特許 6285972 ＡＣＹ−１の虚血／再灌流、移植片機能発現遅延及び移植片バイアビリティーのマーカーとしての使用及びその方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6285972

(24)【登録日】2018年2月9日

(45)【発行日】2018年2月28日

(54)【発明の名称】ＡＣＹ−１の虚血／再灌流、移植片機能発現遅延及び移植片バイアビリティーのマーカーとしての使用及びその方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20180215BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20180215BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20180215BHJP

   G01N 33/573 20060101ALI20180215BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20180215BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   G01N33/50 P

   G01N33/53 D

   G01N33/573 A

   C12Q1/68 AZNA

【請求項の数】10

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2015-562318(P2015-562318)

(86)(22)【出願日】2014年3月13日

(65)【公表番号】特表2016-512325(P2016-512325A)

(43)【公表日】2016年4月25日

(86)【国際出願番号】GB2014050768

(87)【国際公開番号】WO2014140595

(87)【国際公開日】20140918

【審査請求日】2017年3月13日

(31)【優先権主張番号】1304460.7

(32)【優先日】2013年3月13日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】508091030

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ リーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100060759

【弁理士】

【氏名又は名称】竹沢 荘一

(74)【代理人】

【識別番号】100087893

【弁理士】

【氏名又は名称】中馬 典嗣

(72)【発明者】

【氏名】ロザモンド エリザベス バンクス

(72)【発明者】

【氏名】マシュー ピーター ウェルベリー スミス

(72)【発明者】

【氏名】ピーター ジョン セルビー

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー ルイントン

【審査官】 黒田 浩一

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００４／０７４８１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０３２８６８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０４−３３０２７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５２７４２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 KUSAKA, M et al.，Up-Regulation of Osteopontin, Chemokines, Adhesion Molecule, and Heat Shock Proteins in 1-Hour Biopsy From Cardiac Death Donor Kidneys，Transplantation Proceedings，２００５年，Vol. 38, No. 10,，pp. 3347-3350

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ − ３３／９８

ＣＡｐｌｕｓ、ＷＰＩＤＳ、ＭＥＤＬＩＮＥ、ＢＩＯＳＩＳ、ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＣＹ−１からなることを特徴とする、虚血再灌流障害を判定するためのバイオマーカー。

【請求項2】

虚血再灌流障害が、脳、心臓、腎臓、肺及び肝臓から選ばれる少なくとも１つの組織において生じたものである、請求項１に記載のバイオマーカー。

【請求項3】

虚血再灌流障害が、心筋梗塞、脳卒中又は臓器移植によって生じたものである、請求項１又は２に記載のバイオマーカー。

【請求項4】

虚血再灌流障害が、手術後の臓器移植患者において、移植片機能発現遅延に至る、請求項１に記載のバイオマーカー。

【請求項5】

手術後の臓器移植患者が、腎臓移植手術後の患者である、請求項４に記載のバイオマーカー。

【請求項6】

ＡＣＹ−１からなることを特徴とする、移植片機能発現遅延を判定するためのバイオマーカー。

【請求項7】

患者における虚血再灌流障害を診断するためのキットであって、
ｉ）ＡＣＹ−１ポリペプチドに特異的に結合する検出可能にラベル化された試薬、又はＡＣＹ−１核酸に特異的に結合する検出可能にラベル化された試薬；及び
ｉｉ）診断アッセイを実施するための試薬
を含んでなる、キット。

【請求項8】

患者における移植片機能発現遅延を診断するためのキットであって、
ｉ）ＡＣＹ−１ポリペプチドに特異的に結合する検出可能にラベル化された試薬、又はＡＣＹ−１核酸に特異的に結合する検出可能にラベル化された試薬；及び
ｉｉ）診断アッセイを実施するための試薬
を含んでなる、キット。

【請求項9】

ＡＣＹ−１からなることを特徴とする、移植前にドナー腎臓の生存率を評価するためのバイオマーカー。

【請求項10】

虚血再灌流障害を診断するため、又は移植片機能発現遅延を診断するため、もしくは患者における腎障害、腎疾患もしくは腎不全を診断するためのキットであって、ＡＣＹ−１ポリペプチドに特異的に結合する第１の抗体及びＡＣＹ−１ポリペプチド又は前記第１の抗ＡＣＹ−１抗体のいずれかと結合し、検出可能な試薬と結合されている第２の別の抗体を含んでなるアッセイ装置を含んでなる、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、虚血再灌流障害又は移植片機能発現遅延のためのバイオマーカーに係る。具体的には、本発明は、アミノアシラーゼ−１及びアミノアシラーゼ−１を使用する診断及び予後の方法に係る。

【背景技術】

【0002】

腎臓移植は、末期腎疾患の患者にとっては明確なメリットを提供し^1,2、透析と比べて顕著な費用の節約を提供する^3,4。２０１０年において、米国では、１６，１５１件の腎移植が行われ（ｈｔｔｐ：／／ｏｐｔｎ．ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．ｈｒｓａ．ｇｏｖ）、これに対して、英国での対応する数値は２，６８７件である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｋｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．ｏｒｇ．ｕｋ）。しかし、患者の一部は、早期に、移植片機能発現遅延（ＤＧＦ）⁵のような、臨床転帰及び健康上の医療経済学的成果に顕著に影響を及ぼす合併症を経験している。

【0003】

ＤＧＦについて多数の定義が提案されている^6-8が、一般的に使用されている１つは、単独の高カリウム血症のため以外に、腎移植後第１週において透析が必要とされることである。他の臨床状況において見られる急性腎障害との類似性があるが、ＤＧＦの根本的病理は、ドナーの年齢及び虚血の期間のようなドナーに由来の要因、及び再灌流障害、免疫応答、及び免疫抑制剤⁹のようなレシピエントの要因の関与と複雑に絡み合っている。虚血再灌流障害（ＩＲＩ）に続く急性細尿管壊死（ＡＴＮ）は、ＤＧＦの患者における主な組織所見であるが、しかし、急性の細胞性又は体液性の拒絶反応が同時に生ずることがあり、組織学的には、他の病理、例えば、カルシニューリン阻害剤毒性が、しばしば、認められる。循環死後に提供された（ＤＣＤ）臓器及び境界領域ドナーから提供された臓器の使用が増大しているが¹⁰、これは、ＤＧＦの発生の増大（米国において、最近では、移植レシピエントの〜２０％に及んでいる）に一致している。ＤＧＦは、移植片生着不全、患者の死亡、死打ち切り移植片生着不全のリスクを２〜３倍増大させ^11,12、乏しい１年時移植機能、動脈性高血圧、及び急性の拒絶反応のような、移植片の長期生着を低減させる多数の合併症と関連する¹³。総合的には、ＤＧＦは、正に３年経過時の移植片機能損失のリスクを４１％増大させることと関連している¹⁴。

【0004】

ＤＧＦの早期の識別及び基礎病理学の理解の増大は、体液量状態の最適化、時宜を得た適切な透析、及び不必要な検査及び治療の回避を可能にする即時の患者管理を改善する顕著な可能性を有する¹⁵。患者を階級化する機会及び初期時点での目的に合わせた特別な治療介入は、改善された長期転帰を生ずる。プロテオミック技術の開発とともに、臨床的影響を有する新規のバイオマーカーを同定すること（ゲノムに基づく研究から出現する有望なマーカーを補完する）における臨床プロテオミクスの可能性に関する興奮が増大している¹⁶。

【0005】

移植後の透析及び移植片回復に関する要求の潜在的な予測因子として現在調査中の尿中のマーカーとしては、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）及び好中球ゼラチナーゼリポカリン（ＮＧＡＬ）が含まれ¹⁷、組織関連マーカーとしては、ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭが含まれている^15,18。残念ながら、ＤＧＦのケースの多くでは、尿が生成されないか、又は多くの結果の解析を混乱させる残留する本来の腎性アウトプットと混合され、ＤＧＦが一旦発症すると、生検組織は、しばしば、比較的遅い時期にのみ入手可能である。ＮＧＡＬ及びＩＬ−１８は、血清中において分析される際、確約を示してはいないが¹⁹、血液由来のバイオマーカーは、病院検査室での利便性及び日常的な使用のため、移植後を監視する理想的な方法であろう。しかし、血清又は血漿によるバイオマーカーの発見は、総患者数の〜９９％からなるわずか２２人の患者によって行われており、タンパク質存在量の広いダイナミックレンジは＞１０桁に及ぶ²⁰。

【0006】

上述のとおり、ＮＧＡＬ、ＩＬ−１８、ＫＩＭ−１、Ｌ−ＦＡＢＰ、ネトリン−１、及びケラチノサイト由来ケモカインのような多数の有望なバイオマーカーが腎虚血再灌流障害と関連しているが、これらの多くは、尿中、及びＤＧＦの状況における移植後よりもむしろ本来の急性腎障害（ＡＫＩ）において研究されている。ＤＧＦにおいて尿中のＮＧＡＬ及びＩＬ−１８が検査され、移植後１８時間において、ＡＵＣｓ０．７８及び０．７７であった。これらの結果を通して奨励されるようになっているが、それらは、ＤＧＦにおいて、尿排出量が移植後の全ての時点で生ずるかどうか、及びこのような尿排出量が、本来の腎臓から生成される現在の尿によって、どこで混同されるかについての障害の対象である。さらに、尿中ＮＧＡＬは、ＡＫＩにおいて、内因性腎不全から腎前性腎不全を区別するためのマーカーとして提案されており、移植患者における同様の使用も想像されるが、その真の識別能力は疑わしい。ＮＧＡＬ及びＩＬ−１８は、ＤＧＦ及びＳＧＦにおいて血清中で研究されているが、群間の識別は認められておらず、一方、シスタチンＣ（血清クレアチニンよりも優れている）は識別した。ドナーの尿中ＮＧＡＬ（血清ＮＧＡＬではない）は、長期のＤＧＦと関連している。ＩＲＩにおけるバイオマーカーについての多数の候補及び現在までのＮＧＡＬ及びＩＬ−１８のような有望なマーカーの調査にもかかわらず、明確な臨床上の有益性を有する血清中のマーカーの候補は、今のところ出現していない。

【0007】

移植片機能発現遅延は、患者の入院の長さ及びこれに関連する費用についての影響の理由だけでなく、患者の体液状態、及び最少の腎臓機能を示している「ウエットの」移植後患者からの過剰な体液除去により起こり得る可及的な更なる臨床上の合併症を回避するための時宜を得た適切な透析の使用の管理における困難性の理由のため、腎移植においては、なお、重大な臨床的事象である。さらに、ＤＧＦを経験した患者に対する公知のマイナスの長期間の影響は、これが腎移植を行う臨床医にとって極めて重要であることを意味する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

従って、ＤＧＦのような虚血再灌流障害を予測する血液由来のバイオマーカーに関する要求がなお存在している。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明によれば、ＡＣＹ−１の虚血再灌流障害のためのバイオマーカーとしての使用が提供される。好ましくは、前記虚血再灌流障害は、脳、心臓、腎臓、肺及び肝臓から選ばれる少なくとも１つの組織におけるものである。

【0010】

好ましくは、前記虚血再灌流障害は、心筋梗塞、卒中、手術、損傷又は臓器移植によって生じたものである。

【0011】

好ましくは、前記虚血再灌流障害は、移植手術後の患者において、移植片機能発現遅延に至る。好ましくは、前記移植手術後の患者は、腎移植手術後の患者である。

【0012】

他の態様では、本発明は、ＡＣＹ−１の移植片機能発現遅延のためのバイオマーカーとしての使用を提供する。

【0013】

さらに他の態様では、本発明は、患者における虚血再灌流障害を診断する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１についての対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが増大している場合に、患者が虚血再灌流障害を有していると認定する。

【0014】

好ましくは、前記虚血再灌流障害は、脳、心臓、腎臓、肺及び肝臓から選ばれる少なくとも１の組織におけるものである。好ましくは、前記虚血再灌流障害は、心筋梗塞、卒中、又は臓器移植によって生じたものである。

【0015】

好ましくは、前記患者は腎移植手術後の患者である。

【0016】

更なる態様では、本発明は、患者における移植片機能発現遅延を診断する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１についての対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが増大している場合に、患者が移植片機能発現遅延を有していると認定する。

【0017】

好ましくは、前記患者は腎移植手術後の患者である。

【0018】

さらに他の態様では、本発明は、術後の腎移植患者について透析管理戦略を決定する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１についての対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが増大している場合に、患者が移植後１〜７日内に透析を必要としていると認定する、又はコントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが低下している場合に、患者が移植後１〜７日内には透析を必要としないと認定する。

【0019】

さらに他の態様では、本発明は、術後の腎移植患者について体液管理戦略を決定する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から単離したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１に関する対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが増大している場合に、患者が、腎移植手術後の患者に通常投与される液体の量と比べて低減された量の液体を必要としていると認定する、又はコントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが低下している場合に、透析することが余り必要ではないため、患者にとっては、腎臓移植手術後の患者に通常投与される液体の量と比べて増大された量の液体がためになるであろうと認定する。

【0020】

さらに他の態様では、本発明は、患者における腎移植の術後の臨床転帰を予測する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１についての対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して増大している患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルは、移植後１、２、３、４又は５年の時点における前記患者の死亡フリー及び／又は透析フリー生存率の増大を予知するものであるとする。

【0021】

好ましくは、サンプルは血液サンプル、さらに好ましくは血清サンプルである。

【0022】

好ましくは、前記サンプルが、移植後の患者から得たものである。

【0023】

好ましくは、前記患者から、移植後第１、２、３又は４日の時点で得たものである。

【0024】

好ましくは、前記患者はヒトである。

【0025】

好ましくは、前記ＡＣＹ−１はヒトＡＣＹ−１である。好ましくは、前記ＡＣＹ−１はポリペプチドである。好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。或いは、前記ＡＣＹ−１は、ｍＲＮＡのような核酸分子である。好ましくは、前記核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。

【0026】

好ましくは、前記予め決定された対照レベルは、コントロール患者におけるＡＣＹ−１の平均レベルである。

【0027】

好ましくは、本発明の方法は、さらに、ｉ）患者から単離したサンプルにおける、ＮＡＧＬ、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１８、ＲＢＰ、ＦＡＢＰ４、シスタチンＣ及びクレアチニンから選ばれる少なく１個のバイオマーカーのレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＮＡＧＬ、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１８、ＲＢＰ、ＦＡＢＰ４、シスタチンＣ又はクレアチニンのレベルを、コントロールサンプルにおけるＮＡＧＬ、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１８、ＲＢＰ、ＦＡＢＰ４、シスタチンＣ又はクレアチニンのレベル又は予め決定したＮＡＧＬ、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１８、ＲＢＰ、ＦＡＢＰ４、シスタチンＣ又はクレアチニンに関する予め決定した対照レベルと対比することを含んでなる。

【0028】

さらに他の態様では、本発明は、患者における虚血再灌流障害を診断するためのキットを提供し、該キットは、ｉ）ＡＣＹ−１ポリペプチドに特異的に結合する検出可能にラベル化された試剤、又はＡＣＹ−１核酸に特異的に結合する検出可能にラベル化された試剤；及びｉｉ）診断アッセイを実施するための試薬を含んでなる。

【0029】

さらに他の態様では、本発明は、患者における移植片機能発現遅延を診断するためのキットを提供し、該キットは、ｉ）ＡＣＹ−１ポリペプチドに特異的に結合する検出可能にラベル化された試剤、又はＡＣＹ−１核酸に特異的に結合する検出可能にラベル化された試剤；及びｉｉ）診断アッセイを実施するための試薬を含んでなる。

【0030】

さらに他の態様では、本発明は、ＡＣＹ−１ポリペプチドを検出できる化合物又は試剤を含んでなるアッセイ装置を提供する。

【0031】

さらに他の態様では、本発明は、患者における虚血再灌流障害を診断するため、又は移植片機能発現遅延を診断するため、又は患者における腎障害、腎疾患又は腎不全を診断するためのキットを提供し、該キットは、ＡＣＹ−１ポリペプチドに特異的に結合する第１の抗体を含んでなるアッセイ装置；及び（２）ＡＣＹ−１ポリペプチド又は第１の抗−ＡＣＹ−１抗体に特異的に結合し及び検出可能な試剤に結合される第２の異なる抗体を含んでなる。

【0032】

以下に、添付図面を参照して、本発明の具体例を例示する。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】患者群及び研究デザインを示す。

【図2】ａ）質量分析ラベル−フリー強度によって測定した、及びｂ）同じサンプルについての続くＥＬＩＳＡによって測定した、初期バイオマーカー発見のために使用した移植片機能発現遅延（ＤＧＦ）群及び非ＤＧＦ群における術前及び術後第２日における血清アミノアシラーゼ−１（ＡＣＹ−１）の濃度（１群当たり患者５人）を示す。

【図3】異なる臨床経過、すなわち、ａ）無併発性の移植、ｂ）移植片機能発現遅延（著しいＡＣＹ−１の上昇を示すサブクラスからの患者）及び、ｃ）急性の拒絶反応（^＊）、続く２回の尿路感染症（↓）を有する３人の患者における腎移植から長期間経過後の血清アミノアシラーゼ−１（ＡＣＹ−１）、クレアチニン及びシスタチンＣに関するプロフィールの例を示す。移植前の濃度を第０日として示す。

【図4】ａ〜ｄ）に、コホート１及びコホート２について、移植片機能発現遅延（ＤＧＦ）群及び非移植片機能発現遅延群における移植後第１日及び第３日における血清アミノアシラーゼ−１（ＡＣＹ−１）濃度を示し、ｅ〜ｆ）に、移植片機能発現遅延（ＤＧＦ）、緩慢な移植片機能発現（ＳＧＦ）及び早期移植片機能発現（ＩＧＦ）を有するコホート２における患者の移植後第１日及び第３日における血清アミノアシラーゼ−１（ＡＣＹ−１）濃度を示す。Ｔｕｋｅｙボックスプロットは、マン・ホィットニー検定による測定で示された群間の有意差を有する中央値及び四分位範囲を意味する。

【図5】移植片機能発現遅延（ＤＧＦ）の予測に関するＲＯＣ曲線であり、それぞれ、血清ＡＣＹ−１、クレアチニン（ＳＣｒ）、シスタチンＣ（ＣｙｓｔＣ）、及びシスタチンＣと組み合わせたＡＣＹ−１を示す。ａ）は、コホート１の、移植後第１／２日の結果（ｎ＝４７、ただし、ＡＣＹ−１及びシスタチンＣについてはｎ＝３５）であり、ｂ）は、コホート２の、移植後第１日の結果（ｎ＝１９４、ただし、ＡＣＹ−１については、ｎ＝１３８及びシスタチンＣについてはｎ＝１２８）である。

【図6-1】ヒトＡＣＹ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。

【図6-2】ヒトＡＣＹ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。

【図6-3】ヒトＡＣＹ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。

【図6-4】ヒトＡＣＹ−１のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。

【図7】ヒトＡＣＹ−１のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図8】対照の多変量モデルに添加される際のＡＣＹ−１についてのリスクアセスメントプロットを示す。

【図9】ドナーのタイプによって分離したコホート２におけるＤＧＦ患者及び非ＤＧＦ患者についての移植後第１日及び第３日における血清ＡＣＹ−１濃度（ｌｏｇスケール）を示す。中央値は水平バーによって表わされる。非ＤＧＦ群内では、各ドナーのタイプ間で有意差が見られ（ｐ＜０．００１）、それぞれ、ＤＢＤ、ＤＣＤ及びＬＤについて、中央値３５．２、１０７及び１５．６ｎｇ／ｍＬであり、及びＤＧＦ群内では、ＤＢＤ及びＤＣＤの間は同様であり、中央値は７０．３及び４８３．２ｎｇ／ｍＬである。ＤＧＦ群と非ＤＧＦ群とを比較すると、移植を受けた患者において、ＤＢＤ（ｐ＝０．０２３）及びＤＣＤ（ｐ＜０．００１）の両方から、有意に高いＡＣＹ−１濃度が認められた。

【図10】顕著な特性によって分離されたコホート２における腎移植後の透析フリー生存率（ＤｉＦＳ）についての生存時間関数のカプラン・マイヤー（ＫＭ）推定値を示す（追跡期間中央値は、０．０２〜７．９０年の範囲内で、５．９３年である）。ａ）ＤＧＦ患者及びｂ）非ＤＧＦ患者を、それぞれ、移植後第１日のＡＣＹ−１の血清濃度によって分離している（第１日の測定値がない場合には、第３日の測定値を使用できる）。事象の数は、ＤＦＧ患者について、ＡＣＹ−１≧２００で１／２８（３．６％）及びＡＣＹ−１＜２００で９／２４（３７．５％）であり、非ＤＦＧ患者について、ＡＣＹ−１≧２００で２／１６（１２．５％）及びＡＣＹ−１＜２００で５／８９（５．６％）であった。ｃ）ＤＧＦ患者及びｄ）非ＤＧＦ患者を、それぞれ、ドナーのタイプ（ＤＣＤ及びＤＢＤ）によって分離した。事象の数は、ＤＦＧ患者において、ＤＣＤについて１／２１（４．８％）及びＤＢＤについて９／３１（２９％）であり、非ＤＦＧ群において、ＤＣＤについて１／１９（５．３％）及びＤＢＤについて６／８６（７％）であった。ｅ）ドナータイプＤＢＤを有するＤＧＦ患者を、ＡＣＹ−１濃度（上述のとおり）によって分離した。事象の数は、ＤＢＤ／ＡＣＹ−１≧２００について０／９（０％）及びＤＢＤ／ＡＣＹ−１＜２００について９／２２（４０．９％）であった。透析への戻りの理由には、再発ＦＳＧＦ、血管拒絶及び生検における慢性の瘢痕が含まれる。

【発明を実施するための形態】

【0034】

発明者らは、良好な再現性を有するプロテオミック適用範囲の中等度の深度を作成するために既に示された、高質量精度ＴＬＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓラベルフリー分析と組み合わせた最も豊富なタンパク質の１４個の免疫除去を使用して²¹、ＤＧＦを有する又はＤＧＦを有していない腎移植を受けた患者から術前及び術後に採取した血清タンパク質を比較した。発明者らは、驚くべきことには、アミノアシラーゼ−１（ＡＣＹ−１）を重要な候補として同定した。アッセイに続いて、初めて血清中のＡＣＹ−１の測定を可能にする開発、早くも移植後第１日のサンプルにおけるＩＲＩ及びＤＧＦのためのバイオマーカーとしてのＡＣＹ−１の有望な臨床上の利用性を確認する患者のより大きいコホートにおける検証、及び重要なことには、有意な転帰との関連が認められた。

【0035】

さらに、血清系バイオマーカーの同定及び血清の使用は、ＩＲＩ、特にＤＧＦとの関連では明白な利点を有する。ＤＧＦ患者は尿排出量が全くない（これは、尿マーカーの有用性に対して劇的に影響を及ぼす）。余剰の本来の尿排出量は、さらに、この臨床状況において、尿マーカーのアセスメント及び使用を複雑にする。

【0036】

血清のプロテオミック分析から、ＡＣＹ−１をＤＧＦ用のバイオマーカーと特定した。バイオマーカーは、臨床上有用な様式で、腎移植後の患者群の早期の描写を提供し、しっかりと開発されたプロテオミック法、候補の選択及び臨床テスト開発システムを開発を通して、注意深く集めた及び注釈が付けられた臨床サンプルセットにより、臨床での使用の瀬戸際で、明確に定義された臨床上の疑問を持つ可能性を証明している。

【0037】

発明者らは、１）再現性の免疫除去と、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ質量分析計を使用する高質量精度タンデム質量分析との組み合わせにおける必要な方法論²¹；及び２）バイオマーカーパイプラインの発見及び初期検証段階、及び付随する臨床データとともに、将来を見越して集められたサンプルの高品質バンクに至る臨床医及び科学者の一体的なチームの使用の両方の開発を通して、血清のプロテオミック分析から、潜在的に臨床上の有用性を有するマーカーを誘導することができた。

【0038】

アミノアシラーゼ−１（ＡＣＹ−１）
アミノアシラーゼ−１（ＡＣＹ−１）（Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸アミドヒドロラーゼとも呼ばれる）は、ペプチダーゼＭ２０Ａファミリーに属し、Ｎ−アシル化又はＮ−アセチル化アミノ酸（Ｌ−アスパラギン酸を除く）の加水分解に関与し、カルボン酸エステル及びＬ−アミノ酸を生成すると考えられる。ＡＣＹ−１は、予測された単量体質量４５．３ｋＤａを有する亜鉛結合ホモ二量体細胞質タンパク質である²²。真核性細胞では、全細胞タンパク質の５０〜８０％がＮ末端でアシル化されている（タンパク質の機能及び安定性に影響を及ぼし得る翻訳時又は翻訳後の修飾である）。ＡＣＹ−１は、Ｎ−アシル化ペプチド、特にＮ−アセチル化された中性脂肪族アミノ酸の加水分解において触媒作用を発揮して、タンパク質合成のための遊離のアミノ酸を放出する²³。発現及び活性の最も高いレベルは、腎臓において見られ、続いて、肝臓、脳、骨格筋及び膵臓であり、いくつかの他の臓器において低いレベルの発現が認められる^{22, 24-27}。パン細管ＡＣＹ−１発現は、アミノ酸回収における提案された役割²⁸を有するブタ腎臓において示されたが²⁶、ヒト腎臓では、主に近位細管発現である²⁶。可変性の神経学的特徴を有する代謝の先天異常は、ＡＣＹ−１の突然変異と関連し（突然変異に応じて、ＡＣＹ−１の発現及び活性に対する影響を有する）、尿性のＮ−アセチル化アミノ酸を増大させる²⁵。染色体３ｐ２１．１上に配置された場合、腎臓ガン及び肺ガンの両方において、ガン抑制遺伝子としての役割が提案されている^{22, 30, 31}。

【0039】

移植前の低い又は検出不能な血清ＡＣＹ−１濃度及び肝臓ドナーにおける感染による又は手術後の各種増大の不在は、ＤＧＦにおけるＡＣＹ−１の移植後の上昇が、単に、障害性の腎クリアランス又は炎症によるものではないことを示唆している。ＤＧＦは、プレ−獲得から手術後の期間を通して、複数のリスク要因及び細管を含む各種の細胞及び脈環構造に関わる根底にある機構と複合している^{9, 32}。腎細尿管源を仮定すると、ＤＧＦの多くのケースにおける増大した血清ＡＣＹ−１は、細管のダメージの程度を反映するものであり、これは、ＡＴＮ（生検の数は少ないが）との連合及び血清ＡＣＹ−１濃度の、緩慢な移植片機能発現による非併合性の移植からＤＧＦまでの傾向によって支持される。逆に、より高いＡＣＹ−１とＤＧＦに続くより良好な転帰との間の関係は、潜在的にタンパク質合成についてのアミノ酸の利用性に対する影響を介して、増大された合成及び修復プロセスにおける役割を表示できる。

【0040】

ＡＣＹ−１は、シクロスポリンで処置したラット又はシロリムス（ただし、タクロリムスではない）で処置したラット³³では、顕著に変化する７５個の尿タンパク質の１つであり、ＡＣＹ−１は、臓器毒性に関与すると提唱されるミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）から腎臓において産生された生物学的に活性な代謝物と付加物を形成する³⁴。しかし、発明者らは、ＣＮＩ毒性又はＭＭＦとのリンクを見出していない。興味深いことには、ＡＫＩ患者２２人からの血清サンプルの分析（その内の１０は、診断３日以内である）は、血清ＡＣＹ−１濃度が全て＜６０ｎｇ／ｍＬであること示し（データは示されていない）、これは、恐らく、損傷又は修復又はどんな根本的なＩＲＩを反映するかどうかは、特定の移植状況において主として遭遇した及び／又はその際に、より極端且つ広範囲の虚血／病低酸素状態下においてのみ生ずる病理過程に非常に特異的であることを示している。これは、ＤＢＤ、ＤＣＤ及びＬＤ移植の間の血清ＡＣＹ−１における著しい差異によっても支持される。

【0041】

ＤＧＦのためのマーカーに関して、死亡した又は生存するドナーからの移植片から０時間の生検における遺伝子の発現（特に、ケモカインＣＣＬ１９及び２１及びプロテアソームサブユニットＰＳＭＢ８及び１０において）を、関連する臨床因子と組み合わせた結果、ＡＵＣ値は、ＤＧＦについて０．７４及び急性拒絶反応について０．９３であった³⁵。ＤＧＦ患者からの生検におけるＲＡＮＴＥＳ及びＣＣＲ１／ＣＣＲ２の発現は、移植後１年の時点及びそれ以降の移植片の機能と関連することも報告されている³⁶。ＡＫＩにおける使用について、いくつかの既存のマーカーも検討されている^37,38が、例えば、組織ＫＩＭ−１はＤＧＦとは相関せず³⁹、一方、尿中ＮＧＡＬ及びＩＬ−１８は、ＤＧＦについて、いくらかの的中率を有する^17,40が、長期間の機能との相関はない⁴¹。第１日の血清ＮＧＡＬ濃度は、ＤＧＦについての的中率を有していないが、発明者らの研究と同様に、血清シスタチンＣはＡＵＣ０．８３を有する。ＤＧＦに関連するＡＣＹ−１のついての発明者らの特異度（８８．５％）及び陰性的中率（８１．７％）は非常に高く、潜在的にバイオマーカーパネルに貢献できる。直接的に腎機能を反映する血清シスタチンＣは、各種の臨床現場においてＡＫＩを予測することにおける使用のメタ分析でみられる０．９６と同様のＡＵＣにより、ＤＧＦを早期に予測することにおいては、ＡＣＹ−１よりも優れている⁴²。しかし、ＡＣＹ−１及びシスタチンＣを併用することは、第１日では、より高い特異度を有するＡＣＹ−１より、わずかに良好であり、より高感度のＡＣＹ−１アッセイが開発された場合には、ＡＣＹ−１による更なる識別化が可能であろう。

【0042】

ＩＲＩのマウスモデルにおける遺伝子発現研究から、更なる推測機構が明らかであろう⁴³。スフィンゴシンキナーゼ−１（ＳｐｈＫ１）は、スフィンゴシン−１−ホスフェート（腎臓ＩＲＩの保護／修復に関与する）の形成において触媒として機能し^44-46、機能によって分類される移植片の間で異なり⁴⁷、ＡＣＹ−１と相互作用することが報告されている^30,48。ドナーの生検における炎症及び免疫−応答遺伝子は、圧倒的に、ＩＲＩ及びＤＧＦと関連付けられており、更なる見識を提供するために、総合システムによる生物学的分析アプローチが提案されている¹⁵。最近のＤＧＦ及び非ＤＧＦ移植前生検の比較では、ＤＧＦ群が、第１年の間に、腎機能に基づいてサブ分類されるまで、何らの顕著な経路のクラスタリングが見出されておらず、遺伝子がＴ細胞の活性化に関与する際、抗原提示及び細胞接着が、その後の乏しい機能と関連付けられている⁴⁷。ＤＧＦ患者のサブ分類は、当該の研究（この研究では、移植後の血清ＡＣＹ−１における明確な上昇が、ＤＧＦの患者の約２／３においてのみ認められる）におけるＡＣＹ−１による状況と類似している。これは、異なる根本の病態生理学的サブグループを含むことができ、また、ＤＧＦ患者群内におけるＡＣＹ−１の予後の値を証明する。

【0043】

尿細管細胞のアポトーシス及び再生は、腎移植における腎移植片によって経験される虚血再灌流障害（ＩＲＩ）の基本的な部分であるため、及び上述のようにＡＣＹ−１の管内局在化があるとすれば、移植片機能発現遅延（ＤＧＦ）のような顕著なＩＲＩに至るプロセスに関連するＡＣＹ−１の可能性は、生物学的には真実味がある。Ｗｉｓｔｅｒラットに関する単独の研究において、ＡＣＹ−１に対するカルシニューリン阻害剤及びシロリムスの影響が認められている一方、腎移植の上でのＡＣＹ−１のバイオロジーの確固とした理解は欠けている。

【0044】

ここで使用するように、用語「ＡＣＹ−１」は、アミノアシラーゼ−１のポリペプチド及び核酸分子の両方を意味するものとして使用する。

【0045】

好ましくは、ＡＣＹ−１は、ヒトＡＣＹ−１ポリペプチド又は核酸分子である。

【0046】

ここで使用するように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）及び例えば、ヌクレオチドアナログの使用によって産生されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含む。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【0047】

１具体例では、ＡＣＹ−１核酸分子は、配列番号１において示されるヌクレオチド配列、又はこのヌクレオチド配列のいずれかのフラグメントを含んでなる。１具体例では、核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列のいずれかのフラグメントからなる。

【0048】

他の具体例では、単離されたＡＣＹ−１核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、又はこのヌクレオチド配列のいずれかのフラグメントの補体である核酸分子である。他の具体例では、本発明の核酸分子は、ハイブリダイゼーション条件下において、配列番号１に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズできるように、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して十分に補足性であり、これにより、安定したディープレックスを形成できる。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件である。

【0049】

ここで使用するように、用語「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を記述する。ストリンジェントな条件とは、当業者には公知であり、入手できる文献（例えば、「分子生物学における最新のプロトコル」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，１９８９，６．３．１−６.３．６）に見られる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好適な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃におけるハイブリダイゼーション、続く、０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、約５０℃における１回又はそれ以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好適な他の例は、６×ＳＳＣ中、約４５℃におけるハイブリダイゼーション、続く、０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、約５５℃における１回又はそれ以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらに他の例は、６×ＳＳＣ中、約４５℃におけるハイブリダイゼーション、続く、０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、約６０℃における１回又はそれ以上の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ中、約４５℃におけるハイブリダイゼーション、続く、０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、約６５℃における１回又はそれ以上の洗浄である。特に好ましいストリンジェンシー条件（及び実務家が、分子が本発明のハイブリダイゼーションの制限内にあるかどうかを決定するために、いかなる条件を適用すべきか確信できない場合に使用されるべき条件）は、０．５モルリン酸ナトリウム、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、６５℃、続く、０．２×ＳＳＣ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中、約６５℃における１回又はそれ以上の洗浄である。

【0050】

１具体例では、本発明のＡＣＹ−１核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の全長と、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含んでなるか又はからなる。

【0051】

ここで使用するように、用語「相同性」及び「同一性」は、相互に交換可能なものとして使用される。配列間の配列の相同性又は同一性の算定は、下記のようにして行われる。

【0052】

２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性（％）を決定するために、最適な対比を目的として、配列を整列する（例えば、最適な整列のために、第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入でき、比較のため、非相同配列を無視できる）。好適な具体例では、比較のために整列した対照配列の長さは、対照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。ついで、対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されていれば、配列はその位置において同一である（ここで使用するように、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と等しい）。２つの配列間の同一性（％）は、ギャップの数及び各ギャップの長さ（２つの配列の最適な整列のために導入することが要求される）を考慮して、配列によって分けられた同一の位置の数の関数である。

【0053】

配列の対比及び２つの配列間の同一性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行われる。好適な具体例では、２つのアミノ酸配列の間の同一性（％）は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）におけるＧＡＰプログラムを組み込んだＮｅｅｄｌｅｍａｎらアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９７０），４８：４４４−４５３）（ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか及びギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６、又は４及び長さウエイト１、２、３、４、５、又は６を使用する）を使用して決定される。さらに他の好適な具体例では、２つのアミノ酸配列の間の同一性（％）は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）におけるＧＡＰプログラム（ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及びギャップウエイト４０、５０、６０、７０、又は８０及び長さウエイト１、２、３、４、５、又は６を使用する）を使用して決定される。特に好適な因子のセット（及び実務家が、分子が本発明の配列同一性及び配列相同性の制限内にあるかどうかを決定するために、いかなる因子を適用すべきか確信できない場合に使用されるべきもの）は、ギャップペナルティー１２、ギャップエクステンションペナルティー４及びフレームシフトギャップペナルティー５を有するＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスである。

【0054】

或いは、２つのアミノ酸又はヌクレオチドの配列間の同一性（％）は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＭｅｙｅｒｓらのアルゴリズム（（１９８９）、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７）（ＰＭＡ１２０加重残余表、ギャップレングスペナルティー１２及びギャップペナルティー４を使用する）を使用して決定される。

【0055】

１具体例では、核酸フラグメントは、ＡＣＹ−１のドメイン、領域、又は機能的部位に相当する配列を含んでなるか又はからなる。或いは、ＡＣＹ−１の核酸フラグメントは、ＡＣＹ−１ポリペプチドのエピトープ保有領域をコードする。

【0056】

好適な具体例では、核酸フラグメントは、配列番号１の３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００個又はそれ以上の連続するヌクレオチドを含んでなるか又はからなる。

【0057】

１具体例では、ＡＣＹ−１核酸分子は、ＡＣＹ−１ポリペプチド、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる又はからなるＡＣＹ−１ポリペプチド、好ましくは機能的対立遺伝子変異体をコードする核酸配列を含んでなるか又はからなる。或いは、ＡＣＹ−１核酸分子は、ＡＣＹ−１ポリペプチドの対立遺伝子変異体、好ましくは機能的対立遺伝子変異体をコードする核酸配列を含んでなるか又はからなる。

【0058】

ここで使用するように、用語「ＡＣＹ−１ポリペプチドの対立遺伝子変異体」は、機能タンパク質及び非−機能タンパク質の両方を含む。機能的対立遺伝子変異体は、ＡＣＹ−１活性を維持する、集団内のＡＣＹ−１ポリペプチドの天然のアミノ酸配列変異体である。機能的対立遺伝子変異体は、一般的には、配列番号２の１又はそれ以上のアミノ酸の保存的な置換、又はポリペプチドの重大でない領域における重大でない残基の置換、欠失又は挿入のみを含有する。

【0059】

「重大でない」アミノ酸残基は、ＡＣＹ−１の生物活性を無効にする又は実質的に変更することなく、ＡＣＹ−１の野生型の配列（例えば、配列番号２の配列）から変更される残基であり、一方、「必須の」アミノ酸残基は、このような変更を生ずる。

【0060】

「保存的な置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、、グルタミン酸）、不変の極性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝状の側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。

【0061】

１具体例では、ＡＣＹ−１ポリペプチド分子は、配列番号２において示されるアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列のいずれかのフラグメントを含んでなる。１具体例では、ポリペプチド分子は、配列番号２のアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列のいずれかのフラグメントからなる。

【0062】

１具体例では、ＡＣＹ−１ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を含んでなるか又はからなる。好ましくは、このようなポリペプチドは、ＡＣＹ−１生物活性を保持する。

【0063】

１具体例では、ＡＣＹ−１ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの対立遺伝子変異体、又はこのアミノ酸配列のフラグメントである。

【0064】

１具体例では、ペプチドフラグメントは、ＡＣＹ−１ポリペプチド、例えば、配列番号２のポリペプチドのエピトープ保有領域をコードする。

【0065】

１具体例では、ＡＣＹ−１フラグメントは、配列番号２のポリペプチド生物学的に活性なフラグメントを含んでなる又はからなる。

【0066】

ここで使用するように、ＡＣＹ−１ポリペプチドの「生物学的に活性なフラグメント」は、ＡＣＹ−１ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、配列番号２において示されるアミノ酸配列）と十分に相同性であるか又は前記アミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を含んでなるペプチド（全長ＡＣＹ−１ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、ＡＣＹ−１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を発揮する）を含む。ＡＣＹ−１ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントは、配列番号２の１０、２５、５０、１００、２００個又は以上の連続するアミノ酸を含んでなるか又はからなる。

【0067】

好ましくは、ＡＣＹ−１ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの対立遺伝子変異体である。

【0068】

ここで使用するように、用語「ＡＣＹ−１の活性」及び「ＡＣＹ−１の生物活性」は、ＡＣＹ−１の活性に関する。このような活性としては、アシル化Ｌ−アミノ酸のＬ−アミノ酸及びアシル基への加水分解に触媒作用を発揮する能力が含まれる。他の活性としては、亜鉛を結合する能力が含まれる。

【0069】

診断及び予後アッセイ
発明者らは、ＡＣＹ−１が、全ての患者において、移植前では、低いか又は検知不能であり、生体ドナーにおける濃度が、検知不能であるか又は一貫して非常に低いままであることを確認した。さらに、ＡＣＹ−１の濃度は、ＣＲＰの変化と並行しては変化しなかった。これらの知見は、ＡＣＹ−１が腎機能の尺度として単純に機能しないし（すなわち、移植前の末期腎疾患患者ではＡＣＹ−１は産生されない）、炎症又は術後のマーカーとしても機能しないことを示唆している。むしろ、主に、移植片が術後に機能する速度に影響を及ぼすに十分な程度の虚血再灌流障害又は他の損傷／修復プロセスの面では、ピークとなるように思われる（ＳＧＦ及びＤＧＦの両方において無併発性の移植片と比べて明らかに上昇されている）。ＡＣＹ−１は尿細管に位置していることと調和して、唯１人の患者において、十分なタクロリムス毒性が生ずる場合（それ自体、尿細管の損傷の原因となる）、発明者らは、並行しては、ＡＣＹ−１における比較的小さい増大を観察した。しかし、ＡＣＹ−１は、臨床上見られるタクロリムスレベルにおけるより小さい、より一般的な変動によっては影響されないし、陽性の中流尿培養によっては影響されない（これらが、高ＣＲＰ濃度及び入院患者の静脈内抗生物質治療の必要性によって証明された臨床上の顕著な病態生理学と関連する場合でさえも）。

【0070】

第１日のＡＣＹ−１血清濃度は顕著にＤＧＦと関連したが、多変量分析では、統計学的有意性には達し得なかった。マーカーが移植後第１日のような早期に臨床的対応を知らせる可能性は、明らかに有利である。ＤＧＦに関連するＡＣＹ−１についての特異度及び陰性的中率は非常に高く、臨床的に有用であることは注目される（感度及び陽性的中率は、一方では、コホート１においては適正であるのに、コホート２では非常に高いのに反して、低いＡＣＹ−１濃度は、透析を必要とするようにはならない患者群を、より正確に限定できることを意味する）。それにもかかわらず、ＲＯＣ分析で見られるＡＵＣｓも十分に高く、臨床的に有用である（コホート１及び２において、それぞれ、０．７４及び０．７７）。有望な新規のバイオマーカーを、血清クレアチニンのような不完全なゴールドスタンダードと比べることの困難性にもかかわらず、現在の移植後の臨床環境におけるＡＣＹ−１の有用性は、シスタチンＣとの組合せにおけるＡＵＣｓ（コホート１及び２において０．９４及び０．９３）から見られる。

【0071】

発明者らは、ＡＣＹ−１濃度と、ＤＧＦの期間（血清クレアチニンのプラトーに対する日によって定義される）の又は１年、３年又は５年の時点での、より長い期間の腎機能因子（クレアチニン、ｅＧＦＲ、ｕＰＣＲ）との相関関係は観察されなかった。しかし、発明者らは、驚くべきことには、ＤＧＦ患者の中でも、より高いＡＣＹ−１濃度の患者は、カプラン・マイヤー分析によって、群として、５年の時点で、より高い透析フリーの生存率を有することが認められた。これは、移植後のＩＲＩの間における高ＡＣＹ−１濃度は、実際に、移植片が、ＩＲＩが不利益を被らない程度までＩＲＩを改善するためには保護性である（必要でさえある）ことを示唆しており、これは、更なる調査のための創造力に富む領域を提供する。

【0072】

従って、発明者らは、ＡＣＹ−１を、予測医学（例えば、診断アッセイ及び予後アッセイ）における特別な用途のバイオマーカーとして確認した。

【0073】

発明者らによって提供されるデータは、ＡＣＹ−１が、虚血再灌流障害についてのバイオマーカーとして有用であることを確認する（ＡＣＹ−１のレベルが、虚血再灌流障害に罹っている又は発症する危険がある患者を特定できる）。

【0074】

ここで使用するように、「虚血再灌流障害」は、虚血又は酸素不足の状態の後、組織へ血液が供給される際に生ずる組織の損傷を言う。虚血期間における血液からの酸素及び栄養の欠如は、血行の回復により、酸化ストレスの誘導を介して、炎症及び酸化的損傷を生ずる状態を創成する。いずれの組織も虚血再灌流障害を受け得る。特に、感受性の組織としては、脳、心臓、腎臓、肺、肝臓及び骨格筋が含まれる。

【0075】

虚血及びそれによる虚血再灌流障害は、心筋梗塞、敗血症、卒中及び臓器及び組織の獲得及び移植において生ずることがある。移植の際に虚血及び続く虚血再灌流障害に至り得る臓器としては、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、及び胸腺が含まれる。

【0076】

虚血再灌流障害は、移植を受けた患者において、移植片機能発現遅延を生ずることが知られている。ここで使用するように、「移植片機能発現遅延」は、移植後における透析の必要性（いくつかの理由による）又は血清クレアチニン（又はいくつかの他の腎臓機能のマーカー（クレアチニンクリアランスのような算定因子を含む））の期待したような改善の達成不能を含む（ただし、これらに限定されない）いくつかの臨床的定義によって決定されるように、腎移植片の術後の適切な機能発現の不能／遅延を言う。例えば、移植片機能発現遅延は、ａ）腎移植後第１週における透析の要求；ｂ）単独の高カリウム血症のため以外に、腎移植後第１週における透析の必要性；ｃ）移植後第１週における、増大、現状維持、連続する３日間における１日当たり１０％未満の減少のいずれかの術後血清クレアチニンレベルの観察；及びｄ）Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ算定クレアチニンクリアランス（ｃＣＣｒ）＜１０ｍｌ／分（ＤＧＦは、ついで、この値が＞１０ｍｌ／分になった際に終わったと言われる）によって決定される。

【0077】

ここに提供されるデータは、ＡＣＹ−１が、移植片機能発現遅延についてのバイオマーカーとして有用であることを確認する（ＡＣＹ−１のレベルが、移植片機能発現遅延に罹っている又は発症する危険がある患者を特定できる）。

【0078】

ここに記載する診断法は、虚血再灌流障害又は移植片機能発現遅延に罹っている又は発症する危険がある患者を特定できる。

【0079】

１態様では、本発明は、患者における虚血再灌流障害を診断する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１レベルを測定し；及びｉｉ）患者サンプルにおけるＡＣＹ−１レベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１レベル又はＡＣＹ−１について予め決定した対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが増大している場合に、患者が虚血再灌流障害を有していると認定する。

【0080】

更なる態様では、本発明は、移植患者における移植片機能発現遅延を診断する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１についての対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが増大している場合に、患者が移植片機能発現遅延を有していると認定する。本発明は、また、移植患者における移植片機能発現遅延を診断する方法を提供し、該方法は、ｉ）移植前の腎移植組織から採取したサンプル又は腎移植組織の潅流後の潅流体液のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）腎移植組織から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１についての対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが増大している場合に、患者が移植片機能発現遅延を有していると認定する。

【0081】

実施例に記載するように、発明者らは、虚血再灌流障害を有する患者、及び特に移植片機能発現遅延を有する患者におけるＡＣＹ−１レベルは、虚血再灌流障害を有していない患者と比較して増大することを確認した。とりわけ、発明者らは、ＡＣＹ−１レベルの増大が、移植後第１日、２日、３日及び４日において、術後の腎移植患者における移植片機能発現遅延の診断を可能にすることを確認した。

【0082】

ここに記載する予後アッセイは、患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１レベルに基づき、術後の腎移植患者についての透析管理戦略のような好適な体液管理戦略を決定するために使用される。

【0083】

１態様では、本発明は、術後の腎移植患者について体液管理戦略を決定する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１についての対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが増大している場合に、患者が、術後の腎移植患者に通常投与される液体の量と比べて低減された量の液体を必要としていると認定する、又はコントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが低下している場合に、透析することが余り必要ではないため、患者にとっては、術後の腎移植患者に通常投与される液体の量と比べて増大された量の液体がためになるであろうと認定する。

【0084】

ここで使用するように、「術後の腎移植患者についての体液管理戦略」は、患者の臨床状態／要求によって決定されるように、患者への経口又は静脈内へのいずれか又は両方による投与又は投与を控えることを言う。例えば、ＤＧＦ患者では、尿排出量は低減するか、しばしば、０となる。このような患者（排出手段を持たないもの）に多量の液体を投与することは、浮腫（肺浮腫による呼吸器合併症を含む）として証明されるように、水分過負荷を（最終的に）生ずるであろう。よって、ＤＧＦでは、低減された液体の投与（機能している移植片を有する患者について要求されるものと比べて）が好ましい。

【0085】

さらに、透析患者は、しばしば、わずかな量の尿を排出するか、全く排出しない。移植後では、患者がＤＧＦを有していなければ、このような患者は多量の尿を排出する。このような状況では、前記患者に少なくとも同等（しばしば、より多く）の液体を投与することが必要である。これに関連して、十分に液体を投与することができなければ、患者は脱水状態になり、移植片の機能に影響を及ぼす。

【0086】

移植後の患者にどれだけの液体を投与するかを決定する基準法は存在していない。個人的に、患者の尿排出量、及び臨床状態（例えば、それらを調査する肺浮腫の兆候がある）を検査することによって行われている。しかし、良好に機能している移植片では、十分な量の液体を投与することが要求される。ＤＧＦを有する移植片では、同様の量の液体を投与することは有害となりがちである。

【0087】

更なる態様では、本発明は、術後の腎移植患者について透析管理戦略を決定する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１についての対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが増大している場合に、患者が移植後１〜７日内に透析を必要としていると認定する、又はコントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルが低下している場合に、患者が移植後１〜７日内には透析を必要としないと認定する。

【0088】

ここで使用するように、「術後の腎移植患者についての透析管理戦略」とは、術後の腎移植患者が透析を必要としているかどうかの決定を言う。このような戦略は、腎移植患者において、術後毎日、更新及び評価され、体液状態、及び患者の臨床状態の他の態様とともに、高カリウム血症、血清クレアチニン及び血清尿素のような生物化学的因子に基づく。時には、透析の決定は、例えば、ＤＧＦを有する患者が過剰の液体を摂取し、肺水腫により呼吸器の合併症を発症した場合（緊急の透析が必要となりがちである）のように、迅速に行われなければならない。

【0089】

本発明は、また、患者における腎移植片の術後の臨床転帰を予測する方法を提供し、該方法は、ｉ）患者から採取したサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定し；ｉｉ）患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１のレベル又は予め決定したＡＣＹ−１についての対照レベルと対比することを含んでなり、コントロールサンプルと対比して又は予め決定した対照レベルと対比して増大している患者サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルは、前記患者の死亡フリー生存率及び／又は透析フリー生存率の増大を予知するものであるとする。

【0090】

ここで使用するように、「腎移植の術後の臨床転帰」とは、移植患者が、移植後、生存する又は透析フリーでいられる見込みを言う。転帰は、血清クレアチニンレベルを尺度としてアッセイされるが、ｅＧＦＲレベル、尿タンパクのレベル、高血圧症の有無、生存率又は透析フリー生存率の全てが、転帰の尺度として使用される。術後の臨床転帰は、移植後３か月、６か月、１２か月又は１年、２年、３年、４年又は５年の時点における転帰であってもよい。

【0091】

生物学的サンプルにおけるＡＣＹ−１ポリペプチド又は核酸分子の存在、レベル又は不存在は、患者から生物学的サンプルを採取し、該生物学的サンプルをＡＣＹ−１ポリペプチド又は核酸分子を検出することができる化合物又は試剤と接触させることによって測定される。

【0092】

ここで使用するように、用語「生物学的サンプル」及び「患者から採取したサンプル」は、患者内に存在する組織、細胞及び体液と同様に、患者から採取した組織、細胞及び体液を示すものとして交換可能で使用される。サンプルは、尿サンプル、血液サンプル、血清サンプル、痰サンプル、糞便サンプル、体組織の生検、例えば、移植した腎組織の生検、脳脊髄液サンプル、精液サンプル、又はスメアサンプルである。好適なサンプルは血清又は血漿である。或いは、サンプルは潅流液サンプルである。１具体例では、サンプルは移植前又は移植後に採取される。

【0093】

ここで使用するように、「患者」とは、個人、例えば、移植片機能発現遅延のような虚血再灌流障害を有する又は有する危険があるヒトを言う。１具体例では、患者は、心筋梗塞、卒中に罹っている又は罹ったことがある、或いは、臓器移植を受けたことがある個人である。１具体例では、患者は、腎臓、心臓、肺又は肝臓の移植患者のような、術後の臓器移植患者である。

【0094】

ここで使用するように、「術後の臓器移植患者」とは、ドナー臓器を受容した患者を言う。

【0095】

サンプルが術後の臓器移植患者からのものである場合、サンプルは、移植後第１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日の時点で患者から得られたものである。

【0096】

ここで使用するように、「ＤＣＤ」は、用語「循環死後に提供された」と交換可能で使用される。

【0097】

ここで使用するように、「ＤＢＤ」は、用語「脳死後に提供された」と交換可能で使用される。

【0098】

ＡＣＹ−１核酸分子の発現レベルは、ＡＣＹ−１核酸分子によってコードされるｍＲＮＡを測定すること；ＡＣＹ−１核酸分子によってコードされるポリペプチドの量を測定すること；又はＡＣＹ−１核酸分子によってコードされるポリペプチドの活性を測定することを含む多数の方法で測定される。

【0099】

サンプルにおけるＡＣＹ−１ｍＲＮＡのレベルを測定するために、各種の公知のｍＲＮＡ検出法が使用される。

【0100】

例えば、サンプルにおけるＡＣＹ−１核酸分子に相当するｍＲＮＡのレベルは、インサイチュ方式及びインビトロ方式の両方で検出される。ＡＣＹ−１ｍＲＮＡは、サウザン又はノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応又はプローブアレイを使用して検出される。１具体例では、サンプルを、ＡＣＹ−１核酸分子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子（すなわち、ラベル化プローブのようなプローブ）と接触させる。例えば、プローブは、配列番号１の核酸分子のような全長ＡＣＹ−１核酸分子、又は少なくとも１０個、１５個、３０個、５０個、１００個、２５０個又は５００個ヌクレオチドの長さの核酸分子のような、配列番号１の核酸分子の部分（ストリンジェントな条件下でＡＣＹ−１核酸分子とハイブリダイズする）でもよい。

【0101】

或いは、サンプルにおけるＡＣＹ−１ｍＲＮＡのレベルは、核酸増幅によって、例えば、ｒｔＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、自家持続配列複製、転写増幅、又は他の各種の核酸増幅法及び続いて、当分野において知られた技術を使用して、増幅された分子を検出することによって評価される。

【0102】

サンプルにおけるＡＣＹ−１ポリペプチドのレベルを検出するために、各種の公知のタンパク質検出法が使用される。

【0103】

一般に、タンパク質検出法は、ＡＣＹ−１ポリペプチドに選択的に結合する試剤、例えば、抗−ＡＣＹ−１抗体を患者のサンプルと接触させて、サンプルにおけるＡＣＹ−１ポリペプチドのレベルを測定することを含んでなる。好ましくは、試剤又は抗体は、例えば、検出可能なラベルにてラベル化される。好適な抗−ＡＣＹ−１抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルである。Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２のような抗体フラグメントを使用できる。

【0104】

ここで使用するように、用語「ラベル化された」とは、検出可能な物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的ラベル化とともに、検出可能な物質のプローブ又は抗体へのカップリング（すなわち、物理的結合）によるプローブ又は抗体の直接的ラベル化を言う。

【0105】

サンプルにおけるＡＣＹ−１ポリペプチドのレベルは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫沈降、免疫蛍光、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及びウエスタンブロットアッセイのような当分野において知られた技術によって測定される。ＡＣＹ−１ポリペプチドのインビボ検出について、ラベル化抗−ＡＣＹ−１抗体を患者に導入できる。このような抗体は、対象における存在及び位置が、標準的な画像技術によって検出される放射性マーカーによってラベル化される。

【0106】

サンプルにおけるＡＣＹ−１ポリペプチドのレベルは、サンプルにおけるＡＣＹ−１ポリペプチドの活性レベル測定することによっても検出される。

【0107】

本発明の方法は、さらに、患者のサンプルにおけるＡＣＹ−１の活性のレベルを、コントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１の活性レベル又はＡＣＹ−１について予め定めた対照レベルと比較することを含んでなる。

【0108】

１具体例では、本発明の方法は、コントロールサンプルを、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのようなＡＣＹ−１核酸分子を検出できる化合物又は医薬と接触させること、及びコントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１核酸分子のレベルを、患者サンプルにおけるＡＣＹ−１核酸分子のレベルと比較することを含んでなる。

【0109】

他の具体例では、さらに、本発明の方法は、コントロールサンプルを、ＡＣＹ−１ポリペプチドを検出できる化合物又は試剤と接触させること、及びコントロールサンプルにおけるＡＣＹ−１タンパク質のレベルを、テストサンプルにおけるＡＣＹ−１タンパク質の存在と比較することを含んでなる。

【0110】

ここで使用するように、「対照レベル」又は「コントロール」とは、ＡＣＹ−１発現の正常なレベルを有するサンプル、例えば、虚血再灌流障害を有していない又は有することが疑われない健常な対象からのサンプル、或いは、生物学的テストサンプルが得られた同じ対象からのサンプル、例えば、臓器移植前に得られたサンプルを言う。或いは、対照レベルは、予め定められたカットオフ値、すなわち、症状又は病気又はその欠乏を統計学的に予測する診断スコアを創成するために使用される対照データベースからのＡＣＹ−１発現レベルを含んでなるか、又は標準の母集団サンプルに基づく予め定められた対照レベル、或いは、対象の発現のベースラインレベル、すなわち、臓器移植前の対象の発現レベルに基づく予め定められた対照レベルである。

【0111】

或いは、予測は、ＡＣＹ−１の正規化された発現レベルに基づくものでもよい。発現レベルは、サンプルにおけるＡＣＹ−１の絶対発現レベルを、その発現を、恒常的に発現されるｍＲＮＡのようなマーカー（例えば、ｍＲＮＡ）ではない対照核酸の発現と比較することにより補正することによって正規化される。この正規化により、１サンプルにおける発現レベルを他のサンプルと比較すること又は異なった源からのサンプル間で比較することが可能になる。この正規化された発現は、ついで、任意に、対照レベル又はコントロールと比較される。

【0112】

例えば、尿におけるバイオマーカーを測定する際、バイオマーカーは、絶対濃度として発現されるか、或いは、尿クレアチニンレベル又は尿タンパク質レベルのような公知の尿バイオマーカーに対して正規化される。

【0113】

１具体例では、診断又は予後方法は、サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルを測定すること及び少なくとも１の更なるバイオマーカー、例えば、虚血再灌流障害又は移植片機能発現遅延を予測又は表示するバイオマーカーのレベルを測定することを含む。好ましくは、少なくとも１の更なるバイオマーカーは、ＮＧＡＬ、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１８、ＲＢＰ、ＦＡＢＰ４、シスタチンＣ及びクレアチニンから選ばれ、方法は、さらに、生物学的テストサンプルにおけるＮＧＡＬ、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１８、ＲＢＰ、ＦＡＢＰ４、シスタチンＣ及びクレアチニン核酸分子、又はポリペプチドのレベルを検出することを含んでなる。好ましくは、少なくとも１の更なるバイオマーカーのレベルは、上述の方法のいずれか１つを使用して測定される。

【0114】

少なくとも１の更なるバイオマーカーのレベルは、同じ生物学的サンプル又は異なる生物学的サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルについて測定される。

【0115】

或いは、サンプルにおけるＡＣＹ−１のレベルは、質量分析を使用して検出及び定量される。

【0116】

１態様では、本発明は、アッセイ装置、例えは、チップアレイのような、その表面にＡＣＹ−１ポリペプチド又は核酸を検出できる化合物又は試剤が付着した固体支持体を含む。好ましくは、ＡＣＹ−１ポリペプチドを検出できる化合物又は試剤は、抗−ＡＣＹ−１抗体、さらに好ましくは、ＡＣＹ−１捕捉抗体である。１具体例では、アッセイ装置は、さらに、更なるバイオマーカー、好ましくは、腎臓の損傷、疾患又は障害のためのバイオマーカーを検出するための少なくとも１の追加の化合物又は試剤を含んでなる。

【0117】

発明者らは、ＡＣＹ−１を、虚血再灌流障害又はＤＧＦのマーカーとして同定した。本発明の方法は、当業者がＡＣＹ−１レベルに基づき知らされた治療を決定することを可能にする。例えば、ここに記載の診断及び予後方法は、さらに、診断及び予後に基づき患者又は臓器を治療する工程を含んでなる。患者又は臓器を治療する工程は、ｉ）移植後、患者を透析処置する、例えば、腎移植後第１週に患者を透析処置する工程；ｉｉ）患者に静脈注射を投与する、例えば、投与される静脈注射を調整する（すなわち、患者に投与されるＩＶＩ流体の速度及び容量を増減する）工程；ｉｉｉ）患者に免疫抑制剤（例えば、カルシニューリン阻害剤又はシロリムスのようなＴＯＲ阻害剤）を投与する、例えば、ＡＣＹ−１レベルに基づいて免疫抑制剤を増減する又は免疫抑制治療の種類を変更する工程から選ばれる（これらは例示を目的とするものである）。

【0118】

加えて、腎移植後の初期期間におけるＡＣＹ−１の測定は、ＤＧＦを寛解させるように各種の可能性のある介入をガイドするために使用される。

【0119】

キット
本発明は、生物学的サンプルにおけるＡＣＹ−１の存在を検出するためのキットも含む。例えば、キットは、生物学的サンプルにおけるＡＣＹ−１ポリペプチド又は核酸を検出できる化合物又は試剤を含む。化合物又は試剤は、好適な容器に梱包される。キットは、さらに、ＡＣＹ−１タンパク質又は核酸分子を検出するためにキットを使用するための説明書を含んでなる。

【0120】

１態様では、本発明は、患者における虚血再灌流障害を診断する又は移植片機能発現遅延を診断するためのキットを提供し、該キットは、ＡＣＹ−１ポリペプチドに特異的に結合する検出可能にラベル化された試剤又はＡＣＹ−１核酸に特異的に結合する検出可能にラベル化された試剤；及びｉｉ）診断を実施するための試薬を含んでなる。

【0121】

試剤は抗体又は核酸分子である。

【0122】

抗体系キットについて、該キットは、（１）本発明のマーカーに相当するＡＣＹ−１ポリペプチドに特異的に結合する第１の抗体（例えば、固体支持体に付着している）；及び任意に、（２）ＡＣＹ−１ポリペプチド又は第１の抗−ＡＣＹ−１抗体に結合し、検出可能な試剤に共役した第２の異なる抗体を含むことができる。

【0123】

オリゴヌクレオチド系キットについては、該キットは、（１）ＡＣＹ−１核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチドプローブ、例えば、検出可能にラベル化されたプライマー又は（２）ＡＣＹ−１核酸分子を増幅するためのプライマー対を含むことができる。

【0124】

１態様では、本発明は、患者における虚血再灌流障害又は移植片機能発現遅延を診断するためのキットを提供し、該キットは、本発明のマーカーに相当するＡＣＹ−１ポリペプチドに特異的に結合する第１の抗体（例えば、固体支持体に付着されている）；及び（２）ＡＣＹ−１ポリペプチド又は第１の抗−ＡＣＹ−１抗体に結合し、検出可能な試剤に共役した第２の異なる抗体を含んでなるアッセイ装置を含んでなる。

【0125】

キットは、検出可能な試剤を検出するために必要な成分（例えば、酵素又は基質）も含むことができる。キットは、アッセイされ、収容されたテストサンプルと比較されるコントロールサンプル又は一連のコントロールサンプルを含有することもできる。

【0126】

この明細書の記載及び請求の範囲を通して、用語「含んでなる」及び「含有する」及びこれらの変形は、「含むが、これらに限定されない」を意味するものであり、他の部分、添加剤、成分、整数又は工程を除外することを意図するものではない（意図しない）。この明細書の記載及び請求の範囲を通して、単数形は、他に前後関係が要求しない限り、複数形を含むものである。特に、不定冠詞が使用される場合、明細書は、他に前後関係が要求しない限り、単数形とともに、複数形を含むものとして理解されなければならない。

【0127】

本発明の特別な態様、具体例又は実施例に関連して記載する特徴、整数、特性、化合物、化学部分又は基は、矛盾しない限り、ここに記載のいかなる他の態様、具体例又は実施例にも適用可能であると理解されなければならない。この明細書（添付する請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示する特徴の全て、及び／又は開示するいかなる方法又はプロセスの工程の全ては、このような特徴及び／又は工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、いかなる組み合わせとしても組み合わされる。本発明は、いかなる上述の具体例の詳細にも限定されない。本発明は、この明細書（添付の請求の範囲、要約及び図面）に開示する特徴のいずれかの新規な１つ、又はいずれかの新規な組み合わせに、又はここに開示されたいかなる方法又はプロセスの工程のいずれかの新規な１つ、又はいずれかの新規な組み合わせに拡張される。

【0128】

読者は、本願に関連してこの明細書と同時に又は以前に出願され、この明細書とともに公開された全ての論文及び文献の全てに注目されたい。このような全ての論文及び文献の内容を、参照して、ここに組み込む。

【0129】

［実施例］
１． 方法
１．１ 患者群及び研究デザイン
腎移植を受ける前に、患者の承諾を得た（図１）。将来を見越して移植前に、及び移植後に、長期的に１週当たり少なくとも３回、静脈血を採取した（平均１４サンプル／患者）。Ｚ／Ｓｅｒｕｍ Ｃｌｏｔ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｔｕｂｅｓ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）（２５℃において２０００ｇで１０分間遠心分離する前に、室温において４５分から２時間凝固させ、血清を分取し、−８０℃で保存することを可能にする）を使用して、血液を集めた。患者コホート１は、２００８年９月〜２０１１年７月の期間に集めた患者５５人を含み（サンプル６６５個；腎移植患者４７人及び生体ドナー８人）、そのうちの１５人はＤＧＦを有し（単独の高カリウム血症のため以外に、腎移植後第１週において透析を必要とするとの定義に基づく）、及びコホート２は、２００３年１２月〜２００６年３月の期間に集めた患者１９４人（第１日のサンプル１３８個及び第３日のサンプル１７７個）を含み、その内の５５人はＤＧＦを有していた。できる限り臨床的にマッチする、コホート１におけるＤＧＦを有する患者５人及び合併症のない患者５人からの血清サンプル、移植前及び移植後第２日の時点で採取した比較用サンプル（サンプル計２０個）を使用して初期バイオマーカーの発見を実施した。ついで、初めにコホート１からのサンプル、続いてコホート２からのサンプルを使用して（数は統計的検出力に基づき決定される）、初期知見の検証に着手した。例えば、ＤＧＦ患者１０人及び非ＤＧＦ患者２５人の第１／２日におけるＡＣＹ−１測定は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法が、２群比較について、５％有意性検定を補正する際にＡＵＣ＞０．８を検出するために、検定力８０％を与える。

【0130】

１．２ 血清の免疫除去及びサンプルの調製
発見セットにおける血清サンプル２０個を、既に記載されたように²¹、Ｍｕｌｔｉ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ １４ カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、免疫除去に供した。免疫除去されたフラクションを脱塩し、得られた物質を、フィルター−補助サンプル調製法（ＦＡＳＰ）⁹の変法²¹を使用して、トリプシンにて消化した。

【0131】

１．３ ラベルフリー質量分析
０．１％ＴＦＡの最終濃度への酸性化の後、ペプチドサンプルを患者によってブロックランダム化し、Ｐｒｏｘｅｏｎナノエレクトロスプレイイオン源を備えたＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ質量分析計に接続したＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏシステムを使用して分析した（サンプル当たり３×２μｇ注入）。３．５μｍ Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８媒体が充填されたインハウス２５ｍｍキャピラリーエミッターカラムに、サンプルを直接注入した。総捕捉時間は３００分であり、勾配の大部分は、流速０．４μｌ／分において、０．１％ギ酸中ＡＣＮ３〜２５％であった。サーベイＭＳスキャンは、６０，０００にセットされた解像度のＯｒｂｉｔｒａｐ内で獲得された。スキャン当たり最強イオン２０個以下を断片化し、リニアトラップにおいて分析した。

【0132】

１．４ データの解析及び統計学的方法
ＭａｘＱｕａｎｔ（ｖ１．１．１．２５）⁵¹を使用して、ラベルフリー質量分析データの解析を行った。Ａｎｄｒｏｍｅｄａ⁵²及び≧２ペプチドの判定基準を有するＩＰＩヒトデータベース（ｖ３．７５，１９／０８／２０１０）を使用してタンパク質を同定し、及びＤｅｃｏｙデータベースから同定したタンパク質及び公知の混入物を除去した。ＬＦＱ強度に関するノンパラメトリック（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）有意性検定を使用して、患者群間及び患者群内の示差的発現をアッセイした。ｑ値法⁵³を使用して偽発見率を推定した。

【0133】

検証テストでは、血清ＡＣＹ−１及び他のマーカー⁵⁴の予知能力をアッセイするために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。受信者動作特性曲線下の面積（ＡＵＣ）を見積もり、９５％ＣＩｓがブートストラップリサンプルから推定された。ブートストラップ有意性検定を使用して、ＡＵＣを、標準の近似を使用してアッセイしたブートストラップＡＵＣ間の差異の有意性を比較した。突出した予測変数を含有するモデルにおけるＤＧＦに関するＡＣＹ−１の非依存性予知能力をアッセイするために、多変量ロジスティクス回帰分析を使用した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰、カプラン・マイヤー生存時間関数及びロングランク検定を使用して、ＡＣＹ−１及び他のマーカーの濃度と透析フリー生存率との関係を査定した。全ての統計学的検定は両側性であり、全ての分析を、統計学的計算のためのＲ環境で行った（Ｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ，ウィーン、オーストリア）。

【0134】

１．５ 他の分析物との比較
血清クレアチニン、ＣＰＲ、タクロリムス、及び尿タンパク質／クレアチニン比を、臨床プロトコル／指示通りに測定し、さらに、血清クレアチニン及びシスタチンＣを、研究で使用した同じ時点で、コホート１において測定した。

【0135】

１．６ ＥＬＩＳＡ展開
両コホートにおける血清サンプル９８０個について、サンプルをブロックランダム化し、インハウス開発したサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、ＡＣＹ−１濃度を測定した。手短に言えば、９６穴Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ロチェスター，ニューヨーク州）を、ラット抗−ヒトＡＣＹ−１モノクローナル抗体（クローン４７５６２６；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネアポリス）及びＡＣＹ−１標準（０．３１−１５．０ｎｇ／ｍＬ，Ｈｉｓタグ組み換えＡＣＹ−１−Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）にて被覆し、希釈したサンプルを塗布した。２時間のインキュベートの後、ヤギ抗−ＡＣＹ−１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、続いて、連続して、ビオチン化ウサギ抗−ヤギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；プール，英国）、ストレプトアビジン−ＨＲＰ及びテトラメチルベンズアジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、結合したＡＣＹ−１を検出した。２Ｎ硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した後、４５０ｎｍ（５７０ｎｍにて補正）において吸光度を測定し、ＡＣＹ−１濃度を算定した。

【0136】

２． 結果
２．１ 患者群
患者群の検査（表１）は、ＤＣＤ移植片の割合及び誘導レジメン（診療の変更を招く）を除き、コホート１（発見及び初期検証群）及び２（長期間転帰データを有するより大きい検証群）の同様の特性を示す。コホート１における患者の３１．９％及びコホート２における患者の２８．４％においてＤＧＦと診断された。平均年齢及び冷虚血時間（ＣＩＴ）は、各コホートにおいてＤＧＦ群において有意に高く、温虚血時間（ＷＩＴ）はコホート２において同様であった。初期プロテオミック発見のための使用したＤＧＦ患者５人及び非ＤＧＦ患者５人は、ＣＮＩ毒性又は急性拒絶反応の証拠を有しておらず、平均年齢、民族性ミックス、ＣＩＴ、ＷＩＴ、Ａ、Ｂ及びＤＲ坐位における平均ＨＬＡミスマッチ、及び免疫抑制レジメン、ドナータイプにおけるわずかな相違（非ＤＧＦ群においてＤＣＤ３人／ＤＢＤ２人と比べて、ＤＧＦ群ではＤＣＤ５人）の点では、極めて密接にマッチしていた。初期発見セットにおいて使用した患者１０人をコホート１から抽出した。ＤＧＦ５人及び非ＤＧＦ５人は、平均年齢、民族性ミックス、ＣＩＴ、ＷＩＴ、Ａ、Ｂ及びＤＲ坐位における平均ＨＬＡミスマッチ、誘導及び維持免疫抑制レジメンの点では同様であり、ＣＮＩ毒性又は急性拒絶反応の証拠を有している患者はいない。

【0137】

２．２ 質量分析及び候補バイオマーカーの選択
初期質量分析スクリーンのために使用したサンプル２０個（患者１０人、２つの時点）の中で、少なくとも２つのペプチド（その内の少なくとも１つは独特である）を有する患者５５３人が特定され、相対量を測定した。統計学的有意性（ｐ＜０．０５）に基づき、３４個の候補（原理証明としてシスタチンＣを含む）が、術前、術後又は変化パターンによって、ＤＧＦ群及び非ＤＧＦ群の間を区別した。アミノアシラーゼ−１は、全ての患者において術前では検出不能であるが、術後では、特にＤＧＦ群において顕著に増加したため（図２ａ）、優先的に更なる調査に供した。

【0138】

２．３ コホート１におけるＡＣＹ−１の血清濃度及び臨床事象との関係
発明者らが新たに開発し、検証したインハウスＥＬＩＳＡを使用することにより、血清ＡＣＹ−１に関するデータは、発見サンプルに関する質量分析データを広く支持した（図２）。ＡＣＹ−１は、このセットにおける移植前のサンプル全てにおいて検出不能であり（＜１５．６ｎｇ／ｍＬ）、全体としてコホート１では、患者４７人中の４３人が術前で検出不能のＡＣＹ−１を有し、残りは＜５０ｎｇ／ｍＬであり、移植前におけるＤＧＦ群及び非ＤＧＦ群の間の有意差はなかった。分析した長期的サンプル６３６個の内、ＡＣＹ−１は、２３０個のサンプル、主に、移植後第５日のサンプルにおいてのみ検出された。全体的には、ＤＧＦ患者における長期的サンプル２０７個の内の１３８個が検出のＡＣＹ−１を有しており、これらの大部分は移植前及び移植後第５日より前のものである。非ＤＧＦ群では、長期的サンプル４２９個の内の２６８個がＡＣＹ−１の検出不能の濃度を有していた。同様に、肝臓ドナーは、術後では、ＡＣＹ−１濃度＞５０ｎｇ／ｍＬを示すものはおらず、術後サンプルの大部分（１０／１２）は検出不能のＡＣＹ−１濃度を有していた。

【0139】

異なった臨床経過を有する血清ＡＣＹ−１プロフィールの例を図３に示す。ＤＧＦを有する患者１５人の内の１０人において、移植後第４日以降の時点で、ＡＣＹ−１濃度＞２００ｎｇ／ｍＬにおけるピークが観察されたが、非ＤＧＦ移植片では６／３２（１８．８％）のみであり、この内の３人は移植直後に、無併発性の臨床経過を有していた。ＡＣＹ−１濃度の長期プロフィールは、血清クレアチニン、シスタチンＣ、ＣＲＰ、タクロリムス又は尿ＰＣＲのいずれかにおいて見られる傾向に従っておらず、ただし、非常に高いタクロリムス濃度（トラフレベル３３ｎｇ／ｍＬ、意図する範囲９〜１４ｎｇ／ｍＬ）によるタクロリムス毒性に罹った患者１人においてＡＣＹ−１のピークが認められた。重要なことに、生検前４日間ＡＣＹ−１濃度が２６０ｎｇ／ｍＬでビークを示したが、生検の時点では検出不能となった患者１人を除き、陽性の中流尿培養（ｎ＝１９；ＡＣＹ−１＜１５．６〜８８．３ｎｇ／ｍＬ）、術後透析のエピソードの時点、又は生検によって証明された拒絶反応の時点では、患者における血清ＡＣＹ−１における明瞭なピークは存在しなかった。

【0140】

２．４ コホート１と比較したコホート２における移植後のＡＣＹ−１の血清濃度
コホート２（より大きい最終検証セット）では、第１日サンプル１３８個の内、患者３０人が検出不能のＡＣＹ−１濃度を有し（ＤＧＦ患者４／４２（９．５％）、非ＤＧＦ２６／９６（２７．１％））、第３日の値について同様のパターンが認められた（それぞれ、１８．８％対４２．６％）。両コホートにおいて、第１日の濃度は、オーバーラップするものの、ＤＧＦ群及び非ＤＧＦ群の間で顕著に異なっていた（図４ａ、ｂ）。より大きいコホート２からの非ＤＧＦ患者を、クレアチニン減少比（ＣＲＲ＝（０日のクレアチニン−第７日のクレアチニン）／０日のクレアチニン）に基づいてカテゴリーに分類する場合、緩慢な移植片機能発現（ＳＧＦ；ＣＲＲ＜０．７）として分類される患者及び早期移植片機能発現（ＩＧＦ；ＣＲＲ≧０．７）として分類される患者の間における第１日の血清ＡＣＹ−１における顕著な差異（図４ｃ）は、ＩＧＦからＳＧＦ、ＤＧＦへの増大傾向とともに認められ、これは移植片機能の改善率及びＡＣＹ−１の関係を証明している。第３日の血清ＡＣＹ−１濃度についても、同様に結果が認められた。

【0141】

２．５ 血清ＡＣＹ−１の関連性及びＤＧＦに関する予知の有用性
コホート１における予知の有用性の初期探索検査のために、第１日又は第２日のＡＣＹ−１濃度及びシスタチンＣ濃度を、第３日又は第４日のもののように、１つの時点として組み合わせた（それぞれについてｎ＝３５、患者２４人は両時点におけるサンプルを有する）。コホート１では、ＤＧＦを予測する第１／２日のＡＣＹ−１についての受信者動作特性曲線下の面積（ＡＵＣ）は０．７４であり、これは、それぞれ、０．７９及び０．９２のクレアチニン及びシスタチンＣについての数値に相当する。組み合わされたＡＣＹ−１及びシスタチンＣは、ＡＵＣを０．９４にわずかに改善した（図５ａ）。コホート２では、第１日のＡＣＹ−１についてのＡＵＣは０．７７であり、それぞれ、０．７５及び０．９のクレアチニン及びシスタチンＣについての数値に相当し、後者は、ＡＣＹ−１と組み合わされる場合、０．９３に改善した（図５ｂ）。クレアチニンについてのＡＵＣは、より遅い時点では、より高いが（図５ｃ、ｄ）、コホート１及び２における第３／４日及び第３日の値については、同様の結果が見られた。コホート２（表２）における第１日の血清ＡＣＹ−１及びシスタチンＣについてのデータ誘導最適カットポイントは、それぞれ、高い特異性及び感度を示し、ロジスティクス回帰を介する両方の組み合わせからの最適カットポイントは、増大したＹｏｕｄｅｎインデックス⁵⁶を介して明らかなように、より高い感度及び同様の特異性を提供する（０．７１対０．４３及び０．６４）（表２）。

【0142】

より大きい最終検証コホート２を使用することによって、血清ＡＣＹ−１濃度と、生検によって証明された急性尿細管壊死（ＡＴＮ）、移植片のタイプ、移植時の年齢、ＣＩＴ、総ＷＩＴ、第１日の血清クレアチニン及びシスタチンＣとの顕著な関連性が観察された（表３）。単変量解析では、第１日及び第３日の血清ＡＣＹ−１濃度、シスタチンＣ濃度及びクレアチニン濃度、移植片のタイプ、ＷＩＴ及び総ＨＬＡミスマッチは、全て、ＤＧＦの発生と顕著に関連していた（表４）。ＤＧＦの予知に関する多変量ロジスティクス回帰モデルが、第１日の血清ＡＣＹ−１濃度、クレアチニン濃度及びシスタチンＣ濃度、患者の年齢及び性別、移植片のタイプ（ＤＢＤ，ＤＣＤ）、ＨＬＡミスマッチ、ＣＩＴ、ＷＩＴ及び初期ステロイドの使用を組み込んで開発された。第１日の血清ＡＣＹ−１は、尤度比検定（ＬＲＴ ｐ＝０．０１３；別表４）を使用する際に重要であり、減少する場合、単変量解析と比べて高いオッズ比を維持した。シスタチンＣは、このモデルにおけるＤＧＦの唯一の他の独立した予測因子である（ｐ＜０．０００１）。

【0143】

この完全な多変量モデル（新しいモデル）及びＡＣＹ−１なしのモデル（対照モデル）に関するリスクアセスメントプロットを、ＤＧＦを有する又はＤＧＦなしの患者について、図８に示す。モデルは適合度の証拠を示さないし（別表１）、ブートストラップＣＩｓ（ｐ＝０．３４５）から予想されるように、ＡＵＣは顕著には異ならない。ＤＧＦを有していな患者（患者の４７．４％（９５％ＣＩ ２４．５〜７０．２％）が新しいモデルに従って低減されたリスクを有する）にとっては、最大の予測的利益である（表２における高ＮＰＶと一致する）。ＤＧＦを有する患者にとってもリスクの低減があり、この結果、０を含むＣＩを有する全体の総再分類改善度（ＮＲＩ）が生じた。ＤＧＦを有していない患者に関する統合判別改善度（ＩＤＩ）も０．０１９６（９５％ＣＩ ０．００４〜０．０３６）に低減し、さらに、これはＡＣＹ−１の陰性的中率の増大を証明する。

【0144】

２．６ 血清ＡＣＹ−１及び転帰
移植後第１日の血清ＡＣＹ−１濃度は、ＤＧＦの長さ、血清クレアチニン、ｅＧＦＲ（修飾ＭＤＲＤ）、及び１年時点におけるｕＰＣＲ（コホート１及び２）との相関を示さなかった。コホート２における長期間の追跡データの同様の解析は、移植後第１日のＡＣＹ−１濃度と全体の又は透析フリー生存率との間の有意な関連性を示さなかった。

【0145】

ＤＧＦとのＡＣＹ−１の有意な関連性及びＤＧＦを有するＤＢＤ及びＤＣＤ移植片タイプの両方において見られる血清濃度の有意な増大（図９）を考えて、ＤＧＦ群のみを使用する（ｎ＝５４）サブグループ解析を行ったところ、ＤＧＦ患者において、第１／３日（第１日の値が利用できできなければ第３日）の血清ＡＣＹ−１と透析フリー生存率との関連性を示した（第１日のＨＲ＝０．９９３，９５％ＣＩ（０．９８８、０．９９９），ｐ＝０．０１７４）。ＨＲｓ＜１を反映させると、生存曲線は、ＤＧＦを有する患者において第１／３日の血清ＡＣＹ−１と、移植から５年内に透析に戻る危険（非ＤＧＦ群では見られなかった）との間に顕著な負の関連性（ｐ＜０．００１）を示した（図１０ａ，ｂ）。移植後第１日の血清ＡＣＹ−１濃度に基づき、ＤＧＦを有する患者を２つの群にサブ分割して、より小さいサイズの群を作成し、事象の数は小さい（ｎ＝１０透析に戻る）が、差異は著しいままであった。ＤＧＦに至る患者における血清シスタチンＣ又はクレアチニンについて、転帰との同様の関連性は観察されなかった。正式の多変量解析は、少ない事象の数及び変量の数を考えると、統計学的には有効ではなかったが、臨床データの広範囲な検討では、ＤＧＦ患者の高及び低ＡＣＹ−１サブグループの間で異なる因子（可及的にドナータイプを除く転帰における差異にリンクする）が検出されなかった。ＤＧＦ患者のみの中では、９／１０の事象を説明するＤＢＤタイプの移植片とともに、透析フリー生存率における明白な差異が見られ（図１０ｃ、ｄ）、ＤＧＦ群におけるＤＢＤタイプ移植患者内では、移植後第１／３日のＡＣＹ−１血清濃度に基づく転帰における明瞭な差異が見られた（図１０ｅ）。

【0146】

コホート１におけるＤＧＦを有する患者１５人の遡及的解析も、転帰とのＡＣＹ−１の関連性を示唆した。移植失敗及び透析への戻りは何ら生じなかったが、３人の患者が、ｅＧＦＲ１０．０８、１６．１及び１３．６で、移植片が不全へ進行しつつあることが明らかになった。これらを転帰不良群と定義し、転帰及びＡＣＹ−１によって患者を分類する分割表を作成する場合（別表２）、有意の関連性（ｐ＝０．０５６）の証拠は見られなかった。しかし、ＡＣＹ−１≧２００については、転帰不良のオッズは１：８であり、一方、ＡＣＹ−１＜２００の場合は、転帰不良のオッズは２：３である。条件的なＭＬＥは０．２１５と算定され（９５％０．００３〜５．５４５）（これは、コホート２において見られるものと類似する転帰との関連性を示唆する）及び有意のテスト結果の欠落は、恐らく、小さいサンプルにおける低い能力及びより限られた追跡時間の量の組み合わせによるものである。

【0147】

２．７ 総括論議
いくつかの研究では、ＤＣＤドナータイプのＤＧＦのより高い頻度が報告されているが、ドナータイプの重要な調査では、長期間の温虚血にもかかわらず、ＤＣＤ移植片レシピエントにおいては、転帰に対するＤＧＦの影響はない^57-59が、ＤＢＤ患者においては、転帰に対してＤＧＦの有害な影響があることが確認されている^59,60。動物モデルからは、カテコールアミン分泌及び低血圧のような脳死の大きいシステム効果、及び続く、ドナー臓器における炎症誘発メディエーター／サイトカインの活性化（ついで、移植に至る更なる宿主応答を誘発する）が提起された⁶¹。異なったドナータイプを有するＤＧＦの要因である根底にある異なった病理が、既存条件又は前終端条件（ＤＣＤドナーにおいて遭遇するＡＴＮ（温虚血に至る）よりも、ＤＢＤ臓器によるより少ない可逆変化を生ずる）の可能性とともに考察された。これは、移植直後のより低いＡＣＹ−１濃度を有するＤＢＤドナータイプ移植患者のサブグループにおいて見られるように、ＡＣＹ−１は、本質的に、乏しい転帰を有するより低い応答を示す患者による損傷の修復又は応答のマーカーであるとの当該知見と合致する。

【0148】

腎移植を必要とする末期の腎臓疾患を有する患者の数が増加するにつれて、循環死後に提供された（ＤＣＤ）臓器及び境界領域ドナーからの臓器の使用が拡大している。しかし、これは、臨床転帰及び医療経済学的転帰に重大な影響を有する初期非機能性又は移植片機能発現遅延のような合併症のより高い発生率と関連する。このようなドナーからの著しい数の移植片が、質が不十分であるとの認定のために、移植以前に廃棄（回収に至る）される。廃棄についての判断は、多くは、主観的評価及び臨床経験に基づくものであり、より客観的な尺度が必要である。減少するドナー（脳死ドナー（ＤＢＤ）及びＤＣＤの両方）からの腎臓は、摘出前に、その場で、冷たい保全溶液にてフラッシュされ、保存容器内において氷上に保存される。４〜１２時間の腎動脈を通る保存液の再循環を伴う体温低下装置による潅流は、ますます使用されるようになっており、証拠は相克的であるが、良好な転帰を生ずることが報告されている。流れ抵抗のような潅流動力学及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、及び心臓由来脂肪酸結合タンパク質のような因子の潅流液濃度の尺度が、移植片のバイアビリティーの強力な指標として検討されているが、研究は少なく、このようなマーカーは転帰の信頼できる予知であることは明らかになってはいない。

【0149】

予備調査結果は、ＡＣＹ−１が、移植後の血清において検出可能であり及び特にＤＧＦを有する幾人かの患者に関連することに加えて、移植以前に、腎臓からの機械的潅流液において測定されることを示している。予備調査結果は、血清における濃度と同様の濃度を示し、ＤＢＤ移植片よりもＤＣＤ移植片において潜在的に高いレベルであることを示している。従って、これは、移植における臓器の使用前に、潅流液においてＡＣＹ−１を測定できる可能性を提供し、他のマーカーと一緒に、移植片の質及び／又は移植の転帰を測定することにおいて重要である損傷／修復プロセスのいくつかの表示を提供できる。

【0150】

ＡＣＹ−１に加えて、ＡＣＹ−２及びＡＣＹ−３に由来する、トリプシン消化物潅流液の質量分析におけるペプチドの知見は、これらＡＣＹ−２及びＡＣＹ−３も潜在的なバイオマーカーとして価値があることを意味する。

【0151】

【表1-1】

【表1-2】

【0152】

【表2】

【0153】

【表3】

【0154】

【表4-1】

【表4-2】

【0155】

３． 心臓サンプル及び肺サンプルにおける血清ＡＣＹ−１レベル
心臓又は肺移植に至る患者において、血清アミノアシラーゼ−１が、術後の各種の時間間隔で、多くの患者（ただし、全てではない）において上昇すること（少なくとも３人の患者では、レベルは、非常に顕著に上昇している）が観察された（表５及び６）。これは、転帰に関する有意性はこれまで明白でなく、更なる長期間の研究を必要とするが、このような患者における有意な虚血時間により、移植組織において、虚血再灌流障害のような特定の損傷を表示できる。

【0156】

【表5】

【0157】

【表6】

【0158】

【表7】

【0159】

【表8】

【0160】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]