特許 6285436 雌性不妊症のための治療標的および診断マーカーとしての無細胞ＤＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6285436

(24)【登録日】2018年2月9日

(45)【発行日】2018年2月28日

(54)【発明の名称】雌性不妊症のための治療標的および診断マーカーとしての無細胞ＤＮＡ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/22 20060101AFI20180215BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180215BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20180215BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20180215BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20180215BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20180215BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20180215BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20180215BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/22ZNA

   C12N15/00 A

   C12Q1/68 A

   C12Q1/06

   A61P15/08

   A61K38/46

   A61K48/00

   G01N33/53 D

   G01N33/53 N

【請求項の数】16

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2015-524896(P2015-524896)

(86)(22)【出願日】2013年8月1日

(65)【公表番号】特表2015-526079(P2015-526079A)

(43)【公表日】2015年9月10日

(86)【国際出願番号】IB2013056321

(87)【国際公開番号】WO2014020564

(87)【国際公開日】20140206

【審査請求日】2016年7月4日

(31)【優先権主張番号】12179265.9

(32)【優先日】2012年8月3日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】13156626.7

(32)【優先日】2013年2月25日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】500297535

【氏名又は名称】フェリング ベスローテン フェンノートシャップ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100103182

【弁理士】

【氏名又は名称】日野 真美

(74)【代理人】

【識別番号】100162617

【弁理士】

【氏名又は名称】大賀 沙央里

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】アゾー，アンドレ

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５０６９０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５１５９０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 NCBI，Pediar Nurs, 1994, vol.20, no.3, p.278-279，[検索日：2017年5月19日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8008477

【文献】 Reprod Biomed Online, 2009, vol.18, no.3, p.407-411

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

雌性不妊症の治療剤であって、ＤＮａｓｅを含む、治療剤。

【請求項2】

前記雌性不妊症が、受胎性雌における無細胞ＤＮＡのレベルよりも統計的に高い無細胞ＤＮＡのレベルと関連する、請求項１に記載の治療剤。

【請求項3】

前記雌性不妊症が、子宮内膜症と関連しない、請求項１または請求項２に記載の治療剤。

【請求項4】

前記ＤＮａｓｅが組換えＤＮａｓｅである、請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。

【請求項5】

前記ＤＮａｓｅがＤＮａｓｅ Ｉである、請求項１〜４のいずれかに記載の治療剤。

【請求項6】

前記ＤＮａｓｅが静脈内経路または筋肉内経路によって投与される、請求項１〜５のいずれかに記載の治療剤。

【請求項7】

前記ＤＮａｓｅが、黄体期後期の間に不妊性雌に投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の治療剤。

【請求項8】

前記雌性不妊症が、ヒト雌性不妊症である、請求項１〜７のいずれかに記載の治療剤。

【請求項9】

少なくとも２５００ＵＩのＤＮａｓｅ Ｉが、少なくとも４日間、不妊女性に毎日投与される、請求項８に記載の治療剤。

【請求項10】

２５００ＵＩのＤＮａｓｅ Ｉが、黄体期後期の７日間、不妊女性に１日２回投与される、請求項９に記載の治療剤。

【請求項11】

子宮内膜症を有さない哺乳動物の雌において不妊症のｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断を補助する方法であって、
（ｉ）前記雌由来の体液サンプル中の無細胞ＤＮＡのレベルを決定することと、
（ｉｉ）前記レベルを所定の閾値と比較することと
を含み、前記所定の閾値を上回る無細胞ＤＮＡのレベルが不妊症を示す、方法。

【請求項12】

前記体液サンプルが、血漿、血清、血液または卵胞液のサンプルである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記雌がヒトである、請求項１１または請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記体液サンプルが血漿サンプルであり、前記所定の閾値が、５０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌに含まれる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、生物学的サンプル中の無細胞ＤＮＡのレベルを測定するための反応体、および生物学的サンプル中の少なくとも１つの他の生理学的パラメータを測定するための反応体を含み、前記生理学的パラメータが、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）のレベル、テロメラーゼ活性およびホモシステイン濃度からなる群から選択される、キット。

【請求項16】

少なくとも１種のＤＮＡ挿入剤およびＡＭＨを認識する抗体を含む、請求項１５に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【発明の概要】

【0001】

本発明は、雌性不妊症の分野に関する。より正確には、本発明は、雌性不妊症の新規マーカー、ならびにそれを必要とする雌性患者の受胎性を増加させるための新規治療に関する。

【0002】

過去数年間、著者らは、２０％〜２５％もの高さの原因不明不妊症の有病率を報告してきた。不妊症は、少なくとも丸１年間にわたって妊娠しようと試みた後に、カップルが妊娠できないことである。

【0003】

不妊症の診断は、病歴を聴取し身体検査を行うことで始まる。この試験が、１年間の試みにおいて妊娠しない任意のカップルにおける排卵機能の評価、子宮卵管造影図および腹腔鏡検査に限定される場合、多数の不妊症の症例は、原因不明のままである。いくつかのアッセイ（いくつかのホルモンおよびサイトカインのレベルの測定、雌性不妊症に関連する遺伝子中の任意の変異を検出するための遺伝子検査技術）を追加することによる診断試験の拡張は、「原因不明」不妊症をわずかに低減させるにとどまっている。

【0004】

喫煙、過剰なカフェイン摂取またはアルコール使用の有害な影響が公知である。しかし、受胎性に対するそれらの影響は、個体毎に大きく異なり、今日、この影響の定量を可能にする生物学的マーカーは存在しない。したがって、これらの影響は、現在利用可能な試験によっては正確に評価されない。

【0005】

臨床的不妊症の治療の中で、補助生殖医療（ＡＲＴ）は、治療当たりの最も高い生児出生率を有する。ＡＲＴは、その開始以来、世界中で百万を超える乳児の妊娠に寄与してきた。しかし、これらの技術の失敗の割合は、なおも顕著であり、試みが失敗した後にＡＲＴを続行するまたはＡＲＴ治療を繰り返すというカップルの決断は、治療の肉体的、感情的および経済的コストに起因して、しばしば困難な決断である。

【0006】

体外受精（ＩＶＦ）および卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のデータは、最も首尾よいプログラムにおいてでさえ、移植した胚の数と比較して低い着床率を明らかに示している。着床に関する問題を導く欠陥は、おそらく、現在評価されている欠陥よりもかなり一般的であり、原因不明不妊症の別の領域を構成している。

【0007】

インテグリン、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦまたは他の増殖因子などの着床因子をアッセイすることは、不妊症の他の症例の理解を導き得、したがって、「原因不明不妊症」を有すると分類される患者の百分率を低下させるが、ほとんどの症例では、これは、治療に関する最初の熟慮において助けにならない。フランスでは、ＡＲＴの成功率は、卵母細胞回収当たりの生児出生に関して２５％〜２８％の範囲である。

【0008】

上記のことから、雌性不妊症に関与するいくつかのパラメータは、現在の試験によって完全に無視されているように見える。

【0009】

ヒト血漿中の循環無細胞ＤＮＡの存在は、MendelおよびMetais［１］によって１９４８年に報告されている。無細胞循環ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、炎症性障害、酸化ストレスおよび悪性腫瘍を含む、広範な生理学的状態および病理学的状態において研究されてきた。ｃｆＤＮＡは、３０ｎｇ／ｍｌの平均で０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲の血液濃度で、健康な被験体において存在する［２］。正常細胞量のＤＮＡ含量を６．６ｐｇと仮定すると、これらの値は、１ｍｌ当たり５０００ゲノムの平均で、血液１ｍｌ当たり０〜１５，０００ゲノム等量の平均を示す。このＤＮＡのほとんどは二本鎖であり、見たところ核タンパク質複合体の形態である。

【0010】

低百分率のアガロースゲル上でのｃｆＤＮＡの電気泳動は、ＤＮＡ断片のサイズ分布においてサンプル毎のバリエーションを伴って、０．１８キロベース〜２１キロベースの、ＤＮＡ断片のサイズにおけるバリエーションを示す。大きい準ゲノムサイズのＤＮＡ断片を検出することが一般的である。

【0011】

血流中への遊離ＤＮＡの放出と関連する正確な機構は不明確なままであるが、これは、アポトーシス、壊死および細胞からの活性な放出の組合せにおそらく由来する。

【0012】

血流からのｃｆＤＮＡのクリアランスは、迅速に生じる：胎児ＤＮＡは、送達後に、１６．３分間の半減期で母親の血液から消失する［３］。ｃｆＤＮＡは、血漿ヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ）に対して感受性であるが、腎［４］および肝［５］クリアランス機構もまた、ｃｆＤＮＡの排出に関与することが公知である。

【0013】

これまで、ｃｆＤＮＡの放出が生物学的効果を有するかどうかは知られていなかった。培養された細胞は、培地中に二本鎖ＤＮＡを放出することが示されており［６］、ｃｆＤＮＡは、細胞中に取り込まれ得る［７］。これらの知見は、「ゲノメタスタシス」の概念の導入を導いた［８］。しかし、この仮説は未だ証明されていない。

【0014】

循環ＤＮＡは、血漿および血清の両方から単離され得るが、血清は、およそ６倍高い濃度の循環ＤＮＡを含む。最近、Umetaniらは、６倍高い血清ＤＮＡレベルの１０％未満が、他の供給源による夾雑（即ち、血清の分離の間の白血球からの放出）に起因することを示している［９］。より高い血清レベルの理由は未知のままであるが、精製手順の間の血漿中のＤＮＡの喪失は排除された［９］。

【0015】

無細胞循環ＤＮＡは、潜在的に有用なバイオマーカーである。ＤＮＡレベルおよび断片化パターンは、診断および予後判定の目的のために、興味深い可能性を提供する。最近、Bartoovらは、雄性被験体由来の流体サンプル中のｃｆＤＮＡの測定値に基づいて、前記被験体の受胎性の状態を評価するための方法を記載している（ＷＯ２００８／０４７３６４）。彼らは、低受胎性雄にＤＮａｓｅを投与することによって、雄性低受胎性を治療するための方法もまた提案している。無細胞ＤＮＡは、悪性および良性の増殖ならびに炎症性状態、例えば子宮内膜症の非侵襲性モニタリングのためのバイオマーカーとしても提案されている［１０］。

【0016】

ごく最近、Czamanski-Cohenらは、ＩＶＦ治療を受けている３７人の女性のコホートにおいて、血漿ｃｆＤＮＡ濃度が、βＨＣｇ試験の日に、妊娠した女性と比較して、妊娠しなかった女性において統計的により高かったことを報告している。しかし、著者らによって認識されているように、この研究は、雌性不妊症とｃｆＤＮＡ濃度との間の相関を確立できていないが、これは、この研究に含まれていた全ての女性が、ＩＶＦ治療の過程にあったからである［１１］。

【0017】

本明細書に記載されるように、本発明者は、ｃｆＤＮＡレベルが、受胎性の女性よりも不妊の女性において統計的により高かったことを、ここで実証している。したがって、ｃｆＤＮＡのレベルは、不妊症の診断および予後判定のために有用であり得る。ｃｆＤＮＡのレベルは、子宮内膜症に罹患していない女性における不妊症の診断および予後判定のためにも有用であり得る。ｃｆＤＮＡが侵襲性または有痛性の手順なしに取得できるという事実は、ｃｆＤＮＡを、女性における不妊症の診断における使用に特に適したものにしている。さらに、以下の実験部分において実証されるように、無細胞ＤＮＡレベルの低下へと導く治療は、治療された雌性患者の受胎性を顕著に改善する。

【0018】

したがって、本発明の第１の態様は、哺乳動物の雌において不妊症をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断する方法であって、
（ｉ）前記雌由来の体液サンプル中の無細胞ＤＮＡのレベルを決定することと、
（ｉｉ）前記レベルを所定の閾値と比較することと
を含み、前記所定の閾値を上回る無細胞ＤＮＡのレベルが不妊症を示す、方法である。

【0019】

この方法は、ヒトまたは動物の雌、好ましくはヒトにおいて、不妊症を診断するために使用され得る。この方法は、カップルの不妊症の理由が調査される場合に行われる第１の試験と一緒に、またはそれらの試験で不妊症の原因を同定できなかった患者においてこれらの試験後に、実施され得る。特に、本発明の方法は、子宮内膜症に罹患していない雌において不妊症をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するために使用され得る。

【0020】

もちろん、上記において、「不妊症を示す」ｃｆＤＮＡレベルを有する雌は、この雌が、所定の閾値を下回るｃｆＤＮＡを有する雌よりも高い、不妊の可能性を有することを意味している。

【0021】

上記の方法では、体液サンプルは、血漿、血清、血液または卵胞液のサンプルであり得る。

【0022】

以下の実験部分で示されるように、ｃｆＤＮＡ濃度を、９４人の受胎性女性および９６人の不妊女性の血漿中で測定した。このコホートでは、平均ｃｆＤＮＡ血漿濃度は、受胎性女性ではおよそ５０ｎｇ／μｌであり、不妊女性ではおよそ１０９ｎｇ／μｌであった。したがって、上記方法がヒト雌に関し、体液サンプルが血漿サンプルである場合、閾値は、これら２つの値の間で選択され、好ましくは、約５０ｎｇ／μｌ〜約１００ｎｇ／μｌで選択される。もちろん、当業者は、患者のより大きいコホートに対してこのパラメータをさらに調査することによって、これらの値を精緻化および改変することが可能である。より多数の患者に由来するサンプル中のｃｆＤＮＡレベルを測定することによって、当業者は、対応する不妊症の可能性と共に、ｃｆＤＮＡレベルについての値の尺度も確立する。女性の均質な下位群（その年齢および／または挙動パラメータ、例えば彼女らが喫煙するか否か、および／または生理学的パラメータ、例えば、体重、ＨｂＡ１ｃなどに依存する）を含むより大きいコホートにおける測定もまた、異なる状況を反映する異なる閾値の決定を導き得る。この場合、当業者は、他の関連するパラメータを考慮してそのｃｆＤＮＡレベルを解釈することによって、女性の不妊症の可能性を決定する。

【0023】

既に述べたように、この方法は、血漿サンプルとは異なる体液サンプル中のｃｆＤＮＡレベルを測定することによって実施され得る。もちろん、各体液について、適切な閾値を決定するために、受胎性雌および不妊性雌を含む雌の顕著なコホートにおいて、測定を実施する必要がある。

【0024】

この閾値は、不妊であり得る全てまたはほぼ全ての雌を同定することを目的とした場合、受胎性雌の平均値に近くなるように選択される。この場合、受胎性雌は、不妊である可能性が高いと診断されることもあり得る（偽陽性）。対照的に、不妊である最も高い可能性を有する雌のみを同定することを目的とした場合、この閾値は、不妊性雌の平均値に近くなるように選択される。

【0025】

１つの特定の実施形態では、本発明による方法は、女性由来の血漿サンプル中のｃｆＤＮＡのレベルを測定することによって、前記女性において不妊症をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するために実施され、６０ｎｇ／μｌを上回るｃｆＤＮＡの血漿レベルが、不妊症を示す。

【0026】

別の実施形態では、本発明による方法は、女性由来の血漿サンプル中のｃｆＤＮＡのレベルを測定することによって、前記女性において不妊症をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するために実施され、７０ｎｇ／μｌを上回るｃｆＤＮＡの血漿レベルが、不妊症を示す。

【0027】

別の実施形態では、本発明による方法は、女性由来の血漿サンプル中のｃｆＤＮＡのレベルを測定することによって、前記女性において不妊症をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するために実施され、８０ｎｇ／μｌを上回るｃｆＤＮＡの血漿レベルが、不妊症を示す。ここで、前記所定の閾値を上回る無細胞ＤＮＡのレベルは不妊症を示す。

【0028】

別の実施形態では、本発明による方法は、女性由来の血漿サンプル中のｃｆＤＮＡのレベルを測定することによって、前記女性において不妊症をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するために実施され、９０ｎｇ／μｌを上回るｃｆＤＮＡの血漿レベルが、不妊症を示す。ここで、前記所定の閾値を上回る無細胞ＤＮＡのレベルは不妊症を示す。

【0029】

なお別の実施形態では、本発明による方法は、女性由来の血漿サンプル中のｃｆＤＮＡのレベルを測定することによって、前記女性において不妊症をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断するために実施され、１００ｎｇ／μｌを上回るｃｆＤＮＡの血漿レベルが、不妊症を示す。

【0030】

別の態様によれば、本発明は、上記方法を実施するためのキットに関する。特に、本発明は、生物学的サンプル中のｃｆＤＮＡのレベルを測定するための反応体、および生物学的サンプル中の少なくとも１つの他の生理学的パラメータの測定に特異的な反応体を含むキットを対象とし、前記生理学的パラメータは、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）のレベル、テロメラーゼ活性およびホモシステイン濃度からなる群から選択される。

【0031】

生物学的サンプル中のｃｆＤＮＡのレベルは、例えば、任意の核酸染色、例えば、挿入因子などであるがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の技術によって測定され得る。ｃｆＤＮＡレベルを測定するために使用され得、本発明によるキット中に含まれるＤＮＡ挿入因子の非限定的な例には、ベルベリン、エチジウムブロマイド、プロフラビン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、サリドマイド、Ｓｙｂｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、Ｓｙｂｒ（登録商標）ＧｏｌｄおよびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）が含まれる。

【0032】

抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）は、ＭＩＳ（ミュラー管抑制因子）とも呼ばれる。ＡＭＨは卵胞によって直接産生されるので、ＡＭＨレベルは、卵巣中の胞状卵胞の数と相関する。より低いＡＭＨを有する女性は、より低い胞状卵胞計数を有し、より高いレベルを有する女性と比較して、より低い数の卵母細胞を生成することが実証されている。ＡＭＨ血液レベルは、残存する卵供給のサイズ、即ち「卵巣予備能」を反映すると考えられる。ＡＭＨは、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによって測定され得る。したがって、本発明によるキットは、抗ＡＭＨ抗体を含み得る。

【0033】

テロメラーゼは、ＤＮＡ分解を修復する酵素である。しかし、テロメラーゼは、不十分な濃度で存在する場合には、無効であり得る。加えて、高すぎる濃度で存在する場合、テロメラーゼは、アポトーシス因子を生成する。結果として、テロメラーゼは、受胎性にも関係し、初期胚発生に影響を与える。そのレベルは、イムノアッセイによって測定され得、したがって、本発明によるキットは、テロメラーゼを特異的に認識する抗体を含み得る。

【0034】

ホモシステインは、さらなるメチレン（−ＣＨ_２−）基によって異なる、アミノ酸システインの非タンパク質ホモログである。ホモシステインは酸化ストレスのマーカーであり、したがって、個体の受胎性の状態に関する情報を与え得る。ホモシステインレベルは、酵素アッセイによって測定され得る：結合したまたは二量体化したホモシステイン（酸化形態）は、遊離ホモシステインへと還元され、これが次いで、シスタチオニンベータ−シンターゼ（ＣＢＳ）によって触媒されてセリンと反応し、Ｌ−シスタチオニンを形成する。シスタチオニンは、次に、シスタチオニンベータ−リアーゼ（ＣＢＬ）によって分解されて、ホモシステイン、ピルビン酸およびアンモニアを形成する。ピルビン酸は次いで、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）によって、補酵素としてＮＡＤＨを用いて乳酸に変換される。ＮＡＤへのＮＡＤＨの変換の速度は、ホモシステインの濃度（ΔＡ３４０ｎｍ）と正比例する。

【0035】

特定の実施形態によれば、本発明によるキットは、少なくとも１種のＤＮＡ挿入剤およびＡＭＨを特異的に認識する抗体を含む。

【0036】

以下の実験に記載されるように、成功しなかった数回のＩＶＦを含む数回の治療を既に受けた不妊女性を、デオキシリボヌクレアーゼで治療した。デオキシリボヌクレアーゼによる１ラウンドのみの治療とその後のＡＲＴの後、これらの患者のうち５０％よりも多くが、妊娠した。したがって、特に、この不妊症が、受胎性女性において統計的に観察される無細胞ＤＮＡのレベルよりも高い無細胞ＤＮＡのレベルと関連している場合、本発明は、雌性不妊症の治療における使用のための、デオキシリボヌクレアーゼにも関する。

【0037】

デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）は、ＤＮＡ骨格中のホスホジエステル結合の加水分解的切断を触媒する酵素である。デオキシリボヌクレアーゼは、したがって、ヌクレアーゼの１つの型である。広範な種々のデオキシリボヌクレアーゼが公知であり、これらは、その基質特異性、化学的機構および生物学的機能において異なっている。

【0038】

ある種のＤＮａｓｅは、ＤＮＡ分子の末端にある残基のみを切断する（エキソデオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼの１つの型）。他のＤＮａｓｅは、鎖に沿ったいずれの場所でも切断する（エンドデオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼのサブセット）。ある種のＤＮａｓｅは、制限酵素など、それらが切断するＤＮＡ配列について非常に配列特異的であるが、他のＤＮａｓｅは、かなり無差別である。ある種のＤＮａｓｅは二本鎖ＤＮＡのみを切断するが、他のＤＮａｓｅは一本鎖分子に特異的であり、他のＤＮａｓｅは両方に対して作用する。

【0039】

デオキシリボヌクレアーゼＩは、ピリミジンヌクレオチドと隣接するホスホジエステル結合においてＤＮＡを優先的に切断して、３’位上に遊離ヒドロキシル基を有する５’５’−リン酸で終わるポリヌクレオチドを生じ、平均してテトラヌクレオチドを生じる。デオキシリボヌクレアーゼＩは、一本鎖ＤＮＡ、ｄｓＤＮＡおよびクロマチンに対して作用する。

【0040】

デオキシリボヌクレアーゼＩＩ（酸ＤＮａｓｅ）は、ネイティブおよび変性したＤＮＡ中のデオキシリボヌクレオチド結合を加水分解して、３’−リン酸を有する産物を生じる。名称が示唆する通り、デオキシリボヌクレアーゼＩＩは、酸性のｐＨでより効率的である。アルファＤＮａｓｅ ＩＩ（通常、単にＤＮａｓｅ ＩＩと呼ばれる）およびＤＮａｓｅ ＩＩベータ（ＤＬＡＤまたはＤＮａｓｅ ＩＩ様酸ＤＮａｓｅとも呼ばれる）を含むいくつかの公知のＤＮａｓｅ ＩＩが存在する。

【0041】

任意の型のＤＮａｓｅが本発明において使用され得るが、ＤＮａｓｅ Ｉが好ましい。組換えヒトＤＮａｓｅ Ｉは、既に臨床的に使用されている。ＤＮａｓｅ酵素は、嚢胞性線維症罹患者によって、ネブライザーを使用して吸入され得る。粘液中に蓄積する白血球は、ＤＮＡを分解および放出し、このＤＮＡが粘液の「粘着性」を増大させるので、ＤＮａｓｅ酵素は助けになる。ＤＮａｓｅはＤＮＡを分解し、粘液は、肺からの除去がより容易である。

【0042】

本発明は、雌性不妊症を治療する方法にも関する。特定の実施形態では、本発明は、子宮内膜症に罹患していない雌において雌性不妊症を治療する方法に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、受胎性雌において統計的に観察されるものよりも高い無細胞ＤＮＡのレベルを示す雌において雌性不妊症を治療する方法に関する。その実施形態のいずれかでは、本発明による方法は、受胎性雌において観察されるレベルと類似のレベルまで、彼女の無細胞ＤＮＡレベルを減少させるのに十分な量で、この雌にデオキシリボヌクレアーゼを投与することを含む。上記において、「無細胞ＤＮＡのレベル」は、任意の適切な体液、例えば血漿、血清、血液または卵胞液中の無細胞ＤＮＡの濃度として理解すべきである。以下において、（受胎性雌と比較して）高いレベルのｃｆＤＮＡを有する不妊性雌は、本明細書に開示されるような治療を「必要とする」と指定される。本発明は、女性において不妊症を治療するために特に有利である。

【0043】

本発明では、組換えヒトＤＮａｓｅが、特に女性を治療するために、有利に使用され得る。もちろん、別の種由来の雌が治療される場合、この種由来の組換えＤＮａｓｅが好ましい。既に言及したように、任意のＤＮａｓｅが本発明を実施するために使用され得るが、ＤＮａｓｅ Ｉが好ましい。

【0044】

循環無細胞ＤＮＡの減少を得るのに十分な量のＤＮａｓｅの送達を導く限り、本発明を実施する場合、任意の投与経路が使用され得る。例えば、ＤＮａｓｅは、静脈内経路または筋肉内経路によって投与され得る。

【0045】

不妊症の治療のために、ＤＮａｓｅは、血液中および／または卵胞液中の無細胞ＤＮＡのレベルにおける減少を得るのに十分な量で投与される。例えば、最小２５００ＵＩのＤＮａｓｅ Ｉが、少なくとも２日間、好ましくは少なくとも３日間または４日間またはそれ以上の間、不妊性雌に毎日投与され得る。もちろん、個体間の多様性に起因して、異なる応答が観察され得、その結果、投与される用量が無細胞ＤＮＡレベルの減少を得るのに十分であるように投薬レジメンが適合され得、そのレベルは、受胎性患者において観察されたレベルと類似するはずである。ｃｆＤＮＡレベルは、その減少をチェックし、不要な治療を回避するために、追跡され得る。

【0046】

ｃｆＤＮＡレベルの減少後および治療を停止した後に、ｃｆＤＮＡレベルは、その以前の値に達するように迅速に増加することはないことが観察されている。少なくとも数日間、ｃｆＤＮＡレベルはおよそ安定のままである。結果として、ＤＮａｓｅは、黄体期後期の間に、それを必要とする不妊性雌に有利に投与され得る。

【0047】

本発明の特定の実施形態によれば、以下の実験の部分に例示されるように、２５００ＵＩのＤＮａｓｅ Ｉが、黄体期後期の７日間、それを必要とする不妊性雌に１日２回投与される。

【0048】

もちろん、不妊症の治療の上記方法は、本明細書以下の実験に記載されるように、ＡＲＴと組み合わせることができる。

【0049】

本発明は、以下の図面および実施例によってさらに例示される。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】７３人の受胎性男性および８８人の不妊男性ならびに９４人の受胎性女性および９６人の不妊女性の血液血漿中の平均ｃｆＤＮＡ濃度を示す図である。

【図2】３７人の女性由来の血液血漿（黒色四角）および卵胞液（灰色四角）中のｃｆＤＮＡ濃度を示す図である。妊娠したこの群の女性は、その群の全ての女性（妊娠した女性および妊娠しなかった女性を含む）についての平均値よりも低い、血漿中および／または卵胞液中の平均ｃｆＤＮＡレベルを有した。

【実施例】

【0051】

実施例１：患者、材料および方法
精液サンプル
５０歳未満の受胎性男性および不妊男性由来の精液サンプルを、３〜６日間の禁欲後の自慰行為によって収集した。精子の計数ならびに運動性、活力および形態の分析を、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎのガイドラインに従って実施した。合計１６１人の男性をこの研究に含めた：７３人の受胎性男性および８８人の不妊男性。

【0052】

雌由来の血漿および卵胞液サンプル
血漿中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）量は、３７歳未満の９４人の受胎性（ＡＭＨ＞２ｎｇ／ｍｌ）および９６人の不妊女性において測定された。ゲノム研究を実施して、特に不妊女性において、このｃｆＤＮＡの起源を検証した。

【0053】

サンプルが入手可能である場合、ｃｆＤＮＡ定量もまた、対応する不妊女性において卵胞液サンプル中で実施した。合計３７の卵胞液サンプルをこの研究に含めた。

【0054】

卵巣刺激および卵胞液回収
ほとんどの患者を、組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ Ｆ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）もしくはＰｕｒｅｇｏｎ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））またはＨＭＧ（Ｍｅｎｏｐｕｒ（登録商標）：Ｆｅｒｒｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いた長期アゴニストプロトコルまたはアンタゴニストプロトコルを使用して、ＡＲＴについて刺激した。ホルモンおよび超音波検査制御の後、卵巣を組換えまたは尿ＨＣＧで誘発し、その３６時間後に、周知の技術に従って卵母細胞回収を行った。２つまたは３つの支配的な卵胞液を単離し、貯蔵前に遠心分離した。次いで、ｃｆＤＮＡ含量を、血漿／血清中と同じ方法を使用して評価した。

【0055】

ｃｆＤＮＡ単離およびＰＣＲ増幅
血漿ｃｆＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ鋳型調製キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して単離した。溶出緩衝液を、ｄｄＨ_２Ｏを使用することによって２０％溶液に希釈し、７０℃で予め温めた。サンプルを、１６，０００ｇで５分間遠心分離し、４００μｌの血漿を、細胞残骸を回避して、２ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。４００μｌの結合緩衝液および４０μｌの再構成されたプロテイナーゼＫを、このサンプルに混合した。短時間のボルテックス後、チューブを、７０℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、２００μｌの１００％イソプロパノールをこのサンプルに混合し、これを結果として、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ鋳型調製キット中に提供されている高純度フィルター収集チューブの上部リザーバーに移した。カラムを、室温で８，０００ｇで１分間遠心分離した。フロースルーおよび収集チューブを廃棄し、フィルターを新たな収集チューブに合わせた。このローディング工程を、全サンプルがフィルター上にロードされるまで反復した。５００μｌのインヒビター除去緩衝液を上部リザーバーに添加し、室温で８，０００ｇで１分間遠心分離した。フロースルーおよび収集チューブを廃棄し、フィルターを新たな収集チューブと合わせた。これらのチューブを、上部リザーバーに５００μｌの洗浄緩衝液を添加することによって２回洗浄し、室温で１分間遠心分離した。カラムを、最大速（およそ１３，０００ｇ）で１０秒間遠心分離することによって乾燥させ、新たな１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、インキュベータ中で７０℃で５分間温めた。１００μｌの予め温めた２０％溶出緩衝液を、注意深くフィルターに添加した。このチューブおよびフィルターを、７０℃のインキュベータ中に配置し、低速（およそ４００ｒｐｍ）で５分間振盪した。ＤＮＡサンプルを、８，０００ｇで５分間遠心分離することによってこれらのカラムから溶出させ、引き続いて、使用の前に４℃で貯蔵したか、または長期貯蔵のために−７０℃で凍結させた。

【0056】

ＰＣＲ増幅
ＪｍＪＣ２遺伝子座およびＤＸＳ１２８５遺伝子座を増幅するために使用したマスターミックスは、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、２μＭの各プライマーセット、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２および０．５ＵのＢｉｏｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を、１５μｌの反応容量中に含んでいた。ＪｍＪＣ２（Ｙ染色体のマーカー）およびＤＸＳ１２８５（Ｘ染色体のマーカー）を増幅するために使用したプライマーの配列は、６０℃のアニーリングで、それぞれ
５’−ＧＡＧＴＡＴＧＣＧＡＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１）、
５’−ＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡ−３’（配列番号２）および
５’−ＣＧＴＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＴＣＣＣ−３’（配列番号３）、
５’−ＧＡＡＣＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号４）である。

【0057】

ｃｆＤＮＡ定量
血液サンプルを、ＥＤＴＡ含有バキュテナーチューブ中に収集した。それらを、血漿単離のために遠心分離した（３，４００ｒｐｍで１５分間）。ｃｆＤＮＡ定量の前に、血漿および卵胞液サンプルを、３，４００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。サンプルは、赤血球なしで透明でなければならない。実際、ｃｆＤＮＡ定量は、着色サンプル中では変化し得る。標準ＤＮＡ溶液を、１６６μｌ中で２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌに希釈し、標準曲線を描いた。１６６μｌの１Ｎ ＨＣＬＯ_４（過塩素酸）および６６４μｌのジフェニルアミンを、各１６６μｌの血漿または卵胞液の上清サンプルに添加した。サンプルを、３７℃で２０時間インキュベートし、引き続いて、１５，０００ｇで１０分間遠心分離した。３００μｌの上清を、９６ウェルプレートに移し、６００ｎｍで分光光度計（Ｔｅｃａｎ、Ｇｅｎｉｏｓ）で測定した。

【0058】

ＤＮａｓｅ治療
患者を、書面によるインフォームドコンセントを得た後に登録した。

【0059】

先行するサイクルの黄体期後期に、非常に高いレベルのｃｆＤＮＡ（＞１００ｎｇ／マイクロリットル）を有する１０人の選択された女性を、７日間にわたり、筋肉内経路を介して１日２回、１アンプルのドルナーゼアルファ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））２．５ｍｇ（２５００ＩＵ）で治療した。

【0060】

Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）（ドルナーゼアルファ）吸入液は、ＤＮＡを選択的に切断する組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ（ｒｈＤＮａｓｅ）の、無菌の無色透明の高度に精製された溶液である。

【0061】

Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）は、圧縮空気駆動型のネブライザーシステムによって生成されるエアロゾルミストの吸入によって通常投与される。しかし、ｒｈＤＮａｓｅの全身レベルは、吸入後に非常に低かったので（最大１５％）、静脈内法によってであっても、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅの毒性学的研究において副作用が存在しなかったという事実を前提として、ＤＮａｓｅ濃度を増加させるために、ＩＭ注射のためのこの同じ製品を注文することを決断した。

【0062】

統計
両側ｔ検定を使用して、受胎性個体と不妊個体との間のｃｆＤＮＡレベルにおける差異を評価した。相関係数を、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関両側検定を使用して計算した。統計的差異を、Ｐ＜０．０５の場合に有意とみなした。

【0063】

実施例２：ｃｆＤＮＡおよび雄性不妊症
この第１の予備研究の目的は、増加したｃｆＤＮＡにＤＮＡ断片化が関与し得るという事実を前提として、雄性不妊症と高レベルのｃｆＤＮＡとの間の関連の概念を検証することであった。

【0064】

ｃｆＤＮＡの完全性を評価するために、単離されたｃｆＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実施した。Ｘ染色体マーカーを、男性および女性の両方の血漿から単離されたｃｆＤＮＡを用いて増幅した。Ｙ染色体マーカーを、雌性血漿からではなく、雄性血漿から単離されたｃｆＤＮＡを用いて増幅した。

【0065】

より高いレベルのｃｆＤＮＡが、それぞれの受胎性コントロールと比較して、不妊個体由来の血液血漿サンプルにおいて検出された。血漿中のｃｆＤＮＡ量を、７３人の受胎性男性（６０．７ｎｇ／μｌ±４６．９）および８８人の不妊男性（８３．３ｎｇ／μｌ±６４．８）において測定した、ｐ＝８．７ｅ^−３（図１）。

【0066】

実施例３：女性由来の血液血漿中のｃｆＤＮＡ
男性と同様、より高いレベルのｃｆＤＮＡが、それぞれの受胎性コントロールと比較して、不妊女性由来の血液血漿サンプルにおいて検出された。しかし、受胎性個体と不妊個体との間の差異は、男性においてよりも女性において、より大きかった。

【0067】

実際、９４人の受胎性女性由来の血漿中のｃｆＤＮＡ量は、９６人の不妊女性（１０９．４ｎｇ／μｌ±８８．１）中よりも、２倍低い（４９．２ｎｇ／μｌ±５８．０）ことが証明された、ｐ＝１．０２ｅ^−７（図１）。

【0068】

実施例４：３７人の不妊女性における血液血漿対卵胞液中のｃｆＤＮＡ量
血液血漿中のｃｆＤＮＡ濃度を、卵胞液中のｃｆＤＮＡ濃度と比較した。統計的に有意な正の相関が、血液血漿ｃｆＤＮＡ濃度と卵胞液との間で見出された（ｒ＝０．４３、ｐ＝６．４ｅ^−３）（図２）。予備研究では、妊娠女性は、非妊娠女性よりも、卵胞液および血清中の少ないｃｆＤＮＡを有した（データ示さず）。

【0069】

実施例５：血液血漿ｃｆＤＮＡ濃度および受胎性に対するＤＮａｓｅ治療の効果
今日まで、４年間より長い間不妊であったおよび／または原因不明で数回のＩＶＦ／ＩＣＳＩの失敗の履歴を有した１０人の患者を、次のサイクルの２日目に開始し、ＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニストと共に組換えまたは尿ＦＳＨを使用する卵巣誘導治療の直前に、以前のサイクルの黄体期後期中の７日間にわたって治療した。全ての患者は、分割された胚を得、患者１人当たり、３日目の１つまたは数個の胚を移植した。

【0070】

各患者について、血液サンプルを、ＤＮａｓｅ Ｉ治療の直前および直後に収集して、血漿中のｃｆＤＮＡを定量した。

【0071】

これらの患者のうち６人が、１回だけのかかる治療の後に妊娠し、７人の子供の出産が得られた（１人は流産、４人は単胎出産および１人は三つ子出産）。治療された患者と比較したデータを、以下の表１および表２に示す：

【0072】

【表1】

【0073】

【表2】

【0074】

表２に現れるように、妊娠した全ての患者は、ＤＮａｓｅ Ｉ治療後にｃｆＤＮＡの減少を有した。唯一の流産は、質の悪い精巣内精子に起因するとみなした。妊娠しなかった特定の患者では、ｃｆＤＮＡの落ち込みは中程度であり、これは、ＤＮａｓｅ Ｉの用量が、非常に高レベルのｃｆＤＮＡを有する特定の場合には、増加されるべきであることを示唆している。

【0075】

考察
その遊離ＤＮＡレベルに従った、ＤＮａｓｅによる、ＩＶＦ／ＩＣＳＩの前の不妊カップルの女性の短い予防的治療は、症例のうち５０％よりも多くにおいて、妊娠を導いた。全ての治療された女性は、４年よりも長い原因不明不妊症、または着床なしの発生の初期段階における多くの胚移植を示した。

【0076】

（参考文献）

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
雌性不妊症の治療において使用するための、ＤＮａｓｅ。
［２］
受胎性雌における無細胞ＤＮＡのレベルよりも統計的に高い無細胞ＤＮＡのレベルと関連した雌性不妊症の治療において使用するための、上記［１］に記載のＤＮａｓｅ。
［３］
前記雌が子宮内膜症を有さない、雌性不妊症の治療において使用するための、上記［１］または上記［２］に記載のＤＮａｓｅ。
［４］
前記ＤＮａｓｅが組換えＤＮａｓｅである、雌性不妊症の治療において使用するための、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮａｓｅ。
［５］
前記ＤＮａｓｅがＤＮａｓｅ Ｉである、雌性不妊症の治療において使用するための、上記［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮａｓｅ。
［６］
前記ＤＮａｓｅが静脈内経路または筋肉内経路によって投与される、雌性不妊症の治療において使用するための、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のＤＮａｓｅ。
［７］
前記ＤＮａｓｅが、黄体期後期の間に不妊性雌に投与される、雌性不妊症の治療において使用するための、上記［１］〜［６］のいずれかに記載のＤＮａｓｅ。
［８］
ヒト雌性不妊症の治療において使用するための、上記［１］〜［７］のいずれかに記載のＤＮａｓｅ。
［９］
少なくとも２５００ＵＩのＤＮａｓｅ Ｉが、少なくとも４日間、不妊女性に毎日投与される、ヒト雌性不妊症の治療において使用するための、上記［１］〜［８］のいずれかに記載のＤＮａｓｅ。
［１０］
２５００ＵＩのＤＮａｓｅ Ｉが、黄体期後期の７日間、不妊女性に１日２回投与される、ヒト雌性不妊症の治療において使用するための、上記［１］〜［９］のいずれかに記載のＤＮａｓｅ。
［１１］
哺乳動物の雌において不妊症をｉｎ ｖｉｔｒｏで診断する方法であって、
（ｉ）前記雌由来の体液サンプル中の無細胞ＤＮＡのレベルを決定することと、
（ｉｉ）前記レベルを所定の閾値と比較することと
を含み、前記所定の閾値を上回る無細胞ＤＮＡのレベルが不妊症を示す、方法。
［１２］
前記雌が子宮内膜症を有さない、上記［１１］に記載の方法。
［１３］
前記体液サンプルが、血漿、血清、血液または卵胞液のサンプルである、上記［１１］または上記［１２］に記載の方法。
［１４］
前記雌がヒトである、上記［１１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
前記体液サンプルが血漿サンプルであり、前記所定の閾値が、５０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌに含まれる、上記［１４］に記載の方法。
［１６］
上記［１１］〜［１５］のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、生物学的サンプル中の無細胞ＤＮＡのレベルの測定に特異的な反応体、および生物学的サンプル中の少なくとも１つの他の生理学的パラメータの測定に特異的な反応体を含み、前記生理学的パラメータが、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）のレベル、テロメラーゼ活性およびホモシステイン濃度からなる群から選択される、キット。
［１７］
少なくとも１種のＤＮＡ挿入剤およびＡＭＨを特異的に認識する抗体を含む、上記［１６］に記載のキット。

【図1】

【図2】