特許 6288759 トランスグルタミナーゼ活性化剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6288759

(24)【登録日】2018年2月16日

(45)【発行日】2018年3月7日

(54)【発明の名称】トランスグルタミナーゼ活性化剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/19 20060101AFI20180226BHJP

   A61K 8/97 20170101ALI20180226BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20180226BHJP

   A61Q 5/04 20060101ALI20180226BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20180226BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180226BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/19

   A61K8/97

   A61Q19/00

   A61Q5/04

   A61P17/16

   A61P43/00 111

   A61P43/00 105

【請求項の数】4

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2013-178621(P2013-178621)

(22)【出願日】2013年8月29日

(65)【公開番号】特開2014-62089(P2014-62089A)

(43)【公開日】2014年4月10日

【審査請求日】2016年6月9日

(31)【優先権主張番号】特願2012-188767(P2012-188767)

(32)【優先日】2012年8月29日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100076439

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 敏三

(74)【代理人】

【識別番号】100141771

【弁理士】

【氏名又は名称】星野 宏和

(74)【代理人】

【識別番号】100155505

【弁理士】

【氏名又は名称】野明 千雪

(72)【発明者】

【氏名】石川 准子

(72)【発明者】

【氏名】陳 施

(72)【発明者】

【氏名】光永 紫乃

(72)【発明者】

【氏名】菅井 由也

(72)【発明者】

【氏名】下豊留 芳枝

(72)【発明者】

【氏名】大矢 直樹

【審査官】 横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０１０８６８１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０５−１８６３２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０２４１９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１１４１４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０９００９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２４２３１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−０６７６７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−１６０４２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０２０７５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０４３３３０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J Chinese Chemical Society, 1992, Vol.39 No.4, p.351-353

【文献】 J Cosmetic Dermatology, 2013, Vol.12 p.3-11

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００

Ａ６１Ｋ ８／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ハグロソウ（Peristrophe japonica）の抽出物を有効成分とする、トランスグルタミナーゼ活性化剤。

【請求項2】

ハグロソウ（Peristrophe japonica）の抽出物を有効成分とする、セラミド産生促進剤。

【請求項3】

ハグロソウ（Peristrophe japonica）の抽出物を有効成分とする、インボルクリン発現促進剤。

【請求項4】

ハグロソウ（Peristrophe japonica）の抽出物を有効成分とする、くせ毛化剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、及びインボルクリン発現促進剤に関する。

【背景技術】

【0002】

表皮の角質層は、体内の水分の蒸散や外界からの刺激や異物侵入を防ぐバリア機能を担っている。角質層は角質細胞と細胞間脂質から構成され、角質細胞はコーニファイドエンベロープ（cornified envelope）と呼ばれる細胞膜様構造体で包まれている。コーニファイドエンベロープは、安定な角質細胞構造の構築に寄与しており、皮膚のバリア機能維持にとって重要な構造である。コーニファイドエンベロープは、角層の基底層にあるケラチノサイトが角化するとともに、角化に必要なタンパク質であるインボルクリン（本明細書において、「ＩＶＬ」ともいう）やロリクリン等が合成され、次いでそれらのタンパク質がトランスグルタミナーゼの活性化により架橋されることで形成される。インボルクリンの発現・合成やトランスグルタミナーゼの活性は、コーニファイドエンベロープの正常な形成と表皮の正常な角化、ひいては皮膚の保湿機能の維持・改善にとって重要である。この点について、インボルクリンの発現促進及びトランスグルタミナーゼの活性化が、皮膚の正常な角化、バリア機能改善、及び肌荒れ改善につながることが報告されている（例えば、非特許文献１及び２、並びに特許文献１及び２参照）。

【0003】

また、スフィンゴ脂質の一つであるセラミドは、生体全体の中では微量しか存在しない脂質である。しかし、皮膚の最も外側の層である角層中において、セラミドは脂質の約半分を占め、皮膚の保湿機構、バリア機構に重要な役割を果たしている。このセラミドは表皮細胞中において産生、分泌された後に角層の細胞間においてラメラ構造を構築することにより機能する。しかし、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症、乾癬等の皮膚疾患においては、セラミドの健全な代謝が妨げられ、角層中のセラミド量が減少し、皮膚の保湿能の低下や表皮の角化不全、バリア能の低下等を引き起こしていることが数多く報告されている（非特許文献３参照）。セラミドの産生を促進する物質には、動物細胞の増殖抑制、分化誘導、アポトーシスを誘導するなどの効果が期待でき、ひいては炎症性疾患、悪性腫瘍など、細胞の増殖あるいは分化の異常に起因する疾患に対する治療効果が期待できると考えられている（非特許文献４参照）。さらに、セラミドには、骨吸収抑制作用、骨強化作用、歯槽骨減少抑制作用があり、骨粗鬆症、骨折、腰痛、リウマチなどの骨関節疾患の予防及び改善に有用であること（特許文献３参照）、歯周病の予防に効果があること（特許文献４参照）、セラミドには、毛髪のハリ、コシの付与及び感触改善作用があることも報告されている（特許文献５参照）。
このようにセラミドには種々の効能が期待できることもあり、セラミドの産出を促進しうる物質の探求が望まれている。

【0004】

また、インボルクリン等の角化関連タンパク質は毛髪形成にも関与することが知られている。例えば、毛髪毛根部における遺伝子発現解析の結果、くせ毛形質者ではインボルクリン遺伝子の発現量が有意に増加していること、及びインボルクリン遺伝子の発現量を増加させる物質がくせ毛や縮毛の促進剤又はウェーブ化促進剤となりうることが報告されている（特許文献６参照）。

【0005】

キツネノマゴ（Acanthaceae）科ハグロソウ（Peristrophe）属に属する植物の１種であるハグロソウ（Peristrophe japonica）について、その抽出物の生理活性としては、メラニン生成の抑制効果及びドーパオキシダーゼ活性の抑制効果を有すること等が知られている（例えば、特許文献７参照）。しかし、ハグロソウの抽出物がトランスグルタミナーゼを活性化し、セラミドの産生、及びインボルクリンの発現を促進し、皮膚のバリア機能や保湿機能の維持又は改善、肌荒れの予防又は改善、並びに毛髪のくせ毛化、縮毛、ウェーブ化に有用であることはこれまで知られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００４−９１３７６号公報

【特許文献2】特開２００７−１９１４号公報

【特許文献3】特開２００１−１５８７３６号公報

【特許文献4】特開２００１−１５８７３５号公報

【特許文献5】特開平１０−１５２４２１号公報

【特許文献6】国際公開２０１１/０４３３３０号パンフレット

【特許文献7】国際公開２０１２/０９９２４７号パンフレット

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Kalinin，A.，et al.，Journal of Cell Science，2001，vol．114，p．3069-3070

【非特許文献2】Rawlings，A．V.，et al.，Journal of Investigative Dermatology，2005，vol．124，p．1099-1110

【非特許文献3】Ishikawa，J.，et al.，Journal of Cosmetic Dermatology，2013，vol．12，p．3-11

【非特許文献4】David E．Modrak，et al.，Molecular Cancer Therapeutics，2006，vol．5(2)，p．200-208

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、トランスグルタミナーゼを活性化し、皮膚のバリア機能や保湿機能の維持又は改善、肌荒れの予防又は改善に有用な、トランスグルタミナーゼ活性化剤の提供を課題とする。
また、本発明は、セラミドの産生を促進し、皮膚のバリア機能や保湿機能の維持又は改善、肌荒れの予防又は改善などに有用な、セラミド産生促進剤の提供を課題とする。
さらに、本発明は、インボルクリンの発現を促進し、皮膚のバリア機能や保湿機能の維持又は改善、肌荒れの予防又は改善、並びに毛髪のくせ毛化、縮毛、ウェーブ化に有用な、インボルクリン発現促進剤の提供を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者等は上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、ハグロソウの抽出物が、トランスグルタミナーゼを活性化すること、セラミドの産生を促進すること、及びインボルクリンの発現を促進することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。

【0010】

本発明は、ハグロソウの抽出物を有効成分とする、トランスグルタミナーゼ活性化剤に関する。
また、本発明は、ハグロソウの抽出物を有効成分とする、セラミド産生促進剤に関する。
また、本発明は、ハグロソウの抽出物を有効成分とする、インボルクリン発現促進剤に関する。
また、本発明は、ハグロソウの抽出物を有効成分とする、表皮角化改善剤に関する。
また、本発明は、ハグロソウの抽出物を有効成分とする、皮膚保湿機能改善剤に関する。
また、本発明は、ハグロソウの抽出物を有効成分とする、皮膚バリア機能改善剤に関する。
また、本発明は、ハグロソウの抽出物を有効成分とする、肌荒れ予防又は改善剤に関する。
さらに、本発明は、ハグロソウの抽出物を有効成分とする、くせ毛化剤に関する。

【発明の効果】

【0011】

本発明のトランスグルタミナーゼ活性化剤は、トランスグルタミナーゼを活性化し、皮膚のバリア機能や保湿機能の維持又は改善、肌荒れの予防又は改善に有用である。
本発明のセラミド産生促進剤は、セラミドの産生を促進し、皮膚のバリア機能や保湿機能の維持又は改善、肌荒れの予防又は改善などに有用である。
本発明のインボルクリン発現促進剤は、インボルクリンの発現を促進し、皮膚のバリア機能維持又は改善、肌荒れの予防又は改善や毛髪のくせ毛化、縮毛、ウェーブ化に有用である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患、症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
また、本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
さらに、本明細書において、「肌荒れ」とは、皮膚の保湿力が低下して皮膚の水分が奪われ、皮膚表面に落屑や皮膚のひび割れが認められる状態又は皮膚表面粗さが大きくなるような状態をいう。このような状態の皮膚を「あれ肌」又は「ドライスキン」ともいう。

【0013】

本発明のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、及びインボルクリン発現促進剤は、ハグロソウの抽出物を有効成分とする。後述の実施例で実証するように、ハグロソウの抽出物は、トランスグルタミナーゼ活性化効果、セラミドの産生促進効果、及びインボルクリン発現促進効果を有する。
また、本発明の表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、及び肌荒れ予防又は改善剤も、ハグロソウの抽出物を有効成分とする。前述のように、トランスグルタミナーゼの活性化、セラミドの産生促進、及びインボルクリンの発現促進は、表皮の角化改善や皮膚の保湿機能の改善、皮膚のバリア機能維持、及び肌荒れの予防又は改善に非常に重要である。したがって、トランスグルタミナーゼ活性化効果、セラミドの産生促進効果、及びインボルクリン発現促進効果を有するハグロソウの抽出物を、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、及び肌荒れ予防又は改善剤の有効成分とすることができる。
また、前述のように、セラミドは細胞の増殖、分化、アポトーシス等の制御に関係する。そのため、セラミドの産生を促進するハグロソウの抽出物は、動物細胞の増殖抑制、分化誘導、アポトーシスの誘導等により、炎症性疾患、悪性腫瘍など、細胞の増殖あるいは分化の異常に起因する疾患を予防又は治療するための医薬品、医薬部外品等に有用である。また、ハグロソウの抽出物は、骨粗鬆症、骨折、腰痛、リウマチなどの骨関節疾患の予防又は改善、歯周病の予防又は改善のための医薬品、医薬部外品等にも使用しうる。さらに、ハグロソウの抽出物は、毛髪にハリ・コシを付与したり毛髪の感触を改善するための医薬部外品、化粧品等の用途にも有用である。
さらに、前述のように、インボルクリン遺伝子の発現量を増加させる物質がくせ毛や縮毛の促進剤又はウェーブ化促進剤となりうる。したがって、インボルクリン発現促進効果を有するハグロソウの抽出物を、くせ毛化剤の有効成分とすることができる。なお、本明細書において「くせ毛化」とは、毛髪のくせ毛や縮毛の促進、ウェーブ化の促進を包含するものである。

【0014】

本明細書における「ハグロソウ」は、キツネノマゴ科ハグロソウ属の植物である。
ハグロソウ抽出物の製造には、ハグロソウの任意の部分が使用可能であり、全草、根、塊根、根茎、幹、枝、茎、葉（葉身、葉柄等）、樹皮、樹液、樹脂、花（花弁、子房等）、果実（成熟果実、未熟果実等）、種子等を用いることができる。また、これらの部位を複数組み合わせて用いてもよい。なかでも、本発明に用いるハグロソウの抽出物は、ハグロソウの全草の抽出物であることが好ましい。

【0015】

本発明に用いるハグロソウの抽出物は、植物抽出等に用いられる通常の抽出方法により得ることができる。抽出方法は適宜設定することができ、上記植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得ることが好ましい。
ハグロソウの抽出物の調製には、ハグロソウをそのまま又は乾燥粉砕して用いることができる。また、ハグロソウの水蒸気蒸留物又は圧搾物を用いることもでき、これらは精油等より精製したものを用いることもでき、また市販品を利用することもできる。ハグロソウ、又はその水蒸気蒸留物若しくは圧搾物は、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。

【0016】

ハグロソウの抽出物の調製に用いる抽出溶媒は適宜選択することができ、植物成分の抽出に通常用いられるもの、例えば水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、1,2-ブチレングリコール、1,3-ブチレングリコール、1,4-ブチレングリコール、2,3-ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他オイル等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。なかでも、水、エタノール、及びエタノール水溶液が好ましく、エタノール水溶液がより好ましく、アルコール含有率が３０体積％以上のエタノール水溶液がさらに好ましく、アルコール含有率が４０体積％以上のエタノール水溶液が特に好ましい。また、抽出に際して酸やアルカリなどを添加し、抽出溶媒のｐＨを調整してもよい。

【0017】

抽出条件も通常の条件を適用でき、例えばハグロソウを０℃以上１００℃以下で０．５時間以上３０日間以下浸漬又は加熱還流すればよい。抽出効率を上げる為、併せて攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。用いる抽出溶媒の量は、ハグロソウの重量に対して１倍量以上（好ましくは５倍量以上）１００倍量以下（好ましくは５０倍量、より好ましくは４０倍量以下）である。

【0018】

本発明において、ハグロソウの抽出物をそのまま用いてもよいし、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留等により活性の高い画分を分画して用いることもできる。また、得られたハグロソウの抽出物を希釈、濃縮又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、前記方法により得られた抽出物を、前記抽出溶媒とは異なる溶媒で転溶して用いることもできる。
本発明において抽出物とは、前記のような抽出方法で得られた各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液、その精製画分、その乾燥末又はその転溶液を含むものである。

【0019】

本発明のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ抑制又は改善剤、及びくせ毛化剤の形態は適宜選択することができ、例えば、医薬組成物、化粧料組成物若しくは食品組成物とするか、又はこれらに含有させることができる。

【0020】

医薬組成物を調製する場合は、通常、前記有効成分と好ましくは薬学的に許容される担体を含む製剤として調製する。薬学的に許容される担体とは、一般的に、前記有効成分とは反応しない、不活性の、無毒の、固体又は液体の、増量剤、希釈剤又はカプセル化材料等をいい、例えば、水、エタノール、ポリオール類（例えば、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリン、及びポリエチレングリコール等）、適切なそれらの混合物、植物性油などの溶媒又は分散媒体などが挙げられる。

【0021】

医薬組成物は、経口により、非経口により、例えば、口腔内に、皮膚に、皮下に、粘膜に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に、膣内に、肺に、脳内に、眼に、及び鼻腔内に投与される。経口投与製剤としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ペレット剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤及び吸入剤などが挙げられる。非経口投与製剤としては、坐剤、保持型浣腸剤、点滴剤、点眼剤、点鼻剤、ペッサリー剤、注射剤、口腔洗浄剤並びに軟膏、クリーム剤、ゲル剤、制御放出パッチ剤及び貼付剤などの皮膚外用剤などが挙げられる。医薬組成物は、徐放性皮下インプラントの形態で、又は標的送達系（例えば、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン注入、ポリマーマトリックス、リポソーム及びミクロスフェア）の形態で、非経口で投与してもよい。

【0022】

医薬組成物はさらに医薬分野において慣用の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用できる。長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸等が挙げられる。必要に応じてその他の添加剤や薬剤、例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ヒドロタルサイト等）、胃粘膜保護剤（合成ケイ酸アルミニウム、スクラルファート、銅クロロフィリンナトリウム等）を加えてもよい。

【0023】

化粧料組成物を調製する場合、その形態は適宜選択することができ、溶液、乳液、粉末、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ゲル、タブレット等の固形、エアゾール、ミスト、カプセル及びシート等任意の形態とすることができる。また、化粧料組成物の製品形態も任意であり、例えば、洗顔料、メーク落とし、化粧水、美容液、パック、乳液、クリーム及びサンスクリーン等のスキンケア化粧料、ファンデーション、化粧下地、口紅、アイシャドー、アイライナー、マスカラ、アイブロー、頬紅及びネイルエナメル等のメイクアップ化粧料、ヘアシャンプー、ヘアリンス、整髪料、染毛料及び育毛剤等の毛髪化粧料、石鹸、ボディソープ、デオドラント化粧料及び浴用剤等のボディ洗浄料、歯磨剤及び洗口剤等の口腔化粧料、香水等の芳香化粧料等が挙げられる。また、この化粧料は、日本の薬事法上、化粧品もしくは医薬部外品のどちらに属しても良い。

【0024】

化粧料組成物は、化粧品、医薬部外品及び医薬品等に慣用される他の成分、例えば、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、水溶性高分子、増粘剤、皮膜剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール、糖、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルジョン、ｐＨ調整剤、皮膚栄養剤、ビタミン、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、水等を必要に応じて配合し、常法により製造することができる。
その他の化粧料組成物に配合可能な成分としては、例えば、防腐剤（エチルパラベン、ブチルパラベン等）、消炎剤（例えば、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸誘導体、サリチル酸誘導体、ヒノキチオール、酸化亜鉛、アラントイン等）、美白剤（例えば、アスコルビン酸及びその誘導体、胎盤抽出物、ユキノシタ抽出物、アルブチン等）、各種抽出物（例えば、オウバク、オウレン、シコン、シャクヤク、センブリ、バーチ、セージ、ビワ、ニンジン、アロエ、ゼニアオイ、アイリス、ブドウ、ヨクイニン、ヘチマ、ユリ、サフラン、センキュウ、ショウキュウ、オトギリソウ、オノニス、ニンニク、トウガラシ、チンピ、トウキ、海藻等）、賦活剤（例えば、ローヤルゼリー、感光素、コレステロール誘導体等）、血行促進剤（例えば、ノニル酸ワレニルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、ニコチン酸β−ブトキシエチルエステル、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、タンニン酸、α−ボルネオール、ニコチン酸トコフェロール、イノシトールヘキサニコチネート、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、ベラパミル、セファランチン、γ−オリザノール等）、抗脂漏剤（例えば、硫黄、チアントール等）、抗炎症剤（例えば、トラネキサム酸、チオタウリン、ヒポタウリン等）及び殺菌剤（例えば、トリクロサン、塩化セチルピリジニウム、チモール類、塩化ベンザルコニウム等）等が挙げられる。

【0025】

前記医薬組成物及び化粧料組成物は、口腔用組成物、外用組成物、内服組成物などの形態で適用することができ、皮膚外用組成物の形態で用いることが好ましい。
皮膚外用組成物の形態で使用する場合、ハグロソウ抽出物の他に、通常の皮膚外用組成物に用いられる成分、例えば界面活性剤、油性物質、高分子化合物、防腐剤、各種の薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等を適宜配合できる。薬効成分としては、表皮角化改善剤や皮膚保湿機能改善剤の場合は、例えば、ビタミンＤ３、スフィンゴシン誘導体、オレアノール酸、クロフィブリン酸、オレイエタノールアミドが挙げられる。

【0026】

食品組成物を調製する場合、その形態は適宜選択することができ、飲料も包含される。一般食品の他に、表皮の角化改善又は皮膚の保湿機能やバリア機能改善・維持等、トランスグルタミナーゼの活性化、セラミドの産生促進、及びインボルクリンの発現促進のいずれかにより治療、予防又は改善しうる疾患又は状態の治療、予防又は改善等をコンセプトとしてその旨を表示した飲食品、すなわち、健康食品、機能性食品、病者用食品及び特定保健用食品なども包含される。健康食品、機能性食品、病者用食品及び特定保健用食品は、具体的には、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、流動食等の各種製剤形態として使用することができ、これら製剤のために使用することができる。製剤形態の食品組成物は、医薬製剤と同様に製造することができ、前記有効成分と、食品として許容できる担体、例えば適当な賦形剤（例えば、でん粉、加工でん粉、乳糖、ブドウ糖、水等）等とを混合した後、慣用の手段を用いて製造することができる。さらに、食品組成物は、スープ類、ジュース類、乳飲料、茶飲料、コーヒー飲料、ココア飲料、ゼリー状飲料などの液状食品組成物、プリン、ヨーグルトなどの半固形食品組成物、パン類、うどんなどの麺類、クッキー、チョコレート、キャンディ、ガム、せんべいなどの菓子類、ふりかけ、バター、ジャムなどのスプレッド類等の形態もとりうる。また、食品には、飼料も含まれる。

【0027】

食品組成物には、種々の食品添加物、例えば、酸化防止剤、香料、各種エステル類、有機酸類、有機酸塩類、無機酸類、無機酸塩類、無機塩類、色素類、乳化剤、保存料、調味料、甘味料、酸味料、果汁エキス類、野菜エキス類、花蜜エキス類、ｐＨ調整剤、品質安定剤などの添加剤を単独、あるいは併用して配合してもよい。

【0028】

本発明のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤の投与対象は、好ましくは温血脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物である。本明細書において哺乳動物は、例えば、ヒト、並びにサル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの非ヒト哺乳動物が挙げられる。本発明のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤は、ヒト、サルなどの霊長類、特にヒトへの投与に好適である。
本発明に用いる前記抽出物、並びに本発明のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤は、表皮の角化不全の予防若しくは治療、皮膚の保湿、皮膚バリア機能の改善、肌荒れの予防若しくは改善、又は毛髪のくせ毛化を所望する対象者に適用することができる。前記抽出物又は剤は、必要な条件下（好ましくは、湿度が低く乾燥した条件下）で適用するのが好ましい。また、前記抽出物又は剤は、皮膚、頭皮又は毛髪に適用するのが好ましい。

【0029】

本発明のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤における前記有効成分の投与量は、個体の状態、体重、性別、年齢、素材の活性、投与又は摂取経路、投与又は摂取スケジュール、製剤形態又はその他の要因により適宜決定することができる。例えば、前記有効成分の質量に基づき、１日あたり、体重１ｋｇあたり、好ましくは0.001ｍｇ以上、1ｇ以下、又は好ましくは0.001〜1ｍｇである。また、前記有効成分は、１日１回〜数回に分け、又は任意の期間及び間隔で摂取・投与され得る。

【0030】

本発明のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤における前記有効成分の含有量は、上記投与量を達成するように適宜決定できる。例えば、本発明のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤において、前記有効成分の含有量は、0.00001質量％以上が好ましく、0.0001質量％以上がより好ましく、0.0005質量％以上がさらに好ましく、20質量％以下が好ましく、10質量％以下がより好ましく、5質量％以下がさらに好ましく、0.00001〜20質量％が好ましく、0.0001〜10質量％がより好ましく、0.0005〜5質量％がさらに好ましい。

【0031】

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防又は改善剤、くせ毛化剤、製造方法、方法及び使用を開示する。

【0032】

＜１＞ハグロソウの抽出物を有効成分とする、トランスグルタミナーゼ活性化剤。
＜２＞ハグロソウの抽出物を有効成分とする、セラミド産生促進剤。
＜３＞ハグロソウの抽出物を有効成分とする、インボルクリン発現促進剤。
＜４＞ハグロソウの抽出物を有効成分とする、表皮角化改善剤。
＜５＞ハグロソウの抽出物を有効成分とする、皮膚保湿機能改善剤。
＜６＞ハグロソウの抽出物を有効成分とする、皮膚バリア機能改善剤。
＜７＞ハグロソウの抽出物を有効成分とする、肌荒れ予防又は改善剤。
＜８＞ハグロソウの抽出物を有効成分とする、くせ毛化剤。

【0033】

＜９＞前記ハグロソウの抽出物がハグロソウの全草の抽出物である、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤。
＜１０＞前記ハグロソウの抽出物が、エタノール水溶液（好ましくは、アルコール含有率が３０体積％以上（より好ましくは４０体積％以上）のエタノール水溶液）を抽出溶媒としてハグロソウを抽出して得られた、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤。
＜１１＞前記有効成分の含有量が、0.00001質量％以上（好ましくは0.0001質量％以上、より好ましくは0.0005質量％以上）20質量％以下（好ましくは10質量％以下、より好ましくは5質量％以下）である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載のトランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤、インボルクリン発現促進剤、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤。

【0034】

＜１２＞トランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤又はインボルクリン発現促進剤としての、ハグロソウの抽出物の使用。
＜１３＞トランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤又はインボルクリン発現促進剤の製造のための、ハグロソウの抽出物の使用。
＜１４＞ハグロソウの抽出物を、トランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤又はインボルクリン発現促進剤として使用する方法。
＜１５＞ハグロソウの抽出物を用いる、トランスグルタミナーゼ活性化方法、セラミド産生促進方法又はインボルクリン発現促進方法。
＜１６＞前記抽出物を表皮の角化不全の予防若しくは治療、皮膚の保湿、皮膚バリア機能の改善、肌荒れの予防若しくは改善、又は毛髪のくせ毛化を所望する対象者に適用する、前記＜１５＞項記載の方法。
＜１７＞前記抽出物の適用が必要な条件下（好ましくは、湿度が低く乾燥した条件下）で前記抽出物を適用する、前記＜１５＞又は＜１６＞項記載の方法。
＜１８＞前記抽出物を皮膚、頭皮又は毛髪に適用する、前記＜１５＞〜＜１７＞のいずれか１項記載の方法。
＜１９＞前記ハグロソウの抽出物がハグロソウの全草の抽出物である、前記＜１２＞〜＜１８＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜２０＞前記ハグロソウの抽出物が、エタノール水溶液（好ましくは、アルコール含有率が３０体積％以上（より好ましくは４０体積％以上）のエタノール水溶液）を抽出溶媒としてハグロソウを抽出して得られた、前記＜１２＞〜＜１９＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜２１＞トランスグルタミナーゼ活性化剤、セラミド産生促進剤又はインボルクリン発現促進剤におけるハグロソウの抽出物の含有量が、0.00001質量％以上（好ましくは0.0001質量％以上、より好ましくは0.0005質量％以上）20質量％以下（好ましくは10質量％以下、より好ましくは5質量％以下）である、前記＜１２＞〜＜２０＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。

【0035】

＜２２＞表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤としての、ハグロソウの抽出物の使用。
＜２３＞表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤の製造のための、ハグロソウの抽出物の使用。
＜２４＞ハグロソウの抽出物を、表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤として使用する方法。
＜２５＞ハグロソウの抽出物を適用する、表皮角化改善方法、皮膚保湿機能改善方法、皮膚バリア機能改善方法、肌荒れ予防若しくは改善方法、又はくせ毛化方法。
＜２６＞前記抽出物を表皮の角化不全の予防若しくは治療、皮膚の保湿、皮膚バリア機能の改善、肌荒れの予防若しくは改善、又は毛髪のくせ毛化を所望する対象者に適用する、前記＜２４＞又は＜２５＞項記載の方法。
＜２７＞前記抽出物の適用が必要な条件下（好ましくは、湿度が低く乾燥した条件下）で前記抽出物を適用する、前記＜２４＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の方法。
＜２８＞前記抽出物を皮膚、頭皮又は毛髪に適用する、前記＜２４＞〜＜２７＞のいずれか１項記載の方法。
＜２９＞皮膚の表皮角化不全の予防若しくは治療方法、皮膚保湿機能改善方法、皮膚バリア機能改善方法、肌荒れ予防若しくは改善方法、又はくせ毛化方法のために用いる、ハグロソウの抽出物。
＜３０＞皮膚の表皮角化不全の予防若しくは治療薬、皮膚保湿機能改善薬、皮膚バリア機能改善薬、肌荒れ予防若しくは改善薬、又はくせ毛化薬の製造のための、ハグロソウの抽出物の使用。
＜３１＞皮膚の表皮角化不全、皮膚保湿機能、皮膚バリア機能、肌荒れ、又はくせ毛化の非治療的な処置方法のために用いる、ハグロソウの抽出物の使用。
＜３２＞ハグロソウの抽出物を医薬組成物又は化粧料組成物の形態で適用する、前記＜３１＞項記載の使用。
＜３３＞ハグロソウの抽出物を外用組成物の形態で適用する、前記＜３２＞項記載の使用。
＜３４＞ハグロソウの抽出物を食品又は飲料の形態で適用する、前記＜３１＞項記載の使用。
＜３５＞前記ハグロソウの抽出物がハグロソウの全草の抽出物である、前記＜２２＞〜＜３４＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜３６＞前記ハグロソウの抽出物が、エタノール水溶液（好ましくは、アルコール含有率が３０体積％以上（より好ましくは４０体積％以上）のエタノール水溶液）を抽出溶媒としてハグロソウを抽出して得られた、前記＜２２＞〜＜３５＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
＜３７＞前記表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、肌荒れ予防若しくは改善剤、又はくせ毛化剤における、ハグロソウの抽出物の含有量が、0.00001質量％以上（好ましくは0.0001質量％以上、より好ましくは0.0005質量％以上）20質量％以下（好ましくは10質量％以下、より好ましくは5質量％以下）である、前記＜２２＞〜＜３６＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。

【実施例】

【0036】

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0037】

調製例１
ハグロソウの全草（新和物産社製）１０ｇを細切し、３０体積％エタノール水溶液１００ｍＬを加え、室温・静置条件下で７日間抽出を行った。その後、濾過して、ハグロソウ抽出物６１ｍＬを得た。得られた抽出物について、蒸発残分を算出したところ、蒸発残分は１．１０％（ｗ／ｖ）であった。これを３０体積％エタノール水溶液で希釈し、１．０％（ｗ／ｖ）（エキス固形分）抽出物を調製した。
＜蒸発残分の算出＞
ハグロソウ抽出物１ｍＬを乾燥機（DRY Thermo Unit DTU-1C（商品名、TAITEC CORPORATION社製））を用いて１０５℃で６時間乾燥させたところ、乾燥物１１．０ｍｇが得られた。この抽出物の蒸発残分を、１１．０／１０００×１００＝１．１０％（ｗ／ｖ）と算出した。なお、下記の調製例においても、各抽出物の蒸発残分は同様にして算出されたものである。

【0038】

調製例２
調製例１と同様の条件で５０体積％エタノール水溶液を使用して抽出を行った。その後、濾過して、ハグロソウ抽出物５８ｍＬを得た。得られた抽出物について、蒸発残分を算出したところ、蒸発残分は０．９２％（ｗ／ｖ）であった。これを濃縮した後、５０体積％エタノール水溶液で１．０％（ｗ／ｖ）（エキス固形分）抽出物を調製した。

【0039】

調製例３
調製例１と同様の条件で６０体積％エタノール水溶液を使用して抽出を行った。その後、濾過して、ハグロソウ抽出物５８ｍＬを得た。得られた抽出物について、蒸発残分を算出したところ、蒸発残分は０．７９％（ｗ／ｖ）であった。これを濃縮した後、６０体積％エタノール水溶液で１．０％（ｗ／ｖ）（エキス固形分）抽出物を調製した。

【0040】

調製例４
調製例１と同様の条件で７０体積％エタノール水溶液を使用して抽出を行った。その後、濾過して、ハグロソウ抽出物６０ｍＬを得た。得られた抽出物について、蒸発残分を算出したところ、蒸発残分は０．７０％（ｗ／ｖ）であった。これを濃縮した後、７０体積％エタノール水溶液で１．０％（ｗ／ｖ）（エキス固形分）抽出物を調製した。

【0041】

調製例５
調製例１と同様の条件で８０体積％エタノール水溶液を使用して抽出を行った。その後、濾過して、ハグロソウ抽出物５５ｍＬを得た。得られた抽出物について、蒸発残分を算出したところ、蒸発残分は０．６０％（ｗ／ｖ）であった。これを濃縮した後、８０体積％エタノール水溶液で１．０％（ｗ／ｖ）（エキス固形分）抽出物を調製した。

【0042】

調製例６
調製例１と同様の条件で９０体積％エタノール水溶液を使用して抽出を行った。その後、濾過して、ハグロソウ抽出物５３ｍＬを得た。得られた抽出物について、蒸発残分を算出したところ、蒸発残分は０．３６％（ｗ／ｖ）であった。これを濃縮乾固させた後、９０体積％エタノール水溶液で１．０％（ｗ／ｖ）（エキス固形分）抽出物を調製した。

【0043】

調製例７
調製例１と同様の条件で９９．５体積％エタノール水溶液を使用して抽出を行った。その後、濾過して、ハグロソウ抽出物５２ｍＬを得た。得られた抽出物について、蒸発残分を算出したところ、蒸発残分は０．１７％（ｗ／ｖ）であった。これを濃縮乾固させた後、９９．５体積％エタノール水溶液で１．０％（ｗ／ｖ）（エキス固形分）抽出物を調製した。

【0044】

調製例８
ハグロソウの全草（親和物産社製）６００ｇを細切し、９９．５体積％エタノール水溶液６０００ｍＬを加え、室温・静置条件下で７日間抽出を行った。その後、濾過して、ハグロソウ抽出物４５０４ｍＬを得た。得られた抽出物４０００ｍＬにヘキサン２０００ｍＬを加え撹拌した後、さらに水６０００ｍＬを加えた。これを液液分配した後、下層８３６７ｍＬを抜出した。得られた抽出液２５００ｍＬに1,3-ブチレングリコール１０００ｍＬを加え、エバポレータにて濃縮し、エタノール及び水を除去した。これに水１５００ｍＬを加えた後、５℃、４日間の条件で澱出しした。濾過により不溶物を除去した後、得られた濾液２４０３Ｌに４０体積％1,3-ブチレングリコール水溶液を加え、抽出物３２６６ｍＬを調製した。得られた抽出物について蒸発残分を算出したところ、蒸発残分は０．０２％（ｗ／ｖ）であった。

【0045】

試験例１ トランスグルタミナーゼ活性の測定
１２穴プレートにヒト表皮角化細胞株ＨＥＫｎ（KURABO社製）を４×１０⁴個／ウェルにて播種し、培養した。培地には、市販のクラボウ社製EpiLife-KG2を用いた。３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一日培養後、増殖因子（ＢＰＥ、ＥＧＦ）を含まない培地に交換し、製造例１〜８で調製したハグロソウ抽出物を最終濃度が表１に示す値となるように、それぞれ添加した。また、ハグロソウ抽出物のかわりに、コントロールとして抽出溶媒である５０体積％エタノールを最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）で、ポジティブ・コントロールとしてＣａＣｌ₂を最終濃度１．５ｍＭで、それぞれ添加した。なお、ＣａＣｌ₂には角化を促す作用が知られており、ポジティブ・コントロールとして用いた。これらはいずれも更に３７℃で３日間培養した。
培養終了後、培養液を除去し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、１５０μＬの抽出緩衝液（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％TritonX-100、Protease inhibitorsを含む１０ｍＭ Tris-HCl buffer、pH7.4）でセルスクレーパーを用い細胞を回収し、超音波処理による細胞破砕液を得た。遠心分離操作（15,000rpm、10分）によって得られた上清をライセートとして評価に用いた。Transglutaminase Colorimetric Microassay Kit（商品名）によりメーカーの使用説明書に従って、酵素活性を測定した。タンパク質濃度はBCA Protein Assay Kit（商品名、Thermo Scientific社製）を用いてメーカーの使用説明書に従って、定量した。

【0046】

評価結果を表１に示す。各抽出物サンプルのトランスグルタミナーゼ活性は、５０体積％エタノールを添加したコントロールのトランスグルタミナーゼ活性を１とした場合の相対値で示した。

【0047】

【表1】

【0048】

表１から明らかなように、ハグロソウ抽出物を添加した系ではトランスグルタミナーゼ活性がポジティブ・コントロールと同程度或いはそれ以上に大きく上昇していた。
さらに、トランスグルタミナーゼ活性は皮膚のバリア機能維持、保湿機能の維持又は改善、及び肌荒れの予防又は改善に関係し、トランスグルタミナーゼを活性化することで、表皮の角化不全の防止や皮膚の保湿機能の改善、及び肌荒れの予防又は改善などが可能となる。したがって、トランスグルタミナーゼ活性化効果を有するハグロソウの抽出物を表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、及び肌荒れ予防又は改善剤の有効成分とすることができる。

【0049】

試験例２ セラミド産生促進効果の検証
培養プレートを用い、培養液（商品名：EpiLife-KG2、KURABO社製）中にて、正常ヒト表皮角化細胞（商品名：NHEK(F)、KURABO社製）を３７℃、5％ＣＯ₂で培養した。
その後、培養液を上皮成長因子などの増殖因子を除いたEpiLife-KG2に換え、調製例２で調製したハグロソウ抽出物を、濃度が固形分換算で１ｗ／ｖ％となるように調整したものを、０．１％量添加した。また、ハグロソウ抽出物のかわりに、コントロールとして抽出溶媒である５０体積％エタノールを最終濃度０．１％ｖ／ｖで、ポジティブ・コントロールとして下記に示すように調製したユーカリ（Eucalyptus globulus）抽出物を表２に示す最終濃度となるように、それぞれ添加した。なお、ユーカリ抽出物にはセラミドの産生を促す作用が知られており、ポジティブ・コントロールとして用いた。
３日間培養した後、各々の細胞を１ｗｅｌｌごと回収した。

【0050】

回収した細胞からBligh and Dyer法により脂質を抽出した有機相をガラス管に移し、窒素乾固した後、クロロホルム、メタノールで再溶解し、脂質サンプルとした。
また、脂質を抽出した後の細胞に０．１Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ水溶液を加え、６０℃で２時間加熱することにより、タンパク質を可溶化し、室温まで冷却した後２Ｎ ＨＣｌを加えて中和し、タンパク量をＢＣＡ法により定量した。

【0051】

調製した脂質サンプルを薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でクロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１で２回水平展開した。硫酸銅液をスプレーで噴霧し、ホットプレートで焼き付けセラミドを検出し、セラミド量とした。なお、セラミド量は、５０体積％エタノールを添加したときのセラミド量を１とし、相対値で示した。
結果を表２に示す。

【0052】

（参考例）
ユーカリノキ（Eucalyptus globules Labillardiere、新和物産社製）の葉４０ｇを細切し、５０体積％エタノール４００ｍＬを加え、室温・静置条件下で７日間抽出を行った。その後、濾過して、ユーカリ抽出物２９１ｍＬを得た。得られた抽出物について蒸発残分を算出したところ、蒸発残分は３．１６％（ｗ／ｖ）であった。これを５０体積％エタノール水溶液で希釈して、１．０％（ｗ／ｖ）抽出物を調製した。

【0053】

【表2】

【0054】

表２から明らかなように、ハグロソウ抽出物を添加した系ではコントロールの系に比べてセラミド産出量の上昇が認められた。したがって、ハグロソウ抽出物を有効成分とする本発明のセラミド産生促進剤は、セラミド産生を促進することができることがわかる。
さらに、セラミドは皮膚のバリア機能維持、保湿機能の維持又は改善、及び肌荒れの予防又は改善に関係し、セラミドの産生を促進することで、表皮の角化不全の防止や皮膚の保湿機能の改善、及び肌荒れの予防又は改善などが可能となる。したがって、セラミドの産生促進効果を有するハグロソウの抽出物を表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、及び肌荒れ予防又は改善剤の有効成分とすることができる。

【0055】

試験例３ インボルクリン発現量の評価
（１）細胞培養
ヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴは、ＤＭＥＭ（ギブコ社製）に、非働化した１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ社製）を添加した培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下で培養した。

【0056】

（２）ＩＶＬ発現の評価
１次スクリーニングにはInvolucrin ELISA Assay Kit BT-650（商品名、ＢＴＩ製）を一部プロトコルを改変して使用した。詳細なプロトコルを以下に示す。
２４穴プレートにＨａＣａＴ細胞を５×１０⁴個／ウェルにて播種し、培養した。翌日、調製例２で調製した固形分換算で１．０％（ｗ／ｖ）となったハグロソウ抽出物を表３に示す最終濃度含む培地に交換して更に２４時間培養した。また、ハグロソウ抽出物のかわりに、コントロールとして抽出溶媒である５０体積％エタノールを最終濃度０．５％ｖ／ｖ含む培地に交換してさらに２４時間培養したものを用いた。抽出物の添加から２４時間後、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄し、２０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ：７．５）・２ｍＭ ＥＤＴＡにComplete Mini Protease Inhibitor Cocktail（商品名、Ｒｏｃｈｅ社製）を含む抽出緩衝液４００μＬを細胞に添加した。Protease Inhibitor Cocktailは抽出緩衝液１０ｍＬに対して１粒加えた。この抽出緩衝液存在下でセルスクレーパーにより、細胞を剥離・回収した後、ソニケーターによる超音波処理を行った。この溶液を遠心して回収した上清をライセートとして評価に用いた。
ライセートの総タンパク質濃度はBCA Protein Assay Kit（商品名、Thermo Scientific社製）を用いてメーカーの使用説明書に従って、定量した。９６穴プレートの１ウェルに対し、３μｇの総タンパク質量となるようにライセートをbuffer B（２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｇ／Ｌ Tween 20、２．５ｇ／Ｌ Gelatin in PBS）で希釈し、９６穴プレートに添加した後、抗ＩＶＬ抗体（キット付属品、希釈率１／３００）を加えて４℃で一晩１次抗体反応を行った。また、別の９６穴プレート（ナルジェヌンク製、４６９０７８）にヒトＩＶＬタンパク質（キット付属品）を１ｎｇ／ｗｅｌｌずつ添加し、縮合剤であるＥＤＣ（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide、関東化学株式会社製）１０μｇ／ｗｅｌｌと共に、４℃で一晩抗原の吸着を行った。翌日、抗原を吸着させたプレートの溶液を吸引除去し、１００μＬの０．１Ｍ ＮＨ_４Ｃｌを添加して３０分間室温で反応させた。反応後、distilled Ｈ₂Ｏ（ギブコ社製）で４回、buffer Bで１回洗浄し、前日の１次抗体反応液１００μＬを添加して３０分間室温で反応させた。この反応の後、buffer Bで５回洗浄し、キット付属の抗ウサギ-AP Conjugate抗体（希釈率１／２０００）を添加して室温で１時間反応させた。反応後、buffer Bで４回、buffer D（１ｍＭ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ ｉｎ ０．０５Ｍ carbonate/bicarbonate（シグマ社製、商品名：C3041-50CAP）で１回洗浄し、p-nitrophenylphosphate（１ｍｇ／ｍＬ in buffer D、シグマ社製）溶液を１００μＬ添加して発色反応を行った。発色が確認された後、４０５ｎｍの吸光度を測定し、ＩＶＬ量を定量した。
評価結果を表３に示す。抽出物サンプルのＩＶＬ量は、５０％エタノールを添加したコントロールのＩＶＬ量を１とした場合の相対値で示した。

【0057】

【表3】

【0058】

表３から明らかなように、ハグロソウ抽出物を添加した系ではインボルクリンの発現量が増加していた。
さらに、インボルクリンの発現は皮膚のバリア機能維持、保湿機能の維持又は改善、及び肌荒れの予防又は改善に関係し、インボルクリンの発現を促進することで、表皮の角化不全の防止や皮膚の保湿機能の改善、及び肌荒れの予防又は改善などが可能となる。また、インボルクリン遺伝子の発現量を増加させる物質がくせ毛や縮毛の促進剤又はウェーブ化促進剤となりうる。したがって、インボルクリン発現促進効果を有するハグロソウの抽出物を表皮角化改善剤、皮膚保湿機能改善剤、皮膚バリア機能改善剤、及び肌荒れ予防又は改善剤及びくせ毛化剤の有効成分とすることができる。