特許 6291721 微生物の検査方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6291721

(24)【登録日】2018年2月23日

(45)【発行日】2018年3月14日

(54)【発明の名称】微生物の検査方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180305BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20180305BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20180305BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

   C12Q1/06

【請求項の数】4

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2013-91512(P2013-91512)

(22)【出願日】2013年4月24日

(65)【公開番号】特開2014-212719(P2014-212719A)

(43)【公開日】2014年11月17日

【審査請求日】2016年3月25日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003768

【氏名又は名称】東洋製罐グループホールディングス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002354

【氏名又は名称】特許業務法人平和国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】一色 淳憲

(72)【発明者】

【氏名】小梶 真実

(72)【発明者】

【氏名】田辺 卓

(72)【発明者】

【氏名】吉田 充裕

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−２００２１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 食品と開発，２０１２年，vol.47, no.1，pp.38-40

【文献】 月刊ＨＡＣＣＰ，２０１３年 ４月２２日，vol.19, no.5，pp.40-43

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

環境中から試料を採取して、得られた試料に含まれる微生物を培地にて培養する培養工程と、
前記微生物を培養することでコロニーが２以上形成された場合に、これら形成されたコロニーを２以上の集合に分けて、前記集合毎に前記集合に含まれる前記微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程と、
抽出した核酸を用いて増幅対象領域を含む核酸断片を増幅させる核酸増幅工程と、
増幅された核酸断片を用いて、前記集合毎に前記集合に含まれる前記微生物を検出する微生物検出工程と、
前記微生物検出工程において２種類以上の微生物が検出された場合に、検出された前記微生物毎に、前記２以上の集合の総数である全集合数に対する、それぞれの微生物が検出された集合数の割合を算出し、該割合の最も高い種を前記環境中における微生物の優勢種と推定する優勢種推定工程と、を有する
ことを特徴とする微生物の検査方法。

【請求項2】

前記微生物を培養することでコロニーが４以上形成された場合に、前記核酸抽出工程において、これら形成されたコロニーを４以上の集合に分けて、前記集合毎に前記集合に含まれる前記微生物の核酸を抽出することを特徴とする請求項１記載の微生物の検査方法。

【請求項3】

前記微生物が、カビ、酵母、又はバクテリアであることを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の検査方法。

【請求項4】

前記微生物検出工程において、前記増幅された核酸断片と相補的に結合する、前記微生物を検出するためのプローブが固定化された担体を用いて、前記集合毎に前記集合に含まれる前記微生物の種類を判定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物の検査方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、環境中における微生物の存否等を確認するための検査方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、食品製造現場や臨床現場、文化財保護環境等において、カビや細菌などの微生物が存在するか否かを検査して、環境の安全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。
例えば、カビの検査では、一般的に、環境中から試料を採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法（培養法）が行われている（特許文献１参照）。

【0003】

しかしながら、この方法では、カビ種ごとに分離培養することが必要であるため、検査工程が煩雑になるという問題があった。また、培養に長期間を要するため、例えばヒトが生活する屋内の検査や食物の検査など、迅速性が要求される検査には不向きであった。さらに、形態的特徴を表す胞子が形成されないと同定ができず、労力が無駄になってしまう場合があるという問題もあった。

【0004】

また、最近は、カビの検査においてＤＮＡを用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取した試料を培養した後、培養細胞からＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりターゲット領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、試料中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、例えば電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、試料中に存在するカビを同定する方法などが提案されている（特許文献２，３参照）。

【0005】

【特許文献1】特開２００７−１９５４５４号公報

【特許文献2】特開２００８−２７８８４８号公報

【特許文献3】特開２００８−２７８８６１号公報

【特許文献4】特開２００１−２３８７００号公報

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、このようなＤＮＡを用いた同定法によれば、環境中における微生物の存否を確認することはできるが、その環境中において、どの微生物が優勢種であるのかまでは確認することができなかった。
また、特許文献１に記載のように、菌種ごとに分離培養を行って、形態的特徴の観察に基づきカビを同定する方法によれば、同定されたカビの個数を数えることにより、各カビの存在割合を把握することができるため、どのカビが優勢種であるかを確認することが可能である。しかしながら、この方法は、優勢種の確認に長期間を要するため、ヒトが生活する屋内の検査や食物の検査などの迅速な対応が望まれる検査には不向きであった。
ここで、生物集団等から２個以上の試料を得てＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ、標的遺伝子特異的プライマー、およびコントロール遺伝子特異的プライマーを含有する反応液を調製して、定量的ＰＣＲに供して各増幅産物の量を測定し、増幅産物の量に基づき生物集団中の異種個体の存在割合を決定し、存在割合の信頼度を統計処理によって決定する生物集団中の異種個体の存在割合の定量的測定方法が提案されている（特許文献４参照）。

【0007】

しかしながら、このような増幅産物の量に基づき生物集団中の異種個体の存在割合を決定する方法では、個体間の増幅対象領域のサイズが大きく異なる場合には有効であるものの、増幅対象領域のサイズに十分な違いがない場合には有効に用いることができないという問題があった。
例えば、ＤＮＡを用いた微生物の検査では、複数種類の微生物について、ＤＮＡにおける同一領域を増幅対象領域とする場合が多い。このとき、検査対象の微生物によっては、異なる種類間において、それぞれの増幅対象領域のサイズがあまり違わないことがある。このような場合には、例えば電気泳動によって増幅産物の量を分析しても、複数種類の微生物由来の増幅産物が１つのバンドに入ってしまうため、各微生物の存在割合を決定することは困難であり、環境中における微生物の優勢種を判定することはできなかった。

【0008】

そこで、本発明者らは鋭意研究し、ＤＮＡを用いた微生物の検査にあたり、微生物の種類間の増幅対象領域のサイズがあまり違わない場合でも、環境中における微生物の優勢種を簡易に判定することが可能な方法を見いだした。
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、環境中における微生物の優勢種を現実的な使用を考慮すればあまり問題にならない範囲でほぼ適切に簡易に推定することが可能な微生物の検査方法の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を達成するため、本発明の微生物の検査方法は、環境中から試料を採取して、得られた試料に含まれる微生物を培地にて培養する培養工程と、微生物を培養することでコロニーが２以上形成された場合に、これら形成されたコロニーを２以上の集合に分けて、集合毎に集合に含まれる微生物の核酸を抽出する核酸抽出工程と、抽出した核酸を用いて増幅対象領域を含む核酸断片を増幅させる核酸増幅工程と、増幅された核酸断片を用いて、集合毎に集合に含まれる微生物を検出する微生物検出工程と、微生物検出工程において２以上の微生物が検出された場合に、検出された微生物毎に、２以上の集合の総数である全集合数に対する、それぞれの微生物が検出された集合数の割合を算出し、該割合の最も高い種を環境中における微生物の優勢種と推定する優勢種推定工程とを有する方法としてある。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、環境中における微生物の優勢種をほぼ適切に簡易に推定することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験で用いたプライマーセットの塩基配列を示す図である。

【図2】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験で用いたプローブの塩基配列を示す図である。

【図3】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験において、ＩＴＳ領域の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析するために用いたシーケンス用プライマーセットの塩基配列を示す図である。

【図4】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験結果（使用チップ数５，６）を示す図である。

【図5】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験結果（使用チップ数４）を示す図である。

【図6】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の効果を確認するための試験結果（使用チップ数１，２）を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明の微生物の検査方法の一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、この実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。

【0013】

［微生物の検査方法］
本実施形態の微生物の検査方法は、集合毎に集合に含まれる微生物を検出し、２種類以上の微生物が検出された場合、検出された微生物毎に、全集合数に対する各微生物が検出された集合数の割合を算出することにより、環境中における微生物の優勢種を判定することを特徴とする。
具体的には、以下のように、（ａ）微生物培養工程、（ｂ）核酸抽出工程、（ｃ）核酸増幅工程、（ｄ）微生物検出工程、（ｅ）優勢種判定工程を含むものとすることが好ましい。

【0014】

（ａ）微生物培養工程
環境中から試料を採取して、得られた試料に含まれる微生物を培地にて培養する工程である。
「環境中」には、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生等における室内及び屋外の空気、液体、その他の検査対象が含まれる。また、飲食品や各種器具等の検査対象物も含まれる。
「微生物」には、カビや酵母などの真菌類の他、バクテリアなどの細菌類も含まれ、コロニーを形成する微生物であれば、本実施形態の微生物の検査方法を適用することが可能である。

【0015】

環境中から試料を採取する方法としては、特に限定されないが、例えば、エアーサンプラーなどを用いて、検査対象の環境中の空気等を採取することができる。
また、微生物の培養方法も特に限定されないが、採取した試料を専用培地に吹き付けて、試料に含まれるカビなどを寒天培地等で培養することができる。カビの培養条件としては、２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。

【0016】

（ｂ）核酸抽出工程
微生物を培養することでコロニーが２以上形成された場合に、これら形成されたコロニーを２以上の集合に分けて、当該集合毎に微生物の核酸を抽出する工程である。
コロニーが多数形成された場合には、２〜７コロニー程度ずつの集合に分けることが好ましい。１つの集合に１コロニーのみ含める場合、検査対象の微生物内における優勢種判定の精度は１００％になるが、サンプル数が多すぎて実験が煩雑になる。また、１つの集合におけるコロニー数を増やすほど、１つの集合に複数種類の微生物が含まれる可能性が高くなるが、ＰＣＲにより同時に増幅する種類数が増えるほど、非特異産物が増幅されるリスクが高くなるのでＰＣＲに用いるプライマーが有効に機能しなくなり、ＤＮＡチップに用いるプローブが有効に機能しない、あるいは非特異産物が目的産物の結合を阻害することになる。このような観点から１つの集合におけるコロニー数は、４又は５とすることがより好ましい。

【0017】

また、集合数が１の場合には、検出された微生物を優勢種と判定することはできるものの、試料に複数の微生物が含まれる場合、検出された微生物間での比較が行えないため、集合数は２以上にすることが好ましい。さらに、集合数を４以上にすれば、試料に検査対象の微生物が数種類含まれる場合に、それらの優勢順位もある程度判定できるため、より好ましい。

【0018】

微生物から核酸を抽出する方法としては、特に限定されないが、例えば次のように行うことができる。集合毎に、培地に生じた様々な種類の微生物のコロニーを一括して採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて微生物の細胞を破砕する。そして、得られた微生物の細胞の破砕物から、ＣＴＡＢ法（Cetyl trimethyl ammonium bromide）やＤＮＡ抽出装置により、核酸を抽出することができる。

【0019】

（ｃ）核酸増幅工程
抽出した核酸を用いて、標的領域（増幅対象領域）を含む核酸断片を増幅させる工程である。
「標的領域（増幅対象領域）」とは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などによって増幅させるターゲット領域を意味する。
「核酸断片」とは、ＰＣＲ法などにより、プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ等の一部分を意味する。

【0020】

核酸断片を増幅する方法としては、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
本実施形態の微生物の検査方法において、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、微生物の標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃ １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程） ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程） ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分

【0021】

ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。

【0022】

本実施形態では、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβチューブリン遺伝子を標的領域として、ＤＮＡ断片の増幅を行うことができる。
このとき、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとしては、図１に示す配列番号１及び２の塩基配列からなるもの（配列番号１：フォワードプライマー、配列番号２：リバースプライマー）を用いることができる。
また、βチューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとしては、図１に示す配列番号３及び４の塩基配列からなるもの（配列番号３：フォワードプライマー、配列番号４：リバースプライマー）を用いることができる。

【0023】

（ｄ）微生物検出工程
増幅された核酸断片を用いて、集合毎に集合に含まれる微生物を検出する工程である。
微生物の検査にあたっては、標的領域のサイズがあまり違わない複数種類の微生物を同時に増幅させ、その増幅産物にもとづき各微生物を識別することが必要となる場合がある。このため、微生物を検出する方法としては、ＤＮＡチップ（微生物検査用担体）を用いて増幅産物を対応するプローブに結合させ、増幅産物の蛍光標識を検出することにより、微生物の種類を判定する方法が、好適に用いられる。この方法によれば、増幅産物の配列が認識されることにより、各微生物の識別がより正確に行われるためである。

【0024】

具体的には、検査対象の微生物のゲノムＤＮＡにおける標的領域から選択したプローブを、ＤＮＡチップ上に予め固定化させておく。プローブは、それぞれ対応する検査対象の微生物由来の増幅産物とのみハイブリダイズでき、それによって検査対象の微生物を特異的に検出可能にすることができる。
例えば、図２に示すように、ユーロチウム属菌（Eurotium sp.）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号５に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができ、βチューブリン遺伝子から選択されたプローブとして、配列番号６に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。

【0025】

また、アスペルギルス ペニシリオイデス菌（Aspergillus penicillioides）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号７に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができ、βチューブリン遺伝子から選択されたプローブとして、配列番号８に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
また、アスペルギルス バージカラー菌（Aspergillus versicolor）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号９に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができ、βチューブリン遺伝子から選択されたプローブとして、配列番号１０に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。

【0026】

また、ペニシリウム属菌（Penicillium sp.）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号１１に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができ、βチューブリン遺伝子から選択されたプローブとして、配列番号１２に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
また、フザリウム属菌（Fusarium sp.）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号１３に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。
また、クラドスポリウム属菌（Cladosporium sp.）を検出する場合には、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとして、配列番号１４に示す塩基配列を有するものを好適に用いることができる。

【0027】

ユーロチウム属菌、アスペルギルス ペニシリオイデス菌、及びアスペルギルス バージカラー菌については、ＩＴＳ領域及びβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方を用いて、これらの両方において陽性反応が得られた場合のみに当該カビが検出されたと判定することが好ましい。これらのカビについては、このようにすることで、偽陽性反応にもとづく過誤判断を防止することが可能なためである。

【0028】

ペニシリウム属菌については、少なくともＩＴＳ領域又はβ−チューブリン遺伝子から選択されたプローブのいずれかにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することが好ましい。ペニシリウム属菌には、本実施形態においてペニシリウム属菌を検出するために用いられるＩＴＳ領域から選択されたプローブ又はβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの一方でしか検出できない種類のカビが含まれるが、それぞれのプローブの特異性は高く、偽陽性反応を生じることなくペニシリウム属菌のカビを検出することが可能なためである。

【0029】

フザリウム属菌、及びクラドスポリウム属菌については、ＩＴＳ領域のみから選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することが好ましい。これらのカビのＩＴＳ領域から選択されたプローブは特異性が高く、偽陽性反応を生じることなくこれらのカビをそれぞれ検出することが可能なためである。

【0030】

本実施形態の微生物の検査方法において使用可能なＤＮＡチップは、配列番号５〜１４に示す塩基配列を有するプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。

【0031】

このようにして得られたＤＮＡチップに、核酸増幅工程で得られた増幅産物を滴下し、増幅産物をＤＮＡチップに固定化されたプローブにハイブリダイズさせる。そして、ハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することにより、環境中に存在している検査対象の微生物を特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置などの一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴを用いて、増幅産物における蛍光標識の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal to Noise ratio，（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値）として得ることが好ましい。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。

【0032】

（ｅ）優勢種判定工程
微生物検出工程において２種類以上の微生物が検出された場合に、検出された微生物毎に、２以上の集合の総数である全集合数に対する、それぞれの微生物が検出された集合数の割合を算出することにより、環境中における微生物の優勢種を判定する工程である。

【0033】

具体的には、例えば全集合数を３とした場合であって、集合１から真菌Ａと真菌Ｂが検出され、集合２から真菌Ａと真菌Ｂが検出され、集合３から真菌Ａと真菌Ｃが検出された場合に、真菌毎に検出された集合数の割合を算出する。このとき、真菌Ａの割合は３／３で１００．０％となり、真菌Ｂの割合は２／３で６６．７％となり、真菌Ｃの割合は１／３で３３．３％となる。この結果、第一番目の優勢種はＡと判定され、第二番目の優勢種はＢと判定され、第三番目の優勢種はＣと判定される。

【0034】

このとき、仮にコロニー数が１５で、これらを全て分離培養して、１個体ずつ形態観察法による同定を行った場合、例えば真菌Ａが９個、真菌Ｂが４個、真菌Ｃが２個検出されると、それぞれの存在割合は、真菌Ａが６０．０％、真菌Ｂが２６．７％、真菌Ｃが１３．３％と正確に算出することができる。
しかしながら、この形態観察法による同定では、膨大な手間、時間、及びコストが必要になるという問題があった。また、その問題は、コロニー数が増加すればするほど膨大なものとなっていた。

【0035】

ところで、そもそも培地に生じたコロニーの数が少ない場合や、検査者が高度な形態同定能力を有しているような場合には、分離培養を行わずに優勢種を判定できる場合がある。このような場合には、本実施形態の微生物の検査方法を用いなくとも優勢種を判定することができる。
また、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定によれば、微生物を培養した培地から各集合へのコロニーの集め方が、判定結果に影響を与える可能性はある。

【0036】

さらに、環境中に存在する微生物は、その環境によって大きく相違する場合があるところ、本実施形態の微生物の検査方法で使用するＤＮＡチップに、検査した環境中における優勢種のプローブが固定化されていない場合もあり得る。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法により、あらゆる環境中の微生物の優勢種を完全に正確に検出できる分けではない。検出される可能性が高い微生物のプローブをＤＮＡチップに数多く固定化しておいたとしても、環境によってはそれ以外の微生物が優勢種である可能性は存在する。

【0037】

しかしながら、本実施形態の微生物の検査方法の現実的な使用を考慮すれば、これらはあまり問題にはならない。
すなわち、本実施形態の微生物の検査方法によれば、通常は、類似した環境下での使用が多く想定され、検査対象の微生物内において優勢種をほぼ適切に判定することができる。そして、このように優勢種を簡単に判定できることは、従来の形態観察法による膨大な手間、時間、及びコストを考慮すると、大変有効なものである。また、優勢種の判定の精度は、集合数を増加させることにより、高めることができる。

【0038】

ここで、本実施形態の微生物の検査方法において、培地に生じた各コロニーの微生物が全て検査対象の微生物である場合、全集合数をコロニー数と同じにすれば、理論上、優勢種を完全に正確に判定できる（環境中からの試料の採取時点で微生物の採取漏れがあるケースや培養に失敗したケースなどの例外的なケースを除く。）。
しかしながら、コロニー数が多い場合、集合数を減らすことが、手間、時間、及びコスト低減の観点から望ましい。
そこで、以下の実施例により、本実施形態の微生物の検査方法の効果を確認した結果、集合数が２以上であれば優勢種を確認できることが示され、集合数が４以上であれば試料中に検査対象の微生物が複数含まれている場合に、優勢種のおおよその優勢の順位を確認できることも示された。

【0039】

このように本実施形態の微生物の検査方法によれば、環境中における微生物の優勢種を迅速かつ簡易に確認することが可能となる。

【実施例】

【0040】

以下、本発明の実施形態に係る微生物の検査方法の有効性を確認するために行った試験について、具体的に説明する。

【0041】

［本実施形態の微生物の検査方法による優勢種の判定］
（ａ）微生物培養工程
まず、施設環境から野生カビを採取し、これを検出対象カビとして使用した。具体的には、エアーサンプラーを用いて各種施設環境内の空気を採取し、これをサンプルＡ〜Ｊの各培地に吹き付けて培養した。培養は、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。Ａ〜Ｊの各培地には、いずれもＭ４０Ｙ培地を使用した。

【0042】

（ｂ）核酸抽出工程
次に、サンプルごとに、培地に生じた様々な種類のカビの各コロニーの一部を、最大で５コロニー以下のグループ（集合）になるように、全てのコロニーを各グループに分けて、それぞれのカビをグループ毎に一括して採取した。
具体的には、図４に示すように、サンプルＡには２９コロニーが生じていた。このため、サンプルＡにおけるグループは、５コロニーのグループが５個、４コロニーのグループが１個の合計６個（全集合数は６）とした。
また、同図に示すように、サンプルＢには２２コロニーが生じていた。このため、サンプルＢにおけるグループは、５コロニーのグループが２個、４コロニーのグループが３個の合計５個（全集合数は５）とした。
また、同図に示すように、サンプルＣには２１コロニーが生じていた。このため、サンプルＣにおけるグループは、５コロニーのグループが３個、４コロニーのグループが１個、２コロニーのグループが１個の合計５個（全集合数は５）とした。

【0043】

さらに、図５に示すように、サンプルＤには２０コロニーが生じていた。このため、サンプルＤにおけるグループは、５コロニーのグループが４個の合計４個（全集合数は４）とした。
また、同図に示すように、サンプルＥには１９コロニーが生じていた。このため、サンプルＥにおけるグループは、５コロニーのグループが３個、４コロニーのグループが１個の合計４個（全集合数は４）とした。
また、同図に示すように、サンプルＦには１８コロニーが生じていた。このため、サンプルＦにおけるグループは、５コロニーのグループが３個、３コロニーのグループが１個の合計４個（全集合数は４）とした。

【0044】

さらに、図６に示すように、サンプルＧには９コロニーが生じていた。このため、サンプルＧにおけるグループは、５コロニーのグループが１個、４コロニーのグループが１個の合計２個（全集合数は２）とした。
また、同図に示すように、サンプルＨには６コロニーが生じていた。このため、サンプルＨにおけるグループは、５コロニーのグループが１個、１コロニーのグループが１個の合計２個（全集合数は２）とした。
また、同図に示すように、サンプルＩには３コロニーが生じていた。このため、サンプルＩにおけるグループは、３コロニーのグループが１個の合計１個（全集合数は１）とした。
また、同図に示すように、サンプルＪには３コロニーが生じていた。このため、サンプルＪにおけるグループは、３コロニーのグループが１個の合計１個（全集合数は１）とした。

【0045】

それぞれのグループのコロニーを、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、コロニーにおけるカビの細胞を破砕した。そして、グループ毎に、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出した。

【0046】

（ｃ）核酸増幅工程
次いで、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域とβ−チューブリン遺伝子とを同時に増幅した。
このとき、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとして、図１に示す配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆプライマー）及び配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマー（Ｒプライマー）を用いた。また、β−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとして、同図に示す配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。なお、いずれもオペロンテクノロジー株式会社により合成したものを使用した。

【0047】

また、ＰＣＲ用反応液として、サンプルＡ〜Ｊのそれぞれについて、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を使用し、次の組成のものを２０μｌ作成した。
１．Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
２．Ampdirect(addition-4) 4.0μl
３．dNTPmix 1.0μl
４．Cy-5dCTP 0.2μl
５．ITS1-Fw primer(2.5μM)（配列番号１） 1.0μl
６．ITS1-Rv primer(2.5μM)（配列番号２） 1.0μl
７．BtF primer(10μM)（配列番号３） 1.0μl
８．BtR primer(10μM)（配列番号４） 1.0μl
９．Template DNA（サンプルＡ〜Ｊ毎にそれぞれ） 1.0μl
１０．NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）

【0048】

上記各ＰＣＲ用反応液を使用して核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（Ｒ） Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。
（a）９５℃ １０分
（b）９５℃ ３０秒
（c）５６℃ ３０秒
（d）７２℃ ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃ １０分

【0049】

（ｄ）微生物検出工程
ＤＮＡチップには、ジーンシリコン（Ｒ）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図２に示される、以下の全てのプローブを固定化したものを使用した。以下において、（ＩＴＳ）はＩＴＳ領域から選択されたプローブを示し、（β）はβチューブリン遺伝子から選択されたプローブを示している。
（１）ユーロチウム属菌用 配列番号５（ＩＴＳ），配列番号６（β）
（２）アスペルギルス ペニシリオイデス菌用 配列番号７（ＩＴＳ），配列番号８（β）
（３）アスペルギルス バージカラー菌用 配列番号９（ＩＴＳ），配列番号１０（β）
（４）ペニシリウム属菌用 配列番号１１（ＩＴＳ），配列番号１２（β）
（５）フザリウム属菌用 配列番号１３（ＩＴＳ）
（６）クラドスポリウム属菌用 配列番号１４（ＩＴＳ）

【0050】

次に、サンプルＡ〜Ｊのそれぞれについて、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記ＤＮＡチップに滴下した。
このＤＮＡチップを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。

【0051】

次いで、ＤＮＡチップを標識検出装置（GenePix4100A Molecular Devices社製）にかけて、各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を算出した。
ここで、（１）ユーロチウム属菌、（２）アスペルギルス ペニシリオイデス菌、及び（３）アスペルギルス バージカラー菌については、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの両方のＳ／Ｎ比値が３以上を示した場合に陽性と判定した。
また、（４）ペニシリウム属菌については、ＩＴＳ領域から選択されたプローブとβチューブリン遺伝子から選択されたプローブの少なくともいずれか一方のＳ／Ｎ比値が３以上を示した場合に陽性と判定した。
また、（５）フザリウム属菌、及び（６）クラドスポリウム属菌については、ＩＴＳ領域から選択されたプローブのＳ／Ｎ比値が３以上を示した場合に陽性と判定した。

【0052】

（ｅ）優勢種判定工程
その結果、図４に示すように、サンプルＡにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が５グループで検出され（陽性を示したチップ数５枚）、ペニシリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は６枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数５÷全集合数６＝８３．３％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数６＝１６．７％である。
よって、サンプルＡの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であると判定される。

【0053】

同様に、サンプルＢにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が５グループで検出され（陽性を示したチップ数５枚）、ペニシリウム属菌が２グループで検出された（陽性を示したチップ数２枚）。使用したチップ数は５枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数５÷全集合数５＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数５＝４０．０％である。
よって、サンプルＢの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であると判定される。

【0054】

同様に、サンプルＣにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が５グループで検出され（陽性を示したチップ数５枚）、ペニシリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は５枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数５÷全集合数５＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数５＝２０．０％である。
よって、サンプルＣの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であると判定される。

【0055】

同様に、サンプルＤにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が４グループで検出され（陽性を示したチップ数４枚）、ペニシリウム属菌が２グループで検出され（陽性を示したチップ数２枚）、ユーロチウム属菌が２グループで検出された（陽性を示したチップ数２枚）。使用したチップ数は４枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数４÷全集合数４＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％であり、ユーロチウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％である。
よって、サンプルＤの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌とユーロチウム属菌であると判定される。

【0056】

同様に、サンプルＥにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が４グループで検出され（陽性を示したチップ数４枚）、ペニシリウム属菌が２グループで検出され（陽性を示したチップ数２枚）、フザリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は４枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数４÷全集合数４＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％であり、フザリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数４＝２５．０％である。
よって、サンプルＥの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であり、第三番目がフザリウム属菌であると判定される。

【0057】

同様に、サンプルＦにおけるグループでは、アスペルギルス バージカラー菌が３グループで検出され（陽性を示したチップ数３枚）、クラドスポリウム属菌が２グループで検出され（陽性を示したチップ数２枚）、アスペルギルス ペニシリオイデス菌が２グループで検出された（陽性を示したチップ数２枚）。使用したチップ数は４枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、アスペルギルス バージカラー菌の集合数の割合は、検出された集合数３÷全集合数４＝７５．０％であり、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％であり、アスペルギルス ペニシリオイデス菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数４＝５０．０％である。
よって、サンプルＦの優勢種は、第一番目がアスペルギルス バージカラー菌であり、第二番目がクラドスポリウム属菌とアスペルギルス ペニシリオイデス菌であると判定される。

【0058】

同様に、サンプルＧにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が２グループで検出され（陽性を示したチップ数２枚）、ペニシリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は２枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数２＝１００．０％であり、ペニシリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数２＝５０．０％である。
よって、サンプルＧの優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌であり、第二番目がペニシリウム属菌であると判定される。

【0059】

同様に、サンプルＨにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が２グループで検出された（陽性を示したチップ数２枚）。使用したチップ数は２枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数２÷全集合数２＝１００．０％である。
よって、サンプルＨの優勢種は、クラドスポリウム属菌であると判定される。

【0060】

同様に、サンプルＩにおけるグループでは、クラドスポリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は１枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数１＝１００．０％である。
よって、サンプルＩの優勢種は、クラドスポリウム属菌であると判定される。

【0061】

同様に、サンプルＪにおけるグループでは、アスペルギルス ペニシリオイデス菌が１グループで検出され（陽性を示したチップ数１枚）、クラドスポリウム属菌が１グループで検出された（陽性を示したチップ数１枚）。使用したチップ数は１枚である。
したがって、本実施形態の微生物の検査方法における優勢種の判定方法によれば、アスペルギルス ペニシリオイデス菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数１＝１００．０％であり、クラドスポリウム属菌の集合数の割合は、検出された集合数１÷全集合数１＝１００．０％である。
よって、サンプルＪの優勢種は、アスペルギルス ペニシリオイデス菌とクラドスポリウム属菌であると判定される。

【0062】

［ＤＮＡ配列解析による優勢種の確認］
上記サンプルＡ〜Ｊごとに、培地に生じた様々な種類のカビの各コロニーの一部を個別に採取し、それぞれ２５℃の暗所で７〜１０日間分離培養した。Ａ〜Ｊの各培地には、いずれもＭ４０Ｙ培地を使用した。
そして、分離培養された各コロニーのカビをＤＮＡ配列解析に供して、その菌種を確認した。

【0063】

具体的には、プライマーセットとして配列番号１５に示す塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号１６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを使用し、核酸合成酵素としてＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑポリメラーゼを使用し、核酸増幅装置としてＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、その他の条件は上述のＰＣＲ条件と同様にして、各カビのゲノムにおけるＩＴＳ１領域を増幅した。
そして、それぞれの増幅産物と、上記プライマーセット（シーケンス用プライマーセット）をタカラバイオ株式会社に委託して、ＤＮＡシーケンサーによりＤＮＡ配列解析を行い、それぞれの増幅産物に対応するカビの種類を確認した。その結果を、図４〜６に示す。

【0064】

［試験結果］
サンプルＡからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌の他に、Xylariales sp.、Diaporthe sp.、Pleosporales sp.、及びStereum hirsutumの４種類の微生物が検出された。これら４種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＡにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌であった。
一方、ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＡにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種は、Xylariales spであった。
しかしながら、これは本試験において検査対象外の微生物であり、検査対象としていたクラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌は、それぞれ実際の第二番目、実際の第三番目の優勢種として検出されている。
したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。

【0065】

サンプルＢからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌の他に、Mycosphaerella crystallina、Xylariales sp.、Artrinium sp.、及びLeptosphaerulina chartaruの４種類の微生物が検出された。これら４種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＢにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌であった。
ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＢにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はペニシリウム属菌であった。
したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。

【0066】

サンプルＣからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌の他に、Arthrinium sp.、Periconia macrospinosa、Toxicocladosporium irritans、Dothideomycete sp.、Phoma sp.、Pleosporales sp.、及びUnknown（種類不明のもの）の７種類の微生物が検出された。これら７種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＣにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌であった。
ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＣにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はペニシリウム属菌であった。
したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。

【0067】

サンプルＤからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌、ペニシリウム属菌、及びユーロチウム属菌の他に、Unknown（種類不明のもの）、Pleosporales sp.、Diaporthe sp.、及びAureobasidium pullulansの４種類の微生物が検出された。これら４種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＤにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌とユーロチウム属菌であった。
ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＤにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はペニシリウム属菌であり、実際の第三番目の優勢種はユーロチウム属菌であった。
したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定できていることがわかる。また、その優勢の順位もある程度判定できていることがわかる。

【0068】

サンプルＥからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌、ペニシリウム属菌、及びフザリウム属菌の他に、Leptosphaeria sp.、Unknown（種類不明のもの）の２種類の微生物が検出された。これら２種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＥにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌、第三番目がフザリウム属菌であった。
ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＥにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はペニシリウム属菌であり、実際の第三番目の優勢種はフザリウム属菌であった。
したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。

【0069】

サンプルＦからは、ＤＮＡ配列解析により、アスペルギルス バージカラー菌、クラドスポリウム属菌、及びアスペルギルス ペニシリオイデス菌の他に、Leptosphaerulina chartarum、Leptosphaeria sp.、Sclerotinia sclerotiorum、Creosphaeria sassafrans、Fungal endophyte
sp.、及びUnknown（種類不明のもの）の６種類の微生物が検出された。これら６種類の微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＦにおける優勢種は、第一番目がアスペルギルス バージカラー菌、第二番目がクラドスポリウム属菌とアスペルギルス ペニシリオイデス菌であった。
ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＦにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はアスペルギルス バージカラー菌であり、実際の第二番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第三番目の優勢種はアスペルギルス ペニシリオイデス菌であった。
したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定できていることがわかる。また、その優勢の順位もある程度判定できていることがわかる。

【0070】

サンプルＧからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌の他に、Phaeosphaeriopsis sp.が検出された。この微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これは本試験において検査対象外の微生物となっている。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＧにおける優勢種は、第一番目がクラドスポリウム属菌、第二番目がペニシリウム属菌であった。
一方、ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＧにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であったが、実際の第二番目の優勢種はPhaeosphaeriopsis sp.であり、ペニシリウム属菌は実際の第三番目の優勢種であった。
しかしながら、Phaeosphaeriopsis sp.は本試験において検査対象外の微生物であり、検査対象としていたクラドスポリウム属菌とペニシリウム属菌は、それぞれ実際の第一番目、実際の第三番目の優勢種として検出されている。
したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種及びその優勢の順位を高い精度で判定できていることがわかる。

【0071】

サンプルＨからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌の他に、Pleosporales sp.が検出された。この微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これは本試験において検査対象外の微生物となっている。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＨにおける優勢種は、クラドスポリウム属菌であった。
ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＨにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はPleosporales sp.であった。
したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定できていることがわかる。

【0072】

サンプルＩからは、ＤＮＡ配列解析により、クラドスポリウム属菌の他に、Alternaria alternataが検出された。この微生物を検出するためのプローブは、本実施形態の微生物の検査方法において用いたＤＮＡチップには固定化されておらず、これらは本試験において検査対象外の微生物となっている。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＩにおける優勢種は、クラドスポリウム属菌であった。
ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＩにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であり、実際の第二番目の優勢種はAlternaria alternataであった。
したがって、この結果から、検査対象とする微生物内において、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定できていることがわかる。

【0073】

サンプルＪからは、ＤＮＡ配列解析により、アスペルギルス ペニシリオイデス菌とクラドスポリウム属菌が検出された。
本実施形態の微生物の検査方法により判定されたサンプルＪにおける優勢種は、アスペルギルス ペニシリオイデス菌とクラドスポリウム属菌であった。
ＤＮＡ配列解析の結果、サンプルＪにおけるコロニーのうち、実際の第一番目の優勢種はアスペルギルス ペニシリオイデス菌であり、実際の第二番目の優勢種はクラドスポリウム属菌であった。
サンプルＪは、使用したチップ数が１枚であるため、複数の微生物が存在している場合、これらの優勢種の違いは判定できないが、検査対象とする微生物内において、実際の優勢種を特定することはできている。
以上の通り、本実施形態の微生物の検査方法によれば、簡易な方法により、優勢種を高い精度で判定することが可能になっている。

【0074】

本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記の試験のＰＣＲ用反応液におけるＩＴＳ領域増幅用プライマーセット及びβ−チューブリン遺伝子増幅用プライマーセット以外の成分については、適宜変更することができる。また、上記のようなＤＮＡチップを用いて蛍光検出を行うのではなく、電流検出方式など他の検出方式のＤＮＡチップにより、プローブにハイブリダイズした増幅産物を検出することなども可能である。

【産業上の利用可能性】

【0075】

本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生等において、環境中の微生物の存否を確認する検査を行うにあたり、微生物の種類と優勢種を迅速かつ簡易に検出する場合に、好適に利用することが可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]