特許 6291842 検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6291842

(24)【登録日】2018年2月23日

(45)【発行日】2018年3月14日

(54)【発明の名称】検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置

(51)【国際特許分類】

   G01B 11/00 20060101AFI20180305BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20180305BHJP

【ＦＩ】

   G01B11/00 H

   G01N21/64 F

【請求項の数】10

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2013-546519(P2013-546519)

(86)(22)【出願日】2013年10月4日

(86)【国際出願番号】JP2013077159

(87)【国際公開番号】WO2014057893

(87)【国際公開日】20140417

【審査請求日】2016年10月3日

(31)【優先権主張番号】特願2012-227302(P2012-227302)

(32)【優先日】2012年10月12日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000003159

【氏名又は名称】東レ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100089118

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 宏明

(72)【発明者】

【氏名】薙野 邦久

(72)【発明者】

【氏名】吉川 俊平

【審査官】 櫻井 仁

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／１０１９４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−１４８９２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−０２４５３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−０４９２８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−２２４８９４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｂ １１／００−１１／３０

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

レンズによって集光されたレーザー光を、凹凸形状を有する基板に照射し、該基板からの反射光および／または散乱光の光強度を画像データとして取得して前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出方法であって、
前記レンズの焦点位置よりも前記レンズに近い位置であって、前記レンズの焦点距離をｆ、前記基板を前記焦点位置から前記レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記基板の光照射面を配置し、該光照射面からの反射光および／または散乱光を検出光として受光し、該受光した光の強度の変化に基いて前記基板の高さの差異を検出することを特徴とする検出方法。

【請求項2】

前記基板の光照射面を前記焦点位置に配置した場合に、該光照射面からの正反射光を前記検出光から分離する光学系を用いることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。

【請求項3】

前記α／ｆの範囲は、０．０１７〜０．１７であることを特徴とする請求項１または２に記載の検出方法。

【請求項4】

凹凸形状が形成され、各々蛍光標識されたサンプルと結合可能な複数のプローブが配置されたマイクロアレイに対し、対物レンズを介して前記蛍光標識の励起波長を含む光を照射し、かつ前記マイクロアレイからの光を受光して、該受光した光に基づく画像をもとに前記マイクロアレイの解析を行うマイクロアレイの解析方法であって、
前記蛍光標識からの蛍光を検出して蛍光画像データを取得する蛍光画像データ取得ステップと、
前記対物レンズの焦点距離をｆ、前記マイクロアレイを前記対物レンズの焦点位置から前記対物レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記マイクロアレイの表面を配置し、前記マイクロアレイの表面からの光を検出して、前記蛍光画像データのアライメントを行うアライメント用画像データを取得するアライメント用画像データ取得ステップと、
前記アライメント用画像データの光強度の変化をもとに、前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出ステップと、
前記検出ステップによって検出された前記凹凸形状の高さの差異に基づいて前記蛍光画像データを補正する補正ステップと、
前記補正ステップによって補正された前記蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定する位置決定ステップと、
を含み、
前記アライメント用画像データ取得ステップは、前記マイクロアレイの表面を、前記対物レンズの焦点位置に対して該対物レンズに近い位置に配置した状態で、前記アライメント用画像データを取得することを特徴とするマイクロアレイの解析方法。

【請求項5】

前記検出ステップは、前記アライメント用画像データにおいて、前記光強度の変化に基づいて３つ以上の基準点を検出し、
前記補正ステップは、検出した基準点を基に前記蛍光画像データの歪みを補正することを特徴とする請求項４に記載のマイクロアレイの解析方法。

【請求項6】

前記補正ステップは、前記基準点に基づく前記アライメント用画像データの傾斜角度θｘ，θｙを取得して、該傾斜角度θｘ，θｙおよび下記式（１），（２）をもとに、前記蛍光画像データの剪断変形歪みを補正することを特徴とする請求項５に記載のマイクロアレイの解析方法。

【数1】

【請求項7】

前記α／ｆの範囲は、０．０１７〜０．１７であることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一つに記載のマイクロアレイの解析方法。

【請求項8】

前記マイクロアレイは、ＤＮＡマイクロアレイであることを特徴とする請求項４〜７のいずれか一つに記載のマイクロアレイの解析方法。

【請求項9】

凹凸形状が形成され、各々蛍光標識されたサンプルと結合可能な複数のプローブが配置された基板から、前記蛍光標識の蛍光を含む光を受光して、該受光した光に基づく画像データを取得する蛍光読取装置であって、
少なくとも所定波長の励起光を含む照明光を出射する光源と、
前記照明光を前記基板に照射するとともに、該照明光が照射された前記基板の表面からの光を受光する対物レンズと、
前記対物レンズが受光した光を検出して、該検出した蛍光による蛍光画像データおよび前記基板からの光による基板画像データを取得する画像取得部と、
画像取得部によって取得された前記基板画像データをもとに、前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出部と、
前記検出部によって検出された前記凹凸形状の高さの差異をもとに、前記蛍光画像データを補正する補正部と、
前記基板を保持する保持手段と、
前記保持手段を前記対物レンズの光軸に沿って移動させる駆動部と、
を備え、
前記駆動部は、前記画像取得部により前記基板画像データを取得する際、前記対物レンズの焦点位置に対して、前記対物レンズに近い位置であって、前記対物レンズの焦点距離をｆ、前記基板を前記焦点位置から前記対物レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記基板を配置するように前記保持手段を移動させることを特徴とする蛍光読取装置。

【請求項10】

前記α／ｆの範囲は、０．０１７〜０．１７であることを特徴とする請求項９に記載の蛍光読取装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロアレイの表面における凹凸形状の高さの差異を検出する検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置に関する。

【背景技術】

【0002】

１９９０年以降、生物学、医学、薬学方面でマイクロアレイと呼ばれる技術の開発が進み利用されるようになってきた。マイクロアレイは、ガラスやプラスチックなどの基板上に、数十から数万のプローブを固定したものであって、蛍光分子などで標識されたサンプル（ターゲット）をこの基板にアプライし、プローブとサンプルとの結合反応を蛍光などで検出するためのものである。マイクロアレイは一度に網羅的な測定が可能であり、今後テーラーメード医療に必須のものになると期待されている。

【0003】

従来、ＤＮＡをプローブとして基板に固定したＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップ）や、タンパク質をプローブとして基板に固定したタンパク質マイクロアレイ、多数の微小標本をプローブとして基板に固定化した組織マイクロアレイ、多数の低分子化合物をプローブとして基板に固定化した化合物マイクロアレイなどが知られている。

【0004】

このうち、ＤＮＡチップは、最も実用化が進んでおり、疾患に関連する遺伝子の探索や、その遺伝子を用いて検査、診断を行おうとする研究が活発に行われており、一部は実用化されている。

【0005】

以下にマイクロアレイの一形態であるＤＮＡチップについて、詳細に説明する。

【0006】

ＤＮＡチップは、ガラスや樹脂等からなる基板の上にＤＮＡをグリッド状にスポット（固定化）したものである。ＤＮＡチップ上には、標識されるＤＮＡサンプルと特異的に反応可能なプローブとして、一本鎖のＤＮＡ（ＤＮＡプローブ）がスポットされている。なお、ＤＮＡプローブは、配列が既知のものが用いられる。一方、解析すべき未知配列のＤＮＡサンプル（一本鎖ＤＮＡ）には、光学的に検出可能な発光又は蛍光マークを付けておく。こうすると、解析すべき未知配列のＤＮＡサンプルをＤＮＡチップ上に流し込んだ場合、該ＤＮＡサンプルの配列がＤＮＡプローブの配列と相補的な関係にあれば、ＤＮＡプローブとＤＮＡサンプルとが結びついて二本鎖のＤＮＡになる。したがって、ＤＮＡプローブと結びつかなかったＤＮＡサンプルをすべて洗い流し、ＤＮＡチップ上に残存する判定したいＤＮＡサンプルを発光させ、この発光を読取り装置（スキャナー）により読みとると、二本鎖となったＤＮＡの状況を画像として観察することができる。すなわち、ＤＮＡチップ上で発光するマークの分布を解析することで、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析することができる。このように、ＤＮＡチップ上に既知の配列を有するＤＮＡプローブセットを構成し、それぞれ異なる配列のＤＮＡプローブをＤＮＡチップ上に搭載することで、遺伝子の変異や遺伝子の発現量などを検出することができる。

【0007】

以下、図１３に、ＤＮＡチップ解析の一連の処理工程の詳細を示す。

【0008】

図１３に示す前処理工程においては、検体から抽出したＤＮＡサンプル中に含まれる未知のＤＮＡを増幅し、これらのＤＮＡに蛍光マーク（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）を付与する（ステップＳ２０１）。

【0009】

次にハイブリダイゼーション工程において、多種類のＤＮＡプローブが搭載されたＤＮＡチップの基板上に、蛍光マークを付与したＤＮＡサンプルを滴下する。ここで、ＤＮＡサンプルがスポットされたＤＮＡプローブと相補的な関係にあれば、結びついて二本鎖になる（ステップＳ２０２）。

【0010】

次に、洗浄工程において、所定の洗浄液により、ハイブリダイズされたＤＮＡチップを洗浄する（ステップＳ２０３）。これにより、グリッド状に配置されたＤＮＡプローブと結びつかなかったＤＮＡサンプルがすべて洗い流される。

【0011】

続いて、洗浄されたＤＮＡチップに対し、光を照射してスキャニングする（ステップＳ２０４）。スキャニング工程においては、蛍光マークを励起するのに適した波長のレーザー光をＤＮＡチップに照射し、各ＤＮＡプローブにそれぞれ結びついた（ハイブリダイズした）ＤＮＡサンプルからの蛍光を電気信号として取得する。これにより、スポットされた各ＤＮＡプローブ（遺伝子）と結合したＤＮＡサンプルに付与された蛍光マークの発光量が測定され、それに基づいて解析処理を行う蛍光画像データを得ることができる。

【0012】

解析工程においては、得られた蛍光画像データに対してテンプレートを利用して各スポットの蛍光強度を算出し、各種の解析を実行する（ステップＳ２０５）。

【0013】

ここで、図１４に、ＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップ１００の一例を示す。図１４に示すＤＮＡチップ１００は、凹凸形状を有する矩形の板状をなす。ＤＮＡチップ１００は、板面が格子状に分割されてなる複数のブロック１０１を有する。このブロック１０１の上面には、略円柱状または円錘台状をなして設けられ、個々の遺伝子に対応するＤＮＡプローブを複数固定し、行方向および列方向に所定数、マトリクス状に配列された複数のスポット１０２が形成されている。また、複数のブロック１０１は、角柱状に切り欠かれてなる凹部１０３の底部に形成されている。なお、スポット１０２上に配置されるＤＮＡプローブは、既にその塩基配列が解読されている互いに異なる遺伝子にそれぞれ対応するものであり、ブロック１０１上におけるその配置位置は予め定められている。

【0014】

また、図１５に、ＤＮＡチップの蛍光画像データに対して適用されるテンプレートの一例を示す。図１５に示すように、テンプレートは、複数（例えば、図１５では３２個）のブロック（ブロック１０１に対応）に分割されており、各ブロック内においてはｍ行ｎ列（図１５では２２×２２）のマトリクス状に配置された検出エリア（ＤＮＡチップ１００の個々のスポット１０２に対応する）が設けられている。

【0015】

上記の解析工程においては、読みとったＤＮＡチップの蛍光画像データ中の個々のスポット１０２に、解析ツールが提供するテンプレートの検出エリアを当てはめ（アライメント）、当該検出エリアにおいて各スポット１０２の蛍光強度を算出する。このとき、正確な解析を実行するためには画像上の個々のスポット１０２に対してテンプレートの個々の検出エリアが正しく設定されるよう、アラインメント処理が正確に実行される必要がある。

【0016】

このアライメントの方法としては、ブロック単位でアライメントを行うパターンマッチング法や投影法などがある。そして、特許文献１が開示する技術のように、ポジティブコントロールと呼ばれる蛍光物質やどのような検体にでも含まれているハウスキーピング遺伝子をスポットしたチップを使用して、アライメントを正確に行なおうとする試みもなされている。

【0017】

さらには、特許文献２が開示する技術のように、基板からの反射光や散乱光で凹凸形状を画像化し、この画像からアライメントを行う方法も考案されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0018】

【特許文献1】特開２００５−１７２８４０号公報

【特許文献2】特開２００５−２４５３２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0019】

しかしながら、ブロック単位でアライメントを行う典型的なパターンマッチング法や投影法は、いずれも、ハイブリダイズしたサンプルＤＮＡの量が多く、各ブロック１０１において十分な強さの蛍光を発するスポット１０２が１／４から半数程度存在しないと、正しくアライメント出来ない。そのため、検体から抽出したサンプル中に含まれるＤＮＡ量が少ない場合、アライメントが正常に行えない場合がある。

【0020】

一方、蛍光物質をスポットして配置する方法では、十分な強さの蛍光を発するスポットが少なくてもアライメントが行えるという利点があるものの、スポット１０２上に配置可能なＤＮＡ数が減少し、チップ製造時におけるコストアップ等の問題がある。また、蛍光物質をスポットした場合、ハイブリダイゼーション中に、それが遊離し、ポジティブコントロールの周辺を汚染してしまい、データを得られないおそれもある。

【0021】

本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、基板の高さの差異を正確に検出可能な画像を取得することが可能な検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0022】

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる検出方法は、レンズによって集光されたレーザー光を、凹凸形状を有する基板に照射し、該基板からの反射光および／または散乱光の光強度を画像データとして取得して前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出方法であって、前記レンズの焦点位置よりも前記レンズに近い位置に前記基板の光照射面を配置し、該光照射面からの反射光および／または散乱光を検出光として受光し、該受光した光の強度の変化に基いて前記基板の高さの差異を検出することを特徴とする。

【0023】

また、本発明にかかる検出方法は、上記の発明において、前記基板の光照射面を前記焦点位置に配置した場合に、該光照射面からの正反射光を前記検出光から分離する光学系を用いて前記基板の高さの検出を行なうことを特徴とする。

【0024】

また、本発明にかかる検出方法は、上記の発明において、前記レンズの焦点距離をｆ、前記基板を前記焦点位置から前記レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記基板の光照射面を配置することを特徴とする。

【0025】

また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、凹凸形状が形成され、各々蛍光標識されたサンプルと結合可能な複数のプローブが配置されたマイクロアレイに対し、対物レンズを介して前記蛍光標識の励起波長を含む光を照射し、かつ前記マイクロアレイからの光を受光して、該受光した光に基づく画像をもとに前記マイクロアレイの解析を行うマイクロアレイの解析方法であって、前記蛍光標識からの蛍光を検出して蛍光画像データを取得する蛍光画像データ取得ステップと、前記マイクロアレイの表面からの光を検出して、前記蛍光画像データのアライメントを行うアライメント用画像データを取得するアライメント用画像データ取得ステップと、前記アライメント用画像データの光強度の変化をもとに、前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出ステップと、前記検出ステップによって検出された前記凹凸形状の高さの差異に基づいて前記蛍光画像データを補正する補正ステップと、前記補正ステップによって補正された前記蛍光画像データにおける各プローブの位置を決定する位置決定ステップと、を含み、前記アライメント用画像データ取得ステップは、前記マイクロアレイの表面を、前記対物レンズの焦点位置に対して該対物レンズに近い位置に配置した状態で、前記アライメント用画像データを取得することを特徴とする。

【0026】

また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、上記の発明において、前記検出ステップは、前記アライメント用画像データにおいて、前記光強度の変化に基づいて３つ以上の基準点を検出し、前記補正ステップは、検出した基準点を基に前記蛍光画像データの歪みを補正することを特徴とする。

【0027】

また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、上記の発明において、前記補正ステップは、前記基準点に基づく前記アライメント用画像データの傾斜角度θｘ，θｙを取得して、該傾斜角度θｘ，θｙおよび下記式（１），（２）をもとに、前記蛍光画像データの剪断変形歪みを補正することを特徴とする。

【数1】

【0028】

また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、上記の発明において、前記アライメント用画像データ取得ステップは、前記対物レンズの焦点距離をｆ、前記マイクロアレイを前記焦点位置から前記対物レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記マイクロアレイの表面を配置して前記アライメント用画像データを取得することを特徴とする。

【0029】

また、本発明にかかるマイクロアレイの解析方法は、上記の発明において、前記マイクロアレイは、ＤＮＡマイクロアレイであることを特徴とする。

【0030】

また、本発明にかかる蛍光読取装置は、凹凸形状が形成され、各々蛍光標識されたサンプルと結合可能な複数のプローブが配置された基板から、前記蛍光標識の蛍光を含む光を受光して、該受光した光に基づく画像データを取得する蛍光読取装置であって、少なくとも所定波長の励起光を含む照明光を出射する光源と、前記照明光を前記基板に照射するとともに、該照明光が照射された前記基板の表面からの光を受光する対物レンズと、前記対物レンズが受光した光を検出して、該検出した蛍光による蛍光画像データおよび前記基板からの光による基板画像データを取得する画像取得部と、画像取得部によって取得された前記基板画像データをもとに、前記凹凸形状の高さの差異を検出する検出部と、前記検出部によって検出された前記凹凸形状の高さの差異をもとに、前記蛍光画像データを補正する補正部と、前記基板を保持する保持手段と、前記保持手段を前記対物レンズの光軸に沿って移動させる駆動部と、を備え、前記駆動部は、前記画像取得部により前記基板画像データを取得する際、前記対物レンズの焦点位置に対して、前記対物レンズに近い位置に前記基板を配置するように前記保持手段を移動させることを特徴とする。

【0031】

また、本発明にかかる蛍光読取装置は、上記の発明において、前記駆動部は、前記対物レンズの焦点距離をｆ、前記マイクロアレイを前記焦点位置から前記対物レンズに近づける距離をαとしたとき、α／ｆが所定の範囲内となるように設定されるαに応じた位置に前記基板を配置するように前記保持手段を移動させることを特徴とする。

【発明の効果】

【0032】

本発明によれば、基板の高さの差異を正確に検出可能な画像を取得することで、ポジティブコントロールを配置していないＤＮＡチップの解析や、サンプルに含まれるＤＮＡ量が少ないチップの解析の場合にも、アライメント処理を適切に行うことができ、解析が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の一例を示す模式図である。

【図2】図２は、本実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像の一例を模式的に示す図である。

【図3】図３は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の要部の構成を示す模式図である。

【図4-1】図４−１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の要部の構成を示す模式図である。

【図4-2】図４−２は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の要部の構成を示す模式図である。

【図5-1】図５−１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。

【図5-2】図５−２は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。

【図5-3】図５−３は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。

【図6】図６は、本発明の実施の形態にかかる画像のアライメント処理を示すフローチャートである。

【図7】図７は、本発明の実施の形態にかかるアライメント用画像データの四隅の座標の検出方法を説明する模式図である。

【図8】図８は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を示す模式図である。

【図9-1】図９−１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。

【図9-2】図９−２は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。

【図9-3】図９−３は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像を説明する図である。

【図10】図１０は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の他の例を示す模式図である。

【図11-1A】図１１−１Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-1B】図１１−１Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-2A】図１１−２Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-2B】図１１−２Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-3A】図１１−３Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-3B】図１１−３Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-4A】図１１−４Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-4B】図１１−４Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-5A】図１１−５Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-5B】図１１−５Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-6A】図１１−６Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-6B】図１１−６Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-7A】図１１−７Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-7B】図１１−７Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-8A】図１１−８Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-8B】図１１−８Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-9A】図１１−９Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-9B】図１１−９Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-10A】図１１−１０Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-10B】図１１−１０Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-11A】図１１−１１Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-11B】図１１−１１Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図11-12A】図１１−１２Ａは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップの画像を示す図である。

【図11-12B】図１１−１２Ｂは、本発明の実施例にかかるＤＮＡチップにおける光強度変化のグラフである。

【図12-1】図１２−１は、本発明の実施例にかかるスライドガラスの画像を示す図である。

【図12-2】図１２−２は、図１２−１の画像における矢印Ｐ_１３−Ｐ_１３’間における光強度変化を示すグラフである。

【図12-3】図１２−３は、図１２−１の画像における矢印Ｐ_１３−Ｐ_１３’間におけるスライドガラス上の高さの差異を示すグラフである。

【図13】図１３は、従来のＤＮＡチップ解析の一連の処理工程の詳細を示すフローチャートである。

【図14】図１４は、従来のＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップの一例を示す模式図である。

【図15】図１５は、従来のＤＮＡチップの蛍光画像データに対して適用されるテンプレートの一例を示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、以下の実施の形態により本発明が限定されるものではない。また、以下の説明において参照する各図は、本発明の内容を理解でき得る程度に形状、大きさ、および位置関係を概略的に示してあるに過ぎない。従って、本発明は各図で例示された形状、大きさ、および位置関係のみに限定されるものではない。

【0035】

一般的にマイクロアレイの蛍光読取装置（スキャナー）は、励起波長の光ビームおよび／またはマイクロアレイを一次元的または二次元的に走査して、基板上の検体からの蛍光を検出し、そのデータを画像化し、その画像を元に、各プローブ（サンプルに標識された蛍光標識）からの蛍光量を求める。本発明で用いるスキャナーの好ましい光学系を図１に示す。図１は、本発明の実施の形態にかかるスキャナーの光学系の一例を示す模式図である。

【0036】

例えば図１に示すスキャナー１は、レーザー光源、対物光学系、光学フィルタ、蛍光画像データおよびアライメント用画像データ（基板画像データ）を取得する画像取得部等から構成され、スキャナー１は、上述したＤＮＡチップ１００（マイクロアレイ）を二方向に走査するための走査機構（図示しない、また本明細書ではＤＮＡチップ１００の主面において、基板の長手方向をｙ軸、それに直交する方向をｘ軸とする）と、ＤＮＡチップ１００を複数載置するオートローダー機構（図示しない）と、を有する。

【0037】

具体的に、スキャナー１は、それぞれ特定波長の励起光を少なくとも含む照明光を基板表面に出射するレーザー光源１１，１２と、該励起光を受光したプローブからの蛍光を平行光にする対物レンズ１３と、レーザー光源１１，１２および対物レンズ１３の間に設けられ、レーザー光源１１，１２からそれぞれ出射された照明光であって、光路Ｎ１上を進行する照明光を対物レンズ１３側に通過させる穴１４０が形成されるとともに、ＤＮＡチップ１００から発せられた光の少なくとも一部を光路Ｎ２側に折り曲げる穴あきミラー１４と、レーザー光源１１から発せられた励起光に応じた波長の光をカットしつつＤＮＡプローブとハイブリダイズしたサンプルからの蛍光に応じた波長の光のみを透過させる励起光カットフィルタ１５ａ、およびレーザー光源１２から発せられた励起光に応じた波長の光をカットしつつ、ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたサンプルからの蛍光に応じた波長の光のみを透過させる励起光カットフィルタ１５ｂを有するカットフィルタ１５と、ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたサンプルからの蛍光を結像する結像レンズ１６と、ＤＮＡプローブとハイブリダイズしたサンプルからの蛍光を受光することによって蛍光画像データを取得するとともに、基板表面からの反射光を受光し、その受光強度からＤＮＡチップ１００のブロック１０１表面の凹凸形状を検出可能なアライメント用画像データとして取得する画像取得部１７と、を備えている。なお、励起光カットフィルタ１５ａ，１５ｂ（カットフィルタ１５）は、穴あきミラー１４と画像取得部１７とを結ぶ光路Ｎ２に対して挿脱自在に設けられる。

【0038】

穴あきミラー１４は、励起光をＤＮＡチップ１００（対物レンズ１３）に入射させるための穴１４０が通常中央に設けられている。また、穴あきミラー１４の穴１４０は、図１に示すように、光読み取りの際に、ノイズとなる基板からの正反射光を画像取得部１７側に導かないように、蛍光または励起光の反射光（検出光）と、基板からの正反射光とを幾何学的に分離する機能を有する。

【0039】

なお、図１に示す態様においては、装置を小さくするために、レーザー光源１１，１２からの励起光をミラー１８，１９により屈折させてＤＮＡチップ１００に到達させる。

【0040】

また、走査機構の基準軸は、歪みの無い画像を得るために、直交していることが好ましい。走査機構としては、一般的に二軸共、スライダーを用いることが好ましい。

【0041】

さらに本実施の形態では、スキャナー１全体の制御を行う制御部２０と、ＤＮＡチップ１００を保持する保持部１０４（保持手段）を、ＤＮＡチップ１００（ブロック１０１）の主面が対物レンズ１３の光軸と平行な光路Ｎ１に沿うように移動させる制御を行う駆動部２１と、を備える。駆動部２１の制御によって、ＤＮＡチップ１００は、対物レンズ１３に対して近接または離間する。

【0042】

また、制御部２０は、ＤＮＡチップ１００の表面における凹凸形状の高さの差異（以下、高さの差異という）を検出する検出部２０ａと、検出部２０ａが検出した高さの差異をもとに、画像取得部１７が取得した画像を補正する補正部２０ｂと、補正部２０ｂが補正した画像に基づき、予め記録されている解析定義ファイルを参照して、ＤＮＡチップ１００のスポット１０２の位置を決定する決定部２０ｃと、を有する。

【0043】

本実施の形態では、サンプルに２種の蛍光マークを付け、それらの読み取りを行う装置としたため、当該２種の蛍光マークに対応した波長の光を出射するレーザー光源１１，１２と、出射される励起光の波長にそれぞれ対応した励起光カットフィルタ１５ａ，１５ｂとを備えている。しかしながら、サンプルに一種のみの蛍光マークをつけ、その読みとりを行う装置としてもよいし、３種以上の蛍光マークを付け、それらの読み取りを行う装置としてもよい。いずれの場合も、用いる蛍光マーク（蛍光色素）に対応したレーザー光源と励起光カットフィルタを設ければよい。

【0044】

次にスキャナー１での蛍光画像データの取得方法について述べる。まず、図１を用いて蛍光画像データの取得方法について説明する。なお、以下では蛍光色素としてＣｙ５、Ｃｙ３を用いた態様を説明するが、サンプルを標識するための蛍光色素はいずれか一方でもよいし、またこれらに限定されるものではない。蛍光色素としては例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ３．５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＴＡＭＲＡ、Ｏｙｓｔｅｒ ６５０、Ｃｙ５．５などを用いることができる。

【0045】

例えば、最初に蛍光色素Ｃｙ５を読み取るために、Ｃｙ５用のレーザー光源１１（例えば波長６３５ｎｍの光を発するレーザー光源）からレーザー光（すなわち蛍光色素Ｃｙ５の励起光）を照射する。レーザー光は、穴あきミラー１４および対物レンズ１３を介してＤＮＡチップ１００に照射される。照射されたレーザー光により励起発光した蛍光分子からの蛍光ならびにチップ表面で反射および／または散乱したレーザー光は、対物レンズ１３で互いに略平行光にされ、光路Ｎ１において図中矢印方向に進行する。

【0046】

その後、蛍光ならびにレーザー光は、穴あきミラー１４で反射されて光路Ｎ２上を進行し、光路Ｎ２上に配置されたＣｙ５用の励起光カットフィルタ１５ａに入射する。なお、ＤＮＡチップ１００の表面で正反射したレーザー光は、穴あきミラー１４の穴１４０を通過する。励起発光した蛍光分子からの蛍光は、この励起光カットフィルタ１５ａを透過し、結像レンズ１６で集光される。

【0047】

一方、励起光カットフィルタ１５ａに到達した励起光（チップ表面で反射および／または散乱した光）はカットされる。結像レンズ１６で集光された蛍光は、画像取得部１７に入射する。画像取得部１７は、受光した光データに対して光電変換処理を施して、光の強弱に応じた電気信号（アナログ信号）を出力する。このような工程を、ＤＮＡチップ１００を二方向に走査させて繰り返しつつ、画像取得部１７から出力された電気信号をＡ／Ｄ変換して蛍光画像データを作成する。

【0048】

続いて、蛍光色素Ｃｙ３の読み込みを行う。蛍光色素Ｃｙ３の読み込みは、Ｃｙ５用のレーザー光源１１をＣｙ３用のレーザー光源１２（例えばレーザー波長５３２ｎｍの光を発するレーザー光源）に置き換えるとともに、Ｃｙ５用の励起光カットフィルタ１５ａをＣｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂに置き換える以外は、蛍光色素Ｃｙ５の読み込みと同様に行えばよい。すなわち、Ｃｙ３用のレーザー光源１２からレーザー光（すなわち蛍光色素Ｃｙ３の励起光）を照射するとともに、Ｃｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂにて該励起光カットフィルタ１５ｂに到達した励起光（すなわちチップ表面で反射および／または散乱した光）を除去することで、蛍光色素Ｃｙ５と同様に蛍光画像データを作成する。

【0049】

図２は、本実施の形態にかかるスキャナー１で読み取ったＤＮＡチップ１００の画像の一例を模式的に示す図である。ここで、スキャナーの走査機構が２つのスライダーを備えたものである場合、これらスライダーが必ずしも直交しているとは限らない。装置組み立て時、もしくは時間の経過等に伴って、ずれてしまう場合がある。そのため、スキャナー１で読み取ったＤＮＡチップ１００の画像も、例えば図２（ａ）に示すようにｘ軸に対して傾いている可能性がある。このように、取得した画像における走査機構の走査方向がｘ軸および／またはｙ軸と一致しない場合は得られた蛍光画像データが歪んでしまい、テンプレートの検出エリアを得られた画像に正しく位置合わせすることが出来ない。また、スライダーのｘ軸、ｙ軸が機械的に直交していた場合でも、蛍光画像のｘ軸、ｙ軸と、スライダーの軸とが直交していないため、ＤＮＡチップ１００をセットした際に回転してしまい、結果的に蛍光画像が回転している場合もある。これらの場合も、テンプレートの検出エリアを得られた画像に正しく位置合わせすることができない。

【0050】

このため、画像から直交度のズレを検出して、スライダーが直交する走査機構で得られる画像と同等になるように補正することが好ましい。より具体的には、蛍光画像データをｘ軸に対してｙ軸方向に投影し、座標Ｘ毎の積算強度（各画素値の積算値）を算出する。この処理を、座標原点周りに蛍光画像データを予め設定した角度ずつ回転させて繰り返す。例えば、投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向がずれている場合の積算強度グラフは、図２（ｂ）に示すように振幅の小さいグラフになる。

【0051】

一方、投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向が一致した場合の積算強度グラフは、図２（ｃ）に示すように、一定の間隔で振幅に変化が生じ、信号の振幅が最大となる。投影データのこのような特徴を利用し、積算強度の標準偏差が最大値をとる角度を求めることで、スポット１０２のｙ軸に対する配列の角度を検出することができる。同様にｘ軸に対する配列の角度を求め、せん断変形等の画像処理を施すことでスポットの配列方向を直交させることが可能である。

【0052】

以上のようにして蛍光画像データを取得する場合、検体が非常に少ないと、蛍光色素Ｃｙ５、Ｃｙ３ともに、蛍光を発するＤＮＡプローブ（ＤＮＡサンプルとハイブリダイズしたＤＮＡプローブ）数が少なくなるためブロックの境界がわからず、また画像の直交度補正も出来ないため、アライメント処理が不可能となる。

【0053】

そこで、本発明においては、上記のような蛍光画像データのほかにＤＮＡチップ１００を再セットすることなく、アライメント用画像データも取得する。アライメント用画像データの取得の際には、対物レンズ１３でレーザー光が集光された焦点位置よりも、ＤＮＡチップ１００を対物レンズ１３側に近づけて設置し、アライメント用画像データを取得することが好ましい。図３は、本実施の形態にかかるスキャナー１の光学系の要部の構成を示す模式図である。図４−１，４−２は、本実施の形態にかかるスキャナー１の光学系の要部の構成を示す模式図であって、図４−１はＤＮＡチップ１００の凹部１０３において、傾斜を有する場合を示す図であり、図４−２はＤＮＡチップ１００の凹部１０３において、傾斜を有しない場合を示す図である。

【0054】

図３は、入射光が穴あきミラー１４を通してＤＮＡチップ１００のブロック１０１の表面（光照射面）に入射される様子を示している。入射光はレーザー光に代表される平行光である。入射光が対物レンズ１３で集光された焦点位置（ジャストフォーカス位置、表面位置Ｐ０）にブロック１０１の表面があると仮定した場合、その正反射光は、対物レンズ１３で集光され、理想的には入射光と同じ径となり、大部分の正反射光は、穴あきミラー１４の穴１４０を通過し、画像取得部１７側にはほとんど導かれない（図３中実線矢印Ｙ１）。但し、対物レンズ１３の収差（球面収差、コマ収差、非点収差など）により、一部の反射光が穴あきミラー１４で反射し、画像取得部１７に導かれるが、その強度は小さい。

【0055】

一方、焦点位置よりも遠い位置（表面位置Ｐ１）にＤＮＡチップ１００のブロック１０１の表面がある場合、その表面からの正反射光は、対物レンズ１３から見ると、焦点位置（表面位置Ｐ０）よりも遠い部分から発せられた点光源とみなされる。そのため、その反射光は対物レンズの入射光側で焦点を結ぶ（図３中一点鎖線矢印Ｙ２）。よって、穴あきミラー１４の位置で、光の径が表面位置Ｐ０における表面からの光の径と比較して小さくなる。よって、大部分の正反射光は、穴あきミラー１４の穴１４０を通過するため、画像取得部１７側に導かれずさらに暗くなる。

【0056】

このような理由により、ＤＮＡチップ１００の反射光を画像化すると、例えば、ブロック１０１の上面（対物レンズに近い部分）が明るく、凹部１０３の底部（対物レンズから遠い部分）が暗い画像を得ることができる。

【0057】

しかしながら、ＤＮＡチップ１００の表面に微細な傷や付着物があった場合、そこで乱反射が生じる。その乱反射の光路を図３の破線矢印Ｙ３で示す。この乱反射した光は、穴あきミラー１４で反射し、画像取得部１７側に入る。このため、ＤＮＡチップ１００の表面に微細な傷や付着物がある場合、乱反射による画像乱れが生じ、基板の凹凸を画像化出来ない場合が生じる。特に基板が樹脂製の場合、金型による成型で作製する場合が多いが、加工工具による金型の切削跡がそのまま基板に転写され、乱反射による画像乱れが生じる場合が多い。

【0058】

以上の不具合を解消するために、ＤＮＡチップ１００の撮像対象表面を焦点位置（表面位置Ｐ０）よりも対物レンズ１３に近づけた位置（表面位置Ｐ２）でアライメント用画像データを取得する。そうすると、図３の点線矢印Ｙ４で示すように、正反射光は、対物レンズ１３から見て焦点距離よりも近い部分から発する点光源とみなされるので、対物レンズ１３を通過しても発散し、穴あきミラー１４で、画像取得部１７側に反射する。このために、乱反射光（例えば、破線矢印Ｙ３）の影響が少なくなり、基板の段差（エッジ）部分のみが暗くなる。

【0059】

撮像対象表面の表面位置Ｐ２は、対物レンズ１３の焦点距離ｆと、ＤＮＡチップ１００を焦点位置（表面Ｐ０）から対物レンズ１３に近づける距離αとの関係α／ｆを用いて設定されることが好ましい。このα／ｆの好ましい範囲は、０．０１７〜０．１７であり、更に好ましくは、０．０３３〜０．１７である。駆動部２１は、制御部２０の制御のもと、設定されたαの位置にＤＮＡチップ１００の撮像対象面が配置されるように、保持部１０４を移動する制御を行う。

【0060】

ここで、図４−１に示すように、ＤＮＡチップ１００の凹部１０３の側面が角度θで傾斜している場合、その反射光は別の方向にけられる。また、凹部１０３の側面が垂直（角度θ＝９０度）に切り立っている場合（図４−２）、レンズに戻る反射光は、２回反射となる。２回反射であると非常に光が弱くなる（通常、透明体の反射率は４％程度なので、２回反射の光量は、１回反射に対して１／２５の強度となる）。そのため基板の段差部分が暗くなる。

【0061】

凹部１０３の角度θの好ましい範囲は、２０度から９０度である。９０度より大きいと基板の作成が困難であり、２０度未満であると、段差部分が画像データで認識できないことがある。図１４のようなＤＮＡチップ１００は、生産性の観点から樹脂を射出成形することで作製することが好ましい。その場合、成型の容易さ（金型からの抜きやすさ）という点から、角度θは、２０度から８０度であることが更に好ましい。

【0062】

このようにして得られたアライメント用画像の例を図５−１〜５−３に示す。図５−１〜５−３は、本実施の形態にかかるスキャナーで読み取ったマイクロアレイの画像を説明する図である。図５−１は、アライメント用画像を示す図である。図５−２は、図５−１のアライメント用画像における矢印Ｐ−Ｐ’間における光強度変化を示すグラフである。図５−３は、図５−１のアライメント用画像における矢印Ｐ−Ｐ’間におけるＤＮＡチップ１００の高さの差異を示すグラフである。図５−２より、ＤＮＡチップ１００の凹部１０３の側面に対応する位置において反射光量が減っており、基板上の凹凸形状を画像化できていることが確認できる。これを元にアライメント用画像中のＤＮＡチップ１００の凹部１０３の位置を判断し、蛍光画像をアライメントすることが可能となる。

【0063】

アライメント用画像データ取得用の光源については、好ましくはレーザー光源（例えば波長４０５ｎｍ、５３２ｎｍ、６３５ｎｍ）を用いることが出来る。レーザー光源の場合は、平行光であるために、図３で説明した現象により、アライメント用画像データにおいてエッジ（光強度差）を明確に検出可能である。

【0064】

ここで、具体的に上記の装置構成においてアライメント用画像データを取得するには、Ｃｙ５用のレーザー光源１１からレーザー光を照射するとともに、Ｃｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂを使用することが好ましい。Ｃｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂには一般的に５５０〜６００ｎｍを透過するバンドパスフィルタを用いることが多いが、該励起光カットフィルタ１５ｂは、一般的に、Ｃｙ５の励起光の波長の光（６３５ｎｍ）をわずかに透過するので（例えば、６３５ｎｍの光のＯＤ値が約５）、図５−１に示すように、ＤＮＡチップ１００の凹凸形状を画像化することが可能である。すなわち、特定波長の光によって励起発光した蛍光分子からの蛍光ではなく、基板表面からの反射光や散乱光を受光して、該基板そのものの凹凸形状を画像化することができる。

【0065】

アライメント用画像データを取得する際には、焦点位置よりもＤＮＡチップ１００を対物レンズ１３に近い場所に配置することが好ましい。焦点位置は、対物レンズ１３の高さを固定しＤＮＡチップ１００を高さ方向（対物レンズ１３の光軸方向）に変化させて各ＤＮＡプローブからの蛍光量を測定し、その値が最も大きくなる高さを実測することにより求めることが出来る。逆にＤＮＡチップ１００の高さを固定し、対物レンズ１３の高さを上下することも可能である。ＤＮＡチップ１００の表面の反射光や散乱光を受光する際、上述したα／ｆの関係に基づき、ＤＮＡチップ１００の表面（撮像対象面）の位置を焦点位置から１００μｍ以上レンズ側に近づけることが好ましい。より好ましくは２００μｍ以上である。近づける距離の上限については、ＤＮＡチップ１００と対物レンズ１３とが衝突しない程度であれば、特段の制限は無いが、スキャナー１のような装置においては通常３０００μｍ以下である。アライメント用画像データ取得用の光源については、スキャナーの部品点数を少なくできることから、蛍光分子を励起するための励起光を出射する光源を用いることが好ましいが、別途、アライメント用画像データ取得用光源を設けてもかまわない。

【0066】

また、アライメント用画像データの取得時にフィルタを使わない方法も採用しうる。しかしながら、フィルタを用いない場合は、画像取得部に入る光量が大きくなりすぎるために画像取得部の光検出機構を損傷する可能性がある。よって、上記したように、Ｃｙ５用のレーザー光源１１からレーザー光を照射する場合には励起光カットフィルタ１５ｂを使用するなど、照射する光源の波長をわずかに透過するフィルタを用いることが好ましい。反対に、Ｃｙ３用のレーザー光源１２からレーザー光を照射して励起光カットフィルタ１５ａを用いてもよい。また、励起光カットフィルタ１５ａ，１５ｂの代わりにＮＤフィルタを用いたり、励起光カットフィルタ１５ａ，１５ｂやＮＤフィルタを使用せずにレーザー光の出力自体を弱くしてアライメント用画像データを得たりしても構わない。もちろん、これらの組み合わせも適用できる。

【0067】

なお、図５−１〜５−３では、焦点位置から基板（ＤＮＡチップ１００）を２５０μｍレンズ側に近づけて取得した。このように、積極的に焦点位置から基板をレンズ側に近づけ、レーザー光の反射光を積極的に受光することで、図５−１のような、基板表面のエッジ形状が表れたアライメント用画像データが得られる。

【0068】

このようにして取得したアライメント用画像データを用いると、基板のエッジ（凹部１０３の外縁）を正確に検出することが可能である。以下、ＤＮＡチップ１００を用いた場合の、上記の方法を含んだアライメントの具体的な手順例を記す。図６は、本実施の形態にかかる画像のアライメント処理を示すフローチャートである。

【0069】

まず、スキャナー１にＤＮＡチップ１００をセットし、前述のとおり、画像取得部１７によって蛍光色素Ｃｙ５およびＣｙ３の蛍光画像データを読み込む（ステップＳ１０１）。続いて、ＤＮＡチップ１００をセットしたまま、Ｃｙ５用のレーザー光源１１からレーザー光を照射するとともに、Ｃｙ３用の励起光カットフィルタ１５ｂを使用し、画像取得部１７によってアライメント用画像データを読み込む（ステップＳ１０２）。この際、ＤＮＡチップ１００は、上述したように、焦点位置よりも対物レンズ１３に近い位置に配置される。なお、ステップＳ１０２においては、Ｃｙ３用のレーザー光源１２からレーザー光を照射するとともにＣｙ５用の励起光カットフィルタ１５ａを使用してもよい。

【0070】

そして、ステップＳ１０３以降で、アライメント用画像データを使用して蛍光画像データにおける各ＤＮＡプローブの位置を決定し、解析する。

【0071】

具体的には、まず、アライメント用画像データにおける少なくとも３つの基準点を検出する（ステップＳ１０３）。ここで、少なくとも３つの基準点としては、例えば図７に示すとおり、アライメント用画像での四隅の座標を挙げることができる。かかる四隅の座標の検出方法は、検出部２０ａによって行なわれ、明暗情報を用いたエッジ検出による上述した凹部１０３の位置判断が挙げられる。

【0072】

図７に示すように、ＤＮＡチップ１００において、検出部２０ａによって凹部１０３の外縁が検出され得る領域Ｅａ１〜Ｅａ４，Ｅｂ１〜Ｅｂ４を予め設定し、それぞれの領域において、図５−１に示すような矢印Ｐ−Ｐ’間における光強度の変化を測定し、ＤＮＡチップ１００の高さの差異を検出する。その後、検出部２０ａは、各領域Ｅａ１〜Ｅａ４，Ｅｂ１〜Ｅｂ４で検出された高さの差異の中心位置を用いて、領域Ｅａ１の中心位置と領域Ｅａ２の中心位置とを直線的に結んで凹部１０３の外縁の一辺とする。凹部１０３の外縁のその他の三辺についても、領域Ｅａ３の中心位置および領域Ｅａ４の中心位置、領域Ｅｂ１の中心位置および領域Ｅｂ２の中心位置、領域Ｅｂ３の中心位置および領域Ｅｂ４の中心位置をそれぞれ直線的に結ぶ。これにより、画像取得部１７によって得られたアライメント画像における凹部１０３の外縁を形成する。また、それぞれ結ばれて形成された直線同士の交点（座標）を求めることにより、凹部１０３の４隅を基準点１１０ａ〜１１０ｄとして得ることができる。

【0073】

続いて、ステップＳ１０４，Ｓ１０５において、基準点に基づいて蛍光画像データの歪みを補正する。

【0074】

具体的には、補正部２０ｂは、例えば前述の基準点１１０ａ〜１１０ｄの座標から、凹部１０３の外縁における各辺のｘ軸に対する傾斜角度θｘ、およびｙ軸に対する傾斜角度θｙを検出する（ステップＳ１０４）。傾斜角度θｘ，θｙは、四隅の座標を結んだ４本の線分について、該当方向の（対向する）２本の線分の角度の平均値を取ることが望ましい。なお、基準点が３点であっても、傾斜角度θｘ，θｙを算出可能である。そして、補正部２０ｂは、図８（ａ），（ｂ）に示すように、ｙ軸に応じた辺（凹部１０３の外縁の辺）のｙ軸に対する傾斜角度θｙを補正角度として用い、蛍光画像データを回転させて、凹部１０３のｙ軸に応じた辺をｙ軸に対して平行にする。また、補正部２０ｂは、図８（ｂ），（ｃ）に示すように、ｘ軸に応じた辺（凹部１０３の外縁の辺）のｘ軸に対する配列角度θｘを補正角度として用い、蛍光画像データを回転させて、凹部１０３のｘ軸に応じた辺をｘ軸に対して平行にする。変換後は、図８（ｃ）に示すように、ｘ軸、ｙ軸に対して外縁がそれぞれ平行な画像を得ることができる。

【0075】

さらに、補正部２０ｂは、回転後の画像に対して、上述のように検出した二方向に規則的に配列されているスポット１０２について、上述した傾斜角度θｘ，θｙおよび下記式（１），（２）に基づいて、変換（せん断変形）を実施する（ステップＳ１０５）。これにより、画像のせん断変形歪みを補正する。ここで、下記式（１）の（ｘ，ｙ）は変換前の座標、（Ｘ，Ｙ）は変換後の座標である。また、スキャナーの走査機構のずれ（走査機構の基準軸の直交度）に相当するθｘｙは、下記式（１），（２）に示すように、傾斜角度θｘから傾斜角度θｙを減じて求める。

【数2】

【0076】

さらに、ＤＮＡチップ１００が樹脂成型品である場合、ハイブリダイゼーション工程や洗浄工程での吸湿や温度変化により樹脂が膨張する場合がある。各工程での処理時間にもよるが、数十μｍ膨張する場合があり、アライメントの精度に影響を与える。

【0077】

このため、補正部２０ｂは、例えば上述した四隅の座標からｘ軸方向およびｙ軸方向のチップ長さを算出するとともに、設計値と一致するように、蛍光画像データに対して収縮膨張補正を行う（ステップＳ１０６，Ｓ１０７）。

【0078】

続いて、上記のようにして、補正部２０ｂによって角度補正、せん断変形補正、収縮膨張補正が施された蛍光画像データに対して、決定部２０ｃが、解析定義ファイルを参照して蛍光画像のアライメントを行なう。予め解析定義ファイルに保存しているテンプレートにおける各スポットの位置情報は、例えばチップ左上の隅（基準点１１０ａ）を原点とした、各スポットの中心座標となっている。このため、決定部２０ｃは、ステップＳ１０７で収縮補正した後の画像について、例えば左上隅の座標を原点として、各スポット枠を計算することで各スポット（プローブ）の位置を決定し、図９−１〜９−３に示すようなアライメントを行う（ステップＳ１０８）。なお、図９−１がＣｙ３の蛍光画像データに対してアライメントを行った結果を示す画像、図９−２がＣｙ５の蛍光画像データに対してアライメントを行った結果を示す画像である。これにより、各スポット１０２に対して、各スポット１０２に応じたテンプレート（図１５参照）を当てはめて、検出エリアと対応付けることができる。また、一例として、確認のためにアライメント用画像データに対してアライメントを行った結果を図９−３に示す。図９−３に示すように、アライメント処理によって、ＤＮＡチップ１００の凹部１０３の外縁の一角における直線部分が、基準点１１０１において直交していることが分かる。

【0079】

その後、ステップＳ１０８で求めた各スポットの中心座標から、スポット半径内の画素の信号強度について、平均値、メディアン値、標準偏差等の統計量を算出し、スポットの属するブロック番号、スポットの行列番号、配置されているＤＮＡプローブ名と合わせて、各種数値データをファイルとして出力する（ステップＳ１０９）。上述した処理によって、得られた蛍光画像データに対して歪み等の修正を行い、平均値、メディアン値、標準偏差等の正確な統計量を算出する。

【0080】

なお、上記ステップＳ１０１，Ｓ１０２の順序、およびステップＳ１０６，Ｓ１０７の順序は入れ替わってもよい。

【0081】

本発明においては、このようにしてＤＮＡサンプルのＤＮＡプローブへのハイブリダイズに基づいて得られた蛍光画像データを処理して所望の数値データを取得するが、得られる各種の数値データは、検体内で、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析するため等に用いられる。

【0082】

また、以上のようなＤＮＡチップ１００の解析においては、ＤＮＡチップ１００に形成された凹凸を利用して画像の補正、アライメントを行う。そのため、検体から抽出したサンプル中に含まれるＤＮＡ量が少なく発光するＤＮＡプローブが少ない画像、さらに、走査機構の精度が悪い読取り装置によって得られた画像に対しても、ＤＮＡチップ１００上に配置された検出エリアの位置決め処理を高精度に実行可能となる。

【0083】

上述した実施の形態によれば、ＤＮＡチップ１００の撮像対象表面を焦点位置（表面位置Ｐ０）よりも対物レンズ１３に近づけた位置（表面位置Ｐ２）でアライメント用画像データを取得するようにしたので、基板の高さの差異を正確に検出可能な画像を取得することができる。これにより、ポジティブコントロールを配置していないＤＮＡチップの解析や、サンプルに含まれるＤＮＡ量が少ないチップの解析の場合にも、アライメント処理を適切に行うことができ、解析が可能となる。

【0084】

ここで、図１０に本発明で使用するスキャナーに好適な光学系の他の態様を示す。なお、図１０において、図１に示すスキャナー１の構成要素と同一のものには同一の符号が付してある。図１０に示すスキャナー２は、スキャナー１の穴あきミラー１４に代えて微小ミラー１４ａを用いることにより、微小ミラー１４ａにて励起光を反射させてＤＮＡチップ１００に入射させるとともに、光読み取りの際、ノイズとなるＤＮＡチップ１００からの正反射光を画像取得部１７側に導かないように、蛍光または励起光の反射光（検出光）と正反射光とを幾何学的に分離する機能を有する。これにより、正反射光を光路Ｎ３から分離することができる。この構成においても、上述したスキャナー１と同様の効果を得ることができる。

【0085】

上記実施形態においては、基板にＤＮＡプローブがスポットされたＤＮＡチップの実施形態を説明したが、本発明は、ＲＮＡ、タンパク質、微小標本、低分子化合物、細胞等をスポットしたチップに対しても適用可能である。

【0086】

例えば、上記で説明した凹凸形状を有するＤＮＡチップ１００において、ＤＮＡプローブの代わりにタンパク質（抗体）を固定化し、検体との反応の有無や定量化を蛍光にて検出する場合でも、同様な方法を用いることができる。試料細胞の溶解液に存在するタンパク質をＣｙ５、コントロール細胞溶解液に存在するタンパク質をＣｙ３で標識して、両者を混合して抗体アレイと反応する場合や、タンパク質を蛍光標識する代わりにビオチン標識し、抗体アレイに結合後、酵素標識アビジンを用いてシグナルを増感する手法などがある。このような場合でも、本発明により、精度よくアライメントが可能となり、蛍光強度の各種数値データをファイルとして出力可能である。ＲＮＡアレイの場合でも、凹凸形状を有する基板（スポット１０２）上に固定化されたＲＮＡと、蛍光標識したＤＮＡやＲＮＡとのハイブリダイゼーションを蛍光で検出する場合に本手法を用いることができる。微小標本・細胞アレイにおいても、凹凸形状を有する基板上に固定化された微小標本や細胞と蛍光標識検体（例えば抗体）との結合反応を蛍光により検出する際に、本発明を適応することが可能である。

【実施例】

【0087】

以下実施例等をあげて本発明を説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。

【0088】

超精密機械加工により、図１４に示すＤＮＡチップ１００のような形状の基板に対応する金型を作製し、この金型を用いて射出成型により、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）からなる基板をＤＮＡチップ１００として製作した。金型には、工具による切削跡があり、そのため、基板にも工具切削跡が転写されている状態であった。切削跡による基板高さの乱れは、実測したところ１μｍ以下であった。

【0089】

製作したＤＮＡチップ１００の凸部（スポット１０２）上面にＤＮＡプローブを固定し、ハイブリダイゼーションまで行い、ＤＮＡチップスキャナー（３Ｄ−Ｇｅｎｅ Ｓｃａｎｎｅｒ（３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）））で蛍光画像およびアライメント用画像の取得を行った。蛍光画像とアライメント用画像の取得にかかる装置構成および条件は以下（１）〜（４）の通りである。

【0090】

（１）スキャナーの光学系は、図１に示すスキャナー１の光学系を用いた。すなわち、ＤＮＡチップ１００へレーザー光を入射し、かつ、基板からの正反射光を通過するための穴あきミラー１４を有しているものである。

【0091】

（２）スポット１０２からの蛍光取得時に、ＤＮＡチップ１００の高さ（対物レンズ１３とＤＮＡチップ１００との距離）を変化させ、蛍光強度が最も強くなる高さ位置を０とした。この位置が、レーザー光の焦点位置（表面位置Ｐ０）である。本実施例では、Ｃｙ５で標識化したＤＮＡサンプルを用いたので、波長６３５ｎｍのレーザーとＣｙ５用のバンドパスフィルタを用いた。なお、本スキャナーには、基板とレンズとの距離を調整できる機能がついている。

【0092】

（３）Ｃｙ５の蛍光を測定するレーザー（波長６３５ｎｍ）を使用し、フィルタとしてはＣｙ３を測定する際に使用するバンドパスフィルタと同じものを用いた。本実施例で使用したＣｙ３用のフィルタは、６３５ｎｍでＯＤ値が約５であり、わずかに６３５ｎｍの波長を透過する。レーザー光とフィルタの組合せを上述した組合せとすることにより、基板表面からの反射・散乱光を取得し画像データ化が可能である。

【0093】

（４）オフセット位置（焦点位置から基板表面までの距離）は、−５００μｍから＋１５００μｍまで変化させ、反射・散乱光の画像の比較を行った（図３）。なお、オフセット位置が０との表現は、基板が対物レンズで絞られたレーザー光の焦点位置（表面位置Ｐ０）にあることを示す。また、オフセット位置の符号がマイナスの場合は、焦点位置を基準として基板が対物レンズから遠い位置（表面位置Ｐ１）にあり、符号がプラスの場合は、基板が焦点位置を基準として対物レンズに近い位置（表面位置Ｐ２）にあることを示す。

【0094】

図１１（図１１−１〜図１１−１２）は、本発明の実施例にかかるスキャナー１で読み取ったＤＮＡチップ１００（基板）の画像（Ａ）および光強度変化のグラフ（Ｂ）である。ここで、図１１−１は、オフセット位置が０の場合の画像、および画像中の矢印Ｐ_１−Ｐ_１’間における光強度変化を示すグラフである。図１１−２〜図１１−９は、オフセット位置が＋１００、＋２００、＋３００、＋４００、＋５００、＋７５０、＋１０００、＋１５００の場合の画像、および画像中の矢印Ｐ_２−Ｐ_２’間、矢印Ｐ_３−Ｐ_３’間、矢印Ｐ_４−Ｐ_４’間、矢印Ｐ_５−Ｐ_５’間、矢印Ｐ_６−Ｐ_６’間、矢印Ｐ_７−Ｐ_７’間、矢印Ｐ_８−Ｐ_８’間、矢印Ｐ_９−Ｐ_９’間における光強度変化を示すグラフである。図１１−１０〜図１１−１２は、オフセット位置が−１００、−２００、−５００の場合の画像、および画像中の矢印Ｐ_１０−Ｐ_１０’間、矢印Ｐ_１１−Ｐ_１１’間、矢印Ｐ_１２−Ｐ_１２’間における光強度変化を示すグラフである。なお、図１１に示す画像は、上述した補正部２０ｂによって補正されたアライメント用画像データに応じた画像である。

【0095】

図１１に示すように、オフセット位置が＋２００μｍ以上の場合は、基板のエッジ部分（実際の高さの差９０μｍ、図４−１で示す傾斜角度θは７０度）に対応した明確なコントラストのついた画像および光強度変化のグラフが得られた（図１１−３Ａ，１１−３Ｂ〜図１１−９Ａ，１１−９Ｂ）。一方、オフセット位置が０μｍでは、切削痕による、基板表面のあれ（高さ１μｍ以下）が原因で、乱反射が生じ、９０μｍの凹凸形状とは一致しないが、切削痕と一致する反射強度の乱れを生じていた（図１１−１Ｂ）。オフセット位置が＋１００μｍの場合は、０μｍと比較し、切削痕の影響は小さくなるものの、その影響は残っていた（図１１−２Ｂ）。また、オフセット位置が−１００μｍ、−２００μｍでは、切削痕による、基板表面のあれ（高さ１μｍ以下）が原因で、乱反射が生じ、反射強度の乱れが生じていた（図１１−１０Ｂ、図１１−１１Ｂ）。オフセット位置が−５００μｍでは、基板表面の画像が取得できなかった（図１１−１２Ａ）。

【0096】

以上の結果により、オフセット位置が＋２００μｍ以上、＋１０００μｍ以下の間で、基板のエッジ部分が暗い特に好ましい画像が得られた。なお、オフセット位置が＋１５００μｍでは、エッジ部分が認識できるものの全体的に暗くなる傾向が見られた。オフセット位置がマイナスの場合はエッジが全く認識できない画像しか得られなかった。

【0097】

また、これらの結果に基づき、アライメント用画像を取得する際のオフセット位置を−５００μｍ、０μｍ、＋１００μｍ、＋２００μｍ、＋５００ｕｍ、＋１０００μｍ、＋１２５０μｍ、＋１５００μｍと変化させ、画像のアライメント処理が適切に行えるかどうかの評価を次の手順（１）’〜（５）’で行った。

【0098】

（１）’ハイブリダイゼーション処理済みのＤＮＡチップを合計２０枚用意した。なお、ＤＮＡチップの基板の形状は図１４に示すとおりである。エッジ部分の高さの差は９０μｍであり、図４−１で示す角度θは７０度である。

【0099】

（２）’それぞれのＤＮＡチップについて、オフセット位置が０μｍ（焦点位置）でＣｙ５の蛍光画像を取得した。

【0100】

（３）’オフセット位置を−１００μｍ、０μm、＋１００μｍ、＋２００μｍ、＋５００μｍ、＋７５０μｍ、＋１０００μｍ、＋１２５０μｍ、＋１５００μｍとし、各位置においてアライメント用画像をそれぞれ取得した。このとき、Ｃｙ５の蛍光を測定するレーザー（波長６３５ｎｍ）を使用し、フィルタとしてはＣｙ３を測定する際に使用するバンドパスフィルタと同じものを用いた。

【0101】

（４）’図７の基準点１１０ａ〜１１０ｄに相当する基準点を、それぞれのアライメント用画像データに基づいて、明暗情報を用いたエッジ検出法により検出した。

【0102】

（５）’図６のステップＳ１０４〜Ｓ１０８の工程まで行い、オフセット位置が−１００μｍ、０μm、＋１００μｍ、＋２００μｍ、＋５００μｍ、＋１０００μｍ、＋１２５０μｍ、＋１５００μｍである位置において、それぞれ２０枚のＤＮＡチップに対し、蛍光画像が正しくアライメントされているかどうかを確認した。その結果を表１に示す。

【表1】

【0103】

以上のように、アライメント用画像を取得する際に、ＤＮＡチップを焦点位置に対して対物レンズに近づけることにより、明らかにアライメントの信頼性が増しているのが分かる。上記の実施例ではアライメント用画像を取得する際、焦点位置よりも基板を＋２００μｍ対物レンズ側に近づけて設置することにより、信頼性が大きく増していることが分かる。

【0104】

なお、本実施例にかかるスキャナー１に搭載されている対物レンズのｆ値は６．０ｍｍであった。したがって、上記の結果から、オフセット位置（α）が＋１００〜＋１０００の範囲において、α／ｆの好ましい範囲は、０．０１７（１００／６０００）から０．１７（１０００／６０００）の範囲であった。この範囲では、成功確率が９５％以上である。更に好ましくは、オフセット位置が＋２００〜＋１０００の範囲であって、α／ｆの範囲は、０．０３３（２００／６０００）から０．１７（１０００／６０００）である。この範囲であるとアライメントの成功確率は１００％である。

【0105】

（参考例）
平らなスライドガラスの上に厚さ１５０μｍのテープをはり、それを上記のスキャナー１にセットした。オフセット量＋２５０μｍの状態で、Ｃｙ５の蛍光を測定するレーザー（波長６３５ｎｍ）を使用し、フィルタとしてはＣｙ３を測定する際に使用するバンドパスフィルタと同じものを用いて、アライメント用画像に相当する画像データを得た。この条件は図４−１で示す角度θが９０度に相当する。その結果を図１２−１〜１２−３に示す。

【0106】

図１２−１〜１２−３は、本参考例にかかるスライドガラスの画像および蛍光強度のグラフである。図１２−１は、スキャナー１により得られた画像である。図１２−２は、図１２−１の画像における矢印Ｐ_１３−Ｐ_１３’間における光強度変化を示すグラフである。図１２−３は、図１２−１の画像における矢印Ｐ_１３−Ｐ_１３’間におけるスライドガラス上の高さの差異を示すグラフである。これにより、スライドガラスに貼付されたテープであっても、光の強度変化から高さの差異を把握することができることがわかった。なお、エッジに相当する部分が暗くなっており、角度θが９０度でも問題ないと考えられる。

【産業上の利用可能性】

【0107】

本発明にかかる検出方法、マイクロアレイの解析方法および蛍光読取装置は、基板の高さの差異を正確に検出可能な画像を取得し、アライメント処理を適切に行うのに好適である。

【符号の説明】

【0108】

１，２ スキャナー
１１，１２ レーザー光源
１３ 対物レンズ
１４ 穴あきミラー
１４ａ 微小ミラー
１５ カットフィルタ
１５ａ，１５ｂ 励起光カットフィルタ
１６ 結像レンズ
１７ 画像取得部
１８，１９ ミラー
２０ 制御部
２０ａ 検出部
２０ｂ 補正部
２０ｃ 決定部
２１ 駆動部
１００ ＤＮＡチップ
１０１ ブロック
１０２ スポット
１０３ 凹部
１０４ 保持部
１４０ 穴

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10】

【図11-1A】

【図11-1B】

【図11-2A】

【図11-2B】

【図11-3A】

【図11-3B】

【図11-4A】

【図11-4B】

【図11-5A】

【図11-5B】

【図11-6A】

【図11-6B】

【図11-7A】

【図11-7B】

【図11-8A】

【図11-8B】

【図11-9A】

【図11-9B】

【図11-10A】

【図11-10B】

【図11-11A】

【図11-11B】

【図11-12A】

【図11-12B】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図13】

【図14】

【図15】