特許 6286757 抗ヒトＣＤ６９抗体、及びその医薬用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6286757

(24)【登録日】2018年2月16日

(45)【発行日】2018年3月7日

(54)【発明の名称】抗ヒトＣＤ６９抗体、及びその医薬用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20180226BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180226BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180226BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180226BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180226BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20180226BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180226BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20180226BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20180226BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20180226BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C07K16/18

   A61K39/395 N

   A61P37/08

   A61P29/00

   A61K39/395 D

   !C12P21/08

【請求項の数】18

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2014-512611(P2014-512611)

(86)(22)【出願日】2013年4月23日

(86)【国際出願番号】JP2013061918

(87)【国際公開番号】WO2013161814

(87)【国際公開日】20131031

【審査請求日】2016年4月25日

(31)【優先権主張番号】特願2012-98243(P2012-98243)

(32)【優先日】2012年4月23日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】311001141

【氏名又は名称】ジーンフロンティア株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】304021831

【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(72)【発明者】

【氏名】古城 周久

(72)【発明者】

【氏名】宮越 陽

(72)【発明者】

【氏名】加藤 静恵

(72)【発明者】

【氏名】對比地 久美子

(72)【発明者】

【氏名】速水 友紀

(72)【発明者】

【氏名】中村 美紀子

(72)【発明者】

【氏名】中山 俊憲

(72)【発明者】

【氏名】岩村 千秋

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−０２２９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０６９１８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１３６５０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１２−０３６１８９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ３７／０８

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいてヒトＣＤ６９に特異的に結合し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有し、且つマウスＣＤ６９に交差反応性を有する抗体。

【請求項2】

配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいてヒトＣＤ６９に特異的に結合し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有し、且つマウスＣＤ６９に交差反応性を有するヒト抗体。

【請求項3】

軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号９、１９又は２０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体。

【請求項4】

該軽鎖可変領域が配列番号２３、２７又は２８で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む、
請求項３に記載の抗体。

【請求項5】

ヒトＣＤ６９に特異的に結合し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有し、且つマウスＣＤ６９に交差反応性を有する抗体であって、
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号９、１９又は２０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む
ことを特徴とする、抗体。

【請求項6】

該軽鎖可変領域が配列番号２３、２７又は２８で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む、
請求項５に記載の抗体。

【請求項7】

ヒトＣＤ６９に特異的に結合し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有する、抗体であって、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
（３）該軽鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む；又は
（４）該軽鎖可変領域が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む
ことを特徴とする抗体。

【請求項8】

（３’）該軽鎖可変領域が配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む；又は
（４’）該軽鎖可変領域が配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む、
請求項７に記載の抗体。

【請求項9】

配列番号５９又は７８で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいてヒトＣＤ６９に特異的に結合する、請求項７又は８に記載の抗体。

【請求項10】

ヒトＣＤ６９への結合性に関するＫ_Ｄ値が５×１０^−８Ｍ以下である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項11】

ヒト抗体である、請求項１、及び３〜１０からなる群から選択されるいずれか１項に記載の抗体。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。

【請求項13】

請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を含む、アレルギー性疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤。

【請求項14】

請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項15】

請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項16】

請求項１５に記載のベクターを含む形質転換体。

【請求項17】

アレルギー性疾患若しくは炎症性疾患の予防、又は治療において使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項18】

アレルギー性疾患若しくは炎症性疾患の予防剤、又は治療剤を製造するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ヒトＣＤ６９抗体、及びその医薬用途に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＤ６９は、Ｃタイプレクチンファミリーに属するＩＩ型の膜貫通型タンパク質である。ＣＤ６９は、Ｔ細胞やＢ細胞を刺激すると数時間以内に発現が上昇するため、早期活性化マーカー分子としてリンパ球の活性化の指標として広く用いられている（非特許文献１）。また、胸腺内で分化途中に選択を受けているＴ細胞にも発現がみられている（非特許文献２及び３）。ＣＤ６９には、コレセプターとして抗原レセプターからのシグナル伝達を増強する機能が推測されているが、詳細は不明である。リガンドも現在までのところ、同定されていない。血小板には恒常的に発現しており、活性化した好中球や好酸球などにも発現がみられることから、血小板の機能発現や局所の炎症反応における役割が推測されている。また、関節炎の発症において好中球上のＣＤ６９が重要な役割を果たしていることが明らかになっている（非特許文献４）。更に、ＣＤ６９が、アレルギー性気道炎症をコントロールしており、マウスＣＤ６９に対する抗体が、アレルギー性気道炎症を阻害することが報告されている（非特許文献５）。また、ＣＤ６９欠損マウスにおいて、タバコの煙により誘発されるCOPDやブレオマイシンにより誘導される肺の線維化が減弱されることが報告されている（非特許文献６及び７）。そこで、ＣＤ６９に対する抗体を、これらのアレルギー疾患や、炎症疾患の予防又は治療に応用することが期待されている。しかしながら、ＣＤ６９に対するリガンドが不明であるため、ヒトＣＤ６９に対する抗体の薬理学的効果をインビトロで効率的に評価する方法がなかった。また、既存のヒトＣＤ６９に対する抗体は非ヒトＣＤ６９には交差反応しないため、既存の抗体のインビボにおける薬理学的効果を評価することが実質的に不可能であり、これらの抗体が有用な薬理学的な効果を奏するのか否かすら明らかではなかった。このように、抗ヒトＣＤ６９抗体の薬理学的な効果を評価する満足な方法がこれまでに存在しなかったため、アレルギー疾患や炎症疾患の予防又は治療に応用できる抗ヒトＣＤ６９抗体の開発は大きく立ち遅れていた。

【0003】

ファージディスプレイ法は、機能を持ったペプチドやタンパク質とそれをコードするＤＮＡとがファージ粒子という形で一対一に対応付けられることで試験管内高速選択を実現したディスプレイ技術の１つである。このファージディスプレイ法は抗体選択に応用され、この手法で取得された抗体の医薬開発も行われている（非特許文献８）。更に、ヒト人工抗体ライブラリーとファージディスプレイ法を組み合わせて特異的な抗体を得る手法も確立してきており、これらの手法はＭｏｒｐｈｏＳｙｓ社のＨｕＣＡＬ（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ）を始めとして複数社により実用化が進められてきている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｔｅｓｔｉ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １５ ： ４７９−４８３， １９９４．

【非特許文献2】Ｙａｍａｓｈｉｔａ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５ ： １１３９−１１５０， １９９３．

【非特許文献3】Ｎａｋａｙａｍａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６８ ： ８７−９４， ２００２．

【非特許文献4】Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５ ： ９８７−９９２， ２００３．

【非特許文献5】Ｍｉｋｉ−Ｈｏｓｏｋａｗａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８３ ： ８２０３−８２１５， ２００９．

【非特許文献6】Ｔｓｕｙｕｓａｋｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｒｅｃｅｐｔ． Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ． Ｒｅｓ． ３１ ： ４３４−４３９， ２０１１．

【非特許文献7】Ｙａｍａｕｃｈｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｒｅｓ． １２ ： １３１、２０１１．

【非特許文献8】Ｒｏｔｈｅ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３７６：１１８２−１２００， ２００８．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、アレルギー性疾患や炎症性疾患の予防又は治療に応用可能な抗ヒトＣＤ６９抗体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記課題を解決するため、まず、ヒトＣＤ６９とマウスＣＤ６９の双方に結合する抗ＣＤ６９抗体を作製した。また、抗ヒトＣＤ６９抗体の薬理学的な効果をインビボにおいて評価する方法を鋭意検討した。その結果、特定の抗原で感作したＣＤ６９欠損マウスのＴｈ２細胞にヒトＣＤ６９を強制発現させ、このＴｈ２細胞をマウスの体内に戻すと、ヒトＣＤ６９を発現するＴｈ２細胞が媒介するアレルギー反応をマウスにおいて再現することに成功した。そして、ＨｕＣＡＬにより抗ヒトＣＤ６９抗体を複数作製し、前記マウスを用いて、アレルギー反応に対する効果を評価した結果、優れたアレルギー抑制効果、炎症抑制効果を有する抗ヒトＣＤ６９抗体を見出した。更に、この得られた抗体の軽鎖ＣＤＲ３を改変することにより、ヒトＣＤ６９への親和性を向上させ、かつ、マウスＣＤ６９への交差反応を維持しつつ、アレルギー抑制効果及び炎症抑制効果を増強することに成功した。以上の知見に基づき、本発明を完成した。

【0007】

即ち、本発明は以下に関する。
［１］ヒトＣＤ６９に特異的に結合し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有する、抗体であって、マウスＣＤ６９に交差反応性を有する抗体。
［２］配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいて、ヒトＣＤ６９に結合する、［１］記載の抗体。
［３］軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
（１）該軽鎖可変領域が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号９、１９又は２０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む；又は
（２）該軽鎖可変領域が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号９、１９又は２０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む
（但し、配列番号７〜９、１９および２０で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号１０〜１２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）；
ことを特徴とする［１］に記載の抗体。
［４］（１’）該軽鎖可変領域が配列番号２３、２７又は２８で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む、
［３］に記載の抗体。
［５］ヒトＣＤ６９に特異的に結合し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有する、抗体であって、配列番号５９又は７８で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいてヒトＣＤ６９に結合する抗体。
［６］ヒトＣＤ６９に特異的に結合し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有する、抗体であって、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
（３）該軽鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む；
（４）該軽鎖可変領域が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む；
（５）該軽鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む
（但し、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）；又は
（６）該軽鎖可変領域が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む
（但し、配列番号１３〜１５で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号１６〜１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）
ことを特徴とする抗体。
［７］（３’）該軽鎖可変領域が配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む；又は
（４’）該軽鎖可変領域が配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む、
［６］に記載の抗体。
［８］ヒトＣＤ６９への結合性に関するＫ_Ｄ値が５×１０^−８Ｍ以下である、［１］〜［７］のいずれかに記載の抗体。
［９］ヒト抗体である、［１］〜［８］のいずれかに記載の抗体。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の抗体を含む医薬組成物。
［１１］［１］〜［９］のいずれかに記載の抗体を含む、アレルギー性疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤。
［１２］［１］〜［９］のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
［１３］［１２］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１４］［１３］に記載のベクターを含む形質転換体。
［１５］移入された、ヒトＣＤ６９を発現する、特定抗原により感作されたＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物のＴｈ２細胞を含む、非ヒト哺乳動物。
［１６］非ヒト哺乳動物がマウスである、［１５］の非ヒト哺乳動物。
［１７］アレルギー性疾患若しくは炎症性疾患の予防、又は治療において使用するための、［１］〜［９］のいずれかに記載の抗体。
［１８］哺乳動物に対して、有効量の［１］〜［９］のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、当該哺乳動物におけるアレルギー性疾患若しくは炎症性疾患の予防、又は治療方法。
［１９］アレルギー性疾患若しくは炎症性疾患の予防剤、又は治療剤を製造するための、［１］〜［９］のいずれかに記載の抗体の使用。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、アレルギー性疾患や炎症性疾患の予防又は治療に応用可能な抗ヒトＣＤ６９抗体が提供される。また、本発明によれば、抗ヒトＣＤ６９抗体の薬理学的効果をインビボにおいて評価可能な動物モデルが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】細胞染色によるヒトＣＤ６９及びマウスＣＤ６９への結合評価。

【図2】フローサイトメトリーによるヒトＣＤ６９発現の解析。

【図3】肺胞への白血球浸潤に対する各種抗ヒトＣＤ６９抗体の効果。

【図4】フローサイトメトリーによる各種抗ヒトＣＤ６９抗体の、マウスＣＤ６９及びヒトＣＤ６９への交差反応性の確認。

【図5】肺胞への白血球浸潤に対する各種抗ヒトＣＤ６９抗体の効果。

【図6】マウスＣＤ６９（上段）とヒトＣＤ６９（下段）のアミノ酸配列のアライメントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、ヒトＣＤ６９に対する特異的結合活性を有し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有する抗体を提供する。

【0011】

ＣＤ６９は公知のＩＩ型膜タンパク質であり、そのアミノ酸配列やｃＤＮＡ配列も公知である。ヒトＣＤ６９の代表的なアミノ酸配列を配列番号３０に、ヒトＣＤ６９の代表的なｃＤＮＡ配列を配列番号２９に、マウスＣＤ６９の代表的なアミノ酸配列を配列番号３２に、マウスＣＤ６９の代表的なｃＤＮＡ配列を配列番号３１に、それぞれ示す。

【0012】

本発明の抗体は、ヒトＣＤ６９の細胞外ドメインに対する特異的結合活性を有する。ヒトＣＤ６９の細胞外ドメインは、配列番号３０で表されるアミノ酸配列における６２−１９９の領域に、マウスＣＤ６９の細胞外ドメインは、配列番号３２で表されるアミノ酸配列における６２−１９９の領域に、それぞれ相当する。

【0013】

「ヒトＣＤ６９」とは、ＣＤ６９のアミノ酸配列又は核酸配列が、ヒトにおいて天然に発現しているＣＤ６９のアミノ酸配列又は核酸配列と同一、又は実質的に同一のアミノ酸配列又は核酸配列を有することを意味する。「実質的に同一」とは、着目したアミノ酸配列又は核酸配列が、ヒトにおいて天然に発現しているＣＤ６９のアミノ酸配列又は核酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上）の同一性を有しており、且つヒトＣＤ６９の機能を有することを意味する。ヒト以外の生物種や、ＣＤ６９以外のタンパク質、遺伝子、それらの断片についても同様に解釈する。

【0014】

抗体による抗原Ｘへの「特異的結合」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Ｘに対する結合親和性についてのＫ_Ｄ値が１×１０^−７Ｍ以下であることを意味する。

【0015】

本明細書において、本発明の抗体のヒトＣＤ６９への結合親和性に関するＫ_Ｄ値は、ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｐｌｏｔ法を用いて、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ （ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ， ２０００）に記載されている原理に従い算出される。抗体を様々な濃度の抗原（ヒトＣＤ６９の細胞外ドメイン）と平衡状態に達するまで室温で２時間インキュベーションを行い、これらのインキュベーション液中に存在する遊離抗体の量をＥＬＩＳＡ法で測定する。各平衡化サンプルの遊離抗体量の変化に基づき結合定数および解離定数(Ｋ_Ｄ値)を求める。尚、平衡化反応時の抗体濃度は０．０１５μｇ／ｍｌとし、遊離抗体量を測定する際のＥＬＩＳＡプレートには抗原を１μｇ／ｍｌで固相化したものを用いる。

【0016】

好ましい態様において、本発明の抗体のヒトＣＤ６９への結合親和性に関するＫ_Ｄ値は、５×１０^−８Ｍ以下である。

【0017】

本発明の抗体は、アレルギー性炎症を抑制する活性を有する。アレルギー性炎症とは、アレルギー反応に伴って生じる、標的組織への単核球の選択的な集積により特徴付けられる炎症をいう。単核球には、Ｔｈ２細胞、好酸球、好塩基球、及びマスト細胞が包含される。抗体が、アレルギー性炎症を抑制する活性を有するか否かは、後述する本発明の非ヒト哺乳動物を抗原で曝露することにより誘導されるアレルギー反応（例、白血球浸潤）を抑制するか否か評価することにより確認することができる。

【0018】

本明細書において、「抗体」は、全長抗体及びそのいかなる抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又はその一重鎖を含むものとして使用する。「抗体」は、ジスルフィド結合で連結された少なくとも２個の重鎖（Ｈ）と２個の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を称する。各重鎖は、重鎖可変領域（本文においてＶ_Ｈと略す。）と重鎖定常領域とから構成されている。重鎖定常領域は、３個のドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３から構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本文においてＶ_Ｌと略す。）と軽鎖定常領域から構成されている。軽鎖定常領域は、１個のドメインＣ_Ｌで構成されている。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される変異性の高い領域に小分割され、それらには、フレームワーク領域（ＦＲ）と称され、より保存性の高い領域が散在している。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、３個のＣＤＲと４個のＦＲで構成され、下記の順序、すなわち、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている。当該重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含んでいる。抗体の定常領域は、イムノグロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介でき、それらには、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および旧来の補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が含まれる。

【0019】

本明細書において、抗体の「抗原結合部分」とは、特異的に抗原（例えば、ヒトＣＤ６９）に結合する能力を保持する抗体の１個以上の断片を称するものとして使用する。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって行われることが明らかとなっている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例として、（i）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインから構成される１価の断片であるＦａｂ断片、（ii）ヒンジ領域中ジスルフィド架橋で結合した２個のＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ’）_２断片、（iii）ヒンジ領域の部分を持つ本来的ＦａｂであるＦａｂ’断片（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．１９９３参照）、（iv）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（v）抗体のシングルアームのＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインで構成されるＦｖ断片、（vi）Ｖ_Ｈドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、（vii）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）および（viii）単一可変ドメインと二つの定常領域を含む重鎖可変領域であるナノボディを含む。更に、Ｆｖ断片の２個のドメインであるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え技術を用いてそれらを単一タンパク質鎖として作製できる合成リンカーにより連結でき、この鎖中では、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が対となって１価の分子を形成する（単一鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３参照）。このような単一鎖の抗体も、抗体の「抗原結合部分」に包含される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、当該断片について、未改変抗体の場合と同様に有用性を求めてスクリーニングされる。

【0020】

本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」とは、単一分子組成物の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープと呼ばれる抗原の一部分に対して単一結合特異性と親和性を示す。

【0021】

本発明の抗体は、好ましくはヒト抗体である。「ヒト抗体」とは、フレームワークとＣＤＲ領域の両方ともにヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体をいう。更に、抗体が定常領域を含む場合には、この定常領域もヒト生殖細胞系列イムノグロブリン配列に由来する。本明細書において、「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列イムノグロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダムまたは部位特異的変異誘発またはインビボにおける体細胞変異により導入される変異）を含む態様をも包含する。しかし、本明細書において、「ヒト抗体」の用語は、マウスのようなヒト以外の動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列上に融合させた抗体を含むことは意図していない。

【0022】

本明細書において、ヒト抗体には「再構成ヒト抗体」が包含される。再構成ヒト抗体とは、第１のヒトドナー抗体に含まれる少なくとも１つのＣＤＲが、第２のヒトアクセプター抗体において、第２のヒトアクセプター抗体のＣＤＲの代わりに用いられる改変型抗体をいう。好ましくは、６つのＣＤＲ全てが置換される。より好ましくは、第１のヒトドナー抗体の抗原結合領域（例えば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２）全体が第２のヒトアクセプター抗体における対応領域の代わりに用いられる。より好ましくは、第１のヒトドナー抗体のＦａｂ領域が第２のヒトアクセプター抗体の適切な定常領域と機能可能なように連結して全長抗体を形成する。

【0023】

再構成ヒト抗体は、例えば、ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９６／０２５７６、非特許文献８等に開示された、一般的な遺伝子組換え手法を用いて製造することができる。具体的には、例えばドナーヒト抗体中の目的のＣＤＲとアクセプターヒト抗体中の目的のフレームワーク領域（ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲおよびＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８に記載の方法を参照）。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域もしくはヒト抗体定常領域改変体をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより再構成ヒト抗体を得ることができる（ＥＰ１２５０２３、ＷＯ９６／０２５７６参照）。

【0024】

また本明細書において、ヒト抗体には「人工ヒト抗体」が包含される。人工ヒト抗体は、例えば、非特許文献８等に開示された、一般的な遺伝子組換え手法を用いて製造することができる。

【0025】

本発明の抗体には、上述の抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ, Ｔ. Ｐ. ｅｔ ａｌ.， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９８８） ６, １２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。

【0026】

また本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やヒアルロン酸などの高分子物質、放射性物質、蛍光物質、発光物質、酵素、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。尚、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている（例えば、ＵＳ５０５７３１３、ＵＳ５１５６８４０）。

【0027】

本発明の抗体は単離又は精製されていることが好ましい。「単離又は精製」とは、天然に存在する状態から、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された本発明の抗体の純度（全タンパク質重量に対する、本発明の抗体の重量の割合）は、通常５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば実質的に１００％）である。

【0028】

一態様において、本発明の抗体は、マウスＣＤ６９（好ましくはマウスＣＤ６９の細胞外ドメイン）への交差反応性を有する。「交差反応性」とは、ヒトＣＤ６９に特異的に結合する抗体が、マウスＣＤ６９（好ましくはマウスＣＤ６９の細胞外ドメイン）にも抗原抗体反応により結合するということを意味する。マウスＣＤ６９への交差反応性を有する本発明の抗体は、ヒトＣＤ６９を発現していないマウスにおいても薬効を評価可能な点で、優れている。

【0029】

好ましい態様において、マウスＣＤ６９への交差反応性を有する本発明の抗体は、配列番号３３で表されるアミノ酸配列（ＹＮＣＰＧ）を含むエピトープにおいてヒトＣＤ６９に結合する。配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むエピトープとしては、配列番号３０で表されるアミノ酸配列の連続する部分配列であって、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含み、且つ１２アミノ酸長以下の部分配列からなるエピトープを挙げることができる。配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むエピトープとしては、具体的には、配列番号３５で表されるアミノ酸配列からなるエピトープ、及び配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるエピトープを挙げることができる。

【0030】

マウスＣＤ６９への交差反応性を有する本発明の抗体としては、以下の（１）又は（２）に記載の抗体を挙げることができる：
（１）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号９、１９または２０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、抗体；及び
（２）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号９、１９又は２０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、抗体
（但し、配列番号７〜９、１９及び２０で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号１０〜１２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）。

【0031】

上記（１）又は（２）に記載の抗体は、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むエピトープ（好ましくは、配列番号３０で表されるアミノ酸配列の連続する部分配列であって、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含み、且つ１２アミノ酸長以下の部分配列からなるエピトープ；より好ましくは、配列番号３５又は配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるエピトープ）においてヒトＣＤ６９に結合し得る。

【0032】

一態様において、本発明の抗体は、配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるエピトープにおいてヒトＣＤ６９に結合する。

【0033】

一態様において、本発明の抗体は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列（ＹＡＧＲＥＥ）を含むエピトープにおいてヒトＣＤ６９に結合する。配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むエピトープとしては、配列番号３０で表されるアミノ酸配列の連続する部分配列であって、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含み、且つ１２アミノ酸長以下の部分配列からなるエピトープを挙げることができる。配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むエピトープとしては、具体的には、配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるエピトープ、配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなるエピトープ、及び配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるエピトープを挙げることができる。

【0034】

その他の本発明の抗体としては、以下の（３）〜（６）に記載の抗体を挙げることができる：
（３）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、抗体；
（４）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、抗体；
（５）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、抗体
（但し、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号４〜６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）；及び
（６）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、抗体
（但し、配列番号１３〜１５で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号１６〜１８で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）。

【0035】

上記（３）又は（５）に記載の抗体は、配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるエピトープにおいてヒトＣＤ６９に結合し得る。

【0036】

上記（４）又は（６）に記載の抗体は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むエピトープ（好ましくは、配列番号３０で表されるアミノ酸配列の連続する部分配列であって、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含み、且つ１２アミノ酸長以下の部分配列からなるエピトープ；より好ましくは、配列番号５７、配列番号５８又は配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるエピトープ）においてヒトＣＤ６９に結合し得る。

【0037】

（１）に記載の抗体のヒトＣＤ６９への結合親和性に関するＫ_Ｄ値は、好ましくは３×１０^−８Ｍ以下である。軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有する場合、該抗体のヒトＣＤ６９への結合親和性に関するＫ_Ｄ値は、好ましくは１×１０^−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０^−９Ｍ以下、更に好ましくは２×１０^−９Ｍ以下である。軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有する場合、該抗体のヒトＣＤ６９への結合親和性に関するＫ_Ｄ値は、好ましくは１×１０^−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０^−９Ｍ以下、更に好ましくは３×１０^−９Ｍ以下である。

【0038】

（２）に記載の抗体のヒトＣＤ６９への結合親和性に関するＫ_Ｄ値は、好ましくは３×１０^−８Ｍ以下である。
（２）に記載の抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、抗体
（但し、配列番号７、８及び１９で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号１０〜１２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）である場合、該抗体のヒトＣＤ６９への結合親和性に関するＫ_Ｄ値は、好ましくは１×１０^−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０^−９Ｍ以下、更に好ましくは２×１０^−９Ｍ以下である。
（２）に記載の抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、抗体
（但し、配列番号７、８及び２０で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加しており、且つ／或いは、
配列番号１０〜１２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列において、１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している）である場合、該抗体のヒトＣＤ６９への結合親和性に関するＫ_Ｄ値は、好ましくは１×１０^−８Ｍ以下、より好ましくは５×１０^−９Ｍ以下、更に好ましくは３×１０^−９Ｍ以下である。

【0039】

（３）又は（５）に記載の抗体のヒトＣＤ６９への結合親和性に関するＫ_Ｄ値は、好ましくは５×１０^−８Ｍ以下である。

【0040】

（４）又は（６）に記載の抗体のヒトＣＤ６９への結合性に関するＫ_Ｄ値は、好ましくは８×１０^−９Ｍ以下である。

【0041】

（２）、（５）及び（６）の態様においては、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるアミノ酸の数は、抗体がヒトＣＤ６９に特異的に結合し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有する限り特に限定されないが、１つのＣＤＲ配列につき、好ましくは２アミノ酸以内、より好ましくは１アミノ酸である。また、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加するＣＤＲ配列の数は、抗体がヒトＣＤ６９に特異的に結合し、アレルギー性炎症を抑制する活性を有する限り特に限定されないが、１つの軽鎖可変領域につき、好ましくは２つ以内、より好ましくは１つであり、１つの重鎖可変領域につき、好ましくは２つ以内、より好ましくは１つである。アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方において行われてもよいし、いずれか一方のみにおいて行われてもよい。

【0042】

（２）、（５）及び（６）の態様においては、好ましくは、軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列においてのみ、１〜３個（好ましくは１又は２個、より好ましくは１個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加している。

【0043】

（２）の態様において、軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び／又は付加する場合、該ＣＤＲ３のアミノ酸配列における２番目のセリン及び３番目のチロシンは維持することが好ましい。また、該ＣＤＲ３のアミノ酸配列における１番目のアミノ酸は、グルタミンとグリシンとの間で相互に置換可能であり得る。該ＣＤＲ３のアミノ酸配列における４番目のアミノ酸は、アスパラギン酸とスレオニンとの間で相互に置換可能であり得る。該ＣＤＲ３のアミノ酸配列における５番目のアミノ酸は、セリンとスレオニンとの間で相互に置換可能であり得る。

【0044】

１又は複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ， Ｔ， Ｍｉｚｕｎｏ， Ｔ， Ｏｇａｓａｈａｒａ， Ｙ， ａｎｄ Ｎａｋａｇａｗａ， Ｍ． （１９９５） Ａｎ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｕａｌ ａｍｂｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｇｅｎｅ １５２， ２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ， ＭＪ， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｍ．（１９８３） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００， ４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ， Ｄｒｕｔｓａ，Ｖ， Ｊａｎｓｅｎ，ＨＷ， Ｋｒａｍｅｒ，Ｂ， Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒ，Ｍ， ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ（１９８４） Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ， ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ ＨＪ（１９８７） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５） Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−sｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ８２， ４８８−４９２）が挙げられる。該方法を用いて、抗体の所望のアミノ酸を目的の他のアミノ酸に置換することができる。又、フレームワークシャッフリング（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００７ Ａｐｒ；４４（１１）：３０４９−６０）およびＣＤＲ修復（ＵＳ２００６／０１２２３７７）等のライブラリー技術を用いることにより、フレームワークおよびＣＤＲにおけるアミノ酸を適切な他のアミノ酸に置換することも可能である。

【0045】

本発明の抗体において、ＣＤＲと連結される抗体のフレームワーク領域(ＦＲ)は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。本発明の抗体に用いられるＦＲは特に限定されず、如何なるＦＲが用いられていてもよいが、ヒト抗体のＦＲが用いられることが好ましい。ヒト抗体のＦＲは天然配列を有するＦＲが用いられてもよいし、必要に応じ、ＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、天然配列を有するフレームワーク領域の１又は複数のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入等してもよい。例えば、アミノ酸を置換したＦＲを用いた抗体の抗原への結合活性を測定し評価することによって、所望の性質を有する変異ＦＲ配列が選択できる（Ｓａｔｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３， ８５１−８５６）。

【0046】

（１）及び（２）の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のＶl３（Ｋａｂａｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のＦＲが、重鎖については、好ましくはヒト抗体のＶＨ３（Ｋａｂａｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のＦＲが用いられる。
（３）及び（５）の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のＶk１（Ｋａｂａｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のＦＲが、重鎖については、好ましくはヒト抗体のＶＨ１Ｂ（Ｋａｂａｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のＦＲが用いられる。
（４）及び（６）の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のＶk３（Ｋａｂａｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のＦＲが、重鎖については、好ましくはヒト抗体のＶＨ３（Ｋａｂａｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のＦＲが用いられる。

【0047】

本発明の抗体で用いられる定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が用いられてもよい。本発明の抗体で用いられる定常領域の好ましい例としては、ヒト抗体の定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ由来の定常領域など）を挙げることができる。例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、Ｃεを、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。

【0048】

（１）及び（２）の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のＣλの定常領域が、重鎖については、好ましくはヒト抗体のＣγ４の定常領域が用いられる。
（３）及び（５）の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のＣκの定常領域が、重鎖については、好ましくはヒト抗体のＣγ４の定常領域が用いられる。
（４）及び（６）の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のＣκの定常領域が、重鎖については、好ましくはヒト抗体のＣγ４の定常領域が用いられる。

【0049】

本発明の好ましい抗体として以下のものを挙げることができる：
（１’）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号２３、２７または２８で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含む、抗体；及び
（３’）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（４’）軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む、抗体。

【0050】

上記（１’）の抗体は、上記（１）の抗体の好ましい態様に、上記（３’）の抗体は、上記（３）の抗体の好ましい態様に、上記（４’）の抗体は、上記（４）の抗体の好ましい態様に、それぞれ相当する。

【0051】

上記（１’）の抗体は、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むエピトープ（好ましくは、配列番号３０で表されるアミノ酸配列の連続する部分配列であって、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含み、且つ１２アミノ酸長以下の部分配列からなるエピトープ；より好ましくは、配列番号３５又は配列番号３６で表されるアミノ酸配列からなるエピトープ）においてヒトＣＤ６９に結合し得る。

【0052】

上記（３’）の抗体は、配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるエピトープにおいてヒトＣＤ６９に結合し得る。

【0053】

上記（４’）の抗体は、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含むエピトープ（好ましくは、配列番号３０で表されるアミノ酸配列の連続する部分配列であって、配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含み、且つ１２アミノ酸長以下の部分配列からなるエピトープ；より好ましくは、配列番号５７、配列番号５８又は配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるエピトープ）においてヒトＣＤ６９に結合し得る。

【0054】

また、本発明は上記本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供するものである。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。

【0055】

尚、本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせが包含される。

【0056】

本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体のアミノ酸配列情報、公知の配列情報や本明細書の配列表に記載された配列情報に基づき、公知の遺伝子組換え技術を利用することにより容易に製造することができる。例えば、配列情報に基づき適当なプライマーを設計し、本発明の抗体を構成する構成要素をコードするＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅し、ＤＮＡフラグメントをリガーゼなどの適切な酵素を用いて連結することにより、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。或いは、本発明の抗体のアミノ酸配列情報に基づいて、ポリヌクレオチド合成装置により各構成要素をコードするポリヌクレオチドを合成してもよい。

【0057】

取得された本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ポリヌクレオチドはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。

【0058】

本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは単離又は精製されている。単離又は精製された本発明のポリヌクレオチドの純度（全ポリヌクレオチド重量に対する、本発明のポリヌクレオチドの重量の割合）は、通常５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば実質的に１００％）である。

【0059】

本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供するものである。本発明のベクターには、本発明の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター、及び重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターと、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクターとの組み合わせが包含される。該ベクターは好ましくは単離又は精製されている。ベクターとしては発現ベクター、クローニングベクター等を挙げることができ、目的に応じて選択することが可能であるが、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。該発現ベクターは、本発明の抗体を発現し得る。該発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。ベクターの種類としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を挙げることができ、用いる宿主に応じて適宜選択することができる。

【0060】

宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）、酵母（サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（ラット神経細胞、サル細胞（ＣＯＳ−７等）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ細胞等）等）などが用いられる。

【0061】

哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

【0062】

プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドベクター（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミドベクター（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミドベクター（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）等を挙げることができ、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することができる。

【0063】

ウイルスベクターの種類は、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、宿主として昆虫細胞を用いる場合には、バキュロウイルスベクター等を用いることができる。また、宿主として哺乳動物細胞を用いる場合には、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター等を用いることができる。

【0064】

また、プロモーターは、用いる宿主の種類に対応して、該宿主内で転写を開始可能なものを選択することができる。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。宿主が哺乳動物細胞である場合、サブゲノミック（２６Ｓ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。

【0065】

本発明のベクターには、抗体分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ， Ｓ． Ｐ． ｅｔ ａｌ Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （１９８７） １６９， ４３７９）を使用すればよい。

【0066】

本発明のベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。

【0067】

上記本発明のベクターを、自体公知の遺伝子導入法（例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法、Ｇｅｎｅ Ｇｕｎによる遺伝子導入法等）に従って上記宿主へ導入することにより、該ベクターが導入された形質転換体（本発明の形質転換体）を製造することができる。導入されるベクターとして発現ベクターを使用することにより、該形質転換体は本発明の抗体を発現し得る。本発明の形質転換体は、本発明の抗体の製造等に有用である。

【0068】

本発明の形質転換体を、宿主の種類に応じて、自体公知の方法で培養し、培養物から本発明の抗体を単離することにより、本発明の抗体を製造することができる。宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、ＬＢ培地やＭ９培地等の適切な培地中、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行なわれる。宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、適切な培地中、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行なわれる。宿主が酵母である形質転換体の培養は、バークホールダー培地等の適切な培地中、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行なわれる。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体の培養は、約１０％のウシ血清が添加されたＧｒａｃｅ‘ｓ Ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ等の適切な培地中、通常約２７℃で、約３〜５日間行なわれる。宿主が動物細胞である形質転換体の培養は、約１０％のウシ血清が添加されたＭＥＭ培地等の適切な培地中、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。いずれの培養においても、必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。

【0069】

尚、遺伝子工学的に抗体を製造する方法については、例えば、Ｃｏ， Ｍ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９４） １５２， ２９６８−２９７６ ； Ｂｅｔｔｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ａ． Ｈ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９８９） １７８， ４７６−４９６ ； Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， Ａ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９８９） １７８， ４９７−５１５ ； Ｌａｍｏｙｉ， Ｅ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９８６） １２１， ６５２−６６３ ； Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． （１９８６） １２１， ６６３−６６９ ； Ｂｉｒｄ， Ｒ． Ｅ． ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ， Ｂ． Ｗ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９１） ９， １３２−１３７等を参照のこと。

【0070】

培養物からの本発明の抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。

【0071】

クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ． Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ． Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ al．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ， ＰＯＲＯＳ， Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。

【0072】

また本発明は、上記本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はヒトＣＤ６９が関連するアレルギー性疾患や炎症性疾患の予防又は治療に用いることが可能である。即ち本発明は、上述の抗体を有効成分とするアレルギー性疾患又は炎症性疾患の予防剤又は治療剤も提供する。アレルギー性疾患としては、例えばアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、等が挙げられるが、これに限定されることはない。炎症性疾患としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管支炎、間質性肺炎、肺線維症、肺浮腫、成人呼吸窮迫症候群、慢性関節リウマチ、敗血性ショック、潰瘍性大腸炎、クローン病、再灌流障害、慢性糸球体腎炎、エンドトキシンショック、骨関節炎、多発性硬化症等が挙げられるが、これに限定されることはない。上記アレルギー性疾患又は炎症性疾患は、好ましくは呼吸器（肺、気管支、気道等）におけるアレルギー性疾患又は炎症性疾患である。呼吸器（肺、気管支、気道等）におけるアレルギー性疾患としては、アレルギー性喘息等が挙げられるが、これに限定されることはない。呼吸器（肺、気管支、気道等）における炎症性疾患としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管支炎、間質性肺炎、肺線維症、肺浮腫、成人呼吸窮迫症候群等が挙げられるが、これに限定されることはない。

【0073】

本発明の抗体を「有効成分として含有する」とは、本発明の抗体を活性成分の少なくとも１つとして含むという意味であり、その含有率を制限するものではない。また、本発明の医薬組成物は、本発明の抗体と合わせて他の有効成分を含有してもよい。

【0074】

本発明の抗体は、常法に従って製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｕ．Ｓ．Ａ）。更に、必要に応じ、医薬的に許容される担体及び/または添加物を含んでもよい。例えば、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含むことができる。しかしながら、本発明の医薬組成物は、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜含んでいてもよい。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン等のタンパク質、並びに、アミノ酸を含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、本発明の抗体を、例えば、生理食塩水、ブドウ糖またはその他の補助薬を含む等張液に溶解する。補助薬としては、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、更に、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。

【0075】

また、必要に応じポリペプチドをマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等)とすることもできる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ＆， Ｏｓｌｏ Ｅｄ． （１９８０）等参照）。更に、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、ポリペプチドに適用し得る（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８１） １５： １６７−２７７； Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． （１９８２）１２： ９８−１０５；米国特許第３，７７３，９１９号;欧州特許出願公開（ＥＰ）第58,481号; Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９８３）２２：５４７−５６；ＥＰ第１３３，９８８号）。更に、本剤にヒアルロニダーゼを添加あるいは混合することで皮下に投与する液量を増加させることも可能である（例えば、ＷＯ２００４／０７８１４０等）。

【0076】

医薬組成物中の本発明の抗体の含有量は、例えば、医薬組成物全体の約０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜９９．９重量％である。

【0077】

本発明の医薬組成物は、経口又は非経口のいずれでも投与可能であるが、好ましくは非経口投与される。具体的には、注射及び経皮投与により患者に投与される。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射または皮下注射等により全身又は局所的に投与することができる。治療部位又はその周辺に局所注入、特に筋肉内注射してもよい。経皮投与剤型の例としては、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、および貼付剤等があげられ、全身又は局所的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、１回につき体重１ｋｇあたり本発明の抗体として０．５ｍｇ〜２．５ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。しかしながら、本発明の医薬組成物は、これらの投与量に制限されるものではない。

【0078】

本発明は、アレルギー性疾患や炎症性疾患等におけるヒトＣＤ６９の機能の解析に有用な非ヒト哺乳動物を提供する。具体的には本発明は、移入された、ヒトＣＤ６９を発現する、特定抗原により感作されたＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物のＴｈ２細胞を含む、非ヒト哺乳動物を提供する。

【0079】

非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。非ヒト哺乳動物は、好ましくはマウスである。

【0080】

Ｔｈ２細胞が由来するＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物の遺伝型は、本発明の非ヒト哺乳動物の動物種にとって、免疫学的自己（即ち同種同系）又は免疫学的非自己（即ち同種異系又は異種異系）であり得るが、移入したＴｈ２細胞を長期間生体内に生着させる観点から、好ましくは免疫学的自己である。

【0081】

ＣＤ６９の欠損とは、ＣＤ６９遺伝子が本来有する正常な機能が十分に発揮できない状態をいい、例えば、ＣＤ６９遺伝子が全く発現していない状態、またはＣＤ６９遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下している状態、あるいはＣＤ６９遺伝子産物の機能が完全に喪失した状態、又はＣＤ６９遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にＣＤ６９遺伝子産物の機能が低下した状態が挙げられる。

【0082】

ＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物は、好ましくは、ゲノムＤＮＡの改変を伴う動物、いわゆるトランスジェニック動物であり得る。ＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物は、ＣＤ６９遺伝子欠損ヘテロ接合体、又はＣＤ６９遺伝子欠損ホモ接合体であり得るが、好ましくはＣＤ６９遺伝子欠損ホモ接合体である。

【0083】

ＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物は、例えば、ＥＳ細胞をＣＤ６９遺伝子について相同的組換えを誘導するターゲッティングベクターでトランスフェクトすることにより、ＣＤ６９遺伝子の一方のアレルに欠損が導入されたＥＳ細胞を調製し、得られたＥＳ細胞から、これに由来するＣＤ６９遺伝子の一方のアレルに欠損が導入された子孫動物を調製し、当該子孫動物同士を交配することにより得ることができる。ＣＤ６９欠損マウスの製造については、例えば、Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ２００３． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５： ９８７−９９２を参照のこと。

【0084】

抗原の種類は、ＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物に対して抗原性を有する限り、特に限定されず、所望の抗原を選択することができる。抗原としては、ＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物に対して抗原性を有する、タンパク質、ペプチド、脂質、糖鎖等を挙げることができる。

【0085】

抗原によるＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物の感作は、免疫するのに十分量の当該抗原を、ＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物に注入することにより行うことができる。例えば、１〜３週間に１回の頻度で、合計２〜６回、ＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物を当該抗原で免疫する。免疫に際しては、抗原をアジュバントと供にＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物に投与してもよい。アジュバントとしては、免疫原性を増強し得るものである限り特に限定されないが、例えば、水酸化アルミニウム、キーホールリンペットヘモシアニン、デキストラン、ＢＣＧ、リン酸アルミニウム、ＴＬＲリガンド（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＣｐＧ）等が挙げられるが、Ｔｈ２細胞を効率的に誘導する観点から、水酸化アルミニウム等が好ましく用いられる。

【0086】

Ｔｈ２細胞とは、抗原刺激により、ナイーブなＣＤ４Ｔ細胞から分化した、ＩＬ−４を優勢に産生するＣＤ４Ｔ細胞をいう。

【0087】

Ｔｈ２細胞は、例えば、特定抗原により感作されたＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物の脾臓や末梢血からＣＤ４Ｔ細胞を単離し、当該ＣＤ４Ｔ細胞を、当該抗原、抗原提示細胞、ＩＬ−２及びＩＬ−４の存在下で培養することにより得ることができる。当該抗原に代えて、固相化した抗ＴＣＲ抗体や抗ＣＤ３抗体を用いてもよい。また、固相化した抗ＣＤ２８抗体を併せて用いることにより、より強力にＴｈ２細胞を誘導することができる。

【0088】

得られた細胞がＴｈ２細胞であることは、得られた細胞を抗原で刺激し、ＩＦＮ−γと比較してＩＬ−４を優勢に産生するか否かをフローサイトメトリーにより評価することにより確認することができる。

【0089】

ＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物のＴｈ２細胞にヒトＣＤ６９を発現させるためには、通常、当該非ヒト哺乳動物のＴｈ２細胞内でヒトＣＤ６９を発現し得る発現ベクターで、ＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物のＴｈ２細胞をトランスフェクトする。ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられるが、レトロウイルスベクターを用いると、容易に導入遺伝子が染色体内へ組み込まれ、Ｔｈ２細胞が増殖しても、安定にヒトＣＤ６９を発現し続けることができるので、本発明においては、レトロウイルスベクターが好ましく用いられる。Ｔｈ２細胞へのレトロウイルスによる遺伝子導入の詳細については、例えば、Ｋｉｍｕｒａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２００１． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５： ２７５−２８７．を参照のこと。

【0090】

Ｔｈ２細胞がヒトＣＤ６９を発現していることは、抗ヒトＣＤ６９抗体を用いたフローサイトメトリーにより確認することができる。

【0091】

レシピエント非ヒト哺乳動物へ、ヒトＣＤ６９を発現する、特定抗原により感作されたＣＤ６９欠損非ヒト哺乳動物のＴｈ２細胞を静脈内、又は腹腔内注射することにより、当該Ｔｈ２細胞をレシピエント非ヒト哺乳動物へ移入することができる。移入するＴｈ２細胞の数は、レシピエント非ヒト哺乳動物において、当該抗原に対する移入したＴｈ２細胞の応答反応が確認される程度であれば、特に限定されない。レシピエント非ヒト哺乳動物がマウスである場合には、例えば、１００万〜３００万個のＴｈ２細胞を移入するのが好適である。

【0092】

移入したＴｈ２細胞は、特定の抗原刺激により活性化され、多量のＩＬ−４を産生するので、本発明の非ヒト哺乳動物を当該抗原に曝露することにより、ヒトＣＤ６９を発現するＴｈ２細胞が媒介するアレルギー反応やそれに伴う炎症反応が生じる。本発明は、このような非ヒト哺乳動物アレルギーモデルをも提供する。本発明の非ヒト哺乳動物を用いれば、ヒトＣＤ６９のアレルギー反応や炎症反応における役割をインビボにおいて容易に解析することができる。また、抗ヒトＣＤ６９抗体のアレルギー性疾患や炎症性疾患に対する薬効評価を、非ヒト哺乳動物において実施することができる。

【0093】

刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。

【実施例】

【0094】

以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。尚、実施例における各種遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｉｒｄ． ｅｄ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載の方法に従った。

【0095】

［実施例１］
抗原および抗体作製
（１）ヒトＣＤ６９ 組み換えタンパク質の作製
ヒトＣＤ６９はシステイン６８を介してホモダイマーを形成するため、システイン６８を含む細胞外領域（アミノ酸配列；６２−１９９）をコードするｃＤＮＡ（ＮＭ＿００１７８１）を大腸菌ペリプラズム発現用ベクターに挿入した。この発現ベクターを予め調製（Ｚ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ：ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）しておいた大腸菌ＴＧ１Ｆ（−）株コンピテントセルに形質転換し、クロラムフェニコール（終濃度 ３４μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天プレート上で３７℃、一晩培養した。この大腸菌を２×ＹＴ培地に植菌し、３７℃で３−５時間培養（ＯＤ６００＝０．５−０．８）後、ＩＰＴＧ（終濃度０．１ｍＭ）を添加し、２５℃で一晩培養した。培養した大腸菌を遠心分離により集菌して、溶菌バッファー（２００ｍＭ ホウ酸、１６０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ リゾチウム、ｐＨ８．０）により溶菌させた後、これを遠心分離することで可溶性画分を得た。この可溶性画分よりＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ社製）の標準法に従い、ヒトＣＤ６９ホモダイマータンパク質の精製を行った。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製したヒトＣＤ６９組み換えタンパク質の９５％以上の純度を確認し、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いてタンパク質濃度を決定した。

【0096】

（２）ヒトＣＤ６９組み換えタンパク質のビオチン化
精製したヒトＣＤ６９組み換えタンパク質は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＯ_４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の標準プロトコールに従ってビオチン化し、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて濃度を決定した。

【0097】

（３）ファージディスプレイ法によるヒトＣＤ６９特異的抗体クローンの選択
ビオチン化したヒトＣＤ６９組み換えタンパク質は、ストレプトアビジンコート磁性体ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１ 磁性体ビーズ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)１００μlに４℃、１時間固相化し、１ｍｌのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）で５回洗浄した。ヒト抗体ファージライブラリーにはＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ社製）を用い、ＷＯ２００７/０４２３０９及びＷＯ２００６/１２２７９７等に記載された方法に従って抗体選択を行った。ファージライブラリーにヒトＣＤ６９固相化ビーズを加えて抗原特異的抗体を結合させた。磁性体ビーズを回収し、数回洗浄を行った後、ファージを磁性体ビーズから溶出させた。溶出したファージは、大腸菌に感染させ、３７℃で一晩培養した。尚、ファージ感染大腸菌からのファージレスキュー操作は一般的な方法に従った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｉｒｄ． Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）。以上に記載した選択ラウンドを複数回繰り返して抗原特異的抗体を提示するファージの濃縮操作を行った。

【0098】

（４）ＥＬＩＳＡによる抗原特異的抗体のスクリーニング
濃縮操作後に得られたＦａｂ遺伝子のプールを大腸菌発現ベクターにサブクローニングした。ＷＯ２００６/１２２７９７等に記載の手法に従って、Ｆａｂ抗体を発現させ、ＥＬＩＳＡ法により抗原特異的抗体のスクリーニングを行った。Ｆａｂ抗体は大腸菌破砕液の可溶性画分よりＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ社製）の標準法に従い精製を行った。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製抗体の純度を確認し、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて濃度を決定した。

【0099】

（５）細胞染色評価による抗体クローンのスクリーニング
精製したＥＬＩＳＡ陽性のＦａｂ抗体クローンは更にヒトＣＤ６９およびマウスＣＤ６９過剰発現細胞に対する細胞染色によって抗原反応性の評価を行った。抗原にはヒトＣＤ６９もしくはマウスＣＤ６９発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた標準方法でトランスフェクションして４８時間後に４％ ＰＦＡで固定したＣＨＯ−Ｓ細胞を用いた。染色の１次抗体には５０μｇ/ｍｌの精製Ｆａｂ抗体を使用し、室温で１時間インキュベートした後にＰＢＳで３回洗浄した。２次抗体には５００倍希釈したＡｌｅｘａ５５５標識のａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して室温で１時間インキュベートした後にＰＢＳで３回洗浄した。これを蛍光顕微鏡（ＩＸ７１，ＯＬＹＭＰＵＳ社製）で観察することによって染色の有無を評価した。その結果、１６０−ｃ７６クローンがヒトＣＤ６９（ｈＣＤ６９）とマウスＣＤ６９（ｍＣＤ６９）双方に結合し、（図１）、また、１６０−ｃ７と１６０−ｃ１０３はヒトＣＤ６９のみに結合することが確認され、最終的に合計３クローンが細胞表面上の天然型ヒトＣＤ６９特異的に結合する抗ヒトＣＤ６９抗体クローンとして得られた。

【0100】

（６）抗ヒトＣＤ６９抗体クローンの塩基配列解析
得られた３クローン（１６０−ｃ７、１６０−ｃ７６、１６０−ｃ１０３）の大腸菌を培養し、プラスミドを回収(ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉＰｒｅｐ ｋｉｔ：ＱＩＡＧＥＮ社製)して塩基配列解析に使用した。表１に、それぞれのクローンのＣＤＲ（相補性決定領域）のアミノ酸配列を示した。

【0101】

【表1】

【0102】

（７）抗ヒトＣＤ６９抗体クローンのＩｇＧ抗体作製
得られた３クローンのＦａｂ抗体遺伝子をサブクローニングすることでＩｇＧ発現ベクター（重鎖の定常領域はＩｇＧ４）を構築した。これらの発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の標準方法に従ってＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、７２時間培養後の培養上清を回収した。尚、培地にはＵｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製)を１０％で添加したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。この培養上清からｒＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いた標準方法によってＩｇＧ抗体を精製した。精製後のタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単一バンドであることを確認、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ(ＰＩＥＲＣＥ社製)を用いて濃度を決定した。

【0103】

［実施例２］
肺胞内単核球浸潤に対する抗ヒトＣＤ６９抗体の効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＢＡＬＢ／ｃに対して１０回以上バッククロスしたＣＤ６９欠損（ＣＤ６９ＫＯ）マウス（Ｍｕｒａｔａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ２００３． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５： ９８７−９９２）とＤＯ１１．１０ トランスジェニックマウスを掛け合わせた個体を使用した。これらのマウスの脾臓ＣＤ４Ｔ細胞を、ＡｕｔｏＭＡＣＳソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて精製し、＞９８％の純度とした。単離したＣＤ４Ｔ細胞を、Ｔｈ２条件下（ＩＬ−２ １０ｕ／ｍｌ, ＩＬ−４ １００Ｕ／ｍｌ）で固相化した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体により刺激しながら培養し、培養開始から２日後に、ヒトＣＤ６９（ｈＣＤ６９）遺伝子を含むレトロウイルスベクターにより、ヒトＣＤ６９遺伝子を導入した。ヒトＣＤ６９遺伝子導入の方法は、既述の方法に準じた（Ｋｉｍｕｒａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２００１． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １５： ２７５−２８７．）。培養開始から５日後に、培養した細胞を回収し、フローサイトメトリーにより、ヒトＣＤ６９発現を確認した（図２）。５０．２％の細胞がヒトＣＤ６９陽性であった。

【0104】

３００万個の、上記培養により得られたヒトＣＤ６９（ｈＣＤ６９）を過剰発現する、ＣＤ６９ＫＯマウスＴｈ２細胞、又は野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスのＴｈ２細胞を、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス中に静注投与した（ｄａｙ０）。細胞移入後、ｄａｙ１及び３に、超音波ネブライザー(ＮＥ−Ｕ０７; Ｏｍｒｏｎ社製)を用いて、３０分間、エアロゾル化した生理食塩水中の１％ＯＶＡ溶液をマウスに吸入させることにより、気道を介してマウスをアレルゲンチャレンジに曝露した。

【0105】

ｄａｙ１のＯＶＡ吸入の２時間前に、以下の抗体を１００μｇ／マウスの用量で腹腔内に注入した：
コントロール抗体（抗“ＴＳＬＹＫＫＡＧ” ｐｅｐｔｉｄｅ ＩｇＧ４ 自社開発）
マウス抗ヒトＣＤ６９モノクローナル抗体（ＦＮ５０ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）
１６０−ｃ７
１６０−ｃ７６
１６０−ｃ１０３

【0106】

Ｄａｙ５に、既報に従い肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った（Ｋａｍａｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１１： １０９−１１９）。全ての肺胞洗浄液を採集し、１５０μｌ分取液中の細胞をカウントした。１０万個の生存しているＢＡＬ細胞をサイトスピン４(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)によりスライド上に細胞遠心分離し、メイグリュンワルドギムザ溶液（メルク社製）により染色した。各スライド上、５００個の白血球をカウントし、細胞型を、形態学的クライテリアを用いて同定した。各細胞型の百分率を計算した。

【0107】

結果を図３に示す。抗ｈＣＤ６９抗体は、ＯＶＡ吸入により生じる肺胞内への単核球の浸潤、特に好酸球の浸潤を抑制した。

【0108】

［実施例３］
高親和性抗ヒトＣＤ６９抗体の選択
実施例１で選択した抗体群の軽鎖ＣＤＲ３に変異を導入することにより、よりヒトＣＤ６９への親和性が高い抗体の選択を試みた。具体的には、Ｐｒａｓｓｌｅｒ Ｊ， Ｓｔｅｉｄｌ Ｓ， Ｕｒｌｉｎｇｅｒ Ｓ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． ２００９ Ｊｕｌ；１（４）：５７１−８３．および Ｈｉｌｌｉｇ ＲＣ， Ｕｒｌｉｎｇｅｒ Ｓ， Ｆａｎｇｈａｎｅｌ Ｊ， Ｂｒｏｃｋｓ Ｂ， Ｈａｅｎｅｌ Ｃ， Ｓｔａｒｋ Ｙ， Ｓｕｌｚｌｅ Ｄ， Ｓｖｅｒｇｕｎ ＤＩ， Ｂａｅｓｌｅｒ Ｓ， Ｍａｌａｗｓｋｉ Ｇ， Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ Ｄ， Ｍｅｎｒａｄ Ａ， Ｓｃｈｉｒｎｅｒ Ｍ， Ｌｉｃｈａ Ｋ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００８ Ｍａｒ １４；３７７（１）：２０６−１９．に記述されている方法に従った。２回の抗体選択ラウンドを実施した後、得られた抗体クローン群の軽鎖ＣＤＲ３の塩基配列を調べて新規の配列を持った抗体クローンを同定した。これらを大腸菌内で発現させ、その溶菌液を用いて抗原に対するＥＬＩＳＡを行うと同時に、溶菌液中の抗体量をサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。抗原に対するＥＬＩＳＡの吸光度と抗体量より各クローンの結合比活性を算出し、高親和性クローンを選抜した。また、高親和性上位１０クローンについてはＩｇＧ化を行いＫ_Ｄ値の測定を行った。

【0109】

実施例１と同様に、Ｆａｂ抗体遺伝子をサブクローニングすることでＩｇＧ発現ベクター（重鎖の定常領域はＩｇＧ４）を構築した。これらの発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、７２時間培養し、回収した培養上清からＩｇＧ抗体を精製した。

【0110】

調製したＩｇＧクローンのヒトＣＤ６９への親和性を、ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｐｌｏｔにより評価した。具体的には、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ （ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ， ２０００）に記載されている原理に従い算出した。抗体を様々な濃度の抗原と平衡状態に達するまで室温で２時間インキュベーションを行い、これらのインキュベーション液中に存在する遊離抗体の量をＥＬＩＳＡ法で測定した。各平衡化サンプルの遊離抗体量の変化に基づき結合定数および解離定数(Ｋ_Ｄ値)を求めた。尚、平衡化反応時の抗体濃度は０．０１５ μｇ/ｍｌとし、遊離抗体量を測定する際のＥＬＩＳＡプレートには抗原を１ μｇ/ｍｌで固相化したものを用いた。

【0111】

その結果、軽鎖ＣＤＲ３以外のＣＤＲが１６０−ｃ７６と同じクローン群において、マウスＣＤ６９への交差反応性を維持しつつ、ヒトＣＤ６９へ結合する複数の高親和性クローンが選択された。表２に、特にヒトＣＤ６９への親和性が高かった２クローン、２３４−６１及び２３４−８３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列および親和性を示す。これら２クローンの親和性は、軽鎖ＣＤＲ３以外が同じ配列である１６０−ｃ７６クローンと比較して、ヒトＣＤ６９への親和性が９倍以上増加した。

【0112】

【表2】

【0113】

［実施例４］
マウスＣＤ６９への交差反応性
マウスＣＤ６９への反応性を以下の通り評価した。野生型マウス及びＣＤ６９ＫＯマウス（いずれもＢａｌｂ／ｃ）から脾細胞を単離し、Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）で４時間刺激することにより、ＣＤ６９の細胞表面上への発現を誘導した。１×１０^６個の脾細胞に対して、各抗ヒトＣＤ６９抗体（１６０−ｃ７６、２３４−６１及び２３４−８３）を１μｇ添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、二次抗体としてＡｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８ （ｘ２００ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ：Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により、各抗ヒトＣＤ６９抗体による染色強度を評価した。陽性対照として、Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ６９ ハムスターモノクローナル抗体 （Ｈ１．２Ｆ３）−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。
一方、ヒトＣＤ６９への反応性を、ＰＭＡで４時間刺激することにより、ＣＤ６９の細胞表面上への発現を誘導した健常人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて、マウスＣＤ６９と同様に評価した。陽性対照として、Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６９ マウスモノクローナル抗体（ＦＮ５０）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いた。

【0114】

その結果、１６０−ｃ７６、２３４−６１及び２３４−８３のいずれのクローンも、活性化マウス脾細胞及び活性化ヒト末梢血単核球に結合し、マウスＣＤ６９（ｍＣＤ６９）とヒトＣＤ６９（ｈＣＤ６９）の双方へ交差反応することが示された（図４）。１６０−ｃ７６と比較して、２３４−６１によるマウスＣＤ６９の染色強度は弱かった。一方、２３４−８３は、マウスＣＤ６９へ強力に結合した。

【0115】

［実施例５］
肺胞内単核球浸潤に対する抗ヒトＣＤ６９抗体の効果
実施例２と同様のプロトコールにより、肺胞内単核球浸潤に対する以下の抗ヒトＣＤ６９抗体の効果を評価した。
コントロール抗体（抗”ＴＳＬＹＫＫＡＧ” ｐｅｐｔｉｄｅ ＩｇＧ４ 自社開発）
マウス抗ヒトＣＤ６９モノクローナル抗体（ＦＮ５０ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）
１６０−ｃ７６
２３４−６１
２３４−８３

【0116】

即ち、ＢＡＬＢ／ｃに対して１０回以上バッククロスしたＣＤ６９欠損（ＣＤ６９ＫＯ）マウスを、４ｍｇの水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）中の２５０μｇのＯＶＡ（シグマーアルドリッチからの鶏卵アルブミン）により、腹腔内に免疫した。ＯＶＡ感作したＣＤ６９欠損マウスの脾臓ＣＤ４Ｔ細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）及びＡｕｔｏＭＡＣＳソーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いて、精製し、＞９８％の純度とした。単離したＣＤ４Ｔ細胞を、Ｔｈ２条件下で固相化した抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２８ｍＡｂにより刺激しながら培養し、培養開始から２日後に、ヒトＣＤ６９（ｈＣＤ６９）遺伝子を含むレトロウイルスベクターにより、ｈＣＤ６９遺伝子を導入した。培養開始から５日後に、培養した細胞を回収し、フローサイトメトリーにより、ｈＣＤ６９発現を確認した。５８．７％の細胞がｈＣＤ６９陽性であった。

【0117】

３００万個の、上記培養により得られたｈＣＤ６９を過剰発現するＣＤ６９ＫＯマウスＴｈ２細胞、又は野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスのＴｈ２細胞を、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス中に静注投与した（ｄａｙ０）。細胞移入後、ｄａｙ１及び３に、超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ０７； Ｏｍｒｏｎ社製）を用いて、３０分間、エアロゾル化した生理食塩水中の１％ＯＶＡ溶液をマウスに吸入させることにより、気道を介してマウスをアレルゲンチャレンジに曝露した。

【0118】

ｄａｙ１のＯＶＡ吸入の２時間前に、評価対象の抗体を１００μｇ／マウスの用量で腹腔内に注入した。ｄａｙ４に、既報に従い肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った（Ｋａｍａｔａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１１： １０９−１１９）。全ての肺胞洗浄液を採集し、１５０μｌ分取液中の細胞をカウントした。１０万個の生存しているＢＡＬ細胞をサイトスピン４(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)によりスライド上に細胞遠心分離し、メイグリュンワルドギムザ溶液（メルク社製）により染色した。各スライド上、５００個の白血球をカウントし、細胞型を、形態学的クライテリアを用いて同定した。各細胞型の百分率を計算した。

【0119】

結果を図５に示す。評価したいずれの抗ｈＣＤ６９抗体も、ＯＶＡ吸入により生じる肺胞内への白血球（好酸球、好中球、リンパ球、マクロファージ）の浸潤を抑制した。白血球浸潤抑制能はＦＮ５０＜１６０−ｃ７６＜２３４−６１＜２３４−８３であり、親和性向上による白血球浸潤抑制能の増強が確認された。

【0120】

［実施例６］
エピトープの同定
ヒトＣＤ６９の部分ペプチドを固定化したペプチドアレイを用いて、抗ヒトＣＤ６９抗体２３４−８３、１６０−ｃ７及び１６０−ｃ１０３について、エピトープマッピングを行った。具体的には、下記の表のように、ヒトＣＤ６９の細胞外ドメインをカバーする配列（６０−１９９）に対して、残基数が１２アミノ酸残基でオフセットが３アミノ酸残基のペプチド群からなるペプチドアレイを作製した（ＰｅｐＳｐｏｔｓ, ＪＰＴ社製）。ペプチドアレイと抗ヒトＣＤ６９抗体の反応はＪＰＴ社のマニュアルに従い行った。抗ヒトＣＤ６９抗体はＨＲＰ標識（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ - ＮＨ２, Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）したものを用いた。

【0121】

【表3】

【0122】

その結果、２３４−８３は、上記ペプチド＃２及び＃３に特異的に結合し、特にペプチド＃３に対して強力に結合した。この結果から、２３４−８３のエピトープには、ペプチド＃２とペプチド＃３に共通し、且つヒトＣＤ６９とマウスＣＤ６９に共通する配列番号３３で表されるアミノ酸配列（ＹＮＣＰＧ）が含まれることが示唆された（図６）。

【0123】

１６０−ｃ７は、上記ペプチド＃２６に特異的に結合した。この結果から、１６０−ｃ７は配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなるエピトープにおいてヒトＣＤ６９に結合することが示された。

【0124】

１６０−ｃ１０３は、上記ペプチド＃２４、＃２５及び＃２６に特異的に結合した。この結果から、１６０−ｃ１０３のエピトープには、ペプチド＃２４、＃２５及び＃２６に共通する配列番号７８で表されるアミノ酸配列（ＹＡＧＲＥＥ）が含まれることが示唆された。

【産業上の利用可能性】

【0125】

本発明によれば、アレルギー性疾患や炎症性疾患の予防又は治療に応用可能な抗ヒトＣＤ６９抗体が提供される。また、本発明によれば、抗ヒトＣＤ６９抗体の薬理学的効果をインビボにおいて評価可能な動物モデルが提供される。
本出願は日本で出願された特願２０１２−０９８２４３（出願日：２０１２年４月２３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]