特許 6290237 癌を処置するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6290237

(24)【登録日】2018年2月16日

(45)【発行日】2018年3月7日

(54)【発明の名称】癌を処置するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20180226BHJP

   G01N 33/573 20060101ALI20180226BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20180226BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180226BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   G01N33/573 A

   A61K31/519ZMD

   A61P35/00

【請求項の数】14

【全頁数】59

(21)【出願番号】特願2015-544142(P2015-544142)

(86)(22)【出願日】2013年11月22日

(65)【公表番号】特表2016-500110(P2016-500110A)

(43)【公表日】2016年1月7日

(86)【国際出願番号】US2013071377

(87)【国際公開番号】WO2014085216

(87)【国際公開日】20140605

【審査請求日】2016年11月17日

(31)【優先権主張番号】61/730,795

(32)【優先日】2012年11月28日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】596129215

【氏名又は名称】メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100151448

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 孝博

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100185959

【弁理士】

【氏名又は名称】今藤 敏和

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】シヤムウエイ，スチユワート・デンハム

【審査官】 伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／１２６１２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／１２６１２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５２５０５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／０３４７４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１５３２０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１５１９９７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／００

Ａ６１Ｋ ３１／００

Ｃ１２Ｑ １／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＷＥＥ１キナーゼ関連癌と診断された患者の中からＷＥＥ１阻害剤で処置される患者の同定を補助するための方法であって、
（ａ）前記患者から得られた癌細胞を含む生体試料中の、および対照試料中の、ＰＫＭＹＴ１の遺伝子発現レベルを測定し；
（ｂ）前記患者試料中の前記遺伝子発現レベルが、前記対照試料中の前記遺伝子発現レベルを上回るかまたは下回るかを判定し；
（ｃ）ＷＥＥ１阻害剤での処置に対して、前記患者試料からのＰＫＭＹＴ１のレベルが前記対照試料のレベルを下回る前記患者を選択すること
を含む方法。

【請求項2】

前記対照試料が、疾患がないかまたはＷＥＥ１キナーゼ関連癌と診断されていない１以上の対象から得られる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−１もしくは医薬的に許容可能なその塩またはＷＥＥ１−２もしくは医薬的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−１または医薬的に許容可能なその塩である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−２または医薬的に許容可能なその塩である、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

ＷＥＥ１阻害剤での処置に感受性がある癌患者の同定を補助するための方法であって、
（ａ）前記患者から得られた癌細胞を含む生体試料中の、および対照試料中の、ＰＫＭＹＴ１の遺伝子発現レベルを測定し；
（ｂ）前記患者試料中の前記遺伝子発現レベルが、前記対照試料中の前記遺伝子発現レベルを上回るかまたは下回るかを判定し；
（ｃ）ＷＥＥ１阻害剤での処置に対して、前記患者試料からのＰＫＭＹＴ１のレベルが
前記対照試料のレベルを下回る、前記感受性がある患者を選択すること
を含む方法。

【請求項7】

前記対照試料が、疾患がないかまたはＷＥＥ１キナーゼ関連癌と診断されていない１以上の対象から得られる、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−１もしくは医薬的に許容可能なその塩またはＷＥＥ１−２もしくは医薬的に許容可能なその塩である、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記ＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−１または医薬的に許容可能なその塩である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−２または医薬的に許容可能なその塩である、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記癌が、乳癌、肺癌、膵臓癌、結腸癌、卵巣癌、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病およびホジキンリンパ腫からなる群から選択されるＷＥＥ１キナーゼ関連癌である、請求項６に記載の方法。

【請求項12】

ＷＥＥ１キナーゼ関連癌患者を処置するためのＷＥＥ１阻害剤を含む、ＷＥＥ１キナーゼ関連癌の処置用の医薬組成物であって、前記ＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−１もしくは医薬的に許容可能なその塩またはＷＥＥ１−２もしくは医薬的に許容可能なその塩であり、処置される前記患者の癌細胞がＰＫＭＹＴ１の低発現を特徴とする、医薬組成物。

【請求項13】

前記ＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−１または医薬的に許容可能なその塩である、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

生体試験試料中でＰＫＭＹＴ１の発現産物を検出可能な検出剤を含む、ＷＥＥ１阻害剤での処置に感受性のある癌患者を同定するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、全般的に、発現レベルが抗増殖剤、特にＷＥＥ１阻害剤での処置に対する患者の反応を予測するために有用であるバイオマーカーの同定に関する。バイオマーカーの発現レベルは、アポトーシスの阻害が介在する癌性状態を呈する患者およびＷＥＥ１阻害剤での処置に反応すると思われる患者を予測するために使用され得る。

【背景技術】

【0002】

多くの一般的に使用される抗癌剤は、分裂する細胞中のＤＮＡを無差別に標的とし、究極的にはＤＮＡ損傷を引き起こす。今度は、これにより、細胞でＤＮＡ複製または分裂が起こる前にＤＮＡが修復されるための時間を与えるという目的で、（Ｇ１、ＳまたはＧ２／Ｍ期での）細胞周期の進行を停止させる細胞周期チェックポイントの活性化が惹起される。治療的な観点から、細胞周期停止に介在するチェックポイントキナーゼの阻害は、化学的に誘導されるＤＮＡ損傷が修復される前に腫瘍細胞の細胞分裂を継続することを押し進め得、これにより最終的にアポトーシスまたは分裂期細胞死が引き起こされ得る（Ｍｅｄｅｍａ，Ｒ．Ｈ．およびＭａｃｕｒｅｋ，Ｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１２，３１（２１）：２６０１−２６１３）。細胞株研究により、この仮説が裏付けられ、ＣＨＫ１、ＷＥＥ１、ＡＴＲおよびＡＴＭを含むチェックポイントキナーゼ活性の薬理学的または遺伝学的破壊による化学増感および放射線増感が示される。これらのキナーゼに対する阻害剤は、腫瘍細胞を治療的ＤＮＡ損傷に対して感受性にするそれらの能力に関する前臨床および臨床開発の様々な段階にある。

【0003】

チェックポイントキナーゼＷＥＥ１は、チロシン１５におけるＣＤＫ１（ＣＤＣ２）およびＣＤＫ２の両方の阻害的リン酸化を触媒する（Ｐａｒｋｅｒ，Ｌ．Ｌ．およびＰｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５７（５０７８）：１９５５−１９５７；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．ら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，１９９５，１４（９）：１８７８−１８９１）。ＣＤＫ１およびＣＤＫ２のＷＥＥ１−依存性阻害は、外的に誘導されるＤＮＡ損傷に反応して細胞周期を停止させる（Ｈａｍｅｒ，Ｐ．Ｃ．Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１１，１７（１３）：４２００−４２０７）。ＷＥＥ１活性はまた平静な細胞周期にも必須である（Ｍｃｇｏｗａｎ，Ｃ．Ｈ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｐ．，Ｅｍｂｏ Ｊ．，１９９３，１２（１）：７５−８５；Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｙ．ら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，２００６，２（４）：１６１−１７０）。正常なヒト線維芽細胞での細胞同期化試験から、ＳおよびＧ２／Ｍ期の両方で同様の量のＷＥＥ１タンパク質が検出されたが、その活性が最大であるのは細胞周期のＳ期であることが明らかになった（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．，１９９５）。さらに、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）におけるコンディショナルＷＥＥ１ノックアウトにおいて、細胞は、ゲノムの不安定性、不良チェックポイントおよび早期有糸分裂の所見を示す（Ｔｏｍｉｎａｇａら、２００６）。この表現型は、ＤＮＡ合成におけるＷＥＥ１に対する重大な役割を明らかにする最近の知見により一部説明された。ＤＮＡ損傷剤の非存在下でのＷＥＥ１のノックダウンは、特にＤＮＡ複製が起こるＳ期細胞でのＤＮＡ２本鎖切断の迅速でロバストな検出につながった（Ｂｅｃｋ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１０，１８８（５）：６２９−６３８；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１１，１９４（４）：５６７−５７９）。データは、ＷＥＥ１ノックダウンまたは阻害が、ＣＤＫ１および２の異常に高い活性につながり、その結果、ヌクレオチドプールを急速に枯渇させ、ＷＥＥ１活性の非存在下でＤＮＡエキソヌクレアーゼに対する基質であり、ＤＮＡ２本鎖切断に帰着する膠着状態の複製フォークにつながる、過剰なＤＮＡ複製起点の不適切な時間での発火が起こるという、ＷＥＥ１−依存性ゲノム安定性のモデルを裏付ける（Ｂｅｃｋ，Ｈら、２０１２）。

【0004】

脱制御ＷＥＥ１発現または活性は、いくつかのタイプの癌における病理の顕著な特徴であると考えられる。ＷＥＥ１は、神経膠芽腫において過剰発現されることが多く、その活性が、この腫瘍タイプを分裂期細胞死から保護するので、高ＷＥＥ１レベルは予後不良と関連付けられる（Ｍｉｒ，Ｓ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１０，１８（３）：２４４−２５７）。ＷＥＥ１の高発現は悪性メラノーマで見られ、この集団において無病生存不良と相関した（Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ，Ｇ．Ｉ．ら、Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１２，７（６））。異常なＷＥＥ１発現は、肝細胞癌（Ｍａｓａｋｉ，Ｔ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００３，３７（３）：５３４−５４３）、乳癌（Ｉｏｒｎｓ，Ｅ．ら、Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２００９，４（４））、結腸癌（Ｂａｃｋｅｒｔ，Ｓ．ら、Ｉｎｔｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８２（６）：８６８−８７４））、肺癌（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．ら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，１５（２）：２５２−２５６）および頭頸部扁平細胞癌（Ｗｕ，Ｚ．Ｘ．ら、Ｍｏｌ．＆ Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１１，１０（１２））などのさらなる腫瘍タイプに関連付けられている。ゲノム不安定性レベルが向上している進行性腫瘍は、このような致死的ＤＮＡ損傷の修復を可能とするために機能的チェックポイントを必要とし得る。このようなものとして、ＷＥＥ１は、その阻害の結果、回復不能なＤＮＡ損傷を引き起こすと考えられる進行性腫瘍において魅力的な標的となる（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｓ．およびＳｙｌｊｕａｓｅｎ，Ｒ．Ｇ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１２，４０（２）：４７７−４８６）。

【0005】

特に非反応性の患者または第一選択治療薬に対してリフラクティブ（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ）となると思われる患者に対して、どの患者が特定の治療薬での処置に適しているかを予測するために使用することができるバイオマーカーが必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｍｅｄｅｍａ，Ｒ．Ｈ．およびＭａｃｕｒｅｋ，Ｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１２，３１（２１）：２６０１−２６１３

【非特許文献2】Ｐａｒｋｅｒ，Ｌ．Ｌ．およびＰｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ，Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５７（５０７８）：１９５５−１９５７

【非特許文献3】Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｎ．ら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，１９９５，１４（９）：１８７８−１８９１

【非特許文献4】Ｈａｍｅｒ，Ｐ．Ｃ．Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１１，１７（１３）：４２００−４２０７

【非特許文献5】Ｍｃｇｏｗａｎ，Ｃ．Ｈ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｐ．，Ｅｍｂｏ Ｊ．，１９９３，１２（１）：７５−８５

【非特許文献6】Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｙ．ら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，２００６，２（４）：１６１−１７０

【非特許文献7】Ｂｅｃｋ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１０，１８８（５）：６２９−６３８

【非特許文献8】Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１１，１９４（４）：５６７−５７９

【非特許文献9】Ｍｉｒ，Ｓ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１０，１８（３）：２４４−２５７

【非特許文献10】Ｍａｇｎｕｓｓｅｎ，Ｇ．Ｉ．ら、Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２０１２，７（６）

【非特許文献11】Ｍａｓａｋｉ，Ｔ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００３，３７（３）：５３４−５４３

【非特許文献12】Ｉｏｒｎｓ，Ｅ．ら、Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，２００９，４（４）

【非特許文献13】Ｂａｃｋｅｒｔ，Ｓ．ら、Ｉｎｔｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８２（６）：８６８−８７４

【非特許文献14】Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．ら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２００４，１５（２）：２５２−２５６

【非特許文献15】Ｗｕ，Ｚ．Ｘ．ら、Ｍｏｌ．＆ Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１１，１０（１２）

【非特許文献16】Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｓ．およびＳｙｌｊｕａｓｅｎ，Ｒ．Ｇ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１２，４０（２）：４７７−４８６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、この発明の目的は、ＷＥＥ１阻害剤での処置に反応すると思われる患者を選択するための予測的バイオマーカーを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、全般的に、発現レベルが、ＷＥＥ１阻害剤での処置に対して患者を評価し、分類するために有用である、予測的バイオマーカーの同定に関する。本発明の一実施形態において、予測的バイオマーカー、ＰＫＭＹＴ１は、ＷＥＥ１−１であるＷＥＥ１阻害剤での処置に反応すると思われる患者を同定するために使用される。別の実施形態において、本発明は、ＷＥＥ１関連癌と診断された患者をＷＥＥ１阻害剤で処置するための方法であり、この患者の癌細胞はＰＫＭＹＴ１の低発現を特徴とする。さらに別の実施形態において、本発明は、ＷＥＥ１阻害剤での処置に感受性がある癌患者を処置するための方法であり、この患者の癌細胞は、参照値の発現レベルを下回るＰＫＭＹＴ１の発現レベルを特徴とする。別の実施形態において、本発明は、ＷＥＥ１キナーゼ関連癌を処置することにおける使用のためのＷＥＥ１阻害剤を同定するための方法である。また別の実施形態において、本発明は、ＰＫＭＹＴ１に反応する試薬を含むＷＥＥ１阻害剤での処置に反応すると思われる患者を同定するためのキットである。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ＷＥＥ１阻害剤による多様な腫瘍細胞株における細胞増殖の破壊の図解である。ＷＥＥ１−１の９点の滴定で処置した５２２種類の癌細胞株に対して３つ組で９６時間の枠にわたる増殖をアッセイした。細胞株反応データを起源腫瘍組織に分類し、ＷＥＥ１−１濃度の関数として、（ＤＭＳＯ−処理対照細胞と比較した）生存率として表す。

【図2A】図２Ａおよび２Ｂは、ＷＥＥ１阻害剤での処理の結果起こるＳ期におけるＤＮＡ損傷の説明であり、ここでＥＳ−２、Ａ２０５８、Ａ４３１、Ａ４２７、ＫＮＳ６２およびＮＣＩ−Ｈ４６０細胞をＤＭＳＯ（−）またはＷＥＥ１−１の漸増濃度の何れかで２時間処理した。リン酸化ＣＨＫ１^Ｓ３４５、リン酸化ＣＤＫ１^Ｙ１５、リン酸化ＣＤＫ１^Ｔ１４またはローディング対照としてのアクチンに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによってタンパク質溶解液を分析した（図２Ａ）。最長２または６時間、ＤＭＳＯまたは１５０ｎＭ ＷＥＥ１−１でＴＯＶ−２１Ｇ細胞を処理した（図２Ｂ）。ＤＮＡ複製が活発に起こるＳ期細胞を標識するためにＢｒｄＵでの回収の１時間前に細胞をパルス標識した。総ＤＮＡ含量に対するＤＮＡ２本鎖切断（γＨ２ＡＸ）（図２Ｂ、左パネル）またはＢｒｄＵ取り込みに対するγＨ２ＡＸ（図２Ｂ、右パネル）について、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。γＨ２ＡＸ−染色細胞の％は、ＤＮＡ２本鎖切断を含有する細胞集団に相当し、各処理状態に対して示され、右パネルにおいてＢｒｄＵの状態によって分けられる。

【図2B】図２Ａおよび２Ｂは、ＷＥＥ１阻害剤での処理の結果起こるＳ期におけるＤＮＡ損傷の説明であり、ここでＥＳ−２、Ａ２０５８、Ａ４３１、Ａ４２７、ＫＮＳ６２およびＮＣＩ−Ｈ４６０細胞をＤＭＳＯ（−）またはＷＥＥ１−１の漸増濃度の何れかで２時間処理した。リン酸化ＣＨＫ１^Ｓ３４５、リン酸化ＣＤＫ１^Ｙ１５、リン酸化ＣＤＫ１^Ｔ１４またはローディング対照としてのアクチンに対する抗体を用いたウエスタンブロッティングによってタンパク質溶解液を分析した（図２Ａ）。最長２または６時間、ＤＭＳＯまたは１５０ｎＭ ＷＥＥ１−１でＴＯＶ−２１Ｇ細胞を処理した（図２Ｂ）。ＤＮＡ複製が活発に起こるＳ期細胞を標識するためにＢｒｄＵでの回収の１時間前に細胞をパルス標識した。総ＤＮＡ含量に対するＤＮＡ２本鎖切断（γＨ２ＡＸ）（図２Ｂ、左パネル）またはＢｒｄＵ取り込みに対するγＨ２ＡＸ（図２Ｂ、右パネル）について、フローサイトメトリーによって細胞を分析した。γＨ２ＡＸ−染色細胞の％は、ＤＮＡ２本鎖切断を含有する細胞集団に相当し、各処理状態に対して示され、右パネルにおいてＢｒｄＵの状態によって分けられる。

【図3A】図３Ａから３Ｃは、ＷＥＥ１阻害剤での処理の結果起こるＳ期進行遅延の説明である。血清除去３６時間後にＥＳ−２細胞を同期化させた。図３Ａおよび３Ｂにおいて、レーン１から６のビヒクル（ＤＭＳＯ）またはレーン７から１１の５００ｎＭ ＷＥＥ１−１の何れかのさらなる存在下で２０％ＦＢＳで周期を再開するために細胞を刺激した。ＦＢＳ刺激後の回収時間が示される。回収１時間前に、ＢｒｄＵで細胞をパルス標識し、ＢｒｄＵ染色細胞の％は上部パネルで示す。並行して処理したＥＳ−２細胞からのタンパク質溶解液を回収し、続いて指定の抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。ビヒクル処理対照との比較において、ＷＥＥ１−１処理によって、Ｓ期を通じた進行（図３Ａ、上部パネルおよび図３Ｂ）およびＳ期ＢｒｄＵ取り込み（図３Ａ、上部パネル）が遅延するが、これは、ＤＮＡ複製の減速を示す。ＷＥＥ１−１処理によって、サイクリンＡ発現が遅延し、ｐＣｈｋ１^Ｓ３４５により証明されるように、ＤＮＡ損傷シグナル伝達が誘導される（図３Ａ、左下パネル）。図３Ｂは、ＢｒｄＵ−染色およびＤＮＡ含量を比較する、パートＡからの選択試料（４、１２および２４時間処理）におけるフローサイトメトリー分析を示す。図３Ｃのデータは、２０％ＦＢＳの存在下または非存在下の何れかにおける、５００ｎＭ ＷＥＥ１−１が添加された血清飢餓ＥＳ−２細胞の代表である。２４時間後、フローサイトメトリーによってＤＮＡ含量およびγＨ２ＡＸ（ＤＮＡ２本鎖切断）を分析した。細胞の総集団の％をチャートで与えるが（図３Ｃ）、これにより、集団が２０％ＦＢＳによって刺激される場合、ＷＥＥ１−１がより多くの細胞においてＤＮＡ２本鎖切断を誘導することが明らかになる。

【図3B】図３Ａから３Ｃは、ＷＥＥ１阻害剤での処理の結果起こるＳ期進行遅延の説明である。血清除去３６時間後にＥＳ−２細胞を同期化させた。図３Ａおよび３Ｂにおいて、レーン１から６のビヒクル（ＤＭＳＯ）またはレーン７から１１の５００ｎＭ ＷＥＥ１−１の何れかのさらなる存在下で２０％ＦＢＳで周期を再開するために細胞を刺激した。ＦＢＳ刺激後の回収時間が示される。回収１時間前に、ＢｒｄＵで細胞をパルス標識し、ＢｒｄＵ染色細胞の％は上部パネルで示す。並行して処理したＥＳ−２細胞からのタンパク質溶解液を回収し、続いて指定の抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。ビヒクル処理対照との比較において、ＷＥＥ１−１処理によって、Ｓ期を通じた進行（図３Ａ、上部パネルおよび図３Ｂ）およびＳ期ＢｒｄＵ取り込み（図３Ａ、上部パネル）が遅延するが、これは、ＤＮＡ複製の減速を示す。ＷＥＥ１−１処理によって、サイクリンＡ発現が遅延し、ｐＣｈｋ１^Ｓ３４５により証明されるように、ＤＮＡ損傷シグナル伝達が誘導される（図３Ａ、左下パネル）。図３Ｂは、ＢｒｄＵ−染色およびＤＮＡ含量を比較する、パートＡからの選択試料（４、１２および２４時間処理）におけるフローサイトメトリー分析を示す。図３Ｃのデータは、２０％ＦＢＳの存在下または非存在下の何れかにおける、５００ｎＭ ＷＥＥ１−１が添加された血清飢餓ＥＳ−２細胞の代表である。２４時間後、フローサイトメトリーによってＤＮＡ含量およびγＨ２ＡＸ（ＤＮＡ２本鎖切断）を分析した。細胞の総集団の％をチャートで与えるが（図３Ｃ）、これにより、集団が２０％ＦＢＳによって刺激される場合、ＷＥＥ１−１がより多くの細胞においてＤＮＡ２本鎖切断を誘導することが明らかになる。

【図3C】図３Ａから３Ｃは、ＷＥＥ１阻害剤での処理の結果起こるＳ期進行遅延の説明である。血清除去３６時間後にＥＳ−２細胞を同期化させた。図３Ａおよび３Ｂにおいて、レーン１から６のビヒクル（ＤＭＳＯ）またはレーン７から１１の５００ｎＭ ＷＥＥ１−１の何れかのさらなる存在下で２０％ＦＢＳで周期を再開するために細胞を刺激した。ＦＢＳ刺激後の回収時間が示される。回収１時間前に、ＢｒｄＵで細胞をパルス標識し、ＢｒｄＵ染色細胞の％は上部パネルで示す。並行して処理したＥＳ−２細胞からのタンパク質溶解液を回収し、続いて指定の抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。ビヒクル処理対照との比較において、ＷＥＥ１−１処理によって、Ｓ期を通じた進行（図３Ａ、上部パネルおよび図３Ｂ）およびＳ期ＢｒｄＵ取り込み（図３Ａ、上部パネル）が遅延するが、これは、ＤＮＡ複製の減速を示す。ＷＥＥ１−１処理によって、サイクリンＡ発現が遅延し、ｐＣｈｋ１^Ｓ３４５により証明されるように、ＤＮＡ損傷シグナル伝達が誘導される（図３Ａ、左下パネル）。図３Ｂは、ＢｒｄＵ−染色およびＤＮＡ含量を比較する、パートＡからの選択試料（４、１２および２４時間処理）におけるフローサイトメトリー分析を示す。図３Ｃのデータは、２０％ＦＢＳの存在下または非存在下の何れかにおける、５００ｎＭ ＷＥＥ１−１が添加された血清飢餓ＥＳ−２細胞の代表である。２４時間後、フローサイトメトリーによってＤＮＡ含量およびγＨ２ＡＸ（ＤＮＡ２本鎖切断）を分析した。細胞の総集団の％をチャートで与えるが（図３Ｃ）、これにより、集団が２０％ＦＢＳによって刺激される場合、ＷＥＥ１−１がより多くの細胞においてＤＮＡ２本鎖切断を誘導することが明らかになる。

【図4A】図４Ａおよび４Ｂは、早期有糸分裂が、ＷＥＥ１阻害で細胞毒性を誘導するのに必要ではないことを示す。Ａ２０５８、ＨＴ−２９およびＬｏＶｏ細胞をＤＭＳＯ（−ＷＥ１−１）または薬物のＥＣ_９０濃度のＷＥＥ１−１の何れかで２４時間処理した。有糸分裂マーカーリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３^Ｓ１０、図４Ａ）またはＤＮＡ２本鎖切断マーカーγＨ２ＡＸ（図４Ｂ）に対して陽性である細胞の集団を同定するために、フローサイトメトリーを使用した。上方のパネルにおいて、右のゲートは、予想される有糸分裂集団（４Ｎ ＤＮＡ含量）を示し、左のゲートは、４Ｎ未満のＤＮＡ含量であるｐＨＨ３に対して陽性である細胞を示す。

【図4B】図４Ａおよび４Ｂは、早期有糸分裂が、ＷＥＥ１阻害で細胞毒性を誘導するのに必要ではないことを示す。Ａ２０５８、ＨＴ−２９およびＬｏＶｏ細胞をＤＭＳＯ（−ＷＥ１−１）または薬物のＥＣ_９０濃度のＷＥＥ１−１の何れかで２４時間処理した。有糸分裂マーカーリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３^Ｓ１０、図４Ａ）またはＤＮＡ２本鎖切断マーカーγＨ２ＡＸ（図４Ｂ）に対して陽性である細胞の集団を同定するために、フローサイトメトリーを使用した。上方のパネルにおいて、右のゲートは、予想される有糸分裂集団（４Ｎ ＤＮＡ含量）を示し、左のゲートは、４Ｎ未満のＤＮＡ含量であるｐＨＨ３に対して陽性である細胞を示す。

【図5A】図５Ａから５Ｄは、ＷＥＥ１−１単剤処置のインビボ効力の説明であり、Ａ４２７異種移植物を有するマウスにビヒクル（０．５％メチルセルロース）または６０ｍｇ／ｋｇのＷＥＥ１−１の何れかを投与した。ビヒクルおよび化合物両者の投与は、連続２８日間にわたりＢＩＤであった。異種移植腫瘍体積を週に２回得て、ビヒクル（ｎ＝１０）およびＷＥＥ１−１（ｎ＝１０）処置マウスに対する処置の日数に対してプロット（平均体積−／＋ＳＥＭ）した（図５Ａ）。図５Ｂは、ビヒクルまたはＭＫ−１７７５の何れかで２８日間処置された個々のＡ４２７異種移植片の最終腫瘍体積がプロットされたことを示す。試験開始時の平均腫瘍体積は１６４ｍｍ^３であり、点線で示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＷＥＥ１−１処置がＬｏＶｏ異種移植試験（星印により示される）において第１３日に停止され、腫瘍体積がさらに２週間にわたり測定されたことを除き、図５Ａに対して記載されるとおりＳＫ−ＭＥＳ−１（Ｃ）およびＬｏＶｏ（Ｄ）異種移植モデルで行われた、さらなるインビボ効力試験を示す。

【図5B】図５Ａから５Ｄは、ＷＥＥ１−１単剤処置のインビボ効力の説明であり、Ａ４２７異種移植物を有するマウスにビヒクル（０．５％メチルセルロース）または６０ｍｇ／ｋｇのＷＥＥ１−１の何れかを投与した。ビヒクルおよび化合物両者の投与は、連続２８日間にわたりＢＩＤであった。異種移植腫瘍体積を週に２回得て、ビヒクル（ｎ＝１０）およびＷＥＥ１−１（ｎ＝１０）処置マウスに対する処置の日数に対してプロット（平均体積−／＋ＳＥＭ）した（図５Ａ）。図５Ｂは、ビヒクルまたはＭＫ−１７７５の何れかで２８日間処置された個々のＡ４２７異種移植片の最終腫瘍体積がプロットされたことを示す。試験開始時の平均腫瘍体積は１６４ｍｍ^３であり、点線で示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＷＥＥ１−１処置がＬｏＶｏ異種移植試験（星印により示される）において第１３日に停止され、腫瘍体積がさらに２週間にわたり測定されたことを除き、図５Ａに対して記載されるとおりＳＫ−ＭＥＳ−１（Ｃ）およびＬｏＶｏ（Ｄ）異種移植モデルで行われた、さらなるインビボ効力試験を示す。

【図5C】図５Ａから５Ｄは、ＷＥＥ１−１単剤処置のインビボ効力の説明であり、Ａ４２７異種移植物を有するマウスにビヒクル（０．５％メチルセルロース）または６０ｍｇ／ｋｇのＷＥＥ１−１の何れかを投与した。ビヒクルおよび化合物両者の投与は、連続２８日間にわたりＢＩＤであった。異種移植腫瘍体積を週に２回得て、ビヒクル（ｎ＝１０）およびＷＥＥ１−１（ｎ＝１０）処置マウスに対する処置の日数に対してプロット（平均体積−／＋ＳＥＭ）した（図５Ａ）。図５Ｂは、ビヒクルまたはＭＫ−１７７５の何れかで２８日間処置された個々のＡ４２７異種移植片の最終腫瘍体積がプロットされたことを示す。試験開始時の平均腫瘍体積は１６４ｍｍ^３であり、点線で示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＷＥＥ１−１処置がＬｏＶｏ異種移植試験（星印により示される）において第１３日に停止され、腫瘍体積がさらに２週間にわたり測定されたことを除き、図５Ａに対して記載されるとおりＳＫ−ＭＥＳ−１（Ｃ）およびＬｏＶｏ（Ｄ）異種移植モデルで行われた、さらなるインビボ効力試験を示す。

【図5D】図５Ａから５Ｄは、ＷＥＥ１−１単剤処置のインビボ効力の説明であり、Ａ４２７異種移植物を有するマウスにビヒクル（０．５％メチルセルロース）または６０ｍｇ／ｋｇのＷＥＥ１−１の何れかを投与した。ビヒクルおよび化合物両者の投与は、連続２８日間にわたりＢＩＤであった。異種移植腫瘍体積を週に２回得て、ビヒクル（ｎ＝１０）およびＷＥＥ１−１（ｎ＝１０）処置マウスに対する処置の日数に対してプロット（平均体積−／＋ＳＥＭ）した（図５Ａ）。図５Ｂは、ビヒクルまたはＭＫ−１７７５の何れかで２８日間処置された個々のＡ４２７異種移植片の最終腫瘍体積がプロットされたことを示す。試験開始時の平均腫瘍体積は１６４ｍｍ^３であり、点線で示す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＷＥＥ１−１処置がＬｏＶｏ異種移植試験（星印により示される）において第１３日に停止され、腫瘍体積がさらに２週間にわたり測定されたことを除き、図５Ａに対して記載されるとおりＳＫ−ＭＥＳ−１（Ｃ）およびＬｏＶｏ（Ｄ）異種移植モデルで行われた、さらなるインビボ効力試験を示す。

【図6A】図６Ａおよび６Ｂは、ＰＫＭＹＴ１ノックダウンが、選択的にＷＥＥ１−１に対する感受性を向上させ、ＣＤＫ１の阻害的リン酸化を減少させたことを示す。図６Ａは、相対的ＷＥＥ１−１耐性を呈する２種類の細胞株Ｈ４６０およびＫＮＳ６２においてＰＫＭＹＴ１がノックダウンされたことを示す。非ターゲティング対照（ＣＴ）またはＰＫＭＹＴ１配列を含有するｓｉＲＮＡプールを用いて細胞に対して遺伝子移入を行った。ＶｉａＬｉｇｈｔ ＡＴＰアッセイで増殖についてアッセイする前に、細胞をＷＥＥ１−１、カルボプラチン、ＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）またはドキソルビシンで７２時間処理した。ＰＫＭＹＴ１のノックダウンによって、ＷＥＥ１−１単独に対する増殖ＥＣ_５０が低下したが、試験した他の化合物の場合は低下しなかった。図６Ｂにおいて、非ターゲティング対照（ＣＴ）またはＰＫＭＹＴ１ ｓｉＲＮＡプールを用いてＫＮＳ６２細胞に対して遺伝子移入を行い、指定の時間、４００ｎＭ ＷＥＥ１−１で処理した。

【図6B】図６Ａおよび６Ｂは、ＰＫＭＹＴ１ノックダウンが、選択的にＷＥＥ１−１に対する感受性を向上させ、ＣＤＫ１の阻害的リン酸化を減少させたことを示す。図６Ａは、相対的ＷＥＥ１−１耐性を呈する２種類の細胞株Ｈ４６０およびＫＮＳ６２においてＰＫＭＹＴ１がノックダウンされたことを示す。非ターゲティング対照（ＣＴ）またはＰＫＭＹＴ１配列を含有するｓｉＲＮＡプールを用いて細胞に対して遺伝子移入を行った。ＶｉａＬｉｇｈｔ ＡＴＰアッセイで増殖についてアッセイする前に、細胞をＷＥＥ１−１、カルボプラチン、ＭＥＫ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）またはドキソルビシンで７２時間処理した。ＰＫＭＹＴ１のノックダウンによって、ＷＥＥ１−１単独に対する増殖ＥＣ_５０が低下したが、試験した他の化合物の場合は低下しなかった。図６Ｂにおいて、非ターゲティング対照（ＣＴ）またはＰＫＭＹＴ１ ｓｉＲＮＡプールを用いてＫＮＳ６２細胞に対して遺伝子移入を行い、指定の時間、４００ｎＭ ＷＥＥ１−１で処理した。

【図7A】図７Ａおよび７Ｂは、低ＰＫＭＹＴ１発現により、ＷＥＥ１−１に対する感受性が向上したことを示す。図７Ａにおいて、相対的ＰＫＭＹＴ１発現（ＣＣＬＥデータベース、Ｂｒｏａｄ−Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を３０５種類の細胞株における４００ｎＭ ＷＥＥ１−１処理への反応に対してプロットし、それぞれを１個の点により表した。ＷＥＥ１−１（ｘ−軸）に対する反応は、９６時間増殖アッセイに基づく調整値であり、１の値は、ＤＭＳＯ処理細胞と比べて増殖率に変化がないことを示し、０．２５（垂直破線）以下の値は、負の増殖率または細胞死を示す。３０５種類の細胞株での平均相対ＰＫＭＹＴ１発現は４１３である。図７Ｂは、上の図７Ａの分析に含まれない１３種類の細胞株に対するＰＫＭＹＴ１ ｍＲＮＡ（左パネル）またはＰＫＭＹＴ１タンパク質（右パネル）の相対的発現に対してプロットされたＥＣ_５０値（μＭ）で測定される、ＷＥＥ１−１に対する増殖反応を示す。

【図7B】図７Ａおよび７Ｂは、低ＰＫＭＹＴ１発現により、ＷＥＥ１−１に対する感受性が向上したことを示す。図７Ａにおいて、相対的ＰＫＭＹＴ１発現（ＣＣＬＥデータベース、Ｂｒｏａｄ−Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を３０５種類の細胞株における４００ｎＭ ＷＥＥ１−１処理への反応に対してプロットし、それぞれを１個の点により表した。ＷＥＥ１−１（ｘ−軸）に対する反応は、９６時間増殖アッセイに基づく調整値であり、１の値は、ＤＭＳＯ処理細胞と比べて増殖率に変化がないことを示し、０．２５（垂直破線）以下の値は、負の増殖率または細胞死を示す。３０５種類の細胞株での平均相対ＰＫＭＹＴ１発現は４１３である。図７Ｂは、上の図７Ａの分析に含まれない１３種類の細胞株に対するＰＫＭＹＴ１ ｍＲＮＡ（左パネル）またはＰＫＭＹＴ１タンパク質（右パネル）の相対的発現に対してプロットされたＥＣ_５０値（μＭ）で測定される、ＷＥＥ１−１に対する増殖反応を示す。

【図8A】図８Ａおよび８Ｂは、ＷＥＥ１−１によるＷＥＥ１の阻害がＣＤＫ１および２活性上昇につながることを示す。ＥＳ−２細胞をＤＭＳＯまたは２５０ｎＭ ＷＥＥ１−１の何れかで２４時間処理し、回収し、ウエスタンブロット分析のために溶解させた。図８Ａにおいて、溶解液をＷＥＥ１基質（ｐＣＤＫ１^Ｙ１５）、ＤＤＲマーカー（ｐＣＨＫ１^Ｓ３４５）またはＣＤＫ１および２基質（それぞれｐＳｔａｔｈｍｉｎ^Ｓ３８およびｐＬａｍｉｎＡ／Ｃ^Ｓ２２）に対する個々の抗体で探索した。図８Ｂにおいて、ｐａｎＣＤＫ−基質モチーフ抗体で溶解液を探索した。

【図8B】図８Ａおよび８Ｂは、ＷＥＥ１−１によるＷＥＥ１の阻害がＣＤＫ１および２活性上昇につながることを示す。ＥＳ−２細胞をＤＭＳＯまたは２５０ｎＭ ＷＥＥ１−１の何れかで２４時間処理し、回収し、ウエスタンブロット分析のために溶解させた。図８Ａにおいて、溶解液をＷＥＥ１基質（ｐＣＤＫ１^Ｙ１５）、ＤＤＲマーカー（ｐＣＨＫ１^Ｓ３４５）またはＣＤＫ１および２基質（それぞれｐＳｔａｔｈｍｉｎ^Ｓ３８およびｐＬａｍｉｎＡ／Ｃ^Ｓ２２）に対する個々の抗体で探索した。図８Ｂにおいて、ｐａｎＣＤＫ−基質モチーフ抗体で溶解液を探索した。

【図9A】図９Ａおよび９Ｂは、ＷＥＥ１−１処理により誘導されるＤＮＡ損傷が、マイトジェン刺激を必要とすることを示す。ＥＳ−２細胞を３６時間、血清飢餓状態にし、その時点でこれらを未刺激のままにするかまたは２０％ＦＢＳで処理した。ＤＮＡ含量（７−ＡＡＤ）およびＤＮＡ２本鎖切断（γＨ２ＡＸ）のフローサイトメトリー分析のための回収前に、両条件下で培養した細胞に２４時間、ＤＭＳＯまたは５００ｎＭ ＷＥＥ１−１の何れかを与えた。図９Ａは、細胞周期分布のヒストグラムを示す。図９Ｂは、γＨ２ＡＸ集団を示すゲートでの散布図を示す。総細胞の％は、細胞周期のフェーズにおいてまたはγＨ２ＡＸ陽性としての何れかで示される。

【図9B】図９Ａおよび９Ｂは、ＷＥＥ１−１処理により誘導されるＤＮＡ損傷が、マイトジェン刺激を必要とすることを示す。ＥＳ−２細胞を３６時間、血清飢餓状態にし、その時点でこれらを未刺激のままにするかまたは２０％ＦＢＳで処理した。ＤＮＡ含量（７−ＡＡＤ）およびＤＮＡ２本鎖切断（γＨ２ＡＸ）のフローサイトメトリー分析のための回収前に、両条件下で培養した細胞に２４時間、ＤＭＳＯまたは５００ｎＭ ＷＥＥ１−１の何れかを与えた。図９Ａは、細胞周期分布のヒストグラムを示す。図９Ｂは、γＨ２ＡＸ集団を示すゲートでの散布図を示す。総細胞の％は、細胞周期のフェーズにおいてまたはγＨ２ＡＸ陽性としての何れかで示される。

【発明を実施するための形態】

【0010】

多くの抗癌処置は、ＤＮＡに損傷を与え、続いてＤＮＡ損傷反応（ＤＤＲ）を開始させ、チェックポイントキナーゼを活性化して、ＤＮＡ修復中に分裂を停止させることにより作用する。ＷＥＥ１、チロシンキナーゼは、ＤＤＲにより活性化され、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）１および２をリン酸化し、阻害し、このようにして細胞分裂を停止させる。ＷＥＥ１を阻害することは、細胞周期停止および的確なＤＮＡ修復を抑止することによってＤＮＡ損傷処理を増強する。

【0011】

２−アリル−１−［６−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−２−イル］−６−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アミノ｝−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−オンとしても知られるＷＥＥ１−１は、標準治療（ＳＯＣ）化学療法薬と組み合わせた抗腫瘍薬として現在臨床開発中である、強力で（ＩＣ_５０＝５．２ｎＭ）選択的なＷＥＥ１のＡＴＰ−競合性低分子阻害剤（Ｈｉｒａｉ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２００９，８（１１）：２９９２−３０００）である（Ｓｔａｔｈｉｓ，Ａ．およびＯｚａ Ａ．，Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ ＆ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，２０１０，２３（７）：４２５−４２９；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０１１，２９：２０１１（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ３０６８）；Ｍｉｚｕａｒａｉ，Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２００９，８：３４）。ＷＥＥ１−１に対する先行研究から、最終的にアポトーシスまたは分裂期細胞死をもたらす不定期有糸分裂を強制するＷＥＥ１−１の能力によって、現在使用されている標準治療（ＳＯＣ）化学療法薬に対する補助剤または増感剤としてのその可能性が示されている（Ｈｉｒａｉ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．＆ Ｔｈｅｒ．，２０１０，９（７）：５１４−５２２；Ａａｒｔｓ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１２，２（６）：５２４−５３９；Ｉｎｄｏｖｉｎａ，Ｐ．およびＧｉｏｒｄａｎｏ Ａ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．＆ Ｔｈｅｒ．，２０１０，９（７）；５２３−５２５；Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．＆ Ｔｈｅｒ．，２００４，３（３）：３０５−３１３）。しかし、ＳＯＣ化学療法なしでのＷＥＥ１阻害の治療効果の可能性はあまり明確になっていない。ＷＥＥ１のＲＮＡｉノックダウンは、癌細胞株の増殖を阻害し（Ｉｏｒｎｓ，Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，２００９，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，４（４）；Ｍｕｒｒｏｗ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２０１０，１２２（２）：３４７−３５７）、最近、インビトロで処理された肉腫細胞株において、ＷＥＥ１−１単独でアポトーシスを誘導し得ることが明らかになった（Ｋｒｅａｈｌｉｎｇ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２０１２，１１（１）：１７４−１８２）。

【0012】

出願者らは、本明細書中で、ＷＥＥ１単独の薬理学的阻害が、単剤としてのＷＥＥ１−１の使用を通じて、幅広い腫瘍細胞株のパネルにわたり細胞毒性であり、ＤＮＡ２本鎖切断を強く誘導したことを明らかにする。特に、ＷＥＥ１−１は、ＳＯＣ化学療法または放射線療法と独立し、Ｓ期細胞で起こり、活性ＤＮＡ複製に依存した、ＤＮＡ損傷を誘導した。耐容用量で、ＷＥＥ１−１単剤療法は、異種移植腫瘍成長阻害または退縮に導く。ＷＥＥ１に機能的に関連するキナーゼであるＰＫＭＹＴ１のノックダウンは、選択的に癌細胞をＷＥＥ１−１に対して感受性にしたが、他の細胞毒性剤に対しては癌細胞を感受性にしなかった。本明細書中で記載のように、ＰＫＭＹＴ１の発現は、ＷＥＥ１−１に対して最も反応性がある癌細胞株のおよそ４分の３において、平均以下であった。ＰＫＭＹＴ１発現レベルが低かった細胞株を選択することは、ＷＥＥ１−１に対するこれらの細胞株のインビトロでの感受性の予測となった。まとめると、これらの知見から、強力な単剤抗癌療法としてのＷＥＥ１阻害の使用および、ＷＥＥ１−１単剤療法に反応する可能性が最も高い患者を同定および選択するための低ＰＫＭＹＴ１発現の使用に対する根拠が提供される。

【0013】

したがって、本発明は、ＷＥＥ１−１もしくは医薬的に許容可能なその塩またはＷＥＥ１−２もしくは医薬的に許容可能なその塩であるＷＥＥ１阻害剤で癌を処置するための方法に関する。別の実施形態において、本発明は、ＷＥＥ１阻害剤によって発現がＷＥＥ１阻害に感受性となる予測的バイオマーカー、ＰＫＭＹＴ１に関する。さらに別の実施形態において、本発明は、ＷＥＥ１キナーゼ関連癌の処置を必要とする、ＷＥＥ１キナーゼ関連癌と診断された患者をＷＥＥ１阻害剤で処置するための方法であって、この患者の癌細胞が、ＰＫＭＹＴ１の低発現を特徴とし、このＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−１もしくは医薬的に許容可能なその塩またはＷＥＥ１−２もしくは医薬的に許容可能なその塩である、方法に関する。また別の実施形態において、本発明は、ＷＥＥ１阻害剤での処置に感受性がある癌患者を処置するための方法であって、この患者の癌細胞が、参照値のレベルを下回るＰＫＭＹＴ１の発現レベルを特徴とし、このＷＥＥ１阻害剤が、ＷＥＥ１−１もしくは医薬的に許容可能なその塩またはＷＥＥ１−２もしくは医薬的に許容可能なその塩である、方法である。別の実施形態において、本発明は、ＷＥＥ１キナーゼ関連癌を処置することにおける使用のためのＰＫＭＹＴ１阻害剤を同定するための方法である。また別の実施形態において、本発明は、ＰＫＭＹＴ１に反応する試薬を含むＷＥＥ１阻害剤での処置に反応すると思われる患者を同定するためのキットである。

【0014】

本発明の実施形態において、ＷＥＥ１阻害剤は、ＷＥＥ１−１または医薬的に許容可能なその塩である。

【0015】

本発明の別の実施形態において、ＷＥＥ１阻害剤は、１００ｍｇ／日から２００ｍｇ／日の間の用量で投与される。本発明の実施形態において、ＷＥＥ１阻害剤は、２日半のコースにわたり１日２回（ＢＩＤ）（全部で５回投与）または２日間のコースにわたり１日１回（ＱＤ）（全部で２回投与）、投与され得る。

【0016】

「癌」という用語は、この記載中で言及される場合、様々な肉腫および癌腫を含み、固形癌および造血器癌を含む。本明細書中で言及される場合、固形癌としては、例えば、脳の癌、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、子宮内膜癌、肺癌、胃癌、胆嚢／胆管癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、絨毛癌、子宮体癌、子宮頸癌、腎盂／尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、胎児癌、ウィルムス腫瘍、皮膚癌、悪性メラノーマ、神経芽腫、骨肉腫、ユーイング腫瘍、軟部肉腫が挙げられる。他方で、造血器癌としては、例えば、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性赤血球増加症、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫が挙げられる。

【0017】

「ＷＥＥ１キナーゼ関連癌」という用語は、この記載中で言及される場合、脳の癌、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、小細胞癌、非小細胞癌、乳癌、肺癌、胃癌、胆嚢／胆管癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、絨毛癌、子宮体癌、子宮頸癌、腎盂／尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、胎児癌、ウィルムス癌、皮膚癌、悪性メラノーマ、神経芽腫、骨肉腫、ユーイング腫瘍、軟部肉腫、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫を含むが限定されないＷＥＥ１キナーゼの活性または阻害と関連する癌、またはこれらの癌の化学療法または放射線療法に対する増感剤として、を意味する。特に、本発明のＷＥＥ１阻害剤は、例えば乳癌、肺癌、膵臓癌、結腸癌、卵巣癌、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫に対する治療薬として、またはこれらの癌の化学療法または放射線療法に対する増感剤として有用である。

【0018】

「癌の処置」という用語は、この記載中で言及される場合、患者において癌細胞の増殖を阻害するために、癌患者に抗癌剤が投与されることを意味する。好ましくは、この処置の結果、癌成長退縮の一部の形態が起こるか、またはこの処置により、癌の再発が遅延するかまたは阻止される。より好ましくは、この処置の結果、癌が完全に消失する。

【0019】

「患者」または「対象」という用語は、この記載中で言及される場合、医学的介入または処置を必要とする受容者を意味する。哺乳動物および非哺乳動物患者または対象が含まれる。

【0020】

「予測的バイオマーカー」という用語は、この記載中で言及される場合、発現が、ある種の治療薬または治療薬クラスに対する反応と相関する遺伝子マーカーを意味する。本明細書中で使用される場合、この用語は、ＰＫＭＹＴ１を指し、この発現は、ＷＥＥ１阻害剤の治療効果と相関する。本明細書中の一実施形態において、ＷＥＥ１阻害剤はＷＥＥ１−１である。

【0021】

「マーカー由来ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ転写形態、マーカー遺伝子、それらから産生される何らかのｃＤＮＡまたはｃＲＮＡおよびそれら由来の何らかの核酸、例えばマーカー遺伝子に対応する遺伝子由来の配列を有する合成核酸を意味する。

【0022】

「対照」、「対照レベル」、「参照レベル」または「所定の参照レベル」という用語は、疾患がなくてもあってもよい、同等の対照細胞において測定された個別のベースラインレベルを意味する。これは、同じ個体由来または、正常であるかまたは疾患または試験試料が得られる同じ疾患を示さない別の個体由来であり得る。したがって、「参照値」は、絶対値、値の範囲、平均値、中央値、平均の値または特定の対照またはベースライン値と比較した場合の値であり得る。参照値は、個々の試料値に基づき得、例えば、ＷＥＥ１キナーゼ関連癌があるが、処置の初期または処置前の個体からの試料から得られた値、または被験個体以外のＷＥＥ１キナーゼ関連癌と診断された患者もしくはＷＥＥ１キナーゼ関連癌と診断されていない個体である「正常」個体からの試料から得られる値である。参照値は、ＷＥＥ１キナーゼ介在癌と診断された複数の患者または正常個体由来などの試料の数に基づき得るか、または試験しようとする試料を含むかまたは除外する試料のプールに基づき得る。

【0023】

「ＰＫＭＹＴ１」という用語は、この記載中で言及される場合、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００４２０３（配列番号１）およびＮＰ＿００４１９４（配列番号２）で配列が示される、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼファミリーのメンバーであるタンパク質である、膜結合型チロシン−およびスレオニン−特異的ＣＤＫ１阻害性キナーゼをコードする遺伝子を意味する（Ｌｉｕ，Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，１７（２）：５７１−５８３）。

【0024】

「ＰＫＭＹＴ１の低発現」または「低ＰＫＭＹＴ１発現」という用語は、この記載中で言及される場合、癌と診断されていない患者として特徴づけられるかまたはそのような患者由来の細胞株から得られた細胞または対照細胞と比較した場合に、ＰＫＭＹＴ１ ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質発現がより低いか、またはＰＫＭＹＴ１遺伝子のコピー数が少ない癌と診断された患者として特徴づけられるかまたはそのような患者由来の細胞株から得られた細胞を意味する。

【0025】

本明細書中で使用される場合、「発現レベルを測定する」、「遺伝子発現レベルを測定する」または「発現レベルを得る」などの用語は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または遺伝子によりコードされるタンパク質を含む遺伝子の転写産物により代表される標的遺伝子発現レベルを定量する方法ならびに、関心のある遺伝子がとにかく発現されるか否かを決定する方法を含む。したがって、必ずしも発現量の定量を提供することなく「イエス」または「ノー」の結果を提供するアッセイは、その用語が本明細書中で使用される場合、「発現を測定する」アッセイである。あるいは、この用語は、定量的な値で、例えば、対照遺伝子に対する、もしくは別の試料中の同じ遺伝子に対する、倍単位の発現変化、上かもしくは下か、または発現の対数比率もしくはその何らかの視覚的表示、例えば色の強さが、検出される遺伝子発現の量を表す「ヒートマップ」などで、発現される標的遺伝子の発現レベルを定量することを含み得る。遺伝子の発現レベルを検出するための代表的な方法としては、ノーザンブロッティング、ドットまたはスロットブロット、レポーター遺伝子マトリックス（例えば米国特許第５，５６９，５８８号明細書を参照）、ヌクレアーゼ保護、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイプロファイリング、ディファレンシャルディスプレイ、ＳＡＧＥ（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−８７）、デジタル遺伝子発現系（国際公開第２００７０７６１２８号パンフレット；同第２００７０７６１２９号パンフレットを参照）、複数ｍＲＮＡアッセイ（Ｔｉａｎら、（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ１２６）、ＰＭＡＧＥ（Ｋｉｍら、（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６：１４８１−８４）、ｃＤＮＡ介在アニーリング、選択、伸長およびライゲーションアッセイ（ＤＡＳＬ，Ｂｉｂｉｋｏｖａら、（２００４），ＡＪＰ １６５：１７９９−８０７）、多重分岐状ＤＮＡアッセイ（Ｆｌａｇｅｌｌａら、（２００６），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５２：５０−６０）、２Ｄゲル電気泳動、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ、ＩＣＡＴ、酵素アッセイ、抗体アッセイなどが挙げられるが限定されない。

【0026】

ＷＥＥ１阻害剤
本発明の実施形態において、本発明のＷＥＥ１阻害剤は、ＷＥＥ１−１であり、この構造は下で示されるとおりである。

【化1】

【0027】

ＷＥＥ１−１は、癌の処置に有用であるＷＥＥ１阻害剤である。ＷＥＥ１−１は、２−アリル−１−［６−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−２−イル］−６−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アミノ｝−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−オンとしても知られる。ＷＥＥ１−１は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる、米国特許第７，８３４，０１９号明細書および国際公開第２００７／１２６１２２号パンフレット、同第２００７／１２６１２８号パンフレットおよび同第２００８／１５３２０７号パンフレットに記載されている。ＷＥＥ１−１の結晶形態は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１０−０１２４５４４号明細書および国際公開第２０１１／０３４７４３号パンフレットに記載されている。

【0028】

本発明の実施形態において、本発明のＷＥＥ１阻害剤は、ＷＥＥ１−２であり、この構造は下で示されるとおりである。

【化2】

【0029】

ＷＥＥ１−２は、癌の処置に有用であるＷＥＥ１阻害剤である。ＷＥＥ１−２はまた、３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−イミノ−７−［（２’−メチル−２’，３’−ジヒドロ−１’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］−７’−イル）アミノ］−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンとしても知られる。ＷＥＥ１−２は、その全体において本明細書中で参照により組み込まれる、国際公開第２００８／１５３２０７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１−０１３５６０１号明細書に記載されている。ＷＥＥ１−２の結晶形態は、国際公開第２００９／１５１９９７号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１１−００９２５２０号明細書に記載されている。

【0030】

本発明の化合物は、不斉中心、キラル軸およびキラル面を有し得（Ｅ．Ｌ．ＥｌｉｅｌおよびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４，１１１９−１１９０頁に記載のとおり）、ラセミ体、ラセミ混合物としておよび個々のジアステレオマーとして生じ得、光学異性体を含む全ての可能性のある異性体およびそれらの混合物、全てのこのような立体異性体が本発明に含まれる。さらに、本明細書中で開示される化合物は、互変異性体として存在し得、互変異性構造が１つしか示されていなくても、両互変異性形態が本発明の範囲に包含されるものとする。

【0031】

本発明に記載の化合物において、原子は、それらの天然の同位体存在度を示し得るか、またはこれらの原子の１以上は、同じ原子番号を有するが原子質量または質量数が天然で主に見出される原子質量または質量数とは異なる特定の同位体において人工的に濃縮され得る。本発明は、本明細書中で開示される化合物の全ての適切な同位体変異体を含むものとする。例えば、水素（Ｈ）の異なる同位体形態としては、プロチウム（１Ｈ）および重水素（２Ｈ）が挙げられる。プロチウムは、天然で見出される主要な水素同位体である。重水素に対する濃縮によって、インビボ半減期延長または投与要件の軽減など、ある種の治療的長所がもたらされ得るか、または生体試料の特徴評価のための標準物質として有用な化合物を提供し得る。本明細書中で開示される同位体濃縮化合物は、当業者にとって周知の従来技術によって、または適切な同位体濃縮試薬および／または中間体を用いて、本明細書中のスキームおよび実施例に記載のものと類似の過程によって、不要な実験なく調製され得る。

【0032】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、様々な結晶、非晶質物質、医薬的に許容可能な塩、水和物および溶媒和物としても存在し得る。さらに、本発明のＷＥＥ１阻害剤はプロドラッグとして提供され得る。一般に、このようなプロドラッグは、生体により必要とされる化合物に容易に変換され得る本発明のＷＥＥ１阻害剤の機能的誘導体である。したがって、本発明における様々な癌の処置の方法において、「投与」という用語は、特異的な化合物投与だけでなく、患者への投与後に生体中でその特異的な化合物に変換され得る化合物の投与も含む。適切なプロドラッグ誘導体の選択および産生のための従来法は、例えば「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」，ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載され、これは、本明細書中で参照され、本記載の一部として本明細書中に全体的に組み込まれる。本化合物の代謝産物は、化合物を生体環境に置くことにより産生される活性化合物を含み得、これは本発明中の化合物の範囲内である。

【0033】

バイオマーカー発現レベルの決定
Ａ．バイオマーカーを測定する方法
一実施形態において、本発明は、ＷＥＥ１阻害剤によって発現がＷＥＥ１阻害に感受性となる予測的バイオマーカー、ＰＫＭＹＴ１である。試料中の予測的バイオマーカーの発現レベルは、当分野で公知の何らかの手段により決定され得る。発現レベルは、単離し、バイオマーカーから転写される核酸のレベル（すなわち量）を決定することによって決定され得る。あるいは、またはさらに、バイオマーカーによりコードされる特異的なタンパク質レベルが決定され得る。

【0034】

バイオマーカーの発現レベルは、試料中に存在するｍＲＮＡまたはそれ由来のポリヌクレオチドの量を決定することにより遂行され得る。ＲＮＡレベルを決定するためのあらゆる方法が使用され得る。例えば、ＲＮＡは、試料から単離され、アガロースゲル上で分離される。次に、分離されたＲＮＡをフィルターなどの固形支持体に転写する。次いで、１以上のマーカーを表す核酸プローブをノーザンハイブリッド形成によりフィルターにハイブリッド形成させ、マーカー由来ＲＮＡの量が決定される。このような決定は、例えば、デンシトメーターの使用による、視覚的または機械的なものであり得る。ＲＮＡレベルを決定する別の方法は、ドットブロットまたはスロットブロットの使用によるものである。この方法において、試料からのＲＮＡまたはそれ由来の核酸が標識される。次に、オリゴヌクレオチドがフィルター上で容易に同定可能な別々の位置に置かれている、１以上のマーカー遺伝子由来のオリゴヌクレオチドを含有するフィルターと、ＲＮＡまたはそれ由来の核酸をハイブリッド形成させる。フィルター結合オリゴヌクレオチドへの標識化ＲＮＡのハイブリッド形成またはその欠如は、視覚的に、またはデンシトメーターにより判定される。ポリヌクレオチドは、放射性標識または蛍光（すなわち可視的）標識を用いて標識され得る。

【0035】

多くの組織検体中のバイオマーカー遺伝子の発現は、「組織アレイ」を用いて特徴評価され得る（Ｋｏｎｏｎｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ，１９９８，４（７）：８４４−８４７）。組織アレイにおいて、同じマイクロアレイ上で複数の組織試料を評価し得る。組織アレイによって、ＲＮＡおよびタンパク質レベルのインサイチュ検出が可能となり；連続切片により、複数の試料の同時分析が可能となる。

【0036】

ＲＮＡ存在量を決定する他の方法が当分野で公知であるので、これらの例は限定的なものではない。

【0037】

Ｂ．マイクロアレイ
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドマイクロアレイは、各バイオマーカーの発現状況が同時に評価されるように、発現を測定するために使用され得る。この測定方法が使用される場合、マイクロアレイは、好ましくは、対象サブセット内で分類にとって情報価値があるとして判定された少なくとも２、３、４、５以上のバイオマーカーまたは全バイオマーカーまたはバイオマーカーの何らかの組み合わせを含む。マイクロアレイが含む情報価値があるバイオマーカーの実際の数は、関心のある特定の状態、同定されるバイオマーカー数および場合によってはエンドポイント表現型の決定においてタイプＩエラー、タイプＩＩエラーまたはタイプＩおよびタイプＩＩエラーが最も少なくなることが分かった情報価値のあるバイオマーカー数に依存して変動する。本明細書中で使用される場合、「タイプＩエラー」は偽陽性を意味し、「タイプＩＩエラー」は、偽陰性を意味し；ＣＤＫ阻害剤への曝露に対する患者の治療反応を予測する例において、タイプＩエラーは、ＣＤＫ阻害剤に対する治療反応がある個体を、ＣＤＫ阻害剤処置に対して非反応性であるものとして誤って特徴づけることであり、タイプＩＩエラーは、ＣＤＫ阻害剤処置に対する反応がない個体を、治療反応を有するものとして誤って特徴づけることである。

【0038】

具体的な実施形態において使用される場合、本発明は、特定の対象サブセットについて同定されるバイオマーカーが、このアレイ上のプローブの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％を含む、ポリヌクレオチドアレイを提供する。別の具体的な実施形態において、マイクロアレイは複数のプローブを含み、この複数のプローブは、特定の患者サブセットについて同定されたＷＥＥ１阻害剤曝露／予測−情報バイオマーカーの少なくとも７５％と相補的であり、ハイブリッド形成可能なプローブを含む。本発明のマイクロアレイは、当然ではあるが、特定の状態について同定された、複数の対象サブセットに対するかまたは各対象サブセットに対するＷＥＥ１阻害剤予測／評価−情報バイオマーカーに相補的であり、これとハイブリッド形成可能であるプローブを含み得る。その推進において、本発明のマイクロアレイは、関心のある状態について同定された各対象サブセットに対して同定されたＷＥＥ１阻害剤予測／評価−情報バイオマーカーの少なくとも７５％と相補的であり、これとハイブリッド形成する複数のプローブを含み、ここでこのプローブは、全体で、前記のマイクロアレイ上のプローブの少なくとも５０％である。

【0039】

また別の具体的な実施形態において、本マイクロアレイは、本明細書中に記載の方法により同定される少なくとも２つのバイオマーカーを含む、市販のｃＤＮＡマイクロアレイである。好ましくは、市販のｃＤＮＡマイクロアレイは、本明細書中に記載の方法により特定の状態について患者サブセットに対して情報価値があると同定されたバイオマーカー全てを含む。しかし、このようなマイクロアレイは、同定されたマーカーの最大数まで、このようなマーカーのうち少なくとも１、２、３、４または５個を含み得る。

【0040】

本明細書中に記載のマイクロアレイの何れも、キット中の密封容器中で提供され得る。

【0041】

Ｃ．予測的バイオマーカーの産物を測定するために使用されるポリヌクレオチド
本発明の、ポリペプチド予測的バイオマーカー、ＰＫＭＹＴ１をコードするｍＲＮＡ転写産物に特異的にまたは選択的に結合可能なポリヌクレオチドも企図される。本発明によれば、例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡまたは、本発明の予測的バイオマーカーのＲＮＡ産物のうち１以上と特異的におよび／または選択的にハイブリッド形成する天然のまたは修飾ヌクレオチドの他の組み合わせが有用である。

【0042】

好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡまたは、本発明の予測的バイオマーカーのＲＮＡ産物のうち１以上と両者とも特異的におよび選択的にハイブリッド形成する天然のまたは修飾ヌクレオチドオリゴヌクレオチドの他の組み合わせが使用される。

【0043】

本発明の実施においてＰＫＭＹＴ１の（高または低）発現レベルを決定するために、当分野で公知の何らかの方法が利用され得る。本発明の一実施形態において、本明細書中で同定され、開示される遺伝子とハイブリッド形成するＲＮＡの検出に基づく発現が使用される。これは、逆転写−ＰＣＲなどであるが限定されない当分野の同等物として公知であるかまたは認識される何らかのＲＮＡ検出または増幅方法および、ＲＮＡ安定化または不安定化配列の有無を検出するための方法により容易に行われる。

【0044】

あるいは、ＤＮＡ状況の検出に基づく発現が使用され得る。として同定された遺伝子のＤＮＡの検出は、特定の転帰と相関して発現が上昇した遺伝子に対して使用され得る。これは、Ｑ−ＰＣＲを含むが限定されない当分野で公知のＰＣＲに基づく方法によって容易に行われ得る。逆に、増幅されるものとして同定された遺伝子のＤＮＡの検出は、特定の処置の転帰と相関して発現が上昇した遺伝子に対して使用され得る。これは、当分野で公知のＰＣＲに基づく蛍光インサイチュハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）および染色体インサイチュハイブリッド形成（ＣＩＳＨ）法によって容易に行われ得る。

【0045】

Ｄ．バイオマーカーのＲＮＡ産物を測定するための技術
１．リアルタイムＰＣＲ
実際に、少数の遺伝子、すなわち約１から３０００遺伝子に基づく、遺伝子発現ベースの発現アッセイは、臨床検査室でよく使用される既存の定量的リアルタイムＰＣＲ技術を用いて比較的容易に行われ得る。定量的リアルタイムＰＣＲは、二重標識フルオリジェニック（ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ）プローブを通じてＰＣＲ産物蓄積を測定する。各標的配列に対する内部競合物、試料内に含有される正規化遺伝子またはハウスキーピング遺伝子など、様々な正規化法が使用され得る。リアルタイムＰＣＲに対する十分なＲＮＡを対象からの数ミリグラム量から単離し得る。現在、多遺伝子発現をベースとしたアッセイのルーチン的な臨床用途を現実的な目標とする試薬と一緒に予め搭載されたミクロ流体カードとともに、定量的サーマルサイクラーが使用され得る。

【0046】

本発明によりアッセイされる、本発明の予測的バイオマーカーの遺伝子マーカーまたはそのサブセットは、一般的にはトータルＲＮＡまたはｍＲＮＡまたは逆転写トータルＲＮＡまたはｍＲＮＡの形態である。トータルおよびｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は、当分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９７）を含む分子生物学の標準的教科書で開示される。ＲＮＡ単離はまた、製造者の説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）およびＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）など、市販業者からの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを用いて行うこともできる。

【0047】

ＴＡＱｍａｎ定量的リアルタイムＰＣＲは、製造者の説明書に従い、市販のＰＣＲ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および装置、例えばＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行われ得る。この系は、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピューターからなる。この系は、サーモサイクラー上で９６ウェルまたは３８４ウェルの方式で試料を増幅する。増幅中、全９６ウェルに対して光ファイバーケーブルを通じて、レーザー誘導性蛍光シグナルをリアルタイムで回収し、ＣＣＤで検出する。この系は、機器を動作させるための、およびデータを分析するためのソフトウェアを含む。

【0048】

遺伝子発現測定を行い、本明細書中に記載の分類方法を行うために、本発明で同定された予測的バイオマーカーに基づき、リアルタイムＰＣＲ ＴＡＱｍａｎアッセイを使用し得る。当業者にとって明らかであるように、予測的バイオマーカー転写産物配列に基づいて、本発明の予測的バイオマーカーに相補的であるかまたはこれとハイブリッド形成する多岐にわたるオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブが選択され得る。

【0049】

２．アレイハイブリッド形成
本発明のある態様によるアレイを含むために安定的に支持体と結合される核酸メンバーとして、本発明のＲＮＡ産物を測定するために使用されるポリヌクレオチドを使用し得る。核酸メンバーの長さは、８から１０００ヌクレオチド長の範囲であり得、本発明の予測的バイオマーカーのＲＮＡ産物に特異的であるように選択され得る。一実施形態において、これらのメンバーは、本発明のＲＮＡ産物に選択的である。核酸メンバーは、１本または２本鎖であり得、および／またはｃＤＮＡから増幅されたオリゴヌクレオチドまたはＰＣＲ断片であり得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドはおよそ２０から３０ヌクレオチド長である。ＥＳＴは、好ましくは１００から６００ヌクレオチド長である。アレイ上でプローブとして本発明の予測的バイオマーカーの発現領域の一部を利用し得ることは当業者にとって理解される。とりわけ、本発明の遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドおよび本発明の遺伝子由来のｃＤＮＡまたはＥＳＴは有用である。オリゴヌクレオチドに基づくアレイに対して、プローブとして有用である関心のある遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドの選択は当分野でよく理解されている。とりわけ、標的核酸へのハイブリッド形成を可能にする領域を選択することは重要である。オリゴヌクレオチドのＴｍ、％ＧＣ含量、二次構造の程度および核酸の長さなどの因子は重要な因子である。例えば米国特許第６，５５１，７８４号明細書を参照。

【0050】

３．核酸アレイの構築
提案される方法において、アレイ上の特有の位置の１以上の相補的核酸メンバーが標的核酸に特異的にハイブリッド形成する、相補的核酸メンバー／標的複合体のハイブリッド形成パターンを生成させるのに十分なハイブリッド形成条件下で、標的核酸を含む試料と、実質的に支持体の表面と安定的に結合される核酸メンバーのアレイを接触させる。ハイブリッド形成する標的核酸の同一性は、アレイ上の核酸メンバーの位置を参照して決定され得る。

【0051】

核酸メンバーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写（ＲＴ）などの確立された技術を用いて生成され得る。これらの方法は、当分野で現在公知のものと同様である（例えば、ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｉｎｎｉｓ（Ｅｄｉｔｏｒ）ら、１９９５およびＰＣＲ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｇｒａｈａｍ，１９９７を参照）。当分野で周知の方法（例えば、カラム精製またはアルコール沈殿）によって増幅核酸を精製する。核酸は、プライマーおよび所望の核酸の合成中に生成された不完全産物を実質的に含まないように単離されている場合、純粋とみなされる。好ましくは、精製核酸はまた、実質的に、分子の特異的な結合活性を妨げ得るかまたはそうでなければ遮蔽し得る夾雑物不含である。

【0052】

本発明のある態様によると、アレイは、２０種類の異なる核酸／ｃｍ^２を超える密度で支持体の片面に連結される複数の核酸を含み、各核酸は、非同一である予め選択された領域（例えばマイクロアレイ）の支持体面に連結される。アレイ上の各結合試料は、下記でさらに詳述するように、公知の同一性の、通常は公知の配列の核酸組成物を含む。本発明において、あらゆる考え得る基質を使用し得る。

【0053】

一実施形態において、支持体の表面に連結される核酸はＤＮＡである。一実施形態において、支持体の表面に連結される核酸はｃＤＮＡまたはＲＮＡである。別の実施形態において、支持体の表面に連結される核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成されたｃＤＮＡである。通常、本発明によるアレイ中の核酸メンバーは、少なくとも１０、２５、５０、６０ヌクレオチド長である。一実施形態において、核酸メンバーは、少なくとも１５０ヌクレオチド長である。好ましくは、核酸メンバーは、１０００ヌクレオチド長未満である。より好ましくは、核酸メンバーは、５００ヌクレオチド長未満である。

【0054】

本発明のアレイにおいて、核酸組成物は、支持体の表面と安定的に結合され、その支持体は、柔軟または剛性支持体であり得る。「安定的に結合される」とは、各核酸メンバーが、ハイブリッド形成および洗浄条件下で支持体に対して特有の位置を維持することを意味する。それ自体、試料は、支持体表面と安定的に非共有または共有結合される。非共有結合の例としては、非特異的な吸着、静電相互作用に基づく結合（例えばイオン対相互作用）、疎水性相互作用、水素結合相互作用、支持体面に共有結合される特異的な結合対メンバーを通じた特異的な結合などが挙げられる。共有結合の例としては、剛性支持体の表面上に存在する核酸と官能基（例えば−−ＯＨ）との間で形成される共有結合が挙げられ、この官能基は、下記でさらに詳述するように、天然に存在するものであってもよいし、または導入される連結基のメンバーとして存在してもよい。

【0055】

各組成物中に存在する核酸の量は、アレイが使用されるアッセイ中に、的確なハイブリッド形成および標的核酸配列の検出を提供するのに十分であろう。一般に、アレイの支持体に安定的に結合する各核酸メンバーの量は、少なくとも約０．００１ｎｇ、好ましくは少なくとも約０．０２ｎｇおよびより好ましくは少なくとも約０．０５ｎｇであり、その量は１０００ｎｇ以上に達し得るが、通常は約２０ｎｇを超えない。核酸メンバーが、全体的な円の様相を含むスポットで支持体上に「スポットされる」場合、「スポット」の直径は一般的に、約１０から５，０００μｍ、通常は約２０から２，０００μｍ、より一般的には約１００から２００μｍの範囲である。

【0056】

対照核酸メンバーは、ゲノムＤＮＡ、ハウスキーピング遺伝子、ベクター配列、植物核酸配列、陰性および陽性対照遺伝子などに対応するオリゴヌクレオチドまたは核酸を含む核酸メンバーを含むアレイ上に存在し得る。対照核酸メンバーは、その機能が、関心のある特定の「キー」遺伝子が発現されるか否かを示そうとするものではなく、むしろ、発現のバックグラウンドまたは基底レベルなどの他の有用な情報を提供するものである、較正または対照遺伝子である。

【0057】

他の対照核酸は、アレイ上にスポットされ、プローブが向けられる標的以外の試料中の核酸に対する非特異的な結合またはクロスハイブリッド形成を監視するために、標的発現対照核酸およびミスマッチ対照ヌクレオチドとして使用される。したがって、ミスマッチプローブは、ハイブリッド形成が、特異的であるかまたは非特異的であるかを示す。例えば、標的が存在する場合、完全一致プローブは、常にミスマッチされたプローブよりも明るいはずである。さらに、全対照ミスマッチが存在する場合、突然変異を検出するためにミスマッチプローブが使用される。

【0058】

本発明の核酸メンバーの基質への連結（「スポッティング」と呼ばれる過程）のために多くの方法が使用され得る。例えば、ポリマー連結の方法を教示するために参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，８０７，５２２号明細書の技術を用いて、核酸が連結される。あるいは、当分野で公知のようなコンタクトプリンティング技術を用いて、スポッティングが行われ得る。

【0059】

本発明のＲＮＡ産物の発現の測定は、ＲＮＡ産物の発現を定量するために、本発明のＲＮＡ産物に特異的および／または選択的であるポリヌクレオチドを使用することによって行われ得る。本発明の具体的な実施形態において、ＲＮＡ産物に特異的および／または選択的であるポリヌクレオチドは、プローブまたはプライマーである。一実施形態において、これらのポリヌクレオチドは、測定しようとする個体の試料からのＲＮＡを測定するためにアレイ上にスポットされ得る核酸プローブの形態である。別の実施形態において、ＲＮＡ産物の発現を測定するために市販アレイを使用し得る。また別の実施形態において、本発明のＲＮＡ産物に特異的および／または選択的であるポリヌクレオチドは、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを用いた、または、使用されるポリヌクレオチドがフォワードプライマー、リバースプライマー、ＴａｑＭａｎ標識プローブもしくはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ標識プローブの形態で使用される、ＴａｑＭａｎ（登録商標）もしくはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎを用いた、定量的リアルタイムＲＴ ＰＣＲなどの技術において、プローブおよびプライマーの形態で使用される。

【0060】

僅か１または２の遺伝子を分析しようとする実施形態において、分析しようとする遺伝子のみが増幅されて、乳房細胞で発現される他の遺伝子からのバックグラウンドシグナルが減少するように、適切なプライマーの使用によって、（１または複数の）試料細胞由来の核酸を優先的に増幅し得る。あるいは、および複数の遺伝子を分析しようとする場合、またはごく僅かの細胞（または１つの細胞）が使用される場合、固定化ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成前に、試料からの核酸が全体的に増幅され得る。当然ではあるが、当分野で公知の方法によって、ＲＮＡまたはそのｃＤＮＡ対応物を直接標識し、増幅せずに使用し得る。

【0061】

４．マイクロアレイの使用
「マイクロアレイ」は、好ましくはそれぞれが定められた面積を有し、ガラス、プラスチックまたは合成膜などであるが限定されない固形支持体の表面上に形成される、個別の領域の、直線状または二次元アレイである。マイクロアレイ上の個々の領域の密度は、１つの固相支持体の表面上で検出しようとする固定化ポリヌクレオチドの総数により決定され、好ましくは少なくとも約５０／ｃｍ^２、より好ましくは少なくとも約１００／ｃｍ^２、さらにより好ましくは少なくとも約５００／ｃｍ^２であるが、好ましくは約１，０００／ｃｍ^２を下回る。好ましくは、アレイは、全部で約５００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００または約３０００未満の固定化ポリヌクレオチドを含有する。本明細書中で使用される場合、ＤＮＡマイクロアレイは、試料から増幅またはクローニングされたポリヌクレオチドとハイブリッド形成させるために使用されるチップまたは他の面上に置かれるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのアレイである。アレイにおける各特定のプライマー群の位置は分かっているので、マイクロアレイ中の特定の位置へのそれらの結合に基づき、試料ポリヌクレオチドの正体が特定され得る。

【0062】

遺伝子発現レベルの決定は、マイクロアレイを利用して遂行され得る。一般に、次の段階が含まれ得る：（ａ）対象からｍＲＮＡ試料を得て、それらから標識核酸（「標的核酸」または「標的」）を調製すること；（ｂ）例えばハイブリッド形成または特異的結合によって標的核酸をアレイ上の対応するプローブと結合させるのに十分な条件下で、標的核酸をアレイと接触させること；（ｃ）アレイからの未結合標的を除去してもよい；（ｄ）結合した標的を検出すること、および（ｅ）例えばコンピューターに基づく分析方法を用いて結果を分析すること。本明細書中で使用される場合、「核酸プローブ」または「プローブ」は、アレイに連結される核酸であり、一方で「標的核酸」は、アレイとハイブリッド形成させられる核酸である。

【0063】

「侵襲性」または「非侵襲性」試料採取手段の何れかを用いて、試験しようとする対象から核酸検体を得ることができる。試料採取手段は、それが動物（マウス、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌまたはネコ科動物を含む）の皮膚または臓器内からの核酸の回収を含む場合、「侵襲性」であると言われる。侵襲性試料採取手段の例としては、採血、精液回収、針生検、胸膜吸引、臍帯生検が挙げられる。このような方法の例は、Ｋｉｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，６６：３８７９−３８８２，Ｂｉｓｗａｓら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９０，５９０：５８２−５８３およびＢｉｓｗａｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９１，２９：２２２８−２２３３により論じられている。

【0064】

その一方、「非侵襲性」試料採取手段は、核酸分子が動物の内面または外面から回収されるものである。「非侵襲性」試料採取手段の例としては、「スワブでの採取（ｓｗａｂｂｉｎｇ）」、涙液、唾液、尿、糞便物質の回収などが挙げられる。

【0065】

本発明の一実施形態において、１以上の細胞、すなわち試験しようとする対象からの試料を得て、ＲＮＡを細胞から単離する。対象から細胞試料を得て、次いで所望の細胞型について試料を濃縮することも可能である。例えば、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープへの抗体結合による単離など、様々な技術を用いて、細胞を他の細胞から単離し得る。所望の細胞が固形組織中にある場合、例えば、マイクロダイセクションによって、またはレーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）によって、特定の細胞を切り出し得る（例えば、Ｂｏｎｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７８：１４８１，Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７４：９９８，Ｆｅｎｄら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１９９９，１５４：６１およびＭｕｒａｋａｍｉら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｈｉｔ．，２０００，５８：１３４６を参照）。

【0066】

様々な方法、例えばグアニジンチオシアン酸塩溶解とそれに続くＣｓＣｌ遠心（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７９，１８：５２９４−５２９９）によって、組織または細胞試料からＲＮＡを抽出し得る。単一細胞からのｃＤＮＡライブラリを調製するための方法に記載のように、単一細胞由来のＲＮＡを得ることができる（例えば、Ｄｕｌａｃ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，３６：２４５，およびＪｅｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９６，１９０：１９９参照）。

【0067】

特定の種に対してＲＮＡ試料をさらに濃縮し得る。一実施形態において、例えばポリ（Ａ）＋ＲＮＡがＲＮＡ試料から単離され得る。別の実施形態において、プライマー特異的なｃＤＮＡ合成またはｃＤＮＡ合成および鋳型に対するインビトロ転写に基づく複数回の直線的増幅（例えば、Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：９７１７；Ｄｕｌａｃら、前出；Ｊｅｎａら、前出参照）によって、関心のある配列に対してＲＮＡ集団を濃縮し得る。さらに、特に種または配列に対して濃縮されているかまたはされていないＲＮＡの集団は、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９８９，４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４１：１０７７参照）、自律的配列複製（ＳＳＲ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：１８７４参照）、核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：１１７３参照）を含む様々な増幅方法によってさらに増幅され得る。ＰＣＲ技術のための方法は、当分野で周知である（例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９９２；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９１，１９：４９６７；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９１，１：１７；ＰＣＲ，ｅｄｓ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；および米国特許第４，６８３，２０２号明細書を参照）。増幅の方法は、例えばＯｈｙａｍａら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００，２９：５３０；Ｌｕｏら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９９，５：１１７；Ｈｅｇｄｅら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０００，２９：５４８；Ｋａｃｈａｒｍｉｎａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３０３：３；Ｌｉｖｅｓｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２０００，１０：３０１；Ｓｐｉｒｉｎら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，１９９９，４０：３１０８；およびＳａｋａｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８７：３２に記載されている。ＲＮＡ増幅およびｃＤＮＡ合成はまた、インサイチュで細胞中で行われ得る（例えば、Ｅｂｅｒｗｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９：３０１０参照）。

【0068】

本発明のまた別の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびリアルタイムＰＣＲ、場合によってはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどであるが限定されない、それらの変法などの方法によって、開示されるマーカー配列の全てまたは一部を増幅し、検出し得る。このような方法は、開示される配列の一部分と相補的である１または２つのプライマーを利用するが、これらのプライマーは、核酸合成を開始させるために使用される。

【0069】

新たに合成された核酸は、標識されてもよく、直接的にまたは本発明のポリヌクレオチドへのハイブリッド形成によって検出され得る。

【0070】

マイクロアレイへの核酸分子のハイブリッド形成の検出を可能にするために、核酸分子を標識し得る。すなわち、プローブは、シグナル生成系のメンバーを含み得、したがって、直接的に、またはシグナル生成系の１以上のさらなるメンバーとの複合作用を通じるかの何れかで検出可能である。例えば、核酸は、蛍光標識ｄＮＴＰ（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９２参照）、ビオチン化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰと、それに続く標識化ストレプトアビジン、化学発光標識または同位体の添加により標識され得る。標識の別の例としては、ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９６，１４：３０３に記載のような「分子ビーコン」が挙げられる。それらのハイブリッド形成を可能とする条件下で、新たに合成された核酸を本発明のポリヌクレオチド（含有配列）と接触させ得る。ハイブリッド形成はまた、例えばプラズモン共鳴によっても判定され得る（例えば、Ｔｈｉｅｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６９：４９４８参照）。

【0071】

一実施形態において、複数の、例えば２セットの標的核酸を標識し、１回のハイブリッド形成反応において使用される（「多重」分析）。一方のセットの核酸は、一方の細胞からのＲＮＡに対応し得、別のセットの核酸は、別の細胞からのＲＮＡに対応し得る。区別され得るように個々の発光スペクトルを有する異なる蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）など、異なる標識で複数のセットの核酸を標識し得る。次に、これらのセットを混合し、１つのマイクロアレイに対して同時にハイブリッド形成させ得る（例えば、Ｓｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０：４６７−４７０参照）。

【0072】

多くの様々なマイクロアレイ配置およびそれらの作製のための方法は、当業者にとって公知であり、米国特許第５，２４２，９７４号明細書；同第５，３８４，２６１号明細書；同第５，４０５，７８３号明細書；同第５，４１２，０８７号明細書；同第５，４２４，１８６号明細書；同第５，４２９，８０７号明細書；同第５，４３６，３２７号明細書；同第５，４４５，９３４号明細書；同第５，５５６，７５２号明細書；同第５，４０５，７８３号明細書；同第５，４１２，０８７号明細書；同第５，４２４，１８６号明細書；同第５，４２９，８０７号明細書；同第５，４３６，３２７号明細書；同第５，４７２，６７２号明細書；同第５，５２７，６８１号明細書；同第５，５２９，７５６号明細書；同第５，５４５，５３１号明細書；同第５，５５４，５０１号明細書；同第５，５６１，０７１号明細書；同第５，５７１，６３９号明細書；同第５，５９３，８３９号明細書；同第５，６２４，７１１号明細書；同第５，７００，６３７号明細書；同第５，７４４，３０５号明細書；同第５，７７０，４５６号明細書；同第５，７７０，７２２号明細書；同第５，８３７，８３２号明細書；同第５，８５６，１０１号明細書；同第５，８７４，２１９号明細書；同第５，８８５，８３７号明細書；同第５，９１９，５２３号明細書；同第６，０２２，９６３号明細書；同第６，０７７，６７４号明細書；および同第６，１５６，５０１号明細書；Ｓｈｅｎａら、Ｔｉｂｔｅｃｈ １６：３０１，１９９８；Ｄｕｇｇａｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１０，１９９９；Ｂｏｗｔｅｌｌら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２５，１９９９；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら、２１ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２０−２４，１９９９；Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１１ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，６８７−９０，１９９６；Ｍａｓｋｏｓら、２１ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６６３−６９，１９９３；Ｈｕｇｈｅｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．（２００１）１９：３４２で開示されており、これらの開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。様々な適用においてアレイを使用する方法を記載する特許としては、米国特許第５，１４３，８５４号明細書；同第５，２８８，６４４号明細書；同第５，３２４，６３３号明細書；同第５，４３２，０４９号明細書；同第５，４７０，７１０号明細書；同第５，４９２，８０６号明細書；同第５，５０３，９８０号明細書；同第５，５１０，２７０号明細書；同第５，５２５，４６４号明細書；同第５，５４７，８３９号明細書；同第５，５８０，７３２号明細書；同第５，６６１，０２８号明細書；同第５，８４８，６５９号明細書；および同第５，８７４，２１９号明細書が挙げられ；これらの開示は参照により本明細書中に組み込まれる。

【0073】

一実施形態において、オリゴヌクレオチドのアレイは、固形支持体上で合成され得る。代表的な固形支持体としては、ガラス、プラスチック、ポリマー、金属、メタロイド、セラミック、有機物などが挙げられる。チップ遮蔽技術および光防護化学を用いて、核酸プローブの秩序配列を作製することが可能である。例えば「ＤＮＡチップ」として知られるこれらのアレイまたは非常に大規模な固定化ポリマーアレイ（「ＶＬＳＩＰＳ（登録商標）」アレイ）は、約１ｃｍ^２から数ｃｍ^２の面積を有する基質上に数百万の規定のプローブ領域を含み得、それにより数個から数百万のプローブを組み込む（例えば、米国特許第５，６３１，７３４号明細書を参照）。

【0074】

発現レベルを比較するために、アレイ上での標的核酸とプローブとの間の結合に十分な条件下で標識化核酸をアレイと接触させ得る。一実施形態において、ハイブリッド形成条件は、所望のレベルのハイブリッド形成特異性を提供するために選択され得；すなわち、マイクロアレイ上での標識化核酸とプローブとの間でハイブリッド形成を生じさせるのに十分な条件である。

【0075】

ハイブリッド形成は、基本的に特異的なハイブリッド形成を可能とする条件で行われ得る。核酸の長さおよびＧＣ含量は、熱融解点、したがって、プローブの標的核酸への特異的なハイブリッド形成を得るために必要なハイブリッド形成条件を決定する。これらの因子は、当業者にとって周知であり、また、アッセイにおいて試験され得る。核酸ハイブリッド形成に対する詳細な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９３において見出され得る。

【0076】

上記の方法の結果、アレイ表面上で標識される標的核酸のハイブリッド形成パターンが生成される。標識化核酸の得られるハイブリッド形成パターンは、標的核酸の特定の標識に基づいて選択される検出の特定の方式を用いて、様々な方法で、可視化され得るかまたは検出され得る。代表的な検出手段としては、シンチレーション測定、オートラジオグラフィー、蛍光測定、熱量測定、発光測定、光散乱などが挙げられる。

【0077】

検出のあるこのような方法は、市販のアレイスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）、例えば４１７（登録商標）Ａｒｒａｙｅｒ、４１８（登録商標）Ａｒｒａｙ ＳｃａｎｎｅｒまたはＡｇｉｌｅｎｔ ＧｅｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒを利用する。このスキャナーは、インターフェースおよび使用し易いソフトウェアツール付きのシステムコンピューターから制御される。出力は、様々なソフトウェアアプリケーションに直接インポートされ得るかまたはソフトウェアアプリケーションにより直接読まれ得る。代表的なスキャニング装置は、例えば米国特許第５，１４３，８５４号明細書および同第５，４２４，１８６号明細書に記載されている。

【0078】

投与および投与経路
本発明のＷＥＥ１阻害剤に関して、様々な剤形が選択され得、その例としては、経口製剤、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤または液体または滅菌液体非経口製剤、例えば溶液または懸濁液、坐薬、軟膏などが挙げられる。ＷＥＥ１阻害剤は医薬的に許容可能な塩として利用可能である。本発明のＷＥＥ１阻害剤は、医薬的に許容可能な担体または希釈剤とともに調製される。

【0079】

「医薬的に許容可能な塩」という用語は、この記載中で言及される場合、通常、医薬的に許容可能な塩を意味する。例えば、化合物がヒドロキシル基またはカルボキシル基およびテトラゾリル基などの酸性基を有する場合、これは、ヒドロキシル基または酸性基で塩基付加塩を形成し得るか；または化合物がアミノ基もしくは塩基性複素環基を有する場合、これは、アミノ基または塩基性複素環基で酸付加塩を形成し得る。

【0080】

塩基付加塩としては、例えば、アルカリ金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩など；アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩、マグネシウム塩など；アンモニウム塩；および有機アミン塩、例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロへキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩が挙げられる。

【0081】

酸付加塩としては、例えば、無機酸塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩など；有機酸塩、例えば、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、トリフルオロ酢酸塩など；およびスルホン酸塩、例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。

【0082】

「医薬的に許容可能な担体または希釈剤」という用語は、賦形剤（例えば、脂肪、蜜蝋、半固体および液体ポリオール、天然または硬化油など］、水（例えば、蒸留水、特に注射用蒸留水など）、生理食塩水、アルコール（例えばエタノール）、グリセロール、ポリオール、グルコース水溶液、マンニトール、植物油など）および添加物（例えば、増量剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、保存剤、甘味料、着色剤、調味料または芳香剤、濃縮剤、希釈剤、緩衝物質、溶媒または可溶化剤、保存効果を達成するための化学物質、浸透圧を変化させるための塩、コーティング剤または抗酸化剤など）を指す。

【0083】

固形製剤は、何ら添加物なく、錠剤、カプセル、顆粒剤および粉末の形態で調製され得るか、または適切な担体（添加物）を用いて調製され得る。このような担体（添加物）の例としては、糖類、例えばラクトースまたはグルコースなど；トウモロコシ、小麦またはコメのデンプン；脂肪酸、例えばステアリン酸など；無機塩、例えばメタケイ酸アルミン酸マグネシウムまたは無水リン酸カルシウムなど；合成ポリマー、例えばポリビニルピロリドンまたはポリアルキレングリコールなど；アルコール、例えばステアリルアルコールまたはベンジルアルコールなど；合成セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど；および他の従来使用される添加物、例えばゼラチン、タルク、植物油およびアラビアゴムなどが挙げられ得る。

【0084】

これらの固形製剤、例えば錠剤、カプセル、顆粒剤および粉末などは、各製剤の総重量に基づいて、一般に例えば、０．１から１００重量％および好ましくは５から９８重量％のＷＥＥ１阻害剤を含有し得る。

【0085】

液体製剤は、液体製剤において従来使用される適切な添加物、例えば水、アルコールまたは植物由来油、例えばダイズ油、ピーナツ油およびゴマ油などを用いて、懸濁液、シロップ剤、注射および点滴（静脈内液体）の形態で生成される。

【0086】

特に、製剤が筋肉内注射、静脈内注射または皮下注射の形態で非経口投与される場合、適切な溶媒または希釈剤は、注射用の蒸留水、塩酸リドカインの水溶液（筋肉内注射用）、生理食塩水、グルコース水溶液、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、静脈内注射用の液体（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウムの水溶液など）または電解質溶液（静脈内点滴および静脈内注射用）またはその混合溶液により例示され得る。

【0087】

このような注射は、予め溶解された溶液の形態または、使用時に溶解される、粉末それ自体または適切な担体（添加物）と組み合わせられた粉末の形態であり得る。注射液は、例えば、各製剤の総重量に基づいて０．１から１０重量％の活性成分を含有し得る。

【0088】

経口投与用の懸濁液またはシロップ剤などの液体製剤は、例えば、各製剤の総重量に基づいて０．１から１０重量％の活性成分を含有し得る。

【0089】

本発明における各製剤は、従来の方法または一般的技術に従い、当業者により調製され得る。例えば、調製は、製剤が経口製剤である場合、例えば適切な量の本発明の化合物を適切な量のラクトースと混合し、この混合物を経口投与に適切な硬ゼラチンカプセルに充填することによって行われ得る。他方では、調製は、本発明の化合物を含有する製剤が注射剤である場合、例えば適切な量の本発明の化合物を適切な量の０．９％生理食塩水と混合し、この混合物を注射用のバイアルに充填することによって行われ得る。

【0090】

本発明の成分は、標準的な薬務に従い、医薬組成物中で、単独でまたは医薬的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせての何れかで、ヒトを含む哺乳動物に投与され得る。本成分は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸および局所投与経路を含め、経口または非経口投与され得る。

【0091】

適切な投与量は、医師にとって公知であり、当然ではあるが、特定の疾患状態、投与されている組成物の特異的な活性および処置を受けている特定の患者に依存する。一部の例において、所望の治療量を達成するために、反復投与、すなわち特定の監視または計量された量の反復される個々の投与を提供することが必要であり得、所望の１日用量または効果が達成されるまで、個々の投与が反復される。適切な投与量に関するさらなる情報は以下で提供する。

【0092】

本発明の成分に関連して「投与」という用語およびそれらの変形物（例えば化合物を「投与する」）は、処置を必要とする動物の系に成分または成分のプロドラッグを導入することを意味する。本発明の成分またはそのプロドラッグが、１以上の他の活性物質（例えばＷＥＥ１阻害剤）と組み合わせて提供される場合、「投与」およびその変形物は、それぞれ、成分またはそのプロドラッグおよび他の物質の同時および連続導入を含むと理解される。

【0093】

本明細書中で使用される場合、「組成物」という用語は、指定量で指定成分を含む生成物ならびに指定量での指定成分の組み合わせから直接または間接的に得られる何らかの生成物を包含するものとする。

【0094】

「治療的有効量」という用語は、本明細書中で使用される場合、研究者、獣医師、医師またはその他の臨床家により求められている、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的反応を引き出す、活性化合物または医薬品の量を意味する。これは、第一のおよび第二の処置の合わせた量など、複数の治療薬の使用を含む併用療法を含み、この合わせた量は、所望の生体反応を達成する。所望の生体反応は、部分的もしくは全体的な、癌転移を含む癌の進行の阻害、遅延もしくは予防；癌転移を含む癌の再発の阻害、遅延もしくは予防；または哺乳動物、例えばヒトにおける癌の発生または発現の予防（化学的予防）である。

【0095】

適切な量のＷＥＥ１阻害剤が癌に対する処置を受けている患者に投与される。実施形態において、ＷＥＥ１阻害剤は、約１００ｍｇ／日から２５０ｍｇ／日の範囲の用量で投与される。本発明の実施形態において、ＷＥＥ１阻害剤は、２日半にわたり、１日２回（ＢＩＤ）、全部で５回、投与される。本発明の別の実施形態において、ＷＥＥ１阻害剤は、２日間にわたり、１日１回（ＱＤ）、全部で２回、投与される。

【0096】

本発明の実施形態において、ＷＥＥ１阻害剤は、週に５回投与され得る。本発明の別の実施形態において、ＷＥＥ１阻害剤は、週に２回投与され得る。

【0097】

適応症
一実施形態において、本明細書中で本発明は、ＷＥＥ１関連癌と診断された患者をＷＥＥ１阻害剤で処置する方法であり、この患者は、ＰＫＭＹＴ１の低発現を有することを特徴とする。本発明のＷＥＥ１阻害剤は、キナーゼ−阻害効果、特にＷＥＥ１キナーゼ−阻害的効果を有し、このようなものとして、これは、したがって、ＷＥＥ１キナーゼが関連する様々な癌に対する療法として有用である。ＷＥＥ１キナーゼ関連癌の例としては、脳の癌、頭頸部癌、食道癌、甲状腺癌、小細胞癌、非小細胞癌、乳癌、肺癌、胃癌、胆嚢／胆管癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、卵巣癌、絨毛癌、子宮体癌、子宮頸癌、腎盂／尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、胎児癌、ウィルムス癌、皮膚癌、悪性メラノーマ、神経芽腫、骨肉腫、ユーイング腫瘍、軟部肉腫、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫が挙げられるが限定されず、またはこれらの癌の化学療法または放射線治療に対する増感剤として、含まれる。

【0098】

特に、本発明のＷＥＥ１阻害剤は、例えば乳癌、肺癌、膵臓癌、結腸癌、卵巣癌、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫に対する治療薬として、またはこれらの癌の化学療法または放射線療法に対する増感剤として有用である。

【0099】

上記のＷＥＥ１キナーゼ関連癌の処置に加えて、ＷＥＥ１阻害剤はまた、次の癌：心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支原性肺癌（扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（導管腺癌、インスリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ガストリン産生腫瘍、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）、結腸、結直腸、直腸；泌尿生殖器：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平細胞癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胚性癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝細胞腫（肝細胞癌）、胆管細胞癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、オステオクロンフロマ（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ）（骨軟骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫および巨細胞腫瘍；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形神経膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科学的なもの：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、ムチン性嚢胞腺癌、未分類癌］、顆粒膜莢膜細胞腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、メラノーマ）、膣（明細胞癌、扁平細胞癌、ブドウ状肉腫（胚性横紋筋肉腫）、卵管（癌腫）；血液学的なもの：血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；および皮膚：悪性メラノーマ、基底細胞癌、扁平細胞癌、カポジ肉腫、黒子異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫の処置にも有用であり得る。したがって、「癌性細胞」という用語は、本明細書中で提供される場合、上記で挙げられた状態のうち何れか１つを負っている細胞を含む。

【0100】

本発明の範囲内にさらに含まれるのは、血管形成が関連する疾患を処置または予防する方法であり、これは、このような処置を必要とする哺乳動物に治療的有効量の本発明の組み合わせを投与することから構成される。眼の血管新生疾患は、結果として生じる組織障害の多くが、眼での血管の異常な浸潤に起因し得る状態の例である（国際公開第２０００／３０６５１号パンフレット）。糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞などから生じるものなど、虚血性網膜症によって、または加齢性黄斑変性で観察される脈絡膜血管新生などの変性疾患によって、望ましくない浸潤が惹起され得る。したがって、本化合物の投与によって血管の成長を阻害することによって、血管の浸潤が予防され、網膜血管化、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性などのような眼疾患など、血管形成が関連する疾患が予防または処置される。

【0101】

本発明の範囲内にさらに含まれるのは、眼疾患（網膜血管化、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性など）、アテローム性動脈硬化症、関節炎、乾癬、肥満およびアルツハイマー病を含むが限定されない、血管形成が関連する非悪性疾患を処置または予防する方法である（Ｄｒｅｄｇｅら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００２，２（８）：９５３−９６６）。別の実施形態において、血管形成が関連する疾患を処置または予防する方法は、眼疾患（網膜血管化、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性など）、アテローム性動脈硬化症、関節炎および乾癬を含む。

【0102】

本発明の範囲内にさらに含まれるのは、過剰増殖性障害、例えば再狭窄、炎症、自己免疫疾患およびアレルギー／喘息などを処置する方法である。

【0103】

本発明の範囲内にさらに含まれるのは、ステントを被覆するための本組み合わせの使用であり、したがって、再狭窄の処置および／または予防のための被覆ステント上での本化合物の使用である（国際公開第２００３／０３２８０９号パンフレット）。

【0104】

本発明の範囲内にさらに含まれるのは、変形性関節症の処置および／または予防のための本組み合わせの使用である（国際公開第２００３／０３５０４８号パンフレット）。

【0105】

本発明の範囲内にさらに含まれるのは、低インスリン症を処置する方法である。

【0106】

本発明を例証するのは、ＷＥＥ１関連癌の処置のための薬剤の調製において上に記載されるＷＥＥ１阻害剤の使用である。

【0107】

さらなる抗癌剤
本発明の方法で投与されるＷＥＥ１阻害剤はまた、さらなる治療薬、化学療法薬および抗癌剤との組み合わせでも有用である。治療薬、化学療法薬および抗癌剤との本発明のＷＥＥ１阻害剤とのさらなる組み合わせは、本発明の範囲内である。このような薬剤の例は、Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｖ．Ｔ．ＤｅｖｉｔａおよびＳ．Ｈｅｌｌｍａｎ（ｅｄｉｔｏｒｓ），６^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ １５，２００１），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓで見出され得る。当業者は、薬物および関与する癌の特定の特徴に基づいて、薬剤のどの組み合わせが有用であるかを識別することができる。このようなさらなる薬剤としては、次のもの：エストロゲン受容体修飾物質、アンドロゲン受容体修飾物質、レチノイド受容体修飾物質、細胞毒性／細胞分裂阻害剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤および他の血管形成阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、細胞増殖および生存シグナル伝達の阻害剤、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、ｓｉＲＮＡ療法、γ−セクレターゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤および細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤が挙げられる。本発明のｍＴＯＲ阻害剤およびαｖβ３インテグリンアンタゴニストの組み合わせは、放射線療法とともに同時投与される場合、特に有用であり得る。

【0108】

「エストロゲン受容体修飾物質」は、機序にかかわらず、受容体へのエストロゲンの結合を妨害または阻害する化合物を指す。エストロゲン受容体修飾物質の例としては、タモキシフェン、ラロキシフェン、イドキシフェン、ＬＹ３５３３８１、ＬＹ１１７０８１、トレミフェン、フルベストラント、４−［７−（２，２−ジメチル−１−オキソプロポキシ−４−メチル−２−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−イル］−フェニル−２，２−ジメチルプロパノエート、４，４’−ジヒドロキシベンゾフェノン−２，４−ジニトロフェニル−ヒドラゾンおよびＳＨ６４６が挙げられるが限定されない。

【0109】

「アンドロゲン受容体修飾物質」は、機序にかかわらず、受容体へのアンドロゲンの結合を妨害または阻害する化合物を指す。アンドロゲン受容体修飾物質の例としては、フィナステリドおよび他の５α−レダクターゼ阻害剤、ニルタミド、フルタミド、ビカルタミド、リアロゾールおよびアビラテロン酢酸エステルが挙げられる。

【0110】

「レチノイド受容体修飾物質」は、機序にかかわらず、受容体へのレチノイドの結合を妨害または阻害する化合物を指す。このようなレチノイド受容体修飾物質の例としては、ベキサロテン、トレチノイン、１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、α−ジフルオロメチルオルニチン、ＩＬＸ２３−７５５３、トランス−Ｎ−（４’−ヒドロキシフェニル）レチナミドおよびＮ−４−カルボキシフェニルレチナミドが挙げられる。

【0111】

「細胞毒性／細胞分裂阻害剤」は、アルキル化剤、腫瘍壊死因子、干渉物質、低酸素活性化可能な化合物、微小管阻害剤／微小管−安定化剤、有糸分裂キネシンの阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、有糸分裂進行に関与するキナーゼの阻害剤、増殖因子およびサイトカインシグナル伝達経路に関与するキナーゼの阻害剤、代謝拮抗剤、生体応答修飾因子、ホルモン／抗ホルモン治療薬、造血成長因子、モノクローナル抗体標的化治療薬、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤およびオーロラキナーゼ阻害剤を含む、主に細胞の機能を直接妨害することによって、細胞死を引き起こすかまたは細胞増殖を阻害するか、または細胞減数分裂（ｍｙｏｓｉｓ）を妨害もしくは阻害する化合物を指す。

【0112】

細胞毒性／細胞分裂阻害剤の例としては、セルテネフ（ｓｅｒｔｅｎｅｆ）、カケクチン、イホスファミド、タソネルミン、ロニダミン、カルボプラチン、アルトレタミン、プレドニムスチン、ジブロモズルシトール、ラニムスチン、ホテムスチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、テモゾロミド、ヘプタプラチン、エストラムスチン、トシル酸インプロスルファン、トロホスファミド、ニムスチン、塩化ジブロスピジウム、プミテパ、ロバプラチン、サトラプラチン、プロフィロマイシン、シスプラチン、イロフルベン、デキシホスファミド、シス−アミンジクロロ（２−メチル−ピリジン）白金、ベンジルグアニン、グルフォスファミド、ＧＰＸ１００、（トランス、トランス、トランス）−ビス−ミュー−（ヘキサン−１，６−ジアミン）−ミュー−［ジアミン−白金（ＩＩ）］ビス［ジアミン（クロロ）白金（ＩＩ）］テトラクロリド、ジアリジジニルスペルミン、三酸化ヒ素、１−（１１−ドデシルアミノ−１０−ヒドロキシウンデシル）−３，７−ジメチルキサンチン、ゾルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ビサントレン、ミトキサントロン、ピラルビシン、ピナフィド、バルルビシン、アムルビシン、アンチネオプラストン、３’−デアミノ−３’−モルホリノ−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン、アンナマイシン、ガラルビシン、エリナフィド、ＭＥＮ１０７５５、４−デメトキシ−３−デアミノ−３−アジリジニル−４−メチルスルホニル−ダウノルビシン（国際公開第００／５００３２号パンフレットを参照）、Ｒａｆキナーゼ阻害剤（Ｂａｙ４３−９００６など）およびｍＴＯＲ阻害剤、例えばリダホロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、シロリムスまたはラパマイシン−類似体などが挙げられるが限定されない。

【0113】

低酸素活性化化合物の例はチラパザミンである。

【0114】

プロテオソーム阻害剤の例としては、ラクタシスチンおよびＭＬＮ−３４１（ベルケイド）が挙げられるが限定されない。

【0115】

微小管阻害剤／微小管−安定化剤の例としては、パクリタキセル、ビンデシン硫酸塩、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビンカロイコブラスチン、ドセタキソール、リゾキシン、ドラスタチン、イセチオン酸ミボブリン、オーリスタチン、セマドチン、ＲＰＲ１０９８８１、ＢＭＳ１８４４７６、ビンフルニン、クリプトフィシン、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、アンヒドロビンブラスチン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−プロリン−ｔ−ブチルアミド、ＴＤＸ２５８、エポチロン（例えば米国特許第６，２８４，７８１号明細書および同第６，２８８，２３７号明細書を参照）およびＢＭＳ１８８７９７が挙げられる。実施形態において、エポチロンは、微小管阻害剤／微小管−安定化剤に含まれない。

【0116】

トポイソメラーゼ阻害剤のある例は、トポテカン、ヒカプタミン、イリノテカン、ルビテカン、６−エトキシプロピオニル−３’，４’−Ｏ−エキソ−ベンジリデン−シャールトルーシン、９−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−５−ニトロピラゾロ［３，４，５−ｋｌ］アクリジン−２−（６Ｈ）プロパンアミン、１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［デ］ピラノ［３’，４’：ｂ，７］−インドリジノ［１，２ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）ジオン、ラルトテカン、７−［２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル］−（２０Ｓ）カンプトテシン、ＢＮＰ１３５０、ＢＮＰＩ１１００、ＢＮ８０９１５、ＢＮ８０９４２、リン酸エトポシド、テニポシド、ソブゾキサン、２’−ジメチルアミノ−２’−デオキシ−エトポシド、ＧＬ３３１、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−９−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−６Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］カルバゾール−１−カルボキサミド、アスラクリン、（５ａ，５ａＢ，８ａａ，９ｂ）−９−［２−［Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］エチル］−５−［４−ヒドロオキシ−３，５−ジメトキシフェニル］−５，５ａ，６，８，８ａ，９−ヘキソヒドロフロ（３’，４’：６，７）ナフト（２，３−ｄ）−１，３−ジオキソール−６−オン、２，３−（メチレンジオキシ）−５−メチル−７−ヒドロキシ−８−メトキシベンゾ［ｃ］−フェナントリジニウム、６，９−ビス［（２−アミノエチル）アミノ］ベンゾ［ｇ］イソグイノリン（ｉｓｏｇｕｉｎｏｌｉｎｅ）−５，１０−ジオン、５−（３−アミノプロピルアミノ）−７，１０−ジヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチルアミノメチル）−６Ｈ−ピラゾロ［４，５，１−デ］アクリジン−６−オン、Ｎ−［１−［２（ジエチルアミノ）エチルアミノ］−７−メトキシ−９−オキソ−９Ｈ−チオキサンテン−４−イルメチル］ホルムアミド、Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）アクリジン−４−カルボキサミド、６−［［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オンおよびディメスナである。

【0117】

有糸分裂キネシン、特にヒト有糸分裂キネシンＫＳＰの阻害剤の例は、国際公開第２００３／０３９４６０号パンフレット、同第２００３／０５００６４号パンフレット、同第２００３／０５０１２２号パンフレット、同第２００３／０４９５２７号パンフレット、同第２００３／０４９６７９号パンフレット、同第２００３／０４９６７８号パンフレット、同第２００４／０３９７７４号パンフレット、同第２００３／０７９９７３号パンフレット、同第２００３／０９９２１１号パンフレット、同第２００３／１０５８５５号パンフレット、同第２００３／１０６４１７号パンフレット、同第２００４／０３７１７１号パンフレット、同第２００４／０５８１４８号パンフレット、同第２００４／０５８７００号パンフレット、同第２００４／１２６６９９号パンフレット、同第２００５／０１８６３８号パンフレット、同第２００５／０１９２０６号パンフレット、同第２００５／０１９２０５号パンフレット、同第２００５／０１８５４７号パンフレット、同第２００５／０１７１９０号パンフレット、米国特許出願公開第２００５／０１７６７７６号明細書に記載されている。実施形態において、有糸分裂キネシンの阻害剤としては、ＫＳＰの阻害剤、ＭＫＬＰ１の阻害剤、ＣＥＮＰ−Ｅの阻害剤、ＭＣＡＫの阻害剤およびＲａｂ６−ＫＩＦＬの阻害剤が挙げられるが限定されない。

【0118】

「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」の例としては、ＳＡＨＡ、ＴＳＡ、オキサムフラチン、ＰＸＤ１０１、ＭＧ９８およびスクリプタイドが挙げられるが限定されない。他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対するさらなる参照は、次の原稿；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００３，４６（２４）：５０９７−５１１６で見出され得る。

【0119】

「有糸分裂進行に関与するキナーゼの阻害剤」としては、オーロラキナーゼの阻害剤、ポロ様キナーゼの阻害剤（ＰＬＫ；特にＰＬＫ−１の阻害剤）、ｂｕｂ−１の阻害剤およびｂｕｂ−Ｒ１の阻害剤が挙げられるが限定されない。「オーロラキナーゼ阻害剤」の例はＶＸ−６８０である。

【0120】

「抗増殖剤」としては、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチド、例えばＧ３１３９、ＯＤＮ６９８、ＲＶＡＳＫＲＡＳ、ＧＥＭ２３１およびＩＮＸ３００１など、および代謝拮抗剤、例えばエノシタビン、カルモフール、テガフール、ペントスタチン、ドキシフルリジン、トリメトレキサート、フルダラビン、カペシタビン、ガロシタビン、シタラビン・オクホスファート、フォステアビン・ナトリウム（ｆｏｓｔｅａｂｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ）水和物、ラルチトレキセド、パルチトレキシド（ｐａｌｔｉｔｒｅｘｉｄ）、エミテフール（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、デシタビン、ノラトレキセド、ペメトレキセド、ネルザラビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン、２’−フルオロメチレン−２’−デオキシシチジン、Ｎ−［５−（２，３−ジヒドロ−ベンゾフリル）スルホニル］−Ｎ’−（３，４−ジクロロフェニル）尿素、Ｎ６−［４−デオキシ−４−［Ｎ２−［２（Ｅ），４（Ｅ）−テトラデカジエノイル］グリシルアミノ］−Ｌ−グリセロ−Ｂ−Ｌ−マンノ−ヘプトピラノシル］アデニン、アプリジン、エクテイナシジン、トロキサシタビン、４−［２−アミノ−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−ピリミジノ［５，４−ｂ］［１，４］チアジン−６−イル−（Ｓ）−エチル］−２，５−チエノイル−Ｌ−グルタミン酸、アミノプテリン、５−フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）、アラノシン、１１−アセチル−８−（カルバモイルオキシメチル）−４−ホルミル−６−メトキシ−１４−オキサ−１，１１−ジアザテトラシクロ（７．４．１．０．０）−テトラデカ−２，４，６−トリエン−９−イル酢酸エステル、スワインソニン、ロメテレキソール、デクスラゾキサン、メチオニナーゼ、２’−シアノ−２’−デオキシ−Ｎ４−パルミトイル−１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾンおよびトラスツズマブなどが挙げられる。

【0121】

モノクローナル抗体標的化治療薬の例としては、癌細胞特異的なまたは標的細胞特異的なモノクローナル抗体と連結される、細胞毒性剤または放射性同位体を有する治療薬が挙げられる。例としてはベキサールが挙げられる。

【0122】

「ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤」は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの阻害剤を指す。使用され得るＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の例としては、ロバスタチン（メバコール（ＭＥＶＡＣＯＲ）（登録商標）；米国特許第４，２３１，９３８号明細書、同第４，２９４，９２６号明細書および同第４，３１９，０３９号明細書を参照）、シンバスタチン（ゾコール（ＺＯＣＯＲ）（登録商標）；米国特許第４，４４４，７８４号明細書、同第４，８２０，８５０号明細書および同第４，９１６，２３９号明細書を参照）、プラバスタチン（プラバコール（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ）（登録商標）；米国特許第４，３４６，２２７号明細書、同第４，５３７，８５９号明細書、同第４，４１０，６２９号明細書、同第５，０３０，４４７号明細書および同第５，１８０，５８９号明細書を参照）、フルバスタチン（レスコール（ＬＥＳＣＯＬ）（登録商標）；米国特許第５，３５４，７７２号明細書、同第４，９１１，１６５号明細書、同第４，９２９，４３７号明細書、同第５，１８９，１６４号明細書、同第５，１１８，８５３号明細書、同第５，２９０，９４６号明細書および同第５，３５６，８９６号明細書を参照）、アトロバスタチン（リピトール（ＬＩＰＩＴＯＲ）（登録商標）；米国特許第５，２７３，９９５号明細書、同第４，６８１，８９３号明細書、同第５，４８９，６９１号明細書および同第５，３４２，９５２号明細書を参照）およびセリバスタチン（リバスタチンおよびバイコール（ＢＡＹＣＨＯＬ）（登録商標）としても知られる；米国特許第５，１７７，０８０号明細書を参照）が挙げられるが限定されない。本方法で使用され得るこれらおよびさらなるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の構造式は、Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ，Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｄｒｕｇｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，１９９６，ｐｐ．８５−８９の８７頁および米国特許第４，７８２，０８４号明細書および同第４，８８５，３１４号明細書に記載されている。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤という用語は、本明細書中で使用される場合、全ての医薬的に許容可能なラクトンおよびオープン−アシッド型（ｏｐｅｎ−ａｃｉｄ ｆｏｒｍ）（すなわちラクトン環が開いて遊離酸を形成している）ならびにＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害活性を有する化合物の塩およびエステル型を含み、したがってこのような塩、エステル、オープン−アシッド（ｏｐｅｎ−ａｃｉｄ）およびラクトン型の使用が本発明の範囲内に含まれる。

【0123】

「プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤」は、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ＦＰＴａｓｅ）、ゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩ型（ＧＧＰＴａｓｅ−Ｉ）およびゲラニルゲラニル−タンパク質トランスフェラーゼＩＩ型（ＧＧＰＴａｓｅ−ＩＩ、Ｒａｂ ＧＧＰＴａｓｅとも呼ばれる）を含むプレニル−タンパク質トランスフェラーゼ酵素のうち何らかの１つまたは何らかの組み合わせを阻害する化合物を指す。

【0124】

プレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤の例は、次の刊行物および特許：国際公開第９６／３０３４３号パンフレット、同第９７／１８８１３号パンフレット、同第９７／２１７０１号パンフレット、同第９７／２３４７８号パンフレット、同第９７／３８６６５号パンフレット、同第９８／２８９８０号パンフレット、同第９８／２９１１９号パンフレット、同第９５／３２９８７号パンフレット、米国特許第５，４２０，２４５号明細書、同第５，５２３，４３０号明細書、同第５，５３２，３５９号明細書、同第５，５１０，５１０号明細書、同第５，５８９，４８５号明細書、同第５，６０２，０９８号明細書、欧州特許公開第０６１８２２１号明細書、同第０６７５１１２号明細書、同第０６０４１８１号明細書、同第０６９６５９３号明細書、国際公開第９４／１９３５７号パンフレット、同第９５／０８５４２号パンフレット、同第９５／１１９１７号パンフレット、同第９５／１２６１２号パンフレット、同第９５／１２５７２号パンフレット、同第９５／１０５１４号パンフレット、米国特許第５，６６１，１５２号明細書、国際公開第９５／１０５１５号パンフレット、同第９５／１０５１６号パンフレット、同第９５／２４６１２号パンフレット、同第９５／３４５３５号パンフレット、同第９５／２５０８６号パンフレット、同第９６／０５５２９号パンフレット、同第９６／０６１３８号パンフレット、同第９６／０６１９３号パンフレット、同第９６／１６４４３号パンフレット、同第９６／２１７０１号パンフレット、同第９６／２１４５６号パンフレット、同第９６／２２２７８号パンフレット、同第９６／２４６１１号パンフレット、同第９６／２４６１２号パンフレット、同第９６／０５１６８号パンフレット、同第９６／０５１６９号パンフレット、同第９６／００７３６号パンフレット、米国特許第５，５７１，７９２号明細書、国際公開第９６／１７８６１号パンフレット、同第９６／３３１５９号パンフレット、同第９６／３４８５０号パンフレット、同第９６／３４８５１号パンフレット、同第９６／３００１７号パンフレット、同第９６／３００１８号パンフレット、同第９６／３０３６２号パンフレット、同第９６／３０３６３号パンフレット、同第９６／３１１１１号パンフレット、同第９６／３１４７７号パンフレット、同第９６／３１４７８号パンフレット、同第９６／３１５０１号パンフレット、同第９７／００２５２号パンフレット、同第９７／０３０４７号パンフレット、同第９７／０３０５０号パンフレット、同第９７／０４７８５号パンフレット、同第９７／０２９２０号パンフレット、同第９７／１７０７０号パンフレット、同第９７／２３４７８号パンフレット、同第９７／２６２４６号パンフレット、同第９７／３００５３号パンフレット、同第９７／４４３５０号パンフレット、同第９８／０２４３６号パンフレットおよび米国特許第５，５３２，３５９号明細書で見出すことができる。血管形成におけるプレニル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤の役割の例については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５（９）：１３９４−１４０１を参照。

【0125】

「血管形成阻害剤」は、機序にかかわらず、新しい血管の形成を阻害する化合物を指す。血管形成阻害剤の例としては、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばチロシンキナーゼ受容体Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ１）およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の阻害剤、上皮由来、線維芽細胞由来または血小板由来増殖因子の阻害剤、ＭＭＰ（マトリクスメタロプロテアーゼ）阻害剤、インテグリンブロッカー、インターフェロン−α、インターロイキン−１２、ポリ硫酸ペントサン、アスピリンおよびイブプロフェンのような非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）ならびにセレコキシブおよびロフェコキシブのような選択的シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を含む、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（ＰＮＡＳ，１９９２，８９：７３８４；ＪＮＣＩ，１９８２，６９：４７５；Ａｒｃｈ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．，１９９０，１０８：５７３；Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．，１９９４，２３８：６８；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９５，３７２：８３；Ｃｌｉｎ，Ｏｒｔｈｏｐ．，１９９５，３１３：７６；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９６，１６：０７；Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９７，７５：１０５；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９７，５７：１６２５；Ｃｅｌｌ，１９９８，９３：７０５；Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９８，２：７１５；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９．２７４：９１１６）、ステロイド系抗炎症剤（例えばコルチコステロイド、鉱質コルチコイド、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレッド、ベタメタゾンなど）、カルボキシアミドトリアゾール、コンブレタスタチンＡ−４、スクアラミン、６−Ｏ−クロロアセチル−カルボニル）−フマギロール、サリドマイド、アンジオスタチン、トロポニン−１、アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１９８５，１０５：１４１−１４５を参照）およびＶＥＧＦに対する抗体（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７：９６３−９６８を参照）；Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２：８４１−８４４；国際公開第２０００／４４７７７号パンフレット；および同第２０００／６１１８６号パンフレット）が挙げられるが限定されない。

【0126】

血管形成を調整または阻害し、本発明の化合物と組み合わせても使用され得る他の治療薬としては、凝固および線維素溶解系を調整するかまたは阻害する薬剤が挙げられる（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａ．Ｍｅｄ．，２０００，３８：６７９−６９２における概説を参照）。凝固および線維素溶解経路を調整または阻害するこのような薬剤の例としては、ヘパリン（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１９９８，８０：１０−２３を参照）、低分子量ヘパリンおよびカルボキシペプチダーゼＵ阻害剤（活性トロンビン活性化線維素溶解阻害剤［ＴＡＦＩａ］の阻害剤としても知られる）が挙げられるが限定されない（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．，２００１，１０１：３２９−３５４を参照）。ＴＡＦＩａ阻害剤は、国際公開第２００３／０１３５２６号パンフレットに記載されている。「細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤」は、細胞周期チェックポイントシグナルを伝達するタンパク質キナーゼを阻害し、それによって癌細胞をＤＮＡ損傷剤に対して感受性にする化合物を指す。このような薬剤としては、ＡＴＲ、ＡＴＭおよびＣＨＫ１キナーゼの阻害剤ならびにｃｄｋおよびｃｄｃキナーゼ阻害剤が挙げられ、具体的には、７−ヒドロキシ−スタウロスポリン、フラボピリドール、ＣＹＣ２０２（サイクラセル）およびＢＭＳ−３８７０３２により例示される。

【0127】

「受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を妨害する薬剤」は、ＲＴＫおよびしたがって発癌および腫瘍進行に関与する機序を阻害する化合物を指す。このような薬剤としては、ｃ−キット、Ｅｐｈ、ＰＤＧＦ、Ｆｌｔ３およびｃ−Ｍｅｔの阻害剤が挙げられる。さらなる薬剤としては、Ｂｕｍｅ−ＪｅｎｓｅｎおよびＨｕｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１：３５５−３６５により記載されるようなＲＴＫの阻害剤が挙げられる。

【0128】

「細胞増殖および生存シグナル伝達経路の阻害剤」は、細胞表面受容体のシグナル伝達カスケード下流を阻害する化合物を指す。このような薬剤としては、セリン／スレオニンキナーゼの阻害剤（国際公開第０２／０８３０６４号パンフレット、同第０２／０８３１３９号パンフレット、同第０２／０８３１４０号パンフレット、米国特許出願公開第２００４−０１１６４３２号明細書、国際公開第０２／０８３１３８号パンフレット、米国特許出願公開第２００４−０１０２３６０号明細書、国際公開第０３／０８６４０４号パンフレット、同第０３／０８６２７９号パンフレット、同第０３／０８６３９４号パンフレット、同第０３／０８４４７３号パンフレット、同第０３／０８６４０３号パンフレット、同第２００４／０４１１６２号パンフレット、同第２００４／０９６１３１号パンフレット、同第２００４／０９６１２９号パンフレット、同第２００４／０９６１３５号パンフレット、同第２００４／０９６１３０号パンフレット、同第２００５／１００３５６号パンフレット、同第２００５／１００３４４号パンフレット、米国特許出願公開第２００５／０２９９４１号明細書、同第２００５／４４２９４号明細書、同第２００５／４３３６１号明細書、国際公開第２００６／１３５６２７号パンフレット、同第２００６／０９１３９５号パンフレット、同第２００６／１１０６３８号パンフレットに記載のものなどのＡｋｔの阻害剤を含むが限定されない）、Ｒａｆキナーゼの阻害剤（例えばＢＡＹ−４３−９００６）、ＭＥＫの阻害剤（例えばＣＩ−１０４０およびＰＤ−０９８０５９）、ｍＴＯＲの阻害剤（例えばＷｙｅｔｈ ＣＣＩ−７７９）およびＰＩ３Ｋの阻害剤（例えばＬＹ２９４００２）が挙げられる。

【0129】

特異的な抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体としては、ダロツズマブ、フィギツムマブ、シクスツムマブ、ＳＨＣ７１７４５４、Ｒｏｃｈｅ Ｒ１５０７、ＥＭ１６４またはＡｍｇｅｎ ＡＭＧ４７９が挙げられるが限定されない。

【0130】

上記のように、ＮＳＡＩＤとの組み合わせは、強力なＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤの使用を対象とする。この明細書の目的のために、ＮＳＡＩＤは、細胞またはミクロソームアッセイによって測定される場合、ＣＯＸ−２の阻害に対して１μＭ以下のＩＣ_５０を保持する場合、強力である。

【0131】

本発明はまた、選択的なＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤとの組み合わせも包含する。この明細書の目的のために、選択的なＣＯＸ−２阻害剤であるＮＳＡＩＤは、細胞もしくはミクロソームアッセイにより評価されるＣＯＸ−２に対するＩＣ_５０とＣＯＸ−１に対するＩＣ_５０との比率により測定される場合、ＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２を少なくとも１００倍阻害することに対する特異性を保持するものとして定義される。このような化合物としては、全て参照により本明細書によって組み込まれる、米国特許第５，４７４，９９５号明細書、同第５，８６１，４１９号明細書、同第６，００１，８４３号明細書、同第６，０２０，３４３号明細書、同第５，４０９，９４４号明細書、同第５，４３６，２６５号明細書、同第５，５３６，７５２号明細書、同第５，５５０，１４２号明細書、同第５，６０４，２６０号明細書、同第５，６９８，５８４号明細書、同第５，７１０，１４０号明細書，国際公開第９４／１５９３２号パンフレット、米国特許第５，３４４，９９１号明細書、同第５，１３４，１４２号明細書、同第５，３８０，７３８号明細書、同第５，３９３，７９０号明細書、同第５，４６６，８２３号明細書、同第５，６３３，２７２号明細書および同第５，９３２，５９８号明細書で開示されるものが挙げられるが限定されない。

【0132】

処置の本方法において特に有用であるＣＯＸ−２の阻害剤は、３−フェニル−４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−２−（５Ｈ）−フラノン；および５−クロロ−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−（２−メチル−５−ピリジニル）ピリジンまたは医薬的に許容可能なその塩である。

【0133】

ＣＯＸ−２の特異的な阻害剤として記載されており、したがって、本発明において有用である化合物としては、次のもの：パレコキシブ、ベクストラ（ＢＥＸＴＲＡ）（登録商標）およびセレブレックス（ＣＥＬＥＢＲＥＸ）（登録商標）または医薬的に許容可能なその塩が挙げられるが限定されない。

【0134】

血管形成阻害剤の他の例としては、エンドスタチン、ウクライン、ランピルナーゼ、ＩＭ８６２、５−メトキシ−４−［２−メチル−３−（３−メチル−２−ブテニル）オキシラニル］−１−オキサスピロ［２，５］オクト−６−イル（クロロアセチル）カルバメート、アセチルジナナリン、５−アミノ−１−［［３，５−ジクロロ−４−（４−クロロベンゾイル）フェニル］メチル］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−カルボキサミド、ＣＭ１０１、スクアラミン、コンブレタスタチン、ＲＰＩ４６１０、ＮＸ３１８３８、硫酸化マンノペンタオースリン酸、７，７−（カルボニル−ビス［イミノ−Ｎ−メチル−４，２−ピロロカルボニルイミノ［Ｎ−メチル−４，２−ピロール］−カルボニルイミノ］−ビス−（１，３−ナフタレンジスルホネート）および３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）が挙げられるが限定されない。

【0135】

上記で使用される場合、「インテグリンブロッカー」は、α_ｖβ_３インテグリンへの生理学的リガンドの結合に選択的に拮抗するか、この結合を阻害するかまたはこの結合に対抗する化合物、αｖβ５インテグリンへの生理学的リガンドの結合に選択的に拮抗するか、この結合を阻害するかまたはこの結合に対抗する化合物、α_ｖβ_３インテグリンおよびα_ｖβ_５インテグリンの両方への生理学的リガンドの結合に拮抗するか、この結合を阻害するかまたはこの結合に対抗する化合物および毛細血管内皮細胞上で発現される特定の（１または複数の）インテグリンの活性に拮抗するか、この活性を阻害するかまたはこの活性に対抗する化合物を指す。この用語はまた、α_ｖβ_６、α_ｖβ_８、α_１β_１、α_２β_１、α_５β_１、α_６β_１およびα_６β_４インテグリンのアンタゴニストも指す。この用語はまた、α_ｖβ_３、α_ｖβ_５、α_ｖβ_６、α_ｖβ_８、α_１β_１、α_２β_１、α_５β_１、α_６β_１およびα_６β_４インテグリンのあらゆる組み合わせのアンタゴニストも指す。

【0136】

チロシンキナーゼ阻害剤のいくつかの具体的な例としては、Ｎ−（トリフルオロメチルフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−カルボキサミド、３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル）インドリン−２−オン、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−（３−クロロ−４−フルオロフェニルアミノ）−７−メトキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロポキシル］キナゾリン、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン、ＢＩＢＸ１３８２、２，３，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−１０−（ヒドロキシメチル）−１０−ヒドロキシ−９−メチル−９，１２−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］［１，６］ベンゾジアゾシン−１−オン、ＳＨ２６８、ゲニステイン、ＳＴＩ５７１、ＣＥＰ２５６３、４−（３−クロロフェニルアミノ）−５，６−ジメチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンメタンスルホネート、４−（３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、４−（４’−ヒドロキシフェニル）アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン、ＳＵ６６６８、ＳＴＩ５７１Ａ、Ｎ−４−クロロフェニル−４−（４−ピリジルメチル）−１−フタラジンアミンおよびＥＭＤ１２１９７４が挙げられる。

【0137】

抗癌化合物以外の化合物との組み合わせも本方法中に包含される。例えば、ＰＰＡＲ−γ（すなわちＰＰＡＲ−ガンマ）アゴニストおよびＰＰＡＲ−δ（すなわちＰＰＡＲ−デルタ）アゴニストとの、本発明のｍＴＯＲ阻害剤およびαｖβ３インテグリンアンタゴニストの組み合わせは、ある種の悪性腫瘍の処置において有用である。ＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−δは、核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γおよびδである。上皮細胞上でのＰＰＡＲ−γの発現および血管形成におけるその関与は、文献で報告されている（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９８，３１：９０９−９１３；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：９１１６−９１２１；Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２０００，４１：２３０９−２３１７を参照）。より最近、ＰＰＡＲ−γアゴニストは、インビトロでＶＥＧＦに対する血管形成反応を阻害することが示されており；トログリタゾンおよびマレイン酸ロシグリタゾンの両者とも、マウスにおける網膜血管新生の発生を阻害する（Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．，２００１；１１９：７０９−７１７）。ＰＰＡＲ−γアゴニストおよびＰＰＡＲ−γ／αアゴニストの例としては、チアゾリジンジオン（例えば、ＤＲＦ２７２５、ＣＳ−０１１、トログリタゾン、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾンなど）、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、ＧＷ２５７０、ＳＢ２１９９９４、ＡＲ−Ｈ０３９２４２、ＪＴＴ−５０１、ＭＣＣ−５５５、ＧＷ２３３１、ＧＷ４０９５４４、ＮＮ２３４４、ＫＲＰ２９７、ＮＰ０１１０、ＤＲＦ４１５８、ＮＮ６２２、ＧＩ２６２５７０、ＰＮＵ１８２７１６、ＤＲＦ５５２９２６、２−［（５，７−ジプロピル−３−トリフルオロメチル−１，２−ベンゾイソオキサゾール−６−イル）オキシ］−２−メチルプロピオン酸（ＵＳＳＮ０９／７８２，８５６で開示）および２（Ｒ）−７−（３−（２−クロロ−４−（４−フルオロフェノキシ）フェノキシ）プロポキシ）−２−エチルクロマン−２−カルボン酸（ＵＳＳＮ６０／２３５，７０８および６０／２４４，６９７にて開示）が挙げられるが限定されない。

【0138】

本発明の別の実施形態は、癌の処置のための遺伝子治療と組み合わせた現在開示されている化合物の使用である。癌を処置するための遺伝子ストラテジーの概観については、Ｈａｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９７，６１：７８５−７８９およびＫｕｆｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５ｔｈ Ｅｄ，Ｂ．Ｃ．Ｄｅｃｋｅｒ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，２０００，ｐｐ８７６−８８９を参照。何らかの腫瘍抑制遺伝子を送達するために、遺伝子治療が使用され得る。このような遺伝子の例としては、組み換えウイルス介在遺伝子移入を介して送達され得るｐ５３（米国特許第６，０６９，１３４号明細書を参照）、ｕＰＡ／ｕＰＡＲアンタゴニス（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９８，５（８）：１１０５−１３）およびインターフェロンガンマ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１６４：２１７−２２２）が挙げられるが限定されない。

【0139】

本発明の化合物はまた、固有の多剤耐性（ＭＤＲ）、特に輸送体タンパク質の高レベル発現を伴うＭＤＲの阻害剤と組み合わせて投与することもできる。このようなＭＤＲ阻害剤としては、ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の阻害剤、例えばＬＹ３３５９７９、ＸＲ９５７６、ＯＣ１４４−０９３、Ｒ１０１９２２、ＶＸ８５３およびＰＳＣ８３３（バルスポダール）などが挙げられる。

【0140】

本発明の化合物は、単独でのまたは放射線療法との本発明の化合物の使用の結果であり得る、急性、遅延性、後期および予期嘔吐を含め、吐き気または嘔吐を処置するための制吐剤と一緒に使用され得る。嘔吐の予防または処置のために、他の制吐剤、特に、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニスト、例えばオンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロンおよびザチセトロンなど、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニスト、例えばバクロフェンなど、コルチコステロイド、例えばデカドロン（デキサメタゾン）、ケナログ、アリストコート、ナサリド、プレフェリド、ベネコルテン（Ｂｅｎｅｃｏｒｔｅｎ）または他のもの、例えば米国特許第２，７８９，１１８号明細書、同第２，９９０，４０１号明細書、同第３，０４８，５８１号明細書、同第３，１２６，３７５号明細書、同第３，９２９，７６８号明細書、同第３，９９６，３５９号明細書、同第３，９２８，３２６号明細書および同第３，７４９，７１２号明細書で開示されるものなど、抗ドーパミン作動薬、例えばフェノチアジン（例えばプロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジンおよびメソリダジン）、メトクロプラミドまたはドロナビノールなどと一緒に本発明の化合物が使用され得る。別の実施形態において、ニューロキニン−１受容体アンタゴニスト、５ＨＴ３受容体アンタゴニストおよびコルチコステロイドから選択される制吐剤との併用療法が、本化合物の投与に対する結果であり得る嘔吐の処置または予防に対して開示される。

【0141】

本発明の化合物と併用した使用のニューロキニン−１受容体アンタゴニストは、例えば、米国特許第５，１６２，３３９号明細書、同第５，２３２，９２９号明細書、同第５，２４２，９３０号明細書、同第５，３７３，００３号明細書、同第５，３８７，５９５号明細書、同第５，４５９，２７０号明細書、同第５，４９４，９２６号明細書、同第５，４９６，８３３号明細書、同第５，６３７，６９９号明細書、同第５，７１９，１４７号明細書；欧州特許公開第０３６０３９０号明細書、同第０３９４９８９号明細書、同第０４２８４３４号明細書、同第０４２９３６６号明細書、同第０４３０７７１号明細書、同第０４３６３３４号明細書、同第０４４３１３２号明細書、同第０４８２５３９号明細書、同第０４９８０６９号明細書、同第０４９９３１３号明細書、同第０５１２９０１号明細書、同第０５１２９０２号明細書、同第０５１４２７３号明細書、同第０５１４２７４号明細書、同第０５１４２７５号明細書、同第０５１４２７６号明細書、同第０５１５６８１号明細書、同第０５１７５８９号明細書、同第０５２０５５５号明細書、同第０５２２８０８号明細書、同第０５２８４９５号明細書、同第０５３２４５６号明細書、同第０５３３２８０号明細書、同第０５３６８１７号明細書、同第０５４５４７８号明細書、同第０５５８１５６号明細書、同第０５７７３９４号明細書、同第０５８５９１３号明細書、０５９０１５２号明細書、同第０５９９５３８号明細書、同第０６１０７９３号明細書、同第０６３４４０２号明細書、同第０６８６６２９号明細書、同第０６９３４８９号明細書、同第０６９４５３５号明細書、同第０６９９６５５号明細書、同第０６９９６７４号明細書、同第０７０７００６号明細書、同第０７０８１０１号明細書、同第０７０９３７５号明細書、同第０７０９３７６号明細書、同第０７１４８９１号明細書、同第０７２３９５９号明細書、同第０７３３６３２号明細書および同第０７７６８９３号明細書；国際公開第９０／０５５２５号パンフレット、同第９０／０５７２９号パンフレット、同第９１／０９８４４号パンフレット、同第９１／１８８９９号パンフレット、同第９２／０１６８８号パンフレット、同第９２／０６０７９号パンフレット、同第９２／１２１５１号パンフレット、同第９２／１５５８５号パンフレット、同第９２／１７４４９号パンフレット、同第９２／２０６６１号パンフレット、同第９２／２０６７６号パンフレット、同第９２／２１６７７号パンフレット、同第９２／２２５６９号パンフレット、同第９３／００３３０号パンフレット、同第９３／００３３１号パンフレット、同第９３／０１１５９号パンフレット、同第９３／０１１６５号パンフレット、同第９３／０１１６９号パンフレット、同第９３／０１１７０号パンフレット、同第９３／０６０９９号パンフレット、同第９３／０９１１６号パンフレット、同第９３／１００７３号パンフレット、同第９３／１４０８４号パンフレット、同第９３／１４１１３号パンフレット、同第９３／１８０２３号パンフレット、同第９３／１９０６４号パンフレット、同第９３／２１１５５号パンフレット、同第９３／２１１８１号パンフレット、同第９３／２３３８０号パンフレット、同第９３／２４４６５号パンフレット、同第９４／００４４０号パンフレット、同第９４／０１４０２号パンフレット、同第９４／０２４６１号パンフレット、同第９４／０２５９５号パンフレット、同第９４／０３４２９号パンフレット、同第９４／０３４４５号パンフレット、同第９４／０４４９４号パンフレット、同第９４／０４４９６号パンフレット、同第９４／０５６２５号パンフレット、同第９４／０７８４３号パンフレット、同第９４／０８９９７号パンフレット、同第９４／１０１６５号パンフレット、同第９４／１０１６７号パンフレット、同第９４／１０１６８号パンフレット、同第９４／１０１７０号パンフレット、同第９４／１１３６８号パンフレット、同第９４／１３６３９号パンフレット、９４／１３６６３号パンフレット、同第９４／１４７６７号パンフレット、同第９４／１５９０３号パンフレット、同第９４／１９３２０号パンフレット、同第９４／１９３２３号パンフレット、同第９４／２０５００号パンフレット、同第９４／２６７３５号パンフレット、同第９４／２６７４０号パンフレット、同第９４／２９３０９号パンフレット、同第９５／０２５９５号パンフレット、同第９５／０４０４０号パンフレット、同第９５／０４０４２号パンフレット、同第９５／０６６４５号パンフレット、同第９５／０７８８６号パンフレット、同第９５／０７９０８号パンフレット、同第９５／０８５４９号パンフレット、同第９５／１１８８０号パンフレット、同第９５／１４０１７号パンフレット、同第９５／１５３１１号パンフレット、同第９５／１６６７９号パンフレット、同第９５／１７３８２号パンフレット、同第９５／１８１２４号パンフレット、同第９５／１８１２９号パンフレット、同第９５／１９３４４号パンフレット、同第９５／２０５７５号パンフレット、同第９５／２１８１９号パンフレット、同第９５／２２５２５号パンフレット、同第９５／２３７９８号パンフレット、同第９５／２６３３８号パンフレット、同第９５／２８４１８号パンフレット、同第９５／３０６７４号パンフレット、同第９５／３０６８７号パンフレット、同第９５／３３７４４号パンフレット、同第９６／０５１８１号パンフレット、同第９６／０５１９３号パンフレット、同第９６／０５２０３号パンフレット、同第９６／０６０９４号パンフレット、同第９６／０７６４９号パンフレット、同第９６／１０５６２号パンフレット、同第９６／１６９３９号パンフレット、同第９６／１８６４３号パンフレット、同第９６／２０１９７号パンフレット、同第９６／２１６６１号パンフレット、同第９６／２９３０４号パンフレット、同第９６／２９３１７号パンフレット、同第９６／２９３２６号パンフレット、同第９６／２９３２８号パンフレット、同第９６／３１２１４号パンフレット、同第９６／３２３８５号パンフレット、同第９６／３７４８９号パンフレット、同第９７／０１５５３号パンフレット、同第９７／０１５５４号パンフレット、同第９７／０３０６６号パンフレット、同第９７／０８１４４号パンフレット、同第９７／１４６７１号パンフレット、同第９７／１７３６２号パンフレット、同第９７／１８２０６号パンフレット、同第９７／１９０８４号パンフレット、同第９７／１９９４２号パンフレットおよび同第９７／２１７０２号パンフレット；および英国特許公開第２２６６５２９号明細書、同第２２６８９３１号明細書、同第２２６９１７０号明細書、同第２２６９５９０号明細書、同第２２７１７７４号明細書、同第２２９２１４４号明細書、同第２２９３１６８号明細書、同第２２９３１６９号明細書および同第２３０２６８９号明細書で完全に記載されている。このような化合物の調製は、参照により本明細書中に組み込まれる上述の特許および刊行物に完全に記載されている。

【0142】

実施形態において、本発明の化合物との併用での使用のためのニューロキニン−１受容体アンタゴニストは、米国特許第５，７１９，１４７号明細書に記載される、２−（Ｒ）−（１−（Ｒ）−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）エトキシ）−３−（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−４−（３−（５−オキソ−１Ｈ，４Ｈ−１，２，４−トリアゾロ）メチル）モルホリンまたは医薬的に許容可能なその塩から選択される。

【0143】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、貧血の処置において有用な薬剤とともに投与することもできる。このような貧血治療剤は、例えば、持続性赤血球産生受容体活性化因子（エポエチンアルファなど）である。

【0144】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、好中球減少症の処置において有用な薬剤とともに投与することもできる。このような好中球減少症処置剤は、例えば、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、（Ｇ−ＣＳＦ）などの好中球の産生および機能を制御する造血成長因子である。Ｇ−ＣＳＦの例としては、フィルグラスチムが挙げられる。

【0145】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、レバミソール、イソプリノシンおよびザダキシンなどの免疫促進薬とともに投与することもできる。

【0146】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、ビスホスホネート（ビスホスホネート、ジホスホネート、ビスホスホン酸およびジホスホン酸を含むものと理解される）と組み合わせて、骨癌を含む癌を処置または予防するためにも有用であり得る。ビスホスホネートの例としては、エチドロネート（ジドロネル（Ｄｉｄｒｏｎｅｌ））、パミドロネート（アレディア（Ａｒｅｄｉａ））、アレンドロネート（ホサマックス（Ｆｏｓａｍａｘ））、リセドロネート（アクトネル（Ａｃｔｏｎｅｌ））、ゾレドロネート（ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ））、イバンドロネート（ボニバ（Ｂｏｎｉｖａ））、インカドロネートもしくはシマドロネート、クロドロネート、ＥＢ−１０５３、ミノドロネート、ネリドロネート、ピリドロネートおよびチルドロネートおよび何れかまたは全ての、それらの医薬的に許容可能な塩、誘導体、水和物および混合物が挙げられるが限定されない。

【0147】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、アロマターゼ阻害剤と組み合わせて乳癌を処置または予防するためにも有用であり得る。アロマターゼ阻害剤の例としては、アナストロゾール、レトロゾールおよびエキセメスタンが挙げられるが限定されない。

【0148】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、ｓｉＲＮＡ療法と組み合わせた癌の処置または予防のためにも有用であり得る。

【0149】

本発明のＷＥＥ１阻害剤は、γ−セクレターゼ阻害剤および／またはＮＯＴＣＨシグナル伝達の阻害剤と組み合わせて投与することもできる。このような阻害剤としては、国際公開第０１／９００８４号パンフレット、同第０２／３０９１２号パンフレット、同第０１／７０６７７号パンフレット、同第０３／０１３５０６号パンフレット、同第０２／３６５５５号パンフレット、同第０３／０９３２５２号パンフレット、同第０３／０９３２６４号パンフレット、同第０３／０９３２５１号パンフレット、同第０３／０９３２５３号パンフレット、同第２００４／０３９８００号パンフレット、同第２００４／０３９３７０号パンフレット、同第２００５／０３０７３１号パンフレット、同第２００５／０１４５５３号パンフレット、米国特許出願第１０／９５７，２５１号明細書、国際公開第２００４／０８９９１１号パンフレット、同第０２／０８１４３５号パンフレット、同第０２／０８１４３３号パンフレット、同第０３／０１８５４３号パンフレット、同第２００４／０３１１３７号パンフレット、同第２００４／０３１１３９号パンフレット、同第２００４／０３１１３８号パンフレット、同第２００４／１０１５３８号パンフレット、同第２００４／１０１５３９号パンフレットおよび同第０２／４７６７１号パンフレット（ＬＹ−４５０１３９を含む）に記載の化合物が挙げられる。

【0150】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、Ａｋｔの阻害剤と組み合わせた癌の処置または予防のためにも有用であり得る。このような阻害剤としては、次の刊行物：国際公開第０２／０８３０６４号パンフレット、同第０２／０８３１３９号パンフレット、同第０２／０８３１４０号パンフレット、米国特許出願公開第２００４−０１１６４３２号明細書、国際公開第０２／０８３１３８号パンフレット、米国特許出願公開第２００４−０１０２３６０号明細書、国際公開第０３／０８６４０４号パンフレット、同第０３／０８６２７９号パンフレット、同第０３／０８６３９４号パンフレット、同第０３／０８４４７３号パンフレット、同第０３／０８６４０３号パンフレット、同第２００４／０４１１６２号パンフレット、同第２００４／０９６１３１号パンフレット、同第２００４／０９６１２９号パンフレット、同第２００４／０９６１３５号パンフレット、同第２００４／０９６１３０号パンフレット、同第２００５／１００３５６号パンフレット、同第２００５／１００３４４号パンフレット、米国特許出願公開第２００５／０２９９４１号明細書、同第２００５／４４２９４号明細書、同第２００５／４３３６１号明細書、国際公開第２００６／１３５６２７号パンフレット、同第２００６０９１３９５号パンフレット、同第２００６／１１０６３８号パンフレット）に記載の化合物が挙げられるが限定されない。

【0151】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、ＰＡＲＰ阻害剤と組み合わせた癌の処置または予防のためにも有用であり得る。

【0152】

放射線療法それ自体は、癌の処置の分野での通常の方法を意味する。放射線療法に対して、Ｘ線、γ線、中性子線、電子ビーム、陽子ビームなどの様々な放射線；および線源を使用可能である。最も一般的な放射線療法においては、外部放射、γ線での放射のために、線形加速器が使用される。

【0153】

本発明のＷＥＥ１阻害剤はまた、次の治療薬とさらに組み合わせて癌を処置するためにも有用であり得る：アバレリックス（プレナキシス・デポー（Ｐｌｅｎａｘｉｓ ｄｅｐｏｔ）（登録商標））；アビラテロン酢酸エステル（ジティガ（Ｚｙｔｉｇａ）（登録商標））；（アクティック（Ａｃｔｉｑ）（登録商標））；アルデスロイキン（プロカイン（Ｐｒｏｋｉｎｅ）（登録商標））；アルデスロイキン（プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）（登録商標））；アレムツズマブ（キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）（登録商標））；アルフゾシンＨＣｌ（ウロキサトラル（ＵｒｏＸａｔｒａｌ）（登録商標））；アリトレチノイン（パンレチン（Ｐａｎｒｅｔｉｎ）（登録商標））；アロプリノール（ザイロプリム（Ｚｙｌｏｐｒｉｍ）（登録商標））；アルトレタミン（ヘキサレン（Ｈｅｘａｌｅｎ）（登録商標））；アミフォスチン（エチオール（Ｅｔｈｙｏｌ）（登録商標））；アナストロゾール（アリミデックス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）（登録商標））；（アンゼメット（Ａｎｚｅｍｅｔ）（登録商標））；（アネクシア（Ａｎｅｘｓｉａ）（登録商標））；アプレピタント（エメンド（Ｅｍｅｎｄ）（登録商標））；三酸化ヒ素（トリセノックス（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ）（登録商標））；アスパラギナーゼ（エルスパル（Ｅｌｓｐａｒ）（登録商標））；アザシチジン（ビダザ（Ｖｉｄａｚａ）（登録商標））；ベンダムスチン塩酸塩（トレアンダ（Ｔｒｅａｎｄａ）（登録商標））；ベバクジマブ（ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））；ベキサロテン・カプセル（タルグレチン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）（登録商標））；ベキサロテン・ゲル（タルグレチン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）（登録商標））；ブレオマイシン（ブレノキサン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）（登録商標））；ボルテゾミブ（ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）（登録商標））；（ブロフェナク（Ｂｒｏｆｅｎａｃ）（登録商標））；ブスルファン・静注（ブスルフレックス（Ｂｕｓｕｌｆｌｅｘ）（登録商標））；ブスルファン・経口（マイレラン（Ｍｙｌｅｒａｎ）（登録商標））；カバジタキセル（ジェブタナ（Ｊｅｖｔａｎａ）（登録商標））；カルステロン（メトサーブ（Ｍｅｔｈｏｓａｒｂ）（登録商標））；カペシタビン（ゼローダ（Ｘｅｌｏｄａ）（登録商標））；カルボプラチン（パラプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）（登録商標））；カルムスチン（ＢＣＮＵ（登録商標）、ＢｉＣＮＵ（登録商標））；カルムスチン（グリアデル（Ｇｌｉａｄｅｌ）（登録商標））；インプラント型ポリフェプロサン２０とのカルムスチン（グリアデル・ウエファー（Ｇｌｉａｄｅｌ Ｗａｆｅｒ）（登録商標））；セレコキシブ（セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（登録商標））；セツキシマブ（アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（登録商標））；クロランブシル（ロイケラン（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）（登録商標））；シナカルセット（センシパール（Ｓｅｎｓｉｐａｒ）（登録商標））；シスプラチン（プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）（登録商標））；クラドリビン（ロイスタチン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）（登録商標）、２−ＣｄＡ（登録商標））；クロファラビン（クロラール（Ｃｌｏｌａｒ）（登録商標））；シクロホスファミド（サイトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ）（登録商標）、ネオサール（Ｎｅｏｓａｒ）（登録商標））；シクロホスファミド（サイトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ）注射用（登録商標））；シクロホスファミド（サイトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ）錠（登録商標））；シタラビン（サイトサール−Ｕ（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ）（登録商標））；リポソーム化シタラビン（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））；ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ（コスメゲン（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ）（登録商標））；ダルベポエチン・アルファ（アラネスプ（Ａｒａｎｅｓｐ）（登録商標））；ダサチニブ（スプリセル（ｓｐｒｙｃｅｌ）（登録商標））；リポソーム化ダウノルビシン（ダヌオキソーム（ＤａｎｕｏＸｏｍｅ）（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）（登録商標））；ダウノルビシン、ダウノマイシン（セルビジン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）（登録商標））；デシタビン（ダコジェン（Ｄａｃｏｇｅｎ）（登録商標））；デガレリクス（デガレリクス（Ｄｅｇａｒｅｌｉｘ）（登録商標））；デニロイキン・ディフチトクス（オンタック（Ｏｎｔａｋ）（登録商標））；デノスマブ（Ｘゲバ（Ｘｇｅｖａ）（登録商標））；デクスラゾキサン（ザインカード（Ｚｉｎｅｃａｒｄ）（登録商標））；ドセタキセル（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシンＰＦＳ（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ）（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）（登録商標）、ルベックス（Ｒｕｂｅｘ）（登録商標））；ドキソルビシン（アドリアマイシンＰＦＳ注射用（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ＰＦＳ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（登録商標））；リポソーム化ドキソルビシン（ドキシル（Ｄｏｘｉｌ）（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（ドロモスタノロン（Ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）（登録商標））；プロピオン酸ドロモスタノロン（マステロン注射用（Ｍａｓｔｅｒｏｎｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（登録商標））；エリオットのＢ溶液（エリオットのＢ溶液（Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ Ｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（登録商標））；エピルビシン（エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）（登録商標））；エポエチン・アルファ（エポジェン（ｅｐｏｇｅｎ）（登録商標））；エリブリンメシル酸塩（ハラベン（Ｈａｌａｖｅｎ）（登録商標））；エルロチニブ（タルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）（登録商標））；エストラムスチン（エムシット（Ｅｍｃｙｔ）（登録商標））；エトポシドリン酸塩（エトポフォス（Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ）（登録商標））；エトポシド、ＶＰ−１６（ベペシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ）（登録商標））；エベロリムス（アフィニトール（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）（登録商標））；エキセメスタン（アロマシン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）（登録商標））；フェンタニルバッカル錠（オンソリス（Ｏｎｓｏｌｉｓ）（登録商標））；フェンタニルクエン酸塩（フェントラ（Ｆｅｎｔｏｒａ）（登録商標））；フェンタニル舌下錠（アブストラル（Ａｂｓｔｒａｌ）（登録商標））；フィルグラスチム（ノイポゲン（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）（登録商標））；フロクスウリジン（動脈内）（ＦＵＤＲ（登録商標））；フルダラビン（フルダラ（Ｆｌｕｄａｒａ）（登録商標））；フルオロウラシル、５−ＦＵ（アドルシル（Ａｄｒｕｃｉｌ）（登録商標））；フルタミド（オイレキシン（Ｅｕｌｅｘｉｎ）（登録商標））；フルベストラント（ファスロデックス（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）（登録商標））；ゲフィチニブ（イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（登録商標））；ゲムシタビン（ジェムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（登録商標））；ゲムツズマブ・オゾガマイシン（マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標））；ゴセレリン酢酸塩（ゾラデックス・インプラント（Ｚｏｌａｄｅｘ Ｉｍｐｌａｎｔ）（登録商標））；ゴセレリン酢酸塩（ゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）（登録商標））；グラニセトロン（カイトリル溶液（Ｋｙｔｒｉｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（登録商標））（サンキューソ（Ｓａｎｃｕｓｏ）（登録商標））；ヒストレリン酢酸塩（ヒストレリン・インプラント（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ ｉｍｐｌａｎｔ）（登録商標））；ヒトパピローマウイルス二価ワクチン（セルバリックス（Ｃｅｒｖａｒｉｘ）（登録商標））；ヒドロキシウレア（ハイドレア（Ｈｙｄｒｅａ）（登録商標））；イブリツモマブ・チウキセタン（ゼヴァリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（登録商標））；イダルビシン（イダマイシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ）（登録商標））；イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））；メシル酸イマチニブ（グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（登録商標））；インターフェロンアルファ２ａ（ロフェロンＡ（Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ）（登録商標））；インターフェロンアルファ−２ｂ（イントロンＡ（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）（登録商標））；イピリムマブ（ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）（登録商標））；イリノテカン（カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）（登録商標））；（カディアン（Ｋａｄｉａｎ）（登録商標））；イキサベピロン（イキセンプラ（Ｉｘｅｍｐｒａ）（登録商標））；ラパチニブ（タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ）（登録商標））；レナリドミド（レブリミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）（登録商標））；レトロゾール（フェマーラ（Ｆｅｍａｒａ）（登録商標））；ロイコボリン（ウェルコボリン（Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ）（登録商標）、ロイコボリン（Ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）（登録商標））；酢酸ロイプロリド（エリガード（Ｅｌｉｇａｒｄ）（登録商標））；（ルプロン デポー（Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ）（登録商標））；（ビアドゥア（Ｖｉａｄｕｒ）（登録商標））；レバミゾール（エルガミゾール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）（登録商標））；レボルコボリン（フシレブ（Ｆｕｓｉｌｅｖ）（登録商標））；ロムスチン、ＣＣＮＵ（ＣｅｅＢＵ（登録商標））；メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード（マスタルゲン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）（登録商標））；酢酸メゲストロール（メゲース（Ｍｅｇａｃｅ）（登録商標））；メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ（アルケラン（Ａｌｋｅｒａｎ）（登録商標））；メルカプトプリン、６−ＭＰ（プリネトール（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）（登録商標））；メスナ（メスネックス（Ｍｅｓｎｅｘ）（登録商標））；メスナ（メスネックス錠（Ｍｅｓｎｅｘ ｔａｂｓ）（登録商標））；メトトレキサート（メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）（登録商標））；メトキサレン（ウヴァデクス（Ｕｖａｄｅｘ）（登録商標））；マイトマイシンＣ（ミュータマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）（登録商標））；マイトマイシン Ｃ（ミトザイトレックス（Ｍｉｔｏｚｙｔｒｅｘ）（登録商標））；ミトタン（リソドレン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ）（登録商標））；ミトキサントロン（ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）（登録商標））；フェンプロピオン酸ナンドロロン（デュラボリン−５０（Ｄｕｒａｂｏｌｉｎ−５０）（登録商標））；ネララビン（アラノン（Ａｒｒａｎｏｎ）（登録商標））；ニロチニブ塩酸塩一水和物（タシグナ（Ｔａｓｉｇｎａ）（登録商標））；ノフェツモマブ（ヴァールマ（Ｖｅｒｌｕｍａ）（登録商標））；オファツムマブ（アルゼラ（Ａｒｚｅｒｒａ）（登録商標））；オンダンセトロン（ズプレンズ（Ｚｕｐｌｅｎｚ）（登録商標））；オプレルベキン（ニューメガ（Ｎｅｕｍｅｇａ）（登録商標））；（ニューポジェン（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）（登録商標））；オキサリプラチン（エロキサチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）（登録商標））；パクリタキセル（パクセン（Ｐａｘｅｎｅ）（登録商標））；パクリタキセル（タキソール（Ｔａｘｏｌ）（登録商標））；パクリタキセル・タンパク質結合粒子（アブラキサン（Ａｂｒａｘａｎｅ）（登録商標））；パリフェルミン（ケピバンス（Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ）（登録商標））；パロノセトロン（アロキシ（Ａｌｏｘｉ）（登録商標））；パミドロネート（アレディア（Ａｒｅｄｉａ）（登録商標））；パニツムマブ（ベクチビックス（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）（登録商標））；パゾパニブ（ボトリエント（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）（登録商標））；ペグアデマーゼ（アダジェン（Ａｄａｇｅｎ）（ウシ・ペグアデマーゼ（Ｐｅｇａｄｅｍａｓｅ Ｂｏｖｉｎｅ））（登録商標））；ペグアスパラガーゼ（オンキャスパー（Ｏｎｃａｓｐａｒ）（登録商標））；ペグフィルグラスチム（ニューラスタ（Ｎｅｕｌａｓｔａ）（登録商標））；ペグインターフェロンアルファ−２Ｂ（シラトロン（Ｓｙｌａｔｒｏｎ）（登録商標））；ペメトレキセド２ナトリウム（アリムタ（Ａｌｉｍｔａ）（登録商標））；ペントスタチン（ナイペント（Ｎｉｐｅｎｔ）（登録商標））；ピポブロマン（バーサイト（Ｖｅｒｃｙｔｅ）（登録商標））；プレリキサフォル注射用（モゾビル（Ｍｏｚｏｂｉｌ）（登
録商標））；プリカマイシン、ミトラマイシン（ミトラシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）（登録商標））；ポルフィマーナトリウム（ホトフリン（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）（登録商標））；プララトレキサート注射用（ホロチン（Ｆｏｌｏｔｙｎ）（登録商標））；プロカルバジン（マツラン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）（登録商標））；クアドラメット（Ｑｕａｄｒａｍｅｔ）（登録商標））；４価ヒトパピローマウイルス（６、１１、１６、１８型）組み換えワクチン（ガーダシル（Ｇａｒｄａｓｉｌ）（登録商標））；キナクリン（アタブリン（Ａｔａｂｒｉｎｅ）（登録商標））；ラロキシフェン塩酸塩（エビスタ（Ｅｖｉｓｔａ）（登録商標））；ラスブリカーゼ（エリテック（Ｅｌｉｔｅｋ）（登録商標））；リツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標））；ロミデプシン（イソトダックス（Ｉｓｔｏｄａｘ）（登録商標））；サルグラモスチン（リューカイン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）（登録商標））；サルグラモスチン（プロカイン（Ｐｒｏｋｉｎｅ）（登録商標））；セクレチン（セクレフロー（ＳｅｃｒｅＦｌｏ）（登録商標））；シプリューセル−Ｔ（プロベンジ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）（登録商標））；ソラフェニブ（ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（登録商標））；ストレプトゾシン（ザノサール（Ｚａｎｏｓａｒ）（登録商標））；スニチニブ・マレイン酸塩（スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（登録商標））；タルク（スクレロゾール（Ｓｃｌｅｒｏｓｏｌ）（登録商標））；タモキシフェン（ノルバデックス（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）（登録商標））；テモゾロミド（テモダール（Ｔｅｍｏｄａｒ）（登録商標））；テムシロリムス（トーリセル（Ｔｏｒｉｓｅｌ）（登録商標））；テニポシド、ＶＭ−２６（ヴァモン（Ｖｕｍｏｎ）（登録商標））；（テモダール（Ｔｅｍｏｄａｒ）（登録商標））；テストラクトン（テスラク（Ｔｅｓｌａｃ）（登録商標））；サリドマイド（サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））；チオグアニン、６−ＴＧ（チオグアニン（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）（登録商標））；チオテパ（チオプレックス（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）（登録商標））；トポテカン（ハイカムチン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）（登録商標））；トレミフェン（フェアストン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）（登録商標））；トシツモマブ（ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）（登録商標））；トシツモマブ／Ｉ−１３１トシツモマブ（ベキサール（Ｂｅｘｘａｒ）（登録商標））；トラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標））；（トレルスター・エル・エー（Ｔｒｅｌｓｔａｒ ＬＡ）（登録商標））；トレチノイン、ＡＴＲＡ（ベサノイド（Ｖｅｓａｎｏｉｄ）（登録商標））；パモ酸トリプトレリン（トレルスター・デポ（Ｔｒｅｌｓｔａｒ Ｄｅｐｏｔ）（登録商標））；（ウルトラジェクト（ＵｌｔｒａＪｅｃｔ）（登録商標））；ウラシル・マスタード（ウラシル・マスタード・カプセル（Ｕｒａｃｉｌ Ｍｕｓｔａｒｄ Ｃａｐｓｕｌｅｓ）（登録商標））；バルルビシン（バルスター（Ｖａｌｓｔａｒ）（登録商標））；バンデタニブ（バンデタニブ（Ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）（登録商標））；ビンブラスチン（ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（登録商標））；ビンクリスチン（オンコビン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）（登録商標））；ビノレルビン（ナベルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）（登録商標））；ボリノスタット（ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ）（登録商標））；（ゾフラン ＯＤＴ）（Ｚｏｆｒａｎ ＯＤＴ）（登録商標））；およびゾレドロネート（ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ）（登録商標））。

【0154】

特定される全ての特許、刊行物および係属中の特許出願は参照により本明細書によって組み込まれる。

【0155】

［実施例］
［実施例１］
ＷＥＥ１−１の調製

【化3】

【0156】

２−アリル−１−［６−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−２−イル］−６−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アミノ｝−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−オンの生成
段階１）２−（６−ブロモ−２−ピリジニル）−２−プロパノールの生成：
窒素雰囲気中で、８．７２ｇのメチル６−ブロモピリジン−２−カルボキシレートの３００ｍＬのジエチルエーテル溶液に３０ｍＬの３Ｍメチルマグネシウムヨージド／ジエチルエーテルを添加した。反応液に水および２Ｎ塩酸を添加し、酢酸エチルで抽出した。これを炭酸水素ナトリウム飽和水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で留去して、粗製２−（６−ブロモ−２−ピリジニル）−２−プロパノールを黄色の油状物質として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．５６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．０Ｈｚ），７．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．０Ｈｚ），１．５５（６Ｈ，ｓ）。ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ２１６，２１８。

【0157】

段階２）２−アリル−１−［６−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−２−ピリジニル］−６−（メチルチオ）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−オンの生成：
調製例１−１と同じようにして表題の化合物を得たが、調製例１−１で使用される２−ヨードピリジンの代わりに上記反応で得た化合物を使用した。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．９５（１Ｈ，ｓ），７．９１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．０Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．１，１０．２，６．３Ｈｚ），５．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．２，１．０Ｈｚ），４．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．１，１．２Ｈｚ），４．８１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．５９（４Ｈ，ｓ），１．５９（６Ｈ，ｓ）。ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋：３５８。

【0158】

段階３）２−アリル−１−［６−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−２−イル］−６−｛［４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニル］アミノ｝−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−オンの生成：
１．１０ｇの上記生成物のトルエン（２０ｍＬ）溶液に８１７ｍｇのｍ−クロロ過安息香酸（＞６５％）を添加し、２０分間撹拌した。１．６１ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよび７０６ｍｇの４−（４−メチルピペラジン−１−イル）アニリンを反応液に添加し、一晩撹拌した。炭酸水素ナトリウム飽和水溶液を反応液に添加し、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去し、塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１から０／１、酢酸エチル／エタノール＝９８／２）を通じて残渣を精製した。濃縮後、これを酢酸エチルから再結晶化して、黄色の固形物として表題の化合物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．８３（１Ｈ，ｓ），７．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．０，７．８Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４９（１Ｈ，ｂｒｓ），７．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），６．９３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），５．７０（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．２，１０．０，６．５Ｈｚ），５．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ），４．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），４．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．２６（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），２．７３（４Ｈ，ｂｒｓ），２．４４（３Ｈ，ｓ），１．５９（６Ｈ，ｓ）。ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ５０１。

【0159】

［調製例１−１］
２−アリル−６−（メチルチオ）−１−ピリジン−２−イル−３Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−オンの生成：
４．４４ｇの２−アリル−６−（メチルチオ）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−オン、３．８０ｇのヨウ化銅（Ｉ）、５．３３ｇの２−ヨードピリジンおよび３．８０ｇの炭酸カリウムの１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）溶液に２．４ｍＬのＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンを添加し、９５℃で一晩撹拌した。反応液を冷却し、それにアンモニア水を添加し、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で留去し、酢酸エチルを用いて結晶化して、白色の固形物として表題の化合物を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．９４（１Ｈ，ｓ），８．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），７．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），７．２９−７．２５（１Ｈ，ｍ），５．６８（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．０，１０．２，６．３Ｈｚ），５．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ），４．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．５８（３Ｈ，ｓ）。

【0160】

［実施例２］
ＷＥＥ１−２の調製

【化4】

【0161】

３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−イミノ−７−［（２’−メチル−２’，３’−ジヒドロ−１’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］−７’−イル）アミノ］−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンの生成
調製例２−１で得られた１．５ｇの７−クロロ−３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−イミノ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンの１−ブタノール溶液、調製例２−２で得られた１ｇの２’−メチル−２’，３’−ジヒドロ−１’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］−７’−アミンおよび０．８３ｇのｐ−トルエンスルホン酸一水和物を９０℃で１５分間撹拌した。反応液を冷却し、クロロホルムで希釈し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液および次いで飽和食塩水で有機層を洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、溶媒を留去した。このようにして得て、粗精製した生成物を塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィーに通して精製し、３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−イミノ−７−［（２’−メチル−２’，３’−ジヒドロ−１’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］−７’−イル）アミノ］−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンを得た。クロロホルム／メタノールの混合溶媒中でこれを溶解し、１．５当量の塩酸水溶液をそれに添加し、室温で５分間撹拌した。次に、溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルで洗浄して、３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−イミノ−７−［（２’−メチル−２’，３’−ジヒドロ−１’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］−７’−イル）アミノ］−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オン二塩酸塩を黄色の固形物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１１．８３（１Ｈ，ｂｒｓ），１０．０５（１Ｈ，ｂｒｓ），９．１０（１Ｈ，ｓ），８．８８（１Ｈ，ｓ），７．７９−７．６８（１Ｈ，ｍ），７．６３−７．５９（２Ｈ，ｍ），７．４７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），３．５９（２Ｈ，ｓ），２．４４（２Ｈ，ｓ），２．３２（３Ｈ，ｓ），０．９０−０．８１（４Ｈ，ｍ）ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ ４９４
［調製例２−１］

【化5】

【0162】

７−クロロ−３−（２，６−ジクロロフェニル）−４−イミノ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−２（１Ｈ）−オンの生成
３．０ｇの４−アミノ−２−クロロピリミジン−５−カルボニトリルのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３５ｍＬ）溶液に１．１２ｇの水素化ナトリウムを添加し、室温で５分間撹拌した。４．３８ｇの２，６−ジクロロフェニルイソシアネートを反応液に添加し、室温で１時間撹拌した。酢酸エチルおよび１Ｎ塩酸水溶液を反応溶液に添加し、有機層を分離した。これを飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を留去した。沈殿した固形物をメタノール／酢酸エチルの混合溶媒で凝固させ、ろ過を通じて取り出して、表題の化合物を白色固形物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．３３（１Ｈ，ｓ），７．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］３４２
［調製例２−２］
２’−メチル−２’，３’−ジヒドロ−１’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］−７’−アミンの生成

【化6】

【0163】

段階１）メチル１−（２−シアノフェニル）シクロプロパンカルボキシレートの生成：
１．５ｇの臭化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、６．５ｇの１，２−ジブロモエタンおよび２０ｍＬの５０％水酸化ナトリウム水溶液を４．０ｇのメチル２−シアノフェニルアセテートのトルエン（４０ｍＬ）溶液に添加し、室温で１時間撹拌した。反応液に水を添加し、酢酸エチルで抽出した。この有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）を通じて粗製生成物を精製し、表題の化合物を無色の化合物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．６６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．６，１．２Ｈｚ），７．５５（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．６，１．２Ｈｚ），７．４３−７．３６（２Ｈ，ｍ），３．６６（３Ｈ，ｓ），１．８２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），１．３０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝３．７Ｈｚ）
ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］２０２

【化7】

【0164】

段階２）メチル１−［２−（アミノメチル）フェニル］シクロプロパンカルボキシレート一塩酸塩の生成：
上記の反応段階１）で得られた２．９５ｇの化合物のエタノール（５０ｍＬ）溶液に、１．６ｇの１０％パラジウム−炭素を添加し、２気圧下、室温にて３時間、水素雰囲気中で撹拌した。ろ過を通じてパラジウム−炭素を除去し、ろ液を減圧下で濃縮し、粗製生成物をジエチルエーテルで洗浄して、表題の化合物を無色の固形物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．４７（２Ｈ，ｓ），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．３８（３Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．２，２．１Ｈｚ），７．３６−７．２９（２Ｈ，ｍ），４．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），３．５４（３Ｈ，ｓ），１．６１−１．５６（２Ｈ，ｍ），１．３３−１．２９（２Ｈ，ｍ）ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］２０６

【化8】

【0165】

段階３）１’，２’−ジヒドロ−３’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］−３’−オンの生成
上記反応段階２）で得られた３．２ｇの化合物のメタノール（５０ｍＬ）溶液に４ｍＬの５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、室温で３０分間撹拌した。１Ｎ塩酸水溶液をこれに添加してこれを中和し、減圧下でメタノールを留去した。残渣を水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。この有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を留去して、表題の化合物を無色の固形物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．２３（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．８，１．１Ｈｚ），７．１８（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．３，１．１Ｈｚ），７．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．３，１．０Ｈｚ），６．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．０Ｈｚ），４．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），１．８５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），１．２４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝３．７Ｈｚ）ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］１７４

【化9】

【0166】

段階４）７’−ニトロ−１’，２’−ジヒドロ−３’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］−３’−オンの生成：
上記反応３）で得られた２．１ｇの化合物の硫酸（６０ｍＬ）溶液に１．３ｇの硝酸カリウムを５分間かけて徐々に添加し、室温で１０分間さらに撹拌した。反応液を氷水に注ぎ、沈殿した結晶をろ過により取って、水で洗浄して表題の化合物を黄色の固形物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：８．０９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ），８．０１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），６．８６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．３０（１Ｈ，ｓ），４．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），２．０１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），１．３５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝４．１Ｈｚ）ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］２１９

【化10】

【0167】

段階５）７’−ニトロ−１’，２’−ジヒドロ−３’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］の生成：
氷で冷却しながら、１．３ｇの水素化ホウ素ナトリウムのテトラヒドロフラン懸濁液に、６．３ｇの三フッ化ホウ素−ジエチルエーテル錯体を添加し、１時間撹拌した。この反応液に、上記反応段階４）で得られた２．４ｇの化合物のテトラ−ヒドロフラン（１００ｍｌ）溶液を添加し、還流下で２時間加熱した。反応液を冷却し、次いで重炭酸ナトリウム飽和水溶液で中和した。溶媒を減圧下で留去し、残渣をエタノール中で溶解し、５Ｎ塩酸をそれに添加し、還流下で１時間加熱した。反応液を冷却し、次いで溶媒を減圧下で留去し、残渣を炭酸カリウム水溶液で中和した。水層をクロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下で留去して表題の化合物を得た。ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］２０５

【化11】

【0168】

段階６）２’−メチル−７’−ニトロ−２’，３’−ジヒドロ−１’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］の生成：
上記反応段階５）で得られた化合物（２．３ｇ）のメタノール（５０ｍＬ）溶液、２．７ｍＬの３７％ホルムアルデヒド水溶液および０．７ｍＬの酢酸に、１．５ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、室温で１５時間撹拌した。反応液を重炭酸ナトリウム飽和水溶液で中和し、メタノールを減圧下で留去した。残渣を水で希釈し、クロロホルムで３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）を通じて粗製生成物を精製して、表題の化合物を無色の固形物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ），７．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），３．７７（２Ｈ，ｓ），２．５７（２Ｈ，ｓ），２．４８（３Ｈ，ｓ），１．１６−１．１２（２Ｈ，ｍ），１．１０−１．０６（２Ｈ，ｍ）ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］２１９

【化12】

【0169】

段階７）２’−メチル−２’，３’−ジヒドロ−１’Ｈ−スピロ［シクロプロパン−１，４’−イソキノリン］−７’−アミンの生成：
上記の反応段階６）で得られた１．７ｇの化合物のエタノール（２０ｍＬ）溶液に、８００ｍｇの１０％パラジウム−炭素を添加し、１気圧下、室温にて１５時間、水素雰囲気中で撹拌した。ろ過を通じてパラジウム−炭素を除去し、ろ液を減圧下で濃縮し、塩基性シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）を通じて粗製生成物を精製して、表題の化合物を無色の固形物として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：６．５０−６．４８（２Ｈ，ｍ），６．３８−６．３６（１Ｈ，ｍ），３．６１（２Ｈ，ｓ），３．５０（２Ｈ，ｓ），２．４９（２Ｈ，ｓ），２．４２（３Ｈ，ｓ），０．９１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３，４．６Ｈｚ），０．８１（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．３，４．６Ｈｚ）ＥＳＩ−ＭＳ実測：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］１８９
［実施例３］
一般的材料および方法：
Ａ．細胞培養、増殖アッセイおよびＭＹＴ１ ｓｉＲＮＡノックダウン
細胞株ベンダー（ＡＴＣＣ）により推奨される培地中で全ての癌細胞株を増殖させた。組織培養培地、血清および補助剤はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。増殖アッセイスクリーン（図１）の場合、３８４ウェル組織培養プレートにおいて細胞を播種し、化合物またはビヒクル処理下で増殖させた。９６時間後、製造者のプロトコールに従い、およその細胞含量までＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した。試料を３つ組で操作し、ビヒクル処理対照ウェルに対する被処理試料のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ未処理値として増殖を計算した。

【0170】

ノックダウン試験に対して、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＫＮＳ６２という２種類の非小細胞肺癌細胞株、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡに対して、非ターゲティング対照またはＰＫＭＹＴ１配列の何れかを有するｓｉＲＮＡプール（ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて遺伝子移入した。９６ウェル組織培養プレートにおいて、遺伝子移入から４８時間後に細胞を播種し、翌日、これらを７２時間にわたり化合物またはビヒクルで処理した。およその細胞含量に対して、製造者のプロトコールに従い、ＶｉａＬｉｇｈｔ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。試料を３つ組で操作し、各処理に対する対照未処理値の％を決定することによって増殖を計算した。

【0171】

Ｂ．ウエスタンブロッティング
哺乳動物タンパク質抽出試薬（ＭＰＥＲ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ７８５０５，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で細胞を溶解し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜上に転写した。ウエスタンブロッティングのために使用される抗体は、次の起源由来である：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの、総ＣＤＫ１、ｐＣＤＫ１^Ｙ１５、ｐＣＤＫ１^Ｔ１４、ｐＣＨＫ１^Ｓ３４５、ｐＳｔａｔｈｍｉｎ^Ｓ３８、ｐＬａｍｉｎＡ／Ｃ^Ｓ２２、ｐＣＤＫ基質モチーフ、γＨ２ＡＸ、サイクリンＡおよび総ＰＫＭＹＴ１；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）からのアクチン−ＨＲＰ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｗａｕｋｅｓｈａ，ＷＩ）からの二次ＨＲＰ−結合抗マウスおよびウサギ抗体。ブロットをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｐｉｅｒｃｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に曝露した。

【0172】

Ｃ．フローサイトメトリー
ＤＮＡ２本鎖切断を検出するために、氷冷７０％エタノール中で一晩固定した後、ＦＩＴＣ−結合抗γＨ２ＡＸ（Ｓ１３９）抗体（キット１７−３４４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で細胞を染色し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）／ＲＮａｓｅ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して総ＤＮＡ含量を検出した。早期有糸分裂を調べる試験に対して、抗ｐＨＨ３−Ａｌｅｘａ６４７抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５８２１７）を添加した。

【0173】

同期化試験に対して、血清不含培地中で細胞を３６時間温置し、続いて２０％ＦＢＳを補充した。各回収の１時間前に、細胞に１０μＭブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を瞬間適用した。細胞を固定し、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）ＦＩＴＣ ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）での説明書に従い、抗ＢｒｄＵ ＦＩＴＣ−結合抗体および７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）色素でそれぞれＢｒｄＵおよびＤＮＡ含量について染色した。ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いてＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター上で全てのサイトメトリーデータを回収し、ＦｌｏｗＪｏバージョン７．５において結果を分析した。

【0174】

Ｄ．インビボ有効性試験
５から６週齢のＣＤ−１ Ｎｕ／Ｎｕ雌マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）から入手して、出願者らの動物飼育施設で標準的な実験室条件で飼育し、２０１８Ｓオートクレーブ可能餌（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および水を自由に摂取させた。プロトコールは、出願者らの社内動物飼育および使用委員会により承認された。マウスに細胞（１：１ マトリゲル：ＰＢＳ）を右側腹部の皮下に（ＳＣ）接種した。腫瘍体積が２００ｍｍ^３（＋／−５０）に達したら、マウスをペアマッチし、各群が同様の平均および標準偏差を有するようにした。隔週で腫瘍体積および体重を記録した。マウスは、２日間にわたり１日２回の投与（ＢＩＤ）の４回の処置サイクルを受け、ビヒクルまたはＷＥＥ１−１（６０ｍｐｋ）の何れかを受けた。

【0175】

［実施例４］
ＷＥＥ１の阻害は、多種多様な腫瘍細胞株において細胞増殖を崩壊させる。
遺伝子標的化を通じたマウスにおけるＷＥＥ１発現の喪失は致死的であり、胚が胚盤胞段階にさえ到達しないうちに（初期胚第３．５日）、発生が中断される。この表現型は、胚におけるアポトーシスおよび早期有糸分裂ならびにＷＥＥ１遺伝子を欠くマウス胚線維芽細胞でのＤＮＡ損傷により引き起こされる（Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００６，２（４）：１６１−１７０）。さらに、ＷＥＥ１のＲＮＡｉ−介在性のサイレンシングは、多くの形質転換ヒト細胞株での生存能不良につながる。ＷＥＥ１−１は、ＷＥＥ１の強力なＡＴＰ−競合性阻害剤であり、外因性ＤＮＡ損傷に対して癌細胞を感受性にする（Ｈｉｒａｉ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２００９，８（１１）：２９９２−３０００）。出願者らは、多岐に及ぶヒト腫瘍細胞株にわたり、ＷＥＥ１の薬理学的阻害の効果を調べるために、この低分子阻害剤を使用した（図１）。

【0176】

１６種類の異なる腫瘍型に相当する５２２種類の癌の株を細胞増殖アッセイでＷＥＥ１−１を用いてスクリーニングしたところ、多様な反応が観察された（図１）。ＥＣ_５０値は、試験した細胞株について、２％（９／５２２）で≦０．１μＭから１９％（９８／５２２）で≧１μＭの範囲であった。異なる腫瘍型の平均ＥＣ_５０値を比較したところ、群として、ＷＥＥ１−１処置に対して、結直腸癌細胞株はより感受性が低く（平均ＥＣ_５０＝１．１６μＭ、ｎ＝６６、０．１７から＞１０μＭの範囲）、神経芽腫腫瘍細胞株は、平均でより感受性が高い（平均ＥＣ_５０＝０．２８μＭ、ｎ＝７、０．１２から０．４５μＭの範囲）ことが明らかになった。後者の群の試料サイズは限定されていたが、神経芽腫細胞がＷＥＥ１阻害に対してより反応性がある傾向があるという知見は、最近の知見と一致する（Ｒｕｓｓｅｌｌら、原稿投稿中）。多くの細胞株が、より高い濃度のＷＥＥ１−１が存在しても増殖し、分裂し続けることは、重要であった。これらのデータは、薬理学的ＷＥＥ１阻害の抗増殖効力および体液腫瘍細胞株間の多様性を明らかにした。

【0177】

［実施例５］
ＷＥＥ１阻害はＤＮＡ損傷反応を活性化する。
機能性ゲノムスクリーニングおよび有効性確認研究から、ＷＥＥ１のノックダウンが、ＤＮＡ２本鎖切断およびＤＮＡ損傷反応（ＤＤＲ）の活性化につながることが明らかになった。出願者らは、ＷＥＥ１−１に対する感度が様々である６種類の細胞株においてＷＥＥ１の薬理学的阻害の効果を調べるために、活性化ＤＤＲのマーカーとしてｐＣＨＫ１^Ｓ３４５を使用した：ＥＳ−２（ＥＣ_５０＝２５６ｎＭ）、Ａ２０５８（ＥＣ_５０＝２２５ｎＭ）、Ａ４３１（ＥＣ_５０＝１７０ｎＭ）、Ａ４２７（ＥＣ_５０＝１１６ｎＭ）、ＫＮＳ６２（ＥＣ_５０＝４８７ｎＭ）およびＮＣＩ−Ｈ４６０（ＥＣ_５０＝５３５ｎＭ）。ｐＣＨＫ１^Ｓ３４５に対するウエスタンブロットから、全６種類の細胞株におけるＤＤＲの用量依存的活性化およびより感受性が高い細胞株、すなわちＥＳ−２、Ａ２０５８、Ａ４３１およびＡ４２７では５０ｎＭ ＷＥＥ１−１という低い濃度でｐＣＨＫ１^Ｓ３４５が上昇する証拠が明らかになった（図２Ａ）。ＷＥＥ１−１処理の結果としてのＣＤＫ活性上昇がＥＳ−２細胞で確認された（図８Ａ）。予想されるように、付随するｐＣＤＫ１^Ｙ１５の用量依存的減少も全ての６種類の細胞株で観察され、これにより、ＤＤＲの誘導とＷＥＥ１阻害の結果としてのＣＤＫ活性上昇との間の関連が与えられた。ＰＫＭＹＴ１によるＴ１４でのＣＤＫ１およびＣＤＫ２のリン酸化はまた、ＣＤＫ１／２キナーゼ活性を損なわせることも知られており、ＷＥＥ１−１は、インビトロでＷＥＥ１を阻害するのに必要とされる濃度のおよそ１００倍高い濃度でＰＫＭＹＴ１を阻害する（Ｈｉｒａｉ，Ｈ．ら、２００９）。出願者らは、ｐＣＤＫ１^Ｔ１４レベルが、ＤＮＡ損傷を誘導するＷＥＥ１−１濃度により影響を受けるか否かという疑問を持った。Ａ４２７細胞株の可能性を除いて、出願者らはｐＣＤＫ１^Ｔ１４でのＷＥＥ１−１−依存性効果を観察しなかった（図２Ａ）。

【0178】

［実施例６］
ＷＥＥ１阻害は、Ｓ期ダイナミクスおよびＤＮＡ複製の完全性を崩壊させる。
ＷＥＥ１−１−依存性ＤＮＡ損傷がどこで起こるかを理解するために、出願者らは、フローサイトメトリーによってＴＯＶ２１Ｇ卵巣癌細胞を分析した。指数関数的に増殖するＴＯＶ２１Ｇ細胞において、１％から２％の集団が、ＤＮＡ２本鎖切断マーカーγＨ２ＡＸに対して陽性に染色された。しかし、ＷＥＥ１−１での２時間という短い処理の結果、２３％の細胞がγＨ２ＡＸに対して陽性染色された（図２Ｂ、左パネル）。γＨ２ＡＸ陽性細胞の染色体含量は＞２Ｎであり、このことから、ＷＥＥ１阻害から生じたＤＮＡ損傷が、Ｓ期のＤＮＡ複製中またはその開始後に発生することが示唆された。ＴＯＶ２１Ｇ細胞をＷＥＥ１−１で処理し、ＢｒｄＵでパルス標識した場合、ＢｒｄＵ−陽性細胞でほぼ独占的にＤＮＡ損傷が検出され（２時間で９５％、６時間で９２％）、これにより、ＤＮＡ２本鎖切断がＤＮＡ複製中のＷＥＥ１阻害の結果であるという出願者らの観察が裏付けられる（図２Ｂ、右パネル）。

【0179】

Ｓ期の染色体切断は、ＤＮＡ複製チェックポイントを活性化し、Ｓ期を通じた進行を遅延させると予想された。この予想を確認するために、細胞同期化試験を行った。ＥＳ−２細胞株は血清飢餓時にマイトジェン休止により誘導されるＧ１同期化に他の細胞株よりも影響を受け易かったので（データは示さない）、これらの試験のために、ＥＳ−２細胞株を選択した。Ｓ期同期化に対する他のアプローチ（例えば二重チミジン遮断、アフィディコリン、ヒドロキシウレア、アクチノマイシンＤなど）は、これらの方法が独立にＤＮＡ損傷を誘導し、ＤＮＡ複製のダイナミクスに悪影響を及ぼし得るので、利用しなかった。図３Ａで示されるように、３６時間にわたる血清除去は、ＥＳ−２細胞をＧ１において完全には停止させなかった。しかし、２０％ＦＢＳの添加によって、ビヒクル処理したＥＳ−２細胞のＳ期集団を８時間までに約４０％倍増させ、１２から１４時間までに５０％でピークとなった。対照的に、２０％ＦＢＳの添加とともにＷＥＥ１−１処理が含まれた場合、８時間までにＳ期集団で検出可能な変化はなく、ピークレベル（約５０％）はＦＢＳ後２４時間まで遅延した（図３Ａ）。そのピークでさえも、取り込まれたＢｒｄＵの平均蛍光強度は、ビヒクル処理細胞と比較した場合、ＷＥＥ１−１でかなり低く、これにより、ＢｒｄＵ陽性集団でのＤＮＡ複製の遅延が示唆された。図３Ａで与えられるウエスタンブロット分析によって、ビヒクル処理細胞と比較した、Ｓ期進行遅延（サイクリンＡ）、ＤＤＲのより迅速でロバストな活性化（ｐＣＨＫ１^Ｓ３４５）およびＷＥＥ１−１処理におけるＷＥＥ１キナーゼ活性の阻害（ｐＣＤＫ１^Ｙ１５）が確認された。興味深いことに、ＥＳ−２細胞においてｐＣＤＫ１^Ｙ１５のリン酸化が２４時間にわたり増加した。ＷＥＥ１−１処理２４時間までに誘導されたＤＮＡ２本鎖切断（γＨ２ＡＸ）の程度は、マイトジェン刺激の条件下でかなり大きく、再刺激されなかった細胞と比較した場合、ＤＮＡ複製の鋭い増加が観察された（図３Ｂおよび図９）。

【0180】

［実施例７］
ＷＥＥ１阻害の主な細胞毒性の結果としてのＤＮＡ損傷
それぞれ細胞周期のＳおよびＧ２期におけるＣＤＫ２およびＣＤＫ１キナーゼ両方の一時的活性化のためにＷＥＥ１が必要とされる。したがってＷＥＥ１の阻害は、Ｓ期欠損（ＤＮＡ複製中のＤＮＡ２本鎖切断）およびＧ２−Ｍ欠損（早期有糸分裂）につながると予想された。これらの効果の何れかまたは両方がＷＥＥ１−１に対する感受性に必要であるかまたは十分であるか否かを評価するために、ＷＥＥ１−１の細胞毒性（ＥＣ_９０濃度で、３種類の感受性細胞株、Ａ２０５８、ＨＴ−２９およびＬｏＶｏにおいて、有糸分裂のマーカーである、γＨ２ＡＸおよびリン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）を調べた。ＷＥＥ１−１での処置の２４時間後、ｐＨＨ３陽性細胞の％が全ての３種類の細胞株で上昇した（図４）。３種類の株のうち、ＨＴ−２９細胞のみが実質的な有糸分裂集団を含有し、４Ｎ ＤＮＡが４３％であり、＜４Ｎ ＤＮＡが２３％であり、このことから、Ｓ期細胞からの早期有糸分裂がＤＮＡ複製を完遂しなかったことが示される。しかし、ＷＥＥ１−１処理後、実質的なＨ２ＡＸ−陽性細胞集団が全ての３種類の細胞株で観察された（Ａ２０５８で８％、ＨＴ−２９で５９％、ＬｏＶｏで２７％）。理論により束縛されることを望むものではないが、これらのデータから、早期有糸分裂（ｐＨＨ３）ではなくＤＮＡ２本鎖切断の誘導（γＨ２ＡＸ）が、感受性細胞株におけるＷＥＥ１−１によるＷＥＥ１阻害の主要な細胞毒性的結果であったことが示唆される。

【0181】

［実施例８］
ＷＥＥ１阻害からのインビボでの抗腫瘍活性
耐容用量でのインビボでの腫瘍成長におけるＷＥＥ１−１単剤療法の効果を調べるために、最大耐容用量（ＭＴＤ）を１日２回（ＢＩＤ）投与に対して６０ｍｇ／ｋｇとした。この用量およびスケジュールでの一連の２８日間の試験にわたり、平均体重減少は、処置群で５％を超えなかった（データは示さない）。ＷＥＥ１−１は、低濃度でＡ４２７非小細胞肺癌細胞株において増殖を阻害し（ＥＣ_５０＝１１６ｎＭ）、ＤＮＡ損傷反応を容易に誘導した（図２Ａ）。Ａ４２７異種移植モデルにおいて、ＷＥＥ１−１処理によって、最初の平均腫瘍体積のおよそ５０％への退縮が起こった（図５Ａ）。個々の腫瘍分析から、１０個のビヒクル処理Ａ４２７腫瘍のうち９個が、それらの出発体積の２から６倍成長したことが示された（図５Ｂ）。対照的に、全１０個のＷＥＥ１−１処理腫瘍に対する最終体積は、それらの最初の体積よりも小さかった（図５Ｂ）。ＷＥＥ１−１単剤療法の抗腫瘍成長効果がさらなる異種移植モデルで観察され（図５Ｃ）：腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）は、ＳＫ−ＭＥＳ−１ ＮＳＣＬＣモデルで９２％、ＬｏＶｏ結直腸腫瘍モデルで１３％腫瘍退縮、Ａ４３１類表皮腫瘍モデルで８８％ＴＧＩ、およびＮＣＩ−Ｈ２１２２ ＮＳＣＬＣモデルで６４％ＴＧＩであった。ΔＴ＞０である場合、１００−（１００＊ΔＴ／ΔＣ）として％ＴＧＩを計算した（ΔＴ＝処理群の最終平均体積−最初の平均体積およびΔＣ＝ビヒクル対照群の最終平均体積−最初の平均体積）。まとめると、これらのデータから、耐容性良好なＷＥＥ１−１用量でのＷＥＥ１阻害の抗腫瘍処置の可能性が明らかとなった。

【0182】

［実施例９］
ＰＫＭＹＴ１発現は、ＷＥＥ１阻害剤に対する感受性に影響を及ぼした。
ＷＥＥ１発現は、胚の生存能に必須であり（Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｙ．ら、２００６）、スクリーニングされた癌細胞株の大部分が、ＷＥＥ１−１での処理に対して少なくともある程度の感受性を示す（図１）。しかし、全ての細胞株がＷＥＥ１阻害に対して同じように影響を受け易い訳ではなく、抗増殖性ＥＣ_５０は少なくとも１０倍の範囲であった（図１）。出願者らは、本明細書中で、ＷＥＥ１阻害に対する感受性の決定因子候補は、機能的に関連するＣＤＫ−阻害キナーゼ、ＰＫＭＹＴ１の活性であることを見出した。２つのＮ末端部位、Ｔ１４またはＹ１５の何れかでのＣＤＫ１またはＣＤＫ２のリン酸化は、さもなければ活性化サイクリン結合パートナー（それぞれサイクリンＢまたはサイクリンＡ）の存在にもかかわらず、このキナーゼの不活性化を引き起こした。ＷＥＥ１は、ＣＤＫ１およびＣＤＫ２のＹ１５をリン酸化することが知られており、ＰＫＭＹＴ１は、Ｔ１４および／またはＹ１５でのリン酸化を通じてＣＤＫ１およびＣＤＫ２を同様に阻害することが示されている（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２７０（５２３３）：８６−９０）。

【0183】

出願者らは、本明細書中で、ＰＫＭＹＴ１発現が、２種類の細胞株、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＫＮＳ６２でＷＥＥ１阻害への反応を特異的に変化させ得るか否かを評価するために、ｓｉＲＮＡノックダウンを使用した。これらの株は、ＷＥＥ１−１処理に対して比較的非感受性を示し、ＰＫＭＹＴ１の発現が比較的高いために、選択された（データは示さない）。細胞に対して、全てＰＫＭＹＴ１を標的とする４種類の個々のｓｉＲＮＡのプールを用いて遺伝子移入を行い、様々な細胞毒性剤に対する感受性について増殖アッセイにおいて分析した（図６Ａ）。図６Ａで示されるように、ＰＫＭＹＴ１をノックダウンした場合、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ｎ＝３）およびＫＮＳ６２（ｎ＝２）に対するＷＥＥ１−１抗増殖ＥＣ_５０は、それぞれ６７７ｎＭから１０４ｎＭおよび４８７ｎＭから９３ｎＭにシフトした。特に、ＰＫＭＹＴ１欠乏は、ＷＥＥ１−１処理の最大効果に影響を及ぼさなかった。増強効果の目安として、ＥＣ_５０の倍単位の変化を用いて、ＰＫＭＹＴ１は、ＷＥＥ１−１をＮＣＩ−Ｈ４６０細胞（ｎ＝３）において平均で４．７倍、ＫＮＳ６２細胞（ｎ＝２）において４．９倍増強させた。対照（ＣＴ）およびカルボプラチン、ＭＥＫ阻害剤（ＰＤ−０３２５９０１）またはドキソルビシンで処理したＰＫＭＹＴ１ ｓｉＲＮＡ遺伝子移入細胞の両方での同一の用量反応曲線によって、ＷＥＥ１−１に対するＰＫＭＹＴ１−依存性感受性向上の特異性を確認した（図６Ａ）。ＫＮＳ６２細胞のウエスタンブロット分析（図６Ｂ）から、ＰＫＭＹＴ１ノックダウンの結果、Ｙ１５においてＣＤＫ１および２の基底リン酸化が僅かに低くなり、Ｔ１４において基底リン酸化が顕著に低下したことが示された（レーン９とレーン１および５）。ＰＫＭＹＴ１のノックダウンはまた、ｐＣＨＫ１^Ｓ３４５およびγＨ２ＡＸの両方の全体的増加にもつながる。これは、ＤＮＡ損傷の結果、ＷＥＥ１−１−介在性細胞毒性が起こり（図４Ａおよび４Ｂ）、ＰＫＭＹＴ１ノックダウンがＷＥＥ１−１に対する感受性およびその抗増殖効果を向上させたという観察と一致した（図６Ｂ）。

【0184】

ＰＫＭＹＴ１ノックダウンがＷＥＥ１−１に対する感受性向上につながるという点において、出願者らは、低ＰＫＭＹＴ１発現がまた、最もＷＥＥ１−１反応性である細胞株の予測となり得るという仮説を立てた。この仮説を確証するために、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）およびＮｏｖａｒｔｉｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）およびそのＧｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ｓｔｒａｎｓｋｙ，Ｂ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４８３：６０３−８０７）の間の共同研究である、公開されている細胞株データベースであるＢｒｏａｄ−Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）を用いて、ＰＫＭＹＴ１ ｍＲＮＡレベルに対する５２２種類の細胞株パネルを評価した。ＷＥＥ１−１に対する感受性についてアッセイした５２２種類の癌細胞株のうち、ＰＫＭＹＴ１に対する発現データが３０５種類の株に対して利用可能であった。４５０ｎＭのＷＥＥ１−１での観察された細胞株反応データに対するＣＣＬＥデータベースからの相対的ＰＫＭＹＴ１発現のプロットから、ＰＫＭＹＴ１ ｍＲＮＡとＷＥＥ１−１感受性との間の相関関係は明らかにならなかった（図７Ａ）。しかし、４５０ｎＭのＷＥＥ１−１で処理した場合に死滅した３３種類の細胞株のうち２４種類（７３％）（調整スケールで反応＜０．２５、これは図７Ａで点線により示される）は、平均発現レベル、すなわちＰＫＭＹＴ１ ｍＲＮＡに対して４１３±１５４未満であった。

【0185】

ＰＫＭＹＴ１発現がＷＥＥ１−１感受性の予測となったという仮説をさらに試験するために、以前にＷＥＥ１−１で処理したことのないＣＣＬＥデータベースから１３種類のさらなる細胞株を選択した。これらの１３種類の細胞株におけるＷＥＥ１−１に対する抗増殖ＥＣ_５０値は、ＰＫＭＹＴ１のｍＲＮＡ発現（図７Ｂ、左パネル）およびタンパク質レベル（図７Ｂ、右パネル）の両方と相関した。まとめると、これらのデータは、低ＰＫＭＹＴ１発現が、ＷＥＥ１−１反応性細胞株、すなわちＷＥＥ１−１での処理に対する感受性を予測したという仮説を裏付ける。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】