特許 6285934 イムノアッセイの干渉の低減、及び安定化のためのシャペロン−シャペロン融合ポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6285934

(24)【登録日】2018年2月9日

(45)【発行日】2018年2月28日

(54)【発明の名称】イムノアッセイの干渉の低減、及び安定化のためのシャペロン−シャペロン融合ポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20180215BHJP

   C07K 14/245 20060101ALI20180215BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180215BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20180215BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C07K14/245

   C12N15/00 A

   G01N33/53 D

【請求項の数】10

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2015-530374(P2015-530374)

(86)(22)【出願日】2013年9月4日

(65)【公表番号】特表2015-529211(P2015-529211A)

(43)【公表日】2015年10月5日

(86)【国際出願番号】EP2013068269

(87)【国際公開番号】WO2014037389

(87)【国際公開日】20140313

【審査請求日】2016年7月27日

(31)【優先権主張番号】12006298.9

(32)【優先日】2012年9月6日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(72)【発明者】

【氏名】デューフェル，ハルトムート

(72)【発明者】

【氏名】リーデル，アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】シャアーシュミット，ペーター

(72)【発明者】

【氏名】シュミット，ウルバン

(72)【発明者】

【氏名】ショルツ，クリスティアン

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５２１９３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２８４９０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２６３９８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５３５１９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Scholz C et al，SlyD proteins from different species exhibit high prolyl isomerase and chaperone activities，Biochemsitry，２００６年，Vol 45 No 1，20-33

【文献】 Hong SY et al，Soluble expression of Candida antarctica lipase B in Escherichia coli by fusion with Skp Chaperone，Biotechnology and Bioprocess Engineering，２０１２年，Vol. 17 No. 4，687-692，20120728 first online

【文献】 Scholz C et al，Functional solubilization of aggregation-prone HIV envelope proteins by covalent fusion with chaperone modules，J Mol Biol，２００５年，Vol 345 No 5，1229-1241

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１個の多量体化ドメインと、ＳｌｙＤ又はＳｌｐＡの少なくとも１分子とを含む数分子のフォールディングヘルパーポリペプチドを含有する融合ポリペプチドであって、前記多量体化ドメインがＳｋｐであり、更なる標的ポリペプチド抗原配列が前記融合ポリペプチドの配列の一部に含まれない、前記融合ポリペプチド。

【請求項2】

１分子のＳｋｐが、２個の隣接するＳｌｙＤ又はＳｌｐＡ分子と融合している、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項3】

配列番号１（Ｓｋｐ−タンデム−ＳｌｙＤ）を含む融合ポリペプチド。

【請求項4】

配列番号９（Ｓｋｐ−タンデム−ＳｌｐＡ）を含む融合ポリペプチド。

【請求項5】

干渉を低減し、又は偽陽性の結果を最小にするための、イムノアッセイにおける、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの使用。

【請求項6】

アッセイ試薬のタンパク性成分の溶解度を上昇させるための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドの使用。

【請求項7】

請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを含む、イムノアッセイにより分離試料中の検体を検出するための試薬キット。

【請求項8】

干渉を低減し、又は偽陽性の結果を最小にするための試薬として、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを使用する、分離試料中の検体を検出する方法。

【請求項9】

下記工程を含む、分離試料中の検体を検出する方法；
ａ）体液試料を、前記試料中に存在する前記検体と特異的に結合し得る、特異的結合パートナーと混合することにより免疫反応混合物を生成する工程、
ｂ）前記特異的結合パートナーを前記試料に加える前、同時又は後のいずれかに、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを前記免疫反応混合物に加える工程、
ｃ）前記体液試料中に存在する検体が、前記特異的結合パートナーと免疫反応し、免疫反応生成物が形成されるのに十分な時間、前記免疫反応混合物を維持する工程、及び、
ｄ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在及び／又は濃度を検出する工程。

【請求項10】

分離試料中に存在する検体が抗体である、請求項８又は９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１個の多量体化ドメイン、特にＳｋｐと、ＳｌｙＤ又はＳｌｐＡの少なくとも１分子を含む数分子のフォールディングヘルパー（folding helper）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、更なる標的ポリペプチド配列が前記融合ポリペプチドと融合しない融合ポリペプチドに関する。更に、本発明は、干渉を低減し、又は偽陽性の結果を最小にし、又はタンパク性のアッセイ試薬を安定化するためのイムノアッセイ、並びにイムノアッセイにおける前記融合ポリペプチドの使用に関する。更に、本発明は、前記融合ポリペプチドを含むイムノアッセイに使用するための試薬キットに関する。

【背景技術】

【0002】

古典的なフォールディングヘルパーとして知られているシャペロンは、他のタンパク質をフォールディングし、構造的完全性の維持を補助するタンパク質である。シャペロンは、タンパク質の変性表面又は疎水性表面に結合し、タンパク質を再生し、溶液中に保つように補助する。シャペロンは、その優れた物理化学的性質のため、タンパク質工学において、フォールディング助剤及び融合パートナーとして用いられる。１種のシャペロンは、免疫抑制剤ＦＫ５０６と結合するタンパク質である、ＦＫＢＰシャペロンの系である。

【0003】

高難度蛋白質（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のための融合パートナーとしてのＳｌｙＤ、ＦｋｐＡ及びＳｌｐＡ（＝ＳｌｙＤ−様プロテインＡ）などのＦＫＢＰシャペロンの使用は、広範囲にわたって開示されている（国際公開第２００３／０００８７８号、国際公開第２００９／０７４３１８号、欧州特許第２１２７６７９号明細書）。

【0004】

病原体、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対する抗体の検出のための市販のイムノアッセイキットは、シャペロンが特定の標的抗原配列と融合したポリペプチド融合タンパク質を含有している。このような融合タンパク質は、例えば、Scholzら, J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1242、Scholzら, Biochemistry (2006) 45, 20-33、又はScholzら, Biochemistry (2008) 47, 4276-4287に開示されている。

【0005】

ＳｌｙＤ、ＦｋｐＡ及びＳｌｐＡは、極めて優れた溶解（すなわち、シャペロン）特性を有しており、化学的又は熱的に誘発されたアンフォールディング後に可逆的に再フォールディングし得ることで特徴づけられる。高難度の標的ポリペプチドの融合パートナーとして、それらは少なくとも３つの役割を果たしている。第一に、それらは、原核生物において異種的に過剰発現する標的タンパク質の産生を増大し、第二に、それらは、標的ポリペプチドのインビトロでの再フォールディングを容易にし、かつ促進し、第三に、それらはそれぞれの標的ポリペプチドの全体的な溶解性及び安定性を上昇させる。

【0006】

しかし、ＳｌｙＤ、ＦｋｐＡ及びＳｌｐＡなどのシャペロンは、それ自体が免疫原である。それらは細菌タンパク質に富むので、ヒト（又は一般的に言えば、哺乳動物）の免疫系により非自己と認識され、親和性の高い特定の抗体の産生をもたらす強力な液性免疫応答を引き起こす。したがって、かなりの割合の成人の血清は、前記シャペロンに対するかなりの力価の免疫グロブリンを含んでいる。結果として、ヒト血清試料は、イムノアッセイ、特に細菌のシャペロンモジュールと融合する抗原特定因子（ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｅｒｓ）を用いる二重抗原サンドイッチ形式のイムノアッセイにおいて偽陽性の結果になるというかなりの可能性がある。

【0007】

抗体が誘発する融合パートナーの架橋による、このように好ましくない交差反応を防ぐため、イムノアッセイは、通常は非対称的な形状に設計されている。これは、例えば、周知の二重抗原サンドイッチ形式（ＤＡＧＳ）で設計された抗体の検出のためのイムノアッセイにおいては、当業者は、非特異的架橋を防止するために、アッセイの両側に適用される抗原に対して異なる形式のパートナーを用いていることを意味する。固相及び検出側の抗原に対して同一の形式のパートナーを用いると、試料中の妨害化合物が前記同一形式のパートナー間に架橋を形成し、その結果、（偽）陽性反応を引き起こす可能性がある。

【0008】

抗原−融合タンパク質の一部である、融合パートナーとの好ましくない結合を防止するための更なる手段として、通常、使用する融合モジュール（すなわち、特異抗原をなんら有しない融合部分）の化学的重合型がアッセイに大過剰に加えられる。高いエピトープ密度及びその高い有効濃度のため、好ましくは、前記融合モジュールに対するＩｇＧ及びＩｇＭを誘因し、結合し、クエンチングする。化学的に重合した融合モジュールは、ベイト（釣り餌、ｂａｉｔ）として機能し、融合モジュールは、干渉を抑制し、除外し得るように、試料中の干渉化合物を非常に効率的にクエンチングする。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＳｌｙＤを二重抗原サンドイッチ型のイムノアッセイにおける所与の抗原に対する融合パートナーとして用いる場合、化学的に重合された（例えば、グルタルアルデヒドとの架橋により）大腸菌ＳｌｙＤを生成し、抗−干渉物質としてこのポリマーをアッセイに加えるのに非常に適している。

【0009】

しかし、化学的に重合するタンパク質の使用により、それ自体の化学製造工程にはかなりの不利益がある。適用する架橋剤によっては、化学的重合工程は完全に再現できない。化学的に架橋したポリマーは、通常種々のポリマーサイズの広範囲な分布を示し、すなわち、連続性について大きく変化し、かなりの異質性により特徴づけられる。効果的なポリマー画分（すなわち、所望の抗干渉能力を有するポリマー画分）を選択するため、時間を浪費し、面倒なクロマトグラフ法によりポリマープールを精製及び分画する必要がある。更に、わずかな割合の生成物のみが所望の画分に溶出されるので、収量も限られている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

イムノアッセイにおいて、十分に特徴付けられていない化学的に重合した物質を使用することの障害を克服するため、本発明者らは抗干渉物質を生成する代替方法を探索した。本発明者らは、簡易かつ便利な方法で、十分に高く、十分に特徴付けられたエピトープ密度を有する抗干渉モジュールを得ようと努力した。したがって、完全な組み換え型形式で十分に特徴付けられ、溶解度が高くかつ効率のよい抗干渉物質を生成することが可能かどうかの問題に取り組んだ。手短に言えば、解決すべき課題は、再現可能かつ標準化可能な方法で、高いエピトープ密度を有するシャペロン融合パートナーを溶液形状で得ることである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

前記課題は、請求項により特徴付けられる本発明により解決される。具体的には、本発明は、１個の多量体化ドメインと、ＳｌｙＤ又はＳｌｐＡの少なくとも１分子とを含む数分子のフォールディングヘルパーポリペプチドを含有する融合ポリペプチドであって、更なる標的ポリペプチド配列が前記融合ポリペプチドと融合しない融合ポリペプチドに関する。好ましい多量体化ドメインとしてＳｋｐが用いられる。好ましくは、１分子のＳｋｐは、２個の隣接するＳｌｙＤ分子、又は２個の隣接するＳｌｐＡ分子と融合する。他の好ましい態様においては、１分子のＳｋｐは、２個の隣接するＳｌｙＤ分子、又は２個の隣接するＳｌｐＡ分子、又は融合パートナーとして機能する他の単量体シャペロンとＮ−末端で融合する。「Ｎ−末端で融合する」という用語は、Ｓｋｐが他のタンパク質分子のＮ−末端、本事例ではＳｌｙＤ又はＳｌｐＡのいずれかのＮ−末端に融合することを意味する。更に好ましい様式においては、本発明の融合ポリペプチドは、Ｓｋｐ−タンデム−ＳｌｙＤ又はＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤと命名することもできる配列番号１を含む。好ましい融合ポリペプチドは、配列番号１からなるポリペプチド（Ｓｋｐ−タンデム−ＳｌｙＤ）である。更に好ましい融合ポリペプチドは、Ｓｋｐ−タンデム−ＳｌｐＡ又はＳｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡと命名することもできる配列番号９を含むポリペプチドである。特に好ましくは、配列番号９からなるポリペプチドである。

【0012】

本発明の他の態様は、融合ポリペプチドが、干渉を低減し、又は偽陽性の結果を最小にするために使用することができるような、イムノアッセイにおける添加剤、又はアッセイ試薬への添加剤としての融合ポリペプチドの使用である。本発明によれば、前記融合ポリペプチドは、検定試薬内のタンパク性成分の溶解度を上昇させるためにも用いることができる。本発明の更に好ましい態様は、前記融合ポリペプチドを含むイムノアッセイにより、分離試料中の検体の検出のための試薬キットをも包含する。

【0013】

更に好ましい態様においては、前記で特徴付けられた融合ポリペプチドが、干渉を低減し、又は偽陽性の結果を最小にするための試薬として用いられる、分離試料中の検体を検出する方法が包含される。

【0014】

本発明の他の態様は、下記工程を含む、分離試料中の検体、例えば抗体を検出する方法である。
ａ）体液試料を、前記試料中に存在する前記検体と特異的に結合し得る、特異的結合パートナーと混合することにより免疫反応混合物を生成する工程、
ｂ）前記特異的結合パートナーを前記試料に加える前、同時又は後のいずれかに、本発明の融合ポリペプチドを前記免疫反応混合物に加える工程、
ｃ）前記体液試料中に存在する検体が、前記特異的結合パートナーと免疫反応し、免疫反応生成物が形成されるのに十分な時間、前記免疫反応混合物を維持する工程、及び、
ｄ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在及び／又は濃度を検出する工程。

【0015】

本発明の更なる側面は、イムノアッセイ法により分離試料中の検体を検出するため、特に抗体を検出するための試薬キットであって、本発明の融合ポリペプチドを含む試薬キットである。試薬キットの他の成分は当業者に公知であり、例えば、抗原等の特異的結合試薬が挙げられる。更なるキット構成要素は、緩衝液、防腐剤、標識物質及び使用説明書である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

図１〜７は、表１ａ〜ｃ、２ａ〜ｃ及び３を示し（実施例３参照）、ＨＩＶ抗−ｇｐ４１抗体の検出のためのイムノアッセイにおける融合ポリペプチドの抗干渉活性の結果を示す。詳細には、

【図1】図１は表１ａを示す。

【図2】図２は表１ｂを示す。

【図3】図３は表１ｃを示す。

【図4】図４は表２ａを示す。

【図5】図５は表２ｂを示す。

【図6】図６は表２ｃを示す。

【図7】図７は表３を示す。

【図8】図８は、２８０ｎｍの検出波長で近紫外線領域で観察した、熱的に誘発されるＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤのアンフォールディング及び再フォールディングを示す。

【図9】図９は、２５０〜３３０ｎｍの範囲のＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの近紫外線ＣＤスペクトルを示す（実施例５参照）。

【図10】図１０は表４を示し、抗−ＨＳＶ２抗体の検出のためのイムノアッセイにおける融合ポリペプチドの抗干渉活性の結果を示す（実施例４参照）。

【図11】図１１は、２５０〜３３０ｎｍの範囲のＳｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡの近紫外線ＣＤスペクトルを示す（実施例５参照）。

【発明を実施するための形態】

【0017】

配列番号１は、Ｓｋｐ−タンデム−ＳｌｙＤ又はＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤのアミノ酸配列を示す。Ｓｋｐ及びＳｌｙＤ単位間のグリシンリッチスペーサー領域（下線部）は、融合パートナーの柔軟性を最大にし得、Ｓｋｐ単位が、Ｃ−末端で融合したＳｌｙＤタンパク質の干渉なしで規則正しく配列した三量体を形成し得ることを確認するために加えられた。追加のＣ−末端のオクタヒスチジンタグは、精製の目的で加えられた（実験の項を参照）。配列番号１は、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のＳｌｙＤのアミノ酸残基１〜１６５（配列番号３の完全な分子）をタンデム型で、すなわち、１列に並んだ２個の大腸菌ＳｌｙＤ（１〜１６５）単位を含む。
ADKIAIVNMG SLFQQVAQKT GVSNTLENEF RGRASELQRM ETDLQAKMKK LQSMKAGSDR TKLEKDVMAQ RQTFAQKAQA FEQDRARRSN EERGKLVTRI QTAVKSVANS QDIDLVVDAN AVAYNSSDVK DITADVLKQV KGGGSGGGSG GGSGGGSGGG SGGGMKVAKD LVVSLAYQVR TEDGVLVDES PVSAPLDYLH GHGSLISGLE TALEGHEVGD KFDVAVGAND AYGQYDENLV QRVPKDVFMG VDELQVGMRF LAETDQGPVP VEITAVEDDH VVVDGNHMLA GQNLKFNVEV VAIREATEEE LAHGHVHGAH DHHHDHDHDG GGSGGGSGGG SGGGSGGGSG GGMKVAKDLV VSLAYQVRTE DGVLVDESPV SAPLDYLHGH GSLISGLETA LEGHEVGDKF DVAVGANDAY GQYDENLVQR VPKDVFMGVD ELQVGMRFLA ETDQGPVPVE ITAVEDDHVV VDGNHMLAGQ NLKFNVEVVA IREATEEELA HGHVHGAHDH HHDHDHDGGG SHHHHHHHH
配列番号２は、スイスプロット受入番号Ｐ１１４５７による大腸菌Ｓｋｐ（１６１アミノ酸）の完全なアミノ酸配列を示す。本発明の融合ポリペプチドについて、標的分子が産生され、過剰産生された原核生物宿主の細胞質ゾルに維持されていることを確認するために、大腸菌Ｓｋｐのシグナル配列（アミノ酸１〜２０）を除去する。好ましくは、大腸菌Ｓｋｐの成熟形態、すなわち下記に示す配列のアミノ酸２１〜１６１が使用される。
MKKWLLAAGL GLALATSAQA ADKIAIVNMG SLFQQVAQKT GVSNTLENEF KGRASELQRM ETDLQAKMKK LQSMKAGSDR TKLEKDVMAQ RQTFAQKAQA FEQDRARRSN EERGKLVTRI QTAVKSVANS QDIDLVVDAN AVAYNSSDVK DITADVLKQV K
配列番号３は、スイスプロットデータベースにおいて、ＩＤ Ｐ０Ａ９Ｋ９により入手することもできる、完全な大腸菌ＳｌｙＤアミノ酸配列（１９６アミノ酸残基）を示す。本発明の融合ポリペプチドについて、好ましくは下記に示す配列の大腸菌ＳｌｙＤスパンニングアミノ酸残基１〜１６５のＣ−末端が欠失した変型が使用される。
MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDDHVVVD GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGCCGG HGHDHGHEHG GEGCCGGKGN GGCGCH
配列番号４は、いくつかのシャペロン部分間の、柔軟性を有し、可溶性であり、かつプロテアーゼ耐性のスペーサー又はリンカーとして使用することのできる、グリシンリッチスペーサー（セリンにより分離された三連のグリシン単位を含む）のアミノ酸配列を示す。
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGG
配列番号５は、Ｎｉ−ＴＮＡ補助タンパク質精製を可能にするタンパク質のＣ−末端に加えることのできる、オクタヒスチジンタグ又は「Ｈｉｓ−タグ」（８個のヒスチジン単位を含む）のアミノ酸配列を示す。
GGGSHHHHHH HH
配列番号６は、スイスプロットデータベース受入番号Ｐ４５５２３によっても入手可能なＦｋｐＡの完全アミノ酸配列（２７０アミノ酸）を示す。本発明の融合ポリペプチドについては、標的分子が産生され、過剰産生された原核生物宿主の細胞質ゾルに維持されていることを確認するために、大腸菌ＦｋｐＡのシグナル配列（アミノ酸１〜２５）を除去する。好ましくは、大腸菌ＦｋｐＡの成熟型、すなわち下記配列のアミノ酸２６〜２７０が使用される。
MKSLFKVTLL ATTMAVALHA PITFAAEAAK PATAADSKAA FKNDDQKSAY ALGASLGRYM
ENSLKEQEKL GIKLDKDQLI AGVQDAFADK SKLSDQEIEQ TLQAFEARVK SSAQAKMEKD
AADNEAKGKE YREKFAKEKG VKTSSTGLVY QVVEAGKGEA PKDSDTVVVN YKGTLIDGKE
FDNSYTRGEP LSFRLDGVIP GWTEGLKNIK KGGKIKLVIP PELAYGKAGV PGIPPNSTLV
FDVELLDVKP APKADAKPEA DAKAADSAKK
配列番号７は、スイスプロットデータベース受入番号Ｐ０ＡＥＭ０から入手した、大腸菌ＳｌｐＡの完全なアミノ酸配列（１４９アミノ酸）を示す。
MSESVQSNSA VLVHFTLKLD DGTTAESTRN NGKPALFRLG DASLSEGLEQ HLLGLKVGDK
TTFSLEPDAA FGVPSPDLIQ YFSRREFMDA GEPEIGAIML FTAMDGSEMP GVIREINGDS
ITVDFNHPLA GQTVHFDIEV LEIDPALEA
配列番号８は、スイスプロットＩＤ：Ｑ９ＣＫＰ２のパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）ＳｌｙＤ（全長）のアミノ酸配列を示す。
MKIAKNVVVS IAYQVRTEDG VLVDEAPVNQ PLEYLQGHNN LVIGLENALE GKAVGDKFEV
RVKPEEAYGE YNENMVQRVP KDVFQGVDEL VVGMRFIADT DIGPLPVVIT EVAENDVVVD
GNHMLAGQEL LFSVEVVATR EATLEEIAHG HIHQEGGCCG GHHHDSDEEG HGCGCGSHHH
HEHEHHAHDG CCGNGGCKH
配列番号９は、Ｓｋｐ−タンデム−ＳｌｐＡ又はＳｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡのアミノ酸配列を示す。Ｓｋｐ及びＳｌｐＡ単位間のグリシンリッチスペーサー領域（下線部）は、融合パートナーの柔軟性を最大にし得、Ｓｋｐ単位がＣ−末端で融合したＳｌｐＡタンパク質の干渉なしで規則正しく配列した三量体を形成し得ることを確認するために加えられた。追加されたＣ−末端のヘキサヒスチジンタグは、精製の目的で加えられた。配列番号９は、大腸菌ＳｌｐＡのアミノ酸残基２〜１４８（完全な分子であるが、Ｎ−末端メチオニン及びＣ−末端アラニンを欠失する、配列番号７を参照）をタンデム型、すなわち１列に並んだ２個の大腸菌ＳｌｐＡ（２〜１４８）単位を含む。
ADKIAIVNMG SLFQQVAQKT GVSNTLENEF RGRASELQRM ETDLQAKMKK LQSMKAGSDR TKLEKDVMAQ RQTFAQKAQA FEQDRARRSN EERGKLVTRI QTAVKSVANS QDIDLVVDAN AVAYNSSDVK DITADVLKQV KGGGSGGGSG GGSGGGSGGG SGGGSESVQS NSAVLVHFTL KLDDGTTAES TRNNGKPALF RLGDASLSEG LEQHLLGLKV GDKTTFSLEP DAAFGVPSPD LIQYFSRREF MDAGEPEIGA IMLFTAMDGS EMPGVIREIN GDSITVDFNH PLAGQTVHFD IEVLEIDPAL EGGGSGGGSG GGSGGGSGGG SGGGSESVQS NSAVLVHFTL KLDDGTTAES TRNNGKPALF RLGDASLSEG LEQHLLGLKV GDKTTFSLEP DAAFGVPSPD LIQYFSRREF MDAGEPEIGA IMLFTAMDGS EMPGVIREIN GDSITVDFNH PLAGQTVHFD IEVLEIDPAL EHHHHHH
ＳｌｙＤ融合モジュールを含む希少試薬を用いる市販のイムノアッセイにおいては、タンデムＳｌｙＤ（グルタルジアルデヒドにより重合した、短いペプチド配列を介して連結した２分子のＳｌｙＤ）等の通常化学的に架橋したシャペロン分子が、干渉を低減するために加えられる。背景技術の項で言及したように、製造工程のために、これらの化学的に架橋した添加剤は多少不均一であり、十分な収量で厳密に再現可能な方法で供給することができない。

【0018】

シャペロンが特定の標的抗原配列と融合しているポリペプチド融合タンパク質の使用は、既に極めて詳細に開示されている（本発明の背景を参照）が、先行技術は、イムノアッセイにおける干渉をどのように克服するかを開示していない。国際公開第２００３／０００８７８号には、オリゴマーの形態でその機能を発揮する、標的ポリペプチド配列と融合し得るシャペロンとしてＦｋｐＡが開示されている。欧州特許第１９８２９９３号明細書には、少なくとも１個の多量体化ドメイン及び病原体由来のエピトープ部分の複数のコピーを含む融合ポリペプチドが開示されている。これらのポリペプチドは、特定の抗原標的配列として利用される。しかし、シャペロンモジュールと結合し、その結果偽陽性の結果を引き起こすという交差反応抗体による干渉を除去するという課題は今まで放置されていた。

【0019】

意外にも、シャペロン多量体化ドメインを、ＳｌｙＤ又はＳｌｐＡの少なくとも１つの分子と融合することにより、本発明者らは、非常に効率的な干渉防止剤を得ることができた。その上、特定の血清では、化学的に架橋された先行技術の試薬により、陽性の結果を示唆するかなりのバックグラウンド信号を最小にすることや、効率的に抑制することはできないが、本発明の融合ポリペプチドでは、干渉を低減することで高いバックグラウンド信号を抑制することができる。試料に干渉防止剤を加えた場合、真陽性の試料は全く影響を受けない。すなわち、抗−ＨＩＶ抗体を含む陽性試料は常に陽性試料と判定される。

【0020】

意外にも、シャペロン多量体化ドメインを、ＳｌｙＤ又はＳｌｐＡの少なくとも１分子と融合することにより、本発明者らは、十分にフォールディングされ、非常に溶解度の高い、規則的な三量体を形成する人工のキメラタンパク質を製造することができた。柔軟なリンカー部分を介した２個のシャペロンの融合により、大部分の成分がその本来の性質を維持している、可溶性かつ機能的タンパク質が得られることは、自明にはほど遠い。Ｓｋｐ、ＳｌｙＤ及びＳｌｐＡ等のシャペロンは、疎水性タンパク質の表面を認識し、可逆的に結合するように変化したポリペプチド結合部位を有しているので、またこれらのポリペプチド結合部位は、それ自体もともと疎水性であるので、これは２個のシャペロンのポリペプチド結合部位はお互いに結合して飽和状態になり、エピトープ提示の目的のために価値が限定された固定複合体でありうる。また、２個の（立体的にかさ高い）ＳｌｙＤ単位のＳｋｐのＣ−末端への融合は、Ｓｋｐの構造的完全性を損ない、場合によりＳｋｐの本質的な三量体化を破壊すると考えられる。

【0021】

しかし、本発明者らが発見したものは、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ及びＳｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡが、実際に非常に安定で可溶性であり、たとえオリゴマーであっても主に可逆的なフォールディング作用を示す規則正しい三量体を形成することである。それぞれＳｋｐとＳｌｙＤ又はＳｌｐＡの共有結合性連結により近接近する疎水性ポリペプチド結合領域の高い有効濃度のために、人工的な融合ポリペプチド（すなわち、２個の無関係のシャペロンの組み合わせ）の溶解度は低いと考えられる。意外なことに、その逆が真実である。Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤは優れた溶解度を有し、なんら凝集する傾向もなく、１００ｍｇ／ｍＬ超（５０ｍＭリン酸カリウム ｐＨ７．０、２５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）に濃縮することができる。このように濃度の高い溶液由来のＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤをＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムによるゲルろ過分析に供すると、融合ポリペプチドは、完全に溶解し安定な三量体を示す単一の対称なピークに溶出する。

【0022】

Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤは溶解度が高いだけでなく、その再フォールディング作用は可逆的である。これは、本発明者らがマトリクス結合再フォールディングの工程を含む精製手順を構成し得るという事実により強調される。標的分子は、アンフォールディング形態で、Ｃ−末端のオクタヒスチジンタグを介してＮｉ−ＮＴＡ担体に結合する。標的分子が固相担体に結合した状態で、標的分子は簡単な緩衝液の交換により再びフォールディングされる。その後、再フォールディングされたタンパク質はイミダゾールパルスにより溶出される。意外にも、イミダゾール溶出により、溶出されたＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ単量体はほとんど定量的に可溶性三量体を形成する。本発明者らはＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤのような三量体タンパク質のマトリクス結合再フォールディングは、優れた高い収量を有しながら十分に機能することに驚かされる。本発明者らは、Ｓｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡにとっても同じことが真実であることを発見した。Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤと非常に類似しているように、Ｓｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡは大腸菌過剰発現株から大量に得ることができ、Ｓｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡは、マトリクス支援再フォールディングにより、整列した三量体型で復元され得る。また、そのＳｌｙＤ対応物と全く同様に、Ｓｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡは溶解性が非常に高く、非常に有益な物理化学的性質を有する。

【0023】

本発明によれば、融合ポリペプチドが干渉の低減又はタンパク質安定化のために用いられるので、得られた融合ポリペプチド（先行技術に開示された融合ポリペプチドとは異なる）は更なる標的ポリペプチド抗原配列を含まない。これは、抗体のような検体分子と結合するための特異的な抗原性ポリペプチドとして適用されない。試料中に存在する検体、例えば、病原体に対する抗体、が本発明の融合ポリペプチドと結合しないことは重要である。したがって、ウイルス、細菌、単細胞又は他細胞寄生生物等の哺乳動物の病原体由来の抗原配列等の標的ポリペプチド配列は融合ポリペプチドの一部ではない。

【0024】

本発明の融合ポリペプチドは、高い収率で均一な画分内に再現可能な方法で得ることができる。本発明の融合ポリペプチドは、ＩｇＧ及びＩｇＭタイプの干渉因子を認識し、結合し、抑制するのに必要かつ十分な明確に定義されたエピトープ密度を有する。融合ポリペプチドは、先行技術の化学的に製造された試薬と同等なだけでなく、より優れた方法で、イムノアッセイにおける偽陽性を抑制し得る。その製造工程は規格化するのに簡単、単純かつ容易であり、必然的に極めて優れた抗干渉特性を有する十分に定義された均一な融合ポリペプチドを高収率でもたらす。

【0025】

本発明によれば、融合ポリペプチドは、好ましくは１個の多量体化ドメインを含む。多量体化ドメインは、そのまさしく多量体化ドメインを含むいくつかのタンパク質サブユニットの非共有結合をもたらし、支持するドメインである。例えば、二量体ドメインは２個のサブユニットの結合を起こすドメインであり、三量体ドメインは３個のサブユニットの非共有結合を維持するドメインであるなどである。

【0026】

融合ポリペプチドの第二の部分は、ＳｌｙＤ、好ましくは大腸菌のＳｌｙＤの少なくとも１分子であるが、他の生物由来のＳｌｙＤ分子、例えばパスツレラ・ムルトシダのＳｌｙＤ（配列番号８を参照）も使用することができる。更に好ましくは、１分子のＳｋｐが２個の隣接するＳｌｙＤ分子と融合した融合ポリペプチドである。本発明の他の態様においては、ＳｌｐＡ等の他の単量体シャペロンも、１個の多量体化ドメインと融合する融合パートナーとして好適である。

【0027】

本発明の更なる側面は、干渉を低減し、偽陽性の結果を最小にするための前記融合ポリペプチドの使用である。本発明の融合ポリペプチドは、前記特異的結合パートナーを試料に加える前、同時又は後のいずれかにイムノアッセイ混合物（試料と試料中の検体と特異的に結合する結合パートナーを含む。）に加えることができる。好ましくは、融合ポリペプチドは、検体、例えば抗体を含む体液試料を特異的結合パートナー（この場合、特異的結合パートナーは抗原である）と接触させる前に加える。

【0028】

検体を検出するためのイムノアッセイの種々の形式及び原理、並びに検出の種々の様式は広く開示されており、当業者にはよく知られている。特に興味深いのは、検体が抗体であるイムノアッセイである。好ましくは、本発明のイムノアッセイは、Ａ型、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＨＴＬＶ （ヒトＴ−細胞白血病ウイルス）、ＥＢＶ（エプスタイン−バーウイルス）、風疹ウイルス、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、又はボレリアブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）等のほ乳類のウイルス性又は細菌性病原体に対する抗体を検出する。

【0029】

本発明を実施例の項で更に詳細に説明する。

【実施例】

【0030】

実施例１：融合ポリペプチドの製造
Ｓｋｐ／ＳｌｙＤシャペロン融合ポリペプチドのクローニング及び精製
発現カセットのクローニング
適切な発現構築物を生成するために、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤをコードする発現カセットを、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に２段階クローニング法により結合した。

【0031】

大腸菌Ｓｋｐ（ＥｃＳｋｐ）の配列は、スイスプロットデータベース（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０ＡＥＵ７）から取り出した。最初の工程で、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ由来のシャイン・ダルガノ配列を含む合成遺伝子、グリシンリッチリンカー領域の一部、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（５’末端）及びＢａｍＨＩ（３’末端）の好適な認識部位を有する、成熟型Ｓｋｐシャペロンのアミノ酸２１〜１６１のコード配列（シグナルペプチドスパンニングアミノ酸残基１〜２０を含まず、ＡＴＧ開始コドン（メチオニン）がフレーム内に追加されている）を、Ｓｌｏｎｉｎｇ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。４８９塩基対の合成ＤＮＡ断片を、それぞれの制限エンドヌクレアーゼで加水分解し、Ｔ５プロモーター（Ｐ_Ｔ５）の制御下、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで開放した発現ベクターｐＱＥ８０Ｌに連結する。

【0032】

第二に、グリシンリッチリンカー領域を介して結合し、Ｎ−末端に更なるリンカー領域の部分、並びにＧＧＧＳモチーフによりＣ−末端と結合したオクタ−Ｈｉｓ−タグを含む、２個の大腸菌ＳｌｙＤ単位（ＥｃＳｌｙＤ、残基１〜１６５、スイスプロット受入番号Ｐ０Ａ９Ｋ９）を、同様にＳｌｏｎｉｎｇ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。このカセットの５’末端及び３’末端に、それぞれＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を加えた。遺伝子及び制限部位は、単純な連結により、ＥｃＳｋｐ部分の５’末端にＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤ部分のフレームでの連結を可能にするように設計された。したがって、１１４６塩基対のスパンニング断片は制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで加水分解され、ベクターｐＱＥ８０Ｌを含むＳｋｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで開放された部分に連結される。

【0033】

連結後、大腸菌、ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のコンピテント細胞を、それぞれのＤＮＡで形質転換した。適切な形質転換細胞からプラスミドを調製した後、発現構築物の正確さを配列分析により再確認した。得られた発現プラスミドをｐＱＥ８０Ｓｋｐ−ｄｉＳｌｙＤと命名した。

【0034】

下記図面は、グリシンリッチリンカー領域によって連結し、Ｃ−末端にオクタ−Ｈｉｓ−タグが続き、Ｎｉ−ＮＴＡ支援タンパク質精製を可能にする、１個の大腸菌Ｓｋｐシャペロンユニットと２個の大腸菌ＳｌｙＤシャペロンユニットを含む、完全長の融合ポリペプチドＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤのスキームを示す。

【0035】

【化1】

【0036】

Ｌ＝（ＧＧＧＳ）_５ＧＧＧ（グリシンリッチリンカー領域）、配列番号４を参照
Ｈｉｓ＝ＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ（Ｈｉｓ−タグ）、配列番号５を参照
好ましい融合ポリペプチドの完全アミノ酸配列を配列番号１に示す。

【0037】

ＳｌｙＤの反復構築物（ＳｌｙＤ、ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ、ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ…）をコードする発現カセットは、Biochemistry (2006) 45, 20-33に記載されたようにしてクローニングした。Skp-SlpA-SlpA融合ポリペプチドをコードする発現カセットは、Scholzら, J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1242に従って生成した。

【0038】

大腸菌宿主内でのＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤの組み換え発現
推測上の干渉防止ポリペプチドを十分量で得るために、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤを大腸菌内で組み換え発現させた。この目的のため、大腸菌ＢＬ２１ Ｃｏｄｏｎ^＋（Ｍｅｒｃｋ（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標），Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、生成された発現構築物ｐＱＥ８０Ｓｋｐ−ｄｉＳｌｙＤで形質転換した。

【0039】

アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を補充した５０ｍＬのＳＢ培地（トリプトン３２．０ｇ、酵母エキス２０．０ｇ、ＮａＣｌ ５．０ｇ、および１０００ｍＬの蒸留水）に、ｐＱＥ８０Ｓｋｐ−ｄｉＳｌｙＤを有する１個のコロニーを植菌し、３７℃で一晩インキュベートした（２５０ｒｐｍ）。次いで、１．５ＬのＳＢ培地（＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）に植菌し、０．５以下のＯ．Ｄ．_６００で一晩置いた。３．０以下のＯ．Ｄ．_６００で、０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を培養物に加えることにより、細胞質の過剰発現を誘導した。誘導の４時間後、遠心分離（６０００ｇで２０分）により細胞を集め、−２０℃に貯蔵した。

【0040】

誘導の前、及び４時間後に０．４Ｏ．Ｄ．_６００の一部を取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤの発現について全細胞抽出物の試験を行った。標的分子の過剰発現が非常に多いことがわかった。

【0041】

ＳｌｙＤ及びＳｌｐＡの融合タンパク質の過剰発現は、Scholzら, J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1242、及びScholzら, Biochemistry (2006) 45, 20-33に記載されたようにして実施した。

【0042】

Ｓｋｐ／ＳｌｙＤ／ＳｌｐＡポリペプチド融合物の精製
Ｓｋｐ／ＳｌｙＤポリペプチド融合物と、ＳｌｙＤ及びＳｌｐＡの融合タンパク質は、実質的に同じ手順を用いて精製した。細胞溶解について、凍結したペレットを、冷却した５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、７．０Ｍ ＧｄｍＣｌ、５ｍＭイミダゾールに再懸濁し、懸濁液を氷上で少なくとも２時間撹拌し、細胞溶解を完了させた。遠心分離及びろ過（０．４５μｍ／０．２μｍ）後、未精製の溶解物を、５．０ｍＭ ＴＣＥＰを含む溶解バッファーで平衡化したＮｉ−ＮＴＡに供した。それに続く洗浄工程は、それぞれの標的タンパク質に合わせて、５０ｍＭリン酸ナトリウム、（ｐＨ８．０）、７．０Ｍ ＧｄｍＣｌ及び５．０ｍＭ ＴＣＥＰ溶液にイミダゾールを５〜１５ｍＭの範囲で調整した。少なくとも１０〜１５倍の洗浄バッファーを使用した。次いで、ＧｄｍＣｌ溶液を５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５．０ｍＭ ＴＣＥＰと置換し、マトリクス結合タンパク質の立体配座再フォールディングを誘導した。同時精製したプロテアーゼの再活性化を防止するために、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ，Ｒｏｃｈｅ）を再フォールディング緩衝液に加えた。一晩の反応で、合計１５〜２０倍のカラム容積の再フォールディング緩衝液を使用した。次いで、３〜５倍のカラム容積の５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭイミダゾールで洗浄することにより、ＴＣＥＰ及びＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ阻害剤カクテルの両者を除去した。次いで、非特異的に結合しているタンパク質混入物を除去するために、イミダゾール濃度（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）と１００ｍＭ ＫＣＬ溶液）を、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤ融合タンパク質について６０〜７０ｍＭに、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡについて５０ｍＭに、ＳｌｙＤ融合ポリペプチドについて３０ｍＭに上昇させた。次いで、野生型のタンパク質を、同じ緩衝液中の５００ｍＭイミダゾールで溶出させた。タンパク質を含む画分は、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度について評価し、貯蔵した。最後に、タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ＨｉＬｏａｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供し、タンパク質含有画分を貯蔵し、Ａｍｉｃｏｎセル（ＹＭ１０）中で１０〜２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0043】

精製及び再フォールディング手順を連動させて実施した後、それぞれの標的タンパク質に依存し、１ｇの大腸菌湿潤細胞から、おおよそ１５〜２５ｍｇのタンパク質収量を得ることができた。

【0044】

実施例２
分光測定
タンパク質濃度の測定は、Ｕｖｉｋｏｎ ＸＬ二光線束分光光度計を用いて実施した。モル吸光係数（ε_Ｍ２８０）は、Pace (1995), Protein Sci. 4, 2411-2423に記載された手順を用いて決定した。ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤ−ＥｃＳｌｙＤについては、１３４１０Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル吸光係数（ε_Ｍ２８０）を用い、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｙＤについては、７４５０Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル吸光係数（ε_Ｍ２８０）を用いた。ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡについては、４４７０Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル吸光係数（ε_Ｍ２８０）を用いた。大腸菌の反復ＳｌｙＤ構築物、ＳｌｙＤ、ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ、ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ、ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ及びＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤについては、５９６０Ｍ^−１ｃｍ^−１、１１９２０Ｍ^−１ｃｍ^−１、１７８８０Ｍ^−１ｃｍ^−１、２３８４０ Ｍ^−１ｃｍ^−１及び２９８００Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル吸光係数を用いた。

【0045】

実施例３
ＳｌｙＤポリペプチド融合タンパク質の干渉防止活性
ＳｌｙＤポリペプチド融合タンパク質の干渉防止作用は、自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）で評価した。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅグループの登録商標である。測定は、二重抗原サンドイッチ形式で実施した。

【0046】

Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０における信号検出は、電気化学発光に基づく。ビオチン複合体（すなわち、捕獲抗原）を、ストレプトアビジンをコーティングした電磁ビーズ表面に固定するが、検出抗原は、信号伝達部分として複合ルテニウム陽イオン（レドックス状態２＋及び３＋の間を切り替える）を有している。特異的免疫グロブリン検体が存在すると、発色するルテニウム錯体が固相に架橋し、白金電極で励起後、６２０ｎｍで発光する。信号出力は、任意の光単位である。

【0047】

組み換え型干渉防止ＳｌｙＤポリペプチドは、二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）イムノアッセイ形式で評価した。この目的を達成するため、欧州特許第１４０２０１５号明細書に開示されたＦｋｐＡ−ＦｋｐＡ−ｇｐ４１及びＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ｇｐ４１を、ヒト血清中の抗ｇｐ４１抗体を特異的に検出するために、それぞれビオチン及びルテニウム複合体として用いた。ｇｐ４１はＨＩＶの免疫優勢抗原であり、欧州特許第１４０２０１５号明細書に開示された、ｇｐ４１の細胞外ドメインの可溶性変異体は、ＨＩＶ感染の検出に非常に貴重なツールである。ＦｋｐＡ−ＦｋｐＡ−ｇｐ４１−ビオチン及びＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ｇｐ４１−ルテニウムを、それぞれ７５０ｎｇ／ｍＬの濃度で、Ｒ１（試薬緩衝液１）及びＲ２（試薬緩衝液２）で使用した。

【0048】

最初の実験では、ＨＩＶ陰性のＴｒｉｎａの血清を、前記ＤＡＧＳイムノアッセイ装置で評価した。偽陽性の発生率に対する手がかりを得るため、評価は、干渉防止剤として使用されているＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）、ＧＤＡ−架橋可溶性異種ＳｌｙＤポリマーの非存在下及び存在下で実施した。ＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）を、Ｒ１（ビオチン複合体を含む試薬緩衝液１）に大過剰量（２５μｇ／ｍＬ）で加えた。次いで、６０μＬのＲ１（試薬緩衝液１、ビオチン複合体及び干渉防止ＳｌｙＤポリマー）、６０μＬのＲ２（試薬緩衝液２、ルテニウム複合体）、３０μＬの試料（ヒト血清）及び５０μＬのビーズ懸濁液を混合し、反応容量がおおよそ２００μＬになるまでインキュベートした。

【0049】

表１ａ〜ｃ（図１〜３）は、干渉防止ポリマーの非存在下では、強い信号（偽陽性）の発生率が高いことを示す。ＳｌｙＤ及びＦｋｐＡ等の２種の異なるシャペロンを、二重抗原サンドイッチ型の免疫学的測定の２つの側面で使用するにもかかわらず、本発明者らはＨＩＶ感染が明らかに除外されるヒト血清（Trina Bioreactives AG, Nanikon, Switzerland）の十分に特徴づけられたパネル中に非常に強い信号が多いことを見出した。この発見の理由はさまざまであるが、ＳｌｙＤ及びＦｋｐＡがシャペロンのＦＫＢＰファミリーに属する関連分子であり、高度に保存されたＦＫＢＰドメインを共有しているからである。おそらく、この共通のモチーフを介し、免疫学的交差反応を起こし強い信号を喚起し、その結果、ＨＩＶ検定において偽陽性の結果となる。化学的に重合した干渉防止剤、ＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）を検定混合物に加えることにより、信号の上昇を正常の陰性にまで減少させる。表１ｃ（図３）は、その非常に強い干渉、すなわち高い偽陽性を示し、これは、ＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）を加えることによって効率的に排除することができる。表１ａ〜ｃ（図１〜３）に示す結果の最終結果は以下の通りである。ＤＡＧＳイムノアッセイにおける融合パートナーによる干渉は頻繁であり、これらは、１つの融合パートナーの架橋ポリマー変異体を加えることによって効率的に軽減することができる。

【0050】

表２ａ〜ｃ（図４〜６）は、多様な組み換え型ＳｌｙＤ変異体の干渉防止能力を示す。５種のＨＩＶ陰性血清、５種の抗−ＨＩＶ陽性血清、及びＴｒｉｎａパネル（Trina Bioreactives AG, Nanikon, Switzerland）由来の２種の偽陽性血清について、上述したように、ＦｋｐＡ−ＦｋｐＡ−ｇｐ４１−ビオチン及びＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ｇｐ４１−ルテニウムを用いて評価した。検定は、多様な干渉防止剤の候補の非存在下及び存在下に実施した。試験においては、陽性の用量効果を明らかにするために、干渉防止モジュールを、５μｇ／ｍＬ及び２５μｇ／ｍＬの濃度でＲ１（試薬緩衝液１）に加えた。実験には、陽性参考試料（すなわち、十分に適切かつ強力な干渉防止モジュール）として、ＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）を加えた。干渉防止剤がないと（表２ａ、Ｖ０）、偽陽性のＴｒｉｎａの血清はほとんど６０，０００カウントまでであり、これは、ＨＩＶ感染の結果としての高い抗−ｇｐ４１抗体力価を強く示唆する。しかし、ＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）を加えることにより、偽陽性信号はＨＩＶ陰性血清のレベルにまで低下した（表２ａ、Ｖ１）。Ｓｋｐ−ＳｌｙＤを加えると、偽陽性信号も著しく低下するが、それらはまだ２５μｇ／ｍＬの存在下であっても上昇しており、これは強く判断を誤らせ、健康な個体におけるＨＩＶ感染を示唆する（表２ａ、Ｖ２）。しかし、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤを加えると、偽陽性信号は、ＨＩＶ陰性血清の信号レベルにまで低下する（表２ａ、Ｖ３）。Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤは、干渉防止能力において、化学的に重合したＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）と同様に効率的であることが判明した。明らかに、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤのエピトープ密度は、おそらくＩｇＭ型の免疫グロブリンに属する干渉因子と効率的に結合し、抑制するのに十分に高い。ＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）のような架橋ＳｌｙＤポリマーとの、組み換え技術によって製造されたＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ等のモジュールの等価性（干渉防止に関し）は、本発明者らの実験による驚異的な結果である。

【0051】

表２ｂ（図５）に２つの対照実験を示す。大腸菌ＳｌｙＤを単独で加えることにより試験を行った２つのＴｒｉｎａ干渉の偽陽性血清信号を軽減もせず、大腸菌Ｓｋｐを単独で加えることにより、誤って上昇した信号についての有益な効果を有しもしない（表２ｂ、Ｖ４及びＶ５）。２５μｇ／ｍＬという高濃度でも、１個の成分は偽陽性信号に影響を及ぼすことができない。しかし、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ融合ポリペプチド、Ｓｋｐ及びＳｌｙＤを組み合わせると、強力な干渉防止手段を構成する（表２ａ（図４）、Ｖ３）。１個の単量体大腸菌ＳｌｙＤがＴｒｉｎａ血清１６０９７４４８及び４７１０１９４３の干渉に対処できないことは、それぞれの干渉因子がＭ型の免疫グロブリン（ＩｇＭ）に属することを強く示唆している。明らかに、ＳｌｙＤの効果的な高濃度に付随する高いエピトープ密度は、干渉因子と効率的に結合し、抑制するのに必須である。

【0052】

この仮説に批判的に挑むため、本発明者らは、更に表２ｃ（図６）に示す干渉防止試験を実施した。分析手段として、本発明者らは、Biochemistry (2006) 45, 20-33に開示された標準的クローニング法により製造した大腸菌ＳｌｙＤポリマーを用いた。簡単に言うと、大腸菌ＳｌｙＤユニットを、柔軟なグリシン及びセリンリッチリンカーにより結合し、列を形成させた。１個の融合ポリペプチドにおいて、５個までのＳｌｙＤ単位が大腸菌内で十分な発現量及び簡便な精製手順に可能であった。

【0053】

表２ｃ（図６）は、効率的な干渉防止のための高いＳｌｙＤエピトープ密度の必要性を示し、これは、本発明者らが親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）の効果を活用し得るという事実を示す（親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）は、ＩｇＭ分子のような多価結合分子が重合ＳｌｙＤのような重合基質と接触した時に発生する明白な親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を意味する）。あらゆる干渉防止剤なしで、Ｔｒｉｎａの干渉血清１６０９７４４８及び４７１０１９４３の信号は、それぞれ５９８２７及び５３４９１になり、血清が抗ＨＩＶ陰性であると明白に確認されているとしても抗−ｇｐ４１抗体の存在を明らかに示す。タンデムＳｌｙＤ（ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ）を、Ｒ１（試薬緩衝液１）に２５μｇ／ｍＬの濃度で加えた場合、信号は事実上影響を受けないままである（表２ｃ、Ｖ８）。三量体ＳｌｙＤ （ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ）を、Ｒ１に２５μｇ／ｍＬの濃度で加えた場合、信号は約４０００カウントにまで減少する（表２ｃ、Ｖ７）。減少は大きいが、残っている信号により、陽性を疑わせる結果となる。しかし、ペンタ−ＳｌｙＤ（ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ）を、Ｒ１にわずか５μｇ／ｍＬの濃度で加えた場合、信号は、同じ濃度で化学的に重合されたＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）を加えることにより達成されるものに匹敵する（表２ａ、Ｖ１、表２ｃ、Ｖ６）。言い換えると、ＳｌｙＤの干渉防止能力は、それぞれの構築物を構成するＳｌｙＤ単位の数によって上昇する。干渉防止能力の上昇は直線的でなく、これは、本発明者らが相加効果よりも共同的効果に直面していることを示している。

【0054】

手短に言えば、表２（図４〜６）は、干渉防止の可能性が、相互に連結したＳｌｙＤ単位の数と共に著しく上昇することを示している。これは、接近している少なくとも５個のＳｌｙＤ単位が、効率的な干渉防止に必要かつ十分であることを示唆している。したがって、五量体ＳｌｙＤ（ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ）は前途有望な干渉防止剤であるが、大腸菌宿主内での発現収率は予想以上に低く、生産規模の拡大の厳しい障害となる。Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤは、その干渉防止の可能性に関してＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）と同等である。したがって、三量体ＳｋｐをタンデムＳｌｙＤ（ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ）に融合することにより生成されるエピトープ密度は、明らかに効率的な干渉防止のための要件に十分に適合している。組み換え技術によって製造されたＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤモジュールの有効性は非常に良好で、その製造工程ははるかに再生可能で便利であるので、これはいっそう優れているものである。

【0055】

表３（図７）は、あるケースにおいて、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの干渉防止能力がＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）よりも非常に優れていることを示す。また、５種の陰性血清、５種の抗−ＨＩＶ陽性血清、及び信号を著しく上昇させる３種の干渉血清を、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１２自動分析装置で評価した。干渉防止剤なしでは、３種の干渉血清の信号は１０３５１、１４３７及び７７８カウントに達した。架橋ＳｌｙＤポリマーＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）を、Ｒ１に２０μｇ／ｍＬの濃度で加えると、信号は、８０４２、９０３及び７７２カウントと、わずかに低下した（表３、Ｖ１）。しかし、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤをＲ１に５μｇ／ｍＬ又は１５μｇ／ｍＬの濃度で加えると、信号は陰性血清のレベルへと、わずかに低下した。より正確には、信号は５６６、５３７及び５０７カウントに低下した。Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤを加えることにより、陰性血清の信号に明らかな平滑化作用があり、それが変動係数をわずかに改善していることは注目に値する。この効果は、ＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）を用いるよりも、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤを用いることによって、より顕著である。要約すれば、表３は、あるケースにおいては、干渉防止能力において、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤがＳＳ−Ｈｅｌｉｘ（ＧＤＡ，Ｐ）よりも優れていることを強調している。干渉血清Ｃ１３３２０２の場合、この血清は信号を偽陽性から真陰性まで低下させる。血清Ｐｒ１４９又はＣ１３３１１１に例示するように、わずかに上昇する信号でさえ、分析装置の空試験値に密接に接近する信号レベルまでかなり減少する。その上、本発明者らは、信号の全体的な減少と変動係数の改善をもたらす抗−ＨＩＶ陰性血清の信号に基づくＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの平滑化作用を見出した。

【0056】

実施例４
ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡポリペプチド融合タンパク質の干渉防止活性
ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡの干渉防止活性を、自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）で評価した。Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅグループの登録商標である。測定は、二重抗原サンドイッチ形式で実施した。

【0057】

Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）２０１０における信号検出は、電気化学発光に基づく（詳細な説明については実施例３を参照）。
組み換え型ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡポリペプチドは、二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）イムノアッセイ形式で評価した。この目的を達成するため、欧州特許第２１２７６７８号明細書に開示されたＰｍＳｌｙＤ−ｍｇＧ２及びＥｃＳｌｐＡ−ｍｇＧ２を、ヒト血清中の抗ＨＳＶ−２抗体を特異的に検出するために、それぞれビオチン及びルテニウム複合体として用いた。成熟型糖タンパク質Ｇ２（ｍｇＧ２）は、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の免疫優勢抗原であり、欧州特許第２１２７６７８号明細書に開示され、ＨＳＶ−２感染を検出するのに非常に貴重なツールである。ＰｍＳｌｙＤ−ｍｇＧ２−ビオチン及びＥｃＳｌｐＡ−ｍｇＧ２−ルテニウム複合体を、Ｒ１（試薬緩衝液１）及びＲ２（試薬緩衝液２）中でそれぞれ３００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。

【0058】

抗−ＨＳＶ−２陰性血清、抗−ＨＳＶ−２陽性血清及び抗−ＨＳＶ−２偽陽性血清（すなわち、干渉血清）を、前記ＤＡＧＳ免疫検定装置で評価した。抗−ＨＳＶ−２イムノアッセイにおいて干渉防止剤として使用される、ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ（ＧＤＡ，Ｐ）、可溶性異種ＧＤＡ−架橋ＥｃＳｌｐＡポリマーの非存在及び存在下で評価を実施した。ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ（ＧＤＡ，Ｐ）は、干渉防止の基準としての役割を果たしており、ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡポリペプチドの化学的架橋により生成され、ＥｃＳｌｐＡ融合抗原をベースとするイムノアッセイの特異性を改善するのに十分に適合する、従来の干渉防止剤を構成している。精密な調査の下、過剰量（それぞれ１０μｇ／ｍＬ）の干渉防止剤を、Ｒ１（ビオチン複合体を含む試薬緩衝液１）及びＲ２（ルテニウム複合体を含む試薬緩衝液２）の両方に加えた。次いで、７０μＬのＲ１（ビオチン複合体及び干渉防止剤ＥｃＳｌｐＡポリマーを含む試薬緩衝液１）、７０μＬのＲ２（ルテニウム複合体及び干渉防止剤ＥｃＳｌｐＡポリマーを含む試薬緩衝液２）、２０μＬの試料（ヒト血清）及び４０μＬのビーズ懸濁液を混合し、反応容量がおおよそ２００μＬになるまでインキュベートした。

【0059】

ＰｍＳｌｙＤ（すなわち、パスツレラ・ムルトシダ由来のＳｌｙＤ）及びＥｃＳｌｐＡ（すなわち、大腸菌由来のＳｌｐＡ）の２種の異なるシャペロンを、二重抗原サンドイッチ型の免疫学的測定の２つの側面で使用するにもかかわらず、信号の著しい上昇は、ＨＳＶ−２感染が明らかに除外されるヒト血清のパネル中で、むしろ頻繁に起こる。この発見の理由は、異なる生物由来であるが、融合パートナーＰｍＳｌｙＤ及びＥｃＳｌｐＡがシャペロンのＦＫＢＰファミリーに属する関連分子であり、高度に保存されたＦＫＢＰドメインを共有しているからである。おそらく、この共通のモチーフを介して免疫学的交差反応を起こして強い信号を喚起しその結果、抗−ＨＳＶ−２検定において陽性の結果となる。化学的に重合した干渉防止剤、ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ（ＧＤＡ，Ｐ）を検定混合物に加えることにより、信号の上昇を正常の陰性にまで減少させる。表４（図１０）は、その非常に強い干渉、すなわち高い偽陽性を示し（例えば、試料０１２について）、これは、干渉防止剤ポリマーＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ（ＧＤＡ，Ｐ）を加えることによって効率的に排除することができる。表４（図１０）に示すように、ＤＡＧＳイムノアッセイにおける融合パートナーによる干渉は頻繁であり、これらは、少なくとも１つの融合パートナーの架橋ポリマー変異体を加えることによって効率的に軽減することができる。

【0060】

ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡを検定に加えると、同様に、偽陽性信号がＨＳＶ−２陰性の信号レベルにまで低下することを本発明者らは見出している。実際に、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡは、干渉防止能力において、化学的に重合したＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ（ＧＤＡ，Ｐ）と少なくとも同じくらい効率的であることが判明している。明らかに、Ｓｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡのエピトープ密度は、おそらくＩｇＭ型の免疫グロブリンに属する干渉因子と効率的に結合し、抑制するのに十分に高い。この干渉血清は、単量体干渉防止剤の添加に反応しないという特徴を有する（表４／図１０、試料０１０及び０１３を参照）。真の陽性信号は、融合ポリペプチドＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ、及び化学的に重合したＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ（ＧＤＡ，Ｐ）のいずれによっても影響を受けない。ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ（ＧＤＡ，Ｐ）のような架橋ＥｃＳｌｐＡポリマーとの、組み換え技術によって製造されたＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ等のモジュールの等価性（干渉防止に関し）は、本発明者らの実験による驚異的な結果である。表４（図１０）においては、２つの更なる対照を示す。すなわち、干渉防止能力を評価するために、ＥｃＳｋｐ及びＥｃＳｌｐＡ（すなわち、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ融合ポリペプチドの成分）を単一のシャペロンとしてイムノアッセイに加えた。結果は非常に明確である。ＥｃＳｋｐ単独では、干渉血清の偽陽性信号に全く影響しない。しかし、ＥｃＳｌｐＡ単独では、４つのケースのうちの少なくとも２つで、有利な影響が得られたように思われる。干渉試料０１１及び０１２については、単量体ＥｃＳｌｐＡを大過剰に加えると、それぞれ、信号が８２０４から９６９カウントに、４２１６８から１４８０１に低下する。一部のケースでは、単量体ＥｃＳｌｐＡを加えることにより、検定の特異性を向上させるのに役立つと結論づけることができる。しかし、一見したところ、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡとの比較により、融合ペプチドがその干渉防止の可能性に関して非常に優れていることが明らかになる。干渉血清０１０〜０１３について表４に示すように、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡを加えることにより、偽陽性は真陰性にまで明らかに低下する。組み換え技術によって誘導されたＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ融合タンパク質であっても、干渉防止活性に関し、標準の干渉防止剤ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡ（ＧＤＡ，Ｐ）よりも優れていることは注目に値する（表４、試料０１０、０１１及び０１３を参照）。その取り扱い及び製造の容易さと一緒になり、ＥｃＳｋｐ−ＥｃＳｌｐＡ−ＥｃＳｌｐＡの干渉防止の機能は優れており、この分子はイムノアッセイにおける非常に魅力的な添加剤となる。

【0061】

実施例５
円偏光二色性分光法により検出される熱的に誘導されるＳｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの展開
近紫外二色性（ＵＶ ＣＤ）スペクトルは、温度自動調節セルホルダーを用い、Ｊａｓｃｏ−７２０分光偏光計により測定し、平均残余楕円率に変換した。緩衝液は、５０ｍＭリン酸カリウム、２５０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）であった。経路の長さは０．２ｃｍであり、タンパク質濃度は８．２ｍｇ／ｍＬであった（１４７μＭの単量体は４９μＭの三量体に相当する）。範囲は２５０〜３３０ｎｍであり、バンド幅は１．０ｎｍであり、走査速度は２０ｎｍ／分であり、解像度は０．５ｎｍであり、反応は１秒であった。ノイズ比を改善するために、スペクトルを９回測定し平均化した。

【0062】

円偏光二色性分光法（ＣＤ）は、タンパク質の二次及び三次構造の両方を評価するための選択法である。芳香族領域の楕円率（２５０〜３３０ｎｍ）により、 タンパク質（すなわち、規則正しくフォールディングされたタンパク質の球状構造）の三次接触について報告され、未変性型のフォールディングの指紋領域と考えられる。

【0063】

Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの近ＵＶ ＣＤスペクトルを測定し、融合タンパク質がマトリクス結合再フォールディング工程後に秩序だった構造を採用するかどうかの問題に取り組む。答えは非常に明らかであり、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの近ＵＶ ＣＤ信号により、融合ポリペプチドの規則正しい三次構造が明確に報告される。Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの芳香族残基は、明らかに疎水性タンパク質内に埋め込まれ、その結果、融合構築物内にＳｋｐ及びＳｌｙＤの両者の未変性型の構造を強く指摘する、非対称の環境の状態となる（図９）。

【0064】

Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの熱的に誘導されるアンフォールディングが可逆的であることの問題に対処するために、融解極性を紫外領域の２８０ｎｍの検出波長で測定した。温度範囲は２０〜６５℃であり、バンド幅は１．０ｎｍであり、温度勾配は１℃／分であり、反応は４秒であった（図８を参照）。

【0065】

熱的に誘導されるアンフォールディングを２８０ｎｍ（Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの最大信号振幅の波長）で測定した。加熱により、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ分子の未変性構造を安定化する非共有接点は解放され、最終的に破壊される。この熱的に誘導されるアンフォールディングは、図８に示すように、ＣＤ信号の減少に反映される。６０℃で、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤは完全にアンフォールディングする。タンパク質溶液を２０℃まで冷却すると、ＣＤ信号は驚くほど元に戻る。わずかなヒステリシスがあるが、アンフォールディング曲線と再フォールディング曲線は事実上重ね合わさり、これは、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤの再フォールディング反応が可逆的であることを強く示唆する（図８）。Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤのような複雑な三量体融合タンパク質の熱的に誘導されるアンフォールディングが、少なくとも部分的に可逆的な工程であることは驚くべきことである。熱的に誘導されるアンフォールディング及び単量体サブユニットへの解離後、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤが、６０℃のような高温で非常に急速かつ定量的に凝集することは予期されていた。しかし、本発明者らは、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤが、タンパク質溶液を２０℃に冷却すると、未変性型構造に再度戻ることを見出した。実際に、熱的に誘導されるアンフォールディングの前後に測定された近ＵＶ ＣＤスペクトルは事実上重ね合わさっている（図９を参照）。結論として、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤは強固なフォールディング特性を有しており、これはこの複雑な分子にとって極めて優れたものであり、イムノアッセイの干渉防止又は全体的な安定化成分として役立つ分子として非常に望ましい。

【0066】

本発明者らは、Ｓｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡについて非常に類似の結果が得られることに気付いた。Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤと同様、Ｓｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡは、近紫外領域（２５０〜３３０ｎｍ、２７７ｎｍで最大信号）で顕著なＣＤ信号を示し、これは、マトリクス結合再フォールディング工程後の秩序だった構造を示す。熱転移によって（２７７ｎｍで測定）、本発明者らは、Ｓｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡが５５℃以下の温度で未変性様の構造を維持していることを観察した。更に、未変性分子のＣＤ信号は、図１１に示すように、熱的アンフォールディング／フォールディングサイクル（２０℃／６５℃／２０℃）後に大部分は元に戻る。干渉防止剤は、最適温度から離れている温度条件下でも、その機能を発揮することが好ましい。熱的に誘導されるアンフォールディングの部分的可逆性を有する、Ｓｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡの高い熱的安定性は、この分子の構造安定性を強調している。

【0067】

結論として、Ｓｋｐ−ＳｌｙＤ−ＳｌｙＤ及びＳｋｐ−ＳｌｐＡ−ＳｌｐＡは、この程度の複雑さを有し複雑さを有する分子とっては極めて優れている強固なフォールディング特性を有しており、干渉防止剤、又は一般的にイムノアッセイの安定成分としての機能を果たすモジュールにとって非常に望ましい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]