特許 6293485 コンセンサス抗原コンストラクトおよびそれらから作製されるワクチン、ならびにそれらを使用するマラリアの治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6293485

(24)【登録日】2018年2月23日

(45)【発行日】2018年3月14日

(54)【発明の名称】コンセンサス抗原コンストラクトおよびそれらから作製されるワクチン、ならびにそれらを使用するマラリアの治療方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180305BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20180305BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20180305BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20180305BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20180305BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20180305BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20180305BHJP

   C07K 14/445 20060101ALN20180305BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   A61K31/713

   A61K39/00 H

   A61K48/00

   A61P33/06

   G01N33/53 D

   G01N33/53 N

   G01N33/569 A

   !C07K14/445

【請求項の数】15

【全頁数】77

(21)【出願番号】特願2013-530426(P2013-530426)

(86)(22)【出願日】2011年9月27日

(65)【公表番号】特表2013-543721(P2013-543721A)

(43)【公表日】2013年12月9日

(86)【国際出願番号】US2011053541

(87)【国際公開番号】WO2012047679

(87)【国際公開日】20120412

【審査請求日】2014年9月24日

【審判番号】不服2016-13163(P2016-13163/J1)

【審判請求日】2016年9月2日

(31)【優先権主張番号】61/386,973

(32)【優先日】2010年9月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500429103

【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア

(73)【特許権者】

【識別番号】511108301

【氏名又は名称】イノビオ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ウェイナー， デイビッド ビー

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， チアン

(72)【発明者】

【氏名】サーデサイ， ニランジャン ワイ

(72)【発明者】

【氏名】フェラロ， バーナデット

【合議体】

【審判長】 田村 聖子

【審判官】 渡邉 潤也

【審判官】 大久保 元浩

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０５６８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１２４３０９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０．０４．，ｐ．１１８のＰ９

【文献】 Ｎａｔｕｒｅ，２００２，Ｖｏｌ．４１９，ｐ．４９８−５１１

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

A61K 39/00-39/44

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記核酸配列は、
（１）配列番号１７を含む核酸配列、および
（２）配列番号５を含む核酸配列
からなる群より選択される
前記核酸分子。

【請求項2】

前記核酸分子が、
（ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
（ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
（ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
（ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列
からなる群より選択される熱帯熱マラリア原虫免疫原をさらにコードする、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

前記核酸分子が、
（ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
（ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
（ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
（ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列
からなる群より選択される２つ以上の熱帯熱マラリア原虫免疫原をさらにコードする、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項4】

熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）免疫原ＴＲＡＰをコードする１つ以上の核酸配列を含む１つ以上のプラスミドを包含する組成物であって、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする前記核酸配列が、
（１）配列番号１７を含む核酸配列、および
（２）配列番号５を含む核酸配列
からなる群より選択される
組成物。

【請求項5】

（ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
（ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
（ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
（ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列
のうちの２つ以上、３つ以上または４つ以上を全体として含む１つ以上のプラスミドをさらに包含する、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

（ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
（ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、および、
（ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列
を全体として含む１つ以上のプラスミドをさらに包含し、そして場合により、
前記１つ以上のプラスミドが、（ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列もまた全体として含む、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

１つのプラスミドを含む、請求項４に記載の組成物。

【請求項8】

２つ、３つ、４つ、または５つのプラスミドを含む、請求項４に記載の組成物。

【請求項9】

マラリアに対して哺乳類動物を免疫する方法において使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載に記載の核酸分子。

【請求項10】

マラリアに対して哺乳類動物を免疫する方法において使用するための、請求項４〜８のいずれか一項に記載に記載の組成物。

【請求項11】

電気穿孔により投与するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項12】

電気穿孔により投与するための、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

筋肉内注射または皮内注射により投与するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項14】

筋肉内注射または皮内注射により投与するための、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

請求項１に記載の核酸分子もしくは請求項４の組成物にコードされないマラリアタンパク質および／または請求項１に記載の核酸分子もしくは請求項４に記載の組成物にコードされないマラリアタンパク質に対する抗体の存在を、請求項１に記載の核酸分子もしくは請求項４に記載の組成物を用いてワクチン投与した哺乳類動物の中でのマラリア感染の指標とするエクスビボの方法であって、
前記核酸分子もしくは前記組成物にコードされないマラリアタンパク質および／または前記核酸分子もしくは前記組成物にコードされないマラリアタンパク質に対する抗体の存在を、前記哺乳類動物から単離された液体試料において検出すること
を含み、前記核酸分子もしくは前記組成物にコードされないマラリアタンパク質および／または前記核酸分子もしくは前記組成物にコードされないマラリアタンパク質に対する抗体の存在が、前記哺乳類動物がマラリアに感染していることを示す、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の分野
本発明は、コンセンサス抗原性マラリアタンパク質とそれらをコードする核酸分子、そのようなタンパク質および／または核酸分子を含む改良型マラリアワクチン、ならびにマラリア抗原に対する免疫反応を誘導するために前記ワクチンを使用する方法、ならびにマラリア感染の予防方法および／またはマラリアに感染した個体の治療方法に関連する。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景
本願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年９月２７日に提出された米国特許仮出願第６１／３８６，９７２号に対する優先権を主張するものである。

【0003】

マラリアは、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属の真核生物性原生生物が原因の蚊媒介性の感染性疾病である。それは、米州（２２か国）、アジアおよびアフリカの地域を含む熱帯および亜熱帯地帯に広く行きわたっている。毎年、マラリアは２億５千万件の事例が存在し、１百万と３百万の間の人々が死亡し、それらの大半はサハラ砂漠以南のアフリカ地域の小児である。伝染を減少させ、そして、治療を拡大しようとする努力にもかかわらず、１９９２年以来、その地域がこの疾病の危険にさらされていることにほとんど変化がない。実に、マラリアの流行が現在の上昇傾向のままであれば、次の２０年間に死亡率は２倍になる可能性がある。多くの事例が、人々が病院へのアクセスまたは健康管理を提供する手段を持たない僻地で起こるため、正確な統計は不明である。結果として、大半の事例が記録されない。

【0004】

５種のプラスモディウム寄生生物がヒトに感染することができ、最も重篤な種類の疾病は熱帯熱マラリア原虫（本明細書において熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｐ．ｆ．およびＰＦとも称される）によって引き起こされる。熱帯熱マラリア原虫は原生動物門の寄生生物であり、ヒトでマラリアの原因となるプラスモディウム属の種の１つである。それは、メスのハマダラ蚊によって媒介される。熱帯熱マラリア原虫（または悪性）マラリアは最も高い併発率と死亡率を有するので、熱帯熱マラリア原虫はこれらの感染症のうちで最も危険な原因である。２００６年については、熱帯熱マラリア原虫は、２億４７００万件のヒトマラリア感染（９８％がアフリカ）全てのうちの９１％とマラリアによる死亡件数の９０％の原因となった。

【0005】

マラリアを治療するための多種多様な抗マラリア薬が利用可能である。最近の５年間に、アルテミシニン誘導体を含有する薬品の組合せを使用することにより、流行地域の国々における熱帯熱マラリア原虫感染症の治療が一変した。キニンの静脈内投与もしくは筋肉内投与により、または、ますます、アルテミシニン誘導体であるアルテスネートを用いて重篤なマラリアが治療される。マラリア流行地域の国々への旅行者にマラリアを防止するために（予防）、いくつかの薬品もまた利用可能である。いくつかの抗マラリア薬、特に、クロロキンへの耐性が生じている。

【0006】

マラリア用のワクチンが開発中であるが、完全に有効なワクチンは未だ利用可能ではない。マラリアワクチンの可能性を示す最初の有望な研究が１９６７年に実施されたが、生きた放射線照射により弱毒化したスポロゾイトでマウスが免疫され、その後、正常な生きたスポロゾイトを用いて注射すると、前記マウスの約６０％に防護作用がもたらされた。１９７０年代以来、ヒトでの類似のワクチン投与戦略を開発するかなりの努力がなされている。しかしながら、現在の最も先進的なマラリアワクチン候補は臨床的疾病に対して部分的な防護作用を付与するにすぎない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

熱帯熱マラリア原虫の免疫原ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１のうちの１つ以上をコードする、プラスミドなどの核酸分子が提供される。その免疫原は全長タンパク質、または全長タンパク質の免疫原性断片であり得る。免疫原は、発現の向上のためにコンセンサス配列および／または修飾を含む。インビボで送達されると高レベルの発現をもたらすコード配列が提供される。

【0008】

１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの免疫原全てを全体としてコードするこれらの核酸分子の１つ以上を含む組成物が提供される。そのような組成物は、マラリアに対するワクチンとして有用であり得る。本明細書に開示されるような、より多くの組成物のうちの１つを投与することを含む、マラリアに対して哺乳類動物を免疫する方法が提供される。
したがって本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
複数の熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）免疫原をコードする核酸配列を含むワクチンであって、上記ワクチンが
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、および、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列
の各々を含み、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする上記核酸配列が、
ａ１）配列番号１を含む核酸配列、
ａ２）配列番号１１を含む核酸配列、
ａ３）配列番号１３を含む核酸配列、
ａ４）配列番号２３を含む核酸配列、
ａ５）配列番号１の９０％以上を含む、配列番号２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ６）配列番号１１の９０％以上を含む、配列番号１２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ７）配列番号１４の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号１の９０％以上を含むもの、
ａ８）配列番号２４の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号１１の９０％以上を含むもの、
ａ９）配列番号１３に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号１４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列、
ａ１０）配列番号２３に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号２４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列、
ａ１１）配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、配列番号１３に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ａ１２）配列番号２４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、配列番号２３に対して９８％以上相同である上記核酸配列
からなる群より選択され、ならびに、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする上記核酸配列が、
ｂ１）配列番号３を含む核酸配列、
ｂ２）配列番号１５を含む核酸配列、
ｂ３）配列番号３の９０％以上を含む、配列番号４の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｂ４）配列番号１６の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号３の９０％以上を含むもの、
ｂ５）配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号３に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｂ６）配列番号１６に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号１５に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｂ７）配列番号３に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号３に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号４に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｂ８）配列番号１５に９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号１５に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号１６に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号１６に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの、
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする上記核酸配列が、
ｃ１）配列番号５を含む核酸配列、
ｃ２）配列番号１７を含む核酸配列、
ｃ３）配列番号５の９０％以上を含む、配列番号６の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｃ４）配列番号１８の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号５の９０％以上を含むもの、
ｃ５）配列番号６に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号５に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｃ６）配列番号１８に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号１７に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｃ７）配列番号５に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号５に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号６に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号６に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｃ８）配列番号１７に９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号１７に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号１８に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号１８に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択され、ならびに、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする上記核酸配列が、
ｄ１）配列番号７を含む核酸配列、
ｄ２）配列番号１９を含む核酸配列、
ｄ３）配列番号６の９０％以上を含む配列番号８の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｄ４）配列番号２０の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号７の９０％以上を含むもの、
ｄ５）配列番号８に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号７に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｄ６）配列番号２０に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号１９に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｄ７）配列番号７に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号７に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号８に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号８に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｄ８）配列番号１９に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号１９に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号２０に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号２０に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択される
上記ワクチン。
（項目２）
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列であって、
ｅ１）配列番号９を含む核酸配列、
ｅ２）配列番号２１を含む核酸配列、
ｅ３）配列番号９の９０％以上を含む、配列番号１０の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｅ４）配列番号２２の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号９の９０％以上を含むもの、
ｅ５）配列番号１０に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号９に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｅ６）配列番号２２に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号２１に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｅ７）配列番号９に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号９に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号１０に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号１０に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｅ８）配列番号２１に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号２１に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号２２に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号２２に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択される、熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする上記核酸配列をさらに含む、項目１に記載のワクチン。
（項目３）
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８ＢまたはＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１または２に記載のワクチン。
（項目４）
上記ヌクレオチド配列が１つ以上のプラスミドに組み込まれる、項目１または２に記載のワクチン。
（項目５）
各熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする上記ヌクレオチド配列が別々のプラスミドに組み込まれる、項目１または２に記載のワクチン。
（項目６）
各熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする上記ヌクレオチド配列が２つ以上の異なるプラスミドに組み込まれる、項目１または２に記載のワクチン。
（項目７）
マラリアに対して哺乳類動物を免疫する方法であって、上記哺乳類動物の組織に項目１または２に記載のワクチンを投与する工程を含む方法。
（項目８）
ａ）上記哺乳類動物の組織に上記ワクチンを投与する工程、および、
ｂ）上記組織の細胞を、上記細胞への上記核酸分子の移行を可能とするのに有効な定電流でのエネルギーパルスを用いて電気穿孔する工程
を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
筋肉内注射または皮内注射によりワクチンが投与される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記組織に伝達するための電流が事前設定され、そして、エネルギーパルスが上記の事前設定された電流に等しい定電流でのエネルギーパルスである、項目８に記載の方法。
（項目１１）
上記電気穿孔工程が、
（ａ）上記の電気穿孔を受けた細胞でのインピーデンス（ｉｍｐｅｄｅｎｃｅ）を測定すること、および、
（ｂ）上記の電気穿孔を受けた細胞で定電流を維持するために、上記の測定されたインピーダンスに関して、上記のエネルギーパルスのエネルギーレベルを調節すること、
をさらに含み、上記の測定工程および調節工程が上記のエネルギーパルスの持続時間内に起こる、項目８に記載の方法。
（項目１２）
上記電気穿孔工程が、分散化パターンの上記のエネルギーパルスを伝達するパルスシーケンスパターンに従って、複数の電極に上記のエネルギーパルスを伝達することを含む、項目８に記載の方法。
（項目１３）
上記哺乳類動物がマラリアに感染されておらず、そして、上記免疫反応が防御的免疫反応である、項目８に記載の方法。
（項目１４）
上記哺乳類動物がマラリアに感染しており、そして、上記免疫反応が治療的免疫反応である、項目８に記載の方法。
（項目１５）
複数の熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする核酸配列を含むワクチンであって、上記ワクチンが、
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、および、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、
の各々を含み、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする上記核酸配列が、
ａ１）配列番号２をコードする核酸配列、
ａ２）配列番号１２をコードする核酸配列、
ａ３）配列番号１４をコードする核酸配列、
ａ４）配列番号２４をコードする核酸配列、
ａ５）配列番号２の９０％以上を含む、配列番号２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ６）配列番号１２の９０％以上を含む、配列番号１２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ７）配列番号１４の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号１４の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ８）配列番号２４の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号２４の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ９）配列番号１４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、
ａ１０）配列番号２４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む、核酸配列、
ａ１１）配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの、および、
ａ１２）配列番号２４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号２４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする上記核酸配列が、
ｂ１）配列番号４をコードする核酸配列、
ｂ２）配列番号１６をコードする核酸配列、
ｂ３）配列番号１６の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号１６の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｂ４）配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列、
ｂ５）配列番号１６に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む、核酸配列、
ｂ７）配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号４に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上を含むもの、および、
ｂ８）配列番号１６に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする上記核酸配列が、
ｃ１）配列番号６をコードする核酸配列、
ｃ２）配列番号１８をコードする核酸配列、
ｃ３）配列番号１８の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号１８の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｃ４）配列番号１８に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、
ｃ５）配列番号１８に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号１８に９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、ならびに、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする上記核酸配列が、
ｄ１）配列番号８をコードする核酸配列、
ｄ２）配列番号２０をコードする核酸配列、
ｄ３）配列番号２０の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号２０の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｄ４）配列番号２０に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、および、
ｄ５）配列番号２０に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号２０に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択される
上記ワクチン。
（項目１６）
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列であって、
ｅ１）配列番号２２をコードする核酸配列、
ｅ２）配列番号２２の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号２２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｅ３）配列番号２２に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、および、
ｅ４）配列番号２２に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号２２に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択される熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする上記核酸配列をさらに含む、項目１５に記載のワクチン。
（項目１７）
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８ＢまたはＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１５または１６に記載のワクチン。
（項目１８）
上記ヌクレオチド配列が１つ以上のプラスミドに組み込まれる、項目１５または１６に記載のワクチン。
（項目１９）
各熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする上記ヌクレオチド配列が別々のプラスミドに組み込まれる、項目１５または１６に記載のワクチン。
（項目２０）
各熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする上記ヌクレオチド配列が２つ以上の異なるプラスミドに組み込まれる、項目１５または１６に記載のワクチン。
（項目２１）
マラリアに対して哺乳類動物を免疫する方法であって、上記哺乳類動物の組織に項目１５または１６に記載のワクチンを投与する工程を含む方法。
（項目２２）
ａ）上記哺乳類動物の組織に上記ワクチンを投与する工程、および、
ｂ）上記組織の細胞を、上記細胞への上記核酸分子の移行を可能とするのに有効な定電流でのエネルギーパルスを用いて電気穿孔する工程
を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
筋肉内注射または皮内注射によりワクチンが投与される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記組織に伝達するための電流が事前設定され、そして、エネルギーパルスが上記の事前設定された電流に等しい定電流でのエネルギーパルスである、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
上記電気穿孔工程が、
（ａ）上記の電気穿孔を受けた細胞でのインピーダンスを測定すること、および、
（ｂ）上記の電気穿孔を受けた細胞で定電流を維持するために、上記の測定されたインピーダンスに関して、上記のエネルギーパルスのエネルギーレベルを調節すること、
をさらに含み、上記の測定工程および調節工程が上記のエネルギーパルスの持続時間内に起こる、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
上記電気穿孔工程が、分散化パターンの上記のエネルギーパルスを伝達するパルスシーケンスパターンに従って、複数の電極に上記のエネルギーパルスを伝達することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
１つ以上の熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする核酸配列を含む核酸分子であって、
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、および、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする上記核酸配列が、
ａ１）配列番号１を含む核酸配列、
ａ２）配列番号１１を含む核酸配列、
ａ３）配列番号１３を含む核酸配列、
ａ４）配列番号２３を含む核酸配列、
ａ５）配列番号１の９０％以上を含む、配列番号２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ６）配列番号１１の９０％以上を含む、配列番号１２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ７）配列番号１４の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号１の９０％以上を含むもの、
ａ８）配列番号２４の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号１１の９０％以上を含むもの、
ａ９）配列番号１３に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号１４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列、
ａ１０）配列番号２３に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号２４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列、
ａ１１）配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、配列番号１３に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ａ１２）配列番号２４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、配列番号２３に対して９８％以上相同である上記核酸配列
からなる群より選択され、ならびに、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする上記核酸配列が、
ｂ１）配列番号３を含む核酸配列、
ｂ２）配列番号１５を含む核酸配列、
ｂ３）配列番号３の９０％以上を含む、配列番号４の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｂ４）配列番号１６の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号３の９０％以上を含むもの、
ｂ５）配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号３に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｂ６）配列番号１６に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号１５に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｂ７）配列番号３に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号３に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号４に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｂ８）配列番号１５に９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号１５に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号１６に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号１６に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする上記核酸配列が、
ｃ１）配列番号５を含む核酸配列、
ｃ２）配列番号１７を含む核酸配列、
ｃ３）配列番号５の９０％以上を含む、配列番号６の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｃ４）配列番号１８の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号５の９０％以上を含むもの、
ｃ５）配列番号６に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号５に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｃ６）配列番号１８に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号１７に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｃ７）配列番号５に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号５に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号６に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号６に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｃ８）配列番号１７に９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号１７に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号１８に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号１８に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする上記核酸配列が、
ｄ１）配列番号７を含む核酸配列、
ｄ２）配列番号１９を含む核酸配列、
ｄ３）配列番号６の９０％以上を含む配列番号８の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｄ４）配列番号２０の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号７の９０％以上を含むもの、
ｄ５）配列番号８に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号７に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｄ６）配列番号２０に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号１９に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｄ７）配列番号７に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号７に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号８に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号８に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｄ８）配列番号１９に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号１９に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号２０に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号２０に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択され、ならびに、
熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする上記核酸配列が、
ｅ１）配列番号９を含む核酸配列、
ｅ２）配列番号２１を含む核酸配列、
ｅ３）配列番号９の９０％以上を含む、配列番号１０の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｅ４）配列番号２２の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号９の９０％以上を含むもの、
ｅ５）配列番号１０に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号９に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｅ６）配列番号２２に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号２１に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｅ７）配列番号９に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号９に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号１０に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号１０に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｅ８）配列番号２１に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号２１に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号２２に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号２２に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択される
上記核酸配列。
（項目２８）
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列、
からなる群より選択される熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする核酸配列を含む核酸分子であって、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする上記核酸配列が、
ａ１）配列番号２をコードする核酸配列、
ａ２）配列番号１４をコードする核酸配列、
ａ３）配列番号２の９０％以上を含む、配列番号２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ４）配列番号１４の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号１４の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ５）配列番号１４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、および、
ａ６）配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１の上記コード配列が、
ｂ１）配列番号４をコードする核酸配列、
ｂ２）配列番号１６をコードする核酸配列、
ｂ３）配列番号１６の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号１６の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｂ４）配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列、
ｂ５）配列番号１６に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、
ｂ７）配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号４に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上を含むもの、および、
ｂ８）配列番号１６に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰの上記コード配列が、
ｃ１）配列番号６をコードする核酸配列、
ｃ２）配列番号１８をコードする核酸配列、
ｃ３）配列番号１８の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号１８の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｃ４）配列番号１８に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、
ｃ５）配列番号１８に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号１８に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳの上記コード配列が、
ｄ１）配列番号８をコードする核酸配列、
ｄ２）配列番号２０をコードする核酸配列、
ｄ３）配列番号２０の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号２０の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｄ４）配列番号２０に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、および、
ｄ５）配列番号２０に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号２０に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、ならびに、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳの上記コード配列が、
ｅ１）配列番号２２をコードする核酸配列、
ｅ２）配列番号２２の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号２２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｅ３）配列番号２２に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、および、
ｅ４）配列番号２２に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号２２に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択される
核酸分子。
（項目２９）
上記核酸分子がプラスミドである、項目２７または２８に記載の核酸分子。
（項目３０）
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８ＢまたはＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目２７または２８に記載の核酸分子。
（項目３１）
上記核酸分子が、
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列
からなる群より選択される単一の熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする、項目２７または２８に記載の核酸分子。
（項目３２）
上記核酸分子が、
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列
からなる群より選択される２つ以上の熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする、項目２７または２８に記載の核酸分子。
（項目３３）
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、および、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、
からなる群より選択される熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする１つ以上の核酸配列を含む１つ以上のプラスミドを包含する組成物であって、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする上記核酸配列が、
ａ１）配列番号１を含む核酸配列、
ａ２）配列番号１１を含む核酸配列、
ａ３）配列番号１３を含む核酸配列、
ａ４）配列番号２３を含む核酸配列、
ａ５）配列番号１の９０％以上を含む、配列番号２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ６）配列番号１１の９０％以上を含む、配列番号１２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ７）配列番号１４の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号１の９０％以上を含むもの、
ａ８）配列番号２４の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号１１の９０％以上を含むもの、
ａ９）配列番号１３に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号１４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列、
ａ１０）配列番号２３に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号２４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列、
ａ１１）配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、配列番号１３に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ａ１２）配列番号２４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、配列番号２３に対して９８％以上相同である上記核酸配列
からなる群より選択され、ならびに、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする上記核酸配列が、
ｂ１）配列番号３を含む核酸配列、
ｂ２）配列番号１５を含む核酸配列、
ｂ３）配列番号３の９０％以上を含む、配列番号４の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｂ４）配列番号１６の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号３の９０％以上を含むもの、
ｂ５）配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号３に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｂ６）配列番号１６に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号１５に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｂ７）配列番号３に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号３に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号４に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｂ８）配列番号１５に９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号１５に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号１６に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号１６に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする上記核酸配列が、
ｃ１）配列番号５を含む核酸配列、
ｃ２）配列番号１７を含む核酸配列、
ｃ３）配列番号５の９０％以上を含む、配列番号６の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｃ４）配列番号１８の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号５の９０％以上を含むもの、
ｃ５）配列番号６に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号５に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｃ６）配列番号１８に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号１７に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｃ７）配列番号５に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号５に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号６に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号６に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｃ８）配列番号１７に９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号１７に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号１８に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号１８に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする上記核酸配列が、
ｄ１）配列番号７を含む核酸配列、
ｄ２）配列番号１９を含む核酸配列、
ｄ３）配列番号６の９０％以上を含む配列番号８の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｄ４）配列番号２０の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号７の９０％以上を含むもの、
ｄ５）配列番号８に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号７に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｄ６）配列番号２０に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号１９に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｄ７）配列番号７に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号７に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号８に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号８に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｄ８）配列番号１９に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号１９に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号２０に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号２０に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択され、ならびに、
熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする上記核酸配列が、
ｅ１）配列番号９を含む核酸配列、
ｅ２）配列番号２１を含む核酸配列、
ｅ３）配列番号９の９０％以上を含む、配列番号１０の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｅ４）配列番号２２の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が配列番号４２を含み、上記核酸配列が、配列番号４２をコードするヌクレオチドに連結した、配列番号９の９０％以上を含むもの、
ｅ５）配列番号１０に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列であって、配列番号９に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｅ６）配列番号２２に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列であって、配列番号２１に対して９８％以上相同である上記核酸配列、
ｅ７）配列番号９に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号９に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号１０に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号１０に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であるもの、
ｅ８）配列番号２１に対して９８％以上相同である核酸配列の断片である核酸配列であって、上記核酸配列の上記断片が、配列番号２１に対して９８％以上相同である上記核酸配列の９０％以上であり、そして、配列番号２２に対して９８％以上相同であるタンパク質の断片をコードし、上記タンパク質の上記断片が、配列番号２２に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上であり、そして、配列番号４２を含むもの
からなる群より選択される
組成物。
（項目３４）
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列、
からなる群より選択される熱帯熱マラリア原虫免疫原をコードする１つ以上の核酸配列を含む１つ以上のプラスミドを包含する組成物であって、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする上記核酸配列が、
ａ１）配列番号２をコードする核酸配列、
ａ２）配列番号１２をコードする核酸配列、
ａ３）配列番号１４をコードする核酸配列、
ａ４）配列番号２４をコードする核酸配列、
ａ５）配列番号２の９０％以上を含む、配列番号２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ６）配列番号１２の９０％以上を含む、配列番号１２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ７）配列番号１４の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号１４の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ８）配列番号２４の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号２４の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ａ９）配列番号１４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、
ａ１０）配列番号２４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む、核酸配列、
ａ１１）配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの、および、
ａ１２）配列番号２４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号２４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１の上記コード配列が
ｂ１）配列番号４をコードする核酸配列、
ｂ２）配列番号１６をコードする核酸配列、
ｂ３）配列番号１６の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号１６の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｂ４）配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードする核酸配列、
ｂ５）配列番号１６に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、
ｂ７）配列番号４に対して９８％以上相同であるタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号４に対して９８％以上相同である上記タンパク質の９０％以上を含むもの、および、
ｂ８）配列番号１６に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号１４に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰの上記コード配列が、
ｃ１）配列番号６をコードする核酸配列、
ｃ２）配列番号１８をコードする核酸配列、
ｃ３）配列番号１８の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号１８の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｃ４）配列番号１８に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、
ｃ５）配列番号１８に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号１８に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳの上記コード配列が、
ｄ１）配列番号８をコードする核酸配列、
ｄ２）配列番号２０をコードする核酸配列、
ｄ３）配列番号２０の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号２０の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｄ４）配列番号２０に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、および、
ｄ５）配列番号２０に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号２０に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択され、ならびに、
熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳの上記コード配列が、
ｅ１）配列番号２２をコードする核酸配列、
ｅ２）配列番号２２の９０％以上を含み、そして、配列番号４２を含む、配列番号２２の免疫原性断片をコードする核酸配列、
ｅ３）配列番号２２に対して９８％以上相同であるタンパク質をコードし、そして、配列番号４２を含む核酸配列、および、
ｅ４）配列番号２２に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含むタンパク質の免疫原性断片をコードする核酸配列であって、上記免疫原性断片が、配列番号２２に対して９８％以上相同であり、そして、配列番号４２を含む上記タンパク質の９０％以上を含むもの
からなる群より選択される
組成物。
（項目３５）
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８ＢまたはＲＡＮＴＥＳをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目３３または３４に記載の組成物。
（項目３６）
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列
のうちの２つ以上を全体として含む１つ以上のプラスミドを包含する、項目３３または３４に記載の組成物。
（項目３７）
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列
のうちの３つ以上を全体として含む１つ以上のプラスミドを包含する、項目３３または３４に記載の組成物。
（項目３８）
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列
のうちの４つを全体として含む１つ以上のプラスミドを包含する、項目３３または３４に記載の組成物。
（項目３９）
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、および、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列
を全体として含む１つ以上のプラスミドを包含する、項目３３または３４に記載の組成物。
（項目４０）
ａ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳをコードする核酸配列、
ｂ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＬＳＡ１をコードする核酸配列、
ｃ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＴＲＡＰをコードする核酸配列、
ｄ）熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣｅｌＴＯＳをコードする核酸配列、および、
ｅ）熱帯熱マラリア原虫免疫原Ａｍａ１をコードする核酸配列
を全体として含む１つ以上のプラスミドを包含する、項目３３または３４に記載の組成物。
（項目４１）
１つのプラスミドを含む、項目３３または３４に記載の組成物。
（項目４２）
２つ、３つ、４つ、または５つのプラスミドを含む、項目３３または３４に記載の組成物。
（項目４３）
項目１または２に記載のワクチンを用いてワクチン投与した哺乳類動物の中で、マラリアに感染した哺乳類動物を診断する方法であって、
ａ）上記哺乳類動物から液体試料を単離すること、および、
ｂ）上記ワクチンに含まれないマラリアタンパク質および／または上記ワクチンに含まれないマラリアタンパク質に対する抗体の存在を検出すること
を含み、上記ワクチンに含まれないマラリアタンパク質および／または上記ワクチンに含まれないマラリアタンパク質に対する抗体の存在が、上記哺乳類動物がマラリアに感染していることを示す、上記方法。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A】図１Ａおよび図１Ｂは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲タンパク質についての抗原コンセンサス配列（ＰｆＣｏｎＣＳ）（配列番号２）に関する。図１Ａは、ＰｆＣｏｎＣＳ（配列番号２）とＧｅｎｂａｎｋから選択されたＣＳ配列との相同性の表を記載する。図１ＢはＣＳ配列とＰｆＣｏｎＣＳ配列の多重配列アライメントを示す。示したＰｆＣｏｎＣＳ配列は、配列番号２に、ＣＳのＮ末端メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｏｎｅ）の代わりにＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを、およびＣＳのＣ末端にＨＡタグを、すなわちＩｇＥシグナルペプチドおよびＨＡタグを付加している配列番号２６である。

【図1B-1】同上

【図1B-2】同上

【図1B-3】同上

【図1B-4】同上

【図1B-5】同上

【図1B-6】同上

【図1B-7】同上

【図1B-8】同上

【図1B-9】同上

【図1B-10】同上

【図1B-11】同上

【図1B-12】同上

【図1B-13】同上

【図1B-14】同上

【図2A】図２Ａおよび図２Ｂは熱帯熱マラリア原虫の肝臓ステージ抗原１タンパク質についてのコンセンサス抗原配列（ＰｆＣｏｎＬＳＡ１）（配列番号４）に関する。図２Ａは、ＰｆＣｏｎＬＳＡ１（配列番号４）と選択されたＬＳＡ１配列との相同性の表を記載する。図２ＢはＬＳＡ１配列とＰｆＣｏｎＬＳＡ１配列の多重配列アライメントを示す。示したＰｆＣｏｎＬＡＳ１配列は、配列番号４に、ＬＡＳ１のＮ末端メチオニンの代わりにＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを、およびＬＡＳ１のＣ末端にＨＡタグを、すなわちＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを付加している配列番号２８である。

【図2B-1】同上

【図2B-2】同上

【図2B-3】同上

【図3A】図３Ａおよび図３Ｂは熱帯熱マラリア原虫のトロンボスポンジン関連無名タンパク質（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ−ａｎｏｎｙｍｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）についてのコンセンサス抗原配列（ＰｆＣｏｎＴＲＡＰ）（配列番号６）に関する。図３Ａは、ＰｆＣｏｎＴＲＡＰ（配列番号６）とＧｅｎｂａｎｋから選択されたＴＲＡＰ配列との相同性の表を記載する。図３Ｂは、ＴＲＡＰ配列とＰｆＣｏｎＴＲＡＰ配列との多重配列アライメントを示す。示したＰｆＣｏｎＴＲＡＰ配列は、配列番号６に、ＴＲＡＰのＮ末端メチオニンの代わりにＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを、およびＴＲＡＰのＣ末端にＨＡタグを、すなわちＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを付加している配列番号３０である。

【図3B-1】同上

【図3B-2】同上

【図3B-3】同上

【図3B-4】同上

【図3B-5】同上

【図3B-6】同上

【図3B-7】同上

【図4A】図４Ａおよび図４Ｂは、熱帯熱マラリア原虫のオーキネートおよびスポロゾイトの細胞通過（ｃｅｌｌ−ｔｒａｖｅｒｓａｌ）タンパク質についてのコンセンサス抗原配列（ＰｆＣｏｎＡｇ２またはＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳ）（配列番号８）に関する。図４Ａは、ＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳ（配列番号８）とＧｅｎｂａｎｋからのＣｅｌＴＯＳ配列との相同性を示す。図４Ｂは、ＧｅｎｂａｎｋのＣｅｌＴＯＳ配列とＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳ配列との配列アライメントを示す。示したＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳ配列は、配列番号８に、ＣｅｌＴＯＳのＮ末端メチオニンの代わりにＮ末端にＩｇＥシグナルペプチドを、およびＣｅｌＴＯＳのＣ末端にＨＡタグを、すなわちＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを付加している配列番号３２である。

【図4B】同上

【図5】図５は、ウエスタンブロット法から得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。抗ＨＡ抗体を使用して合成タンパク質を検出した（ＨＡタグが抗原配列のＣ末端に含まれる）。ｐＶＡＸ１を陰性対照として使用した。

【図6A】図６Ａから図６Ｉは、免疫化マウスとその血清の免疫学的分析から得られたデータを記載する。使用したＰ．ｆ．コンセンサス免疫原構築物には核酸配列が含まれた（配列番号２５、２７、２９、および３１、これらはＩｇＥシグナルペプチドおよびＨＡタグにそれぞれ連結した配列番号２、４、６、および８にそれぞれ対応する配列番号２６、２８、３０、および３２をそれぞれコードする。図６Ａは、ＩＮＦ−γのＥＬＩＳｐｏｔ法に基づく個々の抗原の細胞性免疫原性（左パネル）、ならびにＣＳおよびＬＳＡ１についての細胞性応答（ＣＤ４またはＣＤ８）の分類（右パネル）を示す棒グラフを表示する。図６Ｂは、報告されたプラットフォームの免疫原性の比較を示すグラフ（ＣＤ８は上のセット、およびＣＤ４は下のセット）を記載し：ＰｆＣｏｎＬＳＡ１（右グラフ）は、Ａｄ３５またはＡｄ３５／タンパク質の異種プライムブースト方式（左の３グラフ）より、優性なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープへの細胞性応答を強く誘導する。図６Ｃは他のプラットフォームに対する免疫原性の比較を示すグラフを記載し：ＰｆｃｏｎＣＳ（右グラフ）は、Ａｄ５より少し低い抗原特異的ＩＦＮ−γを誘導したが（左グラフ対）、Ａｄ３５およびＲＴＳ，Ｓより強い抗原特異的ＩＦＮ−γを誘導した。図６Ｄはフローサイトメトリゲーティング法を詳述する画像を示すグラフを表示する。図６Ｅは多重抗原ワクチンに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示すグラフを記載し、ＣＳ特異的応答が主要なＣＤ４＋Ｔ細胞応答であることを示す。図６Ｆは多重抗原ワクチンに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示すグラフを記載し、ＣＳ特異的およびＬＳＡ特異的応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大部分を含むことを示す。図６Ｇは、単抗原ワクチンのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し、かつ多重抗原ワクチンと比較したグラフを表し、多重抗原を送達した場合に大きな変化がないことを示す。図６Ｈは液性応答を示すグラフを記載し、液性応答により単抗原ワクチンおよび多重抗原ワクチンの両方が強い抗体応答を誘導したことを示している（平均終末価＞１００，０００）。図６Ｉは、ＬＳＡ１抗体が反復領域外のエピトープに関連していることを示すグラフを記載する。

【図6B】同上

【図6C】同上

【図6D-1】同上

【図6D-2】同上

【図6D-3】同上

【図6D-4】同上

【図6E】同上

【図6F】同上

【図6G】同上

【図6H】同上

【図6I】同上

【図7】図７は、発現構築物ｐＧＸ７００１（配列番号３７）のプラスミドマップであり、これはＩｇＥシグナルペプチドおよびＨＡタグを含むＰｆＣｏｎＡＧ２（ＣｅｌＴＯＳ）のコード配列を含む（配列番号３２をコードする配列番号３１）。

【図8】図８は、発現構築物ｐＧＸ７００２（配列番号３８）のプラスミドマップを表示し、これはＩｇＥシグナルペプチドおよびＨＡタグを含むＰｆＣｏｎＣＳのコード配列を含む（配列番号２６をコードする配列番号２５）。

【図9】図９は、発現構築物ｐＧＸ７００４（配列番号３９）のプラスミドマップを表示し、これはＩｇＥシグナルペプチドおよびＨＡタグを含むＰｆＣｏｎＬＳＡ１のコード配列を含む（配列番号２８をコードする配列番号２７）。

【図10】図１０は、発現構築物ｐＧＸ７００５（配列番号４０）のプラスミドマップを表示し、これはＩｇＥシグナルペプチドおよびＨＡタグを含むＰｆＣｏｎＴＲＡＰのコード配列を含む（配列番号３０をコードする配列番号２９）。

【図11】図１１は、発現構築物ｐＧＸ７００３（配列番号４１）のプラスミドマップを表示し、プラスミドｐＧＸ７００３はＩｇＥシグナルペプチドおよびＨＡタグを含むコード配列、ＰｆＣｏｎＣＳ−ａｌｔを含む（配列番号３６をコードする配列番号３５）。オルタナティブコンセンサスＣＳ−ａｌｔ全長コンセンサスアミノ酸配列（シグナルペプチドまたはＨＡタグを含まない）は、配列番号１１でコードされる配列番号１２である。

【図12】図１２〜２５には、免疫化動物およびそれらの血清の免疫学的分析から得られたデータが記載される。使用したＰ．ｆ．コンセンサス免疫原構築物には、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１をコードする核酸配列が含まれ、それぞれがＩｇＥシグナルペプチドおよびＨＡタグをコードするコード配列を含む。ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１をコードする、使用された核酸配列は、それぞれ配列番号２５、２７、２９、３１、および３３であり、これらはそれぞれアミノ酸配列、配列番号２６、２８、３０、３２、および３４をコードする。シグナルペプチドまたはＨＡタグを含まない全長ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１をコードするこれらの核酸配列の一部は、それぞれ配列番号１、３、５、７、および９（それぞれアミノ酸配列の配列番号２、４、６、８、および１０をコードする）に対応する。図１２は、単抗原構築物および多重抗原構築物を含むワクチンからの液性応答を比較するデータを示す。

【図13】図１３は、多重抗原構築物を含むワクチンにより誘導される、ワクチン中の構築物によりコードされる各抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答に関するデータを示す。

【図14】図１４は、多重抗原構築物を含むワクチンにより誘導される、ワクチン中の構築物によりコードされる各抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答に関するデータを示す。

【図15】図１５は、ＩＦＮγのＥＬＩＳｐｏｔにより評定（ｅｖａｌｕａｔｅ）した免疫応答であって、ＣＳをコードするワクチンの投与により誘導される場合と、ＴＲＡＰ、ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳをコードするワクチンと組み合わせたＣＳをコードするワクチンの投与より誘導される場合とで比較するデータを示す。

【図16】図１６は、多重抗原ワクチンカクテルの全量のうち半量を１匹のマウス後肢に、および他方の半量を反対側の（ｃｏｎｔｒａ−ｌａｔｅｒａｌ）マウス後肢に送達した場合と、これに対してＣＳワクチンを１匹のマウス後肢に、およびＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳワクチンを含有するカクテルを反対側の後肢に送達した場合のいずれかにより、誘導されたＩＦＮγ応答でのＣＳ特異性応答を比較したデータを示す。

【図17】図１７は、多重抗原ワクチン投与したマウスでのＣＤ８＋肝リンパ球によるＬＳＡ１−特異的ＩＦＮγ産生を評定したデータで示す。

【図18】図１８Ａは、ＡＭＡ１タンパク質をコードするワクチン構築物により誘導されたＡＭＡ１−特異的Ｔ細胞応答の評定から得られたデータを示す。図１８Ｂは、ＡＭＡ１タンパク質をコードするワクチン構築物により誘導されたＡＭＡ１−特異的血清陽転化の評定から得られたデータを示す。

【図19】図１９は、アジュバントＩＬ−２８Ｂをコードする構築物を含むまたは含まない多重抗原ワクチンの投与により誘導される、ＩＦＮγのＥＬＩＳｐｏｔにより評定した免疫応答を、１回目と２回目の免疫化前および免疫化後に測定した場合で、比較するデータを示す。左パネルは組み合わせた応答の棒グラフとしてデータを示す。右パネルは、個々の抗原に対する応答のデータを別々に示す。

【図20】図２０は、アジュバントＩＬ−２８Ｂをコードする構築物を含むまたは含まないＩＭ送達された多重抗原ワクチンの、およびＩＤ送達された多重抗原ワクチンのいずれかでの、２回目の免疫化後（８週目）での抗原−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を比較したデータを示す。図２０の左パネルは抗原特異的ＩＦＮγ産生データを示し、中央パネルは抗原特異的ＩＬ−２産生データを示し、また右パネルは抗原−特異的ＴＮＦα産生データを示す。

【図21】図２１は アジュバントＩＬ−２８Ｂをコードする構築物を含むまたは含まないＩＭ送達された多重抗原ワクチンの、およびＩＤ送達された多重抗原ワクチンのいずれかでの、２回目の免疫化後（８週目）での抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を比較したデータを示す。図２１の左上パネルは抗原特異的ＩＦＮγ産生データを示し、中央パネルは抗原特異的ＩＬ−２産生データを示し、また右パネルは抗原−特異的ＴＮＦα産生データを示す。図２１の左下パネルは、ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞での抗原特異的グランザイムＢの評定を確認するデータを示す。

【図22】図２２は、アジュバントＩＬ−２８Ｂをコードする構築物を含むまたは含まないＩＭ送達された多重抗原ワクチンの、およびＩＤ送達された多重抗原ワクチンのいずれかでの、２回目の免疫化後の、全抗原の抗原−特異的血清陽転化を比較するデータを示す。

【図23】図２３は、アジュバントＩＬ−２８Ｂをコードする構築物の様々な量を含まない、または当該構築物を組み合わせた多重抗原ワクチンの投与により誘導される、ＩＦＮγのＥＬＩＳｐｏｔにより評定した抗原−特異的免疫応答を比較したデータを示す。左パネルは、１回目および２回目の免疫化前と免疫化後に測定したものを示す。左パネルは抗原−特異的免疫応答を組み合わせた応答の棒グラフとして示し、右パネルはＣＳ特異的免疫応答についてのデータを示す。

【図24】図２４は、アジュバントＩＬ−２８Ｂをコードする構築物の様々な量を含まない、または当該構築物を組み合わせた多重抗原ワクチンの投与後でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞集団を比較するデータを示す。

【図25-1】図２５は、アジュバントＩＬ−２８Ｂをコードする構築物の様々な量を含まない、または当該構築物を組み合わせた多重抗原ワクチンの投与後でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞のＣＳ特異的血清陽転化（ｓｅｒｏｃｏｖｅｒｓｉｏｎ）集団を比較するデータを示す。

【図25-2】図２５は、アジュバントＩＬ−２８Ｂをコードする構築物の様々な量を含まない、または当該構築物を組み合わせた多重抗原ワクチンの投与後でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞のＣＳ特異的血清陽転化（ｓｅｒｏｃｏｖｅｒｓｉｏｎ）集団を比較するデータを示す。

【図25-3】図２５は、アジュバントＩＬ−２８Ｂをコードする構築物の様々な量を含まない、または当該構築物を組み合わせた多重抗原ワクチンの投与後でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞のＣＳ特異的血清陽転化（ｓｅｒｏｃｏｖｅｒｓｉｏｎ）集団を比較するデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

好ましい実施形態の詳細な説明
本発明の１つの態様において、前記コンセンサス抗原が、下記の、転写上昇のための低ＧＣ含量リーダー配列、ｍＲＮＡ安定性とコドン最適化、可能な範囲でのｃｉｓ作用性配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の除去のうちの１つ以上を有することを含む、転写と翻訳の改善に対処することが望ましい。

【0011】

本発明のいくつかの態様において、下記の、利用可能な全長配列全てを組み込むこと、各位置で最も一般的に現れるアミノ酸を利用する配列をコンピューターで作成すること、および株間の交差反応性を増加させることの１つ以上を有することを含む、複数の株を横断する広範な免疫反応を引き起こすコンセンサス 抗原を生成することが望ましい。

【0012】

１．定義
本明細書に使用される用語法は、特定の実施形態を説明することだけを目的としており、限定することを意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示物を含む。

【0013】

本明細書での数の範囲の列挙については、その間に介在する数それぞれが同じ程度の厳密性をもって明らかに考慮されている。例えば、６〜９の範囲については、数７および８が６と９に加えて考慮されており、６．０〜７．０の範囲については、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６、９および７．０が明らかに考慮されている。

【0014】

ａ．アジュバント
「アジュバント」は、本明細書において使用される場合、本明細書において記載されるＤＮＡプラスミドワクチンに、前記ＤＮＡプラスミドと下文に記載されるコード核酸配列にコードされるマラリア（Ｐ．ｆ．）抗原の抗原性を高めるために添加される任意の分子を意味し得る。

【0015】

ｂ．抗体
「抗体」は、ＩｇＧクラス、ＩｇＭクラス、ＩｇＡクラス、ＩｇＤクラスまたはＩｇＥクラスの抗体または断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および単鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二官能性抗体およびそれらの誘導体を含む、それらの断片または誘導体を意味し得る。抗体は、所望のエピトープ、またはそれに由来する配列に対して充分な結合特異性を示す、哺乳類の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはそれらの混合物であり得る。

【0016】

ｃ．コード配列
「コード配列」または「コード核酸」は、本明細書において使用される場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味し得る。コード配列は、前記核酸が投与される個体または哺乳類動物の細胞での発現を制御することが可能である、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節性エレメントに機能するように結合したイニシエーションシグナルおよびターミネーションシグナルをさらに含み得る。

【0017】

ｄ．相補
「相補」または「相補的な」は、本明細書において使用される場合、核酸分子のヌクレオチド間での、またはヌクレオチド類似体間でのワトソン・クリック塩基対合（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ塩基対合およびＣ−Ｇ塩基対合）またはフーグスティーン塩基対合を意味し得る。

【0018】

ｅ．コンセンサスまたはコンセンサス配列
「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、本明細書において使用される場合、特定のマラリア抗原の複数の亜型または血清型に対する広範な免疫を誘導するために使用することができる、特定のマラリア抗原の複数の亜型をアラインメント解析して構成した合成核酸配列、または対応するポリペプチド配列を意味し得る。コンセンサスマラリア抗原はＣＳタンパク質、ＬＳＡ１タンパク質、ＴＲＡＰタンパク質、ＣｅｌＴＯＳタンパク質およびＡＭＡ１タンパク質を含み得る。高レベルの発現用に設計されたものを含む、コンセンサスアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もまた提供される。また、融合タンパク質などの合成抗原がコンセンサス配列（または、コンセンサス抗原）を含み得る。

【0019】

ｆ．定電流
組織、または前記組織を規定する細胞が、同組織に伝達される電気パルスの持続期間中に受容する、または受ける電流を規定するために本明細書において使用されるような「定電流」。電気パルスは、本明細書において記載される電気穿孔装置から伝達される。本明細書において提供される電気穿孔装置はフィードバックエレメントを持っているので、好ましくは、瞬間的なフィードバックがあり、電気パルスの持続時間にわたってこの電流は一定のアンペア数のままでいる。前記フィードバックエレメントは、パルスの持続期間を通して、組織（または、細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置に電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を上げさせる）ことができ、それにより、同組織での電流が電気パルスの期間を通して（マイクロ秒のオーダーで）、そして、パルス毎に一定である。いくつかの実施形態において、フィードバックエレメントは制御装置を含む。

【0020】

ｇ．電流フィードバックまたはフィードバック
「電流フィードバック」または「フィードバック」は、本明細書において使用される場合、互換的に使用可能であり、そして、電極間の組織で電流を測定し、そして、電流を一定のレベルに維持するために、適宜にＥＰ装置が伝達するエネルギー出力を変化させることを含む所与の電気穿孔装置の能動的応答を意味し得る。パルスシークエンスまたは電気治療を開始する前に、使用者はこの一定レベルを事前設定する。電気穿孔装置中の電子回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニターし、そして、そのモニターした電流（すなわち、組織内の電流）を事前設定した電流と比較し、そして、モニターした電流を事前設定したレベルに維持するためにエネルギー−出力を連続的に調節することができるので、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えば、制御装置がフィードバックを達成することができる。フィードバックループはアナログ閉ループフィードバックであるので、フィードバックループは瞬間的であり得る。

【0021】

ｈ．分散化電流
「分散化電流」は、本明細書において使用される場合、本明細書において記載される電気穿孔装置の様々なニードル電極アレイから伝達される電流のパターンであって、電気穿孔を受けた任意の面積の組織での電気穿孔法に関連する熱ストレスの発生を最小化する、または、好ましくは除去する電流のパターンを意味し得る。

【0022】

ｉ．電気穿孔法
「電気穿孔法」、「電気透過処理」または「電気動力学的促進（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）は、本明細書において互換的に使用される場合、膜貫通電界パルスを使用して生体膜に顕微的経路（細孔）を導入することを指す。それらの存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬品、イオン、および水などの生体分子が細胞膜の一方の側から他方の側へ通過することが可能になる。

【0023】

ｊ．フィードバック機構
「フィードバック機構」は、本明細書において使用される場合、ソフトウェアまたはハードウェア（またはファームウェア）のいずれかが実行する、（エネルギーパルスの伝達の前、その間、および／またはその後に）所望の組織のインピーダンスを受信し、そして、現在の値、好ましくは、電流と比較し、そして、事前設定した値に達するように伝達されるエネルギーパルスを調節する過程を意味し得る。フィードバック機構はアナログ閉ループ回路によって実行され得る。

【0024】

ｋ．断片
「断片」は、特定のマラリア抗原を認識することにより哺乳類動物でマラリアに対する免疫反応を誘発することができるマラリアコンセンサス免疫原のポリペプチド断片を意味し得る。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥシグナルペプチド（配列番号４２）またはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドに連結したマラリアコンセンサス免疫原の断片を含み得る。

【0025】

ＰｆＣｏｎＣＳコンセンサスマラリア免疫原などのＰｆＣｏｎコンセンサスマラリア免疫原の断片、またはＰｆＣｏｎＬＡＳ１コンセンサスマラリア免疫原の断片、またはＰｆＣｏｎＴＲＡＰコンセンサスマラリア免疫原の断片、またはＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳコンセンサスマラリア免疫原の断片、またはＰｆＣｏｎＡＭＡ１コンセンサスマラリア免疫原の断片、またはＰｆＣｏｎＣＳ−ａｌｔオルタナティブコンセンサスマラリア免疫原の断片は、本明細書に示されるように、それぞれ、全長型ＰｆＣｏｎＣＳ免疫原配列（配列番号２）、全長型ＰｆＣｏｎＬＡＳ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号４）、または全長型ＰｆＣｏｎＴＲＡＰコンセンサスマラリア免疫原（配列番号６）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳコンセンサスマラリア免疫原（配列番号８）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＡＭＡ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号１０）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣＳ−ａｌｔ（配列番号１２）の断片の９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントの長さであり得る。シグナルペプチドまたは他の付加された配列を含むＰ．ｆ．コンセンサス配列（例えば、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６などのＰ．ｆ．コンセンサス配列を含むタンパク質）の断片サイズを計算するとき、その計算は全長配列型Ｐｆ配列部分のみである（配列番号２、４、６、８、１０または１２）。いくつかの実施形態において、全長型ＰｆＣｏｎＣＳ免疫原配列（配列番号２）、全長型ＰｆＣｏｎＬＡＳ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号４）、または全長型ＰｆＣｏｎＴＲＡＰコンセンサスマラリア免疫原（配列番号６）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳコンセンサスマラリア免疫原（配列番号８）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＡＭＡ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号１０）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣＳ−ａｌｔ（配列番号１２）のうちの１つの断片が、それぞれ、Ｎ末端配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸残基を除いて全て、またはＣ末端配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸残基を除いて全て、またはＮ末端配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸残基とＣ末端配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸残基を除いて全ての組合せを除いて全てを含む。

【0026】

断片はまた、全長型ＰｆＣｏｎＣＳ免疫原配列（配列番号２）、全長型ＰｆＣｏｎＬＡＳ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号４）、または全長型ＰｆＣｏｎＴＲＡＰコンセンサスマラリア免疫原（配列番号６）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳコンセンサスマラリア免疫原（配列番号８）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＡＭＡ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号１０）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣＳ−ａｌｔ（配列番号１２）の断片のうちの１つの配列に対して、それぞれ、９８％以上または９９％以上相同であるポリペプチドである相同的異型体アミノ酸配列の断片を意味する。相同的異型体アミノ酸配列の前記断片は、特定の全長型相同的異型体アミノ酸配列（全長型ＰｆＣｏｎＣＳ免疫原配列（配列番号２）、全長型ＰｆＣｏｎＬＡＳ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号４）、または全長型ＰｆＣｏｎＴＲＡＰコンセンサスマラリア免疫原（配列番号６）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳコンセンサスマラリア免疫原（配列番号８）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＡＭＡ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号１０）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣＳ−ａｌｔ（配列番号１２）の断片に対して、それぞれ、９８％以上または９９％以上相同であるポリペプチド）の９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントの長さである。Ｐ．ｆ．コンセンサス免疫原配列（配列番号２、４、６、８または１０）に対する相同的異型体アミノ酸配列の相同性を計算するとき、Ｐ．ｆ．コンセンサス免疫原配列に対応する相同的異型体アミノ酸配列のアミノ酸配列に連結した任意のシグナルペプチドまたは他の付加された配列は計算に含まれない。相同的異型体アミノ酸配列の断片の長さを計算するとき、その計算は、Ｐ．ｆ．コンセンサス免疫原配列に対応する全長型相同的異型体アミノ酸配列のパーセンテージに基づく。いくつかの実施形態において、全長型相同的異型体アミノ酸配列の断片は、全長型相同的異型体アミノ酸配列のＮ末端配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸残基を除いて全て、またはＣ末端配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸残基を除いて全て、またはＮ末端配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸残基とＣ末端配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸残基を除いて全ての組合せを除いて全てを含む。

【0027】

「断片」はまた、先に説明したような全長型ＰＦコンセンサス免疫原の断片をコードする核酸配列、または先に説明したような相同的異型体アミノ酸配列の断片をコードする核酸配列であり得る。断片は、配列番号１、３、５、７、９または１１の断片であり、そして、先に説明したような全長型ＰＦコンセンサス免疫原の断片をコードする核酸配列であり得る。断片は、相同的異型体核酸配列の断片である核酸配列であり得る。相同的異型体核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９または１１に対して９８％以上または９９％以上相同であり、そして、配列番号２、４、６、８、１０または１２に対して９８％以上または９９％以上相同であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。相同的異型体核酸配列の断片は相同的異型体アミノ酸配列の断片をコードする。配列番号１、３、５、７、９、１１または相同的異型体核酸配列の断片は、シグナルペプチド、好ましくは免疫グロブリンシグナルペプチド、好ましくはＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドをコードするコード配列を含み得る。相同的異型体核酸配列とコンセンサスＰＦ免疫原コード配列（配列番号１、３、５、７、９または１１）の間のパーセント相同性の計算には、シグナルペプチドのコード配列、または相同的異型体核酸配列に連結することができる他の任意の非コンセンサス全長型ＰＦ免疫原コード配列は含まれない。全長型相同的異型体核酸配列のパーセンテージで表される断片サイズには、シグナルペプチドのコード配列、または相同的異型体核酸配列もしくはその断片に連結することができる他の任意の非コンセンサス全長型ＰＦ免疫原コード配列は含まれない。

【0028】

ｌ．相同的異型体
「相同的異型体アミノ酸配列」は、全長型ＰｆＣｏｎＣＳ免疫原配列（配列番号２）、全長型ＰｆＣｏｎＬＡＳ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号４）、または全長型ＰｆＣｏｎＴＲＡＰコンセンサスマラリア免疫原（配列番号６）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳコンセンサスマラリア免疫原（配列番号８）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＡＭＡ１コンセンサスマラリア免疫原（配列番号１０）の断片、または全長型ＰｆＣｏｎＣＳ−ａｌｔ（配列番号１２）の断片のうちの１つの配列に対して、それぞれ、９８％以上または９９％以上相同であるポリペプチドを意味することが可能であり、そして、それは、特定のマラリア抗原を認識することにより哺乳類動物でマラリアに対する免疫反応を誘発することができる。相同的異型体アミノ酸配列は免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含み、それらに連結することが可能である。Ｐ．ｆ．コンセンサス免疫原配列（配列番号２、４、６、８または１０）に対する相同的異型体アミノ酸配列の相同性を計算するとき、Ｐ．ｆ．コンセンサス免疫原配列に対応する相同的異型体アミノ酸配列のアミノ酸配列に連結した任意のシグナルペプチドまたは他の付加された配列は計算に含まれない。

【0029】

「相同的異型体核酸配列」は、配列番号１、３、５、７、９または１１に対して９８％以上または９９％以上相同であり、そして、特定のマラリア抗原を認識することにより哺乳類動物でマラリアに対する免疫反応を誘発することができる配列番号２、４、６、８、１０または１２に対して９８％以上または９９％以上相同であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。相同的異型体核酸配列は、シグナルペプチド、好ましくは免疫グロブリンシグナルペプチド、好ましくはＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドをコードするコード配列を含み得る。相同的異型体核酸配列とコンセンサスＰＦ免疫原コード配列（配列番号１、３、５、７、９または１１）の間のパーセント相同性の計算には、シグナルペプチドのコード配列または相同的異型体核酸配列に連結することができる他の任意の非コンセンサス全長型ＰＦ免疫原コード配列は含まれない。いくつかの実施形態において、相同的異型体核酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０または１２を含むタンパク質をコードする。

【0030】

ｌ．同一な
「同一な」または「同一性」は、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して本明細書において使用される場合、配列が、特定の領域にわたって同一である残基の特定のパーセンテージを有することを意味し得る。２つの配列を最適に整列し、２つの配列を特定の領域にわたって比較し、マッチした位置の数を得るために、両方の配列で同一の残基が現れた位置の数を決定して、前記の特定の領域の位置の総数でマッチした位置の数を除算し、そして配列同一性のパーセンテージを得るためにその結果に１００を乗算することにより、パーセンテージを計算することができる。２つの配列の長さが異なる場合、または、配列の整列により１つ以上の食い違いになった末端が生じ、そして、比較する特定の領域がただ１つの配列を含む場合、その１つの配列の残基が計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等であるとみなすことができる。同一性は手作業で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピューター配列アルゴリズムを使用することにより計算され得る。

【0031】

ｍ．インピーダンス
「インピーダンス」は、本明細書において使用される場合、フィードバック機構を考察するときに使用されることが可能であり、それはオームの法則に従って電流の値に変換されることが可能であり、したがって、事前設定した電流との比較を可能とする。

【0032】

ｎ．免疫反応
「免疫反応」は、本明細書において使用される場合、所与のＤＮＡプラスミドワクチンを介したマラリアコンセンサス抗原の導入に反応した宿主の免疫系、例えば、哺乳類動物の免疫系の活性化を意味し得る。その免疫反応は細胞性反応または液性反応または両方の形態であり得る。

【0033】

ｏ．核酸
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、共有結合で１つに結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の叙述はまた、相補鎖の配列を規定する。したがって、核酸はまた、叙述された一本鎖の相補鎖を包含する。所与の核酸と同じ目的のため、多くの核酸の異型体を使用することができる。したがって、核酸はまた実質的に同一の核酸およびそれの相補体を包含する。一本鎖により、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブがもたらされる。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。

【0034】

核酸は一本鎖もしくは二本鎖であることが可能であり、または二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含有することが可能である。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、または前記核酸がデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組合せ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組合せを含有する可能性がある場合、ハイブリッドであり得る。化学合成法または組換え方法により核酸を取得することができる。

【0035】

ｐ．機能するように結合した
「機能するように結合した」 は、本明細書において使用される場合、遺伝子の発現 が、それに空間的に連結されたプロモーターの制御下にあることを意味し得る。 プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。 プロモーター と遺伝子の間の距離は、そのプロモーターとそのプロモーター が由来する遺伝子でそれが制御する遺伝子の間の距離とおおおよそ同じであり得る。当技術分野において知られるように、プロモーター機能を喪失することなく、この距離を変化させることができる。

【0036】

ｑ．プロモーター
「プロモーター」は、本明細書において使用される場合、細胞内で核酸の発現を引き起こす、発現を活性化する、または発現を増大させる合成または天然の分子を意味し得る。プロモーターは、核酸の発現をさらに増大させるため、ならびに／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変化させるために、１つ以上の特定の転写調節性配列を含み得る。プロモーターはまた、転写開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターはウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは遺伝子成分の発現を恒常的に、または発現が起こる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が起こる発生段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオンもしくは誘導薬剤などの外部刺激に応答して差示的に調節し得る。プロモーターの代表例にはバクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター‐プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。

【0037】

ｒ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書において使用される場合、例えば、核酸の複雑な混合物の中で第１核酸配列（例えば、プローブ）が第２核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして、異なる状況では異なる。ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度 ｐＨで特定の配列について熱融解点（Ｔ_ｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択され得る。Ｔ_ｍは、（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核濃度で）標的に相補的なプローブの５０％が標的配列に平衡状態でハイブリダイズする（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでプローブの５０％が平衡状態で占有される）温度であり得る。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、および、温度が短プローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、および、（例えば、約５０ヌクレオチドより大きい）長プローブについては少なくとも約６０℃である条件であり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することにより達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性のシグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、次の、６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴う、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベートが含まれる。

【0038】

ｓ．実質的に相補的な
「実質的に相補的な」は、本明細書において使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００もしくはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸からなる領域について第１配列が第２配列の相補体に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、または、その２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。

【0039】

ｔ．実質的に同一な
「実質的に同一な」は、本明細書において使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００もしくはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸からなる領域について第１配列と第２配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、または、核酸に関しては、第１配列が第２配列の相補体に対して実質的に相補的である場合を意味し得る。

【0040】

ｕ．異型体
核酸に関して本明細書で使用される「異型体」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の部分または断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列またはその部分の相補体、（ｉｉｉ）参照核酸またはその相補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）参照核酸、その相補体もしくはそれに実質的に同一である配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味し得る。

【0041】

挿入、欠失または保存的アミノ酸置換によりアミノ酸配列が異なるペプチドまたはポリペプチドに関して、「異型体」は少なくとも１つの生物活性を保持する。異型体はまた、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する、参照タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、類似の特質（例えば、親水性、荷電領域の程度と分布）を有するアミノ酸でアミノ酸を置換することは、小さな変更を典型的には伴うこととして当技術分野において認識される。これらの小さな変更は、当技術分野において理解されるような、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することにより、部分的には、特定され得る（Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７：１０５−１３２ （１９８２））。アミノ酸の疎水性親水性指標はその疎水性と電荷を考慮することに基づく。類似の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換可能であり、なおタンパク質機能を保持し得ることは当技術分野において公知である。１つの態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持しているタンパク質を生じるであろう置換を明らかにするために使用され得る。ペプチドに関して、アミノ酸の親水性を考慮することにより、抗原性と免疫原性によく相関すると報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大局所的平均親水性の計算が可能になる。（米国特許第４，５５４，１０１号、参照により全体が本明細書に組み込まれる。）類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、当技術分野において理解されるように、生物活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドが生じることになり得る。互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で置換を実行することができる。アミノ酸の疎水性指数と親水性値の両方がそのアミノ酸の特定の側鎖によって影響され得る。その観察と一致するが、生物学的機能と両立するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の特質によって明らかにされるようなアミノ酸および、特に、それらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解されている。

【0042】

ｖ．ベクター
本明細書に使用される「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味し得る。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは自己複製性染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのどちらかであり得る。

【0043】

２．Ｐ．ｆ．コンセンサス免疫原
ＰＦに対する免疫反応を誘発することが可能であるコンセンサス抗原である、本明細書において「コンセンサスＰＦ免疫原」とも称されるコンセンサスＰＦタンパク質が本明細書において提供される。総計で６つのコンセンサス配列が調製された。コンセンサスＰＦタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２、本明細書において記載されるようなその断片、本明細書において記載されるようなその相同的異型体アミノ酸配列、または本明細書において記載されるような相同的異型体アミノ酸配列の断片を含み得る。コンセンサスＰＦタンパク質は、シグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含み得る。配列番号２、４、６、８、１０または１２のコンセンサスＰＦタンパク質がＩｇＥシグナルペプチドをさらに含む実施形態には、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６が含まれる。好ましい実施形態には、ＩｇＥシグナルペプチドなどのシグナルペプチドが含まれる。各タンパク質で、ＰＦコンセンサス配列のＮ末端メチオニンはシグナルペプチドと置換される。いくつかの実施形態において、コンセンサスＰＦタンパク質はＨＡタグなどの他のアミノ酸配列を含む。配列番号２、４、６、８、１０または１２のコンセンサスＰＦタンパク質がＩｇＥシグナルペプチドａとＨＡタグをさらに含む実施形態には、配列番号２６、２８、３０、３２、３４および３６が含まれる。

【0044】

ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の全長型スポロゾイト周囲タンパク質配列（総計で６６配列）の編集物からコンセンサスＣＳコンセンサス配列を設計した。全長型ＰｆＣｏｎＣＳリーダー配列のタンパク質配列は配列番号２である。それを導いた配列の各々に対する配列番号２のパーセント相同性は図１Ａに報告されている。配列番号２の６６種のＧｅｎｂａｎｋ配列全てとの相同性の中央値は９８．２％（９７．０〜９９．８）である。ＰｆＣｏｎＣＳの前記ＧｅｎＢａｎｋ配列との配列アラインメントは図１Ｂに示されている。示されているＰｆＣｏｎＣＳ配列は配列番号２６の図１Ｂを含む。「コンセンサスＣＳ免疫原」は、配列番号２を含むタンパク質、本明細書において記載されるようなその断片、本明細書において記載されるような配列番号２に対する相同アミノ酸配列、および本明細書において記載されるようなその断片を指す。コンセンサスＣＳ免疫原はシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含むことが可能であり、そして、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含むことが可能である。ＩｇＥシグナルペプチドを含むコンセンサスＣＳ免疫原には配列番号１４および２６が含まれる。配列番号２６は、ＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを含むコンセンサスＣＳ免疫原である。

【0045】

ＬＳＡ１は非常に保存的な抗原である。コンセンサス配列ＰｆＣｏｎＬＳＡ１はＧｅｎＢａｎｋデータベース中の全長型ＰｆＬＳＡ１配列に基づいて設計された。全長型ＰｆＣｏｎＬＳＡのタンパク質配列は配列番号４である。図２Ａは、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の全長型ＰｆＬＳＡ１配列と組換えタンパク質ワクチン候補であるＬＳＡ１−ＮＲＣに対する配列番号４の相同性を示す。配列番号４は全長型ＬＳＡ１配列に対して９５％相同であり、そして、ＬＳＡ−ＮＲＣに対して９６％相同である。ＰｆＣｏｎＬＳＡ１、全長型ＬＳＡ１およびＬＳＡ１−ＮＲＣの多重配列アラインメントが図２Ｂに示されている。示されているＰｆＣｏｎＬＡＳ１配列は配列番号２８の図２Ｂを含む。全長型ＬＳＡ１配列は、タンパク質の中央部に複数の反復領域を含有する。ＰｆＣｏｎＬＳＡ１はこれらの反復領域のうちの８つのみを含有する。ＰｆＣｏｎＬＳＡ１またはＬＳＡ１−ＮＲＣに含有されない反復領域の部分のみを含むように配列アラインメントを最小化した。「コンセンサスＬＡＳ１免疫原」は、配列番号４を含むタンパク質、本明細書において記載されるようなその断片、本明細書において記載されるような配列番号４に対する相同アミノ酸配列、および本明細書において記載されるようなその断片を指す。コンセンサスＬＡＳ１免疫原はシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含むことが可能であり、そして、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含むことが可能である。ＩｇＥシグナルペプチドを含むコンセンサスＬＡＳ１免疫原には配列番号１６および２８が含まれる。配列番号２８は、ＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを含むコンセンサスＣＳ免疫原である。

【0046】

ＳＳＰ２とも称されるＴＲＡＰコンセンサス配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の全長型熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ／ＳＳＰ２配列（総計２８配列）の編集物から設計された。全長型ＰｆＣｏｎＴＲＡＰ／ＳＳＰ２のタンパク質配列は配列番号６である。それを導いた配列の各々に対する配列番号６のパーセント相同性は図３Ａに報告されている。配列番号６の２８種のＧｅｎｂａｎｋ配列全てとの相同性の中央値は９８．３％（９３．０〜９９．１）である。ＰｆＣｏｎＳＳＰ２／ＴＲＡＰと前記の２８配列の多重配列アラインメントは図３Ｂに示されている。示されているＰｆＣｏｎＴＲＡＰ配列は配列番号３０の図３Ｂを含む。「コンセンサスＴＲＡＰ免疫原」は、配列番号６を含むタンパク質、本明細書において記載されるようなその断片、列本明細書において記載されるような配列番号６に対する相同アミノ酸配列、および本明細書において記載されるようなその断片を指す。コンセンサスＴＲＡＰ免疫原はシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含むことが可能であり、そして、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含むことが可能である。ＩｇＥシグナルペプチドを含むコンセンサスＴＲＡＰ免疫原には配列番号１８および３０が含まれる。配列番号３０は、ＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを含むコンセンサスＴＲＡＰ免疫原である。

【0047】

Ａｇ２とも称されるＣｅｌＴＯＳは非常に保存的なプラスモディウム抗原である。配列番号８であるコンセンサス配列ＰｆＣｏｎＡｇ２（ＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳ）は、新規のリーダー配列を付加して、図４Ａにおいて特定される、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の全長型ＣｅｌＴＯＳ配列に基づいて設計された。ＰｆＣｏｎＡｇ２のタンパク質配列とＧｅｎＢａｎｋ中の全長型ＣｅｌＴＯＳ配列が、図４Ｂに示されるように、比較された。示されているＰｆＣｏｎＣｅｌＴＯＳ配列は、配列番号３２の図４Ｂを含む。コンセンサスＣｅｌＴＯＳ免疫原は、配列番号８を含むタンパク質、本明細書において記載されるようなその断片、本明細書において記載されるような配列番号８に対する相同アミノ酸配列、および本明細書において記載されるようなその断片を指し、そして、シグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含み、そして、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含むことが可能である。ＩｇＥシグナルペプチドを含むコンセンサスＣｅｌＴＯＳ免疫原には配列番号２０および３２が含まれる。配列番号３２は、ＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを含むコンセンサスＣｅｌＴＯＳ免疫原である。

【0048】

Ａｍａ１は非常に保存的なプラスモディウム抗原である。配列番号１０であるコンセンサス配列ＰｆＣｏｎＡｍａ１は全長型Ａｍａ１配列に基づいて設計された。コンセンサスＡｍａ１免疫原は、配列番号１０を含むタンパク質、本明細書において記載されるようなその断片、本明細書において記載されるような配列番号１０に対する相同アミノ酸配列、および本明細書において記載されるようなその断片を指し、そして、シグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含み、そして、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含むことが可能である。ＩｇＥシグナルペプチドを含むコンセンサスＡｍａ１免疫原には配列番号２２および３４が含まれる。配列番号３４は、ＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを含むコンセンサスＡｍａ１免疫原である。

【0049】

オルタナティブコンセンサスＣＳコンセンサス配列であるコンセンサスＣＳ−ａｌｔが設計された。ＰｆＣｏｎＣＳ−ａｌｔのタンパク質配列は配列番号１２である。「コンセンサスＣＳ−ａｌｔ免疫原」は、配列番号１２を含むタンパク質、本明細書において記載されるようなその断片、本明細書において記載されるような配列番号１２に対する相同アミノ酸配列、および本明細書において記載されるようなその断片を指し、そして、シグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドを含むことが可能であり、そして、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含むことが可能である。ＩｇＥシグナルペプチドを含むコンセンサスＣＳ−ａｌｔ免疫原には配列番号２４および３６が含まれる。配列番号３６は、ＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを含むコンセンサスＣＳ−ａｌｔ免疫原である。

【0050】

いくつかの実施形態において、本明細書において示されるＰＦタンパク質のうちの２つ以上の組合せを含む融合タンパク質が提供される。例えば、融合タンパク質は、コンセンサスＣＳ免疫原またはＣｏｎＣＳ−ａｌｔ免疫原、ＣｏｎＬＳＡ１免疫原、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原およびＣｏｎＡｍａ１免疫原のうちの２つ以上を互いに隣接して直接連結して含む、またはスペーサーもしくはもう１個のアミノ酸をその間に含んで連結して含むことが可能である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は２つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は３つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は４つのＰＦ免疫原を含み、そして、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は５つのＰＦ免疫原を含む。２つのコンセンサスＰＦ免疫原を含む融合タンパク質はＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＬＳＡ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＴＲＡＰ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＡｍａ１；ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含み得る。３つのコンセンサスＰＦ免疫原を含む融合タンパク質はＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含み得る。４つのコンセンサスＰＦ免疫原を含む融合タンパク質はＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１；またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含み得る。５つのコンセンサスＰＦ免疫原を含む融合タンパク質はＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含み得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端に連結したシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結した複数のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＰＦ免疫原間にスペーサーが含まれ得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＰＦ免疫原間のスペーサーはタンパク質分解性切断部位であり得る。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ワクチンが投与される、および／または、取り込まれることが意図されている細胞に見出されるプロテアーゼが認識するタンパク質分解性切断部位であり得る。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＰＦ免疫原間にスペーサーが含まれ得るが、そのスペーサーは、ワクチンが投与される、および／または、取り込まれることが意図されている細胞に見出されるプロテアーゼが認識するタンパク質分解性切断部位であり、ならびに前記融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結した複数のシグナルペプチドを含み、切断されると、各コンセンサスＰＦ免疫原の前記シグナルペプチドによりコンセンサスＰＦ免疫原が細胞の外に移動する。

【0051】

３．コンセンサスＰＦ免疫原をコードするコード配列
コンセンサスＰＦ免疫原をコードする核酸配列が本明細書において提供される。前記核酸配列を含む核酸分子の投与により、それが取り込まれ、細胞によって発現されると、ＰＦに対する広範な免疫反応がもたらされる。先に開示した６つのコンセンサスＰＦ免疫原毎のコード配列が調製された。コンセンサスＰＦタンパク質のコード配列は、配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２、本明細書において記載されるようなその断片、本明細書において記載されるような相同的異型体アミノ酸配列、または相同的異型体アミノ酸配列の断片をコードし得る。いくつかの実施形態において、その配列番号２、４、６、８、１０または１２のコード配列は相同的異型体核酸配列であり得る。いくつかの実施形態において、配列番号２、４、６、８、１０または１２の断片をコードするコード配列は相同的異型体核酸配列の断片であり得る。コンセンサスＰＦタンパク質のコード配列は配列番号１、３、５、７、９もしくは１１、本明細書において記載されるようなその断片、本明細書において記載されるような相同的異型体アミノ酸配列をコードする本明細書において記載されるようなその相同的異型体核酸配列、または相同的異型体アミノ酸配列の断片をコードする相同的異型体核酸配列の断片を含み得る。コンセンサスＰＦタンパク質のコード配列はシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどの免疫グロブリンシグナルペプチドのコード配列を含み得る。コード配列は、配列番号２、４、６、８、１０または１２のコンセンサスＰＦタンパク質がＩｇＥシグナルペプチドを含む実施形態をコードし得る：配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４および３６。コード配列は、ＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグを含むコンセンサスＰＦタンパク質配列番号２、４、６、８、１０または１２をコードし得る：配列番号２６、２８、３０、３２、３４および３６。ＩｇＥシグナルペプチドのコード配列を含む配列番号１、３、５、７、９または１１のコード配列には配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３および３５が含まれる。ＩｇＥシグナルペプチドとＨＡタグのコード配列を含む配列番号１、３、５、７、９または１１のコード配列には配列番号２５、２７、２９、３１、３３および３５が含まれる。コード配列は本明細書において提供される融合タンパク質をコードし得る。コード配列は、配列番号１、３、５、７、９もしくは１１、本明細書において記載されるようなその断片、本明細書において記載されるような相同的異型体アミノ酸配列をコードする本明細書において記載されるようなその相同的異型体核酸配列、または相同的異型体アミノ酸配列の断片をコードする相同的異型体核酸配列の断片を含み得る。

【0052】

４．プラスミド
哺乳類動物の細胞中で、その哺乳類動物で免疫反応を誘発するのに有効な量のマラリア抗原を発現することが可能であるベクターが本明細書において提供される。そのベクターは、マラリア抗原をコードする異種性の核酸を含み得る。前記ベクターはプラスミドであり得る。前記プラスミドは、マラリア抗原をコードする核酸で細胞を形質移入するのに有用であることが可能であり、マラリア抗原の発現が起こる条件下でその形質転換宿主細胞が培養され、維持される。

【0053】

プラスミドは、本明細書に開示されるようなコンセンサスＰＦ免疫原をコードする１つ以上のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを含み得る。本明細書に開示されるようなコンセンサスＰＦ免疫原をコードするコード配列が調節性エレメントに機能するように結合して好ましい。

【0054】

いくつかの実施形態において、プラスミドは、１つのコンセンサスＰＦ免疫原、すなわち、コンセンサスＰＦ ＣＳ免疫原、コンセンサスＰＦ ＬＳＡ１免疫原、コンセンサスＰＦ ＴＲＡＰ免疫原、コンセンサスＰＦ ＣｅｌＴＯＳ免疫原、コンセンサスＰＦ Ａｍａ１免疫原またはコンセンサスＰＦ ＣＳ−ａｌｔ免疫原のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを有する。

【0055】

いくつかの実施形態において、プラスミドは、複数のコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを有する。複数のコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを有するプラスミドでは、前記コンストラクトは、各コンセンサスＰＦ免疫原が別々の調節性エレメントのセットを含む別々の発現カセットでありうる、または、コード配列がＩＲＳ配列によって分けられる単一の発現カセットに２つ以上のコード配列が組み込まれ得る。

【0056】

いくつかの実施形態において、プラスミドは、２つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを有する。そのようなプラスミドは、ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＬＳＡ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＴＲＡＰ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＡｍａ１；ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを含み得る。

【0057】

いくつかの実施形態において、プラスミドは、３つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを有する。そのようなプラスミドは、ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを含み得る。

【0058】

いくつかの実施形態において、プラスミドは、４つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを有する。そのようなプラスミドは、ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１；またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを含み得る。

【0059】

いくつかの実施形態において、プラスミドは、５つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを有する。そのようなプラスミドは、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１のコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを含み得る。

【0060】

プラスミドは、コード配列の上流にあり得る開始コドン、およびコード配列の下流にあり得る停止コドンを含み得る。開始コドンおよび終止コドンはコード配列とインフレームであり得る。

【0061】

プラスミドはまた、コード配列に機能するように結合したプロモーターを含み得る。コード配列に機能するように結合したプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニ―ウイルスプロモーター、鳥白血症ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。プロモーターはまた、天然プロモーターでも合成プロモーターでも、筋肉もしくは皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターの例は米国特許出願公開第ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載され、その内容の全体が本明細書に組み込まれる。

【0062】

プラスミドはまた、コード配列の下流にあり得るポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ‐グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）に由来するポリアデニル化シグナルであり得る。

【0063】

プラスミドはまたコード配列の上流にエンハンサーを含み得る。エンハンサーはヒトアクチンエンハンサー、ヒトミオシンエンハンサー、ヒトヘモグロビンエンハンサー、ヒト筋クレアチンエンハンサー、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶもしくはＥＢＶに由来するエンハンサーなどのウイルス性のエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、および国際公開第ＷＯ９４／０１６７３７号に記載され、各々の内容が参照により完全に組み込まれる。

【0064】

プラスミドはまた、染色体外でプラスミドを維持し、そして、細胞中で複数コピーのプラスミドを産生するために、哺乳類動物性複製起点を含み得る。プラスミドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）のｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４またはｐＲＥＰ４であることが可能であり、それらは、染色体に組み込まれることなく多コピーのエピソーム性の複製をもたらし得るエプスタイン・バール・ウイルス性複製起点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得る。プラスミドの骨格はｐＡＶ０２４２であり得る。プラスミドは複製不全５型アデノウイルス（Ａｄ５）プラスミドであり得る。

【0065】

プラスミドはまた、プラスミドが投与される細胞での遺伝子発現によく適している可能性がある調節性配列を含み得る。コード配列は、宿主細胞でのそのコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含み得る。

【0066】

コード配列はまたＩｇリーダー配列を含み得る。そのリーダー配列はコード配列の５’に存在し得る。この配列がコードするコンセンサス抗原はコンセンサス抗原タンパク質の前にＮ末端Ｉｇリーダーを含み得る。Ｎ末端ＩｇリーダーはＩｇＥリーダーまたはＩｇＧリーダーであり得る。

【0067】

プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質生産に使用することができるｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）であり得る。プラスミドはまた、酵母の出芽酵母株でのタンパク質生産に使用することができるｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）であり得る。プラスミドはまた、昆虫細胞でのタンパク質生産に使用することができるＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）のプラスミドであり得る。プラスミドはまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞でのタンパク質生産に使用することができるｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）であり得る。

【0068】

５．組成物
プラスミドを含む組成物が提供される。前記組成物は複数コピーの、単一プラスミドなどの単一核酸分子、複数コピーの、２つ以上の異なるプラスミドなどの２つ以上の異なる核酸分子を含むことができる。例えば、組成物は複数の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なる核酸分子を含むことができる。そのような組成物は複数の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なるプラスミドを含むことができる。組成物はコンセンサスＰＦ ＣＳ免疫原、コンセンサスＰＦ ＬＳＡ１免疫原、コンセンサスＰＦ ＴＲＡＰ免疫原、コンセンサスＰＦ ＣｅｌＴＯＳ免疫原、コンセンサスＰＦ Ａｍａ１免疫原またはコンセンサスＰＦ ＣＳ−ａｌｔ免疫原のうちの１つ以上のコード配列を含むことができる。組成物は、単一コンセンサスＰＦ免疫原のコード配列、２つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列、３つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列、４つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列または５つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含有するプラスミドなどの核酸分子を含むことができる。２つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含む組成物は単一プラスミドなどの単一核酸分子上に存在することが可能であり、または、前記組成物は２つの異なるプラスミドなどの２つの異なる核酸分子を含むことが可能であり、一方の核酸分子は１つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含み、そして、他方の核酸分子は異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含む。同様に、３つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含む組成物は単一プラスミドなどの単一核酸分子、２つの異なる核酸分子または３つの異なる核酸分子を含むことができる。同様に、４つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含む組成物は単一プラスミドなどの単一核酸分子、２つの異なる核酸分子、３つの異なる核酸分子または４つの異なる核酸分子を含むことができる。５つのコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含む組成物は単一プラスミドなどの単一核酸分子、２つの異なる核酸分子、３つの異なる核酸分子、４つの異なる核酸分子または５つの異なる核酸分子を含むことができる。

【0069】

いくつかの実施形態において、組成物は、コンセンサスＰＦ ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ免疫原、コンセンサスＰＦ ＬＡＳ１免疫原、コンセンサスＰＦ ＴＲＡＰ免疫原、コンセンサスＰＦ ＣｅｌＴＯＳ免疫原またはコンセンサスＰＦ Ａｍａ１免疫原などの１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする複数の単一核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は複数の単一核酸分子、すなわち、ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＬＳＡ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＴＲＡＰ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＡｍａ１；ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１などの２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードするそのような単一プラスミドを含む。いくつかの実施形態において、組成物は複数の単一核酸分子、すなわち、ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１などの３つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードするそのような単一プラスミドを含む。いくつかの実施形態において、組成物は複数の核酸分子、すなわち、４つのコンセンサスＰＦ免疫原、すなわち、ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１；またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１をコードするそのような単一プラスミドを含む。いくつかの実施形態において、組成物は複数の単一核酸分子、すなわち、５つのコンセンサスＰＦ免疫原、すなわち、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１をコードするそのような単一プラスミドを含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の、２つの異なる核酸分子、例えば、２つのプラスミドを含み、異なる核酸分子のそれぞれが異なるコンセンサスＰＦ免疫原の単一の異なるコード配列を含み、異なる核酸分子のペアがＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＬＳＡ１；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＴＲＡＰ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＣｅｌＴＯＳ；ＣＳもしくはＣＳ−ａｌｔおよびＡｍａ１；ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ；ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１およびＡｍａ１；ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ；ＴＲＡＰおよびＡｍａ１；またはＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含む。まとめると、２つの異なるプラスミドが２つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0071】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の２つの異なる核酸分子、例えば、２つのプラスミドを含み、それらは３つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含む。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。まとめると、２つの異なるプラスミドが３つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0072】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の２つの異なる核酸分子、例えば、２つのプラスミドを含み、それらは４つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含む。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される３つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。まとめると、２つの異なるプラスミドが４つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0073】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の２つの異なる核酸分子、例えば、２つのプラスミドを含み、それらは５つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含む。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される３つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。まとめると、２つの異なるプラスミドが５つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0074】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の３つの異なる核酸分子、例えば、３つのプラスミドを含み、それらは３つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含む。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、３つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。まとめると、３つの異なるプラスミドが３つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0075】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の３つの異なる核酸分子、例えば、３つのプラスミドを含み、それらは４つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含む。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、３つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。まとめると、３つの異なるプラスミドが４つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0076】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の３つの異なる核酸分子、例えば、３つのプラスミドを含み、それらは５つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含む。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、３つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される３つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、３つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。まとめると、３つの異なるプラスミドが５つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0077】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の４つの異なる核酸分子、例えば、４つのプラスミドを含み、それらは４つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含む。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、３つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、４つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。まとめると、４つの異なるプラスミドが４つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0078】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の４つの異なる核酸分子、例えば、４つのプラスミドを含み、それらは５つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含む。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、３つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、４つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される２つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。まとめると、４つの異なるプラスミドが５つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0079】

いくつかの実施形態において、組成物は複数の５つの異なる核酸分子、例えば、４つのプラスミドを含み、それらは５つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を全体として含む。いくつかの実施形態において、１つの核酸分子は、ＣＳ、ＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、２つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、３つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、４つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードし、そして、５つ目は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１から選択される１つのコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。まとめると、５つの異なるプラスミドが５つの異なるコンセンサスＰＦ免疫原をコードする。

【0080】

いくつかの実施形態において、組成物はＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８Ｂおよび／またはＲＡＮＴＥＳのコード配列をさらに含む。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８Ｂおよび／またはＲＡＮＴＥＳのコード配列は、１つ以上のコンセンサスＰＦ免疫原のコード配列を含む１つ以上の核酸分子に含まれることが可能である。ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８Ｂおよび／またはＲＡＮＴＥＳのコード配列は、別々のプラスミドなどの別々の核酸分子に含まれることが可能である。

【0081】

６．ワクチン
哺乳類動物においてマラリアに対する免疫反応を引き起こすことが可能であるワクチンが本明細書において提供される。ワクチンは、先に考察したような各プラスミドを含むことができる。ワクチンは複数の前記プラスミドまたはそれらの組合せを含むことができる。治療的免疫反応または防御的免疫反応を誘導するために、ワクチンが提供され得る。

【0082】

コンセンサスＰＦ ＣＳ免疫原、コンセンサスＰＦ ＬＳＡ１免疫原、コンセンサスＰＦ ＴＲＡＰ免疫原、コンセンサスＰＦ ＣｅｌＴＯＳ免疫原、コンセンサスＰＦ Ａｍａ１免疫原またはコンセンサスＰＦ ＣＳ−ａｌｔ免疫原からなる群より選択される１つ以上のコンセンサスＰＦ免疫原を送達するために、ワクチンを使用することができる。複数の標的の送達の場合、ワクチンは複数の組成物または単一組成物を含むことができる。単一プラスミドに複数のタンパク質をコードするプラスミドを使用することができ、または、異なるタンパク質をコードする異なるプラスミドを含む組成物を使用することができる。

【0083】

ワクチンは薬剤的に許容可能な添加剤をさらに含むことができる。薬剤的に許容可能な添加剤は賦形剤、アジュバント、担体または希釈剤のような機能性分子であり得る。薬剤的に許容可能な添加剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロインド不完全アジュバント、モノホスホリルリピッドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンなどの小胞およびスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子を含み得る形質移入促進剤、または他の公知の形質移入促進剤であり得る。

【0084】

形質移入促進剤はポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。形質移入促進剤はポリ−Ｌ−グルタメートであり、そしてより好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタメートはワクチン中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。形質移入促進剤はまた界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロインド不完全アジュバント、モノホスホリルリピッドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンなどの小胞およびスクアレンを含み、そして、ヒアルロン酸もまた遺伝的コンストラクトと併せて投与され得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドワクチンはまた脂質、ＤＮＡ‐リポソーム混合物として（例えば、国際公開第Ｗ０９３２４６４０号を参照のこと）レクチンリポソームもしくは他の当技術分野において公知のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などの形質移入促進剤、または他の公知の形質移入促進剤を含むことができる。好ましくは、形質移入促進剤はポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。ワクチン中の形質移入剤の濃度は４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。

【0085】

薬剤的に許容可能な添加剤は１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは同じプラスミドから、もしくは別のプラスミドから発現される他の遺伝子であることが可能であり、または、ワクチン中に上記プラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される。１つ以上のアジュバントが、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、欠失を受け、そして、ＩｇＥのシグナルペプチドなどの異なるシグナルペプチドを所望により含むシグナル配列をコードするシグナル配列もしくはコード配列、またはＩｇＥのシグナルペプチドなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を有するＩＬ−１５を含むＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、変異体型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能性断片からなる群より選択されるタンパク質もしくはそれらの組合せ、および／または、それらからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸分子もしくはそれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態において、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣまたはＲＡＮＴＥＳからなる群より選択される１つ以上のタンパク質、および／またはそれらからなる群より選択される１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子であり得る。ＩＬ−１２コンストラクトと配列の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号と対応する米国特許出願第０８／９５６，８６５号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５コンストラクトと配列の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号と対応する米国特許出願第１０／５６０，６５０号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号と対応する米国特許出願第１２／１６０，７６６号，およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４８８２７号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２８コンストラクトと配列の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号と対応する米国特許出願第１２／９３６，１９２に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳと他のコンストラクトおよび配列の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号と対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳコンストラクトと配列の他の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳと他のコンストラクトおよび配列の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号と対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳコンストラクトと配列の他の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫおよびＭＥＣコンストラクトと配列の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号と対応する米国特許出願第１１／７１９，６４６号に開示され、それらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０と他の免疫調節因子の例は米国特許出願第１０／５６０，６５３号に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５と他の免疫調節因子の例は米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、それは参照により本明細書に組み込まれる。

【0086】

ワクチンは、参照により完全に組み込まれる、１９９４年４月１日に提出された米国特許０２１，５７９号に記載されるような遺伝的ワクチン促進剤をさらに含むことができる。

【0087】

ワクチンは約１ナノグラムから１００ミリグラムまで、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量でコンセンサス抗原とプラスミドを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による医薬組成物は約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記医薬組成物は約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、前記医薬組成物は約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、前記医薬組成物は約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、前記医薬組成物は約２５〜約２５０マイクログラム、約１００から約２００マイクログラムまで、約１ナノグラムから１００ミリグラムまで、約１マイクログラムから約１０ミリグラムまで、約０．１マイクログラムから約１０ミリグラムまで、約１ミリグラムから約２ミリグラムまで、約５ナノグラムから約１０００マイクログラムまで、約１０ナノグラムから約８００マイクログラムまで、約０．１から約５００マイクログラムまで、約１から約３５０マイクログラムまで、約２５から約２５０マイクログラムまで、約１００から約２００マイクログラムのコンセンサス抗原またはそのプラスミドを含有する。

【0088】

使用される投与モードに従ってワクチンを製剤することができる。注射可能なワクチン医薬組成物は無菌で発熱性物質フリー、そして、微粒子フリーであり得る。等張性製剤または溶液を使用することができる。等張性用添加物には塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースが含まれ得る。前記ワクチンは血管収縮剤を含み得る。前記等張性溶液はリン酸緩衝生理食塩水を含み得る。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定化剤をさらに含み得る。ワクチン製剤向けのＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなどの安定化物質により、製剤が室温または外界温度で長期間安定であることが可能になり得る。

【0089】

７．ワクチンの送達方法
それに対して免疫反応を誘導することができるマラリアの免疫原に対してそれらを特に有効とするエピトープを含む、コンセンサス抗原の遺伝的コンストラクトとタンパク質を供給するためのワクチンを送達する方法が本明細書において提供される。治療的免疫反応および防御的免疫反応を誘導するためのワクチンを送達する方法またはワクチン投与の方法が提供され得る。前記ワクチン投与工程が哺乳類動物においてマラリアに対する免疫反応を引き起こすことができる。哺乳類動物の免疫系の活性を調節し、そして、免疫反応を向上させるために、個体にワクチンを送達することができる。ワクチンの送達は、細胞内で発現し、そして、その上で免疫系が認識し、細胞性反応、液性反応、または細胞性反応と液性反応を誘導する細胞表面に送達される核酸分子としてのコンセンサス抗原の形質移入であり得る。哺乳類動物に先に考察したようなワクチンを投与することにより、マラリアに対する免疫反応を前記哺乳類動物で誘導または誘発するために、ワクチンの送達を用いることができる。

【0090】

哺乳類動物の細胞にワクチンとプラスミドが送達されると、形質移入された細胞は、ワクチンから注入されたプラスミドの各々のコンセンサス抗原を発現し、そして分泌する。これらのタンパク質は免疫系によって異物として認識され、そして、それらに対して抗体が作製される。免疫系によってこれらの抗体が維持され、そして、それらが以後のマラリア感染に対する有効な反応を可能とする。

【0091】

哺乳類動物において免疫反応を誘発するために、哺乳類動物にワクチンを投与することができる。前記哺乳類動物はヒト、霊長類、非ヒト霊長類、雌ウシ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、スイギュウ、バイソン、ウシ属、シカ、ハリネズミ、ゾウ、リャマ、アルパカ、マウス、ラットおよびニワトリであり得る。

【0092】

ａ．併用治療
他のタンパク質および／またはα−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘因性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、欠失を受け、そして、ＩｇＥのシグナルペプチドなどの異なるシグナルペプチドを所望により含むシグナル配列をコードするシグナル配列もしくはコード配列、またはＩｇＥのシグナルペプチドなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を有するＩＬ−１５を含むＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−２８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、変異体型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能性断片またはそれらの組合せをコードする遺伝子と組み合わせてワクチンを投与することができる。いくつかの実施形態において、次の核酸分子および／またはタンパク質の１つ以上と組み合わせてワクチンを投与する：ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣおよびＲＡＮＴＥＳまたはそれら機能性断片のうちの１つ以上をコードする、コード配列を含む核酸分子からなる群より選択される核酸分子、ならびに、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−２８タンパク質、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質またはＲＡＮＴＥＳタンパク質またはそれらの機能性断片からなる群より選択されるタンパク質。

【0093】

経口投与、非経口投与、舌下投与、経皮投与、直腸内投与、経粘膜投与、局所投与、吸入による投与、バッカル投与による投与、胸膜内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与髄腔内投与、および関節内投与またはそれらの組合せを含む様々な経路によりワクチンを投与することができる。獣医学での使用については、通常の獣医学の実践に従って適切に、許容可能な製剤として前記組成物を投与することができる。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与計画と投与経路を容易に決定することができる。伝統的な注射筒、無ニードル注射装置、「微粒子銃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」、または電気穿孔法（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によりワクチンを投与することができる。

【0094】

インビボ電気穿孔法、リポソーム介在性方法、ナノ粒子促進方法、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組換えワクシニアウイルスなどの組換えベクターを用いる、および用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン投与とも称される）を含むいくつかの周知の技術により哺乳類動物にワクチンのプラスミドを送達することができる。ＤＮＡ注入により、そして、インビボ電気穿孔法と共にコンセンサス抗原を送達することができる。

【0095】

ｂ．電気穿孔法
細胞膜に可逆性の孔を生じさせるために有効なエネルギーパルスを哺乳類動物の所望の組織に伝達するように構成されることが可能である電気穿孔装置を用いて、ワクチンのプラスミドの電気穿孔法によるワクチン投与を達成することができ、そして、好ましくは、エネルギーパルスは、使用者によって事前設定された電流入力と同様の定電流である。電気穿孔装置は電気穿孔コンポーネントおよび電極アッセンブリーまたはハンドルアッセンブリーを含み得る。電気穿孔コンポーネントは、制御装置、電流波形ジェネレーター、インピーダンステスター、波形ロガー、入力要素、状況報告要素、通信ポート、メモリーコンポーネント、電源および電源スイッチを含む、電気穿孔装置の様々な要素の１つ以上を含み、および、組み込むことができる。プラスミドによる細胞の形質移入を促進するために、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ＥＰシステム（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ブルーベル、ペンシルバニア州）またはＥｌｇｅｎ電気穿孔装置（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して電気穿孔法を達成することができる。

【0096】

電気穿孔コンポーネントは電気穿孔装置の１つの要素として機能することができ、そして他の要素は、電気穿孔コンポーネントと通信する別々の要素（またはコンポーネント）である。電気穿孔コンポーネントは電気穿孔装置の１つよりも多い要素として機能することができ、それは、電気穿孔コンポーネントとは別の電気穿孔装置のさらに他の要素と通信し得る。１台の電気機械式装置または機械式装置の部分として存在する電気穿孔装置の要素は、前記の要素が１台の装置として、または互いに通信する別々の要素として機能し得るので、限定されないことが可能である。電気穿孔コンポーネントは、所望の組織に定電流を生じさせるエネルギーパルスを伝達することが可能であり、そして、フィードバック機構を含む。電極アッセンブリーはある空間配置で複数の電極を有する電極アレイを含むことが可能であり、電極アッセンブリーは電気穿孔コンポーネントからのエネルギーパルスを受信し、そして、電極を介してそれを所望の組織に伝達する。複数の電極のうちの少なくとも１つはエネルギーパルスの伝達中に中性であり、そして、所望の組織でのインピーダンスを測定し、そして、電気穿孔コンポーネントにそのインピーダンスを通信する。フィードバック機構は、その測定されたインピーダンスを受信することができ、そして、定電流を維持するために電気穿孔コンポーネントにより伝達されるエネルギーパルスを調節することができる。

【0097】

複数の電極が分散化パターンのエネルギーパルスを伝達することができる。その複数の電極が、プログラムされたシーケンスの下での電極の制御により分散化パターンのエネルギーパルスを伝達することができ、そして、そのプログラムされたシーケンスは使用者により電気穿孔コンポーネントに入力される。そのプログラムされたシーケンスは、順序通り伝達される複数のパルスを含むことができ、複数のパルスの各パルスはインピーダンスを測定する１つの中性電極と共に少なくとも２つの活性電極によって伝達され、そして、複数のパルスの以後のパルスはインピーダンスを測定する１つの中性電極と共に少なくとも２つの活性電極のうちの異なる電極により送達される。

【0098】

フィードバック機構はハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行され得る。フィードバック機構はアナログ閉ループ回路によって実行され得る。フィードバックは５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓ毎に生じるが、好ましくは、リアルタイムフィードバックまたは瞬間的（すなわち、反応時間の決定に利用可能である技術により決定されるような実質的に瞬間的）である。中性電極が所望の組織でのインピーダンスを測定することができ、そして、そのインピーダンスをフィードバック機構に通信し、そして、フィードバック機構がそのインピーダンスに応答し、事前設定された電流に類似の値の定電流を維持するためにエネルギーパルスを調節する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの伝達中に、連続的および瞬間的に定電流を維持することができる。

【0099】

本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進することができる電気穿孔装置と電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されるものが含まれる。それらの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの送達を促進するために使用され得る他の電気穿孔装置と電気穿孔法には、２００６年１０月１７日に提出された米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に提出された米国特許仮出願第６０／９７８，９８２号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下での利益を主張する、２００７年１０月１７日に提出された同時係属中および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されるものが含まれる。それらすべての全体が本明細書に組み込まれる。

【0100】

Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物での選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール式電極システムとそれらの使用法について記載する。前記モジュール式電極システムは複数のニードル電極、皮下注射ニードル、プログラム可能な定電流パルス制御装置から複数のニードル電極への導電性リンクを提供する電気コネクター、および電源を含み得る。操作者は、支持構造に設置された複数のニードル電極をつかみ、そして、身体または植物での選択された組織にそれらをしっかりと挿入することができる。次に、皮下注射ニードルを介して選択された組織に生体分子が送達される。プログラム可能な定電流パルス制御装置が活性化され、そして、複数のニードル電極に定電流電気パルスが印加される。印加された定電流電気パルスが複数の電極間の細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0101】

Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物での選択された組織の細胞への生体分子の導入を効率的に促進するために使用され得る電気穿孔装置について記載する。前記電気穿孔装置は、ソフトウェアまたはファームウェアによってその操作が指定される電気動力学的（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ）装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。前記ＥＫＤ装置は、使用者による制御とパルスパラメータの入力に基づいてアレイ状の電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生じさせ、そして、電流波形データの保存および取得を可能にする。前記電気穿孔装置はまた、ニードル電極のアレイ、注射ニードルの中心注入チャンネル、および取り外し可能なガイドディスクを有する交換可能な電極ディスクを含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0102】

筋肉などの組織だけではなく他の組織または器官にも深く浸透させるために、米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイと方法を応用させることができる。電極アレイの構成のため、（一般的に好まれる生体分子の送達のための）注射ニードルがまた標的器官に完全に挿入され、そして、電極によって予め区画された領域内で標的流出物に対して直角に注射を投与する。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは、２０ｍｍの長さで２１ゲージである。

【0103】

さらに、電気穿孔装置とその使用法を組み込むいくつかの実施形態において考慮されるが、次の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号，２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された第６，９５８，０６０号、および２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号に記載されているものである電気穿孔装置が存在する。また、様々な装置のいずれかを用いるＤＮＡの送達に関する、２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、および、ＤＮＡの注入方法に関する、２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号において提供される内容をカバーする特許が本明細書において考慮される。上記の特許の全体が参照により組み込まれる。

【0104】

ｃ．タンパク質の追加免疫
いくつかの実施形態において、ワクチンプロトコルの一部としてのタンパク質としてコンセンサスＰＦ免疫原が送達され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるとおりのプラスミドＤＮＡ組成物が投与される最初の免疫ワクチン投与の後に、追加免疫としてタンパク質免疫原が送達される。いくつかの実施形態において、追加免疫はプラスミドＤＮＡワクチンとタンパク質の組合せである。いくつかの実施形態において、複数の追加免疫が投与される。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加免疫がタンパク質投与であり、そして、１つ以上の追加免疫がＤＮＡワクチン投与である、複数の追加免疫が投与される。ウイルスベクターおよび／または殺処理した、もしくは弱毒化した病原体を使用する追加免疫もまた使用することができる。初回または直近の投与以外の全ての回に関して独立して、１日、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１２週間、６か月、１年の間隔で１回以上のワクチン投与を行うことができる。

【0105】

タンパク質追加免疫において使用されるタンパク質は、本明細書において開示される情報および周知の方法論を用いるルーチン的方法により作製され得る。例えば、大量のタンパク質を生成するために、前記タンパク質のコード配列を含む組換えベクターが作製され、使用され得る。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターがルーチンに作製され得る。本明細書において使用されるように、用語「組換え発現ベクター」はプラスミド、ファージ、ウイルス粒子、または、適切な宿主に導入されるとき、コード配列の発現を制御するのに必要な遺伝的エレメントを含有する他のベクターを意味するとされる。当業者は、標準的技術と直ぐに利用可能である出発物質を用いて、本発明のタンパク質をコードする核酸分子を単離または合成し、それを発現ベクターに挿入することができる。コード配列は必要な調節性配列に機能するように結合される。発現ベクターは周知であり、そして、直ぐに利用可能である。発現ベクターの例には、プラスミド、ファージ、ウイルスベクターおよび他の核酸分子または宿主細胞の形質転換とコード配列の発現の促進に有用な核酸分子含有賦形剤が含まれる。本発明の組換え発現ベクターは宿主の形質転換に有用である。

【0106】

前記タンパク質を生産するために、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を使用することができる。タンパク質の生産用の周知の組換え発現システムで使用される宿主細胞は周知であり、そして、直ぐに利用可能である。宿主細胞の例には大腸菌などの細菌細胞、出芽酵母などの酵母細胞、ヨトウガ（Ｓ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などの昆虫細胞、非ヒト哺乳類動物組織培養細胞チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＨｅＬａ細胞などのヒト組織培養細胞が含まれる。

【0107】

いくつかの実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、ＤＮＡ分子を周知の発現システムに使用される市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、大腸菌でのタンパク質生産のために、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用することができる。例えば、酵母の出芽酵母株での生産のために、市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用することができる。例えば、昆虫細胞での生産のために、市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用することができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳類動物細胞での生産のために、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用することができる。ルーチンの技術および直ぐに利用可能である出発物質を用いて本発明のタンパク質を生産するために、当業者はこれらの商用発現ベクターおよびシステムまたは他のものを使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）を参照のこと）。したがって、原核生物システムと真核生物性システムの両方で所望のタンパク質が調製されることが可能であり、ある範囲の処理形態のタンパク質となる。

【0108】

当業者は他の市販の発現ベクターとシステムを使用することができ、または、周知の方法および直ぐに利用可能である出発物質を用いてベクターを作製することができる。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、および好ましくはエンハンサーなどの必須の制御配列を含有する発現システムは、様々な宿主に対して、直ぐに利用可能であり、そして、当技術分野において公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）を参照のこと。

【0109】

タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを使用して、次に外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養され、維持される適合性の宿主を形質転換する。こうして生産された本発明のタンパク質は、当業者にとって適切であり、公知であるように、細胞を溶解するか培養液からのどちらかにより、培養物から回収される。当業者は、そのような発現システムを使用して生産される本発明のタンパク質を、周知の技術を用いて、単離することができる。天然の供給物から本発明のタンパク質を、そのようなタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して精製する方法は、そのような抗体を生成する方法がそうであるようにルーチン的である（参照により本明細書に組み込まれるＨａｒｌｏｗ， Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｅ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ を参照のこと）。組換えＤＮＡ方法論または天然の供給物により生産されたタンパク質を精製することにそのような抗体を使用することができる。

【0110】

遺伝的コンストラクトの例には、本発明のタンパク質をコードし、そして、そのコンストラクトが形質移入される細胞で機能するプロモーターに機能するように結合したコード配列が含まれる。恒常的プロモーターの例にはサイトメガロウイルスまたはＳＶ４０に由来するプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例にはマウス乳腺白血病ウイルスプロモーターまたはメタロチオネインプロモーターが含まれる。当業者は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと細胞を用いる形質移入に有用な遺伝的コンストラクトを、直ぐに利用可能である出発物質から容易に作成することができる。そのような遺伝子コンストラクトは本発明のタンパク質の生産に有用である。

【0111】

組換え技術による本発明のタンパク質の生産に加えて、本発明のタンパク質を作製するために自動化ペプチド合成機もまた使用され得る。そのような技術は当業者に周知であり、そして、ＤＮＡにコードされるタンパク質の生産において予想されていない置換を有する誘導体の場合、有用である。例えば、本発明のタンパク質は以下の公知の技術のいずれかにより調製され得る。好都合にも、参照により本明細書に組み込まれるＪ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １５：２１４９−２１５４ （１９６３）においてＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより最初に記述された固相合成技術を用いて本発明のタンパク質を調製することができる。他のタンパク質合成技術は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．， （１９７６） Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ２ｄ Ｅｄ．、参照により本明細書に組み込まれる Ｋｅｎｔ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｐ． ２９５−３５８， ｅｄｓ． Ａｌｉｔａｌｏ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， （Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， １９８５）、ならびに当業者に公知の他の参考図書に見出され得る。合成技術の概要は、参照により本明細書に組み込まれる Ｊ． Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｊ． Ｄ． Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｌｉａ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ． （１９８４） に見出され得る。参照により本明細書に組み込まれるＴｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ． ＩＩ， ３ｄ Ｅｄ．， ｐ． １０５−２３７， Ｎｅｕｒａｔｈ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９７６）に記載されるように、溶液法による合成もまた使用され得る。そのような合成において使用される適切な保護基は上記の原本、ならびに、参照により本明細書に組み込まれるＪ． Ｆ． Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９７３）に見出され得る。概して、これらの合成方法は、伸張しつつあるペプチド鎖に１つ以上のアミノ酸残基または適切な保護化アミノ酸残基を連続的に付加することを含む。通常、第１アミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のどちらかが適切な、選択により除去可能である保護基によって保護される。リシンなどの反応性側鎖を含有するアミノ酸については、異なる選択により除去可能である保護基が活用される。

【0112】

直ぐに利用可能である材料を用いて、周知の方法により哺乳類動物への投与用にタンパク質を製剤することができる。当業者は、本発明に使用され得る多数の薬剤的に許容可能な媒体を容易に理解するであろう。適切な医薬担体は、参照により本明細書に組み込まれる、この分野での標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ａ． Ｏｓｏｌに記載される。局所投与用の製剤には経皮パッチ、軟膏、外用水薬、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤および粉剤が含まれ得る。儒来の医薬担体、水性ベース、粉体ベースまたは油性ベース、増粘剤などが必要である、または好ましい可能性がある。経口投与用の組成物には粉剤または顆粒剤、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル剤、サシェまたは錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が好ましい可能性がある。非経口投与、静脈内投与、髄腔内投与または脳室内投与用の組成物には、緩衝液、希釈剤および他の適切な添加物を含有することもまた可能であり、そして、好ましくは、無菌で発熱性物質フリーである無菌水性溶液が含まれ得る。本発明に従う静脈内投与に適切な医薬組成物は無菌で発熱性物質フリーである。非経口投与用には、本発明のペプチドは、例えば、薬剤的に許容可能な非経口賦形剤と共に、溶液、懸濁液、乳液または凍結乾燥粉体として製剤され得る。そのような賦形剤の例は水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび不揮発性油などの非水性賦形剤もまた使用され得る。賦形剤または凍結乾燥粉体は、等張性を維持する添加物（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性を維持する添加物（例えば、緩衝液および保存剤）を含有し得る。一般的に使用される技術により製剤を無菌化する。例えば、注射による投与に適切な非経口組成物は、０．９％塩化ナトリウム溶液に１．５重量％の有効成分を溶解することにより調製される。

【0113】

本発明に従うタンパク質を含む医薬組成物が単回用量または複数回用量として投与され得る。特定の薬剤の薬物動態特性およびその投与モードと投与経路、受容者の年齢、健康状態および体重、症状の性質と程度、同時に行われている治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果などの公知の因子に応じて投与量が変わる。治療的組成物の製剤とそれらの以後の投与は当業者の技術の範囲内であると考えられている。通常、ペプチドの投与量は約１マイクログラム〜１０００ミリグラム以上、１０マイクログラム〜１０００ミリグラム、好ましくは５０マイクログラム〜５００ミリグラム、より好ましくは１００マイクログラム〜４００ミリグラムでありうる。いくつかの実施形態において、投与量は１０〜２５０マイクログラムの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、投与量はより多い、例えば、２５０マイクログラム〜１ミリグラムであり、または１〜５０ミリグラムのようにより多い。いくつかの実施形態において、投与量はさらに多く、例えば、５０〜５００ミリグラムである。

【0114】

ｄ．ＤＮＡプラスミドの調製方法
本明細書において考察されるＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドを調製する方法が本明細書において提供される。哺乳類発現プラスミドへの最後のサブクローニング工程の後に、当技術分野において公知の方法を用いて大規模発酵タンク中の細胞培養物に接種するために前記ＤＮＡプラスミドを用いることができる。

【0115】

ＥＰ装置と共に使用するための本発明のＤＮＡプラスミドは公知の装置と技術の組合せを用いて製剤または製造され得るが、好ましくは、２００７年５月２３日に提出された、公認の、同時係属中の米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載される最適化されたプラスミド製造技術を用いてそれらが製造される。いくつかの例では、これらの試験で使用されるＤＮＡプラスミドは１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤され得る。製造技術はまた、２００７年７月３日に発行された認可された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含み、米国特許仮出願第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般的に知られる様々な装置およびプロトコルを含み、または、組み込む。それぞれ、先に参照した特許出願および特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号の全体が本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0116】

本発明をさらに以下の実施例にて例示する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、これらが単なる例として示されるものであることを理解すべきである。上記説明およびこれらの実施例から、当業者は本発明の基本的な特徴を確実にすることができ、また本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な利用と条件に適応させるための本発明の様々な変更と修飾を行うことができる。したがって、本明細書に記載および説明されたものに加えた本発明の様々な修正が、前述の説明から、当業者に当然明らかであろう。当該修飾もまた、添付の特許請求の範囲の中に含まれるように意図される。

【0117】

実施例１：発現構築物の調製
ワクチン候補を、４種類の重要なＰ．ｆ．抗原：すなわちスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳ）、肝臓ステージ抗原１（ＬＳＡ１）、トロンボスポンジン関連無名タンパク質（ＴＲＡＰ）、ならびにオーキネートおよびスポロゾイトの細胞通過タンパク質（ＣｅｌＴＯＳ、またはＡｇ２）の同定に基づき開発した。各抗原を、コンセンサス配列に基づき設計し、コドンおよびＲＮＡの最適化を含む、発現の改良を行うためにいくつかの修飾を行った。

【0118】

コンセンサスＣＳ
コンセンサスＣＳ配列を図１Ａに開示されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（全部で６６配列）中の全長ＣＳ配列から設計した。図１ＢはコンセンサスＣＳ配列とＧｅｎＢａｎｋ配列との比較を示す。コンセンサスＣＳ配列は、場合により、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えばＩｇＥシグナルペプチドなどのリーダー配列を含んでもよい。コンセンサスＣＳは、配列番号２に記載される。配列番号２のコンセンサスＣＳのコード配列は、配列番号１に記載される。ＩｇＥリーダー配列を含むコンセンサスＣＳは、配列番号１４および２６に記載される。配列番号１４および２６に記載のＩｇＥリーダー配列を含むコンセンサスＣＳのコード配列は配列番号１３および２５に記載される。ｐＧＸ７００２を産生するためにｐＶＡＸでクローン化される配列番号２５に記載のコード配列は、配列番号３７に記載の配列をもつ。

【0119】

コンセンサスＡｇ２（またはコンセンサスＣｅｌＴＯＳ）
コンセンサスＣｅｌＴＯＳ配列（またコンセンサスＡｇ２配列とも称す）を図４Ａに開示されるＧｅｎＢａｎｋデータベース中の全長ＣｅｌＴＯＳ配列から設計した。図４Ｂは、コンセンサスＣｅｌＴＯＳ配列とＧｅｎＢａｎｋ配列との比較を示す。コンセンサスＣｅｌＴＯＳは、配列番号８に記載される。配列番号８の高いレベルの発現のために設計されたコンセンサスＣｅｌＴＯＳのコード配列は、配列番号７に記載される。コンセンサスＣｅｌＴＯＳ配列は、場合により、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えばＩｇＥシグナルペプチドなどのリーダー配列を含んでもよい。ＩｇＥリーダー配列をもつコンセンサスＣｅｌＴＯＳは、配列番号２０および３２に記載される。配列番号２０および３２の高いレベルの発現のために設計されたＩｇＥリーダー配列を含むコンセンサスＣｅｌＴＯＳをコードする配列は、配列番号１９および３１に記載される。ｐＧＸ７００１を産生するためにｐＶＡＸでクローン化される配列番号３１に記載のコード配列は、配列番号３９に記載の配列をもつ。

【0120】

コンセンサスＬＳＡ１
コンセンサスＬＡＳ配列を全長ＬＡＳ１配列から設計した。図２Ａは、配列番号４とこれらの配列との相同性の程度を示す。図２Ｂは、コンセンサスＣＳ配列とＧｅｎＢａｎｋ配列との比較を示す。全長ＬＳＡ１配列は複数の反復領域をタンパク質の中心に含むが、コンセンサスＬＳＡ１（ＰｆＣｏｎＬＳＡ１）はこれらの反復領域のうち８つしか含まない。コンセンサスＬＡＳ１は、配列番号４に記載される。配列番号４でのコンセンサスＬＡＳ１のコード配列は、配列番号３に記載される。コンセンサスＬＡＳ１配列は、場合により、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えばＩｇＥシグナルペプチドなどのリーダー配列を含んでもよい。ＩｇＥリーダー配列を含むコンセンサスＬＡＳ１は、配列番号１６および２８に記載される。配列番号１６および２８でのＩｇＥリーダー配列を含むコンセンサスＬＡＳ１のコード配列は、配列番号１５および２７に記載される。ｐＧＸ７００４を産生するためにｐＶＡＸでクローン化される配列番号２７に記載のコード配列は、配列番号３９に記載の配列をもつ。

【0121】

コンセンサスＴＲＡＰ（コンセンサスＳＳＰ２）
コンセンサスＴＲＡＰ配列（またコンセンサスＳＳＰ２配列とも称する）を図３Ａに開示されるＧｅｎＢａｎｋデータベース（全部で２８配列）中の全長ＴＲＡＰ配列から設計した。図３Ｂは、コンセンサスＴＲＡＰ配列とＧｅｎＢａｎｋ配列との比較を示す。コンセンサスＴＲＡＰは、配列番号６に記載される。配列番号６に記載の高いレベルの発現のために設計されたコンセンサスＴＲＡＰのコード配列は、配列番号５に記載される。コンセンサスＴＲＡＰ配列は、場合により、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えばＩｇＥシグナルペプチドなどのリーダー配列を含んでもよい。ＩｇＥリーダー配列を含むコンセンサスＴＲＡＰは、配列番号１８および３０に記載される。配列番号１８および３０の高いレベルの発現のために設計されたＩｇＥリーダー配列を含むコンセンサスＴＲＡＰをコードする配列は、配列番号１７および２９に記載される。ｐＧＸ７００５を産生するためにｐＶＡＸでクローン化される配列番号２９に記載のコード配列は、配列番号４０に記載の配列をもつ。

【0122】

オルタナティブコンセンサスＣＳ（ＣＳ−ａｌｔ）
配列番号１２の配列をもつオルタナティブコンセンサスＣＳを生成した。配列番号１２のコード配列は、配列番号１１である。コンセンサスＣＳ−ａｌｔ配列は、場合により、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えばＩｇＥシグナルペプチドなどのリーダー配列を含んでもよい。ＩｇＥリーダー配列を含むコンセンサスＣＳ−ａｌｔは、配列番号２２および３４に記載される。配列番号２２および３４の高いレベルの発現のために設計されたＩｇＥリーダー配列を含むコンセンサスＣＳ−ａｌｔをコードする配列は、配列番号２１および３３に記載される。配列番号３３でのコンセンサス配列をｐＶＡＸに基づいた発現ベクターに挿入し、図１１に発現構築物ｐＧＸ７００３として示した（配列番号４１）。

【0123】

実施例２：コンセンサス抗原の発現
次いで、クローン化発現構築物を、インビトロでの翻訳アッセイにて発現させ、タンパク質の発現をウエスタンブロット法により確認した。プラスミドを、リポフェクタミンを用いてＲＤ細胞に遺伝子導入した。２０時間後、細胞を採取し、全ての細胞溶解物を得た。タンパク質を定量し、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。抗ＨＡ抗体（ＨＡタグを抗原配列のＣ末端に含む）を用いて合成タンパク質を検出した。ｐＶＡＸ１を陰性対照として使用した。結果を図５に示す。

【0124】

実施例３−ワクチン投与したマウスでの免疫応答
細胞性免疫原性の検査のために、各抗原コードプラスミドの１０μｇまたは２０μｇをＢａｌｂ／ｃマウスの前脛骨筋に筋肉注射により送達し、その後ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応型定電流エレクトロポレーション装置（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ブルーベル、ペンシルバニア州）を用いてエレクトロポレーションを実施した。マウス（各群：ｎ＝５）は、０、３、および６週目で３回の免疫化を受けた。細胞性および応答を、最終の免疫化から１週間後（５週目）に評価した。ＥＬＩＳｐｏｔを、９６穴プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて、製造業者の取扱指示（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）により実施した。各免疫化マウスからの２ｘ１０^５の脾細胞をプレートの各穴に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩、Ｒ１０（陰性対照）、コンカナバリンＡ（陽性対照）、または各抗原に特異的なペプチドプールの存在下で刺激した。ペプチドプールは、全タンパク質に及ぶ１５−ｍｅｒのペプチドであり、１１アミノ酸ずつオーバーラップするペプチドから構成されている。

【0125】

コンセンサス抗原の細胞性免疫原性をＩＮＦ−γのＥＬＩＳｐｏｔ細胞性免疫原性分析により確認した。個々のコンセンサス抗原の細胞性免疫原性を図６Ａに示し、また多重抗原ワクチンカクテルを図６Ｂに示す。全てのワクチンが、ＥＬＩＳｐｏｔで確認されたように、強いＩＦＮ−γ応答を誘導した。ＣＳ−およびＬＳＡ１−特異的応答の大部分は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の優性エピトープに起因し得る。免疫原性を、Ａｄ３５またはＡｄ３５／タンパク質ブーストを含む報告されているプラットフォームと比較した。結果を図６Ｂに示す。ＰｆＣｏｎＬＳＡ１（右グラフ）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の優性Ｔ細胞エピトープに対し、Ａｄ３５またはＡｄ３５／タンパク質の異種プライムブースト方式より強い細胞性応答を誘導した（左の３グラフ）。免疫原性を、Ａｄ５、Ａｄ３５、およびＲＴＳ，Ｓを含む報告されているプラットフォームと比較した。結果を図６Ｃに示す。ＰｆｃｏｎＣＳ（右グラフ）は、抗原特異的ＩＦＮガンマをＡｄ５より少し低く誘導した（左のグラフ対）が、Ａｄ３５およびＲＴＳ，Ｓより強く誘導した。フローサイトメトリゲーティング法を用いた。その結果を図６Ｄに示した。多重抗原ワクチンを比較してＣＤ４＋Ｔ細胞応答の詳細を解明した。多重抗原ワクチンに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答により、ＣＳ特異的応答が主要なＣＤ４＋Ｔ細胞応答であることが示された（図６Ｅ）。多重抗原ワクチンを比較してＣＤ８＋Ｔ細胞応答の詳細を解明した。多重抗原ワクチンに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答により、ＣＳ−およびＬＳＡ−特異的応答がＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大部分を含むことが示された（図６Ｆ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、単抗原ワクチンと多重抗原ワクチンとで比較した。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答により、多重抗原を送達した場合に大きな変化がないことが示された（図６Ｇ参照）。液性応答を調べた。単抗原ワクチンおよび多重抗原ワクチンの両方が、図６Ｈに示すように強い抗体応答を誘導した（平均終末価＞１００，０００）。図６Ｉは、ＬＳＡ１抗体が反復領域外のエピトープに関連していることを示すグラフを表示する。ある実験では、抗体を表示して、インビボで同種抗原を認識した。各抗原を、流体力学的尾静脈注射（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により注射し、肝臓内にて過剰発現させた。次いで、肝臓切片を免疫化マウス由来の血清で塗抹し（１：５００）、また全ての切片に、発現細胞の抗体認識を示す各免疫化マウス（ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰまたはＣｅｌＴＯＳ）由来の血清を塗抹した（図示なし）。

【0126】

実施例４：インビボエレクトロポレーションにより送達した多重抗原ｐＤＮＡワクチン候補を用いたマウスの検査
初期検査
多重抗原ワクチンアプローチによるマラリア用の改良ＤＮＡワクチンが、検査の対象である。筋肉注射およびエレクトロポレーション（ＥＰ）により送達され、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆ．）感染の肝臓ステージを標的とする多重抗原ＤＮＡワクチン候補を、マウスの初期検査で評価した。このワクチン候補は、４種類の重要な肝臓ステージＰ．ｆ．抗原：すなわちスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳ）、肝臓ステージの抗原１（ＬＳＡ１）、トロンボスポンジン関連無名タンパク質（ＴＲＡＰ）、ならびにオーキネートおよびスポロゾイトの細胞通過タンパク質（ＣｅｌＴＯＳ）を組み込んでいた。ワクチン抗原を、コンセンサス配列に基づき、コドンおよびＲＮＡの最適化ならびに非常に効率的なＩｇＥリーダー配列の付与などの発現を改良するためのいくつかの修飾により設計した。

【0127】

Ｂａｌｂ／ｃマウスでの免疫原性検査の前に、抗原発現をインビトロでの翻訳、ウエスタンブロット法、および免疫組織化学により確かめた。マウスでは、ワクチンは、他のベクター系により導かれるものと類似した、またはこれらを超えた、強い抗原−特異的細胞性および液性応答を誘発した。具体的には、１０^６脾細胞あたりのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）スポット形成細胞数（ｓｐｏｔ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）（ＳＦＵ）を、ＥＬＩＳｐｏｔ：ＣＳ（１６０７±３９１）、ＬＳＡ１（１９０８±８２１）、ＴＲＡＰ（９２９±２５５）、およびＣｅｌＴＯＳ（４７７±１６０）により定量化した。さらに、ＣＳワクチンおよびＬＳＡ１ワクチンを単独で送達またはＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳを組み合わせて送達し、ＣＳワクチンおよびＬＳＡ１ワクチンはＥＬＩＳＡによる確認で、強力なＣＳ特異的およびＬＳＡ−特異的血清陽転化（ＩｇＧ終末価＞１５０，０００）を誘導した。

【0128】

さらなるマウス検査
最近の証拠から、肝臓ステージ多重抗原への液性応答および細胞性応答の両方を強く誘発するマラリアワクチン候補がＰ．ｆから保護し得ることが裏付けられている。したがって、本ワクチンアプローチの最終目的は、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳへの細胞性および液性応答を同時に誘導することである。いくつかの検査をマウスモデルにて実施し、さらにワクチンの設計および送達を最適化し、さらにワクチン誘導免疫応答を特徴化した。

【0129】

他の検査では、付加的なＤＮＡに基づくマラリア抗原と組み合わせたＰｆ ＣＳのＤＮＡワクチンの送達がＣＳ特異的Ｔ細胞応答を減少させ得ることが示唆されている（Ｓｅｄｅｇａｈ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００４， １１（５）：４４８−５６）６）。この理由について、本多重抗原ワクチン候補（ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳのＤＮＡワクチンが単回投与で送達さている）により誘導された抗原特異的応答をまず個々のワクチンにより誘導された応答と比較した。これらの検査について、Ｂａｌｂ／ｃマウスは３週間の間隔で３回の免疫化（０日目、３週目、６週目）を受け、免疫応答を最終ワクチン投与から１週間後（７週目）に評定した。ワクチンを筋肉内に投与し、次いでＣＥＬＬＥＴＲＡ（商標）適応型定電流装置（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ブルーベル、ペンシルバニア州）を用いてＥＰにより投与した。投与した各ワクチンの投与量は単抗原ワクチンおよび多重抗原ワクチンアプローチで同量であった。１週目、３週目、および最終検査時に採血し、ＥＬＩＳＡを用いて液性分析を行った。細胞性応答を、最終免疫化から１週間後にＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔおよびフローサイトメトリにより確認した。

【0130】

マウスモデルでのワクチン抗原の組合せ送達の最適化
将来のヒトでの臨床試験を裏付けるために、候補抗原の免疫原性を更に特徴化し多重抗原製剤を開発するために検査に取り組んだ。具体的には、２つの疑問を評価した：１）ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳ抗原は一緒に製剤化し得るか、および２）多重−プラスミドＤＮＡ抗原の共発現が製剤の免疫効力の結果に影響を与えるか。

【0131】

多成分マラリアワクチンの開発のための以下の２つのアプローチを考察した：（１）４抗原を個々に発現するＤＮＡプラスミドの物理的な組合せとその後の多重抗原製剤の共送達；および（２）抗原を定義どおりに翻訳共役（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ）し共送達するような、２以上の抗原の１プラスミドでのクローン化。２アプローチのうち、選択肢（１）は抗原組合せに関し最大の柔軟性を提供すると思われた。本アプローチにより、免疫干渉を最も容易に起こす個々の組合せについての取り調べが可能となり、したがって細胞性および液性免疫応答の発現と誘導について相互に両立し得る、さらなる開発のための抗原組合せの選択に役立つ。本アプローチによりまた、検証した臨床的仮説（ＤＮＡのＥＰ単独対プライムブースト例えばＤＮＡ−タンパク質）ならびに評価した所望の免疫応答（細胞性対液性）に応じて抗原を「混合またはマッチング」させ得る実験が可能となった。この方法を追究することにより得られたデータを本明細書に包含する。

【0132】

選択肢（２）もまた、実行可能であると思われ、また必要なプラスミド数を減少させる（多重抗原を単独のベクターに組み合わせるので）利点を有すると思われた。しかし、複数の非依存的要因がそのようなポリシストロン性の構築物の発現と免疫原性に影響を与えることから、先天的な最適化は時間を浪費しかねない。これらは多重プロモーター、関連タンパク質分解性切断部位、ＲＮＡレベルでの翻訳終止−再開配列、ならびにおそらく最も重要なものにはプロモーターに対応する抗原の順序および構築物全体のサイズの最適化を含む。大型の抗原（＞１ｋｂのＤＮＡの挿入）については、ワクチンの有効性を最大にするために、抗原の各々の最適な発現を達成する上記パラメータの全てを最適化する必要がある可能性があった。結果として、後者のアプローチは選択的に実行可能であるが、ヒトでの免疫原性および有効性データの確立への最も効率的な道を提供するために、これらの実験では追究しなかった。臨床開発の後期に、大規模なヒト臨床試験に取り組む前に、抗原の成分および特異的アレンジメントの最終的な選択をより適切に行う。

【0133】

臨床試験設計の情報を提供してその更なる臨床への転換を支援するために可能性のある干渉について、抗原組合せを評定した。

【0134】

可能性のある抗原競合の評定−液性免疫原性
単抗原ワクチンおよび多重抗原ワクチンは、高いレベルのＣＳ−およびＬＳＡ１−特異的血清陽転化を誘導した。組換えタンパク質の産生を完成させることにより、ＴＲＡＰワクチンおよびＣｅｌＴＯＳワクチンにより誘導される液性応答を評定することが可能となった。ＣＳおよびＬＳＡ１と同様に、単抗原ワクチンおよび多重抗原ワクチンの両方が、高いレベルのＴＲＡＰ−およびＣｅｌＴＯＳ−特異的血清陽転化を誘導した。全ての抗原について、２回目のワクチン投与により抗体価の大きなブーストが、また３回目のワクチン投与により少ない程度であるが抗体価のブーストが存在した（図１２）。著しいものは、ワクチン投与した動物の１００％がたった２回の免疫化後に血清陽転化し、全ての抗原の両ワクチンアプローチについての終末価は、３回目のワクチン投与後で≧１００，０００であった。

【0135】

可能性のある抗原競合の評定−細胞性免疫原性
単抗原ワクチンおよび多重抗原ワクチンによるＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦαの抗原−特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の分泌誘導をＩＣＳによりまず評価した。本データを以下に簡潔に概略する。

【0136】

概して、多重抗原ワクチンは、強いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導した。具体的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞の０．０１％が抗原−特異的ＩＦＮγを産生し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の２．４５％が抗原−特異的ＩＬ−２を産生し、またＣＤ４＋Ｔ細胞の１．３９％が抗原−特異的ＴＮＦαを産生した（図１３）。多重抗原ワクチンにより誘導されたＩＦＮγの抗原−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞分泌レベルを単抗原ワクチンと比較した。ＣＳワクチンおよびＬＳＡ１ワクチンについて、多重抗原ワクチンはＩＬ−２の抗原−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞産生をより強く誘導し、またＣＳ特異的ＩＬ−２分泌の増加は統計的有意性（ｐ＝０．０６）に達していた。多重抗原ワクチンについて認められた抗原特異的応答での唯一の統計学的有意の減少は、ＣｅｌＴＯＳ（ｐ＝０．０１）およびＴＲＡＰ（ｐ＝０．０１）への応答での、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＮＦα産生のレベルの減少であった。ＣｅｌＴＯＳ−およびＴＲＡＰ−特異的ＴＮＦαの産生のこれらの現象にかかわらず、ＣＳ−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＮＦα分泌が増加する傾向にあり、またＬＳＡ−特異的ＣＤ４＋ＴＮＦαの応答では変化がなかった。

【0137】

多重抗原ワクチンはまた、強い抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。具体的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、０．９％が抗原−特異的ＩＦＮγを産生し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の３．１％が抗原−特異的ＩＬ−２を産生し、またＣＤ８＋Ｔ細胞の１．５１％が抗原−特異的ＴＮＦαを産生した（図１４）。ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ応答と同様に、多重抗原ワクチンおよび単抗原ワクチンアプローチ間でのＩＦＮγの抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞分泌の程度の違いは最小であった。興味深いことに、ＣＳ−およびＬＳＡ１−特異的ＩＬ−２ならびにＣＳ−およびＬＳＡ１−特異的ＴＮＦα産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が多重抗原ワクチンにより著しく増加した。

【0138】

しかし、多重抗原の免疫原性をＩＦＮγのＥＬＩＳｐｏｔにより評定した場合に、抗原競合が存在する事がよりいっそう明らかであった。具体的には、ＣＳワクチンをＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳワクチンと共送達した場合に、ＣＳ−特異的ＩＦＮγ応答の３倍の減少が認められた。認められたＩＦＮγ産生強度の減少は送達したＤＮＡの総量が増加したためではなかった（図１５）。ＩＣＳと比較してＥＬＩＳｐｏｔ法を使用して認められたＣＳ−特異的ＩＦＮγ応答の外見上の著しい減少は、アッセイの感度がより高いことによる可能性が最も高く、必ずしも抗原−特異的Ｔ細胞数の著しい減少によるものではないと考えられる。重要なことには、ＥＬＩＳｐｏｔによるＣＳ−特異的ＩＦＮγ産生の減少は、総Ｔ細胞集団のたった０．００５％の減少を表し、これはＣＳ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の総集団の、ＩＣＳにより認められたＩＦＮγ産生の減少と同様である（０．００４％）。

【0139】

可能性のある抗原競合の評定−概略
総合すると、ＩＣＳおよびＥＬＩＳＡデータにより、概して抗原は、誘発された免疫応答ではほとんど干渉されずに多重抗原製剤中に組み合わされ得ることが示唆される。

【0140】

ＣＳ特異的応答を増大させる方法（ｓｔｒａｔｅｇｙ）
それでもなお、ＣＳ特異的応答はマラリアワクチンに含まれることが重要であると考えられることから、全多重抗原ワクチンＩＦＮγ応答のうちＣＳ−特異的要素の強度を上昇させる目的で、２つのワクチン送達アプローチを評定した。第一のアプローチでは、多重抗原ワクチンカクテル全量のうち半量を１匹のマウス後肢に送達し、他の半量をその反対側のマウス後肢に送達した（「スプリットレグ（ｓｐｌｉｔ ｌｅｇ）」送達）。第二のアプローチでは、ＣＳワクチンを１匹のマウス後肢に送達し、またＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳワクチンを含有するカクテルを反対側の後肢に送達した。これらのアプローチは、ＣＳ特異的ＩＦＮγ産生の強度に著しい影響は与えなかった（図１６）。これらのデータから、多重抗原ワクチンにより認められたＩＦＮγ応答でのＣＳ特異性の減少は、未知の全身性メカニズムによる可能性が最も高く、４種類全ての抗原の同部位への共送達に直接関連しているわけではない。

【0141】

対合比較
次に、ペアワイズ（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）効果を評定して、１つの抗原が他のワクチン抗原への抗原−特異的ＩＦＮγ応答の誘導を調節し得るかを確認した。マトリックスアプローチを用いて、全ての可能性のある２−抗原組合せを評定し、また抗原−特異的ＩＦＮγ産生をＩＦＮγのＥＬＩＳｐｏｔにより確認した。各々の抗原対に関する単抗原ワクチン応答に対するＩＦＮγ産生の倍率変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を表１に報告する。注目すべきは、ＣＳワクチン応答およびＬＳＡ１ワクチン応答の両方が、ＣｅｌＴＯＳワクチンと共送達した場合に減少していた。

【表1】

【0142】

これらの知見は予備的であり、抗原組合せの免疫原性の変化が統計学的有意性に達し得なかったが、前述のように全ての抗原と全ての抗原対が強いＴ細胞応答を生じさせたことを留意することが重要である。したがって、顕著な差にもかかわらず、基準となる免疫応答の高いレベルの状況下で干渉が認められ、概して他のワクチンアプローチと比べた強いＴ細胞応答の誘導は劣っていなかった。

【0143】

統合した全てのデータにより、組み合わせた４抗原製剤を臨床現場で検査し得ること、および認められた抗原競合（存在するならば）は偶発的であり、その範囲は制限され、また本検査の結果を超えて一般化し得るものではないことが示唆される。

【0144】

ＣＤ８＋肝リンパ球によるＬＳＡ１−特異的ＩＦＮγ産生
齧歯類モデルにて、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、主要なエフェクター細胞、およびスポロゾイト感染肝細胞を除去する際の重大なエフェクター分子としてのＩＦＮγに関係があるとされてきた。このことから、本ワクチン候補を評定し、ＣＤ８＋肝リンパ球による抗原−特異的ＩＦＮγ産生を誘導し得るかどうかを確認した。肝リンパ球を、多重抗原ワクチン投与マウスから単離した。肝リンパ球を単離する前に、肝臓を完全にかん流させて単離した肝リンパ球集団中の循環しているＴ細胞の存在を低減または除外させた。ＬＳＡ１−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌の誘導をＩＣＳにより測定した。肝臓のＣＤ８＋Ｔ細胞の平均１．５％がＬＳＡ１−特異的ＩＦＮγを産生し（ｎ＝８）、未処置のマウスではバックグラウンドが認められなかった（ｎ＝３）（図１７）。

【0145】

これらのデータにより、試験した多重抗原候補などのＤＮＡに基づくワクチンは、抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、肝臓すなわち筋肉内免疫化後にスポロゾイト感染肝細胞を除去するために抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が必要とされる部位にて、誘導することが示される。

【0146】

概略
抗原を組み合わせる効果についての研究（単抗原対多重抗原組合せ）により、ＣＳ、ＴＲＡＰ、ＬＳＡ−１、およびＣｅｌＴＯＳを組み合わせて４プラスミド組合せマラリアワクチンとし得ることが実証された。

【0147】

実施例５：抗原ＡＭＡ１のコード配列を含むＤＮＡワクチンの開発
最近では、他のグループがＡＭＡ１抗原を組み込んだワクチンアプローチの有望なデータを報告している。Ｐｆ ３Ｄ７株由来のＡＭＡ１タンパク質をコードするワクチン構築物が設計されているが、これを本明細書に開示する。細胞性および液性免疫原性を、標準的なワクチン投与スケジュール（上記参照）に従って、ワクチンを３回投与した（１０μｇ、２０μｇ、および３０μｇ）マウス（各群：ｎ＝４）にて評定した。ワクチンは強いＡＭＡ１−特異的Ｔ細胞応答（図１８Ａ）と血清陽転化（図１８Ｂ）を誘導した。細胞性および液性免疫応答の両方が投与により有意な増加を示さなかった。ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳワクチンを含みさらにＡＭＡ１ワクチンを含むワクチンを設計し使用した。

【0148】

実施例６：インビボエレクトロポレーションにより送達される多重抗原ｐＤＮＡワクチン候補を用いた非ヒト霊長類研究
ＥＰにより送達した本多重抗原マラリアワクチンによりアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＮＨＰモデルにて誘発された細胞性および液性免疫応答両方の質と量を評定する検査を継続している。ＤＮＡワクチン単独の検査に加えて、ＩＬ−２８Ｂの共送達およびＣＳタンパク質ブーストの組合せのワクチン誘導免疫応答への効果を検査中であり、機能アッセイを、ワクチン候補の免疫原性、ならびに細胞性および液性応答に対するアジュバントの組合せと異種プライムブーストアプローチの影響を評定する際に使用した。

【0149】

ＮＨＰ検査を開始した。別の検査の対照としての役割をもつ別の群（５群）を早期にワクチン投与した。これらの検査は現在進行中である。検査群およびワクチン投与および採血タイムラインをそれぞれ表２および表３に示す。

【表2】

【表3】

【0150】

２回目の免疫化（８週目）後のＮＨＰデータの概略
２回目のワクチン投与後での継続中のＮＨＰ検査の細胞性および液性免疫原性データを以下に概略する。

【0151】

細胞性免疫原性
概して、全４抗原および送達アプローチについて、２回目の免疫化により抗原−特異的ＩＦＮγ応答をブーストした（図１９、左パネル）。２回目の免疫化後、平均抗原−特異的ＩＦＮ（ＩＦＮによる応答（ＥＬＩＳｐｏｔ））は、ＩＬ−２８Ｂを含むＩＭ送達（ｎ＝５）（１３１０（３０９ＳＦＵ、範囲９８６〜１５４０ＳＦＵ）およびＩＤ送達（ｎ＝５）（４０２（２８８ＳＦＵ、範囲１３２〜７６０ＳＦＵ）に比べ、ＩＭ群（ｎ＝１０）（１３５０（１１１６ＳＦＵ、範囲３１８〜３８４２ＳＦＵ）にてやや増大した。興味深いことに、特にＩＬ−２８Ｂの共送達ではＣＳＰ特異的応答の強度が増大し（図１９、右パネル）、かつその応答の変動性が減少していた。

【0152】

細胞性免疫原性もまた、フローサイトメトリにより評定し、２回目の免疫化後（８週目）の抗原特異的応答を図２０および図２１に示す。ＩＦＮγのＣＤ４＋Ｔ細胞産生は、ＩＭ（０．２２％）送達アプローチおよびＩＭ＋ＩＬ−２８（０．２０％）送達アプローチについては類似していた。ＩＦＮγの抗原−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞分泌の最低レベルがＩＤ送達について認められた（図２０、左パネル）。ＩＬ−２８Ｂとの共送達は、ワクチン単独のＩＭ送達（０．２０％）に比べて、ＩＬ−２（０．４９％）の抗原−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞産生を増大していた。（図２０、中央パネル）。全ての群でのＣＤ４＋Ｔ細胞区画にて、強いＣＳＰ−およびＬＳＡ１−特異的応答、ＴＮＦα応答が存在した。抗原−特異的ＴＮＦαは、ＩＭ＋ＩＬ−２８Ｂ（２．０％）およびＩＤ（１．９％）に比べて、ＩＭ群（３．２％）にて最大であった（図２０、右パネル）。

【0153】

ＣＤ８＋Ｔ細胞区画でのＩＦＮγＴ細胞応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞区画でのＩＦＮγのＥＬＩＳｐｏｔおよび応答と同様な傾向であった。概して、抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＩＤ送達と比べてＩＭ送達（ＩＬ−２８Ｂを含むまたは含まない）についてより強いものであった。抗原−特異的ＩＦＮγ産生は、ＩＤ群（０．１５％）と比べて、ＩＭ群（０．４４％）およびＩＭ＋ＩＬ−２８Ｂ群（０．４２％）で最大であった（図２１、左パネル）。ＣＳＰ−特異的ＩＦＮγ産生は、ＩＬ−２８Ｂの共送達（０．２８％）により、アジュバントを含まないワクチンのＩＭ送達（０．１１％）と比べて高い値であった。ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の大部分はまた、グランザイムＢ＋であった（図２１、下方の左パネル）：ＩＭ、０．３５％；ＩＭ＋ＩＬ−２８Ｂ、０．３５％；ＩＤ、０．１１％）。ＩＬ−２の抗原−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞産生は、ＩＤ（０．２４％）に比べて、ＩＭ群（０．４８％）およびＩＭ＋ＩＬ−２８Ｂ群（０．４１％）でより高い値であった（図２１、中央パネル）。ＣＤ４＋Ｔ細胞区画と同様に、比較的低い程度であるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞区画にて強いＴＮＦα応答が存在し、そのＴＮＦα応答はＣＳＰ抗原およびＬＳＡ１抗原への応答で圧倒的であった。具体的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．５８％、０．４０％、および０．４３％がそれぞれＩＭ、ＩＭ＋ＩＬ−２８、およびＩＤ群にてＴＮＦαを産生した。

【0154】

液性免疫原性
全抗原について、抗原−特異的血清陽転化の高いレベルが、全体で２回目の免疫化でブーストされた単独の免疫化後に認められた（図２２）。全抗原についてのＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡにより測定し、終末価をＦｒｅｙ， Ａ．らにより記載されたように算定した（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９８； ２２１：３５−４１）。簡潔には、終末価は未処置の抗体価の平均値から算定した９５％信頼区間の予測上限を超えてとどまる最終希釈の逆数として報告される。ＣＳＰおよびＬＳＡ１−特異的血清陽転化が、２回目の免疫化後に全ての群で増加した。平均ＴＲＡＰ終末価および平均ＣｅｌＴＯＳ終末価は、２回目の免疫化によりＩＭ送達およびＩＤ送達について増加したが、ＩＭ＋ＩＬ−２８Ｂ群についてはその平均力価は増加しなかった。ＩｇＧのＴＲＡＰ−およびＣｅｌＴＯＳ−特異的レベルは概してＩＬ−２８Ｂにより増加しなかったが、応答の一貫性が増した。

【0155】

概略
非ヒト霊長類でのワクチン抗原の免疫原性に関する研究により、４種類の抗原組合せが、２回のみのワクチン投与後、ＮＨＰでの強いＴ細胞応答および液性免疫応答を産生することが実証されてきた。本明細書に記載のＮＨＰデータは、霊長類モデルでのＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、およびＣｅｌＴＯＳを標的化するｐＤＮＡ構築物の免疫原性を確証し、マウスモデルでの先行データを裏付ける。上述のように、インビボでのＥＰにより送達されたｐＤＮＡ抗原は強い細胞性および液性応答を生じさせる。送達経路（ＩＤ対ＩＭ）とＩＬ−２８Ｂサイトカインの使用の違いの結果生じる相対的免疫応答を試験したところ、ワクチン製剤のＩＤ送達が強い液性免疫応答を導くことが示された。さらなるタンパク質ブーストの免疫応答の強度と量への影響を評価する。

【0156】

実施例７：ＩＬ−２８Ｂがワクチン−特異的細胞性および液性応答を増強し制御性Ｔ細胞集団を低減させる
ＤＮＡワクチンの送達を組み合わせた、サイトカイン遺伝子アジュバント、ＩＬ−２８をコードするＤＮＡベクターの送達効果を評定し、ワクチン抗原について、抗原−特異的エフェクターおよび記憶Ｔ細胞の応答特異性の増加について確認した。最近の証拠により、記憶Ｔ細胞の高いレベルを誘導するマラリアワクチンが長期的な防御を提供し得ることが示唆されている。ＩＬ−２８Ｂサイトカイン遺伝子アジュバントをコードするＤＮＡベクター（Ｍｏｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ２００９ １１３（２３）：５８６８−７７．）を他のＤＮＡワクチンと共に送達することで、免疫原性全体と記憶Ｔ細胞レベルが増加したが、制御性Ｔ細胞レベルが減少した。ＩＬ−２８Ｂが、ＣＴＬに特徴的な表現型を示す抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導させることを実証した。

【0157】

ＩＬ−２８Ｂのマウスモデルにて本ワクチンへの抗原特異的応答を増大させる能力を調査した。多重抗原ワクチンと１０μｇのＩＬ−２８Ｂを共送達することにより、総ワクチン−特異的ＩＦＮγ応答が１．５倍に増大した。ＩＬ−２８Ｂは、ＣＳ特異的およびＣｅｌＴＯＳ−特異的ＩＦＮγ産生をそれぞれ２．５倍および２．０倍に増大させた（図２３）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞集団の減少は、ワクチン−特異的ＩＦＮγ応答の増加と同様な傾向であった（図２４）。ＩＬ−２８Ｂは、特異的に細胞性免疫原性を増強させることが以前に報告されているが、２種の異なるワクチンへの液性応答に影響を与えなかった。本ワクチンと共送達する場合、ＩＬ−２８ＢはまたＣＳ特異的血清陽転化を増加させた（図２５）。

【0158】

サイトカインアジュバントＩＬ−２８Ｂの、候補ワクチンの免疫効力を調節および／または向上させる場合の効果について研究により、ＩＬ−２８Ｂの共送達がワクチン特異的ＩＦＮ−γ産生を増加させ、Ｔｒｅｇ数を減少させ、またＣＳ−特異的血清陽転化を増大させることが示された。

【0159】

実施例８：ＤＮＡ／タンパク質プライムブーストアプローチ
ＣＳタンパク質は重要な抗原であり、その液性応答の誘導能力が防御に関連し得る。ＮＨＰ検査でのＣＳタンパク質ブーストの試験に加えて、ＣＳタンパク質のそれ自体による免疫原性と潜在的毒性をマウスにて試験した。

【図1A】

【図1B-1】

【図1B-2】

【図1B-3】

【図1B-4】

【図1B-5】

【図1B-6】

【図1B-7】

【図1B-8】

【図1B-9】

【図1B-10】

【図1B-11】

【図1B-12】

【図1B-13】

【図1B-14】

【図2A】

【図2B-1】

【図2B-2】

【図2B-3】

【図3A】

【図3B-1】

【図3B-2】

【図3B-3】

【図3B-4】

【図3B-5】

【図3B-6】

【図3B-7】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D-1】

【図6D-2】

【図6D-3】

【図6D-4】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図6I】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25-1】

【図25-2】

【図25-3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]