特許 6289053 ソフォロリピッドの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6289053

(24)【登録日】2018年2月16日

(45)【発行日】2018年3月7日

(54)【発明の名称】ソフォロリピッドの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/44 20060101AFI20180226BHJP

   C12R 1/72 20060101ALN20180226BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/44

   C12P19/44

   C12R1:72

【請求項の数】2

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2013-241740(P2013-241740)

(22)【出願日】2013年11月22日

(65)【公開番号】特開2015-100290(P2015-100290A)

(43)【公開日】2015年6月4日

【審査請求日】2016年9月9日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】四方 健一

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 仁

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−０４５１９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０５０４１３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開昭５６−０９２７８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−３２５２８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２２５７２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１４６９２０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−１８８７９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−２５４５９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２９６９０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５３−０５２６９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−１８８１４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biotechnology and Bioengineering (2002) Vol.77,pp.489-494

【文献】 Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) Vol.76, pp.23-34

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ソフォロリピッドを生産する能力を有するカンジダ属に属する微生物を好気的条件下、炭素源として糖及び油脂類を含有する培養液中で培養し、ソフォロリピッドを得る工程を含むソフォロリピッドの製造方法であって、
前記培養液中のソフォロリピッドを生産する能力を有するカンジダ属に属する微生物の濃度が波長６６０ｎｍにおける吸光度として１００〜３００であり、培養液に供給される酸素の供給速度が０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであり、且つ培養液中の３０℃における溶存酸素濃度が０．５〜１０ｐｐｍである、製造方法。

【請求項2】

培養液に酸素濃度が２１％超９０％以下の空気を通気させる請求項１記載のソフォロリピッドの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ソフォロリピッドの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

酵母等の微生物が生産する両親媒性物質はバイオサーファクタント（生物界面活性剤）と呼ばれ、環境適合性と機能性を兼ね備えた材料として、食品、化粧品、ライフサイエンス、環境・エネルギー分野等での応用が研究されている。
なかでもソフォロリピッドは、比較的安価な基質から得られるため、現在産業利用されている代表的なバイオサーファクタントの一つである。

【0003】

ソフォロリピッドの製造方法として、例えば、カンジダ属酵母を植物油と遊離脂肪酸を混合した液体培地で培養し、ソフォロリピッドを発酵生産する方法（特許文献１）、カンジダ属酵母を植物油、脂肪酸等の代わりに６〜３０個の炭素原子の鎖長をもつ２−アルカノールを含有する培地で培養し、非環状のソフォロリピッドを製造する方法（特許文献２）が知られている。また、ジアセチルラクトン型のソフォロリピッドを得るために、培養液への酸素供給量を制限して微生物を培養する方法（特許文献３）が知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００２−４５１９５号公報

【特許文献2】特開平８−３２５２８７号公報

【特許文献3】国際公開第２０１０／０５０４１３号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、従来技術の方法では、基質である炭素源（糖、油脂、脂肪酸誘導体等）からソフォロリピッドへの変換速度（発酵速度）が遅く、工業生産に適した生産性の向上が大きな課題と考えられた。
したがって、本発明は、変換速度が速く、効率よく基質からソフォロリピッドを製造することのできる方法を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らが検討した結果、炭素源基質からソフォロリピッドへの変換速度を速めるには、発酵に用いられる微生物の数を増やし、酸素供給量を増加させることが有効と考えられた。しかし、酸素供給量が増え、培養液中の溶存酸素濃度が高まるとかえって微生物のソフォロリピッドの生産性に影響を及ぼすことが懸念された。そこで更に鋭意検討したところ、一定数の微生物に対し供給される酸素の供給速度を特定の範囲に制御することで、培養液中の溶存酸素濃度を制御することにより、変換速度が速まり、極めて効率よく基質からソフォロリピッドを製造できることを見出した。

【0007】

すなわち、本発明は、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を好気的条件下、炭素源を含有する培養液中で培養し、ソフォロリピッドを得る工程を含むソフォロリピッドの製造方法であって、
前記培養液中のソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物の濃度が波長６６０ｎｍにおける吸光度として１００〜３００であり、且つ培養液に供給される酸素の供給速度が０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒである、製造方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、基質からソフォロリピッドへの変換速度を高めることができるので、ソフォロリピッドを効率よく製造することができる。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明のソフォロリピッドの製造方法は、ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を好気的条件下、炭素源を含有する培養液中で培養し、ソフォロリピッドを得る工程を含むものであり、前記培養液中のソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物の濃度が波長６６０ｎｍにおける吸光度として１００〜３００であり、且つ培養液に供給される酸素の供給速度が０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒである。

【0010】

ソフォロリピッドは、ソフォロースとヒドロキシ脂肪酸とからなる糖脂質である。ソフォロースは、グルコースがβ−１，２結合した二糖類であり、ヒドロキシ脂肪酸は、ω位、或いはω−１位にヒドロキシ基を有する脂肪酸である。ヒドロキシ脂肪酸の脂肪酸部分は、特に限定されないが、炭素数６〜３０の飽和又は不飽和脂肪酸が好ましい。また、ソフォロースは、ヒドロキシ基が一部アセチル化したものも含む。
ソフォロリピッドは、ヒドロキシ脂肪酸のカルボキシル基が遊離した酸型と分子内のソフォロースと結合したラクトン型に大別され、一般的に発酵生産では酸型とラクトン型の混合物として得られることが知られている。

【0011】

本発明で用いられるソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物は、基質からソフォロリピッドを生成し、菌体外に産出する能力を有する微生物であればよく、例えば、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する微生物が挙げられる。
カンジダ属に属する微生物としては、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｐｉｃｏｌａ等が挙げられる。なかでも、ソフォロリピッド生産性の点から、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａが好ましい。

【0012】

ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物は、該微生物が資化し得る炭素源を含むものであれば、従来公知の培地を用いて培養することができる。例えば、ＹＭ培地等の市販の液体培地を用いることができる。また、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要な栄養源等を培地の成分として適宜用いることができる。
炭素源としては、例えば、糖（グルコース、アラビノース、キシロース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシット、グリセリン、可溶性澱粉、廃糖蜜、転化糖等）、油脂類（大豆油、ナタネ油、サフラワー油、米油、コーン油、パーム油、ヒマワリ油、綿実油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、ハトムギ油、小麦胚芽油、シソ油、アマニ油、エゴマ油、サチャインチ油、クルミ油、キウイ種子油、サルビア種子油、ブドウ種子油、マカデミアナッツ油、ヘーゼルナッツ油、カボチャ種子油、椿油、茶実油、ボラージ油、パームオレイン、パームステアリン、やし油、パーム核油、カカオ脂、サル脂、シア脂、藻油等の植物性油脂；魚油、ラード、牛脂、バター脂等の動物性油脂；又はそれらのエステル交換油、水素添加油もしくは分別油；カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、リンデル酸、ツズ酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、ソルビン酸、リノール酸、リノエライジン酸、γ−リノレン酸、リノレン酸、アラキドン酸等の脂肪酸又はそのエステル等）が挙げられる。また、酢酸等の資化しうる有機酸、エタノール等のアルコール類等を用いてもよい。
窒素源としては、例えば、アンモニア、無機・有機アンモニウム塩、尿素、コーングルテンミール、大豆粉、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、ペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等が挙げられる。

【0013】

培養液中の初発の炭素源の含有量は、微生物の増殖の点から、１〜３０％（ｗ／ｖ）、更に５〜２０％（ｗ／ｖ）が好ましい。また、窒素源の含有量は１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。また、培養様式によって、培養液中の濃度が前記範囲となるように培養期間中に連続的又は断続的に添加してもよい。

【0014】

培養方法は、好気的条件下であればよく、通気攪拌培養、振盪培養等の一般的な方法を適用することができる。
培養温度は、使用する微生物の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、２０〜３３℃が好ましく、２８〜３０℃がより好ましい。このとき培養液の初発ｐＨ（３０℃）は２〜７が好ましく、３〜６がより好ましい。

【0015】

培養液のｐＨを調整する緩衝剤としては、例えば、炭酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸塩、リン酸、塩酸、硫酸等の無機塩、水酸化ナトリウム等の水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等が挙げられ、これらを単独又は２種以上組み合わせて用いることができる。

【0016】

ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を用いてソフォロリピッドを生産する場合、一般的には、先ず前培養を行って菌体を活性化させ、次いで、これを本培養の培養液に接種して培養を行い、ソフォロリピッドを生産することが好ましい。前培養及び本培養の期間は、適宜設定できるがそれぞれ１０〜１００時間が好ましく、２０〜６０時間がより好ましい。
本発明においては、ソフォロリピッドを生産する際、培養液中のソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物の濃度は、波長６６０ｎｍにおける吸光度として１００〜３００である。該濃度（ＯＤ６６０）は、ソフォロリピッドの生産性、液物性の点から、１２０以上が好ましく、また、２００以下、更に１６０以下が好ましい。また、該濃度（ＯＤ６６０）は、１００〜２００がより好ましく、さらに好ましくは１２０〜１６０である。

【0017】

また、ソフォロリピッドを生産する際、培養液に供給される酸素の供給速度は０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒである。
酸素供給速度は、培養系において空気中の酸素が液相の微生物に移動する速度として次式で示される。

【0018】

【数1】

【0019】

ｄＣ／ｄｔ：酸素供給速度（ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ）
Ｃ^*：培養液中の飽和溶存酸素濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
ｋＬａ：酸素物質移動容量係数（ｈｒ^-1）
酸素供給速度の算出方法の詳細は実施例に記載した。
斯かる酸素供給速度は、ソフォロリピッドの生産性の点から、０．１ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以上であるが、更に０．１５ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以上であるのが好ましく、また、ソフォロリピッドの変換効率の点から、０．５ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以下であり、更に０．３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以下であるのが好ましい。また、酸素供給速度は、０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、更に０．１５〜０．３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであるのが好ましい。

【0020】

酸素供給速度は、通気酸素濃度、通気速度（通気量）、撹拌回転数、圧力等によって調整することができる。
本発明において、通気酸素濃度は、供給される空気中の酸素濃度であり、酸素供給速度の点から、２１％（体積比率、以下同じ）より高い濃度とするのが好ましく、更に３０％以上、より好ましくは４０％以上とするのが好ましい。上限としてはソフォロリピッドの変換効率の点から、９０％、より好ましくは８５％とするのが好ましい。なお、通気酸素濃度は培養挙動に合わせて変化させることが好ましい。
また、通気速度（通気量）は、泡量の点から０．２〜１ｖｖｍが好ましく、撹拌回転数は、撹拌翼径が０．５ｍ以下では２００〜１０００ｒ／ｍｉｎが好ましく、撹拌翼径が０．５ｍ以上では５０〜２００ｒ／ｍｉｎが好ましい。圧力は常圧から微加圧の条件が好ましく、加圧条件としては０〜０．１ＭＰａの範囲が好ましい。

【0021】

このような酸素の供給により、培養液中の溶存酸素濃度は制御される。
ソフォロリピッドを生産する際、培養液（３０℃）中の溶存酸素濃度は、０．５ｐｐｍ以上、更に１ｐｐｍ以上であるのが好ましく、より好ましくは２ｐｐｍ以上である。また、ソフォロリピッドの変換効率の点から、１０ｐｐｍ以下、更に７ｐｐｍ以下、より好ましくは３．５ｐｐｍ以下であるのが好ましい。また、溶存酸素濃度は、０．５〜１０ｐｐｍ、更に１〜７ｐｐｍが好ましく、より好ましくは２〜３．５ｐｐｍである。

【0022】

このような培養により、培養液中にソフォロリピッドが蓄積するので、培養終了後、適当な分離・精製手段により培養液からソフォロリピッドを採取することができる。
例えば、酢酸エチル等を用いた溶剤抽出後、分別沈殿、液液分配、カラムクロマトグラフ及び高速液体クロマトグラフ等を単独或いは組み合わせて用いることによりソフォロリピッドを取得することができる。

【0023】

本発明によれば、０．００４〜０．０１ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、好ましくは０．００５〜０．００９、より好ましくは０．００６〜０．００８の変換速度で基質からソフォロリピッドを製造することができる。なお、変換速度とは、培養液１Ｌに含まれるソフォロリピッド生産量を発酵１時間あたりの量で示した値である。
ソフォロリピッド生産量の測定方法は実施例に記載した。

【0024】

本発明により得られるソフォロリピッドは、界面活性剤、化粧品基材、各種中間体の原料等としての利用が期待される。

【0025】

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の製造方法を開示する。

【0026】

＜１＞ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物を好気的条件下、炭素源を含有する培養液中で培養し、ソフォロリピッドを得る工程を含むソフォロリピッドの製造方法であって、
前記培養液中のソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物の濃度が波長６６０ｎｍにおける吸光度として１００〜３００であり、且つ培養液に供給される酸素の供給速度が０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒである、製造方法。

【0027】

＜２＞ソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物が、好ましくはカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）に属する微生物であり、より好ましくはＣａｎｄｉｄａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ、又はＣａｎｄｉｄａ ａｐｉｃｏｌａであり、更に好ましくはＣａｎｄｉｄａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａである＜１＞に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜３＞炭素源が、好ましくは糖と油脂類、より好ましくはグルコースと脂肪酸又はその塩である＜１＞又は＜２＞に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜４＞培養液中のソフォロリピッドを生産する能力を有する微生物の濃度が波長６６０ｎｍにおける吸光度として、好ましくは１２０以上であり、また、好ましくは２００以下、より好ましくは１６０以下であり、また、好ましくは１００〜２００、より好ましくは１２０〜１６０である＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜５＞培養液に供給される酸素の供給速度が、好ましくは０．１５ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以上であり、また、好ましくは０．３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ以下であり、また、好ましくは０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、より好ましくは０．１５〜０．３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒである＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜６＞培養液に酸素濃度が好ましくは２１％超、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上であり、また、好ましくは９０％以下、より好ましくは８５％以下であり、また、好ましくは２０％超９０％以下、より好ましくは３０％以上９０％以下、更に好ましくは４０％以上８５％以下である空気を通気させる＜１＞〜＜５＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜７＞培養時の通気速度（通気量）が好ましくは０．２〜１ｖｖｍであり、撹拌回転数が、撹拌翼径０．５ｍ以下では好ましくは２００〜１０００ｒ／ｍｉｎ、撹拌翼径０．５ｍ以上では好ましくは５０〜２００ｒ／ｍｉｎであり、加圧条件が好ましくは０〜０．１ＭＰａである＜１＞〜＜６＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜８＞培養時の温度が、好ましくは２０〜３３℃、より好ましくは２８〜３０℃であり、培養液の初発ｐＨ（３０℃）が、好ましくは２〜７、より好ましくは３〜６である＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜９＞培養液中の３０℃における溶存酸素濃度が、好ましくは０．５ｐｐｍ以上、より好ましくは１ｐｐｍ以上、更に好ましくは２ｐｐｍ以上であり、また、好ましくは１０ｐｐｍ以下、より好ましくは７ｐｐｍ以下、更に好ましくは３．５ｐｐｍ以下であり、また、好ましくは０．５〜１０ｐｐｍ、より好ましくは１〜７ｐｐｍ、更に好ましくは２〜３．５ｐｐｍである＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。
＜１０＞ソフォロリピッドを、好ましくは０．００４〜０．０１ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒ、より好ましくは０．００５〜０．００９、更に好ましくは０．００６〜０．００８の変換速度で得る＜１＞〜＜９＞のいずれか１に記載のソフォロリピッドの製造方法。

【実施例】

【0028】

以下の実施例及び比較例において、酸素濃度の「％」は空気中の体積比率を示し、それ以外の「％」は「％（ｗ／ｖ））」を意味する。

【0029】

〔菌体濃度の測定〕
培養液を２００倍に希釈し１ｃｍ角の石英ガラス製セルに注入し、分光光度計ＵＶ―１８００（島津製作所製）を用いて、６６０ｎｍの吸光度を測定し、希釈率からＯＤ６６０を算出した。

【0030】

〔酸素供給速度の算出〕
酸素供給速度は以下の式により算出した。

【0031】

【数1】

【0032】

（式中、Ｃ^*は培養液中の飽和溶存酸素濃度、Ｃは培養液中の溶存酸素濃度である。ｋＬａは酸素物質移動容量係数である。）
培養液中の飽和溶存酸素濃度と溶存酸素濃度は溶存酸素濃度センサー（エイブル製）を用いて測定を行った。
酸素物質移動容量係数（ｋＬａ）は、ガッシングアウト法により算出した。具体的には、培養液に窒素を通気し溶存酸素濃度を０ｐｐｍにした後に、窒素に換えて空気を通気し、その溶存酸素濃度変化からｋＬａの算出を行った。

【0033】

〔ソフォロリピッドの分析〕
培養液２ｍＬをサンプリングし、ヘキサン１ｍＬで２回洗浄した後、酢酸エチル１ｍＬで２回抽出し回収を行った。その後、溶媒を留去し、酢酸エチル画分の回収を行った。回収した酢酸エチル画分０．０１ｇに対して、内部標準としてドデカンとメタノール１ｍＬ、濃塩酸０．０３ｍＬを添加し、１００℃温浴バスにて２時間メタノール交換を行った。冷却後、飽和食塩水１ｍＬ、ヘキサン１．５ｍＬを添加し混合を行い、静置後にヘキサン相を回収した。得られたヘキサン相の溶媒を留去し、シリル化剤ＴＭＳＩ−Ｈを０．２ｍＬ添加し７０℃で２０分シリル化を行った後、水１．５ｍＬ、ヘキサン１．５ｍＬを添加し混合を行い、静置後にヘキサン相を回収し、ＧＣ分析に供した。

【0034】

〔ＧＣ分析条件〕
カラム：ＤＢ−１−ＨＴ／１４ｍ×２５０μｍ×０．１μｍ
カラム条件：流量０．７ｍｌ／分 ６０℃１分→１０℃／分→３００℃１０分
インジェクション：スプリット５０：１／２８０℃
検出：ＦＩＤ ２８０℃ Ｈ２：３０ｍｌ／分、Ａｉｒ：４００ｍｌ／分

【0035】

〔培養方法〕
１．プレート培養
Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ ＮＢＲＣ１０２４３株を用いた。
グルコース１％、酵母エキス１％、トリプトン１％、寒天１．５％を含む寒天培地のシャーレに種菌を１白金耳植菌し、温度３０℃で２日間培養を行った。

【0036】

２．前培養
グルコース１％、酵母エキス１％、トリプトン１％を含む培養液１００ｍＬを坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分高温で滅菌を行った。冷却後、プレートから１白金耳、植菌を行い、温度３０℃、撹拌回転数１２０ｒ／ｍｉｎの条件にて２日間撹拌培養を行った。

【0037】

３．本培養
パルミチン酸エチル１０％、グルコース１０％、酵母エキス８％、尿素１．２％を含む培養液をｐＨ５．０に調整し、１．２Ｌにメスアップした。培養液を全容２Ｌのジャーファーメンターにて滅菌後に、前培養液２４ｍＬ植菌し、温度３０℃、撹拌回転数（撹拌翼径０．５ｍ以下）６００ｒ／ｍｉｎ、通気速度（通気量）０．６Ｌ／分（０．５ｖｖｍ）の条件にて撹拌培養を行った。

【0038】

実施例１
培養開始から２４時間後、通気酸素濃度を２１〜８５％に高め、更に３６時間撹拌培養を行った。この時の菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）は１５０、培養液中の溶存酸素濃度は３ｐｐｍ、酸素供給速度は０．１７２ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。
培養後、ＧＣ分析よりソフォロリピッド変換速度を求めたところ０．００７０ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。

【0039】

実施例２
通気酸素濃度を４０％に高めた以外は実施例１と同様に培養を行った。菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）は１５４、培養液中の溶存酸素濃度は４ｐｐｍ、酸素供給速度は０．２１３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。
培養後、ＧＣ分析よりソフォロリピッド変換速度を求めたところ０．００７０ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。

【0040】

実施例３
通気酸素濃度を５０％に高めた以外は実施例１と同様に培養を行った。菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）は１５３、培養液中の溶存酸素濃度は９ｐｐｍ、酸素供給速度は０．２６６ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。
培養後、ＧＣ分析よりソフォロリピッド変換速度を求めたところ０．００６６ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。

【0041】

比較例１
本培養の培養液の組成を酵母エキス８％から酵母エキス２％に変更し、全培養期間を通じて通気酸素濃度を２１％のままとした以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養開始から４８時間後の菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）は３０、培養液中の溶存酸素濃度は４ｐｐｍ、酸素供給速度は０．０４３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。
培養後、ＧＣ分析よりソフォロリピッド変換速度を求めたところ０．００１６ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。

【0042】

比較例２
本培養の培養液の組成を酵母エキス８％から酵母エキス４％に変更し、全培養期間を通じて通気酸素濃度を２１％のままとした以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養開始から４８時間後の菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）は１００、培養液中の溶存酸素濃度は０ｐｐｍ、酸素供給速度は０．０４３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。
培養後、ＧＣ分析よりソフォロリピッド変換速度を求めたところ０．００２９ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。

【0043】

比較例３
全培養期間を通じて通気酸素濃度を２１％のままとした以外は実施例１と同様に培養を行った。培養開始から４８時間後の菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）は１２０、培養液中の溶存酸素濃度は０ｐｐｍ、酸素供給速度は０．０４３ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。
培養後、ＧＣ分析よりソフォロリピッド変換速度を求めたところ０．００２６ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。

【0044】

比較例４
本培養の撹拌回転数を６００ｒ／ｍｉｎから８００ｒ／ｍｉｎにした以外は実施例１と同様に培養を行った。
培養開始から２４時間後、通気酸素濃度を９５％に高め、更に３６時間撹拌培養を行った。この時の菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）は１４５、培養液中の溶存酸素濃度は２５ｐｐｍ、酸素供給速度は０．５９７ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。
培養後、ＧＣ分析よりソフォロリピッド変換速度を求めたところ０．００１１ｍｏｌ／Ｌ／ｈｒであった。
各実施例及び比較例の条件と結果を表１に示す。

【0045】

【表1】

【0046】

表１に示すように、比較例１では菌数が少なく、比較例２、３では酸素供給速度が小さく溶存酸素濃度が低くなり、比較例４では酸素供給速度が大きく溶存酸素濃度が高くなり、これらの条件ではソフォロリピッドを効率良く得ることができなかった。これに対し、実施例に示す様に、高菌体濃度下、酸素供給速度を特定の範囲に制御し、培養液中の溶存酸素濃度を制御する条件でのみ、基質からソフォロリピッドへの変換速度が速くなり、ソフォロリピッドを効率良く得ることを達成した。