6292655 キトサン及びヒアルロナンを含むナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6292655

(24)【登録日】2018年2月23日

(45)【発行日】2018年3月14日

(54)【発明の名称】キトサン及びヒアルロナンを含むナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/73 20060101AFI20180305BHJP

   A61K 8/02 20060101ALI20180305BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20180305BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20180305BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20180305BHJP

   A61K 8/365 20060101ALI20180305BHJP

   B82Y 30/00 20110101ALI20180305BHJP

【ＦＩ】

   A61K8/73

   A61K8/02

   A61Q19/00

   B82Y5/00

   B82Y40/00

   A61K8/365

   B82Y30/00

【請求項の数】13

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2013-213218(P2013-213218)

(22)【出願日】2013年10月10日

(65)【公開番号】特開2014-114272(P2014-114272A)

(43)【公開日】2014年6月26日

【審査請求日】2016年9月12日

(31)【優先権主張番号】特願2012-226107(P2012-226107)

(32)【優先日】2012年10月11日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 開催日：平成２４年５月２９日 集会名：第６１回高分子学会年次大会にて発表

(73)【特許権者】

【識別番号】000113470

【氏名又は名称】ポーラ化成工業株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】899000079

【氏名又は名称】学校法人慶應義塾

(74)【代理人】

【識別番号】100137338

【弁理士】

【氏名又は名称】辻田 朋子

(74)【代理人】

【識別番号】100196313

【弁理士】

【氏名又は名称】村松 大輔

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 智典

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 保博

【審査官】 駒木 亮一

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０６−１００４６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０４−２７５２０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０２−３００１０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１６７１２４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ８／００−８／９９

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２

Ａ６１Ｋ４７／００−４７／４８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒアルロナン、キトサン、及びヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを含む複合粒子であって、前記アニオン性ポリマーは、キトサンに対する親和性がヒアルロナンに比して高いことを特徴とする、複合粒子。

【請求項2】

前記アニオン性ポリマーは、硫酸化ポリマー、又はカルボキシル基高含有ポリマーである、請求項１に記載の複合粒子。

【請求項3】

前記硫酸化ポリマーは、硫酸化多糖である、請求項２に記載の複合粒子。

【請求項4】

前記硫酸化多糖は、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、フコイダン、ケラタン硫酸、ヘパリン、カラギナンである、請求項３に記載の複合粒子。

【請求項5】

前記カルボキシル基高含有ポリマーは、カルボキシル基高含有多糖である、請求項２〜４のいずれかに記載の複合粒子。

【請求項6】

前記カルボキシル基高含有多糖は、ペクチン、アルギン酸である、請求項５に記載の複合粒子。

【請求項7】

ヒアルロナンを４０〜８０質量％、キトサンを１５〜４５質量％、及び前記アニオン性ポリマーを１〜３０質量％含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の複合粒子。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれかに記載の複合粒子の製造方法であって、
ヒアルロナン、キトサン、前記アニオン性ポリマーを、緩衝液の存在下で複合化することを特徴とする、複合粒子の製造方法。

【請求項9】

ヒアルロナンを緩衝液中に溶解する工程と、
キトサンを緩衝液中に溶解する工程と、
前記アニオン性ポリマーを、緩衝液中に溶解する工程と、
ヒアルロナン溶液、キトサン溶液、及びアニオン性ポリマー溶液を混合撹拌する工程と、
を含む、請求項８に記載の複合粒子の製造方法。

【請求項10】

前記ヒアルロナン溶液、キトサン溶液、及びアニオン性ポリマー溶液を混合撹拌する工程において、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナンのカルボキシル基の電荷比が１：０．１〜１：５、かつ、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和の電荷比が、１：０．０１〜１：２、となるように各溶液を混合することを特徴とする、請求項８又は９に記載の複合粒子の製造方法。

【請求項11】

前記緩衝液がクエン酸緩衝液である、請求項８〜１０のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。

【請求項12】

請求項１〜７のいずれかに記載の複合粒子の保存方法であって、前記複合粒子を、緩衝液中で保存することを特徴とする、複合粒子の保存方法。

【請求項13】

前記緩衝液がクエン酸緩衝液である、請求項１２に記載の複合粒子の保存方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚外用剤の原料として利用され得るナノ粒子、及びそのナノ粒子の製造方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

皮膚外用剤の有効成分を角質細胞層内に送達するためには、従来以下のような点が問題とされてきた。
皮膚の角層細胞層は、外界からの異物の侵入を防ぐためにバリア機能を有しており、有効成分が角層細胞層内に到達しにくい。
特に、有効成分が高分子化合物である場合には、高分子化合物が低浸透性であるため角層細胞層内に浸透しにくく、有効成分が皮膚表面で凝集してしまう。

【0003】

このような状況において、有効成分を角層細胞層内に送達するためのキャリアとして、ナノ粒子の開発が進められてきた。
特許文献１には、核酸、オリゴ核酸、又はその誘導体；カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質若しくはそれを含む集合体；及びアニオン性ポリマーを含む複合体の凍結乾燥体が記載されている。

【0004】

特許文献２には、直径１μｍ未満の活性成分の投与用のナノ粒子を得る方法であって、ａ）ヒアルロナン塩の水溶液を調製し、ｂ）カチオン性ポリマーの水溶液を調製し、ｃ）ポリアニオン塩を前記ヒアルロナン塩溶液に加え、ｄ）前記ｂ）およびｃ）において得られた溶液を撹拌混合し、自然発生的にナノ粒子を得ることを含んでおり、前記ａ）、ｂ）またはｃ）において得られた溶液のうち１つに、あるいは前記ｄ）において得られたナノ粒子の懸濁液に、前記活性成分を溶解させ、ナノ粒子に吸着させる、方法が記載されている。

【0005】

特許文献３には、生物学的に活性な分子を放出するためのナノ粒子を含んでなる系であって、前記ナノ粒子が、ａ）少なくとも５０重量％のキトサンまたはキトサン誘導体、およびｂ）５０重量％未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧ誘導体を含んでなる共役物を含んでおり、前記料成分ａ）とｂ）とが、キトサンアミノ基を介して共有結合しており、前記ナノ粒子が架橋剤により架橋していることを特徴とする系が記載されている。

【0006】

特許文献４には、平均サイズ１マイクロメートル未満のナノ粒子を含み、ナノ粒子がａ）ヒアルロナンまたはその塩；およびｂ）キトサンまたはその誘導体、を含む生物活性分子の放出のための系であって、キトサンまたはその誘導体の分子量が９０ｋＤａ未満であることを特徴とする系が記載されている。また、生物活性分子として核酸等を含む系、網状化剤としてトリポリリン酸塩を含む系が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００７／１３２８７３号パンフレット

【特許文献2】特表２００７−５２０４２４号公報

【特許文献3】特表２００８−５３３１０８号公報

【特許文献4】特表２００９−５３７６０４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

ところで、製造したナノ粒子を化粧水の成分などとして配合する際には、溶液中での安定性が問題となる。
特に、従来のナノ粒子は、溶液中でナノ粒子同士の凝集が起こり、粒子径が増大するという問題があった。
そこで、本発明は、キトサン及びヒアルロナンを含む、溶液中での安定性に優れた複合粒子を提供することを課題とする。特にキトサン及びヒアルロナンからなる二元複合粒子よりも溶液中での安定性に優れた複合粒子を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、キトサン及びヒアルロナンを含む複合粒子の溶液中での安定性を高める技術を求めて鋭意研究努力を重ねた結果、キトサン及びヒアルロナンに、キトサンに対する親和性がヒアルロナンに比して高いアニオン性ポリマーを組み合わせることにより、複合粒子の安定性が顕著に高まることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、以下のとおりである。

【0010】

前記課題を解決するための本発明は、ヒアルロナン、キトサン、及びヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを含む複合粒子であって、前記アニオン性ポリマーは、キトサンに対する親和性がヒアルロナンより高いことを特徴とする。
キトサンに対する親和性が、ヒアルロナンに比して高いアニオン性ポリマーを、組み合わせることにより、複合粒子の溶液中での保存安定性が顕著に高まる。特に、ヒアルロナンとキトサンの二元系複合粒子は、低濃度、低温で保存した場合には、凝集を起こしやすいという問題があったが、本発明の三元系複合粒子は、このような条件でも問題となるような粒子径の増大をほとんど起こさない。すなわち、温度や濃度にかかわらず安定性が高いものである。

【0011】

前記アニオン性ポリマーとしては、硫酸化ポリマー、又はカルボキシル基高含有ポリマー等を用いることが可能である。

【0012】

例えば、前記硫酸化ポリマーは、硫酸化多糖である。本発明の複合粒子を皮膚外用剤、化粧料の成分として用いる場合には、その安全性から硫酸化多糖が好ましく用いられる。

【0013】

前記硫酸化多糖としては、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、フコイダン、ケラタン硫酸、ヘパリン及びカラギナンなどが挙げられる。

【0014】

例えば、前記カルボキシル基高含有ポリマーは、カルボキシル基高含有多糖である。

【0015】

前記カルボキシル基高含有多糖としては、アルギン酸、ペクチンなどが挙げられる。

【0016】

本発明の好ましい形態では、ヒアルロナンを４０〜８０質量％、キトサンを１５〜４５質量％、前記アニオン性ポリマーを１〜３０質量％含む。
各成分を上記範囲で含むことにより、小さな粒子径の複合粒子を作製でき、しかも安定性も実現することが容易になる。

【0017】

本発明はまた、ヒアルロナン、キトサン、前記アニオン性ポリマーを、緩衝液の存在下で複合化することを特徴とする、複合粒子の製造方法である。
本発明の製造方法によれば、小さな粒子径であり、かつ溶液中での安定性の高い複合粒子を効率よく作製することができる。

【0018】

本発明の好ましい形態では、本発明の製造方法は、ヒアルロナンを緩衝液中に溶解する工程と、キトサンを緩衝液中に溶解する工程と、前記アニオン性ポリマーを、緩衝液中に溶解する工程と、ヒアルロナン溶液、キトサン溶液、及びアニオン性ポリマー溶液を混合撹拌する工程と、を含む。
このような方法によれば、凝集を防ぎながら粒子径の複合粒子を製造することが容易になる。

【0019】

本発明の好ましい形態では、本発明の製造方法は、前記ヒアルロナン溶液、キトサン溶液、及びアニオン性ポリマー溶液を混合撹拌する工程において、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナンのカルボキシル基の電荷比が１：０．１〜１：５、かつ、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和の電荷比が、１：０．０１〜１：２、となるように各成分の混合比を調整する。
このように電荷比に基づいた混合比で混合され、作製された複合粒子は、粒子径が小さくなり、また、保存安定性に優れたものとなる。

【0020】

本発明の好ましい形態では、前記緩衝液はクエン酸緩衝液である。
緩衝液としてクエン酸緩衝液を用いることにより、ナノサイズ（たとえば、約１００ｎｍ以下）の複合粒子を効率よく製造することが容易になる。特に、比較的大きな分子量（たとえば、６００ｋＤａ以上）のヒアルロナンを用いた場合においても、ナノサイズの複合粒子を製造することができる。

【0021】

本発明は、上記製造方法により製造された複合粒子の保存方法であって、前記複合粒子を、緩衝液中で保存することを特徴とする。また、この場合の緩衝液としては、クエン酸緩衝液が好ましい。
本発明の複合粒子を、緩衝液中で保存することにより、粒子径の増大を引き起こさずに安定的に保存することができる。

【発明の効果】

【0022】

本発明の複合粒子は、従来のヒアルロナンとキトサンの二元系複合粒子に比して、溶液中での安定性にきわめて優れる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ヒアルロナン（４８０ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図2】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図3】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（１０ｋＤａ）三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図4】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（１４ｋＤａ）三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図5】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（１５ｋＤａ）三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図6】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（４０ｋＤａ）三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図7】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／ヘパリン三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図8】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／ペクチン三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図9】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／κ-カラギナン三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図10】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／ι-カラギナン三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図11】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／アルギン酸（６４ｋＤａ）三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図12】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／アルギン酸（１１０ｋＤａ）三元複合粒子の各混合比における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図13】ヒアルロナン（４８０ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／ニ元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図14】ヒアルロナン（４８０ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図15】ヒアルロナン（９１０ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）二元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図16】ヒアルロナン（９１０ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図17】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）ニ元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図18】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図19】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（１０ｋＤａ）三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図20】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（１５ｋＤａ）三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図21】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（４０ｋＤａ）三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図22】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／ヘパリン三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図23】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／ペクチン三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図24】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／アルギン酸（６４ｋＤａ）三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図25】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／ι-カラギナン三元複合粒子の各作製濃度における粒子径の個数分布を示すグラフである。

【図26】ヒアルロナンとキトサンの二元複合粒子の、４℃低濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図27】ヒアルロナン、キトサン、コンドロイチン硫酸の三元複合粒子の、４℃低濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図28】ヒアルロナンとキトサンの二元複合粒子の、室温低濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図29】ヒアルロナン、キトサン、コンドロイチン硫酸の三元複合粒子の、室温低濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図30】ヒアルロナンとキトサンの二元複合粒子の、３７℃低濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図31】ヒアルロナン、キトサン、コンドロイチン硫酸の三元複合粒子の、３７℃低濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図32】ヒアルロナンとキトサンの二元複合粒子の、４℃高濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図33】ヒアルロナン、キトサン、コンドロイチン硫酸の三元複合粒子の、４℃高濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図34】ヒアルロナンとキトサンの二元複合粒子の、室温高濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図35】ヒアルロナン、キトサン、コンドロイチン硫酸の三元複合粒子の、室温高濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図36】ヒアルロナンとキトサンの二元複合粒子の、３７℃高濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図37】ヒアルロナン、キトサン、コンドロイチン硫酸の三元複合粒子の、３７℃高濃度での粒子径の変化を示すグラフである。

【図38】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）二元複合粒子の、４℃での粒子径の変化を示すグラフである。

【図39】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）二元複合粒子の、室温（ＲＴ）での粒子径の変化を示すグラフである。

【図40】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）二元複合粒子の、３７℃での粒子径の変化を示すグラフである。

【図41】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子の、４℃での粒子径の変化を示すグラフである。

【図42】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子の、室温（ＲＴ）での粒子径の変化を示すグラフである。

【図43】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子の、３７℃での粒子径の変化を示すグラフである。

【図44】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／コンドロイチン硫酸（１５ｋＤａ）三元複合粒子の、室温（ＲＴ）での粒子径の変化を示すグラフである。

【図45】ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）／キトサン（１１０ｋＤａ）／ヘパリン三元複合粒子の、室温（ＲＴ）での粒子径の変化を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明は、ヒアルロナン、キトサン、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの複合粒子に関する。
まず、複合粒子を形成する各成分について説明する。

【0025】

＜１＞ヒアルロナン
本発明で用いられるヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸およびＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの二糖を繰り返し単位とする多糖である。

【0026】

本発明で用いられるヒアルロナンの分子量は制限されないが、好ましくは１００〜２０００ｋＤａ、より好ましくは３００〜１５００ｋＤａ、さらに好ましくは４００〜１３００ｋＤａのものを用いることができる。

【0027】

ヒアルロナンは、ヒアルロン酸、又はヒアルロン酸塩のいずれであっても良い。
ヒアルロン酸塩を形成する塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
ヒアルロナンは、市販品を用いることが可能である。

【0028】

＜２＞キトサン
キトサンは、キチンの脱アセチル化により得られ、グルコサミンを繰り返し単位とする多糖である。キトサンの脱アセチル化度は、例えば５０〜９８％程度である。
本発明で用いられるキトサンの分子量は制限されないが、例えば１〜５００ｋＤａ、好ましくは１０〜３００ｋＤａ、さらに好ましくは１９〜１１０ｋＤａのものを用いることができる。また、小さな粒子径の複合粒子を作製する観点からは、キトサンの分子量は好ましくは２０〜２００ｋＤａ、より好ましくは５０〜１５０ｋＤａ、さらに好ましくは、８０〜１２０ｋＤａのものが挙げられる。

【0029】

キトサンは、キトサンの誘導体であっても良い。たとえば、アセチル化、アルキル化、スルホン化、チオール化誘導体が挙げられる。また、塩酸、酢酸、クエン酸、硝酸、乳酸等の塩も使用できる。
キトサンは、市販品を用いることが可能である。

【0030】

＜３＞ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマー
本発明で用いられるヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーは、キトサンに対する親和性が、ヒアルロナンのキトサンに対する親和性より高いものである。
複合粒子における第三の成分としてキトサンに対する親和性がヒアルロナンよりも高いアニオン性ポリマーを用いることにより、形成される複合粒子を強固なものとすることができ、溶液中での粒子同士の凝集を防ぐことが可能となる。

【0031】

例えば、前記アニオン性ポリマーは、硫酸化ポリマー、又はカルボキシル基高含有ポリマーである。
硫酸化ポリマーとしては、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、フコイダン、ケラタン硫酸、ヘパリン、カラギナンなどの硫酸化多糖や、硫酸化ポリビニルアルコールなどの強酸性ポリマーが挙げられる。
カラギナンとしてはκ−カラギナン及びι−カラギナンが好ましく例示でき、より好ましくは硫酸化度が高いι−カラギナンが挙げられる。
カルボキシル基高含有ポリマーは、ヒアルロナンよりもキトサンに対して親和性が高いものとなるように多量のカルボキシル基を有しているポリマーと定義される。
カルボキシル基高含有ポリマーとしては、ポリアルギン酸、ペクチンなどのカルボキシル基含有多糖、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸などが挙げられる。
本発明の複合粒子を皮膚外用剤、化粧料などに用いる場合には、その安全性から多糖を用いることが好ましく、硫酸化多糖、カルボキシル基含有多糖を用いることが特に好ましい。
前記アニオン性ポリマーの分子量は、好ましくは３〜６０ｋＤａ、さらに好ましくは１０〜５０ｋＤａ、より好ましくは２０〜４０ｋＤａである。
また、前記アニオン性ポリマーとしては、好ましくは３〜３０００ｋＤａ、さらに好ましくは１０〜２０００ｋＤａ、より好ましくは２０〜１８００ｋＤａのものを用いることもできる。
より具体的には、以下のものを用いることができる。
コンドロイチン硫酸・・・５〜５０ｋＤａ
ヘパリン・・・２〜３０ｋＤａ
カラギナン・・・１０００〜２０００ｋＤａ
ポリアルギン酸・・・４０〜１００ｋＤａ
ペクチン・・・３０〜５００ｋＤａ

【0032】

次に、本発明の複合粒子について説明する。
＜４＞複合粒子
本発明の複合粒子は、上述したヒアルロナン、キトサン、及びヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーであって、キトサンに対する親和性がヒアルロナンよりも高いものの３成分を含む。
複合粒子における各成分の割合は、以下を基準とすることができる。
ヒアルロナン：好ましくは４０〜８０質量％、さらに好ましくは５０〜７５質量％、より好ましくは６０〜７０質量％
キトサン：好ましくは１５〜４５質量％、さらに好ましくは２０〜４０質量％、より好ましくは２５〜３５質量％
ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマー：好ましくは１〜３０質量％、さらに好ましくは２〜２０質量％、より好ましくは３〜１０質量％

【0033】

また、ヒアルロナンとキトサンの比率として、キトサン由来のアミノ基の数１に対して、ヒアルロン酸由来のカルボキシル基の数が、０．１以上、好ましくは０．３〜５、より好ましくは０．５〜１となるような比率とすることも好ましい。
また、キトサンとヒアルロナンの重量比として、キトサン１に対して、アニオン性ポリマーが、好ましくは０．１〜１０、さらに好ましくは０．１〜０．３もしくは０．７〜２である。
また、キトサンとヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの重量比として、キトサン１に対して、アニオン性ポリマーが、好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．１〜１．５である。
また、キトサンとヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの比率として、キトサン由来のアミノ基の数１に対して、ヒアルロン以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和が、０．００５以上、好ましくは０．０１〜１５、より好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．１〜１となるような比率とすることも好ましい。

【0034】

＜５＞複合粒子の製造方法
上述した複合粒子は、例えば、各成分を溶液中で複合することにより得ることができる。
この際、溶液として、緩衝液を用いることが好ましい。
緩衝液としては、クエン酸緩衝液、ＭＯＰＳ、ＰＢＳなどを用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることで、小さな粒子径の複合粒子を効率よく製造できる。特に、クエン酸緩衝液を用いることで、６００ｋＤａ以上の大きい分子量のヒアルロナンを用いても、１００ｎｍ以下のナノ粒子を形成することが可能となる。
クエン酸緩衝液のｐＨは、好ましくは７．０以下、さらに好ましくは６．８以下、より好ましくは６．５以下である。また、ｐＨの下限値は特に制限されないが、例えば皮膚外用剤などに用いる場合には、皮膚への刺激性の観点などから、ｐＨ５．５程度を下限とすることが好ましい。

【0035】

また、クエン酸緩衝液におけるクエン酸濃度は、好ましくは０．１〜１０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜５ｍＭ、特に好ましくは１〜２ｍＭである。

【0036】

以下、具体的な製造方法について、説明する。
（１）ヒアルロナン溶液の調製
溶媒として、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、ヒアルロナン溶液を調製する。
ヒアルロナン溶液におけるヒアルロナンの濃度は、２００〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５００〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜２０００μｇ／ｍＬである。このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でキトサン溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。

【0037】

（２）キトサン溶液の調製
溶媒として、上述したクエン酸緩衝液を用い、キトサン溶液を調製する。
キトサン溶液におけるキトサンの濃度は、好ましくは２００〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５００〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜２０００μｇ／ｍＬである。このような濃度に調節しておくことにより、後の工程でヒアルロナン溶液と混合した際に、粒子の不要な凝集を回避することができる。

【0038】

（３）アニオン性ポリマー溶液
ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの溶液（以下、アニオン性ポリマー溶液）におけるアニオン性ポリマーの濃度は、２００〜５０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５００〜３０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜２０００μｇ／ｍＬである。

【0039】

（４）各溶液の混合
続いて、調製したヒアルロナン溶液、キトサン溶液、及びアニオン性ポリマー溶液を混合する。
各溶液の混合割合は、例えば以下を基準として決定することが好ましい。
キトサン由来のアミノ基の数１に対して、ヒアルロン酸由来のカルボキシル基の数が、０．１以上、好ましくは０．２〜５、より好ましくは０．５〜１である。
また、ヒアルロナンとキトサンの比率として、キトサン由来のアミノ基の数１に対して、ヒアルロン酸由来のカルボキシル基の数が、０．１以上、好ましくは０．３〜５、より好ましくは０．５〜１となるような比率とすることも好ましい。
また、キトサンとヒアルロナンの重量比として、キトサン１に対して、ヒアルロナンが、好ましくは０．１〜１０、さらに好ましくは０．１〜０．３もしくは０．７〜２である。
また、キトサンとヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの重量比として、キトサン１に対して、アニオン性ポリマーが、好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．１〜１．５である。
また、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナンのカルボキシル基の電荷比が１：０．０５〜１：５、より好ましくは１：０．１〜１：２、さらに好ましくは１：０．２〜１：１、かつ、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和の電荷比が、１：０．０１〜１：５、より好ましくは１：０．０５〜１：２、さらに好ましくは１：０．１〜１：１、となるように各成分を混合するようにしてもよい。かかる混合比は、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーとして、コンドロイチン硫酸（分子量は問わない）、ヘパリン、ペクチン、κ−カラギナン、ι−カラギナンを用いる場合に特に好ましい。
またヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーとして、アルギン酸を用いる場合には、混合液中のキトサンのアミノ基とヒアルロナンのカルボキシル基の電荷比が１：０．０５、より好ましくは１：０．１〜１：２、さらに好ましくは１：０．２〜１：１、かつ、混合液中のキトサンのアミノ基とアルギン酸のカルボキシル基と硫酸基の和の電荷比が、１：０．００５〜１：１、好ましくは１：０．０１〜１：０．５、さらに好ましくは１：０．０５〜１：０．２、となるように調整する。
混合後の溶液に対するヒアルロナンの濃度が、好ましくは１〜２０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜１０００μｇ／ｍＬである。
混合後の溶液に対するキトサンの濃度が、好ましくは１〜１０００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜５００μｇ／ｍＬである。
混合後の溶液に対するアニオン性ポリマーの濃度が、好ましくは０．２〜５０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．５〜２０μｇ／ｍＬである。

【0040】

混合の方法としては、各溶液を一度に混合する方法、一つの溶液に、他の溶液を滴下する方法などが挙げられる。いずれも、溶液を撹拌しながら混合を行うことが、凝集を回避する観点から好ましい。
また、一つの溶液に、他の溶液を滴下する方法においては、ヒアルロナン溶液をキトサン溶液に滴下する方法が、より小さな粒径の粒子を作製する観点から好ましい。
また、アニオン性ポリマー溶液を、予めヒアルロナン溶液と混合しておいて、ここにキトサン溶液を滴下する方法が好ましく挙げられる。

【実施例】

【0041】

＜試験例１＞三元複合粒子の作製
複合粒子の作製には、以下の成分を用いた。
ヒアルロナン（ＨＡ、発酵法由来、ＭＲＣポリサッカライド社）：４８０ｋＤａ、ヒアルロナン濃度３４．３μｇ／ｍＬ（混合前の調製時濃度は１０３μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
キトサン（焼津水産工業）：３４．３ｋＤａ、キトサン濃度１６．７μｇ／ｍＬ（調製時濃度は５０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
コンドロイチン硫酸（ＣＳ，硫酸化度：１．２１％、生化学工業）：２２ｋＤａ、２．０μｇ／ｍＬ（調製時濃度は６．０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
クエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）：クエン酸濃度１ｍＭ

【0042】

上に示す割合で、ヒアルロナンとキトサンとの二元複合粒子と、ヒアルロナン、キトサン、コンドロイチン硫酸の三元複合粒子を作製した。
二元複合粒子については、クエン酸緩衝液を溶媒としてヒアルロン酸ナトリウム溶液とキトサン溶液を調製し、キトサン溶液を撹拌しながら、キトサン溶液にヒアルロン酸ナトリウム溶液を滴下することにより複合粒子を作製した。
また、三元複合粒子については、クエン酸緩衝液を溶媒としてヒアルロン酸ナトリウム溶液、キトサン溶液、コンドロイチン硫酸溶液を調製し、コンドロイチン硫酸溶液をヒアルロン酸ナトリウム溶液に加え、混合した後に、混合液にキトサン溶液を滴下して撹拌し、作製した。
すなわち、１ｍｇ／ｍＬ ＨＡクエン酸溶液、１ｍｇ／ｍＬキトサンクエン酸溶液、１ｍｇ／ｍＬ ＣＳクエン酸溶液にクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を所定量加え希釈し、室温で１５分間静置した。希釈したＨＡ溶液とＣＳ溶液を十分混合した後、希釈したキトサン溶液を加えて室温で１５分間静置することで、ＨＡ/キトサン/ＣＳ三元複合体ナノ粒子を作製した。混合比は、キトサンのアミノ基（Ｎ）、ＨＡのカルボキシル基（Ｃ）、コンドロイチン硫酸のカルボキシル基と硫酸基の和（−）の電荷比Ｎ：Ｃ：（−）が１：０．５：０．５となるように調整されたものである。
二元複合粒子、三元複合粒子を、製造に用いたクエン酸緩衝液中、低温条件（４℃）で保存した。
表１に、複合粒子の粒子径、複合粒子の表面電荷（ゼータ電位）及び多分散指数を示す。
複合粒子の平均粒子径及び多分散指数は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−Ｚ ＺＥＮ３６００、 Ｍａｌｖｅｒｎ社（動的光散乱法）を用いて測定した。
複合粒子の表面電荷は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ ＺＥＮ３６００、 Ｍａｌｖｅｒｎ社（レーザードップラー法）を用いて測定した。

【表1】

【0043】

ゼータ電位においてヒアルロナン単体は約−６３ｍＶ、キトサン単体は約３ｍＶである。表１に示すように、本実施例で作製した粒子の表面電荷は、比較例１の二元複合粒子では−３１．４ｍＶ、実施例１の三元複合粒子では−３４．５ｍＶであることから、単体との違いが見られた。すなわち、本試験例の処方によって二元複合粒子及び三元複合粒子が形成されていることが確認できた。
二元複合粒子と三元複合粒子を比較すると、平均粒子径はいずれも１００ｎｍ程度であったが、多分散指数が二元複合粒子は０．２５５であるのに対して、三元複合粒子は０．１６６であった。つまり三元複合粒子の方が二元複合粒子に比して均一な粒子径を持つ集合として得られることがわかった。

【0044】

＜試験例２＞キトサンの分子量の検討
試験例１においては分子量３４．３ｋＤａのキトサンを用いてヒアルロナンとコンドロイチン硫酸との三元複合粒子が形成できることを示した。次に、キトサンの分子量を変更した場合にも三元複合粒子が形成されるのか否かについて検討を行った。
本試験例においては分子量１１０ｋＤａのキトサン（脱アセチル化度：６４．７％、焼津工業）と、試験例１で使用した分子量４８０ｋＤａのヒアルロナン及び分子量２２ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いて三元複合粒子の作製を行った（実施例２）。なお、本実施例における三元複合粒子の作製は、試験例１と同じ方法により行った。また、各成分の作製濃度は以下に記載する通りである。
ヒアルロナン：１７．２μｇ／ｍＬ（混合前の調製時濃度は１０３μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は1mg/mL）
キトサン：２４．７μｇ／ｍＬ（調製時濃度は５０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は１ｍｇ／ｍＬ）
コンドロイチン硫酸：２．１μｇ／ｍＬ（調製時濃度は６．０μｇ／ｍＬ、保存用の溶液の作製濃度は１ｍｇ／１ｍＬ）
クエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）：クエン酸濃度１ｍＭ
各成分の混合比は、キトサンのアミノ基（Ｎ）、ＨＡのカルボキシル基（Ｃ）、コンドロイチン硫酸のカルボキシル基と硫酸基の和（−）の電荷比Ｎ：Ｃ：（−）が１：０．５：０．５となるように調整されたものである。

【0045】

作製した複合粒子の平均粒子径、多分散指数及び表面電荷は、試験例１と同様の機器を用いて測定した。
表２に本試験例で作製した実施例２に係る三元複合粒子と、試験例１で作製した実施例１に係る三元複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。

【0046】

【表2】

【0047】

表２より、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸三元複合粒子の作製にあっては、低分子量（３４．３ｋＤａ）のキトサンよりも、高分子量（１１０ｋＤａ）のキトサンを用いた方が、より小さい粒子径を持つ複合粒子を得られることが分かった。

【0048】

＜試験例３＞ヒアルロナンの分子量の検討
試験例１及び２においては分子量４８０ｋＤａのヒアルロナンを用いた場合に、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸三元複合粒子を作製することができることを示した。次に、分子量４８０ｋＤａ以外のヒアルロナンを用いた場合においても同様に三元複合粒子を作製することができるか否か検討を行った。
本試験例では、分子量９１０及び１３００ｋＤａのヒアルロナンを用いて三元複合粒子の作製を行った。本試験例における複合粒子の作製方法、各成分の作製濃度及び測定方法等は試験例２と同様である。なお、本試験例で使用した９１０ｋＤａと１３００ｋＤａのヒアルロナンも発酵法由来、ＭＲＣポリサッカライド社製のものである。
表３に各分子量のヒアルロナンを用いた場合における三元複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。

【0049】

【表3】

【0050】

表３に示す通り、分子量４８０、９１０及び１３００ｋＤａのヒアルロナンのいずれを用いた場合であっても、４０ｎｍ前後の小さな複合粒子を形成できることが分かった。また、低分子量のヒアルロナンを用いた場合には、複合粒子の粒子径は小さくなるという傾向があることがわかった。

【0051】

＜試験例４＞コンドロイチン硫酸の分子量の検討
試験例１〜３においては分子量２２ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いた場合に、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸三元複合粒子を作製することができることを示した。次に、分子量２２ｋＤａ以外のコンドロイチン硫酸を用いた場合においても同様に三元複合粒子を作製することができるか否か検討を行った。
本試験例では、分子量１０、１４、１５及び４０ｋＤａのコンドロイチン硫酸と、分子量１３００ｋＤａのヒアルロナンと、分子量１１０ｋＤａのキトサンとの三元複合粒子の作製を行った。本試験例における複合粒子の作製方法、各成分の作製濃度及び測定方法等は試験例２と同様である。なお、本試験例で使用したコンドロイチン硫酸の硫酸化度は、分子量１０ｋＤａのものが１．０２％、分子量１４ｋＤａのものが０．９６％、分子量１５ｋＤａのものが１．０６％、分子量４０ｋＤａのものが１．０８％であり、いずれも生化学工業より購入したものである。
表４に各分子量のコンドロイチン硫酸を用いた場合における三元複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。

【0052】

【表4】

【0053】

表４に示す通り、いずれの分子量のコンドロイチン硫酸を用いた場合であっても、比較例２の二元複合粒子よりも小さな粒子径の三元複合粒子が形成されることが分かった。この結果から、コンドロイチン硫酸はいずれの分子量であっても、ヒアルロナン／キトサン二元複合粒子よりも小さな粒子径を持つ、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸三元複合粒子を形成することができることが分かった。

【0054】

＜試験例５＞コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーの検討
試験例１〜４においては、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸からなる三元複合粒子が形成されることについて示した。
本試験例では、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーであっても、三元複合粒子を形成することができるのか否かについて検討を行った。
本試験例では、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーとして、ヘパリン（分子量５〜２０ｋＤａ、ｎａｋａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）、ペクチン（分子量５０〜３５０ｋＤａ、和光純薬工業）、アルギン酸（６４ｋＤａ及び１１０ｋＤａ、和光純薬工業）、κ−カラギナン（１４００ｋＤａ、ＭＲＣポリサッカライド）及びι−カラギナン（１６００ｋＤａ、ＭＲＣポリサッカライド）を用いて検討を行った。
本試験例における複合粒子の作製方法及び測定方法等は試験例２と同様である。作製濃度は、ヒアルロナン（１３００ｋＤａ）及びキトサン（１１０ｋＤａ）については試験例２と同様であり、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーについては以下に示す通りである。
ヘパリン：６．８μｇ／ｍＬ
ペクチン：８．０μｇ／ｍＬ
アルギン酸（６４ｋＤａ及び１１０ｋＤａ）：１．６μｇ／ｍＬ
κ−カラギナン：３．６μｇ／ｍＬ
ι−カラギナン：２．１μｇ／ｍＬ
上の混合比は、これまでの試験例と同様にキトサンのアミノ基（Ｎ）、ＨＡのカルボキシル基（ｃ）、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和（−）の電荷比Ｎ：Ｃ：（−）が１：０．５：０．５となるように調整されたものである。
表５に本試験例において作製した複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。

【0055】

【表5】

【0056】

表５に示す通り、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーとしていずれの分子種を用いた場合であっても、１００ｎｍ以下の三元複合粒子を形成できることがわかる。

【0057】

＜試験例６＞混合比の検討
これまでの試験例においてはキトサンのアミノ基（Ｎ）、ヒアルロナンのカルボキシル基（Ｃ）、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーのカルボキシル基と硫酸基の和（−）の電荷比Ｎ：Ｃ：（−）が１：０．５：０．５となるように、各成分の濃度を調整し、三元複合粒子が形成されることを確認した。
本試験例では、Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．５以外の混合比であっても三元複合粒子の形成ができるか否かについて検討を行った。
本試験例においてはＮ：Ｃ比は１：０．５で固定し、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの比率（−）を変更して試験を行った。本試験例における複合粒子の作製方法及び測定方法等は試験例２と同様である。作製濃度は、ヒアルロナン及びキトサンについては試験例２と同様であり、コンドロイチン硫酸以外のアニオン性ポリマーについては、試験例２〜５における濃度を基に、表６〜１７に示す各実施例におけるヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーの比率（−）に対応するように増減した。
表６〜１７に、三元複合粒子の成分、混合比（Ｎ：Ｃ：（−）比）、作製した複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。また、図１〜１２に、作製した複合粒子の粒子径の個数分布を表すグラフを示す。

【0058】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【表15】

【表16】

【表17】

【0059】

表６〜１１及び図１〜６に示すように、種々の分子量のコンドロイチン硫酸を用いた場合には、Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．１、１：０．５：０．５、１：０．５：１のすべての場合において、すべての分子量のコンドロイチン硫酸において５０ｎｍ前後の三元複合粒子を得ることができることがわかった。また、Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．１、１：０．５：０．５のときには多分散指数も低く、溶液中に存在する複合粒子の粒子径の均一性も高いことが分かった。

【0060】

表１２〜１５及び図７〜１０より、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーとしてヘパリン、ペクチン、κ−カラギナン、ι−カラギナンを用いたときには、すべての混合比において１００ｎｍ程度の粒子が形成されることがわかる。
また、Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．１、１：０．５：０．５のときには多分散指数も低く、溶液中に存在する複合粒子の粒子径の均一性も高いことが分かった。
また、表１４及び図９に示すようにκ−カラギナンを用いた場合には、混合比Ｎ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．５、１：０．５：１のいずれにおいても、形成される三元複合粒子はι−カラギナンを用いた場合に比べ粒子径は大きく、且つ分散指数は高くなることがわかった。つまり、三元複合粒子の作製においてアニオン性ポリマーとしては、κ−カラギナンよりも硫酸化度が高いι−カラギナンの方がより好ましいということができる。

【0061】

表１６及び図９より、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーとして分子量６４ｋＤａのアルギン酸を用いる場合には、その混合比率が低い方が、多分散性の低い複合粒子を得ることができることがわかる。より多分散性の低い複合粒子を得ることができる混合比率はＮ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．０５及び１：０．５：０．１であった。
一方、表１７及び図１２より、分子量１１０ｋＤａのアルギン酸を用いる場合にも同様に、その混合比率が低い方が多分散指数の低い複合粒子が得られることが分かった。より多分散性の低い複合粒子を得ることができる混合比率はＮ：Ｃ：（−）＝１：０．５：０．０１及び１：０．５：０．０５であった。

【0062】

＜試験例７＞作製濃度の検討
本試験例においては、これまでの試験例における複合粒子の作製濃度を濃くした場合であっても、凝集することなく三元複合粒子を得ることができるのか否かについて検討を行った。
これまでの試験例で作製した実施例２〜５、７〜１１及び１３の三元複合粒子の作製時の各成分の濃度を５倍及び１５倍にした時の平均粒子径等を測定した。本試験例における複合粒子の作製方法及び測定方法は、作製時の各成分の濃度以外は、これまでの比較例と同様である。
また、比較例として二元複合粒子の作製濃度を変更した場合に形成される複合粒子の平均粒子径等も測定した。
表１８〜３０に、本試験例で作製した複合粒子の平均粒子径、個数分布における１００ｎｍ以下の粒子の割合、多分散指数（Ｐｄｉ）、そして表面電位（ゼータ電位）を示す。なお、表中（×１）、（×５）及び（×１５）とは、作製濃度が１倍（これまでの試験例と同じ）、５倍、１５倍であることを示す。また、図１３〜２５に本試験例で作製した複合粒子の粒子径の個数分布を表すグラフを示す。

【0063】

【表18】

【表19】

【表20】

【表21】

【表22】

【表23】

【表24】

【表25】

【表26】

【表27】

【表28】

【表29】

【表30】

【0064】

表１８〜２３及び図１３〜１８に示すように、ヒアルロナンの分子量を種々のものに変更した場合では、ヒアルロナン／キトサン二元複合粒子においては作製濃度が高くなるに比例して粒子径が大きくなることがわかる。また。１５倍の濃度で複合粒子を作製した場合には、その多分散指数は非常に大きくなってしまう。
一方、ヒアルロナン／キトサン／コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）三元複合粒子においては、いずれの分子量のヒアルロナンを用いた場合であっても、形成される三元複合粒子の平均粒子径は、作製濃度５倍までは１００ｎｍ以下となることがわかった。また、１５倍の濃度で作製した場合であっても、かかる三元複合粒子の多分散指数は、二元複合粒子と比較して低くなることがわかる。
これらの結果より、ヒアルロナン／キトサンを含む複合粒子を作製するにあたり、コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）を加えると、作製濃度を濃くしても小さい粒子径であり、且つ多分散性の低い（安定性の高い）複合粒子を得ることができることがわかる。

【0065】

表２４〜３０及び図１９〜２５から分かるように、コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）以外のアニオン性ポリマーであっても、コンドロイチン硫酸（２２ｋＤａ）を用いた場合と同様に、二元複合粒子と比較して、高濃度で作製したときの粒子径及び多分散指数が低くなることがわかる。
以上の結果より、ヒアルロナン及びキトサンを含む複合粒子の作製において、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを加えると、作製濃度が高濃度であっても小さく安定性の高い複合粒子を得ることができることがわかった。

【0066】

＜試験例８＞保存安定性の検討（１）
これまでの試験例において、種々の分子量、分子種を用いて、ヒアルロナン、キトサン及びヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを含む三元複合粒子の形成ができることを示した。本試験例においては、かかる三元複合粒子の保存安定性について検討した。

【0067】

まず、試験例１において作製した実施例１及び比較例１に係る複合粒子の保存安定性について検討を行った。保存温度を４℃としたときのこれら複合粒子の作製時、１日後、１週間後における平均粒子径等を試験例１と同様の測定方法により測定した。表３１にその結果を示す。また、この時の粒子径分布を図２６及び２７に示す。

【0068】

【表31】

【0069】

表３１、図２６及び２７から分かるように、二元複合粒子は、作製１日後に平均粒子径が大きくなり、作製１週間後には、２倍近くまでに平均粒子径が大きくなった。一方、三元複合粒子は、作製１日後には平均粒子径がほとんど変わらず、作製１週間後でも、２０％程度の増大であった。

【0070】

次に、比較例１及び実施例１に係る二元複合粒子及び三元複合粒子を、調製時および保存時のキトサン濃度は変えずに、室温、又は３７℃で保存した。
表３２、３３に、複合粒子の粒子径と、複合粒子の表面電荷を示す。
また、図２８〜３１に、複合粒子の粒子径の変化を示す。

【0071】

【表32】

【0072】

【表33】

【0073】

表３２、３３及び図２８〜３１から分かるように、二元複合粒子及び三元複合粒子のいずれにおいても、作製直後と作製１週間後で平均粒径はほとんど変化しなかった。
これらの結果より、三元複合粒子は、二元複合粒子に比べて、低温保存時の粒子の安定性に大きく優れていることが分かった。

【0074】

次に、試験例１で用いた二元複合粒子及び三元複合粒子を、調製時および保存時のキトサン濃度を２５１μｇ／ｍＬ、ヒアルロナン濃度を５１６μｇ／ｍＬ、コンドロイチン硫酸濃度を２９．３μｇ／ｍＬとして、４℃、室温、又は３７℃で保存した。すなわち、試験例１における作製濃度の１５倍の濃度で二元及び三元複合粒子を作製した。
表３４〜３６に、複合粒子の粒子径と、複合粒子の表面電荷を示す。
また、図３２〜３７に、複合粒子の粒子径の変化を示す。

【0075】

【表34】

【0076】

【表35】

【0077】

【表36】

【0078】

表３４〜３６、図３２〜３７から分かるように、二元複合粒子及び三元複合粒子のいずれにおいても、作製直後と作製１週間後で平均粒径はほとんど変化しなかった。
試験例１の結果と併せて、三元複合粒子は、二元複合粒子に比べて、低濃度、低温保存時の粒子の安定性に大きく優れていることが分かった。

【0079】

＜試験例９＞保存安定性の検討（２）
次に試験例３〜５で作製した実施例４、７、９に係る三元複合粒子の保存安定性について検討を行った。実施例４に係る三元複合粒子については４℃、室温（ＲＴ）及び３７℃における、作製時、１日後、１週間後、１か月後の平均粒子径等を測定した（表４０〜４２及び図４１〜４３参照）。なお、比較として、試験例４で作製した比較例２についても同様に平均粒子径等の継時的な変化を測定した（表３７〜３９及び図３８〜４０参照）。
また実施例７及び９に係る三元複合粒子の保存安定性については、室温においてのみ検討を行った（表４３、４４及び図４４、４５参照）。

【0080】

【表37】

【表38】

【表39】

【表40】

【表41】

【表42】

【表43】

【表44】

【0081】

表３７〜３９に示す通り、いずれの保存温度においても二元複合粒子は作製後、徐々に多分散性が上昇しているのがわかる。一方、表４０〜４２に示す通り、三元複合粒子は作製後一週間経過した後であっても多分散指数は０．１〜０．２程度を維持している。
また、表４３及び４４に示すように、分子量２２ｋＤａコンドロイチン硫酸に代えて分子量１５ｋＤａのコンドロイチン硫酸及びヘパリンを用いたときも、作製後１週間経過後であっても多分散指数は０．１〜０．２程度を維持できていることがわかる。
以上の結果より、ヒアルロナン及びキトサンを含む複合粒子の作製において、ヒアルロナン以外のアニオン性ポリマーを加えてできる三元複合粒子は、二元複合粒子と比較して保存安定性に優れていることがわかった。

【産業上の利用可能性】

【0082】

本発明は、高分子化合物を有効成分として用いる化粧料の製造に応用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】