特許 6284768 不妊治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6284768

(24)【登録日】2018年2月9日

(45)【発行日】2018年2月28日

(54)【発明の名称】不妊治療剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/736 20060101AFI20180215BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20180215BHJP

   A61K 31/566 20060101ALI20180215BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180215BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/736

   A61P15/08

   A61K31/566

   A61P43/00 121

【請求項の数】6

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2014-5765(P2014-5765)

(22)【出願日】2014年1月16日

(65)【公開番号】特開2015-134725(P2015-134725A)

(43)【公開日】2015年7月27日

【審査請求日】2016年11月29日

(73)【特許権者】

【識別番号】596033174

【氏名又は名称】株式会社紀州ほそ川

(74)【代理人】

【識別番号】100104307

【弁理士】

【氏名又は名称】志村 尚司

(72)【発明者】

【氏名】宇都宮 智子

(72)【発明者】

【氏名】細川 清

【審査官】 金子 亜希

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−０７３６５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１３４４８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−１２８５６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２３９５８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本受精着床学会雑誌，２０１３年 ３月３１日，30(1)，117-122

【文献】 Mol. Reprod. Dev，２００２年，61，385-397

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／７３６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

梅の実を塩漬けして得られる抽出物と、デヒドロエピアンドロステロンを含むヒトの不妊を治療するための組成物。

【請求項2】

梅の実を塩漬けして得られる抽出物を脱塩して得られる組成物と、デヒドロエピアンドロステロンを含むヒトの不妊を治療するための組成物。

【請求項3】

梅の実を塩付けして得られる抽出物又は梅の実を塩漬けして得られる抽出物を脱塩して得られた組成物の使用であって、
ヒトの不妊治療用の薬剤を含むヒトの不妊治療のための組成物を製造するための使用。

【請求項4】

前記不妊治療のための組成物は、少なくともデヒドロエピアンドロステロンを含む組成物である請求項３に記載の使用。

【請求項5】

ヒトの不妊治療用の薬剤と共に用いられるヒトの不妊治療のための内服用組成物であって、梅の実を塩漬けして得られる抽出物及び／又は当該抽出物をさらに脱塩して得られる組成物を含む内服用組成物。

【請求項6】

前記不妊治療用の薬剤は、少なくともデヒドロエピアンドロステロンを含む薬剤である請求項５に記載の内服用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は不妊治療剤に関する。

【背景技術】

【0002】

一般に、２年以上避妊なしで性交しても妊娠しない場合、不妊症と診断される。カップルの１０〜１５％が不妊症で悩まされていると言われる。不妊には、女性側および男性側のそれぞれに多数の要因が存在している。女性側の主な要因として、排卵障害又は内分泌異常、子宮内膜症などの要因が考えられている。不妊治療の初期の段階では排卵誘発剤や子宮内膜症に対する治療剤が用いられることが多い。しかし、こうした治療でも必ずしも懐妊できず、より効果の高い不妊療法が求められている。

【0003】

このような状況で高度生殖医療（assisted reproductive technology：ＡＲＴ）が普及しはじめている。ＡＲＴは体外受精（ＩＶＦ）、顕微授精（ＩＣＳＩ）、凍結胚移植などの治療法を含む。ＡＲＴでは良質な卵子の確保が極めて重要である。

【0004】

しかしながら、不妊治療の年数が長期化するほど卵巣予備能（Ovarian reserve）の低下は進行し、ｈＭＧ（human menopausal gonadotropin）療法に対する反応性も低下するので、ますますその治療が困難となる。

【0005】

ｈＭＧ療法に対する反応性などが低下したLow responderに対して、サプリメント製剤としても用いられているＤＨＥＡ（dehydroepiandrosterone：デヒドロエピアンドロステロン）の投与が行われている。ＤＨＥＡは副腎から分泌される性ホルモンであり、テストステロンやエストロゲンの前駆体で、動脈硬化阻止作用や抗肥満、抗老化作用を有する。また、ゴナドトロピンに対する卵巣の反応性を上げて卵子の質を改善するとの報告（非特許文献２、３）もある。

【0006】

一方、卵子の質の低下は酸化ストレスによるところが大きいと考えられていること（非特許文献４）から、抗酸化物質には卵子の質を改善する効果があることが期待されている（非特許文献５、６）。さらには、卵の老化は酸化ストレスが顆粒膜細胞のアポトーシスに関与した結果であるとの報告もある（非特許文献７、８）。

【0007】

ところで、梅の実は古くから食用されている天然の素材であり、梅の実を塩付けして得られた梅酢も食用されている。特許文献１や非特許文献１には、梅干の生産時に多量に副製される梅酢を脱塩・濃縮して得られる脱塩濃縮梅酢を飼料と共に鶏に給与すると、産卵率や卵質（卵量、ハウユニット、卵黄色、卵蛋白質のアミノ酸組成など）が向上し、鶏の免疫性が改善されたことが示されている。また、特許文献２には梅の実の種が生理不順に効果を示すことが、特許文献３には梅肉エキスが冷え症に効果があることが示されている。さらに梅には抗酸化作用があることもよく知られた事実である（非特許文献９）。

【0008】

しかしながら、これまでのところ、梅の実又はその抽出物が不妊治療に効果があることは知られておらず、梅の実又はその抽出物に含まれている成分のうち如何なる成分が、産卵率の向上や卵質の向上に寄与するのかどうかも不明であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２００５−７３６５１号公報

【特許文献2】特開２００２−１５４９８０号公報

【特許文献3】特開２００６−３４８００１号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】伊丹哲哉ら，ニワトリの産卵性および卵質に及ぼす脱塩濃縮梅酢の影響，日本家禽学会誌，42，209-216，2005

【非特許文献2】Barad, D., Gleicher, N.，Increased oocyte Production after treatment with dehydroepiandrosterone.，Fertil. Steril.，84，756，2005

【非特許文献3】Casson, PR. et al.，Dehydroepiandrosterone supplementation augments ovarian stimulation in poor responders: a case series.，Hum Replod.，15，2129-2132，2000

【非特許文献4】Utsunomiya, H. et al.，Fruit-juice concentrate of Asian plum inhibits growth signals of vascular smooth muscle cells induced by angiotensin II.，Life Sciences，72，659-667，2002

【非特許文献5】Devine, PJ. et al.，Roles of reactive oxygen species and antioxidants in ovarian toxicity.，Biol Replod.，86，1-10，2011

【非特許文献6】Juan J. Tarin, et al.，Oral antioxidants counteract the negative effects of female aging on oocyte quantity and quality in the mouse.，Mol reprod and devel，61，385-397，2002

【非特許文献7】Tatone C et al.，Cellular and molecular aspects of ovarian follicle ageing.，Hum Reprod Update.，14，131-42，2008

【非特許文献8】Wiener-Megnazi Z et al.，Oxidative stress indices in follicular fluid as measured by the thermochemiluminescence assay correlate with outcome parameters in in vitro fertilization.，Fertil Steril.，3，1171-6，2004

【非特許文献9】Nakahata, T. et al.，Sphingosine-1-phosphate inhibits H2O2-induced granulasa cell apoptosis via the PI3K/Akt signaking pathway，Fertil. Steril.，98，1001-1008，2012

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであって、本発明の課題は、新しい不妊治療剤を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明に係る不妊治療剤は、梅の実の抽出物、例えば梅酢の濃縮物を有効成分とし、さらにはデヒドロエピアンドロステロンと組み合わせてなることを特徴としている。

【発明の効果】

【0013】

本発明に係る不妊治療剤の服用は妊娠率を向上させる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は活性成分の単離方法を示す図である。

【図2】図２は化合物１の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである

【図3】図３は３,４−ＤＨＢＡのエストラジオールの分泌促進効果を示すグラフである。

【図4】図４は脱塩濃縮梅酢（梅ＢＸ７０Ｓ）の高速液体クロマトグラムによる分析結果を示すチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明に係る不妊治療剤は梅の実の抽出物を有効成分とし、それ単独で投与されること又はＤＨＥＡと組み合わせて投与される。

【0016】

抽出原料として用いられる梅の実は、バラ科サクラ属のウメ（Prunus mume）の果実であればよく、その品種は問われない。抽出に用いられる部位は、梅の果肉でもあり、梅の種子でもあり、梅の実全体でもあり得る。抽出には好ましくは粉砕物が用いられる。

【0017】

抽出溶媒には各種の溶媒が用いられる。抽出溶媒は、例えば、水であり、有機溶媒であり、それらの混合溶媒でもあり得る。有機溶媒は、ペンタン、ヘキサン、オクタン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、クロロホルム、ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、メタノールやエタノール、イソプロパノール、１,２−プロパンジオール、グリセリン等のアルコール類、フェノール等のフェノール類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどのエーテル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル、プロピオン酸メチルなどのエステル類でありえる。本発明に係る活性成分は３,４−ＤＨＢＡであると考えられるところから、当該成分が多く抽出される溶媒が好ましく、その抽出溶媒は好ましくはメタノール、酢酸エチル等の親水性溶媒である。

【0018】

抽出方法は特に限定されず、一般的には梅の実をそのままで、あるいは梅の果肉部分及び／又は種子の部分を取り出して溶媒に浸漬することで行われる。浸漬時に必要により加熱や攪拌、加圧されることもある。また、例えば超臨界抽出法のように超臨界状態に置かれた媒体で抽出を行う方法でもよい。

【0019】

本発明に係る抽出物は梅酢でもあり得る。梅酢は、塩漬けによって高い浸透圧が生じることにより得られる浸出液である。この浸出液は梅の実に含まれる種々の成分を含むので、本明細書ではこの梅酢も梅の実の抽出物として定義される。

【0020】

抽出溶媒で抽出された抽出液や梅酢はそのまま用いられるが、さらに各種の溶媒を用いて液液抽出や濃縮を行い、活性成分である３,４−ＤＨＢＡ（3,4-Dihydroxybenzaldehyde：３,４−ジヒドロキシベンズアルデヒド）を多く含む抽出画分を得てもよい。また、梅酢を用いる場合には、塩分濃度を下げるために脱塩を行うことが好ましい。脱塩は、例えば逆浸透膜や透析膜を利用して行われ、例えば特許文献１に記載された脱塩方法が使用され得る。

【0021】

得られた抽出物は不妊治療剤として用いられる。不妊治療剤は不妊治療の一方法として使用される。本発明の抽出物はエストラジオール産生促進作用を有する３,４−ＤＨＢＡを含み、抽出物における活性本体は３,４−ＤＨＢＡであると考えられることから、排卵誘発剤や子宮内膜症に対する治療剤として利用され得る。特にＡＲＴ治療に有効であって、採取された卵の性質を向上させる。また、ＤＨＥＡと組み合わせて投与することで卵の性質を向上させ、妊娠率を向上させる。

【0022】

抽出物はそのままで投与することができるが、通例、添加剤の使用により種々の剤型に製剤化される。剤型は例えば錠剤であり、顆粒剤であり、散剤であり、カプセル剤であり、チュアブル剤であり、エキス剤であり、液剤であり、注射剤であり得る。添加剤は、デンプンや乳糖などの賦形剤であり、滑沢剤であり、崩壊剤であり、コーティング剤であり、精製水であり、注射用蒸留水であり、ｐＨ調整剤であり、保存剤であり、剤型に必要とされる１種又は２種以上の添加剤が使用され得る。また、梅酢を利用する場合には、クエン酸含有量が高いので、服用しやすくするため、得られた梅酢若しくはその濃縮物にアルカリを加えて酸の一部又は全部が中和されることもある。また、甘味料や香料が加えられることもある。梅酢の中和方法は、例えば特開２０１１−１７７０３７号に記載された方法が例示される。

【0023】

投与量や投与方法は当業者によって適宜定められ得る。被投与者の体重、年齢、剤型、投与方法によっても異なるが、抽出溶媒による抽出物では、１日あたり０.００１ｍｇ〜１ｇであり、濃縮梅酢である抽出物では、１日あたり０.０１ｍｇ〜１００ｇであり、３,４−ＤＨＢＡを投与する場合には、１日あたり０.１ｎｇ〜０.５ｇである。

【0024】

本発明において、ＤＨＥＡと３,４−ＤＨＢＡを組み合わせるとは、両者を同時に投与することだけなく、異なる時期に投与することも含む。異なる時期に投与される場合とは、例えば、１日において投与時刻が異なる場合、日や週を変えて投与時期が異なる場合、治療周期において投与時期が異なる場合などを含む。投与計画は、効果などを考慮しながら、適宜、当業者によって決定され得る。

【0025】

ＤＨＥＡと組み合わせる場合にも、ＤＨＥＡとの投与比も適宜当業者によって定められ得る。投与比も被投与者の体重、年齢、剤型、投与方法によっても異なるが、抽出物（抽出溶媒による抽出物や梅酢の場合）との投与比（ＤＨＥＡに対する質量比）は０.００１〜１００であり、３,４−ＤＨＢＡとの投与比（ＤＨＥＡに対する質量比）０.０００００１〜１である。

【0026】

次に下記の実施例に基づき、本発明について具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されることはない。

【実施例1】

【0027】

ＡＲＴ治療で良好な結果が得られなかった被験者に対して脱塩濃縮梅酢を投与して、妊娠効果に対する影響を調べた。
１．脱塩濃縮梅酢の調整
脱塩濃縮梅酢を特許文献１の実施例１に記載の方法に準じて製造した。つまり、梅の実を塩付けして得られた梅酢を、電気透析と加熱濃縮により脱塩濃縮梅酢（以下「梅ＢＸ７０」と言う）を得た。この梅ＢＸ７０（酸度（クエン酸として）５０.５w/w％）を９０℃で２時間加熱した後、水酸化カリウムと糖アルコールの混合物を加えて酸の一部を中和して試料（酸度２６.６w/w％）を調整した（以下「梅ＢＸ７０Ｓ」と言う）。

【0028】

２．不妊症の改善
ＡＲＴによっては良好胚の得られなかった反復不成功例１６例（３３歳〜４３歳、平均年齢３９.４歳）の被験者に対して、ＤＨＥＡ（dehydroepiandrosterone）を５０ｍｇ/ｄａｙで連日投与した。ＤＨＥＡを２か月間服用してもらった後、卵巣刺激を行い採卵、ＩＶＦ又はＩＣＳＩを施行した。上記１６例のうちＤＨＥＡを服用後も妊娠に至らなかった症例のうち同意の得られた６例に対し、ＤＨＥＡを５０ｍｇ/ｄａｙと上記梅ＢＸ７０Ｓ１２ｍｌ/ｄａｙを２か月間服用してもらった後、卵巣刺激を行い採卵、ＩＶＦ又はＩＣＳＩを施行した。卵巣刺激法についてはlong法、short法又はＧｎＲＨアンタゴニスト併用でｈＭＧを投与した。治療は、ｉ）何も服用せずＡＲＴを行った周期、ii）ＤＥＨＡを服用した周期、iii）ＤＨＥＡと梅ＢＸ７０Ｓを併用した周期（６名のみ）という流れで実施された。

【0029】

何も服用しなかった周期とＤＨＥＡ服用周期、ＤＨＥＡと梅酢試料の服用周期、それぞれの採卵前ｈＣＧ（Human chorionic gonadotropin）投与日の血清estradiol（Ｅ２）値、採卵数、受精率、妊娠率（胎嚢が確認された臨床的妊娠）について検討した。研究結果の統計学的解析はWilcoxonの検定を用い、P<0.05を有意差ありとした。統計評価は平均±標準誤差で表した。

【0030】

その結果は次のとおりであった。対象周期はＩＶＦ周期が４９周期、ＩＣＳＩ施行周期は１１周期であり、合計６０周期であった。平均ＡＭＨ（抗ミュラー管ホルモン）は１.４９ｎｇ/ｍｌであった。

【0031】

何も服用していない周期（無添加周期）は１６症例に対してＩＶＦを２０周期に施行、ＩＣＳＩを５周期に施行した。妊娠は対象２５周期中で１症例１周期のみであった。ＤＨＥＡ周期は１６症例に対しＩＶＦを１７周期、ＩＣＳＩを４周期施行した。妊娠は対象２１周期で７名７周期だった。ＤＨＥＡと梅酢試料併用周期（ＤＨＥＡ/梅ＢＸ７０Ｓ周期）は６症例に対してＩＶＦを１２周期、ＩＣＳＩを２周期施行した。対象１４周期のうち４名４周期に妊娠が成立した。

【0032】

平均採卵数は無添加周期が７.３６±１.２８個、ＤＨＥＡ周期が６.５２±１.０７個、ＤＨＥＡ/梅ＢＸ７０Ｓ周期が４.５±０.７３個であり、治療周期が経過するごとに採卵数は低下していった。

【0033】

採卵前ＨＣＧ投与日平均血清Ｅ２値は、無添加周期で２６１６.４±６５８.９ｐｇ/ｍｌ、ＤＨＥＡ周期で２２６０.３±４６７.３ｐｇ/ｍｌ、ＤＨＥＡ/梅ＢＸ７０Ｓ周期で１４９０.７±１８９.２ｐｇ/ｍｌと採卵数と同様に治療が経過するごとに低下していった。

【0034】

平均受精率は無添加周期が４３.１±９.８％、ＤＨＥＡ周期が５４.７±７.２９％、ＤＨＥＡ/梅ＢＸ７０Ｓ周期が８３.０±７.７％と無添加周期よりもＤＨＥＡ周期、ＤＨＥＡ/梅ＢＸ７０Ｓ周期が有意に高率であった。

【0035】

妊娠率についても無添加周期が４％、ＤＨＥＡ周期が３３.３％、ＤＨＥＡ/梅ＢＸ７０Ｓ周期が２８.６％と無添加周期よりもＤＨＥＡ周期、ＤＨＥＡ/梅ＢＸ７０Ｓ周期が有意に高率であった。

【0036】

以上のように、ＤＨＥＡ投与でも妊娠に至らなかった重症不妊患者に対してＤＨＥＡと梅酢（梅ＢＸ７０Ｓ）の投与を行い、平均採卵数が最も低値であったにもかかわらず治療３群中で、最も高い受精率を得て、６症例中４症例で妊娠成立に至った。このことから難治性不妊患者に対してＤＨＥＡと梅ＢＸ７０Ｓを投与することにより卵の質が改善し、ＡＲＴ治療成績が改善されると言える。

【実施例2】

【0037】

１．ヒト卵巣顆粒膜細胞（ＣＯＶ４３４）を用いた活性成分の単離・同定
次に、梅の実の抽出物である脱塩濃縮梅酢に不妊症の改善効果が観察されたことから、不妊の改善に効果があると推定される活性成分の単離・同定を行った。図１に活性成分の単離方法を示す。卵巣顆粒膜細胞は卵細胞を取り囲む細胞であり、卵胞腔の形成と卵胞液の貯留を促して卵胞の発育に寄与する。この際、ヒト卵巣顆粒膜細胞は、卵胞発育に阻害的に働くアンドロジェンをアロマターゼ（芳香化酵素）によりエストロゲンジェンに転換する。これにより、卵胞からのエストロジェンの分泌量が増加して、下垂体前葉から急激な一過性のＬＨ（Luteinizing hormone: 黄体形成ホルモン）の放出（ＬＨサージ）が誘導される。その結果、成熟卵胞が排卵する。卵胞の正常な排卵には、このように卵巣顆粒膜細胞のアンドロジェン／エストロジェン転換機能が重要な役割を果たし、卵胞の発育過程で顆粒膜細胞の細胞死（アポトーシス）が生じると卵胞は排卵せずに退行すると考えられている。これらのことから、ヒト卵巣顆粒膜細胞（ＣＯＶ４３４）の生存率に対する影響を指標として、活性成分を単離した。単離した成分について各種スペクトル分析（マススペクトル、^１Ｈ−ＮＭＲ、^１３Ｃ−ＨＭＲ）を行い、活性成分は3,4-Dihydroxybenzaldehyde（３,４−ＤＨＢＡ）であると同定した（図２参照）。

【0038】

（梅種子からの抽出）
梅の果肉よりも活性成分の含有量が多いことが予想されることから抽出には梅の実の種を用いた。粉砕した梅の実の種３００ｇに９００mlのメタノールを加えて、還流冷却装置を用いて８時間の抽出操作を繰り返した。３回の抽出操作により得られたエタノール抽出液を図１に示す方法で液液抽出を行い、Ｆｒ−１〜１４までの各フラクションを得た。これらのフラクションについて、ＣＯＶ４３４生存率に対する影響を調べた。

【0039】

（ＣＯＶ４３４生存率の測定）
細胞株はヒト卵巣顆粒膜細胞（ＣＯＶ４３４：DS Pharma Biomedical, Osaka, Jpn）を用いた。細胞培養用培地は１０％(v/v)牛胎児血清（FBS; HyClone, Logan, UT, USA）、１％（v/v） penicillin/streptomycin（PS：Life Technologies, Carlsbad, CA USA）を含むDulbecco's modified Eagle's medium（DMEM：Life Technologies）を使用した。ＣＯＶ４３４細胞は３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。

【0040】

培養したＣＯＶ４３４細胞を96 well-plateに５×１０^４cell/wellとなるように播種し、３日間培養した。培養後、培養液を除去し、各サンプルを目的の濃度となるように加えた培養液を１００μＬ添加した。また、他のwellにコントロールとしてＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド：最終濃度０.１％（v/v））を加えた培養液を１００μＬ添加した。細胞を１８時間培養後、培養液を除去し、新しい培養液を１００μＬ添加した。次に、各wellにＭＴＳ（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; Promega, Madison, WI, USA）を２５μＬ添加し、１時間培養した。ＭＴＳは生細胞によって還元され有色のホルマザンとなるので、その４９０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。細胞生存率はコントロールの吸光度を１００％として求めた。その結果、図１に示すようにＦｒ.８に活性が認められた。

【0041】

２．３,４−ＤＨＢＡのエストラジオールの産生促進効果
ＣＯＶ４３４細胞を12-well plateに５×１０^５cells/wellで播種し４日間培養した。次に培養液を除去し、３,４−ＤＨＢＡを加えた培養液０.５ｍＬを加えて１８時間培養を行い、培養液を回収した。培養液を10,000rpmで１５分間遠心後、上清を回収し、培養液中に含まれるエストラジオールの濃度測定を日本医学臨床検査研究所（wakayama, Jpn）に依頼した。Well間の細胞数のばらつきを補正するために、培養液回収後のwellに新しい培養液０.５ｍＬを加え、さらにＭＴＳを１２５μＬ添加して１時間培養後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。ここで得られた吸光度から細胞の生存率を計算し、その値でエストラジオール濃度を補正した。結果はコントロールに対する相対値で示した。その結果を図３に示した。

【実施例3】

【0042】

次に梅酢中の活性成分について次の条件にて高速液体クロマトグラフィによる分析を行ったところ、上記梅ＢＸ７０Ｓの１ｍｌ中に約１０μｇの３,４−ＤＨＢＡが確認された。その分析結果の一例を図４に示した。３,４−ＤＨＢＡは２３０.５ｎｍ、２７８.５ｎｍ、３１２.５ｎｍに吸収ピークを示すが、３２０ｎｍ付近の吸収を測定することで３,４−ＤＨＢＡを測定することができた。また、濃縮前の脱塩梅酢中に約４.８μｇの３,４−ＤＨＢＡが確認された。
（分析条件）
カラム：Shim-pack VP-ODS ４.６×１５０ｍｍ（島津製作所製）
検出波長（ＵＶ）：３２０ｎｍ
注入量：１０μＬ
移動相：（Ａ）０.１％ギ酸含有水、（Ｂ）０.１％ギ酸含有メタノール
Ａ：Ｂ＝ ０− ３分 ９０：１０
３−１５分 ９０：１０→６０：４０
１５−２０分 ２０：８０
２０−３０分 ９０：１０

【0043】

以上のことから、梅の実の抽出物が有する活性成分は、エストラジオール産生を促進する物質である３,４−ＤＨＢＡであることが分かった。これまでのところ、３,４−ＤＨＢＡが梅の実の抽出物に含まれていること及びエストラジオールの産生促進作用があることは知られておらず、特に梅の実の抽出物である梅酢が不妊治療剤として利用可能であることが結論づけられた。また、梅の実の抽出物である梅酢とＤＨＥＡの組み合わせ投与がＡＲＴ療法における妊娠率を向上することも証明された。

【産業上の利用可能性】

【0044】

本発明は新規な不妊治療剤を提供する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】