特許 6289477 金属含有半電導性ポリマードット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6289477

(24)【登録日】2018年2月16日

(45)【発行日】2018年3月7日

(54)【発明の名称】金属含有半電導性ポリマードット

(51)【国際特許分類】

   C08J 3/12 20060101AFI20180226BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20180226BHJP

   C08K 3/08 20060101ALI20180226BHJP

   C08K 3/22 20060101ALI20180226BHJP

   H01F 1/11 20060101ALI20180226BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20180226BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20180226BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20180226BHJP

【ＦＩ】

   C08J3/12 Z

   B82Y40/00

   C08K3/08

   C08K3/22

   H01F1/11 120

   G01N33/53 U

   G01N33/543 541A

   G01N33/574 D

【請求項の数】27

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2015-535892(P2015-535892)

(86)(22)【出願日】2013年10月8日

(65)【公表番号】特表2016-503436(P2016-503436A)

(43)【公表日】2016年2月4日

(86)【国際出願番号】US2013063917

(87)【国際公開番号】WO2014058903

(87)【国際公開日】20140417

【審査請求日】2016年10月11日

(31)【優先権主張番号】61/710,851

(32)【優先日】2012年10月8日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512205245

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャリゼーション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】チウ， ダニエル ティー．

(72)【発明者】

【氏名】サン， ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ユー， ジアンボ

(72)【発明者】

【氏名】ウー， チャンフェン

【審査官】 春日 淳一

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／０５７２９５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特許第６０５９５３３（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】 Yang-Hsiang Chan, et al，J Am Chem Soc，米国，２０１２年 ４月１９日，Vol.134，p.7309-7312

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｊ３／００−３／２８、９９／００

Ｇ０１Ｎ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

金属含有（ＭＣ）半電導性（ＳＣ）ポリマードット（Ｐｄｏｔ）であって、
（ｉ）Ａｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｇａ、Ｆｅ、その酸化物、その錯体、その合金、またはそれらの組み合わせから選択される金属を含むナノ粒子（ＮＰ）と、
（ｉｉ）前記ＮＰを包囲するＳＣポリマーと
を備え、
前記ＳＣポリマーは、蛍光性であり、そして、前記ＳＣポリマーは、前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの少なくとも５０％ｖ／ｖを構成するか、または前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ群は、８０ｎｍ±２０％より小さい平均直径を有する、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。

【請求項2】

前記ＮＰは、１つの金属粒子から成る、請求項１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。

【請求項3】

前記１つの金属粒子は、ＡｕまたはＦｅを含む、請求項２に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。

【請求項4】

前記１つの金属粒子は、ＦｅＯ_ｘを含み、ｘは、ａ／ｂに等しく、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項２に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。

【請求項5】

前記ＳＣポリマーは、前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの少なくとも５０％ｖ／ｖを形成し、前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ群は、８０ｎｍ±２０％より小さい平均直径を有する、請求項１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。

【請求項6】

前記ＳＣポリマーは、前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの少なくとも８０％ｖ／ｖ±２０％を形成している、請求項１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。

【請求項7】

前記ＮＰは、疎水性ポリマーに付着されることにより、疎水性コアを形成している、請求項１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。

【請求項8】

３５０ｎｍ±２０％〜８５０ｎｍ±２０％の吸収波長を有する、請求項１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。

【請求項9】

請求項１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔをナノ析出するプロセスであって、前記プロセスは、
金属を含む疎水性ＮＰをＳＣポリマーと水溶液中で混合し、それによって、前記ＮＰを前記ＳＣポリマーのマトリクス内に捕捉し、それによって、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを形成することを含み、前記ＳＣポリマーが蛍光性である、プロセス。

【請求項10】

前記ＮＰは、１つの金属粒子から成る、請求項９に記載のプロセス。

【請求項11】

前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、スクロースステップ勾配を使用して、空のＰｄｏｔから分離される、請求項１０に記載のプロセス。

【請求項12】

前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、遠心分離を使用して、空のＰｄｏｔからさらに分離される、請求項１１に記載のプロセス。

【請求項13】

各ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、１つのみのＮＰを含む、請求項１０に記載のプロセス。

【請求項14】

ＮＰをトルエンと接触させることにより、前記疎水性ＮＰを形成することをさらに含む、請求項９に記載のプロセス。

【請求項15】

前記トルエンは、チオール末端官能基を伴う半電導性ポリマーを含む、請求項１４に記載のプロセス。

【請求項16】

遠心分離を使用して、前記疎水性ＮＰを前記トルエンから分離することをさらに含む、請求項１４に記載のプロセス。

【請求項17】

前記混合することは、音波処理を用いて行われる、請求項１０に記載のプロセス。

【請求項18】

前記ＳＣポリマーは、前記混合の間、前記疎水性ＮＰより高い濃度にある、請求項１０に記載のプロセス。

【請求項19】

請求項１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを標的細胞に関連付け、前記標的細胞の領域内に磁場を印加し、それによって、前記標的細胞を操作することによって、磁性を使用して標的細胞を操作するインビトロの方法。

【請求項20】

前記ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔのＮＰは、１つの金属粒子から成る、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記１つの金属粒子は、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｇａ、その酸化物、その合金、その錯体、それらの組み合わせ、ならびに非磁気金属との組み合わせおよび錯体を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記１つの金属粒子は、Ｆｅまたはその酸化物を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記１つの金属粒子は、ＦｅＯ_ｘであり、Ｘは、ａ／ｂに等しく、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記ＳＣポリマーは、カルボン酸末端ポリスチレン−ポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記カルボン酸末端ポリスチレン−ポリ（エチレングリコール）ポリマー上のカルボン酸基は、生物学的活性化合物と生体結合する、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記生物学的活性化合物は、ストレプトアビジンである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記標的細胞は、癌細胞である、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の引用）
本願は、米国仮特許出願第６１／７１０，８５１号（２０１２年１０月８日出願）の利益を主張し、該出願の開示全体は、参照により本明細書に引用される。

【0002】

（開示の分野）
本開示は、少なくとも１つの金属を含む半電導性ポリマードット（Ｐｄｏｔ）と、その製造方法および使用方法とを提供する。

【背景技術】

【0003】

ポリマードット（Ｐｄｏｔ）は、最近、撮像用途において大きな有望性が期待される、新しいタイプの蛍光ナノプローブとして登場した。小型蛍光染料および量子ドット（Ｑｄｏｔ）と比較して、Ｐｄｏｔは、高輝度、高速発光率、および良好な光安定性を保有する。Ｐｄｏｔのサイズはまた、その発光スペクトルに著しく影響を及ぼさずに修正され、広範囲の用途にわたって、その可用性を増加させることができる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

Ｐｄｏｔハイブリッドは、Ｐｄｏｔ単独では利用可能ではない、追加の機能性を提供することができる。例えば、Ｐｄｏｔ（Ｐｄｏｔ−Ｑｄｏｔ）内に埋め込まれた量子ドット（Ｑｄｏｔ）を伴う、Ｐｄｏｔハイブリッドは、アミン基で官能化された半電導性ポリマーをＱｄｏｔの表面に共有結合することによって調製される。これらのＰｄｏｔハイブリッドは、高輝度を伴う、狭帯域かつ近ＩＲ蛍光発光を示す（Ｃｈａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１２，１３４，７３０９−７３１２）。

【0005】

Ｑｄｏｔの他にも、多くの他の無機ナノ粒子（ＮＰ）および粒子が存在し、広範囲の用途のために、Ｐｄｏｔ−ハイブリッドを調製するために使用されることができる。本開示は、金属を利用して、金属含有（ＭＣ）半電導性（ＳＣ）Ｐｄｏｔ（ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ）を調製する。以下により完全に説明されるように、種々の金属およびポリマーが、これらのハイブリッドＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔに関連付けられた有益な効果を達成するために使用されることができる。例えば、Ａｕは、光退色しないため、金（Ａｕ）粒子またはＡｕを含むＮＰが、暗視野顕微鏡検査における長期観察および単一粒子追跡のための造影剤として使用されている。しかし、暗視野顕微鏡検査では、Ａｕを、光を同様に強く散乱させ、したがって、Ａｕと同様の信号を発する他の細胞内マイクロおよびナノ特徴から区別することは困難である。この問題は、特定の実施形態において、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ内にＡｕを提供し、Ｐｄｏｔハイブリッドに、二重モダリティ撮像能力を提供する、本開示によって克服される。このように、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔのみが、強い暗視野および蛍光性信号の両方を発生させることができるので、他の細胞特徴と容易に区別されることができる。ここでは、蛍光は、真のＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔプローブを識別するのに役立てるために使用され、そして、暗視野が、長期撮像を実施し、Ａｕの光学安定性を利用するために使用される。

【0006】

別の実施例では、金属は、鉄（Ｆｅ）または酸化鉄（ＦｅＯ_ｘ）である。これらの実施形態では、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、生体撮像およびサンプル調製の両方において使用されることができる。例えば、ＦｅまたはＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、磁石に誘引され、それによって集結させられる。これらのハイブリッドＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、ＵＶ光によって励起されると、強い蛍光を発光する。ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔで標識された細胞は、永久磁石を使用して、操作および濃縮されることができる。いくつかの実施形態では、酸化鉄含有Ｐｄｏｔが、蛍光撮像および磁気共鳴画像診断等のマルチモダリティ撮像のために使用されることができる。

【0007】

部分的に前述に基づいて、本明細書に説明されるのは、細胞標識および操作（インビトロおよびインビボ）を含む、種々の用途に有用なＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
金属含有（ＭＣ）半電導性（ＳＣ）ポリマードット（Ｐｄｏｔ）であって、
（ｉ）金属を含むナノ粒子（ＮＰ）と、
（ｉｉ）前記ＮＰに関連付けられたＳＣポリマーと
を備え、
前記ＳＣポリマーは、前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの少なくとも５０％ｖ／ｖを含むか、または前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ群は、約８０ｎｍより小さい平均直径を有する、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
（項目２）
前記ＮＰは、１つの金属粒子から成る、項目１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
（項目３）
前記１つの金属粒子は、Ｎａ、Ｌｉ、Ｚｎ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｓｉ、Ｇａ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ａｇ、Ａｕ、その酸化物、その錯体、その合金、またはそれらの組み合わせを含む、項目２に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
（項目４）
前記１つの金属粒子は、ＡｕまたはＦｅを含む、項目３に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
（項目５）
前記１つの金属粒子は、ＦｅＯ_ｘを含み、ｘは、ａ／ｂに等しく、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、項目３に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
（項目６）
前記ＳＣポリマーは、前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの少なくとも５０％ｖ／ｖを形成し、前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ群は、約８０ｎｍより小さい平均直径を有する、項目１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
（項目７）
前記ＳＣポリマーは、前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの少なくとも約８０％ｖ／ｖを形成している、項目１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
（項目８）
前記ＮＰは、疎水性ポリマーに付着されることにより、疎水性コアを形成している、項目１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
（項目９）
約３５０ｎｍ〜約８５０ｎｍの吸収波長を有する、項目１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
（項目１０）
項目１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔをナノ析出するプロセスであって、前記プロセスは、
金属を含む疎水性相転移ＮＰをＳＣポリマーと水溶液中で混合し、それによって、前記ＮＰを前記ＳＣポリマーのマトリクス内に捕捉し、それによって、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを形成することを含む、プロセス。
（項目１１）
前記ＮＰは、１つの金属粒子から成る、項目１０に記載のプロセス。
（項目１２）
前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、スクロースステップ勾配を使用して、空のＰｄｏｔから分離される、項目１１に記載のプロセス。
（項目１３）
前記ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、遠心分離を使用して、空のＰｄｏｔからさらに分離される、項目１２に記載のプロセス。
（項目１４）
各ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、１つのみのＮＰを含む、項目１１に記載のプロセス。
（項目１５）
ＮＰをトルエンと接触させることにより、前記疎水性相転移ＮＰを形成することをさらに含む、項目１０に記載のプロセス。
（項目１６）
前記トルエンは、チオール末端官能基を伴う半電導性ポリマーを含む、項目１５に記載のプロセス。
（項目１７）
遠心分離を使用して、前記疎水性相転移ＮＰを前記トルエンから分離することをさらに含む、項目１５に記載のプロセス。
（項目１８）
前記混合することは、音波処理を用いて行われる、項目１１に記載のプロセス。
（項目１９）
前記ＳＣポリマーは、前記混合の間、前記疎水性相転移ＮＰより高い濃度にある、項目１１に記載のプロセス。
（項目２０）
項目１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを標的細胞に関連付け、前記標的細胞の領域内に磁場を印加し、それによって、前記標的細胞を操作することによって、磁性を使用して標的細胞を操作する方法。
（項目２１）
前記ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔのＮＰは、１つの金属粒子から成る、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記１つの金属粒子は、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｇａ、その酸化物、その合金、その錯体、それらの組み合わせ、ならびに非磁気金属との組み合わせおよび錯体を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記１つの金属粒子は、Ｆｅまたはその酸化物を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記１つの金属粒子は、ＦｅＯ_ｘであり、Ｘは、ａ／ｂに等しく、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記ＳＣポリマーは、カルボン酸末端ポリスチレン−ポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記カルボン酸末端ポリスチレン−ポリ（エチレングリコール）ポリマー上のカルボン酸基は、生物学的活性化合物と生体結合する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記生物学的活性化合物は、ストレプトアビジンである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記標的細胞は、癌細胞である、項目２０に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、単一金（Ａｕ）粒子が各Ｐｄｏｔ（Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ）内に埋め込まれた、本明細書に説明されるようなＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを生成するための手技を図示する。

【図2】図２Ａ−Ｃは、空のＰｄｏｔからのＡｕまたはＦｅＯｘを含有するＰｄｏｔの分離を図示する。（Ａ）は、ステップスクロース勾配とともに遠心分離を使用する、精製手技を描写する、略図である。スクロース溶液の上方の分画から回収された空のＰｄｏｔ（左）、管の下層分画からのＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ（右）の透過電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）画像である。差し込みヒストグラムは、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔのサイズ分布を示す。平均直径は、６４ｎｍであった。（Ｂ）は、単一Ａｕ粒子を含有するＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔのＴＥＭ画像と、各ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ内のＡｕ粒子の数を示す、ヒストグラムである。平均サイズは、２８ｎｍであった。差し込みヒストグラムは、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔのサイズ分布である。（Ｃ）は、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔのＴＥＭ画像である。平均サイズは、５２ｎｍであった。ハイブリッドＰｄｏｔの内側に埋め込まれた使用されたＦｅＯ_ｘ粒子は、平均直径４０ｎｍであった。差し込みヒストグラムは、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔのサイズ分布である。スケールバーは、５０ｎｍを表す。

【図3】図３Ａ−Ｄは、本明細書に説明されるように調製されたＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの光学特性評価を図示する。（Ａ）は、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの吸収（Ａｂｓ．）、（Ｂ）は、発光（Ｆｌｕ．）スペクトルである。励起波長は、３８０ｎｍであり、ＳＣポリマーは、ポリ（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）（ＰＦＯ）であった。（Ｂ）は、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの吸収であり、（Ｄ）は、発光スペクトルである。励起波長は、４５７ｎｍであり、ＳＣポリマーは、ポリ［（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−（１，４−ベンゾ−｛２，１，３｝−チアジアゾール）］（ＰＦＢＴ）であった。

【図4】図４Ａ−Ｃは、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの暗視野および蛍光顕微鏡画像を図示する。（Ａ）は、ガラスカバースリップ上に固定されたＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの暗視野（左）であり、（Ｂ）は、蛍光（右）画像である。（Ｃ）は、細胞内側のＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの暗視野および蛍光画像である。（ｉ）は、細胞全体の暗視野画像であり、（ｉｉ）は、（ｉ）内の赤の長方形領域の拡大画像であり、（ｉｉｉ）は、（ｉｉ）の対応する蛍光画像である。Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、図２におけるものと同一であった。スケールバーは、１μｍを表す。

【図5】図５Ａ−Ｃは、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔで標識された細胞の免疫磁気単離を図示する。（Ａ）は、永久磁石を用いた水溶液中に分散されたＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの操作である。（Ｂ）は、細胞表面タンパク質ＥｐＣＡＭを標識するためのＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔへのストレプトアビジンの生体結合を示す、略図である。（Ｃ）は、永久磁石を用いたＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔで標識された細胞の免疫磁気分離である。右の画像は、単離された細胞を示す。スケールバーは、５μｍを表す。

【図6】図６Ａ−Ｂは、合成されたＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの特性を図示する。（Ａ）は、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔのＴＥＭ画像である。（Ｂ）は、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔのサイズヒストグラムである。平均サイズは、６．５ｎｍであった。スケールバーは、２０ｎｍを表す。

【図7】図７Ａ−Ｂは、磁気ＮＰが埋め込まれたＰＦＯ−Ｐｄｏｔ（ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ）のＴＥＭ画像を図示する。Ａ）は、１０ｎｍ磁気ＮＰを含有するＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔである。Ｂ）は、２０ｎｍ磁気ＮＰを含有するＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔである。スケールバーは、１００ｎｍを表す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

ポリマードット（Ｐｄｏｔ）は、最近、撮像用途において大きな有望性が期待される、新しいタイプの蛍光ナノプローブとして登場した。Ｐｄｏｔ系ハイブリッドは、Ｐｄｏｔ単独では利用可能ではない、追加の機能性を提供することができる。本開示は、他の用途の中でもとりわけ、細胞撮像および操作の両方において有益な機能性を伴う、金属含有（ＭＣ）半電導性（ＳＣ）Ｐｄｏｔ（ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ）を提供する。特定の実施形態では、Ｐｄｏｔは、少なくとも１つの金属を含む少なくとも１つのＮＰと、ＮＰに関連付けられたポリマーとを含む。追加の実施形態では、ポリマーマトリクスは、ＮＰを包囲することができる。追加の特定の実施形態では、ＮＰは、１つの金属粒子を含む、それから成る、または本質的にそれから成る。さらなる実施形態では、少なくとも１つの金属を含む、または１つの金属粒子から成る、ＮＰは、ＮＰに付着された疎水性または親水性ポリマーあるいは他の疎水性または親水性分子を有することにより、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔに対して「疎水性コア」または「親水性コア」を形成する。そして、本疎水性コアまたは親水性コアは、その中にＳＣポリマーを有するポリマーマトリクスによって包囲される。本明細書で使用される場合、「包囲される」とは、完全封入ならびに８０％封入、８５％封入、９０％封入、９５％封入、または９９％封入を含む。

【0010】

ＮＰ、疎水性コアまたは親水性コア、およびポリマーマトリクス間の関連は、物理的または化学的関連を通した関連であることができる。物理的関連は、限定ではないが、ファンデルワールス力、静電気、πスタッキング、疎水性、エントロピー的な力、およびそれらの組み合わせを含む、ある範囲の力から生じ得る。化学関連は、化学結合を通して生じ得る。

【0011】

説明されるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ群は、特定の用途に応じて、さまざまな平均直径を有することができる。特定の実施形態では、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、平均直径５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍ、２０ｎｍ、２１ｎｍ、２２ｎｍ、２３ｎｍ、２４ｎｍ、２５ｎｍ、２６ｎｍ、２７ｎｍ、２８ｎｍ、２９ｎｍ、３０ｎｍ、３１ｎｍ、３２ｎｍ、３３ｎｍ、３４ｎｍ、３５ｎｍ、３６ｎｍ、３７ｎｍ、３８ｎｍ、３９ｎｍ、４０ｎｍ、４１ｎｍ、４２ｎｍ、４３ｎｍ、４４ｎｍ、４５ｎｍ、４６ｎｍ、４７ｎｍ、４８ｎｍ、４９ｎｍ、５０ｎｍ、５１ｎｍ、５２ｎｍ、５３ｎｍ、５４ｎｍ、５５ｎｍ、５６ｎｍ、５７ｎｍ、５８ｎｍ、５９ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１２０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１８０ｎｍ、または２００ｎｍ、平均直径１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、または未満１０ｎｍ、平均直径５ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜６０ｎｍ、２０ｎｍ〜４０ｎｍ、２０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜８０ｎｍ、５０ｎｍ〜８０ｎｍ、６０ｎｍ〜８０ｎｍ、７０ｎｍ〜８０ｎｍ、１０ｎｍ〜４０ｎｍ、またはこれらの列挙された値のいずれかによって境界される、あるいはそれらの間の任意の範囲を有する。

【0012】

本明細書に開示されるようなＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、金属、または、少なくとも１つの金属、金属合金、金属塩、および／または金属錯体を有する金属化合物を含むことができる。ＮＰは、金属および他の非金属構成要素を含むかまたはそれから本質的に成ることができるか、あるいは、金属粒子（金属単独）から本質的に成るかまたはそれから成ることができる。金属として、限定ではないが、Ｎａ、Ｌｉ、Ｚｎ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｓｉ、Ｇａ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ａｇ、またはＡｕが挙げられ得る。さらに、これらの金属の酸化物、錯体、および組み合わせもまた、説明されるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔにおいて使用されることができる。一実施形態では、Ａｕが、金属として使用される。別の実施形態では、ＦｅＯ_ｘが、金属として使用され、ｘは、ａ／ｂに等しく、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。

【0013】

金属粒子は、単一金属原子、金属原子のクラスタ、金属原子の格子、金属原子の空間個別的なクラスタまたは格子、あるいは金属化合物、合金および／または酸化物のクラスタまたは格子（特定の実施形態では、空間個別的なクラスタまたは格子）であることができる。金属原子のクラスタは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００、２００、５００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、１，０００，０００，０００、５，０００，０００，０００、１，０００，０００，０００，０００、またはそれ以上の原子を含むことができる。いくつかの実施形態では、単一金属粒子のみが、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ内に含まれる。

【0014】

本明細書に説明されるＮＰは、付着された疎水性ポリマー、付着された親水性ポリマー、または付着された両親媒性ポリマーを有し、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの疎水性コア、親水性コア、または両親媒性コアを形成することができる。これらのコアは、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの製造、展開、および／または使用を補助することができる。特定の実施形態では、付着のための疎水性ポリマーとして、限定ではないが、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリルアミド、ポリイソブチレン、ポリジエン、ポリフェニレン、ポリエチレン、ポリラクチド、ポリスチレン、ポリシロキサン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリウレタン、そのブロックコポリマー、そのランダムまたは交互コポリマー、および同等物が挙げられ得る。特定の実施形態では、付着のための親水性ポリマーとして、限定ではないが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリアルキレングリコール、ポリ（エチレンオキシド）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、デンプン、多糖類、ポリシアル酸、および同等物が挙げられ得る。一実施形態では、親水性ポリマーは、ポリアルキレングリコールである。より具体的実施形態では、親水性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

【0015】

本明細書に説明される方法を使用して生成されるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、金属含有ＮＰ、疎水性コア、親水性コア、または両親媒性コアを包囲する、ポリマーマトリクスを形成するために、高割合または含有量のＳＣポリマーまたは半電導性ポリマーおよび他のポリマーの混成物を含む。高割合のＳＣポリマーは、より高い割合のＳＣポリマーが、より明るいＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔにつながるので、説明されるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔから高蛍光輝度を要求する生体医療用途において重要であり得る。

【0016】

例えば、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ中に存在する全ポリマーのうち、存在するＳＣポリマーの割合は、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの１０％を上回る、３０％を上回る、５０％を上回る、８０％を上回る、９０％を上回る、９５％を上回る、または９９％を上回るｖ／ｖであることができる。特定の実施形態では、ＳＣポリマーは、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％ｖ／ｖ、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％ｖ／ｖ、または少なくとも９９％ｖ／ｖ、あるいは５０％〜８０％、４０％〜９０％、または６０％〜８０％ｖ／ｖを占めることができる。別の実施形態では、ＳＣポリマーマトリクスは、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％ｖ／ｖ、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％ｖ／ｖ、５０％〜８０％、５０％〜９０％、または６０％〜８０％ｖ／ｖを占めることができる。ＳＣポリマーまたはＳＣポリマーマトリクスのｖ／ｖ割合はまた、これらの列挙された値のいずれかによって境界される、またはその間の任意の範囲を含むことができる。体積比または割合（ｖ／ｖ）は、金属ＮＰ対ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの平均直径を求めるために、ＴＥＭ撮像に基づいて、または動的光散乱測定に基づいて、検証されることができる。

【0017】

Ｐｄｏｔに関連付けられたＳＣポリマー、またはＳＣポリマーおよび非ＳＣポリマーのポリマー混成物は、特定の用途に好適となるように調整されることができ、かつ疎水性、親水性、または両親媒性にされることができる。半電導性ポリマーは、その大吸収断面、高速発光率、および高蛍光量子収率を含む、いくつかの好ましい特性に由来する、特性輝度を有することができる。半電導性ポリマーは、非局在化π電子を伴う構造単位を含む、ポリマーを含む。

【0018】

ポリマーマトリクスを形成するために使用される好適なＳＣポリマーとして、限定ではないが、フルオレンポリマー、フェニレンビニレンポリマー、フェニレンポリマー、フェニレンエチニレンポリマー、ベンゾチアゾールポリマー、チオフェンポリマー、カルバゾールフルオレンポリマー、フルオロンポリマー、ペリレンポリマー、ローダミンポリマー、シアニンポリマー、スクアラインポリマー、ポルフィリンポリマー、フタロシアニンポリマー、クマリンポリマー、キサンテンポリマー、ボロンジピロメテン系ポリマー、金属錯体系ポリマー、およびその誘導体を含む、ＳＣホモポリマーが挙げられ得る。前述の列挙されたポリマーの組み合わせまたはヘテロポリマーもまた、使用されることができる。

【0019】

本明細書に開示されるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔとの使用のために適切なより特定の例示的ＳＣポリマーは、以下の表１に列挙される。

【0020】

【表1】

【0021】

特定の実施形態では、ＳＣポリマーは、少なくとも２つの異なるＳＣ単位を含むコポリマーである。例えば、ＳＣコポリマーは、所与の比率で存在する、フルオレンおよびベンゾチアゾールＳＣ単位の両方を含有し得る。ＳＣコポリマーを合成するために使用される典型的ＳＣ単位として、限定ではないが、フルオレン単位、フェニレンビニレン単位、フェニレン単位、フェニレンエチニレン単位、ベンゾチアゾール単位、チオフェン単位、カルバゾールフルオレン単位、ボロンジピロメテン単位、およびその誘導体が挙げられる。異なるＳＣ単位が、ブロックコポリマーにおけるように、区分けされ得るか、または入り交じり得る。本明細書で使用される場合、ＳＣコポリマーは、主要ＳＣ種の識別を記述することによって表される。例えば、ＰＦＢＴは、ある比率において、フルオレンおよびベンゾチアゾール単位を含有するＳＣポリマーである。ある場合には、ダッシュが、微量ＳＣ種の割合、したがって、微量ＳＣ種の識別を示すために使用される。例えば、ＰＦ−０．１ＢＴは、９０％ＰＦおよび１０％ＢＴを含有するＳＣコポリマーである。別の実施形態では、ＳＣポリマーは、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上の異なるＳＣ単位を含む、コポリマーである。

【0022】

他の実施形態では、ＳＣポリマーの混成物が、使用されることができる。混成物は、ＳＣホモポリマー、コポリマー、およびオリゴマーの任意の組み合わせを含み得る。ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを形成するために使用される、半電導性ポリマー混成物は、結果として生じるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの特性を調整するために、例えば、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔに対する所望の励起または発光スペクトルを達成するために、選択され得る。

【0023】

本明細書に説明されるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、１つ以上の吸収ピークを含む、特性吸収スペクトルを有することができる。一実施形態では、Ｐｄｏｔは、３５０ｎｍ、３６０ｎｍ、３７０ｎｍ、３８０ｎｍ、３９０ｎｍ、４００ｎｍ、４１０ｎｍ、４２０ｎｍ、４３０ｎｍ、４４０ｎｍ、４５０ｎｍ、４６０ｎｍ、４７０ｎｍ、４８０ｎｍ、４９０ｎｍ、５００ｎｍ、５２０ｎｍ、５２５ｎｍ、５３０ｎｍ、５４０ｎｍ、５５０ｎｍ、５６０ｎｍ、５７０ｎｍ、５８０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、６１０ｎｍ、６２０ｎｍ、６３０ｎｍ、６４０ｎｍ、６５０ｎｍ、６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７２０ｎｍ、７４０ｎｍ、７５０ｎｍ、７６０ｎｍ、７７０ｎｍ、７８０ｎｍ、７９０ｎｍ、８００ｎｍ、８１０ｎｍ、８２０ｎｍ、８３０ｎｍ、８４０ｎｍ、８５０ｎｍ、８６０ｎｍ、５２０ｎｍ〜５３０ｎｍ、４００ｎｍ〜６４０ｎｍ、６５０ｎｍ〜８５０ｎｍ、３５０ｎｍ〜６００ｎｍ、３５０ｎｍ〜８５０ｎｍ、または４００ｎｍ〜６００ｎｍに吸収のピークを有することができる。他の実施形態では、吸収は、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５３２ｎｍ、５６０ｎｍ、６３３ｎｍ、および６５０ｎｍ〜８５０ｎｍにおいて生じることができ、また、これらの列挙された値のいずれかによって境界される、またはその間の任意の範囲を含むことができる。

【0024】

Ｐｄｏｔはまた、エネルギーが供給されると、蛍光を発することができる。蛍光は、可視領域４００ｎｍ〜７００ｎｍの波長で生じることができる。蛍光は、近紫外線領域３００ｎｍ〜４００ｎｍの波長で生じることができる。蛍光はまた、電磁スペクトルの近赤外線または赤外線領域内の波長で生じることができる。近赤外線発光は、波長７００ｎｍ〜１５００ｎｍを有する電磁放射を指す。

【0025】

（ＭＣ−ＳＣ−ＰＤＯＴ形成の方法）
ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを調製するために、２つの主要アプローチが、説明される。１つは、ミニエマルションに基づくものであり、もう１つは、ナノ析出に基づくものである。

【0026】

（１．ミニエマルション形成方法）。両親媒性界面活性剤分子が、疎水性ＳＣポリマーを含有する水溶性ミセルを形成するために使用されることができる。しかしながら、本ミニエマルション法に従って形成されるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、非常に小割合の蛍光ＳＣポリマー（ポリマーマトリクスの１．２％〜８％）を含有し、また、非常に大きく、平均直径またはサイズ１２０ｎｍ〜１８０ｎｍ以上におよび得る。

【0027】

（２．ナノ析出形成方法）。ミニエマルションによって生産されるものより小さいＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、より優れた細胞標識および生体分布特性を保有することができるため、より望ましくあり得る。ミニエマルション法と比較して、ナノ析出によって調製されたＰｄｏｔは、より小さくあり得、共有結合によって、ストレプトアビジン等の生体分子に容易に結合される（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ことができる。加えて、ナノ析出法では、埋め込まれるＮＰの数は、たった１つまで減少されることができ、例えば、ＮＰは、単一金属粒子を含む、本質的にそれから成る、またはそれから成る。

【0028】

例示的ナノ析出プロセスでは、疎水性相転移金属含有ＮＰが、少なくとも１つのＳＣポリマーと水溶液中で混合され、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを形成する。

【0029】

相転移ＮＰは、ＮＰを疎水性溶媒と接触させることによって形成されることができる。すなわち、ＮＰを水性環境から疎水性溶媒中に転移させるために、ＮＰは、性質上、疎水性である、または疎水性にされ、例えば、疎水性コーティングを有するか、あるいは疎水性ポリマーまたは分子から形成され得る。一実施形態では、ＮＰは、疎水性溶媒中に分配するためにＮＰの表面をコーティングするために、疎水性反応性化合物と反応させられることができる。そのような疎水性反応性化合物は、チオール末端官能基を伴う、ＳＣポリマーであることができる。そのようなポリマーは、限定ではないが、チオール末端ポリスチレン、チオール末端ポリ（ビニルピロリドン）、チオール末端ポリ（４−ビニルピリジン）またはチオール末端ポリ（ブタジエン）であることができる。

【0030】

ＮＰの表面が、疎水性になると、疎水性溶媒中に均質に分散されることができる。適切な疎水性溶媒として、限定ではないが、エーテル、トルエン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メタン、ブタン、プロパン、ペンタン、ヘキサン、および同等物が挙げられる。一実施形態では、溶媒は、トルエンであることができる。

【0031】

相転移されると、ＮＰは、水性環境中でＳＣポリマーと混合されることができる。そのような混合は、撹拌バー、渦、音波処理、または同等物等の物理的手段を使用して達成されることができる。一実施形態では、混合は、音波処理によって行われる。

【0032】

ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを適切に形成するために、ＳＣポリマーの濃度は、ＮＰより高い濃度で提供されることができる。ＳＣポリマー対ＮＰの比は、限定ではないが、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１：１を上回る、２：１を上回る、３：１を上回る、４：１を上回る、または５：１を上回ることができる。

【0033】

ある条件下では、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの形成は、空のＰｄｏｔ、すなわち、少なくとも１つのＮＰを含有しないＰｄｏｔの形成を伴い得る。少なくとも１つのＮＰを含む所望のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、スクロースステップ勾配または任意の他の適切なステップ勾配等のステップ勾配を使用して、空のＰｄｏｔから分離されることができる。所望のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔはまた、遠心分離を使用して、空のＰｄｏｔから分離されることができる。いくつかの実施形態では、ステップ勾配ステップおよび遠心分離ステップの両方が、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを空のＰｄｏｔから分離するために利用されることができる。

【0034】

（Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔおよびＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの形成および説明）。Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔおよびＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの形成は、前述の方法のより特定の実施例として提供される。概して、Ａｕ−ＮＰは、最初に、水溶液中で合成され、次いで、チオール末端ポリスチレンの助けを借りて、トルエン中への相転移を介して、表面が疎水性となるように修飾される。相転移後、上層トルエン溶液は、遠心分離され、疎水性Ａｕ−ＮＰを収集する。ＮＰペレットは、疎水性ＳＣポリマー一緒に、ＴＨＦ中に再分散される。このＴＨＦ溶液は、次いで、音波処理下で純水中に注入され、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを生産する（図１）。

【0035】

他の実施形態では、疎水性表面をすでに含み、トルエン中に十分に分散されたＦｅＯ_ｘ−ＮＰが、購入されることができる。したがって、これらのＮＰは、直接、遠心分離され、ＳＣポリマーと一緒にＴＨＦ中に再分散されることができる。

【0036】

溶液中に存在する全Ａｕおよび／またはＦｅＯ_ｘ−ＮＰが、Ｐｄｏｔ内に封入されるのを確実にするのに役立つように、溶液中のＳＣポリマー濃度は、概して、ＮＰより高く保たれる。Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔおよびＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、空のＰｄｏｔよりはるかに高い密度を有するため、空のＰｄｏｔから分離されることができる。図２Ａは、スクロースステップ勾配が使用される、精製手技を図示する。より重いＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、スクロース層を貫通し、遠心分離管の底部に沈降する一方、より軽い空のＰｄｏｔは、スクロース層の上方に留まる。

【0037】

図２Ａはまた、スクロース層の上方の溶液と遠心分離管の底部のものとから回収されたＰｄｏｔの透過電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）画像を図示する。ＴＥＭ画像では、空のＰｄｏｔは、ペレット中に認められず、またはいかなるＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔも、上層分画中に認められなかった。この結果は、略１００％収率を伴う、空のＰｄｏｔからのＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの精製成功を示す。他の実施形態では、８０％を上回る、８５％を上回る、９０％を上回る、９５％を上回る、９６％を上回る、９７％を上回る、９８％を上回る、または９９％を上回る収率が、容認可能であることができる。一実施形態では、高濃度のＡｕ−ＮＰが、使用され、複数のＡｕ−ＮＰを含有した大型Ｐｄｏｔ（直径６４ｎｍ）をもたらす。

【0038】

Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔのサイズは、埋め込まれたＡｕ−ＮＰの数が減少すると、さらに縮小されることができる。例えば、最初に添加されたＡｕ−ＮＰの濃度が十分に低いとき、ＰｄｏｔあたりのＡｕ−ＮＰの占有率は、低下する。単一Ａｕ−ＮＰのみを含有するＰｄｏｔが、生成された（図２Ｂ参照）。単独占有Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの平均サイズは、２８ｎｍであると測定された。他の平均サイズは、本明細書に説明されるように達成されることができる。単一封入ＮＰを伴うＰｄｏｔを生成するためのこの方式はまた、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔにも機能し得る（図２Ｃ参照）。

【0039】

Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔおよびＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔハイブリッドの光学特性もまた、特性評価されることができる。Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、吸収スペクトルの５２５ｎｍにおいて新しいピークを有し、これは、純ＰＦＯＰｄｏｔから得られたピークと異なる（図３Ａ）。この新しいピークは、Ａｕ−ＮＰの特性局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）に由来する。水中に分散された裸Ａｕ−ＮＰと比較して、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔのＬＳＰＲピークは、若干、赤方偏移される。この赤方偏移は、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ間の近接近性と、Ｐｄｏｔが水より高い屈折率を有するためのＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの周囲の局所環境の変化とによって生じると考えられる。Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔおよび純ＰＦＯＰｄｏｔの発光スペクトルはまた、類似する。図３Ｂに図示されるように、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの吸収ピークは、ＦｅＯ_ｘ−ＮＰの広帯域吸収のため、わずかに広がる。すなわち、ＳＣポリマーの蛍光発光スペクトルの形状は、ＦｅＯ_ｘ−ＮＰによって影響されない。

【0040】

ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ内のＮＰは、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの蛍光を消光させる潜在性を有する。この潜在性問題の範囲を決定するために、種々のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの量子収率（ＱＹ）値が、測定されることができる。純ＰＦＯＰｄｏｔのＱＹ値は、３７％であり、複数のＡｕ−ＮＰを伴うＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの場合、７％である。ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔあたりのＡｕ−ＮＰの数が、１まで減少されると、ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔのＱＹは、１８％まで増加される。各ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔが、Ｑｄｏｔより３０倍明るくなり得るという事実を前提として、ＱＹにおけるこの２〜５倍の減少は、管理可能である。また、本明細書に説明されるように調製されたＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの発蛍光団密度は、ミニエマルション法によって調製されたＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔより有意に高いことに留意されたい。例えば、本明細書に説明されるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔでは、ポリマーマトリクスの９０％（ＳＣポリマー１０部、ＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ１部）は、蛍光ＳＣポリマーである。したがって、説明されるナノ析出法を使用して調製されたＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、その望ましい光学特性の多くを保持する。

【0041】

説明される方法は、他の多機能ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔプローブを作成するための他のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの形成のために一般化可能である。一実施形態では、これらの方法は、高割合または含有量の蛍光ＳＣポリマーを含み、ひいては、非常に明るいＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔをもたらす組成物を伴う、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを生成することができる。

【0042】

（例示的ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ用途および関連付けられた考慮点）。

【0043】

本明細書に説明されるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、多くの異なる診断シナリオおよび／または治療手技において有用であり得る。一実施例において、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、二重モダリティ撮像において使用されることができ、二重モダリティ撮像において、Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔからの蛍光およびＡｕからの散乱の共局在性が、下流単一粒子追跡および細胞撮像のためのＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔプローブを識別するために使用されることができる。

【0044】

他の実施形態では、磁性を使用して標的細胞を操作するための方法が、開示される。これらの実施形態では、磁気ＮＰが、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ内に埋め込まれ、Ｐｄｏｔは、標的細胞に関連付けられる。磁場の印加は、標的細胞を操作することができる。操作として、限定ではないが、誘引、単離、反発、局在化、精製、転移、または同等物が挙げられ得る。特定の実施形態では、磁気ＮＰとして、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｇａ、その酸化物、その錯体、それらの組み合わせ、ならびに非磁気金属との組み合わせおよび錯体が挙げられ得る。一実施形態では、金属粒子は、ＦｅＯ_ｘであり、ｘは、ａ／ｂに等しく、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。

【0045】

Ｐｄｏｔを標的細胞または他の物質に付着可能にするために、Ｐｄｏｔは、最初に、適切なポリマーでコーティングされることができるか、または適切なポリマーマトリクスを含むことができる。適切なポリマーコーティングまたはポリマーマトリクスとして、標的分子との反応を受けやすい末端基を伴うポリマーが挙げられ得る。一実施形態では、ポリマーマトリクスを形成するために使用されるポリマーとして、ポリスチレン−ポリ（エチレングリコール）等のカルボン酸末端ポリマーが挙げられ得る。

【0046】

Ｐｄｏｔが、遊離カルボン酸基を有すること等によって、活性表面を有すると、生物学的活性標的分子は、付着されることができる。生物学的活性化合物は、具体的標的細胞、細胞株、または物質に対して調整されることができる。例えば、生物学的活性化合物は、癌細胞を標的とし、それに付着することができる、ストレプトアビジンであることができる。

【0047】

標的細胞、細胞株、または物質に付着されると、磁場が印加され、その起源から離れた場所に、標的細胞、細胞株、または物質を移動させること、または別様に操作することができ、特定の実施例では、それは、本体または他のベシクルから分離または別様に除去されることができる。

【0048】

特に、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの場合、種々のサイズの磁気ＮＰを含有するＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔが、調整された。ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ調製の間、高分子量ポリマーＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨが、ハイブリッドＰｄｏｔ中に混成された。ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの表面上のカルボン酸基は、ストレプトアビジンとの容易な生体結合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を可能にした。そして、標的細胞株は、生体結合されたＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔと結合され、それによって、細胞を標識した。そして、標識された細胞は、磁石に誘引された。故に、本明細書に開示される実施形態では、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、サンプル調製において採用され、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔでタグ付けされた細胞は、外部磁石を使用して単離された。細胞はまた、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの強烈な蛍光に基づいて、検出および撮像された。

【0049】

より強い磁石および磁気ＮＰが、この方法に基づいて開発され得ることを前提として、細胞分離効率は、さらに改良され得る。

【0050】

（例示的実施形態：）
１．金属含有（ＭＣ）半電導性（ＳＣ）ポリマードット（Ｐｄｏｔ）であって、
（ｉ）金属を含むナノ粒子（ＮＰ）と、
（ｉｉ）ＮＰに関連付けられたＳＣポリマーと
を含むか、それらから本質的に成るか、またはそれらから成り、ＳＣポリマーは、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの少なくとも５０％ｖ／ｖを含むか、またはＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ群は、８０ｎｍより小さい平均直径を有する、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
２．ＮＰは、１つの金属粒子から本質的に成るか、またはそれから成る、実施形態１に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
３．金属または１つの金属粒子は、Ｎａ、Ｌｉ、Ｚｎ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｉｎ、Ｓｉ、Ｇａ、Ａｌ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ａｇ、Ａｕ、その酸化物、その錯体、その合金、またはそれらの組み合わせを含むか、それから本質的に成るか、またはそれから成る、実施形態１または２に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
４．金属または１つの金属粒子は、ＡｕまたはＦｅを含むか、それから本質的に成るか、またはそれから成る、実施形態１、２、または３に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
５．金属または１つの金属粒子は、ＦｅＯ_ｘを含むか、それから本質的に成るか、またはそれから成り、ｘは、ａ／ｂに等しく、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、実施形態１、２、または３に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
６．ＳＣポリマーは、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの少なくとも５０％ｖ／ｖを形成し、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ群は、８０ｎｍより小さい平均直径を有する、実施形態１、２、３、４、または５に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
７．ＳＣポリマーは、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの少なくとも８０％または少なくとも９０％ｖ／ｖを形成する、実施形態１、２、３、４、５、または６に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
８．ＮＰは、疎水性ポリマーに付着されることにより、疎水性コアを形成する、実施形態１、２、３、４、５、６、または７に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
９．３５０ｎｍ〜８５０ｎｍの吸収波長を有する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、または８に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ。
１０．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、または９に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔをナノ析出するプロセスであって、
金属を含む疎水性相転移ＮＰをＳＣポリマーと水溶液中で混合し、それによって、ＮＰをＳＣポリマーのマトリクス内に捕捉し、それによって、ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを形成することを含むか、それから本質的に成るか、またはそれから成る、プロセス。
１１．ＮＰは、１つの金属粒子から本質的に成るか、またはそれから成る、実施形態１０に記載のプロセス。
１２．ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、スクロースステップ勾配を使用して、空のＰｄｏｔから分離される、実施形態１０または１１に記載のプロセス。
１３．ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、遠心分離を使用して、空のＰｄｏｔからさらに分離される、実施形態１２に記載のプロセス。
１４．各ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、１つのＮＰを含むか、それから本質的に成るか、またはそれから成る、実施形態１０、１１、１２、または１３に記載のプロセス。
１５．ＮＰをトルエンと接触させることにより、疎水性相転移ＮＰを形成することをさらに含む、実施形態１０、１１、１２、または１３に記載のプロセス。
１６．トルエンは、チオール末端官能基を伴う半電導性ポリマーを含む、実施形態１５に記載のプロセス。
１７．遠心分離を使用して、疎水性相転移ＮＰをトルエンから分離することをさらに含むか、それから本質的に成るか、またはそれから成る、実施形態１５または１６に記載のプロセス。
１８．混合することは、音波処理を用いて行われる、実施形態１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６に記載のプロセス。
１９．ＳＣポリマーは、混合の間、疎水性相転移ＮＰより高い濃度にある、実施形態１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７に記載のプロセス。
２０．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、または９に記載のＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを標的細胞に関連付け、標的細胞の領域内に磁場を印加し、それによって、標的細胞を操作することによって、磁性を使用して標的細胞を操作する方法。
２１．ＭＣ−ＳＣ−ＰｄｏｔＮＰは、１つの金属粒子から本質的に成るか、またはそれから成る、実施形態２０に記載の方法。
２２．金属または１つの金属粒子は、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｇａ、その酸化物、その錯体、その合金、それらの組み合わせ、ならびに非磁気金属との組み合わせおよび錯体を含むか、それから本質的に成るか、またはそれから成る、実施形態２０または２１に記載の方法。
２３．金属または１つの金属粒子は、Ｆｅまたはその酸化物を含むか、それから本質的に成るか、またはそれから成る、実施形態２０、２１、または２２に記載の方法。
２４．１つの金属粒子は、ＦｅＯ_ｘを含むか、それから本質的に成るか、またはそれから成り、ｘは、ａ／ｂに等しく、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、ｂは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である、実施形態２０、２１、または２２に記載の方法。
２５．ＳＣポリマーは、カルボン酸末端ポリスチレン−ポリ（エチレングリコール）ポリマーを含む、実施形態２０、２１、２２、２３、または２４に記載の方法。
２６．カルボン酸末端ポリスチレン−ポリ（エチレングリコール）ポリマー上のカルボン酸基は、生物学的活性化合物と生体結合する、実施形態２５に記載の方法。
２７．生物学的活性化合物は、ストレプトアビジンである、実施形態２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６に記載の方法。
２８．標的細胞は、癌細胞である、実施形態２７に記載の方法。

【0051】

（実施例）
（１．材料）。ジメチルフェニル（ＰＦＯ、ＭＷ１２００００Ｄａ）で末端封止されたポリ（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）、およびポリ［（９，９−ジオクチルフルオレニル−２，７−ジイル）−コ−（１，４−ベンゾ−（２，１０，３）−チアジアゾール）］（ＰＦＢＴ、ＭＷ １５７０００ Ｄａ）が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｙｅ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ．（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入された。チオール末端ポリスチレン（ＰＳＳＨ，ＭＷ １０００ Ｄａ）が、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ．（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から購入された。テトラクロロ金酸（ＨＡｕＣｌ_４）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）、炭酸カリウム（Ｋ_２ＣＯ_３）、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、および磁気ＮＰ（１０ｎｍ、２０ｎｍ平均サイズ、トルエン中５ｍｇ／ｍＬ）が、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手された。磁気ＮＰ（４０ｎｍ平均サイズ、オレイン酸コーティング、クロロホルム中２５ｍｇ／ｍＬ）が、Ｏｃｅａｎ ＮａｎｏＴｅｃｈ（Ｓｐｒｉｎｄａｌｅ，Ａｒｋａｎｓａｓ）から購入された。カルボキシル基で官能化されたポリスチレングラフト処理エチレンオキシド（ＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ；ＰＳ部分のＭＷ２１，７００Ｄａ；ＰＥＧ−ＣＯＯＨの１２００Ｄａ；多分散性、１．２５）が、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ．（Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から得られた。スクロースが、Ａｖａｎｔｏｒ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から注文された。

【0052】

（２．Ａｕ−ＮＰの合成）。氷浴中の１００ｍＬ ＭｉｌｌｉＱ水に、４ｍＬの１．０％テトラクロリド金酸（ＨＡｕＣｌ_４）水溶液および１．３ｍＬの０．２ＭＫ_２ＣＯ_３が、投入された。溶液は、激しく撹拌され、その後、１．０ｍＬの１．５４ｍｇ／ｍＬ水素化ホウ素ナトリウム溶液（氷浴中に保たれる）が、添加された。この手技は、５回（合計５ｍＬ）、繰り返された。溶液は、次いで、４℃で一晩撹拌された。

【0053】

（３．Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの調製）。１ｍｇ／ｍＬＰＳＳＨを含有する４−ｍＬトルエンに、２ｍＬのＡｕ ＮＰ溶液が投入され、混合された。激しく振盪された後、混合物は、実験台に置かれ、相分離させられた。Ａｕ ＮＰが上層トルエン溶液に相転移された後、下層水溶液は、廃棄された。無水硫酸ナトリウムが、添加され、トルエンを乾燥させた。次いで、Ａｕ ＮＰ含有トルエン溶液が、４０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離された。ペレットが、２ｍＬテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に再分散された。５００μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＰＦＯおよび５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ溶液が、Ａｕ ＮＰを含有するＴＨＦ溶液に添加された。追加の量のＴＨＦが添加され、最終体積を５ｍＬに調節した。５−ｍＬ混合物は、次いで、強力な音波処理下、１０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に急注入された。ＴＨＦは、９０℃で窒素ガスを溶液中に吹送することによって除去された。ＴＨＦを含まないＰｄｏｔ溶液は、続いて、１〜２分間、音波処理され、０．２−μｍセルロース膜フィルタを通して濾過された。

【0054】

（４．Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの精製）。遠心分離管に、１．５ｍＬの１．５Ｍスクロース水溶液が投入され、その後、前述のように調製された２ｍＬのＡｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ溶液が、スクロース層の上部に置かれた。遠心分離管は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ^ＴＭ Ｍａｘ−Ｅ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ機械内に入れられ、４５分間、４５０００ｒｐｍでスピンされた。スクロース層の上方の溶液は、収集され、「純Ｐｄｏｔ」として標識された。スクロース層の底部に形成されたペレットは、音波処理を用いて、２ｍＬの水中に再分散され、「Ａｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔ」として標識された。Ａｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔの流体力学直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）分光計（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて測定された。蛍光量子収率が、１５０Ｗ ＣＷキセノンランプからの励起光を伴う積分球（モデルＣ９９２０−０２、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を使用して収集された。Ａｕ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの吸収および蛍光スペクトルが、それぞれ、ＤＵ７２０走査分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）およびＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−３蛍光分光光度計（ＨＯＲＩＢＡ ＪｏｂｉｎＹｖｏｎ，ＮＪ）を用いて測定された。

【0055】

（５．Ａｕ−ＮＰ−ＰＦＯＰｄｏｔの暗視野および蛍光顕微鏡撮像）。カバースリップ上のＡｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔを撮像するために、Ａｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔを含有する溶液の液滴が、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で表面修飾されたクリアなカバースリップ上に置かれた。細胞内側のＡｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔを撮像するために、手技は、以下のように行われた。培養フラスコ中のＨｅＬａ細胞の集密が、適切なレベルに到達すると、細胞は、培養液で軽く漱ぎ、その後、５分間、３７℃において、３ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％ ｗ／ｖ Ｔｒｙｐｓｉｎ，０．５３ｍ Ｍ ＥＤＴＡ）でインキュベートすることによって培養フラスコから採取された。完全切り離し後、細胞は、漱がれ、遠心分離され、培養液中に再懸濁された。１００マイクロリットルの懸濁された細胞溶液が、ペトリ皿内側の清潔なガラスカバースリップの上部に置かれた。カバースリップは、１時間、細胞インキュベータ内に放置され、細胞をガラス表面に付着させた。次いで、１．５ｍＬの細胞培養液が、ペトリ皿に添加され、カバースリップを浸した。ペトリ皿は、１日、細胞インキュベータ内に放置された。そして、適切な量のＡｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔ溶液が、ペトリ皿に添加され、細胞は、約４時間、インキュベートされた。次いで、ガラスカバースリップが、１５分間、パラアルデヒド溶液中に置かれ、顕微鏡実験が行われる前に、細胞を固定させた。Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００倒立顕微鏡が、撮像のために使用された。顕微鏡が、暗視野モードで動作されたとき、開口数（ＮＡ）１．３オイルコンデンサおよび調節可能ＮＡ（０．７−１．３）を伴う１００倍対物レンズが、搭載された。１００Ｗハロゲンランプが、光源として使用された。顕微鏡が、エピ蛍光モードで動作されたとき、４０５−ｎｍレーザが、励起光源として使用され、４１０−ｎｍダイクロイックミラーおよび４６０／８０ｎｍ帯域通過フィルタが、蛍光発光をＰｄｏｔからフィルタリングするために使用された。暗視野および蛍光画像の両方が、ｐｒｏｓｉｌｉｃａカメラ（ＧＣ１３８０およびＧＣ６６０，Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，ＭＡ）を用いて撮影された。

【0056】

Ａｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔが、暗視野および蛍光顕微鏡の両方に対して、二重−モダリティ撮像プローブとしての役割を果たし得るかどうかを試験するために、暗視野光学系を具備した蛍光顕微鏡を使用して、撮像された。個々のＡｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔが、暗視野および蛍光モードの両方において、優れた信号対雑音比を伴って撮像された（図４Ａ）。２つの画像内の全てのＡｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔの位置が、互いに関連付けられた。より複雑な環境を表す、哺乳類細胞内側のＡｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔ（図４Ｂ）もまた、撮像された。暗視野モードでは、多くの細胞小器官もまた、光を強く散乱させ、これは、Ａｕ−ＮＰからそれらを区別することを困難にした。蛍光モードに切り替えられると、明点の数は、減少した（図４Ｂ）。蛍光画像中の各明点は、暗視野画像内の対応する明点を有していた。Ａｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔのみ、強い蛍光および散乱の両方の信号を発生させ得ることを考慮すると、暗視野画像中に現れた明点をＡｕ−ＮＰ−Ｐｄｏｔに由来する６つの点（矢印によって指し示される）に定めることが可能であった。結合ポリマーは、通常暗視野顕微鏡内の照明光下では、Ａｕ−ＮＰを腐食または損傷させないため、Ａｕ−ＮＰの暗視野散乱光安定性は、変化しないはずである。Ａｕ−ＮＰは、光退色しないため、暗視野モードにおける長期粒子追跡および撮像に好適であった。Ｐｄｏｔからの蛍光は、これらのＰｄｏｔナノ複合体と光を散乱させた他のナノスケール細胞特徴を区別するのに役立った。

【0057】

（６．ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの調製）。有機溶媒中２ミリリットルの磁気ＮＰが、適切な時間（１０−ｎｍおよび２０−ｎｍ磁気ＮＰの場合、１時間、４０−ｎｍ磁気ＮＰの場合、１５分）、１４，０００ｒｐｍでスピンされた。ペレットは、音波処理下、ＰＦＢＴおよびＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨを含有するＴＨＦ中に再分散された。溶液は、続いて、Ａｕ−ＮＰと同一の方法で処理された。磁気ＮＰを含有するＰｄｏｔは、スクロース勾配遠心分離によって、純Ｐｄｏｔから分離された。

【0058】

（７．ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔへのストレプトアビジン結合）。結合反応において、８０μＬのポリエチレングリコール（５％ｗ／ｖ ＰＥＧ、ＭＷ３３５０）および８０μＬのＨＥＰＥＳバッファ（１Ｍ、ＰＨ７．３）が、４ｍＬのＦｅ_３Ｏ_４−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ溶液に添加された。ストレプトアビジン（１ｍｇ／ｍＬ、３０μＬ）が、次いで、溶液に添加され、十分に混合された。

【0059】

次に、８０μＬの新しく調製されたＥＤＣ溶液（ＭｉｌｌｉＱ水中５ｍｇ／ｍＬ）が、溶液に添加された。前述の混合物は、室温で４時間、磁気撹拌された。結果として生じるＰｄｏｔ結合体は、（１００ＫＭＷ）スピンカラムを用いて集結され、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧカラム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて精製された。精製後、適切な量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が、最終濃度１％（ｗ／ｗ）に達するように添加された。

【0060】

（８．ストレプトアビジン結合ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを用いた実験のための細胞培地の調製）。ヒト子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）および乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から注文された。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（０．８５％ＮａＣｌ中５０００単位／ｍＬペニシリンＧ、５０μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン）が捕捉されたＥａｇｌｅｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍにおいて、５％ＣＯ_２中で３７℃で培養された。細胞は、集密に達するまで、実験に先立って、事前培養された。細胞は、培養液で軽く漱ぎ、その後、５分間、３７℃で３ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％ ｗ／ｖ Ｔｒｙｐｓｉｎ、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ）インキュベートすることによって、培養フラスコから採取された。完全切り離し後、細胞は、漱がれ、遠心分離され、培養液中に再懸濁された。その濃度は、血球計数器を使用して、顕微鏡によって決定された。

【0061】

（９．ＦｅＯ_ｘ−ＮＰ−ＰＦＢＴ Ｐｄｏｔを用いた細胞標識）。細胞表面マーカーをＩｇＧ結合体で標識するために、１００−μＬ標識バッファ（１×ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ）中１００万個のＭＣＦ−７細胞が、回転振盪機上において、３０分間、暗闇の中、室温で、０．３μＬの０。５ｍｇ／ｍＬビオチン化一次抗ヒトＣＤ３２６ＥｐＣＡＭ抗体（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でインキュベートされ、その後、標識バッファを使用した洗浄ステップが続いた。次いで、細胞は、振盪機上において、３０分間、暗闇の中、室温で、ＢｌｏｃｋＡｉｄ^ＴＭブロッキングバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）内のストレプトアビジン結合Ｐｄｏｔでインキュベートされ、その後、標識バッファを用いた２回の洗浄ステップが続いた。細胞は、後に、遠心分離によって得られた細胞ペレットを５００μＬの固定バッファ（１×ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ、１％パラホルムアルデヒド）中に溶解することによって固定された。

【0062】

（１０．ＦｅＯ_ｘ−ＮＰ−ＰＦＢＴ Ｐｄｏｔで標識された細胞の撮像）。Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００倒立顕微鏡が、撮像のために使用された。顕微鏡が、微分干渉（ＤＩＣ）モードで動作されたとき、開口数（ＮＡ）１．３オイルコンデンサ、ＮＡ１．４を伴う１００倍対物レンズ、２つの偏光子、およびＮｏｍａｒｓｋｉプリズムが、搭載された。１００Ｗハロゲンランプが、光源として使用された。顕微鏡が、エピ蛍光モードで動作されたとき、４８８−ｎｍレーザが、励起光源として使用され、５０５−ｎｍダイクロイックミラーおよび５５０／６０ｎｍ帯域通過フィルタが、Ｐｄｏｔからの蛍光発光をフィルタリングするために使用された。ＤＩＣおよび蛍光画像は両方とも、ｐｒｏｓｉｌｉｃａカメラ（ＧＣ１３８０およびＧＣ６６０，Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，ＭＡ）を用いて撮影された。

【0063】

（１１．ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔおよび磁性）。ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの場合、生体撮像およびサンプル調製の両方におけるその潜在的用途が、試験された。種々のサイズ（１０ｎｍ、２０ｎｍ、および４０ｎｍ）の磁気ＮＰを含有するＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ（図７参照）が、正常に調製された。これらのＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、磁石に誘引され、それによって集結された。すなわち、ハイブリッドＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、ＵＶ光によって励起されると、強い蛍光を発光した（図５Ａ）。ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ調製の間、高分子量ポリマーＰＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨは、ハイブリッドＰｄｏｔ中に混成された。ＦｅＯｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの表面上のカルボン酸基は、単純ＥＤＣ反応を通して、ストレプトアビジンとの容易な生体結合を可能にした（図５Ｂ）。ＭＣＦ−７癌細胞株は、次いで、ストレプトアビジン結合ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔと、血中循環腫瘍細胞を単離するために一般に使用される細胞表面タンパク質である、ＥｐＣＡＭに対するビオチン化一次抗体とで標識された。ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔ標識細胞は、永久磁石を使用して操作および濃縮され得る（図５Ｃ）。図５Ｃでは、標識された細胞の大部分は、磁石に正常に誘引されたことが分かる。より強い磁石および磁気ＮＰが使用され得ることを前提として、細胞分離効率は、必要に応じて、さらに改良され得る。磁石によって集結された細胞がＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを有していることをさらに確認するために、単離された細胞が、蛍光顕微鏡によって撮像され、細胞表面上のＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの存在を確認した（図５Ｃ）。このように、ＦｅＯ_ｘ−ＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔは、Ｐｄｏｔからの強い蛍光信号を利用することによって、免疫磁気単離ならびに細胞撮像および検出のためのＦｅＯ_ｘ−ＮＰの使用と同様に、細胞濃縮および単離のために使用されることができる。

【0064】

当業者によって理解されるであろうように、本明細書に開示される各実施形態は、その特定の記載された要素、ステップ、成分、または構成要素を備える、それから本質的になる、またはそれから成ることができる。本明細書で使用される場合、移行用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を備える）」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（〜を備える）」は、限定ではないが、主要量においてであっても、規定されていない要素、ステップ、成分、または構成要素を含み、その含有を可能にすることを意味する。移行句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（〜から成る）」は、規定されていない任意の要素、ステップ、成分、または構成要素を除外する。移行句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（〜から本質的に成る）」は、実施形態の範囲を規定された要素、ステップ、成分、または構成要素、および実施形態に重大な影響を及ぼさないものに限定する。本明細書で使用される場合、重大な影響は、細胞撮像または操作におけるＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔの機能的使用を無効にする、または生産プロセスにおいて、細胞撮像または操作におけるために有意に好適ではないＭＣ−ＳＣ−Ｐｄｏｔを生産するであろう。本明細書で使用される場合、「有意に好適ではない」とは、細胞撮像または操作におけるＰｄｏｔの性能の測定可能品質における統計的に有意な差異を意味する。

【0065】

別様に示されない限り、成分、分子量等の特性、明細書および請求項において使用される反応条件等の数量を表す全ての数は、全事例において、用語「約」によって修飾されると理解されたい。故に、別様に示されない限り、明細書および添付の請求項に記載の数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る、近似値である。最低限、かつ請求項の範囲と同等の原理の用途を限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、かつ通常の丸め技法を適用することによって、解釈されるべきである。さらなる明確化が要求されるとき、用語「約」は、記載された数値値または範囲と併せて使用されるとき、当業者によってそれに合理的に与えられた意味を有する、すなわち、記載値の±２０％、記載値の±１９％、記載値の±１８％、記載値の±１７％、記載値の±１６％、記載値の±１５％、記載値の±１４％、記載値の±１３％、記載値の±１２％、記載値の±１１％、記載値の±１０％、記載値の±９％、記載値の±８％、記載値の±７％、記載値の±６％、記載値の±５％、記載値の±４％、記載値の±３％、記載値の±２％、または記載値の±１％の範囲内まで、記載値または範囲より幾分多いまたは幾分少ないことを示す。

【0066】

本発明の広い範囲を説明する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において説明される数値は、できる限り正確に報告されている。しかしながら、任意の数値は、それぞれの試験測定において得られた標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を、本質的に含む。

【0067】

本発明を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される、不定冠詞と定冠詞（「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語）、および同様の指示物は、本明細書において他に指示がないか、文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書における数値範囲の列挙は、単に、その範囲内に入るそれぞれの単独の値を、個別に指すための簡易法としての役割を果たすことが意図されている。本明細書において他に指示されていない限り、個別の値のそれぞれは、本明細書において個別に列挙されているものとして、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載された全ての方法は、本明細書において他に指示されないか、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書において提供される任意の、かつ全ての実施例、または例示的な言葉（例えば、「等」）の使用は、単に、本発明をより解りやすくすることを意図しており、特許請求されるもの以外に、本発明の範囲に制限を加えるものではない。本明細書における用語は、本発明の実践に必須な任意の非特許請求要素を指していると解釈されるべきではない。

【0068】

本明細書において開示された発明の代替的な要素または実施形態のグループ分けは、制限として解釈されるべきではない。各グループ構成要素は、個別に、あるいはグループの他の構成要素または本明細書に見られる他の要素との任意の組合せで、参照され、また請求され得る。グループの１つ以上の構成要素が、便宜上および／または特許性の理由から、グループに含まれ、またはグループから削除され得ることが予期される。任意のそのような包含または削除が生じるときには、本明細書は、修正されたグループを含むものとみなされ、従って、付属の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュグループの書面による記載を満たす。

【0069】

本発明を実行するうえで発明者らに知られる最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態が、本明細書において説明されている。言うまでもなく、前述の説明を読めば、これらの記載された実施形態の変形形態が、当業者には明らかとなる。本発明者は、当業者がそのような変形例を適切に利用することを期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で、本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法令により許される範囲で、本明細書に付属する特許請求の範囲において列挙される主題のあらゆる修正形態および均等物を含む。また、その全ての可能な変形例における前述の要素の任意の組み合わせは、本明細書において他に指示されていないか、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。

【0070】

なお、多数の特許および刊行物が、本明細書を通して参照された。前述の参考文献および刊行物のそれぞれは、その全体が個別に、参考として本明細書に組み込まれる。

【0071】

最後に、本明細書において開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものであることが理解されるべきである。利用され得る他の修正形態は、本発明の範囲内である。したがって、制限としてではなく一例として、本発明の代替的な構成が、本明細書の教示に従って利用され得る。したがって、本発明は、示され、記載されたように厳密には、それに限定されない。

【0072】

本明細書に記載される特定のものは、一例として、また、本発明の好ましい実施形態を単に例示的に述べることを目的とするものであり、本発明の種々の実施形態の原理および概念的側面の最も有用かつ容易に理解される記載であると考えられるものを示すために提示される。これに関しては、本発明の基本的理解に必要なもの以上の本発明の構造的詳細を示そうとするものではなく、この記載を図面および／または実施例とともに理解すれば、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化することができるかが当業者に明らかとなる。

【0073】

本開示において使用される定義および説明は、以下の実施例において明らかかつ明確に修正されていない限り、またはその意味の適用がいずれかの構成を無意味または本質的に無意味にする場合でない限り、今後のいずれの構成にも効力を及ぼすことを意味し、そのように意図される。この用語の構成が、それを無意味または本質的に無意味にする場合には、その定義は、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ第３版、または当業者に公知の辞書、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＡｎｔｈｏｎｙＳｍｉｔｈ編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）から採用すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】