特許 6286571 Ｌ−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物、及びそれを利用したＬ−リジン生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6286571

(24)【登録日】2018年2月9日

(45)【発行日】2018年2月28日

(54)【発明の名称】Ｌ−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物、及びそれを利用したＬ−リジン生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20180215BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180215BHJP

   C12P 13/08 20060101ALI20180215BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12N15/00 A

   C12P13/08 A

【請求項の数】4

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2016-550437(P2016-550437)

(86)(22)【出願日】2014年9月25日

(65)【公表番号】特表2016-533771(P2016-533771A)

(43)【公表日】2016年11月4日

(86)【国際出願番号】KR2014008932

(87)【国際公開番号】WO2015064917

(87)【国際公開日】20150507

【審査請求日】2016年4月25日

(31)【優先権主張番号】10-2013-0128634

(32)【優先日】2013年10月28日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM11347P

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM11430P

(73)【特許権者】

【識別番号】513178894

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(74)【代理人】

【識別番号】100169971

【弁理士】

【氏名又は名称】菊田 尚子

(74)【代理人】

【識別番号】100169579

【弁理士】

【氏名又は名称】村林 望

(72)【発明者】

【氏名】パーク，サン ヘー

(72)【発明者】

【氏名】ムーン，ジュン オク

(72)【発明者】

【氏名】ベ，ヒュン ウォン

(72)【発明者】

【氏名】リー，クワン ホー

【審査官】 北田 祐介

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−１９１３７０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １３／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチドの発現が強化された、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。

【請求項2】

前記発現強化は、コピー数増加、発現調節配列の操作、またはその組み合わせによるものであることを特徴とする請求項１に記載の微生物。

【請求項3】

前記微生物は、コリネバクテリウムグルタミクムであることを特徴とする請求項１に記載の微生物。

【請求項4】

培地において請求項１に記載の微生物を培養する段階と、
前記微生物または前記培地中のＬ−リジンを得る段階と、
を含む、Ｌ−リジンを生産する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌ−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物、及びそれを利用したＬ−リジン生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ−リジンは、必須アミノ酸の一種であり、飼料、医薬品及び食品などの分野に使用されている。Ｌ−リジンは、主に、大腸菌やコリネバクテリウムなど微生物を利用した直接発酵法によって生産されているために、収率などが向上した生産菌株の開発または発酵工程の改善によるＬ−リジンの生産性向上は、大きい経済的効果をもたらす。

【0003】

リシンの生産効率を改善させるための方法として、リシン生合成経路上の遺伝子を増幅させたり、遺伝子のプローモーターを変形させたりして、生合成経路上の酵素活性を増大させる方法が利用されてきた。また、生合成経路関連遺伝子以外にも、リシンの生産能を高めるための遺伝子の探索は、続けてなされてきた。

【0004】

本発明者らは、リシン生産能と係わる形質を探索するために、コリネバクテリウムグルタミクムの野生型ＤＮＡライブラリーの作成及び探索を試みた。その結果、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子の発現が強化される場合、リシンを効率的に生産することができるということを確認することにより、本発明を完成した。これまで、コリネバクテリウム由来ＮＣｇｌ０８６２を追加して導入してＬ−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物については、報告されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチドの発現が強化されたコリネバクテリウム属微生物を提供するものである。

【0006】

本発明は、前記微生物を利用してＬ−リジンを生産する方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明が解決しようとする課題は、コリネバクテリウムグルタミクムのＮＣｇｌ０８６２遺伝子が過発現されるように変形された、Ｌ−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物、及びそれを利用したＬ−リジン生産方法を提供することである。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチドの発現が強化された、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
（２）前記発現強化は、コピー数増加、発現調節配列の操作、またはその組み合わせによるものであることを特徴とする（１）に記載の微生物。
（３）前記微生物は、コリネバクテリウムグルタミクムであることを特徴とする（１）に記載の微生物。
（４）（１）に記載の微生物を培養する段階と、培養物中のＬ−リジンを得る段階と、を含むＬ−リジンを生産する方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明の一様相による微生物を利用して、Ｌ−リジンの生産を増加させることができる。

【0009】

本発明の他の様相によるＬ−リジンを生産する方法を利用して、Ｌ−リジンの生産を増加させることができる。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明の一様相は、配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするポリヌクレオチドの発現が強化されたコリネバクテリウム属微生物を提供するものである。

【0012】

前記ポリヌクレオチドの発現量強化は、発現調節配列の置換、または突然変異による変形；ポリヌクレオチド配列自体の変異導入；開始コドンの交替；染色体への挿入、またはベクターを介する導入によるコピー数増加；あるいはその組み合わせによるものでもある。

【0013】

前記ポリヌクレオチドの発現調節配列は、変形されたものでもある。前記発現調節配列は、それと作動自在に連結されたポリヌクレオチドの発現を調節する配列であり、例えば、プローモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサー、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列などが含まれてもよい。前記ポリヌクレオチドは、開始コドンが交替されたものでもある。前記開始コドンは、ＴＴＧあるいはＧＴＧからなる開始コドンをＡＴＧで置換することにより、当該遺伝子の酵素活性を増大させたものでもある。前記ポリヌクレオチドは、染色体内の特定位置に挿入されることにより、コピー数が増加されたものでもある。前記特定位置は、例えば、トランスポゾンまたはイントゼニック（intergenic）部位などを含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、発現ベクター内に挿入され、その発現ベクターを宿主細胞内で導入することにより、コピー数が増加されたものでもある。

【0014】

前記ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２のヌクレオシド配列を有するものでもある。

【0015】

本発明において用語「作動自在に連結された」は、前記調節配列と前記ポリヌクレオチド配列との機能的な結合を意味し、それによって、前記調節配列は、前記ポリヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を調節することになる。前記調節配列は、前記ポリヌクレオチドの発現量を増加させることができる強力なプローモーターでもある。前記調節配列は、コリネバクテリウム属、または他の微生物に由来したプローモーターでもある。前記プローモーターは、例えば、ｔｒｃプローモーター、ｇａｐプローモーター、ｔａｃプローモーター、Ｔ７プローモーター、ｌａｃプローモーター、ｔｒｐプローモーター、ａｒａＢＡＤプローモーターまたはｃｊ７プローモーターでもある。前記調節配列は、例えば、コリネバクテリウム属微生物において、リシン生合成経路上の主要遺伝子のプローモーター配列を、さらに高いプローモーター活性を有するように変形させたものでもある。前記調節配列は、例えば、ｌｙｓＣＰ１プローモーターでもある。「ｌｙｓＣＰ１プローモーター」は、アスパラギン酸キナーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコーディングする遺伝子のプローモーター部位において、塩基配列を置換することにより、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子の発現量増加を介して、前記酵素の活性を野生型対比で、約５倍ほど向上させた強力なプローモーターを意味する（大韓民国登録特許第１０−０９３０２０３号）。

【0016】

本発明において用語「ベクター」は、適切な宿主内において、目的遺伝子を発現させることができるように、遺伝子の調節配列と塩基配列とを含むポリヌクレオチド製造物を意味する。あるいは、宿主細胞内に導入させ、宿主のゲノム上の内生的（endogenous）遺伝子の調節配列を変えたり、ゲノム上の特定部位に発現自在な目的遺伝子を挿入したりすることができるように、相同組み換えが自在な塩基配列を含むポリヌクレオチド製造物を意味する。従って、本発明のベクターは、宿主内への導入いかんあるいは染色体挿入いかんを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよいが、選別マーカーは、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤による耐性、または表面タンパク質の発現のような選択自在な表現型を付与するマーカーが使用される。選択剤が処理された環境においては、選別マーカーを発現する細胞だけ生存するか、他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。

【0017】

本発明において使用されるベクターは、大腸菌及びコリネ型細菌において、双方向に自家複製が可能なｐＥＣＣＧ１２２ベクター（大韓民国登録特許第１０−００５７６８４号）または宿主細胞に形質転換され、目的タンパク質を暗号化する遺伝子を、宿主細胞内の染色体内に挿入させることができるベクターであり、コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）内において複製されないｐＤＺベクター（大韓民国登録特許第１０−０９２４０６５号）を、例として挙げることができる。また、ｐＤＺベクターから由来したベクターとして、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体内トランスポゾン部位遺伝子を挿入させることができるｐＤＺＴｎ（大韓民国登録特許第１０−１１２６０４１号）を、例として挙げることができるが、それらに限定されるものではない。

【0018】

本発明において用語「形質転換」は、ポリヌクレオチドを宿主に導入し、ポリヌクレオチドがゲノム外因子として、またはゲノムに挿入されることにより、複製自在になることを意味する。本発明のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入する方法も含まれ、宿主によって、当分野で公知されているように、電気パルス法によって遂行することができる。

【0019】

前記コリネバクテリウム属微生物は、例えば、コリネバクテリウムグルタミクム、コリネバクテリウムエフィシェンス、コリネバクテリウムジフテリアまたはコリネバクテリウムアンモニアゲネスでもある。

【0020】

前記コリネバクテリウム属微生物は、Ｌ−リジン生産能を有するものでもある。前記微生物は、Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物に、前記ポリヌクレオチドを導入し、Ｌ−リジン生産能が向上したものでもある。

【0021】

本発明において用語「Ｌ−リジン生産能を有する」は、本発明の微生物が培地で培養される場合、培地内に、Ｌ−リジンを生産して分泌する能力を有するということを意味する。前記微生物は、野生型または親菌株より、大量に培養培地にＬ−リジンを生産して蓄積させることができる微生物でもある。

【0022】

前記Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、ＮＡＤＰＨ生成関連遺伝子、及び／またはＬ−リジン生合成関連または分泌関連の遺伝子発現が強化または弱化されるか、外来遺伝子に置換されたものでもある。前記ＮＡＤＰＨ生成関連遺伝子は、例えば、グルコース脱水素酵素（glucose dehydrogenase）、グルコン酸キナーゼ（gluconate kinase）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（glucose 6-phosphate dehydrogenase）または６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（6-phosphogluconate dehydrogenase）をコーディングする遺伝子でもある。前記Ｌ−リジン生合成関連遺伝子は、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸還元酵素、meso−ジアミノピメリン酸脱水素酵素またはジアミノジピメリン酸脱炭酸酵素をコーディングする遺伝子でもある。前記Ｌ−リジン分泌関連遺伝子は、リシン排出キャリア遺伝子であるｌｙｓＥでもある。前記Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、またキシロースを炭素源として利用して、Ｌ−リジンを生産することができる能力を獲得したものでもある。

【0023】

一具体例において、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（ＫＦＣＣ１０８８１）でもある（大韓民国登録特許第１０−０１５９８１２号）。

【0024】

他の具体例において、前記コリネバクテリウム属微生物は、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、デヒドロピコリン酸還元酵素及びジアミノピメリン酸脱炭酸酵素をコーディングするポリヌクレオチドを導入したものでもある。例えば、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐでもある（大韓民国登録特許第１０−０９２４０６５号）。

【0025】

さらに他の具体例において、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（ＫＦＣＣ１０７５０）でもある。

【0026】

さらに他の具体例において、前記コリネバクテリウム属微生物は、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ：pyruvate carboxylase）をコーディングするポリヌクレオチドの変異体、ホモセリン脱水素酵素（ｈｏｍ：homoserine dehydrogenase；ｈｏｍ）をコーディングするポリヌクレオチドの変異体、及びアスパラギン酸キナーゼ（ｌｙｓＣ：aspartate kinase）をコーディングするポリヌクレオチドの変異体が導入されてリシン生産能を有するようになった微生物でもある（Binder et al., Genome Biology, 2012, 13: R40）。前記微生物は、例えば、コリネバクテリウムグルタミクムＣＪ３Ｐでもある。

【0027】

本発明の他の様相は、前記微生物を培養する段階と、培養物中のＬ−リジンを得る段階と、を含む、Ｌ−リジンを生産する方法を提供するものである。

【0028】

前記微生物については、前述の通りである。

【0029】

前記微生物の培養は、当業界に知られている適切な培地及び培養条件によって行われる。かような培養過程は、選択される微生物によって、容易に調整して使用することができる。前記培養の方法は、回分式、連続式及び流加式の培養からなる群から選択される１以上の培養を含んでもよい。

【0030】

前記培養に使用される培地は、特定微生物の要求条件を満足させることができる培地でもある。前記培地は、炭素源、窒素源、微量元素成分、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される培地でもある。

【0031】

前記炭素源は、炭水化物、脂肪、脂肪酸、アルコール、有機酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される炭素源でもある。前記炭水化物は、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロース、及びそれらの組み合わせでもある。前記脂肪は、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油、及びそれらの組み合わせでもある。前記脂肪酸は、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、またはそれらの組み合わせでもある。前記アルコールは、グリセロールまたはエタノールでもある。前記有機酸は、酢酸を含んでもよい。

【0032】

前記窒素源は、有機窒素源、無機窒素源、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記有機窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）、大豆ミール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記無機窒素源は、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0033】

前記培地は、リン、金属塩、アミノ酸、ビタミン、前駆体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものを含んでもよい。前記リンの供給源は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、またはそれらに相応するナトリウム含有塩を含んでもよい。前記金属塩は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄でもある。

【0034】

前記培地、またはそれをなす個別成分は、回分式、連続式または流加式の培養に添加される。

【0035】

前記培養方法において、培養物のｐＨを調整することができる。前記ｐＨの調整は、前記培養物に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸または硫酸を添加して行われる。また、前記培養方法は、気泡生成抑制を含んでもよい。前記気泡生成抑制は、消泡剤の使用を介して行われる。前記消泡剤は、脂肪酸ポリグリコールエステルを含んでもよい。また、前記培養方法は、培養物内へのガス注入を含んでもよい。前記ガスは、培養物の好気状態を維持するためのいかなるガスも含んでもよい。前記ガスは、酸素または酸素含有ガスでもある。前記酸素含有ガスは、空気を含む。前記培養において、培養物の温度は、２０ないし４５℃、例えば、２２ないし４２℃、あるいは２５ないし４０℃である。培養期間は、所望のＬ−リジン生成量を獲得するまで持続することができる。

【0036】

生産されたＬ−リジンは、例えば、培養液を、硫酸または塩酸で処理した後、陰イオン交換クロマトグラフィー、濃縮、晶析、等電点沈澱などの工程を併用し、培養物から回収される。

【0037】

以下、下記実施例によって、本発明についてさらに具体的に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に実施するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0038】

実施例１：野生型コリネバクテリウムグルタミクムgenomic ＤＮＡライブラリー作成
コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株のgenomic ＤＮＡを準備した後、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを処理し、６ないし８ｋｂの部分切片を獲得した。前記切片を、制限酵素ＢａｍＨＩ末端を有する大腸菌及びコリネバクテリウムの形質転換用シャトルベクターｐＥＣＣＧ１２２に連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲ（配列番号３及び４のプライマー利用）を介して、前記切片が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、それらをいずれも混合培養し、一般的に知られているプラスミド抽出法によってプラスミドを抽出した。

【0039】

配列番号３：ＴＣＡＧＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＴＣＧＧＴＴＴＡＴ
配列番号４：ＣＣＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ

【0040】

実施例２：ライブラリー導入、及びリシン生産能向上菌株の選別
実施例１で作成した組み換えベクターを、電気パルス法を利用して、リシン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換した後、下記の複合平板培地に塗抹した。
＜複合平板培地＞
ブドウ糖２０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４５０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ５ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４１０ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１，０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２，０００μｇ、ニコチンアミド２，０００μｇ、寒天２０ｇ、カナマイシン２５ｍｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0041】

コロニー約２，０００個を、下記の複合液体培地２００μｌを含む９６ディープウェルプレート（bioneer社）の個別ウェルに接種し、３０℃２４時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。リシンオキシダーゼ（oxidase）法によって、培養液各５０μｌを、リシンオキシダーゼを含む反応混合物（リン酸カリウム（ｐＨ７．５）２００μｌ、リシンオキシダーゼ（０．１ユニット／μｌ）０．０４μｌ、ペルオキシダーゼ（１ユニット／μｌ）０．０４μｌ、ＡＢＴＳ ０．４ｍｇ）が分注されている９６ウェルプレートに添加し、３０分間の反応後、ＯＤ_{４０５ｎｍ}で吸光度を測定して発色程度を比較した。そこから、対照群（ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ｐＥＣＣＧ１２２）より高い吸光度を示す７種の実験区を選別した。
＜複合液体培地＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １，０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２，０００μｇ及びニコチンアミド２，０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0042】

各菌株を、下記の種培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌコーナーワッフルフラスコに接種し、３０℃２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、１ｍｌの種培養液を、下記の生産培地２４ｍｌを含む２５０ｍｌコーナーワッフルフラスコに接種し、３７℃９６時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。培養を終了した後、ＨＰＬＣを利用して分析したＬ−リジン濃度を、下記表１に示した。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ４ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４８ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １，０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２，０００μｇ、ニコチンアミド２，０００μｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0043】

＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形粉（cornsteep solid）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１，０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２，０００μｇ、ニコチンアミド３，０００μｇ、ＣａＣＯ_３３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0044】

【表1】

【0045】

前記結果から、対照群対比のリシン生産能が上昇したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Ｍ２とＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Ｌ５２とを選択し、そこからプラスミドを抽出した。その後、配列番号３及び４のプライマーを利用して塩基配列を分析した。ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Ｍ２に由来したプラスミドは、ｐＥＣ−Ｌ１と命名し、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Ｌ５２に由来したプラスミドは、ｐＥＣ−Ｌ２と命名した。プラスミドｐＥＣ−Ｌ１は、ＮＣｇｌ０８５７遺伝子ＯＲＦ開始コドン上流約２００ｂｐ地点から、ＮＣｇｌ０８６２の遺伝子ＯＲＦ終結コドン下流約２００ｂｐ付近までを含み、プラスミドｐＥＣ−Ｌ２は、ＮＣｇｌ０８６１遺伝子ＯＲＦ終結コドン下流約２５０ｂｐ地点から、ＮＣｇｌ０８６５遺伝子のＯＲＦ開始コドン上流約３００ｂｐ付近までを含んでいた。それを介して、２種のプラスミドには、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子が共通して含まれているということを確認した。

【0046】

実施例３：ＮＣｇｌ０８６２遺伝子のプローモーター交替のためのベクター作成
実施例２で得られた結果を基に、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子が過発現された場合、実際にリシン生産能向上を誘導するか否かということを確認するために、染色体上のＮＣｇｌ０８６２遺伝子のプローモーターを交替させるためのベクターを作成した。そのために、ｌｙｓＣ遺伝子のプローモーターとして、野生型プローモーター（ｌｙｓＣＰ）と、改良型プローモーターであるｌｙｓＣＰ１とを使用した。

【0047】

これについて詳細に説明すれば、次の通りである。

【0048】

米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ Ｇｅｎｂａｎｋ）を根拠とし、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子（配列番号２）のＯＲＦ開始コドンを中心に、上流及び下流をそれぞれ増幅するためのプライマー対（配列番号５及び６、または配列番号７及び８）を考案した。また、ｌｙｓＣ遺伝子上流の塩基配列から、プローモーター部位を増幅するためのプライマー（配列番号９及び１０）を考案した。以下に配列番号及び塩基配列を示した。下線を引いた配列は、制限酵素に対する認識部位を示す。

【0049】

配列番号５：ＧＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＣＧＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴ
配列番号６：ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＧＣＴＴ
配列番号７：ＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＣＴ
配列番号８：ＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＣＧＴＴＣＡＴＡＡＴＴ
配列番号９：ＴＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧ
配列番号１０：ＴＡＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴＡＣＧ

【0050】

コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株のgenomic ＤＮＡをテンプレートにして、配列番号５及び６、配列番号７及び８、並びに配列番号９及び１０のプライマー対でＰＣＲを行った。そこから、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子のＯＲＦ開始コドンから、両側３００ｂｐのＤＮＡ切片と、ｌｙｓＣ遺伝子の野生型プロモーター（以下、「ｌｙｓＣＰプロモーター」と称する）切片とを獲得した。ＰＣＲ増幅は、９４℃５分間変性後、９４℃３０秒変性、５６℃３０秒アニーリング、７２℃３０秒重合を３０回反復した後、７２℃７分間重合反応を行った。前記ＮＣｇｌ０８６２遺伝子のＯＲＦ開始コドンから、両側３００ｂｐのＰＣＲ増幅産物を、それぞれＥｃｏＲI及びＢａｍＨI、並びにＢａｍＨI及びＳａｌIで処理した後、コリネバクテリウム属微生物の染色体挿入用ベクターｐＤＺを、制限酵素ＳａｌIと制限酵素ＥｃｏＲIとで処理して得たＤＮＡ切片と連結してベクターを獲得した。

【0051】

プローモーターであるｌｙｓＣＰまたはｌｙｓＣＰ１を増幅するために、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２またはＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣＰ１（大韓民国登録特許第１０−０９３０２０３）菌株のgenomic ＤＮＡをテンプレートにして、配列番号９及び１０のプライマー対でＰＣＲを行い、３００ｂｐのｌｙｓＣＰプロモーター及びｌｙｓＣＰ１プローモーターの切片を獲得した。前述のｌｙｓＣ野生型プローモーターとｌｙｓＣＰ１プローモーターとのＤＮＡ切片を、ＢａｍＨIとＮｄｅIとで処理した後、前記作成されたベクターを、ＢａｍＨIとＮｄｅIとで処理して得たＤＮＡ切片と連結し、組み換えプラスミドであるｐＤＺ−ｌｙｓＣＰ＿Ｎ０８６２とｐＤＺ−ｌｙｓＣＰ１＿Ｎ０８６２とをそれぞれ作成した。

【0052】

実施例４：リシン生産菌株由来ＮＣｇｌ０８６２遺伝子プローモーター交替菌株のリシン生産能分析
前記実施例３で作成した組み換えプラスミドｐＤＺ−ｌｙｓＣＰ＿Ｎ０８６２，ｐＤＺ−ｌｙｓＣＰ１＿Ｎ０８６２をコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに、電気パルス法で形質転換させ（Van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52: 541-545, 1999）、一般的に知られている染色体相同組み換えによって、染色体上のＮＣｇｌ０８６２遺伝子のプローモーター部位に、ｌｙｓＣプローモーターが挿入された菌株を、ＰＣＲ（配列番号５及び８）を介して選別した。選別された組み換え菌株を、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ＿Ｎ０８６２及びＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿Ｎ０８６２と命名した。

【0053】

前述のように作成されたリシン生産菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ＿Ｎ０８６２とＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿Ｎ０８６２のリシン生産能を確認するために、前記実施例２と同一の方法で種培養及び生産培養を行い、培養液中のリシン濃度を分析した（表２）。

【0054】

【表2】

【0055】

表２で示されているように、ｌｙｓＣ野生型プローモーターに交替された菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ＿Ｎ０８６２は、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ対比のリシン生産能が、平均１％上昇し、ｌｙｓＣＰ１プローモーターに交替された菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿Ｎ０８６２は、親菌株対比のリシン生産能が、平均４％上昇したということを確認した。その後、前記菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：ｌｙｓＣＰ１＿Ｎ０８６２をＣＡ０１−２２６９と命名し、２０１３年６月１２日付けで韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、寄託番号は、ＫＣＣＭ１１４３０Ｐである。

【0056】

実施例５：染色体内でのＮＣｇｌ０８６２遺伝子の追加挿入のためのベクター作成
トランスポゾン遺伝子位置に目的遺伝子を挿入するように、ｐＤＺベクターから考案されたｐＤＺＴＮベクターを基本ベクターとして使用し、前記実施例２のＮＣｇｌ０８６２遺伝子を染色体上に追加挿入するためのベクターを考案及び作成した。

【0057】

報告された塩基配列に基づいて、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子部位を増幅するためのプライマー（配列番号７及び１２）を合成し、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体をテンプレートにしたＰＣＲを介して、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子約３７０ｂｐのＯＲＦ部位を増幅した。

【0058】

また、ｌｙｓＣ遺伝子のプローモーター部位を増幅するためのプライマー（配列番号１０及び１１）を合成し、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｌｙｓＣＰ１導入菌株の染色体ＤＮＡをテンプレートにしたＰＣＲを介して、約３００ｂｐのプローモーター部位を増幅した。このとき、ＰＣＲは、９４℃５分間変性後、９４℃３０秒変性、５６℃３０秒アニーリング、７２℃３０秒重合を３０回反復した後、７２℃７分間重合反応して行った。

【0059】

配列番号１１：ＴＡＡＣＴＡＧＴＴＡＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧ

【0060】

ＰＣＲで増幅された遺伝子断片を、制限酵素ＳｐｅＩとＮｄｅＩとで処理し、それぞれのＤＮＡ切片を獲得した後、それを、制限酵素ＳｐｅＩ末端を有する染色体導入用ｐＤＺＴＮベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンが含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲ（配列番号１２及び１３）を介して、目的とする遺伝子が挿入されたベクターに形質転換されたコロニーを選別した後、一般的に知られているプラスミド抽出法を利用してプラスミドを獲得し、該プラスミドをｐＤＺＴＮ−Ｎ０８６２と命名した。

【0061】

配列番号１２：ＴＡＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＴＣＧＧＴＣＣＧＧＧＣＡ
配列番号１３：ＧＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡＧＣＴＴＧＴＣＡＣ

【0062】

実施例６：染色体内ＮＣｇｌ０８６２遺伝子追加挿入菌株のリシン生産能分析
前記実施例５で作成したベクターｐＤＺＴＮ−Ｎ０８６２を、染色体上での相同組み換えによって、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換させた。その後、ＰＣＲ（配列番号１２及び１３）方法でコロニーを選択的に分離し、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｎ０８６２−Ｔｎと命名した。ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｎ０８６２−Ｔｎと対照群とを、実施例２と同一の方法で培養し、培養液中のＬ−リジン濃度を分析した（表３）。

【0063】

【表3】

【0064】

前記ＮＣｇｌ０８６２遺伝子が染色体上に追加挿入された菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ：：Ｎ０８６２−Ｔｎは、親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ対比のリシン生産能が８％上昇したということを確認した。

【0065】

実施例７：染色体内に、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子が追加挿入されたＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来微生物を利用したＬ−リジン生産
前記実施例５で作成したベクターｐＤＺＴＮ−Ｎ０８６２を、Ｌ−リジン生合成経路構成遺伝子７種が、染色体上に追加挿入されたリシン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐに形質転換させた。その後、ＰＣＲ方法で、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子が染色体上に追加挿入された菌株を選別し、コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ：：Ｎ０８６２−Ｔｎと命名した。実施例２と同一の方法で培養し、培養液中のＬ−リジンの濃度を分析した（表４）。

【0066】

【表4】

【0067】

その結果、親菌株対比のリシン生産能が５％上昇したということを確認した。

【0068】

実施例８：染色体内に、ＮＣｇｌ０８６２が追加挿入されたＣＪ３Ｐ由来微生物を利用したＬ−リジン生産
コリネバクテリウムグルタミクムに属する他の菌株での効果も確認するために、前記実施例５で作成したベクターｐＤＺＴＮ−Ｎ０８６２を、Ｌ−リジン生産能向上関連３種の遺伝子変異を有するリシン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＣＪ３Ｐに形質転換させた。その後、ＰＣＲ方法で、ＮＣｇｌ０８６２遺伝子が、染色体上に追加挿入された菌株を選別し、コリネバクテリウムグルタミクムＣＪ３Ｐ：：Ｎ０８６２−Ｔｎと命名した。実施例２と同一の方法で培養し、そこから回収されたＬ−リジンの濃度を分析した（表５）。

【0069】

【表5】

【0070】

その結果、親菌株対比のリシン生産能が１２％上昇したということを確認した。

【0071】

実施例９：染色体に、ＮＣｇｌ０８６２が導入されたＫＣＣＭ１１３４７Ｐ由来微生物を利用したＬ−リジン生産
コリネバクテリウムグルタミクムに属する他の菌株での効果も確認するために、前記実施例５のような方法で、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（大韓民国登録特許第１９９４−０００１３０７号）に、ｐＤＺＴＮ−Ｎ０８６２を導入し、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ：：Ｎ０８６２−Ｔｎと命名した。実施例２と同一の方法で培養し、そこから回収されたＬ−リジンの濃度を分析した（表６）。

【0072】

【表6】

【0073】

その結果、親菌株対比のリシン生産能が６％上昇したということを確認した。

【0074】

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ
受託日：１９９１１２１０

【0075】

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１４３０Ｐ
受託日：２０１３０６１２

【受託番号】

【0076】

ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ
ＫＣＣＭ１１４３０Ｐ

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]