

【0024】

このため、無菌性炎症の発症は、透析液の注入後に観察される主要な合併症である。

【0025】

これらの炎症性の発症の一部は化学的性質の問題（化学的汚染物質または特定の化合物の誤った用量の偶発的な注入）に関連しているが、症例の大多数は、透析液を調製するために使用される溶液中に存在する微生物起源の汚染物質の存在と直接的に関連している。

【0026】

リポ多糖（ＬＰＳ）およびペプチドグリカン（ＰＧＮ）は、それらが微量で存在する場合でさえ炎症を引き起こすリスクが高い、微生物起源の主要な汚染物質である。

【0027】

さらに、これらの汚染物質により誘導される炎症反応を増悪させる可能性がある分子、例えば、依然として生物活性のあるその最小構造がムラミルジペプチド（ＭＤＰ）であるＰＧＮの解重合生成物の存在も考慮に入れたことは、本出願人企業の功績である。

【0028】

ＰＧＮの解重合生成物に加えて、そのプロトタイプがｆ−ＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅトリペプチド）であるホルミル化微生物ペプチドもまた、実質的な相乗活性を有する。元々、これらのペプチドは白血球に及ぼす化学誘因活性について同定されたが、それら自体ではサイトカイン反応を誘導することができない。

【0029】

このため、それらが微量のＰＧＮおよび／またはＬＰＳの作用を増悪させることにより無菌性炎症の発症の間接的原因となる可能性があるため、これらの「小分子」を見逃さないことが重要である。

【0030】

前記汚染物質を効果的に同定およびアッセイするための方法の明確化
このため本出願人企業は、先行技術において利用可能な方法よりも有効な検出およびアッセイ方法を開発することに専心してきた。

【0031】

ここ数年間にわたり、炎症反応試験において動物モデルを置き換えるために、初代細胞を使用する多数の試験が開発されてきた。

【0032】

しかし、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、実験的なバイアスの原因となる可能性がある、かなり大きな個体間変動の対象になる。

【0033】

これとは反対に、単球細胞系は一貫した反応を生じるため、これにより現在開発中の試験が培養においてこの種の細胞をますます使用する理由が説明される。しかし、これらの試験には、溶液中に混合物として存在する全ての汚染物質に対する全ての炎症反応を生じさせ、結果として汚染物質の性質を特徴付けることができないという欠点がある。

【0034】

さらに増悪した炎症反応が、例えば炎症の急性期のサイトカイン、例えば：
− ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、
− ＩＬ−１β（インターロイキン１β）、および
− 例えばＣＣＬ５（ケモカイン（Ｃ−Ｃ単位）リガンド５）／ＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， Ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ， ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）などのケモカイン
に対しては視認できるが、ＩＬ−６（インターロイキン６）に対しては全く、またはごくわずかにしか視認できないことに留意することも重要である。

【0035】

このように、ＩＬ−６の産生に基づく方法（米国特許出願公開第２００９／０２３９８１９号明細書および同第２００７／０１８４４９６号明細書）は、溶液中の混合物などの汚染物質を検出するために好適ではない。

【0036】

このため、本出願人企業の国際特許出願である国際公開第２０１２／１４３６４７号パンフレットの中で、文献において現在使用および／または記載されている手順の感度の閾値より低い炎症促進性作用を有する微生物汚染物質を検出するための高感度で効果的な方法を開発し、および引き続いて製造回路から発生するバッチ内に微量に存在する炎症促進性分子の群またはさらにその性質を同定したのは、本出願人企業の功績であった。

【0037】

個々の精製工程の有効性の決定
本出願人企業は、次に製造ラインに、特にグルコースポリマーの製造ラインに最適な安全性を確保するために実施すべき、重要な精製工程をより明確に規定することを目指した。

【0038】

このため、本出願人企業は、本出願人企業の国際特許出願である国際公開第２０１２／１４３６４７号パンフレットの中に提示した単球細胞系に基づく検出およびアッセイ法を使用することにより、前記回路を精製するために重要な個々の工程の妥当性を確認することに専心した。

【0039】

そこで、本出願人企業の国際特許出願である国際公開第２０１３／１７８９３１号パンフレットでは、本出願人企業は、下記の個々の工程：
− 熱処理、
− 酸化、
− 活性炭上の通過、
− 吸着樹脂、限外濾過樹脂または濾過樹脂上の通過、
− 化学的もしくは酵素的加水分解
の有効性を分析した。

【0040】

これらの様々な個々の工程の有効性を分析するために、次に様々な除去工程を様々な基質；
− イコデキストリンの原料であるグルコースポリマー（欧州特許第６６７３５６号明細書の教示によるクロマトグラフィー分画の前に）、
− イコデキストリンのバッチ、
− 商標名ＮＵＴＲＩＯＳＥ（登録商標）ＦＢ０６で本出願人企業により販売されている、分岐マルトデキストリンのバッチ、
− 商標名ＬＹＣＡＤＥＸ（登録商標）ＰＦで本出願人企業により販売されている、注射剤中で調製できるように調製されたデキストロース一水和物のバッチ、
− 本出願人企業が特許所有者である国際特許出願の国際公開第２００７／０９９２１２号パンフレットの教示により調製された高分岐可溶性グルコースポリマーのバッチ、
− 市販のマルトデキストリン
で実施した。

【0041】

これらの様々な研究は、これらの工程各々が基質各々に対して所定の汚染物質の除去に及ぼした可能性のある影響の証明を可能にしてきたが、それでも依然として全ての潜在的汚染物質から全ての基質を確保できる最良の組み合わせを定義することが不可欠であった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0042】

このため、特許出願の国際公開第２０１３／１７８９３１号パンフレットに提示した全ての結果から、依然として、グルコースポリマー、より詳細には食品分野（食物繊維の豊富な健康食品成分）および医療分野（腹膜透析）を対象とするグルコースポリマー、またはグルコースポリマー加水分解物、より詳細には医療分野（非発熱性注射用ブドウ糖）を対象とするグルコースポリマー加水分解物の製造または精製回路を汚染除去するための最適化された方法を開発するという、満たされていない要件が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0043】

このため、本発明は、製造回路、特にグルコースポリマー中に存在する可能性がある全ての炎症性分子を汚染の性質に係らず除去することに効果的であることが判明している、厳選されて順番に配置された、いくつかの除去工程の組み合わせを提案する。

【0044】

そこで本発明の方法は、下記の工程：
− 洗浄性および清澄化性を有する酵素製剤による処理、
− 非常に高い吸着能および「マイクロポーラス」多孔性を有する医薬品グレードの活性炭による処理、
− 任意選択的に、「メソポーラス」多孔性を有する第２の活性炭による処理、
− １００オングストロームより大きな多孔性を有するマクロポーラス吸着性ポリマー樹脂上の通過、および
− ５ｋＤａでの連続的限外濾過
の組み合わせに関する。

【0045】

本発明の文脈の中で：
− 「洗浄性および清澄化性を有する酵素製剤」は、ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）により販売されているＭａｎｎａｗａｙ（登録商標）などのマンナナーゼタイプの酵素活性を意味することが意図されており；
− 「非常に高い吸着能および「マイクロポーラス」多孔性を有する医薬品グレードの活性炭」は、Ｎｏｒｉｔ Ｃ Ｅｘｔｒａ ＵＳＰ活性炭と同等の多孔性を有する活性炭を意味することが意図されており；
− 「「メソポーラス」多孔性を有する活性炭」は、ＥＮＯ−ＰＣ活性炭と同等の多孔性を有する活性炭を意味することが意図されており；
− 「１００オングストロームより大きな多孔性を有するマクロポーラス吸着性ポリマー樹脂」は、ＤＯＷＥＸ ＯＰＴＩＤＯＲＥ ＳＤ２タイプの樹脂を意味することが意図されている。

【0046】

好ましくは、本方法は、５つの工程を含む。

【0047】

特に、グルコースポリマーは、イコデキストリンおよびマルトデキストリン、特に分岐もしくは非分岐マルトデキストリンから選択され、およびグルコースポリマー加水分解物は、デキストロース一水和物などの完全な加水分解生成物である。

【0048】

選択された工程は、様々な群の汚染物質を標的とすること、およびしたがって炎症反応
性を有していない生成物を得ることを可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】標準的アゴニストに対するＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞の反応である。

【図2】標準的アゴニストに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２細胞の反応である。

【図3】標準的アゴニストに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞の反応である。

【図4】標準的アゴニストに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＯＤ２細胞の反応である。

【図5】標準的アゴニストに対するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ細胞の反応である。

【図6】グルコースポリマー基質により誘導された細胞反応である。

【図7】手順１による除去後にＥ１２４２基質により誘導された細胞反応である。

【図8】手順２による除去後にＥ２０９Ｊ基質により誘導された細胞反応である。

【図9】手順５による除去後にＥ５２４８基質により誘導された細胞反応である。

【図10】手順３による除去後にＥ３０６３基質により誘導された細胞反応である。

【図11】手順４による除去後にＥ１５６５基質により誘導された細胞反応である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

本発明の方法は、グルコースポリマーまたはその加水分解物を精製するために慣習的に使用されている経路を置き換えることが意図されている。

【0051】

本発明によるグルコースポリマーまたはその加水分解物を除去するための方法は、下記の工程：
ａ）グルコースポリマーまたはその加水分解物を準備する工程；
ｂ）任意選択的に、工程ａ）で準備されたグルコースポリマーまたはその加水分解物中の炎症促進性分子を検出またはアッセイする工程；
ｃ）下記の精製工程：
ｉ．洗浄性および清澄化性を有する酵素製剤による処理、
ｉｉ．非常に高い吸着能および「マイクロポーラス」多孔性を有する医薬品グレードの活性炭による処理、
ｉｉｉ．任意選択的に、「メソポーラス」多孔性を有する第２の活性炭による処理、
ｉｖ．１００オングストロームより大きな多孔性を有するマクロポーラス吸着性ポリマー樹脂上の通過、および
ｖ．５ｋＤａでの連続的限外濾過
を実施する工程
を含む。

【0052】

グルコースポリマーまたはその加水分解物は、腹膜透析、経腸および非経口栄養補給ならびに新生児の栄養補給を対象とすることができる。

【0053】

好ましい一実施形態では、本発明の文脈内で調製されるグルコースポリマーは、イコデキストリンまたは（後述するように、分岐もしくは非分岐）マルトデキストリンである。

【0054】

本明細書において関連するグルコースポリマー加水分解物は、詳細には、完全な加水分解生成物、例えば、本出願人企業により商標名ＬＹＣＡＤＥＸ（登録商標）ＰＦで販売されている非発熱性デキストロース一水和物であると理解されている。

【0055】

グルコースポリマー加水分解物は、グルコースポリマー加水分解物の調製の１つもしく
は複数の段階で、および詳細にはグルコースポリマー加水分解物の調製法の後期の工程で汚染除去することができる。

【0056】

したがって、本発明による方法で提供されるグルコースポリマーまたはその加水分解物は、最終生成物に先行する製品に相当する。

【0057】

炎症促進性成分は、上記の細菌起源の全ての分子である。

【0058】

それらは、特に：
− ＰＧＮ、
− ＬＰＳ、
− リポペプチド、
− ＰＧＮの解重合生成物、特にＭＤＰ、
− ホルミル化微生物ペプチド、例えばｆ−ＭＬＰ、
− β−グルカン、
− その他
であってよい。

【0059】

ヒトにおける治療使用（例えば腹膜透析液）のためのグルコースポリマーを調製するための方法の汚染除去工程の有効性を測定するために、本発明の文脈で使用されるｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症反応を測定するための方法は、単球／マクロファージタイプの系（ＴＨＰ−１および／またはＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標））および特定の自然免疫受容体を発現するトランスフェクト系（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標））を使用する細胞試験（「バイオアッセイ」）に基づき、これらの細胞試験は本出願人企業により開発され、先行する特許出願に記載されている。

【0060】

好ましくは、下記の５種の系が使用される：
− Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系：マウスマクロファージに由来するこの系は、グルコースポリマー基質および誘導体（ＰＧＮ、リポペプチド、ＬＰＳ、ザイモサン、ＬＴＡ）中に存在する可能性がある炎症促進性汚染物質の大多数に反応する。このため、その使用は、サンプル中に存在する炎症促進性分子の全負荷を推定することを可能にする。
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系：ｈＴＬＲ２受容体を発現するこの系は、ＴＬＲ２アゴニスト（特にＰＧＮおよびリポペプチド）に特異的に反応する。このため、その使用は、炎症反応を誘発する際のこれらの汚染物質のレベルを決定することを可能にする。
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系：ｈＴＬＲ４受容体を発現するこの系は、ＬＰＳに特異的に反応する。このため、その使用は、炎症反応を誘発する際のこれらの汚染物質のレベルを決定することを可能にする。
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系：ｈＮＯＤ２受容体を発現するこの系は、ＮＯＤ２アゴニストに特異的に反応する。このため、その使用は、炎症反応を誘発する際のＭＤＰおよび関連分子のレベルを決定することを可能にする。
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系：これは、免疫受容体でトランスフェクトされていないコントロール系である。その使用は、グルコースポリマー溶液またはその加水分解物の溶液が毒性機構を介してＳＥＡＰ産生を誘導しないことを確認する必要がある。

【0061】

しかし、当業者であればさらに他の市販の系（ＩＭＧＥＮＥＸ）を使用することも可能であるか、またはそれらを調製できることも留意すべきである。

【0062】

好ましい一実施形態では、細胞系は０．５〜１×１０^６細胞／ｍｌ（培養培地）の密度
で使用され、グルコースポリマーまたはその加水分解物の製剤と細胞との接触はおよそ１６〜２４時間持続される。

【0063】

汚染物質の定量は、用量反応曲線を使用して実施することができる。この用量反応曲線は、詳細には同一条件下で同一細胞を使用して、汚染物質の用量を増やしながら作成することができる。この用量反応曲線は、特にＬＰＳ、ＰＧＮ、リポペプチドおよびＭＤＰ標準物質を用いて作成される。

【0064】

好ましくは、そのような用量反応曲線は、ＴＬＲ４を発現する細胞（例えば、ＴＨＰ−１、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標））についてはＬＰＳの用量を増やしながら、ＴＬＲ２を発現する細胞（例えば、ＴＨＰ−１、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２およびＲａｗ−Ｂｌｕｅ（商標））についてはＰＧＮの用量を増やしながら、ならびにＮＯＤ２を介して反応する細胞（例えば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２）についてはＭＤＰの用量を増やしながら作成することができる。

【0065】

細胞試験は、本出願人企業の特許出願：国際公開第２０１２／１４３６４７号パンフレットおよび同第２０１３／１７８９３１号パンフレットに記載されたように実施されてよい。

【0066】

本発明による方法の第１の除染除去工程は、洗浄性および清澄化性を有する酵素製剤による処理からなる。

【0067】

マンナナーゼタイプ、例えばノボザイムズ社により販売されている酵素製剤Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）の酵素活性は、例えば細菌断片などのマクロ複合体および高分子量ＰＧＮを解離させるために有効であることが証明されている。

【0068】

その活性は、５０℃での処理時間２４時間のために、ＮａＯＨを用いてｐＨ１０へ調整された３２％（重量／容量）のグルコースポリマー溶液中で０．４％（容量／容量）の最終濃度で使用された場合に最適である。

【0069】

処理後、溶液はＨＣｌにより中和され、酵素は８５℃で１０分間にわたり加熱することにより不活性化される。

【0070】

第２の工程は、非常に高い吸着能および「マイクロポーラス」多孔性を有する医薬品グレードの活性炭による処理からなる。

【0071】

本出願人企業は、Ｎｏｒｉｔ Ｃ Ｅｘｔｒａ ＵＳＰタイプの活性炭を使用することを推奨する。これは、Ｃ Ｅｘｔｒａ ＵＳＰ炭素がＰＧＮおよびその分解生成物を除去する際に有効であることが証明されているためである。

【0072】

その活性は、ＨＣｌを用いてｐＨ４．５へ調整された、３２％（重量／容量）のグルコースポリマー溶液中で０．５％（重量／容量）の最終濃度で添加された場合に最適である。この処理は、８０℃で１時間にわたる攪拌下で実施される。処理後、この溶液はＮａＯＨにより中和され、その後０．２２μｍで濾過される。

【0073】

第３の工程は、「メソポーラス」多孔性を有する第２の活性炭による処理からなる。この工程は任意選択的である。

【0074】

この場合、ＥＮＯ−ＰＣタイプの活性炭が好ましい。活性炭のこの品質は幅広い作用スペクトルを有し、１００ｋＤａを超える分子量を有する分子（例えば、ＬＰＳおよびＰＧ
Ｎの分解生成物）を優先的に排除することを可能にする。

【0075】

活性炭は、さらに本明細書では８０℃の温度で１時間にわたりｐＨ４．５で０．５％の含量で使用される。

【0076】

第４の工程は、１００オングストロームより大きな多孔性を有するマクロポーラス吸着性ポリマー樹脂上での処理からなる。

【0077】

同一ファミリーの他の樹脂以外の（ＰＧＮ以外の）汚染分子を排除する、より広範囲のスペクトルを有するＤｏｗｅｘ ＳＤ２樹脂が選択される。

【0078】

３２％（２５０ｍｌ）のグルコースポリマー溶液は、この樹脂２０ｍｌを含有するカラム上で溶出される。

【0079】

最後の工程は、５ｋＤａのカットオフ閾値を有する限外濾過膜上での濾過からなる。

【0080】

限外濾過による処理の目的は、グルコースポリマー溶液中に依然として存在する小さな分子を排除することである。本出願人企業は、この処理が先行処理の経過にわたって蓄積されてきた微量の塩を排除することを可能にする透析作用を有するために、本方法の最後にこの処理を使用することを推奨している。

【0081】

室温で３時間にわたり２５ｍｌ／分の速度で５ｋＤａフィルター上にグルコースポリマー溶液を持続的に注入することが選択される。濾液の損失を補償するために、出発溶液中に濃縮水が注入され、無菌ＰＢＳ緩衝液を添加することにより持続的に初期容量（１００ｍｌ）に調整される。３時間後、濾液の容量は１５０〜２００ｍｌであり、これはグルコースポリマー溶液の初期容量より多い。

【0082】

以下の実施例において示されるように、単独の工程のこの組み合わせは、ポリマーおよびグルコースならびにその誘導体を製造するための回路を細菌起源の汚染物質からの最大限の保護を提供することができる。

【0083】

本発明は、例示的かつ非限定的であることが意図される下記の実施例からより明確に理解されるであろう。

【実施例】

【0084】

実施例１：用量反応曲線の確立
用量反応曲線は、標準アゴニスト分子：ＬＰＳ、ＰＧＮ、ＰＡＭ３（ｃｙｓ）（合成リポペプチドＰであるＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩）、ＬＴＡ、ザイモサンおよびＭＤＰを用いて作成する。Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２、ｈＴＬＲ４、ｈＮＯＤ２およびＮｕｌｌ系はアゴニストの濃度を増加させながらインキュベートし、細胞反応はＳＥＡＰ活性を定量することにより測定する。ＴＮＦ−αは、細胞活性化の陽性対照として使用する。
− Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系（図１）：細胞は、基質中およびグルコースポリマー誘導体（ＰＧＮ、リポペプチド、ＬＰＳ、ザイモサン、ＬＴＡ）中に存在する可能性がある主要な炎症性分子に反応する；これらの細胞は、詳細にはＰＧＮに対しては強度の反応性を有するが、その解重合生成物には反応しない、
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系（図２）：ＰＧＮおよびＰＡＭ３（ｃｙｓ）リポペプチドに対する強度の反応性；細胞は他のＴＬＲ２リガンド（ＬＴＡ、ザイモサン）に対してはより弱度に反応し、ＬＰＳおよびＭＤＰに対しては反応性を示さない、
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系（図３）：ＬＰＳに対する強度の反応性；
細胞はザイモサンに対しては極めて弱度にのみ反応し、ＰＧＮ、リポペプチド、ＬＴＡおよびＭＤＰに対しては反応性を示さない、
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系（図４）：ＭＤＰに対する強度の反応性、
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系（図５）：細胞毒性の非存在についての対照。

【0085】

実施例２：様々なグルコースポリマー基質の調製
上述のように、基質は下記の通りである：
− 本明細書ではＥ１５６５、Ｅ３０６３、Ｅ１２４２およびＥ５２４８を参照として記載する、イコデキストリンの原料である４種のグルコースポリマー（欧州特許第６６７３５６号明細書の教示によるクロマトグラフィー分画の前に）。

【0086】

これらのポリマーの調製は、特許出願の国際公開第２０１２／０５９６８５号パンフレットの教示によって実施する；
− イコデキストリンの汚染バッチ（本明細書ではＥ２０９Ｊを参照として記載する）およびイコデキストリンの「陰性対照」バッチ、すなわち細胞試験における非汚染の対照（本明細書ではＰ１１−１１を参照として記載する）。これらのバッチは、国際出願の国際公開第２０１０／１２５３１５号パンフレットの実施例１に詳述されている、特許出願である欧州特許第６６７３５６号明細書の教示によって調製する。

【0087】

実施例３：未処理サンプルにより誘導された細胞反応の分析
これらの試験の目的は、様々な基質中に存在する汚染物質の炎症促進反応性および性質を決定することである。

【0088】

実施例２によるサンプルを非発熱性（注射用）水中の３２％（重量／容量）で調製する。

【0089】

ＬＰＳレベルおよびＰＧＮレベルのアッセイは、細胞試験に先行してＳＬＰ−ＨＳアッセイおよびＬＡＬアッセイを使用して実施した（データは下記に提示した）。

【0090】

【表1】

【0091】

所定の汚染物質に対する炎症反応の概観を得られるように、様々な基質中の生物汚染物質の存在を５種の細胞種によって分析した（図６）。

【0092】

細胞試験のために、サンプルを細胞培養培地中で１／１０に希釈する（最終濃度：３．２％（ｗ／ｖ））。

【0093】

分析は：
− Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）系：ＰＧＮに対する高反応性を有するあらゆる汚染物質、
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２系：ＰＧＮおよびリポペプチドに対する高反応性、
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ４系：ＬＰＳに対する高反応性、
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＮＯＤ２系：ＭＤＰおよびＰＧＮ解重合生成物、
− ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２系：細胞毒性の非存在についての対照
に対して実施する。

【0094】

サンプルによる評価：
− Ｅ１２４２：ごくわずかに分解したＰＧＮによる強度の汚染の証拠である、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞における高強度炎症反応およびＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞における低強度炎症反応。
− Ｅ１５６５：分解したＰＧＮおよびＬＰＳによる強度の汚染の証拠である、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞における高強度炎症反応、ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞における中強度炎症反応およびＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞における高強度炎症反応。
− Ｅ３０６３：ごくわずかに分解したＰＧＮおよび微量のＬＰＳによる極めて強度の汚染の証拠である、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞における飽和炎症反応、ＨＥＫ−ＴＬＲ４細胞における中強度炎症反応およびＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞における低強度炎症反応。
− Ｅ５２４８：ＰＧＮおよびＬＰＳによる低汚染の証拠である、様々な系における低強度炎症反応。
− Ｅ２０９Ｊ：弱く分解したＰＧＮによる強度の汚染の証拠である、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞における高強度炎症反応およびＨＥＫ−ＮＯＤ２細胞における低強度炎症反応。

【0095】

グルコースポリマー基質は、いずれもＨＥＫ−Ｎｕｌｌ細胞が存在下で全く反応を与えないため、これは細胞毒性がないことを確証する。

【0096】

実施例４：サンプルにより誘導された細胞反応に除去の手順が及ぼす効果の分析
本出願人企業は、本出願人企業の特許出願である国際公開第２０１３／１７８９３１号パンフレットの中で、サンプル中に存在する各タイプの汚染物質に最適合な処理の同定を可能にし、グルコースポリマー基質へ適用するための実験条件を決定することを可能にした。

【0097】

本出願人企業の以前の研究に基づいて、提案された数多くの個々の処理は：
− 活性炭上の処理、
− ５ｋＤａの濾過閾値を有する膜を通しての限外濾過、
− 吸着樹脂上の通過、
− 酵素製剤による処理
である。

【0098】

下記に記載した組み合わせを用いた実験において、工程の選択および配列は：
○実験処理条件、
○サンプル中の汚染のレベル、および
○炎症促進性分子の性質
の関数として決定した。

【0099】

Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）の使用
国際特許出願の国際公開第２０１３／１７８９３１号パンフレットの教示は、酵素製剤が微量のＬＰＳによってわずかに汚染されることを証明した。さらに、微量の酵素は、処理後にグルコースポリマー溶液中に残留する可能性がある。このため、これらの外因性汚染を除去できるように、本出願人企業は、組み合わせの試験において酵素処理工程を手順開始時に配置することを推奨する。

【0100】

活性炭の使用
本試験で保持された活性炭は：
○Ｃ ＥＸＴＲＡ ＵＳＰ、ＰＧＮおよびその分解生成物を除去する際に有効であるため；
○ＥＮＯ−ＰＣ、分子量が１００ｋＤａより大きな汚染物質（例えば、ＬＰＳおよびＰＧＮの分解生成物）に選択的作用を及ぼすため；
○Ａ ＳＵＰＲＡ ＥＵＲ、高分子量の複合体を除去する際に有効性があるため
である。

【0101】

本出願人企業は、活性炭を単独または様々な組み合わせで一対で組み合わせて使用することを選択し、炭素による処理がバッチ式で実施され、加熱工程、中和工程および濾過工程が必要とされることを前提に、それらの工程は酵素処理の直後であるが他の処理の前に実施することを選択してきた。

【0102】

樹脂の使用
保持された樹脂は：
○Ｍａｃｒｏｎｅｔ ＭＮ−１５０、低分子量の分子（例えば、ＭＤＰおよびＰＧＮの分解生成物）を保持する際に有効であるため；
○Ｄｏｗｅｘ ＳＤ２、ＰＧＮＳ以外の汚染物質を除去する広域スペクトルのため
である。

【0103】

膜分離の使用
５ｋＤａの限外濾過による処理の目的は、グルコースポリマー溶液中に依然として存在する小さな分子を排除することである。さらに、この手順は透析作用を有し、先行処理の経過にわたって蓄積している微量の塩の排除を可能にする。

【0104】

このため、この工程は手順の最後に体系的に配置する。

【0105】

各工程後、サンプルを無菌条件下で取り出し、全炎症負荷（Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞反応）および生物汚染物質（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）反応）の量をアッセイできるように細胞試験に使用する。各工程後に得られた細胞反応は、除去手順の有効性を推定できるように、出発基質により誘導された反応と比較する。結果は、最高細胞反応に対する活性として表示する。全ての試験において、非汚染対照は、Ｐ１１−１１イコデキストリンの溶液を用いて実施する。

【0106】

実施例５：個々の処理工程の様々な組み合わせについての比較分析
可能性な組み合わせの多くは、特許出願の国際公開第２０１３／１７８９３１号パンフレットの教示から推定することができる。

【0107】

考えられる手順の３について得られた結果は、下記の通りである。

【0108】

− 手順１：Ｅ１２４２基質；Ｃ ＥＸＴＲＡ ＵＳＰ＋ＥＮＯ−ＰＣ活性炭による処理；Ｍａｃｒｏｎｅｔ ＭＮ−１５樹脂上の通過；５ｋＤａでの限外濾過
細胞試験の結果を図７に示した。

【0109】

Ｅ１２４２基質は、主として高濃度のＰＧＮに関連しているＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞における中間炎症反応（ＴＬＲ２の反応）を誘導する。

【0110】

Ｅ１２４２基質は、ＴＬＲ４およびＮＯＤ２の反応がバックグラウンドノイズに近いことを前提に、微量のＬＰＳおよびＰＧＮの微量の分解生成物も含有する。

【0111】

除去手順は、炎症反応を効果的に減少させる。

【0112】

それにもかかわらず、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞の反応は非汚染対照（Ｐ１１−１１）よりごくわずかに高いままであり、これは微量の汚染物質が依然として存在することを示している。

【0113】

この結果は、除去後の残留ＰＧＮの存在に起因する。実際に、ＴＬＲ２の反応は、炭素による処理後には大きく減少するが、陰性対照よりは高いままである。

【0114】

他の工程は、ＴＬＲ２の反応に影響を及ぼさず、ＴＬＲ２の反応は手順の最後までもはや進化しない。他方、ＴＬＲ４の反応は、第１の処理工程と同様に早期にもはや検出することができず、これはＬＰＳが除去されていることを証明する。ＮＯＤ２の反応に関しては、この反応は限外濾過工程後には抑制される。

【0115】

結論：
炎症性化合物の負荷は効果的に低減されたが、ＰＧＮにより重度に負荷された基質の完全な除去を保証するためには手順１では不十分である。

【0116】

− 手順２：Ｅ２０９Ｊ基質；Ｃ ＥＸＴＲＡ ＵＳＰ＋ＥＮＯ−ＰＣ活性炭による処理；Ｄｏｗｅｘ ＳＤ２樹脂上の通過；５ｋＤａでの限外濾過
細胞試験の結果を図８に示した。

【0117】

この手順のために、樹脂を保持の広域スペクトルを有するＤｏｗｅｘ ＳＤ２と置換した。これらの試験は、Ｅ１２４２と同様の汚染プロファイルを有するＥ２０９Ｊ基質を用いて実施した。

【0118】

この場合、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞の反応は陰性対照と同一であり、これは汚染除去が有効であったことを証明する。

【0119】

それにもかかわらず、ＴＬＲ２の反応は依然として非汚染対照よりごくわずかに高いため、これは微量のＰＧＮが依然として存在することを示している。

【0120】

反応の差は、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞がＰＧＮに対してＲａｗ−Ｂｌｕｅ細胞よりも低い検出閾値を有するという事実と確実に関連している。

【0121】

ＮＯＤ２の反応はＳＤ２上の通過後には減少して限外濾過後に抑制されるが、これはこの樹脂がＰＧＮの分解生成物を除去するために少なくとも補完作用を有することを示唆している。

【0122】

結論
このデータは、樹脂の変更が全てのＰＧＮを排除する際に手順の有効性を改良しなかったことを示している。

【0123】

− 手順３：Ｅ５２４８基質；Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）および次にＣ ＥＸＴＲＡ ＵＳＰ＋Ａ ＳＵＰＲＡ ＥＵＲ炭素による処理；Ｄｏｗｅｘ ＳＤ２樹脂上の通過；５ｋＤａでの限外濾過
細胞試験の結果を図９に示した。

【0124】

この最後の組み合わせでは、Ａ ＳＵＰＲＡ ＥＵＲ炭素をＥＮＯ−ＰＣの代替物としてのＣ ＥＸＴＲＡ ＵＳＰと組み合わせた。

【0125】

Ａ ＳＵＰＲＡ ＥＵＲ炭素は、後者とは反対に高分子量の分子を優先的に排除する。

【0126】

この組み合わせは、ＰＧＮまたはβ−グルカンタイプの凝集したマクロ複合体が負荷されたサンプルの汚染除去するために有効でなければならない。

【0127】

これらの試験は、様々な細胞系において低強度炎症反応を誘導するＥ５２４８基質上で実施したが、ＳＬＰ−ＨＳおよびＬＡＬのアッセイはＰＧＮおよび／またはβ−グルカンの強度の汚染の存在を示唆している。

【0128】

この差は、それらの溶解度を低下させるそれらの高質量の炎症性分子、および結果として試験細胞における反応を誘導する接近可能性によって説明できる。

【0129】

手順の第１の工程後には、様々な細胞系において細胞反応の強度の増加が観察される。

【0130】

この結果は、Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）による酵素処理が細菌複合体もしくは細菌断片をバラバラにさせ、これによりＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＮＯＤ２に対するアゴニスト分子を遊離させる際に有効であることを確認している。

【0131】

炭素による処理後、Ｒａｗ細胞およびＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の反応は有意に減少したが、依然として陰性対照より上回ったままである。

【0132】

同様に、ＴＬＲ４およびＮＯＤ２の反応は大きいままであり、様々な細胞種における非汚染対照と同一のシグナルを入手するための樹脂上の通過および限外濾過の最終的な工程を待つことが不可欠である。

【0133】

結論
これらの結果は、Ａ ＳＵＰＲＡ ＥＵＲ炭素が汚染除去手順に顕著な利益を全く提供しなかったことを示している。

【0134】

最終的な結論
完全に想定できたが、これらの汚染除去手順は、いずれも完全に満足できる結果を与えない。

【0135】

実施例６：最適化された手順の提示
Ｅ３０６３基質上で一連の下記の工程を実施することを選択する。
− Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）による処理、次に
− Ｃ ＥＸＴＲＡ ＵＳＰ＋ＥＮＯ−ＰＣ活性炭による処理、次に
− Ｄｏｗｅｘ ＳＤ２樹脂上の通過、および最後に
− ５ｋＤａでの限外濾過。

【0136】

細胞試験の結果を図１０に示した。

【0137】

ＰＧＮを排除することを目的とする手順の有効性を高めるために、Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）による酵素処理の工程を他の工程の上流に導入する。

【0138】

これらの試験のためには、ＰＧＮが極めて大量に負荷されたＥ３６０３基質を使用した。

【0139】

手順の様々な工程後、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞の反応は、汚染除去が有効であったことを
証明する陰性対照と同一である。

【0140】

さらに、酵素＋炭素処理の組み合わせは、ＴＬＲ２の反応が処理前の飽和シグナルから非汚染対照と同一のシグナルになるため、ＰＧＮを排除するために特に適する。

【0141】

最後に、他の工程は、ＬＰＳ（ＴＬＲ４の反応）およびＮＯＤ２アゴニストの痕跡を排除することに有効である。

【0142】

この組み合わせが実際に有効であることを証明するために、ＥＮＯ−ＰＣ炭素の使用が現実的に汚染除去手順に利益を提供するかどうかを確認するために、ＥＮＯ−ＰＣ炭素を除去した。

【0143】

細胞試験の結果を図１１に示した。

【0144】

これらの試験は、また別の基質である、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＮＯＤ２の様々なアゴニストを用いて汚染されているＥ１５６５基質上で実施した。

【0145】

手順の最後に、Ｒａｗ−Ｂｌｕｅ細胞の反応は有意に減少したが、非汚染対照よりはわずかに大きいままである。この極めて弱い反応は残留ＰＧＮの存在とは関連していないが、むしろ微量のＬＰＳおよびＮＯＤ２アゴニストと、ならびに２つの群の分子間の可能性のある相乗効果と関連している。

【0146】

ＥＮＯ−ＰＣ炭素は、分子量＜１００ｋＤａの分子（ＬＰＳおよびＰＧＮの分解生成物）に対して広域の保持スペクトルを有する。

【0147】

結論
その非存在は、特に基質がこれらの２つの群の炎症性分子で重度に汚染させられている場合は、汚染手順の有効性を低下させたことが観察されている。

【0148】

これらをまとめると、この試験で得られた結果は、厳選されて順番に配置された数種の汚染工程の組み合わせがグルコースポリマー溶液中に存在する可能性がある炎症性分子を排除することに有効であることを立証したことを示している。

【0149】

この組み合わせは、下記の工程：
− 洗浄性および清澄化性を有する酵素製剤、例えばＭａｎｎａｗａｙ（登録商標）による処理、
− Ｃ ＥＸＴＲＡ ＵＳＰと同等の多孔性を有する活性炭による処理、
− 任意選択的に、分解されたＰＧＮおよび／またはＬＰＳが負荷された基質に対してＥＮＯ−ＰＣと同等の多孔性を有する第２の活性炭による処理、
− Ｄｏｗｅｘ−ＳＤ２タイプの吸着樹脂上の通過、
− ５ｋＤａでの連続限外濾過
を含む。

【0150】

選択された工程は、様々な汚染物質の群を標的とすること、および炎症反応性を有していない生成物を提案することを可能にする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】