特許 6293742 デザイナーモノヌクレオソーム（ｄｅｓｉｇｎｅｒｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ）のＤＮＡバーコード化ならびにクロマチンリーダー、ライター、イレーサーおよびそのモジュレーターをプロファイリングするためのクロマチンアレイライブラリー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6293742

(24)【登録日】2018年2月23日

(45)【発行日】2018年3月14日

(54)【発明の名称】デザイナーモノヌクレオソーム（ｄｅｓｉｇｎｅｒｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ）のＤＮＡバーコード化ならびにクロマチンリーダー、ライター、イレーサーおよびそのモジュレーターをプロファイリングするためのクロマチンアレイライブラリー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180305BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20180305BHJP

   C40B 40/10 20060101ALI20180305BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20180305BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20180305BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C40B40/06

   C40B40/10

   C12Q1/68 A

   !C07K14/47

【請求項の数】27

【全頁数】58

(21)【出願番号】特願2015-516214(P2015-516214)

(86)(22)【出願日】2013年6月6日

(65)【公表番号】特表2015-521462(P2015-521462A)

(43)【公表日】2015年7月30日

(86)【国際出願番号】US2013044537

(87)【国際公開番号】WO2013184930

(87)【国際公開日】20131212

【審査請求日】2016年6月6日

(31)【優先権主張番号】61/656,233

(32)【優先日】2012年6月6日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/712,148

(32)【優先日】2012年10月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591003552

【氏名又は名称】ザ、トラスティーズ オブ プリンストン ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100108855

【弁理士】

【氏名又は名称】蔵田 昌俊

(74)【代理人】

【識別番号】100103034

【弁理士】

【氏名又は名称】野河 信久

(74)【代理人】

【識別番号】100075672

【弁理士】

【氏名又は名称】峰 隆司

(74)【代理人】

【識別番号】100153051

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140176

【弁理士】

【氏名又は名称】砂川 克

(74)【代理人】

【識別番号】100124394

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 立志

(74)【代理人】

【識別番号】100112807

【弁理士】

【氏名又は名称】岡田 貴志

(74)【代理人】

【識別番号】100111073

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 美保子

(72)【発明者】

【氏名】マイアー、トム・ダブリュ．

(72)【発明者】

【氏名】ンガイエン、ウェン・ティー．・ティー．

(72)【発明者】

【氏名】メラー、マヌエル・エム．

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１２／０５０９６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０５９７２６０８（ＵＳ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０３０５７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 DAI J. et al.，Cell，134(2008)，p.1066-1078

【文献】 Ruthenburg A.J. et al.，Cell，145(2011)，p.692-706

【文献】 NAKANISHI S. et al.，Nat. Struct. Mol. Biol.，15(8)(2008)，p.881-888

【文献】 KATO M. et al.，J. Mol. Biol.，350(2005)，p.215-227

【文献】 DORIGO B. et al.，J. Mol. Biol.，327(2003)，p.85-96

【文献】 BARTKE T. et al.，Cell，143(2010)，p.470-484

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ４０Ｂ ４０／０６−４０／１０

Ｃ０７Ｋ １４／４７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

合成モノヌクレオソームであって、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と、
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）ヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）であって、１つ以上の前記ヒストンと結合して安定な蛋白質を形成する塩基配列と、
（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のＤＮＡバーコードと、
（ｉｉｉ）前記ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内での１つ以上のＤＮＡ延長部と
を含み、前記ＤＮＡが修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ中の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されてＤＮＡ修飾のパターンを形成している、ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と
の複合体を含み、
さらに（ｉ）ヒストン修飾のパターンおよび／またはＤＮＡ修飾のパターンを有し、それによってヌクレオソーム修飾のパターンを形成し、（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置が前記モノヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾の前記パターンを示す１つ以上の固有のバーコードを含む、合成モノヌクレオソーム。

【請求項2】

ＤＮＡ分子によって互いに結合している２つ以上の合成モノヌクレオソームを含む合成ポリヌクレオソームであって、前記モノヌクレオソームが接続性を有し、前記２つ以上の合成モノヌクレオソームの各々が、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてモノヌクレオソーム性ヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と；
（ｂ）モノヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）ヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、
（ｉｉ）前記ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内でのＤＮＡ延長部とを含み、
前記ＤＮＡが修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ中の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されてモノヌクレオソーム性ＤＮＡ修飾のパターンを形成している、モノヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と
の複合体を含み、
モノヌクレオソーム性ヒストン修飾の前記パターンおよび／または前記ポリヌクレオソーム中のモノヌクレオソーム性ＤＮＡ修飾の前記パターンが、均一であってもよく、または異なっていて、ポリヌクレオソーム性修飾のパターンを得られてもよく；
前記ポリヌクレオソームが、前記ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置がポリヌクレオソーム性修飾の前記のパターンを示す前記ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のバーコードを含む、合成ポリヌクレオソーム。

【請求項3】

リンカーヒストンを更に含む、請求項１に記載の合成モノヌクレオソーム。

【請求項4】

リンカーヒストンを更に含む、請求項２記載の合成ポリヌクレオソーム。

【請求項5】

前記複合体が１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質を更に含む、請求項１または請求項３に記載の合成モノヌクレオソーム。

【請求項6】

前記複合体が１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質を更に含む、請求項２または請求項４に記載の合成ポリヌクレオソーム。

【請求項7】

請求項２、請求項４、または請求項６に記載の合成ポリヌクレオソームを２つ以上含む合成ポリヌクレオソームのライブラリーであって、
前記ライブラリーの各メンバーが、ポリヌクレオソーム性修飾のパターンを示す１つ以上の固有のバーコードを有する、ライブラリー。

【請求項8】

前記ヒストンの前記修飾が、ヒストンアイソフォーム、翻訳後修飾（ＰＴＭ）および／もしくは非天然のアミノ酸を含む、請求項１、請求項３、または請求項５に記載の合成モノヌクレオソーム。

【請求項9】

（ａ）前記ヒストンアイソフォームが、タンパク質配列内の１つ以上のアミノ酸置換もしくはアミノ酸挿入またはタンパク質配列の末端の延長部および／またはタンパク質配列内の短縮を含み；および／または
（ｂ）前記ＰＴＭが、ヌクレオソーム当たり１つの部位の修飾または２つ以上の部位の修飾を有する、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、アルキル化、アシル化、プロリルシス／トランス異性化、ニトロシル化、および酸化を含めた、任意の天然に存在するヒストン修飾から選択され、および／または
（ｃ）前記非天然のアミノ酸が、化学的および生化学的に不活性な、光架橋剤、蛍光標識または同位体標識であり得る翻訳後修飾（ＰＴＭ）の合成類似体から選択される、請求項８に記載の合成モノヌクレオソーム。

【請求項10】

前記ＤＮＡの修飾が、天然に存在する修飾を有するＤＮＡ塩基もしくは人工的な修飾を有する塩基を１つ以上含む、請求項１、請求項３、請求項５、請求項８、または請求項９に記載の合成モノヌクレオソーム。

【請求項11】

１つ以上の請求項１、請求項３、請求項５、請求項８、請求項９、または請求項１０に記載の合成モノヌクレオソームおよび／または１つ以上の請求項２、請求項４、請求項６、または請求項７に記載の合成ポリヌクレオソームを含むキットであって、モノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソームが、１つ以上の容器に含まれている、キット。

【請求項12】

各固有のバーコードとモノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソーム修飾のパターンの間の相関を示す一覧をさらに含む、請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

前記容器が、試験管、マルチウエルプレートのウェルまたは微小流体装置の反応チャンバーである、請求項１１に記載のキット。

【請求項14】

組換えに由来する、および／もしくは有核細胞抽出物から抽出された１つ以上のクロマチンリーダーの認識パターンならびに親和性の特異性を決定する、または組換えに由来する、および／もしくは１つ以上の細胞系の有核細胞抽出物から抽出された１つ以上のクロマチン修飾物質の特異性ならびにクロマチン修飾クロストークを決定する方法であって、
（ｉ）１つ以上の請求項１、請求項３、請求項５、請求項８、請求項９、または請求項１０に記載の合成モノヌクレオソームおよび／または１つ以上の請求項２、請求項４、請求項６、または請求項７に記載の合成ポリヌクレオソームを、１つ以上の前記クロマチンリーダーまたは１つ以上の前記クロマチン修飾物質と接触させることと、
（ｉｉ）結合したおよび／または修飾された合成モノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソームを単離することと、
（ｉｉｉ）前記結合したまたは修飾された合成モノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソームおよび任意の付加されたマークまたは除去されたマークを同定および／または定量化することと
を含む方法。

【請求項15】

２つ以上の請求項１、請求項３、請求項５、請求項８、請求項９、または請求項１０に記載の合成モノヌクレオソームを含むライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーが、モノヌクレオソーム修飾のパターンを示す１つ以上の固有のバーコードを有する、ライブラリー。

【請求項16】

１つ以上のクロマチン相互作用物質または修飾物質に関連する１つ以上の修飾を同定する方法であって、
請求項１５に記載のライブラリーを１つ以上のサブライブラリに分けることと；
前記の１つ以上のクロマチン相互作用物質および／または修飾物質を前記の１つ以上のサブライブラリと共にインキュベートすることと；
１つ以上のクロマチン相互作用物質または修飾物質と結合している１つ以上の修飾モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームから１つ以上のＤＮＡバーコードを単離することと；
前記の単離されたＤＮＡバーコードを、各単離されたＤＮＡ配列に、ポリメラーゼ連鎖反応を介して、前記の１つ以上のクロマチン相互作用物質または修飾物質に対応する追加のバーコード配列を備えることにより多重化すること；および
前記の１つ以上のクロマチン相互作用物質または修飾物質の各々に関連する前記の１つ以上の修飾をポリメラーゼ連鎖反応またはＤＮＡ配列決定を介したバーコード検出により同定すること
とを含む方法。

【請求項17】

エピジェネティック薬物の特異性を同定し、プロファイリングする方法であって、
候補分子を１つ以上の請求項１、請求項３、請求項５、請求項８、請求項９、請求項１０、または請求項１５に記載のモノヌクレオソームおよび／または１つ以上の請求項２、請求項４、または請求項６、または請求項７に記載のポリヌクレオソームと組み合わせることと、
ヌクレオソーム修飾のモジュレーションおよび／またはその結合を検出することとを含み、
それによって、ヌクレオソーム修飾をモジュレートするおよび／またはそれに結合する候補エピジェネティック薬物を同定する、方法。

【請求項18】

ＤＮＡバーコードおよび関連するヌクレオソーム修飾ならびにバーコード化した各ヌクレオソームの組成の一覧を更に含む、請求項７または請求項１５に記載のライブラリー。

【請求項19】

前記ヌクレオソーム性ＤＮＡの前記５’および／もしくは３’末端にまたはその中にＤＮＡバーコードを更に含む、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１５に記載の合成モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソーム。

【請求項20】

１つ以上の修飾されたヒストンタンパク質、補完的な非修飾ヒストン、および１つ以上のバーコード化したヌクレオソーム性ＤＮＡと親和性タグ付けした緩衝ＤＮＡとを既定の比で組み合わせることを含む、請求項１、請求項３、請求項５、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１５、または請求項１９に記載のモノヌクレオソームを会合させる方法。

【請求項21】

前記ライブラリーが安定するように前記ＮＰＳが十分に強力であり、４℃で少なくとも１カ月間貯蔵した後でも、モノヌクレオソームライブラリーメンバーの間で有意なＤＮＡスクランブリングが発生しない、請求項１５に記載のライブラリー。

【請求項22】

前記モノヌクレオソームライブラリーメンバーの比が、等モル（各ライブラリーメンバーについて１：１）であるかまたは等モルでなく、固定された既定の比でライブラリーメンバーの１つまたはサブセットに対して１〜１０００の範囲である、請求項１５または請求項２１に記載のライブラリー。

【請求項23】

前記ヒストンの修飾が、ヒストンアイソフォーム、翻訳後修飾（ＰＴＭ）および／もしくは非天然アミノ酸である；ならびに／または、前記ＤＮＡ分子の前記修飾が、１つ以上のＤＮＡ塩基の天然に存在する修飾もしくは人工的な修飾を含む、請求項７、請求項１５、請求項１８、請求項２１、または請求項２２に記載のライブラリー。

【請求項24】

前記リンカーヒストンがＨ１である請求項３、請求項５、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１５、請求項２１、または請求項２２に記載の合成モノヌクレオソーム。

【請求項25】

前記リンカーヒストンがＨ１である請求項４、請求項６、または請求項７に記載の合成ポリヌクレオソーム。

【請求項26】

前記の結合したまたは修飾された合成モノヌクレオソームおよび／またはポリヌクレオソームの同定および／または定量が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応または次世代配列決定の使用を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項27】

前記緩衝ＤＮＡがＭＭＴＶである請求項２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の概要】

【0001】

本出願は、２０１２年６月６日に出願の米国特許仮出願第６１／６５６，２３３号、および２０１２年１０月１０日に出願の米国特許仮出願第６１／７１２，１４８号の出願日の利益を主張し、その両方を参照によりその全体をここで組み込む。

【0002】

配列表
即時出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で、ＡＳＣＩＩ形態で提出された配列表を含有し、参照によりその全体をここで組み込む。２０１３年６月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、３２１０８−３４８４５３_ＳＬ.ｔｘｔと命名され、サイズは１４，６５３バイトである。

【背景情報】

【0003】

真核生物細胞において、ＤＮＡは、クロマチンと呼ばれる核タンパク質複合体中でヒストンタンパク質と一緒にパッケージングされている。クロマチンの最小反復単位はヌクレオソームであり、それによりクロマチンの繊維および高次構造への折りたたみが可能になる。クロマチンレベルでの遺伝子調節（「エピジェネティクス」）は、ＤＮＡとヒストン両方の動的化学修飾（「マーク」）による性質によって達成され、特殊な「クロマチンライター」および「クロマチンイレーサー」酵素によって媒介される（まとめて「クロマチン修飾物質」と呼ばれる）。「ヒストン修飾物質」とは、それぞれ、１つ以上のマークをヒストンタンパク質にまたはそこから、付着させる（「ヒストンライター」）または除去する（「ヒストンイレーサー」）タンパク質である。「ＤＮＡ修飾物質」とは、それぞれ、１つ以上のマークをＤＮＡにまたはそこから、付着させる（「ＤＮＡライター」）または除去する（「ＤＮＡイレーサー」）タンパク質である。例としては、薬理学的に重要なヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）およびヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）がある。これらの修飾を組み合わせて、（クロマチン繊維内、単一ヌクレオソーム内、および／または単一ヒストン内に）局所的パターンを形成し、そのパターンは固有のマークを認識する特殊なモジュール（「クロマチンリーダー」または「クロマチン相互作用物質」）を有するタンパク質因子の動員プラットフォームとして機能すると考えられる。「ヒストンリーダー」または「ヒストン相互作用物質」はそれぞれ、ヒストンタンパク質上にある１つ以上のマークを認識するまたはそれに結合するタンパク質である。「ＤＮＡリーダー」または「ＤＮＡ相互作用物質」はそれぞれ、ＤＮＡ上にある１つ以上のマークを認識するまたはそれに結合するタンパク質である。ＤＮＡおよびヒストンマークは、細胞の発達および分化に重要であり、したがって異常な修飾および組合せが損なわれた読み出しは、ヒト疾患、特に癌に関係する。結果として、クロマチン生物学およびエピジェネティクスは、学究的世界および製薬業界において多くの研究構想の焦点になった。さらに、トップダウンエピゲノムおよびプロテオーム手法によって生成される情報量と、それに関連するクロマチン生化学の分子詳細に系統的に情報を与える能力との間のミスマッチが急速に拡大する。ヒストン配列、変形、ならびに天然の修飾の型および存在量、ならびに修飾に関与するいくつかの酵素に関するゲノム情報およびプロテオーム情報が膨張しているにもかかわらず、非常に複雑なエピジェネティック機構についての知識は断片的なままであり、有効な生化学ツールが無い。

【0004】

ヒストンタンパク質における異常な翻訳後修飾パターンおよびＤＮＡ塩基に見出されるそれらは、疾患中にしばしば見出される。次世代のエピジェネティック薬物の合理的なデザインの必要条件として、発症機序を理解し、アッセイし、操作するニーズがある。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】典型的な、ＤＮＡコード化ＭＮライブラリー。この特定の変形において、各ＭＮライブラリーメンバーは、ヌクレオソーム性ＤＮＡの５’末端でバーコード化されており、その後のＤＮＡ配列決定読み出し用としてフォワード（ＦＷ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および配列決定プライミング部位を含有する。ＭＮバーコードは、それぞれのＭＮに組み込まれたヒストンバリアントおよび／もしくはＤＮＡバリアントならびに／または他のヒストンおよび非ヒストンタンパク質をコードしている。一般に、ＤＮＡ内のどこにでも、５’もしくは３’末端に、またはその近傍に、１つまたはいくつかのバーコードを組み込むことができる。白：ヒストン八量体；灰色：ヌクレオソーム性ＤＮＡ；黒い突出：Ｎ末端ヒストンテール。フラグは、異なる修飾を表す（ここでは、ヒストンに対する修飾を示す；またはその代わりとして、修飾はＤＮＡ配列内に組み込むこともできる）。異なるバーコードは、それぞれのＭＮバリアントをコードしている異なるＤＮＡ配列を表す。Ｈ：ヒストン。ＭＮ：モノヌクレオソーム。ＦＷ：フォワード配列決定プライミング部位。

【図2】トリＭＮからなる典型的な、ＤＮＡコード化ＣＡライブラリー。この特定の変形において、各ＭＮライブラリーメンバーは、アレイＤＮＡの５’末端でバーコード化されており、その後のＤＮＡ配列決定読み出し用としてＰＣＲおよび配列決定プライミング部位を含有する。ＣＡバーコードは、それぞれのＣＡに組み込まれた、ヒストンバリアントおよび／もしくはＤＮＡバリアント、ＤＮＡ延長部、リンカーヒストン、ならびに／または他の非ヒストンタンパク質をコードしている。一般に、ＤＮＡ内のどこにでも、５’もしくは３’末端に、またはその近傍に、１つまたはいくつかのバーコードを組み込むことができる。白：ヒストン八量体；灰色：アレイＤＮＡ；黒い突出：Ｎ末端ヒストンテール。図１のように、フラグは異なる修飾（ヒストンまたはＤＮＡ）修飾を表す。異なるバーコードは、それぞれのＣＡバリアントをコードしている異なるＤＮＡ配列を表す。Ｈ：ヒストン。ＭＮ：モノヌクレオソーム。ＣＡ：クロマチンアレイ。ＦＷ：フォワード配列決定プライミング部位。

【図3】クロマチン相互作用物質／修飾物質をプロファイリングするためのＤＮＡバーコード化したＭＮライブラリーの使用例。Ｉ．この特定の変形例では、各ＭＮライブラリーメンバーは、ヌクレオソーム性ＤＮＡの５’末端でバーコード化されている。ＭＮバーコードは、ヒストンバリアントおよび／またはＤＮＡバリアントをコードしている。ＩＩ．クロマチン相互作用物質または修飾物質とライブラリー（組換えまたは有核細胞抽出物から得られる）とのインキュベーション。ＩＩＩ．たとえば抗体プルダウンによる、結合しているまたは修飾されたＭＮ基質の単離。ＩＶ．タンパク質消化およびＤＮＡ精製を使用する、バーコード化したＤＮＡ配列の単離。Ｖ．データ分析：入力標準化後のＤＮＡの識別および定量化。バーコード解読は、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション、またはたとえばＰＣＲもしくはＴ４ ＤＮＡライゲーションによるＦＷおよびＲＶ配列決定プライミング部位の付加後のＤＮＡ配列決定のいずれかによって達成することができる（注：任意に、ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。白：ヒストン八量体；灰色：ヌクレオソーム性ＤＮＡ；黒い突出：Ｎ末端ヒストンテール。フラグは、ヒストン上だけでなく潜在的にＤＮＡ上にも見られる異なる修飾を表す。異なるバーコードは、それぞれのＭＮバリアントをコードしている異なるＤＮＡ配列を表す。ＭＮ：モノヌクレオソーム。ＦＷ：フォワード配列決定プライミング部位。ＲＶ：リバース配列決定プライミング部位。

【図4】ＭＮライブラリーに対して実行された操作工程をバーコード化する例。Ｉ．この特定の変形例では、各ＭＮライブラリーメンバーは、ヌクレオソーム性ＤＮＡの５’末端でバーコード化されている。ＭＮバーコードは、ヒストンバリアントおよび／またはＤＮＡバリアントをコードしている。ＩＩ．ライブラリーを分割し、様々な生化学的または生物物理学的操作、ここでは典型的な操作１．１および１．２に供する。ＩＩＩ．たとえば抗体プルダウンによる、成功裏に操作されたＭＮの単離。ＩＶａ．ＤＮＡ配列決定用ＤＮＡライブラリーの調製：タンパク質消化およびＤＮＡ精製を使用する、バーコード化したＤＮＡの単離と、それに続く、ＰＣＲによる実験（多重化）バーコード（ここでは：ＭＰ１．１およびＭＰ１．２）ならびにＦＷおよびＲＶ配列決定プライミング部位の付加（任意に、ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。ＩＶｂ．実験バーコード（ここでは：ＭＰ１およびＭＰ２）の、たとえばＤＮＡの５’−ヌクレオソーム性末端への付加。二重バーコード化したＭＮのプーリング。ライブラリーを分割し、必要なだけ工程ＩＩ〜ＩＶｂを反復する（ここで、２つの各々異なる操作で３回の操作を示す）。ＤＮＡ単離。ＦＷおよびＲＶ配列決定プライミング部位の付加（注：ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。Ｖ．データ分析：ＤＮＡの識別および定量化。白：ヒストン八量体；灰色：ヌクレオソーム性ＤＮＡ；黒い突出：Ｎ末端ヒストンテール。前図のように、フラグは異なる修飾を表す。異なるバーコードは、それぞれのＭＮバリアントをコードしている異なるＤＮＡ配列を表す。ＭＮ：モノヌクレオソーム。ＭＰ：多重化（実験）バーコード。ＦＷ：フォワード配列決定プライミング部位。ＲＶ：リバース配列決定プライミング部位。

【図5】クロマチン相互作用物質をプロファイリングするためのバーコード化した多重化ＭＮライブラリーの使用例。Ｉ．この特定の変形例では、各ＭＮライブラリーメンバーは、ヌクレオソーム性ＤＮＡの５’末端でバーコード化されている。ＭＮバーコードは、ヒストンバリアントおよび／またはＤＮＡバリアントをコードしている。ＩＩ．ライブラリーを分割し、様々なクロマチンリーダー、たとえば１つのリーダーモジュール（ａ）または１つのポリペプチド鎖の中（ｂ）もしくは異なるポリペプチド鎖の上（ｃ）に複数のリーダーモジュール（ｂ、ｃ）を有するリーダー（組換えまたは有核細胞抽出物から得られる）、とインキュベートする。ＩＩＩ．たとえば抗体プルダウンによる、結合しているＭＮの単離。ＩＶ．ＤＮＡ配列決定用ＤＮＡライブラリーの調製：ＩＶａ．タンパク質消化およびＤＮＡ精製を使用する、バーコード化したＤＮＡの単離。ＩＶｂ．ＰＣＲによる実験（多重化）バーコードならびにＦＷおよびＲＶ配列決定プライミング部位の付加（注：ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。ＩＶｃ．二重バーコード化したＤＮＡ配列のプーリング。Ｖ．ＭＮおよび多重化バーコードを解読するためのＤＮＡ配列決定。ＶＩ．ＤＮＡの識別および定量化のためのデータ分析。白：ヒストン八量体；灰色：ヌクレオソーム性ＤＮＡ；黒い突出：Ｎ末端ヒストンテール。前図のように、フラグは異なる修飾を表す。異なるバーコードは、それぞれのＭＮバリアントをコードしている異なるＤＮＡ配列を表す。ＭＮ：モノヌクレオソーム。ＭＰ：多重化（実験）バーコード。ＦＷ：フォワード配列決定プライミング部位。ＲＶ：リバース配列決定プライミング部位。

【図6】クロマチン修飾物質をプロファイリングするためのバーコード化した多重化ＭＮライブラリーの使用例。Ｉ．この特定の変形例では、各ＭＮライブラリーメンバーは、ヌクレオソーム性ＤＮＡの５’末端でバーコード化されている。ＭＮバーコードは、ヒストンバリアントおよび／またはＤＮＡバリアントをコードしている。ＩＩ．ライブラリーを分割し、たとえば触媒ドメイン（ａ）、全長酵素（ｂ）または大きなマルチサブユニット複合体に埋め込まれた酵素（ｃ）（組換えまたは有核細胞抽出物から得られる）を含有する様々なクロマチン修飾物質とインキュベートする。ＩＩＩ．たとえば（ａ）付着したマークまたは（ｂ）除去されたマークに対する抗体プルダウンによる、修飾されたＭＮの単離（この場合、プルダウンは、非基質を取り除くために実行される）。さらなる工程は全て、図５に記載される手順と同等である。白：ヒストン八量体；灰色：ヌクレオソーム性ＤＮＡ；黒い突出：Ｎ末端ヒストンテール。フラグは、ヒストン上だけでなく潜在的にＤＮＡ上にも見られる異なる修飾を表す。異なるバーコードは、それぞれのＭＮバリアントをコードしている異なるＤＮＡ配列を表す。Ｈ：ヒストン。ＭＮ：モノヌクレオソーム。ＭＰ：多重化（実験）バーコード。

【図7】ＭＮ安定性をプロファイリングするためのバーコード化した多重化ＭＮライブラリーの使用例。Ｉ．この特定の変形例では、各ＭＮライブラリーメンバーは、ヌクレオソーム性ＤＮＡの５’末端でバーコード化されている。ＭＮバーコードは、ヒストンバリアントおよび／またはＤＮＡバリアントをコードしている。ＩＩ．ライブラリーを分割し、ＭＮを不安定化する様々な実験条件、たとえば高塩濃度またはクロマチン再形成複合体を含有する有核細胞抽出物への暴露、に暴露する。ＩＩＩ．たとえばアガロースゲル精製による、遊離したバーコード化したヌクレオソーム性ＤＮＡの単離。さらなる工程は全て、図５に記載される手順と同等である。白：ヒストン八量体；灰色：アレイＤＮＡ；黒い突出：Ｎ末端ヒストンテール。前図のように、フラグは異なる修飾を表す。異なるバーコードは、それぞれのＭＮバリアントをコードしている異なるＤＮＡ配列を表す。Ｈ：ヒストン。ＭＮ：モノヌクレオソーム。ＭＰ：多重化（実験）バーコード。ＦＷ：フォワード配列決定プライミング部位。ＲＶ：リバース配列決定プライミング部位。

【図8】クロマチン相互作用物質および修飾物質の活性または機能をモジュレートする分子をプロファイリングするためのバーコード化したＭＮライブラリーの使用例。Ｉ．この特定の変形例において、１つのＭＮバリアントだけが示され、それはヌクレオソーム性ＤＮＡの５’末端でバーコード化されている。ＭＮバーコードは、ヒストンバリアントおよび／またはＤＮＡバリアントをコードしている。ＩＩ．ライブラリーを分割し、クロマチン相互作用物質もしくは修飾物質（組換えまたは有核細胞抽出物から得られる）の機能または活性をモジュレートする様々な分子に暴露する。ＩＩＩ．たとえばリーダー、付着したマーク（ライター）または除去されたマーク（イレーサー）に対するプルダウンによる、ヒットの単離。ＩＶ．阻害剤バーコードの付加（たとえばＤＮＡライゲーションによる）。Ｖ．ＤＮＡライブラリーの生成：ＦＷおよびＲＶプライマーの付加（ＤＮＡライゲーションおよび／またはＰＣＲによる）。さらなる工程は全て、図５に記載される手順と同等である。白：ヒストン八量体；灰色：ヌクレオソーム性ＤＮＡ；黒い突出：Ｎ末端ヒストンテール。前図のように、フラグは異なる修飾を表す。異なるバーコードは、それぞれのＭＮバリアントをコードしている異なるＤＮＡ配列を表す。Ｈ：ヒストン。ＭＮ：モノヌクレオソーム。ＩＢＣ：阻害剤バーコード。ＦＷ：フォワード配列決定プライミング部位。ＲＶ：リバース配列決定プライミング部位。

【図9A】ヒストン半合成およびヌクレオソーム会合の概要。（Ａ）修飾ヒストンを調製するための半合成戦略の略図、この特定の場合では、Ｎ末端修飾ヒストン。

【図9B】（Ｂ）組換えｗｔまたは半合成の修飾ヒストンを等モル比で組み合わせ、変性剤から高塩へと透析する（「透析１」）。それ以上精製することなく、ＢＣ−６０１（ヒストン八量体に対して０．６ｅｑ）とビオチン化ＭＭＴＶ緩衝ＤＮＡ（ヒストン八量体に対して０．４当量；「ＢＩＯ−ＭＭＴＶ」）の混合物を添加する（「透析２」、高から低塩へ）。ストレプトアビジンプルダウン（ＳＡＰ）して、非生産的に形成されたＤＮＡヒストン複合体を除去することによって、望ましいヌクレオソームの精製を達成する。ＭＮ：モノヌクレオソーム；ＮＴ：Ｎ末端；ＢＩＯ：ビオチン；ＳＡＰ：ストレプトアビジン親和性精製；ＰＴＭ：翻訳後修飾。図の下部のＢＩＯ−ＭＭＴＶの配列は、配列番号１３である。

【図10A】次世代配列決定用の多重化した二重バーコード化したＤＮＡ配列の生成。（Ａ）ＰＣＲによるＭＮ形成のための典型的なバーコード化したヌクレオソーム性６０１ ＤＮＡ分子（この例においては、長さ：１９０ｂｐ）の生成。

【図10B】（Ｂ）適切な非パリンドローム突出を使用するＴ４ ＤＮＡライゲーション戦略により、バーコード化したヌクレオソーム性６０１ ＤＮＡ配列の柔軟な調製が可能になる。ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔフォワードプライミング部位のｎｔ１０〜３０にわたる相補的一本鎖ＤＮＡ（「ＦＷ−ｉＴ_10〜30」）とそれぞれの６ｂｐ ＭＮバーコードとをアニールし、ＢｓａＩ−ＤｒａＩＩＩ消化したヌクレオソーム性６０１配列と組み合わせ、Ｔ４ ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用してｉｎ ｓｉｔｕでリン酸化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲーションした。「ＢＣ−６０１」ＤＮＡ鋳型の平滑末端セルフライゲーションを防止するために、下側の鎖の３’末端にＡＡ突出を付着させた。

【図10C】（Ｃ）ＤＮＡ実験の多重化。４つの異なるＭＮバリアントおよび２つの実験（ＥＸＰ１およびＥＸＰ２）に由来するバーコード化したＤＮＡ鋳型の例を示す。ＭＮの実験的由来をコードするためのＰＣＲ多重化は、適切なリバースプライマー（共通の６０１アニーリング部位「６０１ＲＶ」、多重化実験バーコード「ＢＣ−ＥＸＰ１」または「ＢＣ−ＥＸＰ２」およびｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）リバースアダプター「ＲＶ−ｉＴ」を含有する）を使用して達成される。二重バーコード化したＤＮＡ分子をプールし、ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）次世代配列決定装置を使用して分析する。解読および標準化については（Ｄ）を参照のこと。

【図10D】（Ｄ）ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）配列決定後のデータ分析の概要。この例において、ライブラリー入力の配列決定であるＥＸＰ２と一緒に、４種類の異なるＭＮを３つの実験（ＥＸＰ１〜３）に供した。生配列決定リードを、その実験的バーコードに従って最初に仕分けし、それに続けてＭＮバーコードに従って仕分けする。仕分けしたリードを、配列決定した入力に対して続けて標準化して、個々のＭＮの初期量の差異を修正する（中央）。最終的な標準化データを、％入力として示す。ｅｑ：当量；ＦＷ：フォワード；ＲＶ：リバース；ｉＴ：ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）；ＭＮ：モノヌクレオソーム；ＢＣ：バーコード；ＥＸＰ：実験；ＩＰ：入力；ｓｓ：一本鎖；ｄｓ：二本鎖。図の下の配列は、上から下へと、それぞれ配列番号１４、１０、１５、１１および１６〜１８の表示である。

【図11A】コードされているヌクレオソームライブラリーにより、短時間で数百個ものヌクレオソーム−クロマチン調節因子相互作用を高速かつ詳細に調査できる。（ａ）複数の別々の実験において、ヌクレオソーム性６０１ ＤＮＡ（「ＢＣ−６０１」）に追加された６ｂｐバーコード（「ＢＣ−ＭＮ」）にコードされる異なるＰＴＭパターンを含有するヌクレオソームライブラリーを、有核細胞抽出物の形態のヒストンライター、イレーサーおよび／もしくはリーダーまたはその組合せに供する（ここでは、ＥＸＰ１およびＥＸＰ２を示す）。プルダウン実験を使用して、最良の結合体のバーコード化したヌクレオソーム性ＤＮＡを単離し、多重化実験バーコードＢＣ−ＥＸＰ１およびＢＣ−ＥＸＰ２でさらにコードし、プールし、ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）次世代配列決定装置を使用して解読し、入力に対して標準化する。ＤＮＡ設計および調製の詳細については、図１０Ａ〜Ｃを参照のこと。

【図11B】（Ｂ）能率的なワークフローにより、利用可能なヒストンから開始して、数千に相当する実験（３９種類のサイズのライブラリーを１２０種類のライブラリー実験に供する）が、１週間で可能になる。

【図12A】（Ａ）ＭＮバリアント１〜３９の線図。

【図12B】（Ｂ）ＭＮバリアント１〜３９のヒストン組成およびそれに対応するヌクレオソーム性ＤＮＡバーコードの一覧。全てのｗｔヒストンは、大腸菌において組換え的に調製した。半合成ヒストンタンパク質は、ＮＣＬによって調製した（図９ａ）。半合成Ｈ４タンパク質は、追加的なＮ末端アセチル基を含有した（表には表示していない）。

【図12C】（Ｃ）臭化エチジウム染色した無変性ポリアクリルアミドゲルによるＤＮＡライゲーション産物の評価。ｕｂ：ユビキチン；ａｃ：アセチル；ｍｅ：メチル；ｗｔ：野生型；ＭＮ：モノヌクレオソーム；ＩＤ：識別；Ｈ３Ｋａｃ₅：Ｋ９／１４／１８／２３／２７ａｃ；Ｈ４Ｋａｃ₅：Ｋ５／８／１２／１６／２０ａｃ。図１２Ｂ中の配列は、上から下へと、それぞれ配列番号１９〜５７の表示である。

【図13】無変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびそれに続くＤＮＡ臭化エチジウム染色による、バーコード化した個々のヌクレオソームライブラリーメンバーの定性分析。全てのヌクレオソームは単一のバンド（純度９０％超）を形成し、会合したヒストンタンパク質に導入した修飾に応じて、他と異なるゲル移動挙動を示した。プールした３９マーＭＮライブラリーの無変性臭化エチジウム染色ポリアクリルアミドゲルを、右に示す。ｕｂ：ユビキチン；ａｃ：アセチル；ｍｅ：メチル；ｗｔ：野生型；ＭＮ：モノヌクレオソーム。

【図14A】修飾特異的抗体およびヒストンリーダー「ブロモドメイン植物ホメオドメイン（ＰＨＤ）フィンガー転写因子ＢＰＴＦ」を使用するＭＮライブラリーのプロファイリング。（Ａ）α−Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体（ａｂ８５８０）を使用するライブラリーの免疫沈降によって、バーコード化したＭＮライブラリーの安定性を試験した。４℃での貯蔵を延長した後（白）でも、ＤＮＡスクランブリング（DNA scrambling）は観察されなかった（網掛け）。

【図14B】（Ｂ）この研究において利用した、Ｎ末端にＧＳＴタグ付けした組換え型ＢＰＴＦ構築物。Ｎ末端にＧＳＴタグ付けした構築物を大腸菌で組換え的に発現させ、グルタチオン親和性、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色によって、タンパク質の純度を評価した。

【図14C】（Ｃ、Ｄ）ＢＰＴＦ構築物を使用するバーコード化したヌクレオソームライブラリーのＧＳＴプルダウン。樹脂に結合したＢＰＴＦ−ＰＨＤ（Ｃ）、ＢＰＴＦ−ＰＨＤ−ＢＤ（Ｄ、左）およびＢＰＴＦ−ＰＨＤ（Ｄ、右）を、３９種類のヌクレオソームバリアントに対してプローブした。図１０Ｃ、Ｄで示すようにデータの処理を実行し、入力標準化配列決定リードを、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３バリアント（１に設定し、^*印で表示した；（平均±ＳＤ）％入力値を差し込み図に示す）に対してさらに標準化した。ＩＰ：入力；ＧＳＴ：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；ＰＨＤ：植物ホメオドメイン；ＢＤ：ブロモドメイン；ＣＢＢ：クマシーブリリアントブルー。

【図14D】（続き）

【図15A】ヒストンリーダーおよびライターｐ３００を使用するＭＮライブラリーのプロファイリング。（Ａ）ライブラリー結合実験において利用したＮ末端にＧＳＴタグ付けした組換え型ｐ３００構築物。Ｎ末端にＧＳＴタグ付けした構築物を大腸菌で組換え的に発現させ、グルタチオン親和性、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色によって、タンパク質の純度を評価した。

【図15B】（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＧＳＴタグ付けしたｐ３００構築物を使用するバーコード化したヌクレオソームライブラリーのＧＳＴプルダウン。樹脂に結合したＧＳＴ−ｐ３００−ＢＤ−ＰＨＤ（Ｂ、左）、ＧＳＴ−ｐ３００−ＢＤ（Ｂ、右）およびＧＳＴ−ｐ３００−ＰＨＤ（Ｃ）を、３９種類のヌクレオソームバリアントに対してプローブした。図１０Ｃ、Ｄに記載の通り、この後に、ＤＮＡ単離、精製、リバース実験多重化バーコードを使用する多重化、ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）技術を使用する配列決定、解読および入力標準化を続けた。入力標準化配列決定リードを、Ｈ４Ｋａｃ₅バリアント（１に設定し、^*印で表示した；（平均±ＳＤ）％入力値を差し込み図に示す）に対してさらに標準化した。ＩＰ：入力；ＧＳＴ：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；ＰＨＤ：植物ホメオドメイン；ＢＤ：ブロモドメイン；ＣＢＢ：クマシーブリリアントブルー。

【図15C】（続き）

【図15D】（続き）

【図16A】バーコード化したＭＮライブラリーを使用する、ｐ３００および有核細胞抽出物のヒストンライティング活性のプロファイリング。（Ａ、Ｂ）バーコード化した３９マーライブラリーを、アセチル補酵素Ａの非存在下（網掛け）または存在下（白）でｐ３００アセチル化に供した（Ａ）。図１０Ｃ、Ｄに記載の通り、Ｈ３Ｋ１８ａｃ（Ａ）またはＨ４Ｋ５ａｃ（Ｂ）に対する抗体を使用する反応産物の免疫沈降、それに続くＤＮＡ単離、精製、リバース実験多重化バーコードを使用する多重化、ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）技術を使用する配列決定、解読および入力標準化によって、部位特異的アセチル化の程度を評価した。特定部位でのアセチル化の程度を表すプルダウン効率は、％入力で表示される。

【図16B】（続き）

【図16C】（Ｃ）ヒト２９３Ｔ細胞から得られる有核細胞溶解物のヒストンライティング活性の検出。２０μＭ ＡｃＣｏＡ、１０μＭ Ｓ−アデノシンメチオニン（ＳＡＭ）および１０μＭ アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下で、バーコード化したライブラリーを有核細胞抽出物とインキュベートし、反応産物をＨ３Ｋ１４ａｃマークに特異的な抗体を使用して単離した。図１０Ｃ、Ｄに記載の通り、この後に、ＤＮＡ単離、精製、リバース実験多重化バーコードを使用する多重化、ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）技術を使用する配列決定、解読および入力標準化を続けた。

【図17】図１７は、１つ以上の態様に従ってコンピュータを実行するための典型的なアーキテクチャについて記載する。

【説明】

【0006】

この発明は、たとえば、デザイナーモノヌクレオソームのＤＮＡバーコード化ならびにクロマチンリーダー、ライター、イレーサーおよびそのモジュレーターをプロファイリングするためのクロマチンアレイライブラリーに関する。化学的に定義されたヌクレオソームのバーコード化したライブラリー、および化学的に定義されたバーコード化したポリヌクレオソームライブラリー（時にはここでデザイナークロマチンアレイライブラリーまたは「ＣＡ」と呼ばれる）を含めた、高度に並列化された定量的クロマチン生化学的構成要素および方法を提供する。

【0007】

この開示は、高スループットクロマチン生化学および生物物理学のための強力なプラットフォームのニーズを満たしている。具体的には、組換えおよび合成ヒストン（特異的な翻訳後修飾；ＰＴＭを有する）とバーコード化したＤＮＡ配列（特異的なエピジェネティック修飾、たとえばメチル化およびヒドロキシメチル化ならびに／または他の非天然の修飾を有する）ならびに／または追加的なリンカーヒストンおよび／もしくは非ヒストンタンパク質とを、デザイナーモノヌクレオソーム（ＭＮ）およびクロマチンアレイ（ＣＡ）ライブラリーへと会合させる。ヒストンおよび／またはＤＮＡ修飾は、ヌクレオソーム性修飾もしくはヌクレオソーム修飾と一般に呼ばれてもよい。時にはここで、用語クロマチン修飾が使用される。これは、天然に存在する（たとえば対象の細胞中にある）クロマチン状態を表すｉｎ ｖｉｔｒｏモデルである。適切な単離技術、たとえばプルダウン実験を使用すれば、これらのライブラリーを使用して、とりわけ（ａ）その認識パターンを調査するための一価または多価クロマチンリーダー；（ｂ）潜在的ヒストンＰＴＭおよびＤＮＡ修飾クロストークを調査するためのクロマチンライターおよびイレーサー；（ｃ）クロマチンと相互作用するタンパク質因子または酵素の活性をモジュレートするＤＮＡおよびヒストン修飾；ならびに（ｄ）クロマチンと相互作用するおよび／またはクロマチンを修飾するタンパク質因子もしくは酵素の活性をモジュレートする分子、をプロファイリングすることができる。本発明の方法および組成物および装置は、高度な並列化に適している。デザイナークロマチンライブラリーの特定の生化学的操作をコードしている追加的なバーコードをＤＮＡ分子に付着させてもよい。これらの多重化ＤＮＡ配列（その配列は（ａ）特異的なヌクレオソーム修飾、ＤＮＡの性質および型ならびにライブラリーメンバーのヒストン組成と（ｂ）特定の実験との両方をコードする）を次世代配列決定技術および他のＤＮＡ解読技術によって同時に処理する。配列決定データの分析により、基質特異性および潜在的クロストーク（ライターおよびイレーサー）ならびに相対的な結合親和性（リーダー）を明らかにすることができる。加えて、これらの実験により機構研究が可能になり、ｉｎ ｖｉｖｏで見られる大きなクロマチン関連複合体の活性に対する診断ツールとして機能することができ、その複合体は、たとえば健康なおよび癌患者の有核細胞抽出物から得られる、クロマチンリーダー、ライターおよびイレーサーがしばしば一体化している。これらの方法および組成物は、次世代のエピジェネティック薬物の合理的な設計およびプロファイリングを実現する。

【0008】

本発明の一側面は、合成された（ライブラリーに導入する前に、単離されている、合成的に作製された、細胞中でモノヌクレオソームに結合している天然に見出される構成要素を含まない、精製されている）モノヌクレオソームのライブラリーであり、ライブラリーは、２個以上（たとえば、少なくとも１０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、約１０，０００個まで、またはそれ以上）の型のモノヌクレオソーム（モノヌクレオソームの組のメンバー）を含む。ライブラリーメンバーの最小数は、２である。ライブラリーサイズの上限は、ヒストンバリアント（数百〜数千個）、ＤＮＡバリアント（数百〜数千個）および非ヒストンクロマチン関連タンパク質（数百〜数千個）の組み合わせ理論によって定義される。一例は、以下の修飾の各々のうち１つ：ヒストン翻訳後修飾（およそ数１００個）（ＥＮＣＯＤＥ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｅｔ．ａｌ．、２０１２）、ヒストンアイソフォーム（およそ数１００個）、ＤＮＡ修飾（およそ数１００個）、およびクロマチン関連タンパク質（およそ数１００個）を含有するライブラリーであり、数百〜数千個のヌクレオソームのライブラリーを得られる。別の例において、ライブラリーは、生物学的に重要な全てのクロマチン状態（クロマチン状態とは、定義されている、ヒストン翻訳後修飾、ヒストンアイソフォーム、ＤＮＡ修飾およびクロマチン関連タンパク質の天然に存在する組合せを含むクロマチン分子である）を含有し、数百、潜在的には数千個のヌクレオソームのライブラリーを得られる。別の例において、ライブラリーは特定の実験に適合させることができる。たとえば、ヌクレオソーム結合／認識におけるトリメチルリジンの役割は、天然に存在するヌクレオソームバリアント、すなわち公知のトリメチルリジン含有ヒストンバリアントの全てを含有するサブセットの画分だけを使用して解決することができ、数十〜数百個のヌクレオソームのライブラリーを得られる。別の例は、上述のライブラリー型３つ全てに由来するライブラリーメンバーを含む。

【0009】

各モノヌクレオソームは、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンＨ１を各々２コピー含有するタンパク質八量体であってヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／またはヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてヒストン修飾（ヒストン修飾は、ヒストンアイソフォーム、ＰＴＭおよび／または非天然のアミノ酸であり得る）のパターンを形成している、タンパク質八量体と、
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子（モノヌクレオソームの一部分であるＤＮＡ分子、たとえばヒストンタンパク質の八量体の周りに巻き付いている。モノヌクレオソームに存在するヌクレオソーム性ＤＮＡは、時にはここで「モノヌクレオソーム性またはモノヌクレオソームＤＮＡ」と呼ばれる。ヌクレオソーム性ＤＮＡは、ヌクレオソームと結合している。）と
の複合体を含む。ヌクレオソーム性ＤＮＡ（本明細書において、文脈に別段の明確な指図がない限り、用語「ａ」および「ｔｈｅ」は、１または１以上を指す）は、
（ｉ）強力なヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）（たとえば、その配列は、合成モノヌクレオソームのスクランブリングを防止するために十分強く結合することができ、たとえば、その配列は、およそ５０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍またはそれ以上、バルクＤＮＡより強くヒストン八量体に結合する）と、
（ｉｉ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する（たとえば、ヌクレオソーム性ＤＮＡの中、またはその一方の末端もしくはその近傍、たとえばＮＰＳから特定の距離またはＤＮＡ中の他の定点に位置する）１つ以上のＤＮＡバーコードと、任意に
（ｉｉｉ）ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／またはＮＰＳ内でのＤＮＡリンカーを含めたＤＮＡ延長部と
を含む。これらは、共有結合したＤＮＡ配列および人工的な非ＤＮＡ分子を含む。

【0010】

ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子は修飾されていなくてもよくおよび／またはＤＮＡ中のヌクレオチドのうち少なくとも１つが修飾されてＤＮＡ修飾の固有のパターンを形成していてもよい。

【0011】

任意に、モノヌクレオソームは、
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質
を含んでもよい。

【0012】

本発明の合成モノヌクレオソームライブラリーにおいて、ライブラリーの各モノヌクレオソームは、ヒストン修飾の固有のパターンおよび／またはＤＮＡ修飾の固有のパターンを有し、それによって、ヌクレオソーム修飾の固有のパターンを形成してもよい。ＤＮＡ分子は、ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置がヌクレオソーム修飾の固有のパターンを示す（と相関する、関連付けられる、既定の関係がある）１つまたはいくつかの固有のバーコードを含んでもよい。

【0013】

本発明の別の側面は、合成ポリヌクレオソーム（本明細書では合成クロマチンまたは合成クロマチンアレイ（ＣＡ）とも呼ばれる）であり、定義されたＤＮＡ分子（たとえば、定義されたＤＮＡ分子の各々は、同じかまたは異なる配列を有することができる）によって互いに結合している（互いに連結されている）２つ以上の合成モノヌクレオソーム（たとえば、少なくとも３、５、７、９、１２、１５または２０個）を含み、モノヌクレオソームは定義された結合性（互いの空間的配向）を有する。

【0014】

これらモノヌクレオソームの各々は、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンＨ１を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／またはヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてモノヌクレオソーム性ヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と；
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と；任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質と
の複合体を含む。

【0015】

本発明の合成ポリヌクレオソームにおいて、ポリヌクレオソーム中のモノヌクレオソームのモノヌクレオソーム性ヌクレオソーム修飾のパターンは、均一であってもよく、または異なっていて（固有であって）、ポリヌクレオソーム性ヌクレオソーム修飾の固有のパターンを得られてもよい。ポリヌクレオソームは、ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する（たとえば、ポリヌクレオソーム性ＤＮＡの中に、またはポリヌクレオソーム性ＤＮＡの５’もしくは３末端にまたはその近傍に内部的に位置する）（１つ以上の）バーコードを含んでもよい。ポリヌクレオソームに存在するヌクレオソーム性ＤＮＡは、時にはここで「ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ」と呼ばれる。バーコードの定義された位置は、たとえば、ヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）から特定の距離またはポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の他の定点にあってもよい。バーコードの配列とポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の位置との組合せは、ポリヌクレオソーム性ヌクレオソーム修飾の固有のパターンを示す。

【0016】

本発明の他の側面は、合成ポリヌクレオソームのライブラリー（時にはここで合成クロマチンまたは合成クロマチンアレイ（ＣＡ）と呼ばれる）であり、上記の通り２つ以上の合成ポリヌクレオソームを含む。そのようなライブラリーの各メンバーは、１つ以上の固有のバーコードを有し、ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置は、ポリヌクレオソーム性修飾の固有のパターンを示す。

【0017】

本発明のライブラリー（モノヌクレオソームライブラリーまたはポリヌクレオソームライブラリー）において、ヒストンは様々な方法のいずれかで修飾されてもよい。これらの修飾は、たとえば、ヒストンアイソフォーム、ＰＴＭおよび／または非天然のアミノ酸を含んでもよい。

【0018】

ヒストンアイソフォームまたはバリアントは、天然に存在してもまたは人工でもよい。それらは、タンパク質配列内のアミノ酸置換（たとえば最も一般的なヒストンＨ３バリアントは、Ｈ３．１、Ｈ３．２、Ｈ３．３である）もしくはアミノ酸挿入またはタンパク質配列の末端での延長（たとえばマクロＨ２Ａ）によって特徴づけられる。ヒトにおけるヒストンアイソフォームの部分的な一覧としては、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ：
Ｈ２ＡＦ、Ｈ２ＡＦＢ１、Ｈ２ＡＦＢ２、Ｈ２ＡＦＢ３、Ｈ２ＡＦＪ、Ｈ２ＡＦＶ、Ｈ２ＡＦＸ、Ｈ２ＡＦＹ、Ｈ２ＡＦＹ２、Ｈ２ＡＦＺ、Ｈ２Ａ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＤ、マクロ−Ｈ２Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＭ、Ｈ２Ａ２ ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ３、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＣ
（ｂ）ヒストンＨ２Ｂ：
Ｈ２ＢＦ、Ｈ２ＢＦＭ、Ｈ２ＢＦＳ、Ｈ２ＢＦＷＴ、Ｈ２Ｂ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＤ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＥ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＦ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＩ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＬ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ、Ｈ２Ｂ２、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ
（ｃ）ヒストンＨ３：
Ｈ３Ａ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｊ、Ｈ３Ａ２、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｃ、Ｈ３Ａ、ＨＩＳＴ３Ｈ３、ＣＥＮＰ−Ａ
（ｄ）ヒストンＨ４：
Ｈ４１、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｇ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ、Ｈ４４、ＨＩＳＴ４Ｈ４
（ｅ）リンカーヒストンＨ１：
Ｈ１Ｆ、Ｈ１Ｆ０、Ｈ１ＦＮＴ、Ｈ１ＦＯＯ、Ｈ１ＦＸ、Ｈ１Ｈ１、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｔ
がある。

【0019】

他のヒストンアイソフォームは、当業者に明らかである。

【0020】

加えて、ヒストンにおける変異が癌で観察され（たとえば、Ｈ３．３のテール中のＬｙｓ２７Ｍｅｔは、小児の脳幹部腫瘍において頻繁に発生する）、そのような変異体もまた、本発明のライブラリーに含めることができる。

【0021】

ヒストンの様々なＰＴＭが、当業者に明らかである。ＰＴＭには、任意の天然に存在するヒストン修飾、たとえば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ＳＵＭＯ化、グリコシル化、アルキル化、アシル化、プロリルシス／トランス異性化、ニトロシル化および酸化がある。まだ発見されていないまたは特徴づけられていないＰＴＭも、本発明に含まれる。

【0022】

非天然のアミノ酸にはＰＴＭの合成類似体があり、その類似体は、当業者に明らかになる化学的および／または生化学的に不活性な、光架橋剤、蛍光標識、同位体標識その他であり得る。

【0023】

修飾は、ヌクレオソーム中の１つの部位、または２つ以上の部位で発生し得る。

【0024】

ここでは、「バーコード」とは、ＤＮＡ分子中のその位置と併せて使用して、たとえばヌクレオソームのライブラリーの中で、そのＤＮＡ分子を明確に同定することができる核酸配列である。バーコードの数は、使用されるライブラリーの複雑さによって決定され、ヒストンバリアント（ここで示す例において、これらのヒストンは、ヒストンＰＴＭ状態が異なっている）、ＤＮＡ配列、固有のヌクレオソームを形成するのに使用される追加のクロマチン関連タンパク質、またはクロマチンアレイバリアントの数および組合せによって決まる。たとえば、１ヌクレオチド（ｎｔ）のバーコードは、４個のライブラリーメンバー、２ｎｔバーコードは１６個のバリアント、３ｎｔバーコードは６４個のバリアント、４ｎｔは２５６個のバリアント、５ｎｔは１，０２４個のバリアントなどをコードすることができる。ＤＮＡバーコードの長さは、ライブラリーのサイズによって決定される。ライブラリーサイズに応じて、ＤＮＡバーコードは、ライブラリーの各メンバーを一意的にコードするために十分な数の変形を生成するのに十分ないくつかの塩基を有する。バーコードは、（ここで例に示すように）一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡもしくは二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡまたはその組合せであり得る。

【0025】

本明細書に記載した例では、６ヌクレオチドバーコードが使用され、そのバーコードは、４，０９６個の異なるヌクレオソームまたはクロマチンアレイバリアントを原理的にはコードする。一般に、長さ４〜１２ヌクレオチドのバーコードは、現実的なサイズのライブラリーを有するほとんどの用途を包含するが、より大きな組合せ冪数が必要な場合には、バーコードをより長くすることができる。

【0026】

「ヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）」は、ヒストンおよびヒストン複合体、特にはヒストン八量体（２コピーのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４からなる）と強く相互作用する少なくとも１４６塩基対の天然または合成の二本鎖ＤＮＡ配列である。ＮＰＳは、ＤＮＡに対して特異的な位置および配向のヒストン八量体を有するヌクレオソームを形成する。ヒストン−ＤＮＡ複合体は、長期間の貯蔵（４℃で数か月）の間、および標準的な生化学的操作の間（一般的な緩衝液中の低い数十ナノモル（ｎＭ）の濃度で、３０℃で数時間）は安定でなければならない。ここで例に使用されるＮＰＳは、６０１と呼ばれる人工配列であり、バルクＤＮＡよりおよそ１００倍強くヒストン八量体に結合する（Ｌｏｗａｒｙ ＆ Ｗｉｄｏｍ、１９９８）。上述の基準を満たす任意の代替の人工的なまたは天然のＤＮＡ配列、その多くは当業者に明らかになる、を使用することができる。たとえば、ＮＰＳは、およそ１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、またはそれ以上、バルクＤＮＡより強くヒストン八量体に結合することができる。

【0027】

本発明のモノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームＤＮＡのＤＮＡ延長部は、任意の様々な形態をとることができる。たとえば、それらはＤＮＡバーコード、（たとえば下流の配列決定読み出し用またはＰＣＲ増幅用の）ＤＮＡプライミング部位、（次節において概説するような）ＤＮＡリンカー、代替の位置決定配列、（追加的なヒストンまたは非ヒストンタンパク質用の）タンパク質結合部位、酵素ＤＮＡ基質、塩基を修飾したＤＮＡ、または他の人工的な非ＤＮＡ分子、たとえば親和性ハンドル（affinity handle）（たとえばビオチン）もしくは蛍光プローブであり得る。

【0028】

本発明のモノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームＤＮＡ中のＤＮＡリンカーは、様々な長さおよび組成のものであり得る。実際には、ヌクレオソームは、通常約１０〜９０ｂｐのリンカーＤＮＡによって分離されている。これらのリンカーは、異なる組織、種の間でまたは単一細胞のゲノム内でも、および塩基組成中で異なる。人工的なリンカーは、ヒストン八量体を包み込まないことによって特徴づけられる。実質的には、より長い配列はＤＮＡ鎖上におけるヒストンの位置決定を混乱させる可能性があるので、ＤＮＡ付加物の上限は１００〜１０００ｂｐの範囲である。

【0029】

本発明のモノヌクレオソームもしくはポリヌクレオソームＤＮＡは、１つ以上の、修飾されていないＤＮＡ塩基、天然に存在する修飾、たとえばメチル化、アルキル化もしくは酸化を有する塩基、または人工的な修飾を有する塩基を含むことができる。様々な適切な修飾が当業者には明らかである。

【0030】

様々な非ヒストンクロマチン関連タンパク質が当業者に明らかであり、転写因子、ヒストン相互作用物質および修飾物質、ならびにクロマチン再形成タンパク質がある。

【0031】

本発明の別の側面は、たとえばここで記載される方法のうち１つを実施するための、キットである。キットは、ヌクレオソーム（モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソーム）または本発明のモノヌクレオソームもしくはポリヌクレオソームライブラリーを含んでもよい。キットは、各固有のバーコードとヌクレオソーム修飾の固有のパターンとの間の相関（関係、関連、既定の関係）を示す一覧（解説、アルゴリズム、要約、コンピュータ読み込み可能な媒体など）を含んでもよい。この型の典型的な一覧を、図１２Ｂに示す。本発明の態様において、ヌクレオソームまたはライブラリーは、試験管、マルチウエルプレートのウェルもしくは微小流体装置の反応チャンバー内にある。本発明のキットの他の任意の要素は、適切な緩衝液、媒体構成要素、基質、補因子、阻害剤など；アッセイ結果を記憶および／または評価するためのコンピュータもしくはコンピュータ読み込み可能な媒体；または包装材料を含む。

【0032】

本発明の別の側面は、クロマチンリーダー認識パターンおよび親和性の特異性、クロマチンライターおよびイレーサーの特異性およびクロストークを決定する方法であって、本発明のライブラリーを１つまたはいくつかの組換えに由来するクロマチン相互作用物質および／また修飾物質とインキュベートする（接触させる）ことと、または本発明のライブラリーを調査しようとする細胞系（たとえば、ヒト癌患者から得られる細胞を含める）の有核細胞抽出物から得られるクロマチン相互作用物質および／もしくは修飾物質とインキュベートすることと、結合したおよび／または修飾されたライブラリーメンバーを単離することと、結合したまたは修飾されたライブラリーメンバーおよび任意の付加されたマークまたは除去されたマークを同定および／または定量することとを含む。本方法は、大きなクロマチン再形成複合体を分析することを含んでもよい。本方法は、ヒト癌患者から得られる細胞を含めた、細胞系を分析することを含んでもよい。

【0033】

本発明の別の側面は、相互作用物質または修飾物質に関連する修飾を同定する方法であり、本発明のライブラリーを用いて１を超える数のクロマチン相互作用物質および／または修飾物質を多重化することと、修飾に従ってライブラリーを同数のサブライブラリーに分けることと、各相互作用物質または修飾物質に関連する修飾を同定することとを含む。

【0034】

本発明の別の側面は、エピジェネティック薬物の特異性を同定し、プロファイリングする方法であって、候補分子を本発明のライブラリーと組み合わせることと、ヌクレオソーム修飾のモジュレーション（たとえば、クロマチンと相互作用しているタンパク質因子または酵素を阻害するまたは作動させる）を検出することとを含み、それによって、ヌクレオソーム修飾をモジュレートする候補エピジェネティック薬物を同定する、方法である。

【0035】

本発明の別の側面は、ＤＮＡバーコードおよび関連するヌクレオソーム修飾ならびにバーコード化した各ヌクレオソームの組成の一覧と組み合わせたヌクレオソームのライブラリーである。

【0036】

本発明の別の側面は、ＤＮＡ分子の５’および／もしくは３’末端にまたはその中のどこかにＤＮＡバーコードを含む、合成モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームである。

【0037】

本発明の別の側面は、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンＨ１を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／またはヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてヒストン修飾（たとえば、ヒストンアイソフォーム、ＰＴＭおよび／または非天然のアミノ酸）のパターンを形成している、タンパク質八量体と、
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）強力なヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、
（ｉｉ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する（たとえば、ヌクレオソーム性ＤＮＡの中、その一方の末端もしくはその近傍、たとえばＮＰＳから特定の距離またはＤＮＡ中の他の定点に位置する）１つ以上のＤＮＡバーコードと、
（ｉｉｉ）ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／またはＮＰＳ内でのＤＮＡリンカーを含めたＤＮＡ延長部（たとえば、共有結合したＤＮＡ配列および人工的な非ＤＮＡ分子）と
を含むヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質と
の複合体を含み、ヌクレオソーム性ＤＮＡ中のバーコードの配列および位置が、モノヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾のパターンを示す、合成モノヌクレオソームである。

【0038】

本発明の別の側面は、ヒストンタンパク質とバーコード化したヌクレオソームＤＮＡとを組み合わせることを含む、本発明のモノヌクレオソームを会合させる方法である。本方法は、たとえば、ヒストンタンパク質およびバーコード化したヌクレオソーム性ＤＮＡとビオチンタグ付けしたＭＭＴＶ緩衝ＤＮＡとを既定の比で組み合わせることを含んでもよい。任意の、ＭＭＴＶ以外の様々な配列およびビオチン以外の親和性タグを使用することができる。適切な配列および親和性タグは、当業者に明らかである。

【0039】

本発明のライブラリーにおいて、モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソーム中のＮＰＳは一般に十分に強力であり、それにより、ライブラリーは安定し、貯蔵を延長した後でも、たとえば４℃で少なくとも１カ月間、モノヌクレオソームとポリヌクレオソームライブラリーメンバーの間で有意なＤＮＡスクランブリングが発生しない。本発明の側面において、ヒストンおよび／またはＤＮＡ修飾は、生物学的に重要なクロマチン状態の代表的なセットを含む。本発明の側面において、モノヌクレオソームとポリヌクレオソームライブラリーメンバーの比は、等モル（各ライブラリーメンバーについて１：１）であるかまたは等モルでなく、固定された既定の比でライブラリーメンバーの１つまたはサブセット（たとえば、１〜１０００の範囲、たとえば１、１０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００）に対して１〜１０００（たとえば、１：１０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００）の範囲である。

【0040】

本発明の態様は、以下を含む。

【0041】

（Ａ）各ＭＮまたはＣＡライブラリーメンバーの合成履歴をバーコード化しているＤＮＡ
この態様は、デザイナーモノヌクレオソーム（ＭＮ）およびデザイナークロマチンアレイ（ＣＡ）ライブラリーの製造に関し、各ライブラリーメンバーは、各ＭＮまたはＣＡバリアントに特異的な合成履歴をコードするＤＮＡバーコードを保有する。

【0042】

ＭＮは、
（１）標準的なヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（またはその修飾された変形）、ならびに場合によってはリンカーヒストンＨ１を２コピー含有するタンパク質八量体と、
（２）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）強力なヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、
（ｉｉ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する（たとえば、ヌクレオソーム性ＤＮＡの中、その一方の末端もしくはその近傍、たとえばＮＰＳから特定の距離またはＤＮＡ中の他の定点に位置する）１つ以上のＤＮＡバーコードと、
（ｉｉｉ）ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／またはＮＰＳ内でのＤＮＡリンカーを含めたＤＮＡ延長部（たとえば、共有結合したＤＮＡ配列および人工的な非ＤＮＡ分子）と
を含むヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質と
からなる複合体である。

【0043】

具体的に、ＭＮライブラリーの各メンバーは、
（ａ）ヒストンアイソフォーム、ヒストンＰＴＭパターン、非天然のアミノ酸を有するヒストンを含めたヒストンバリアントの固有の組合せ、ならびに
（ｂ）ＮＰＳ、ＤＮＡバーコードおよび／またはＤＮＡ延長部を含有する固有のヌクレオソーム性ＤＮＡバリアント
を保有する。ＤＮＡは、標準的なＤＮＡ塩基、天然に存在する修飾（たとえばメチル化または酸化）を有する塩基、または人工的な修飾を有する塩基のいずれか、および任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質を含有することができる。

【0044】

異なるヒストンＰＴＭおよび／もしくはＤＮＡ修飾パターンならびに／または他のヒストンおよび非ヒストンタンパク質を有する各固有のＭＮ組成は、ヌクレオソーム性ＤＮＡ内のどこか、末端、たとえば５’末端、またはその近傍のＤＮＡ配列（ここではＭＮバーコードと呼ばれる）中にコードされている（図１）。ライブラリーサイズの上限は、ヒストンとＤＮＡバリアントとの組み合わせ理論によって定義される。実用的な理由により、ライブラリーのサイズは下流の実験によって定義され、通常は数十〜数百〜数千個のライブラリーメンバーの範囲である。たとえば、サイズは、約１０、２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００個またはそれ以上のライブラリーメンバーであってもよく、またはより小さくてもより大きくてもよい。

【0045】

ＣＡは、ＭＮ単位（上のＭＮ定義を参照のこと）からなる複合体であり、（ａ）均一に修飾する、または（ｂ）一意的に修飾することができる。アレイの長さは可変であり、通常は２〜１２ＭＮの範囲、たとえば二量体、三量体、五量体などである。ＭＮは、定義された配列で互いに接続されている。合成モノヌクレオソームとは対照的に、合成クロマチンアレイは、ポリヌクレオソームとここで呼ばれてもよい。

【0046】

その数は、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８または２０までの任意の数であってよい。

【0047】

ＣＡライブラリーの各メンバーは、定義された接続度で別々に修飾されたＭＮからなり、
（ａ）
（ｉ）ヒストンアイソフォーム、ヒストンＰＴＭパターン、非天然のアミノ酸を有するヒストンを含めたヒストンバリアントの固有の組合せ、
（ｉｉ）１つまたはいくつかの異なるＮＰＳ、ＤＮＡバーコードおよび／またはＤＮＡリンカーを含有する固有のヌクレオソーム性ＤＮＡバリアントを有するＭＮを保有する。ＤＮＡは、標準的なＤＮＡ塩基、天然に存在する修飾（たとえばメチル化または酸化）を有する塩基、もしくは人工的な修飾を有する塩基のいずれか、ならびに／または
（ｃ）リンカーヒストンおよび／もしくは他の非ヒストンタンパク質を含有することができる。

【0048】

タンパク質ＰＴＭおよび／もしくはＤＮＡ修飾パターン、ＭＮ接続性、ＤＮＡの長さおよび同一性、リンカーヒストンの存在および修飾パターン、ならびに／または非ヒストンタンパク質は、アレイＤＮＡ内のどこか、末端、たとえば５’末端、またはその近傍のＤＮＡ配列（ここではＣＡバーコードと呼ばれる）中にコードされている（図２）。ライブラリーサイズの上限は、個々のＰＴＭおよび／もしくはＤＮＡ修飾、ＭＮ接続度、ＤＮＡバリアント、リンカーヒストンならびに／または非ヒストンタンパク質の組み合わせ理論によって定義される。実用的な理由により、ライブラリーのサイズは下流の実験によって定義され、通常は数百〜数千個のライブラリーメンバーの範囲である。

【0049】

ＭＮまたはＣＡバーコードは、ライブラリー内のＭＮもしくはＣＡの化学組成に一意的かつ明確なタグを付ける。これらのバーコード化したライブラリーは、様々な生化学的および生物物理学的な仮説を試験することと生成することの両方、たとえば（ＤＮＡコード化化学ライブラリーに基づく既存の手順（Ｂｕｌｌｅｒ、Ｍａｎｎｏｃｃｉ ＆ Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ、２０１０；Ｃｌａｒｋ、２０１０）と類似する）バーコード解読の過程によってクロマチン相互作用物質または修飾物質の基質特異性をプロファイリングすること、に使用することができる（図３）。適切な方法としては、
（１）制限消化
（２）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
（３）ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション
（４）ＤＮＡ配列決定、たとえば次世代配列決定（Ｍａｒｄｉｓ、２００８）技術ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０１１）またはＩｌｌｕｍｉｎａ
がある。

【0050】

ＤＮＡ配列決定の場合に、必要とするフォワード（ＦＷ）およびリバース（ＲＶ）配列決定プライミング部位は、たとえば分子クローニング、ＰＣＲまたはＤＮＡライゲーションによって、過程の任意の段階でヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡに付加することができる。

【0051】

特に、読み出しに次世代配列決定技術（Ｍａｒｄｉｓ、２００８）を使用する場合、望ましい生化学的または生物物理学的特性を有するＭＮもしくはＣＡの識別に加えて、単離したライブラリーメンバーの定量化が実行可能である。下に概説するように、たとえば定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるＤＮＡ絶対定量工程と組み合わせて、配列決定前にＭＮまたはＣＡ基質の相対的結合親和性を一回の多重化実験で得ることができる。

【0052】

たとえば、組換え起源のもしくは有核細胞抽出物から得られる、クロマチンと相互作用する（たとえばクロマチンリーダー）またはクロマチンを修飾する（たとえばクロマチンライターまたはイレーサー）タンパク質を、バーコード化したＭＮもしくはＣＡライブラリーとインキュベートする（図３）。この例に記載される特定の場合において、それは、ＭＮ形成の前に、ヌクレオソーム性Ｗｉｄｏｍ６０１ ＤＮＡ、ヒストン八量体が高い親和性で結合する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの人工的な領域１４７ｂｐ、の５’末端で付着しているｄｓバーコードを有するＭＮライブラリーである（Ｌｏｗａｒｙ ＆ Ｗｉｄｏｍ、１９９８）。ライブラリーのサイズおよび組成は、モジュール方式で下流の実験に適合させることができる。以下の工程において、望ましい生化学的または生物物理学的な特性を有するＭＮまたはＣＡ基質が、
（１）プルダウン（親和性または免疫沈降）実験
（２）ＭＮもしくはＣＡの結合または修飾に応じた異なる物理的または化学的特性による分離、たとえば電気泳動移動度（電気泳動移動度シフトアッセイ）、疎水性、電荷（イオン交換クロマトグラフィー）、またはサイズ（サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ）
（３）
（１）相互作用物質（クロマチンリーダー）のタギングと
（２）直接単離（たとえば蛍光ベース分子選別を使用する）またはさらなる生化学的もしくは化学的官能化のための相互作用物質（クロマチンリーダー）に対する標識（親和性、化学的ハンドル、蛍光プローブ）と
（３）相互作用物質（クロマチンリーダー）を認識する二次タンパク質と
（４）付着したまたは除去されたマーク（クロマチン修飾物質）に対する抗体と
（５）付着したまたは除去されたマーク（クロマチン修飾物質）を認識する二次タンパク質（リーダー）と
（６）直接単離（たとえば蛍光ベース分子選別技術を使用する）またはさらなる生化学的もしくは化学的官能化のための人工的な標識（親和性、化学的ハンドル、蛍光プローブ）を有する修飾された酵素基質（クロマチン修飾物質）と
を使用する蛍光活性分子細胞選別（ＦＡＭＳ）
を含めた適切な方法によって単離される。

【0053】

たとえば、タンパク質または付着したもしくは除去された修飾に対する抗体を使用して、（ａ）最も強くＭＮもしくはＣＡ結合体と複合体化したクロマチン相互作用物質、たとえばリーダーをプルダウンする、または（ｂ）クロマチン修飾物質、たとえばライターまたはイレーサーの好ましいＭＮもしくはＣＡ基質を単離する。ＤＮＡ単離の後に、たとえばＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ配列決定（Ｍａｒｄｉｓ、２００８）、たとえばＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）もしくはＩｌｌｕｍｉｎａといった方法論を使用してＭＮもしくはＣＡバーコードを解読することにより、クロマチン相互作用物質または基質を同定し、定量化する。

【0054】

（Ｂ）各ＭＮまたはＣＡライブラリーメンバーの実験履歴のＤＮＡバーコード化
この態様は、生化学的または生物物理学的な過程による操作、たとえばクロマチン相互作用タンパク質およびクロマチン修飾酵素の阻害剤ならびに／または活性化因子を含めた、その過程をモジュレートする追加的な分子の存在下における生化学的なまたは生物物理学的な操作を含む。ＤＮＡバーコード化は、小分子ライブラリー（Ｂｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｃｌａｒｋ、２０１０；Ｋｌｅｉｎｅｒ、Ｄｕｍｅｌｉｎ ＆ Ｌｉｕ、２０１１）および抗体（Ａｇａｓｔｉ、Ｌｉｏｎｇ、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｌｅｅ ＆ Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ、２０１２；Ｋｒｕｔｚｉｋ ＆ Ｎｏｌａｎ、２００６）を標識する異なる状況で公知である。

【0055】

たとえば、バーコード化したＭＮもしくはＣＡライブラリーは、様々な生化学的または生物物理学的な過程によって操作される（図４）。この例に記載される特定の場合において、それは、ＭＮ形成の前に、ヌクレオソーム性６０１ ＤＮＡの５’末端で付着しているバーコードを有するＭＮライブラリーである。操作工程は、別々のバーコード（ここでは実験バーコードと呼ばれる）にその後コードされる。

【0056】

バリアントＡ：実験が１つの実験操作工程にしか供されない場合、実験（多重化）バーコードは、基質およびＤＮＡの単離後にＰＣＲによって付着させることができる。このＰＣＲ工程において、ＭＮまたはＣＡバリアントの同一性は、ＭＮまたはＣＡバーコードと実験（多重化）バーコードの両方を含有するＤＮＡ配列の生成によって特定の実験と結びつけられる。その後の配列決定用としてＦＷおよびＲＶプライミング部位も含む、二重バーコード化したＤＮＡ配列の長さは、選んだＤＮＡ塩基配列決定法による信頼できる読み出し長に制限される。

【0057】

バリアントＢ：複数の実験操作が実行される場合、各ライブラリーメンバーのヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡの５’もしくは３’末端に実験バーコードを付着させることができる。

【0058】

上で概説したように、特定の生化学的または生物物理学的過程による操作を受けたサブライブラリーが、適切な方法によって単離され、実行した特定の操作をコードしているバーコードが、全てのサブライブラリーメンバーにライゲーションされる。他と異なるようにバーコード化したライブラリーをプールし、生化学的または生物物理学的な第２の過程によるその後の操作のために再び分割し、最初の工程について記載したように、第２の実験のバーコードをＤＮＡの５’または３’末端に付着させることによって扱う。これは、必要なだけ繰り返すことができる。最後のバーコード化工程において、たとえばＤＮＡライゲーションによって、ＦＷ配列決定プライミング部位を同様に付着させる。ＤＮＡ単離の後に、ＰＣＲによってＤＮＡ配列決定用のＲＶプライミング部位が付加される。それぞれのＭＮまたはＣＡは、ＤＮＡ配列決定を使用して操作バーコードおよびＭＮもしくはＣＡバーコードを解読することによって同定され、定量化される。この方法は、クロマチン相互作用物質および／もしくは修飾物質、たとえばクロマチンリーダー、ライターもしくはイレーサーまたは組換え起源の活性または機能をモジュレートする、または有核細胞抽出物から得られる分子（たとえば小分子またはより大きな生体分子、たとえばペプチドもしくはタンパク質）の存在下で実験に適合させることができる。

【0059】

実験バーコードは、ＭＮまたはＣＡバリアントが実験を通じて受けた各生化学的または生物物理学的な過程を明確にコードしている。モノヌクレオソームおよび合成クロマチンアレイライブラリーは、以前に様々な方法で自然界から単離されたヌクレオソームおよびクロマチンアレイと異なり、たとえば合成されており、化学的に純粋であり、制御されたパターンで所定のヒストンおよびＤＮＡ修飾を含有し、所与のモノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームバリアントを指定する１つ以上の固有のバーコードを有する。ここでの他の場所で述べたように、強力で定義されたＮＰＳ配列も含み、天然の基質を含む生物から得られるクロマチンは未知の修飾を有し、バーコード化されていないので、本発明のライブラリーには、または本発明の合成モノヌクレオソームおよびアレイを使用して達成されるような操作もしくはタギングには不適である。

【0060】

ＤＮＡをバーコード化する記載した組成物および方法を利用して、（１）ＭＮおよびＣＡと相互作用するならびに／またはそれを修飾する分子をスクリーニングおよび／またはプロファイリングすること；（２）クロマチン相互作用物質および／または修飾物質ならびにＭＮもしくはＣＡバリアントに関して好ましいＭＮもしくはＣＡ基質特異性を発見および／またはプロファイリングすること；（３）クロマチン相互作用物質および／または修飾物質をモジュレートする分子を発見し、プロファイリングすること；（４）その生化学的および生物物理学的特性に関してＭＮおよびＣＡバリアントをプロファイリングすることができる。本発明による方法は、
（１）クロマチン相互作用物質、たとえばヒストンリーダー、ならびに特定のＰＴＭおよび／またはＤＮＡ修飾パターンに対するそれらの好ましい結合をプロファイリングすることを含む。

【0061】

たとえば（ａ）１つもしくは（ｂ、ｃ）複数のリーダーモジュール（（ｂ）１つのポリペプチド鎖内または（ｃ）より大きなタンパク質複合体内にある異なるポリペプチド鎖上に存在する（図５））のいずれかを含有するクロマチンリーダーまたはその変形を、バーコード化したライブラリー（この例では、ヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡの５’末端に１つだけバーコードを含有する）と溶液中でインキュベートする。別の手法として、研究しようとする生物の有核細胞溶解物を調製し、バーコード化したライブラリーとインキュベートすることができる。これに続けて、たとえばクロマチンリーダーまたはリーダーに付着している親和性タグの抗体プルダウンによって、ＭＮもしくはＣＡ結合体を単離する。ＤＮＡ単離後に、第２のバーコード、または特定の（プルダウン）実験をコードする多重化（「ＭＰ」）、ならびにＤＮＡ配列決定用のＦＷおよびＲＶプライミング部位が、ＰＣＲによって付加される。（注：任意に、ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。ＤＮＡ配列決定を使用してＭＮまたはＣＡおよび多重化バーコードを解読することにより、好ましい結合体を同定する。多重化ＰＣＲ工程により、たとえば様々なタンパク質／ＭＮ濃度、様々なリーダー、その切断または変異体を使用する複数の実験を並列に実行して、単一の配列決定工程で読み出すことができる。

【0062】

（２）クロマチン修飾物質、たとえばヒストンライターまたはイレーサー、およびその好ましい基質修飾認識パターンのプロファイリング
任意の必要とされる基質、たとえばＳアデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、アセチル補酵素Ａ（ＡｃＣｏＡ）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下で、クロマチンライターもしくはイレーサーまたはその変形、たとえば（ａ）触媒ドメイン（ｂ）全長酵素または（ｃ）大きなマルチサブユニット複合体（図６）をライブラリー（この特定の場合において、ヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡの５’末端に１つだけバーコードを含有する）とインキュベートする。別の手法として、研究しようとする生物の有核細胞溶解物を調製し、任意の必要とされる基質、たとえばＳＡＭ、ＡｃＣｏＡおよびＡＴＰの存在下で、バーコード化したライブラリーとインキュベートすることができる。この工程に続けて、たとえば付着したまたは除去されたマークの抗体プルダウンにより、クロマチンライターもしくはイレーサーによって成功裏に修飾されたＭＮまたはＣＡ基質を単離する。クロマチンライターの場合、付着しているマークに対する抗体を使用してクロマチンライターによって修飾されたＭＮ／ＣＡをプルダウンする。クロマチンイレーサーの場合、除去されたマークに対する抗体を使用してクロマチンイレーサーに標的されなかったＭＮ／ＣＡを取り去り、後にヒストンイレーサーの好ましい基質を残す。ＤＮＡ単離後に、第２のバーコード、または特定の実験をコードする多重化、ならびにＤＮＡ配列決定用のＦＷおよびＲＶプライミング部位が、ＰＣＲによって付加される（注：任意に、ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。ＤＮＡ配列決定を使用してＭＮまたはＣＡおよび多重化バーコードを解読することにより、基質を同定する。多重化ＰＣＲ工程により、たとえば様々なタンパク質／ＭＮ濃度、様々な酵素、その切断または変異体を使用する複数の実験を並列に実行して、単一の配列決定工程で読み出すことができる。

【0063】

（３）細胞系のエピジェネティックシグネチャーのプロファイリング
上で概説した戦略を使用して、核抽出物中で、ヒストン修飾物質活性を同様に便利にアッセイすることができる。この構成により、クロマチン修飾活性および特異的クロストークの識別が可能になり、その幾つかは所与の細胞型の特性である。特には、癌細胞は固有のクロマチン修飾傾向を有する。たとえば、ＥＺＨ２は悪性乳癌のマーカーであり（Ｋｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３）、組織サンプルからの存在量より酵素活性を測定する能力は、診断価値が高い（Ｓｐａｃｉｌ ｅｔ ａｌ．２０１３）。バーコード化したヌクレオソームライブラリーを組織生検由来核抽出物とインキュベートして、固有の細胞型および病状に対するクロマチン修飾（たとえばヒストンおよび／またはＤＮＡ修飾）のシグネチャーをカタログ化し、それによって核生化学の機能不全の診断が可能になる。

【0064】

（４）ＭＮ安定性のプロファイリング
バーコード化したＭＮライブラリー（この特定の場合において、ヌクレオソーム性ＤＮＡの５’末端に１つだけバーコードを含有する）を、ＭＮを不安定化する様々な実験条件、たとえば高塩濃度、に暴露する（図７）。別の手法として、研究しようとする生物の有核細胞溶解物を調製し、バーコード化したライブラリーとインキュベートすることができる。各塩増加後のヌクレオソーム性ＤＮＡの遊離を使用して、それぞれのＭＮの安定性を観察した。ＤＮＡ単離後に、第２のバーコード、または特定の実験、たとえば使用した塩濃度をコードする多重化、ならびにＤＮＡ配列決定用のＦＷおよびＲＶプライミング部位が、ＰＣＲによって付加される。（注：任意に、ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。ＤＮＡ配列決定を使用してＭＮおよび多重化バーコードを解読することにより、他と異なる安定なＭＮを同定する。これらの安定性テストを、ＭＮ安定性をモジュレートするタンパク質、たとえばヒストンシャペロンまたはクロマチン再形成因子の存在下における実験に拡張し、並列に実行して、多重化ＰＣＲ工程により単一の配列決定工程で読み出すことができる。

【0065】

（５）ＣＡ安定性のプロファイリング
ＣＡライブラリー（この特定の場合において、アレイＤＮＡの５’末端に１つだけバーコードを含有する）を、クロマチンアレイを不安定化する実験条件、たとえば高塩濃度、に暴露する（図７と類似する）。別の手法として、研究しようとする生物の有核細胞溶解物を調製し、バーコード化したライブラリーとインキュベートすることができる。各塩増加後のクロマチンＤＮＡの遊離を使用して、それぞれのＣＡの安定性を観察した。ＤＮＡ単離後に、第２のバーコード、または特定の実験、たとえば使用した塩濃度をコードする多重化、ならびにＤＮＡ配列決定用のＦＷおよびＲＶプライミング部位が、ＰＣＲによって付加される。（注：任意に、ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。ＤＮＡ配列決定を使用してＣＡおよび多重化バーコードを解読することにより、他と異なる安定なＣＡを同定する。これらの安定性テストを、アレイ安定性をモジュレートするタンパク質、たとえばヒストンシャペロンまたはクロマチン再形成因子の存在下における実験に拡張することができ、並列に実行して、多重化ＰＣＲ工程により単一の配列決定工程で読み出すことができる。

【0066】

（６）ＣＡ接触性のプロファイリング
ＣＡライブラリーを、ＭＮおよび／またはＣＡの折りたたみをモジュレートする実験条件、たとえば高い塩濃度、に暴露する。別の手法として、研究しようとする生物の有核細胞溶解物を調製し、バーコード化したライブラリーとインキュベートすることができる。ＣＡライブラリーメンバーの接触性は、様々な方法によって、たとえばＣＡ内に固定されているＰＴＭパターンの認識（たとえばヒストンリーダーによる）によって、またはたとえばＣＡ ＤＮＡ内に埋め込まれている転写因子に対するＤＮＡ結合部位の認識によって調査することができる。ＤＮＡ単離後に、第２のバーコード、または特定の実験をコードする多重化、ならびにＤＮＡ配列決定用のＦＷおよびＲＶプライミング部位が、ＰＣＲによって付加される（注：任意に、ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。ＤＮＡ配列決定を使用してＣＡおよび多重化バーコードを解読することにより、それぞれのＣＡを同定する。これらの接触性テストを、クロマチンアレイの圧縮／圧密緩和をモジュレートするタンパク質の存在下における実験に拡張することができ、実験を並列に実行して、多重化ＰＣＲ工程により単一の配列決定工程で読み出すことができる。

【0067】

（７）クロマチン相互作用物質および修飾物質、たとえばヒストンリーダー／ライター／イレーサーの活性をモジュレートする分子のスクリーニング
推定される阻害剤を含有する分子ライブラリーメンバー（たとえば小分子、ペプチド、核酸、ペプチド−核酸、フォルダマー）の存在下で、１つまたはいくつかのバーコード化したＭＮもしくはＣＡを対象のクロマチンリーダー、ライターまたはイレーサーとインキュベートする（図８）。ＭＮまたはＣＡ基質の選択は、特定の実験においてどのリーダー、ライターまたはイレーサーが使用されるかによって決定される。別の手法として、研究しようとする生物の有核細胞溶解物を調製し、分子ライブラリーの存在下でバーコード化したライブラリーとインキュベートすることができる。各インキュベーション工程の後に、使用したそれぞれの候補分子をコードしているバーコード（ここでは阻害剤バーコードと呼ばれる）およびＦＷプライミング部位を、ヌクレオソーム性またはクロマチンＤＮＡの５’末端に付加する。ＭＮ／ＣＡをプールし、たとえば（（ａ）付着したもしくは（ｂ）除去されたマークまたは（ｃ）リーダーに対する）プルダウンによって、使用した特異的分子によりクロマチン相互作用または修飾が損なわれたサブライブラリーの単離を実行する。ＤＮＡ単離の後に、ＰＣＲによってＤＮＡ配列決定用のＲＶプライミング部位が付加される（注：任意に、ＦＷおよび／またはＲＶプライミング部位は、ＭＮ形成の前にヌクレオソーム性ＤＮＡに含めることもできる）。ＤＮＡ配列決定を使用して阻害剤バーコードを解読することにより、ヒットを同定する。

【0068】

以下は、ヒストン修飾、ヒストン修飾物質（ヒストンライターおよびイレーサーを含む）、ヒストンリーダー、ＤＮＡ修飾およびＤＮＡ修飾物質およびＤＮＡリーダー、ならびに本発明に従って使用されてもよい細胞型の例である。

【0069】

ヒストンリーダー、以下のドメインを含有するタンパク質を含む：
ブロモドメイン（ＢＤ）
植物ホメオドメイン（ＰＨＤ）
タンデム型ＰＨＤ
クロモドメイン
ＷＤ４０
Ｔｕｄｏｒ
ダブル／タンデム型Ｔｕｄｏｒ
ＭＢＴ
アンキリンリピート
ｚｆ−ＣＦ
ＰＷＷＰドメイン（配列番号１として開示されている「ＰＷＷＰ」）
１４−３−３
ＢＲＣＴ
ＵＢＡ
ヒストンライター、以下を含む：
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）
ヒストンアシル基転移酵素、
ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）
キナーゼ
ユビキチナーゼ（ＵＢ）
ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼ
プロリンイソメラーゼ
ヒストン再形成複合体
ヒストンイレーサー、以下を含む：
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）
ヒストン脱メチル化酵素（ＨＤＭ）
デユビキチナーゼ（ＤＵＢ）
ホスファターゼ
アルギニンデイミナーゼ
ＤＮＡ修飾物質、以下を含む：
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）
メチルシトシンヒドロキシラーゼ／オキシダーゼ（ＴＥＴファミリー酵素）
ＤＮＡ修飾リーダー、以下を含む：
メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）
ＳＥＴおよびリングフィンガー結合ドメイン（ＳＲＡ）
ＤＮＡ修飾、以下を含む：
［シトシン］メチル化／メチルシトシン
［シトシン］ヒドロキシメチル化／ヒドロキシメチルシトシン
［シトシン］ホルミル化／ホルミルシトシン
［シトシン］カルボキシル化／カルボキシシトシン
［アデノシン］メチル化／メチルアデノシン
［グアニジン］酸化／オキソグアニジン
チミジン二量体化
脱塩基部位
一本鎖ニック
有核細胞溶解物、以下に由来するものを含む：
ヒト細胞（たとえば２９３Ｔ細胞、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ−３Ｔ３）ヒト癌細胞（たとえば７２１、Ｕ９３７、ＢＣＰ１、Ａ２７８０、Ａ−５４９、Ａ４３１、ＣＭＬＴ１、ＤＵ１４５、Ｈ１２９９、ＫＹＯ１、ＭＣＦ−７、Ｒａｊｉ、ＴＨＰ１）
ならびに健康なまたは疾患起源の他の任意の生物に由来する細胞
クロマチンと相互作用するおよび／または修飾するタンパク質を調査するために他の研究者によって使用された手法を以下に記載する。

【0070】

（１）クロマチンの消化によるＭＮまたは小さいＣＡのライブラリー、通常はミクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）処理を使用する
この手法は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）（Ｓｃｈｏｎｅｓ ＆ Ｚｈａｏ、２００８）と呼ばれる免疫沈降実験技術の変形であり；
（ａ）細胞中のタンパク質とＤＮＡとの相互作用
（ｂ）特定のゲノム領域でのヒストンを含めた、タンパク質の存在量および局在性
（ｃ）特定のヒストンＰＴＭの存在量および局在性
を調査するために使用され、
−通常は、内在性クロマチンとその結合タンパク質とを細胞溶解物中で架橋し
−ＭＮａｓｅによってクロマチンを消化してＣＡおよび／またはＭＮのライブラリーを得て
−対象のタンパク質またはＰＴＭマークを選択的に免疫沈降し、結合しているＤＮＡ断片を精製し、その配列を決定する。

【0071】

この型のサンプルは、大きくて生物学的に重要なライブラリーを表しており、そのゲノム遺伝子座に関して有益な情報を提供するが、クロマチン相互作用物質および修飾物質をプロファイリングする際に使用するには欠点、たとえば：
（ａ）サンプル内（内在性クロマチン相互作用タンパク質による汚染）と異なる実験間（実験毎に再現するのが困難なライブラリー組成、一部にはｉｎ ｖｉｔｒｏスクランブリングによる）両方での、サンプルの不純物／不均一性、
（ｂ）合成履歴がコードされていないので、プルダウン後のＭＮまたはＣＡ組成の読み出し、がある。読み出しは、いずれかの抗体（特定のマークまたはタンパク質に対する）によって、時には質量分析法（ＭＳ）と組み合わせて（Ｂｒｉｔｔｏｎ、Ｇｏｎｚａｌｅｓ−Ｃｏｐｅ、Ｚｅｅ ＆ Ｇａｒｃｉａ、２０１１）決める。特には、ＭＳは、ライブラリーのどんなタグ付けも必要としない極めて感度が高い不偏の方法である。しかし、ＭＳは、１つのポリペプチド鎖内のヒストンリーダー／ライター／イレーサーの認識パターン、すなわち１つのヒストン内のＰＴＭパターン、しかプロファイリングできず、完全なヌクレオソーム性構成中の異なるヒストンに存在するＰＴＭに一緒に使用することができない。さらに、感度は高いが、ＭＳには一定の修飾に対して検出限界があり、たとえばリン酸化には特に問題がある。ＭＳは、一定の修飾間、たとえば不斉に対する対称ジメチルアルギニン、を判別することができない。最後に、ＭＳにおいて検出されるイオン信号は、（ＤＮＡに基づく情報と異なり）どんな種類の増幅もできないので、感度に対して実際の実用上の制限がさらに加えられる。

【0072】

（２）特定のＰＴＭマークを含む化学的に定義されたＮ末端ヒストンペプチドライブラリー
修飾されたＮ末端ヒストンテールペプチドの大きなライブラリー（数千までのメンバーを含有する）を、固相化学を使用して合成し（Ｇａｒｓｋｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）、それを使用して、ＰＴＭパターンの結合に対するいくつかの公知のヒストンリーダードメインをプロファイリングした。完全なＭＮまたはＣＡと比較して、ペプチドライブラリーの構築はより簡単で、より速く（自動化できる）、モジュール式（たとえば分割−およびプール技術を使用する）である。さらに、たとえば固体支持体上での物理的な分離により、全てのライブラリーメンバーをコードすることができる。たとえばＭＳにより、異なって修飾されたペプチドの同一性を決定することができる。１本のポリペプチド鎖内のヒストンテールに存在するヒストンＰＴＭとのタンパク質相互作用をスクリーニングすることができるが、（ｉ）ヒストンの球状ドメイン内、異なるヒストン上、もしくは生理的モノヌクレオソームおよびポリヌクレオソーム性環境中の異なるヌクレオソーム上にあるＰＴＭパターン；および（ｉｉ）ＤＮＡ修飾パターン、または（ｉｉｉ）その組合せとの相互作用、たとえばヌクレオソーム性構成中の特定のＰＴＭパターンに対するクロマチンリーダーの多価結合は、調査することができない。

【0073】

（３）特定のＰＴＭパターンを含有する化学的に定義された単一のＭＮ
−特定のＰＴＭパターンを有する完全な化学的に定義されたＭＮ基質を従来の単一プルダウン実験に使用して、ヒストンリーダー、ブロモドメインＰＨＤフィンガー転写因子（ＢＰＴＦ）の多価性の概念を調査した（Ｒｕｔｈｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）。この研究により、ヒストンＰＴＭパターンを読み出す際の天然のヌクレオソーム性構成の重要性が示されたが、非常に低いスループットおよび仮説型実験計画の必要性に悩まされた。記載の発明において提唱されるように、合成履歴がコードされていないため好ましい結合体の識別および定量化ができなかったので、各プルダウン実験により単一のヒストンリーダー−ＭＮ対の結合事象が調査されたが、同時に複数のＭＮバリアントを用いて実行することはできなかった。Ｋｉｎｇｓｔｏｎおよび共同研究者によって（クロマチン再形成因子に供するために）、ＮＰＳの５’末端に２つの異なる発蛍光団、Ｃｙ３およびＣｙ５を付着させることにより、２つのヌクレオソームのモノヌクレオソームライブラリーが構築された（Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｇａｒｌｉｃｋ ＆ Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、２０１０）。記載された発明と比較して、この手法の短所としては、
（１）極めて小さいヌクレオソームライブラリーサイズ、そのサイズは、直交する蛍光分子の利用可能性および適合性によって制限される（記載されている刊行物においてライブラリーサイズは２であるが、およそ４まで拡大できる）
（２）読み出し感度の低さ（蛍光対ＤＮＡベース読み出し）、したがって材料およびコスト効率が悪い
（３）蛍光ベース読み出しのため実験を多重化できないこと
（４）データの標準化の困難さ
がある。

【0074】

現在まで、定量的高スループットクロマチン生化学用として成功裏に開発された方法は全くなく、それは、不偏の様式で適切な読み出しを含むクロマチン相互作用／修飾タンパク質をプロファイリングするために、大きくて多様性があるが化学的に定義されているモノヌクレオソームまたはクロマチンアレイライブラリーの構築を必要とする（Ａｌｌｉｓ ＆ Ｍｕｉｒ、２０１１；Ｆｉｅｒｚ ＆ Ｍｕｉｒ、２０１２）。

【0075】

本発明による組成物および方法は、上で概説した３つの手法の短所を克服し、そのようなデザイナークロマチンライブラリーの生成、望ましい特性を備える相互作用分子の単離、識別および定量化の解決策を提供する。以下の特徴が含まれてもよい：
−修飾されたモノヌクレオソームおよびポリヌクレオソームの形態でｉｎ ｖｉｖｏに存在する天然のクロマチン状態の再現
−化学的に定義され、さらに天然のモノヌクレオソームおよびポリヌクレオソーム性基質を得られる均質な調製
−人工的なＮＰＳを使用することによる、ヌクレオソーム調製、処理、およびその後の生化学アッセイ中のＤＮＡスクランブリングの安定性
−バーコード化戦略（（ａ）ＭＮまたはＣＡバリアントと（ｂ）実験の両方を明確にコードしている）によりモノヌクレオソームおよびポリヌクレオソーム性ライブラリーに実行される生化学アッセイの高スループット性
−ＰＣＲ工程および次世代配列決定による高感度で（すなわち増幅性）定量的な読み出し。

【0076】

固有のＤＮＡバーコードを使用して、各ＭＮもしくはＣＡライブラリーメンバーの固有の生化学的および／または生物物理学的特性をコードすることが有利である。これらのバーコードは、それぞれのポリヌクレオソーム性ＤＮＡ配列に付着しているかまたはその中に含まれる。

【0077】

従来から、ＤＮＡバーコード化はゲノムレベルで実行されており、合成ヒストンＨ３およびＨ４変異体を用いるヌクレオソームプロービングの例に示すように、対象の遺伝子が固有の分子バーコードでタグ付けされて、バーコード増幅、標識およびマイクロアレイハイブリダイゼーションによってそれぞれのタンパク質プールの識別が容易になる（Ｄａｉ、Ｈｙｌａｎｄ、Ｙｕａｎ、Ｈｕａｎｇ ＆ Ｂａｄｅｒ、２００８）。

【0078】

ゲノムレベル以外の識別用バーコードの使用については、ＤＮＡバーコード化した化学的ライブラリーに関して記載されており（Ｂｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｃｌａｒｋ、２０１０；Ｋｌｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１）、ＤＮＡ領域が人工的なハンドルとして導入されて、各小分子ライブラリーメンバーおよびＤＮＡコード化抗体ライブラリーが一意的にタグ付けされる（Ａｇａｓｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｋｒｕｔｚｉｋ ＆ Ｎｏｌａｎ、２００６）。

【0079】

本発明によるバーコード化したヌクレオソームまたはクロマチンアレイの使用により、いくつかの明白な利点が得られる。たとえば、バーコードは、ライブラリー中の個々のＭＮもしくはＣＡバリアントを明確にコードしており、マイクロアレイハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ配列決定によって解読して、好ましい結合体または基質について定量的な情報を得ることができる。加えて、このバーコード化戦略を利用して、所与のライブラリーに対して実行される全ての生化学的または生物物理学的操作をモジュール方式でコードすることができる。

【0080】

モノヌクレオソームライブラリーおよびクロマチンアレイライブラリーを調製する方法は、以下のものを含む：
（１）ヒストン合成
（ａ）翻訳後修飾された野生型（ｗｔ）および天然のヒストンならびに記載された手順を使用するその変形。

【0081】

−組換えタンパク質合成、固相ペプチド合成またはその組合せ（たとえばネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）（Ｄａｗｓｏｎ ＆ Ｋｅｎｔ、２０００）、発現タンパク質ライゲーション（Ｍｕｉｒ、２００３）（ＥＰＬ）またはアンバー変異抑制法（Ｗａｎｇ、Ｘｉｅ ＆ Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００６）技術を使用する）を使用して、ＭＮまたはＣＡにその後組み込まれる、野生型の、翻訳後修飾されている、人工的にタグ付けされている、または短縮されているヒストンを含めたヒストンバリアントを合成する（図９ａ）。

【0082】

（ｂ）記載された手順を使用する、メチル化リシン（Ｋｍｅ）またはアセチル化リシン（Ｋａｃ）類似体を保有する翻訳後修飾ヒストン
−Ｓｈｏｋａｔおよび共同研究者ならびにＮｏｒｄｅｎｓｋｉｏｅｌｄおよび共同研究者によって記載される戦略をそれぞれ使用して、システイン変異体をアルキル化して、メチルアミノエチルシステイン（Ｋｍｅ類似体）を得る（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．２００７）か、またはチオール−エン反応に供して、アセトアミドエチルシステイン（Ｋａｃ類似体）を得る（Ｃａｏ、Ｋｏｒｏｌｅｖ ＆ Ｎｏｒｄｅｎｓｋｉｏｅｌｄ、２０１１）。

【0083】

１つの翻訳後修飾されたヒストンの合成には時間がかかるが、自動化および並列化、たとえばモジュール式ＮＣＬジャンクションおよび手順の開発によって、ならびに修飾されたアミノ酸類似体を含有するヒストンを包含することによって、促進することができる。

【0084】

（２）八量体形成
ｗｔおよび／または修飾ヒストンの等比での添加、６Ｍ ＧｄｍＨＣｌから２Ｍ ＮａＣｌへの透析、それに続くＳＥＣ精製によって、ヒストンを会合させる（Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｌｕｇｅｒ、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ ＆ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、１９９９）。別法として、八量体形成は、わずか１ｎｍｏｌ規模のヒストン（ヒストンバリアントに応じて、およそ５０μｇの合計ヒストン）で実行することができる。しかし、より多くの材料が必要な場合には規模を増やすことができ、適切な透析装置が使用される限り、使用する体積に適合するように減らすことができる。２８０ｎｍでの紫外線分光測定および３００ｎｍでのバックグラウンド除去によって濃度を測定することができ、算出された消衰係数は、一般的なウェブサイト、たとえばワールドワイドウェブサイトｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍを使用することによって得られてもよい。ヒストンを、氷上で、展開緩衝液（６Ｍ塩化グアニジウム、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、４℃でｐＨ７．５、１ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）およそ５５μＬに等モル比で混合して、４℃で約１ｍｇ／ｍＬの合計タンパク質濃度を得る。混合物を小型透析ボタン（カットオフ３，５００Ｄａ）の中に置き、再折りたたみ緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、４℃でｐＨ７．５、１ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）３ｘ６００ｍＬに対して、各４℃で少なくとも４時間、１回の透析工程は終夜で透析する。翌日、混合物をエッペンドルフチューブへ移し、１７，０００ｇで、４℃で少なくとも５分間遠沈して、沈殿物を除去する。上清を、新たなチューブに移す。５０％（ｖ／ｖ）グリセリンを添加し、紫外線吸収を使用して八量体濃度を測定し、通常は２〜５μＭであった。八量体を、ＭＮ会合に直接処理する、および／または−２０℃で貯蔵することができる。

【0085】

（３）バーコード化した、修飾されていないならびに修飾されているヌクレオソーム性およびアレイＤＮＡの調製
（ａ）ヌクレオソームおよびアレイ骨格：
修飾されていないＤＮＡは、公知の方法、たとえば分子クローニング、ＰＣＲもしくはその断片のＤＮＡライゲーション、または化学的合成によって得ることができる。任意のＤＮＡ配列がヌクレオソーム性位置決めを指示できる場合には、その配列、たとえば提示された例において使用されるＷｉｄｏｍ ６０１配列（Ｌｏｗａｒｙ ＆ Ｗｉｄｏｍ、１９９８）、を使用することができる。必要な用途に応じて、様々な長さおよび型のＮＰＳならびにＤＮＡリンカーを利用することができる。一般に、数十ｎＭ（たとえば、５、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上）の濃度におけるライブラリーメンバー相互間のＤＮＡスクランブリングを避けるには、良好なライブラリーメンバーのバーコード化および識別に十分に強力なＮＰＳが必要とされる。修飾されているＤＮＡは、導入された修飾に応じて、酵素的または化学的方法を含めた適切な方法を使用して合成される必要がある。

【0086】

（ｂ）バーコード
ヌクレオソーム性もしくはアレイＤＮＡ内のどこにでも、またはその５’もしくは３’末端に、またはその近傍、あるいはリンカー領域内に、１つまたはいくつかのバーコードを組み込む。バーコードの選択および長さは、特定の実験および全体のライブラリーをコードするのに必要とされる組合せ冪数の程度に適合させることができる。バーコードは、ライブラリーメンバーの任意の生化学的または生物物理学的特性、たとえばヒストンバリアント、ＤＮＡバリアント、ＭＮ接続性、リンカーＤＮＡ、リンカーヒストン、非ヒストンタンパク質および／または操作の型、をコードする。たとえば、９節に記載される原理証明実験に示すように、６ｂｐのヌクレオチド領域をヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡの５’末端に付着させ、最大で４０９６個のＭＮもしくはＣＡバリアントをコードさせることができる。これらのバーコードは、
（ｉ）プラスミドＤＮＡへの分子クローニング、それに続くヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡを遊離させるための酵素的制限
（ｉｉ）ＰＣＲ
（ｉｉｉ）ＭＮもしくはＣＡ形成前の、ヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡの５’もしくは３’末端に対する酵素的ＤＮＡライゲーション
（ｉｖ）ＭＮもしくはＣＡ形成後の、ヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡの５’もしくは３’末端に対する酵素的ＤＮＡライゲーション
（ｖ）その組合せ
などの方法によって導入することができる。

【0087】

（ｃ）ＦＷおよびＲＶ配列決定プライミング部位。

【0088】

ＤＮＡ配列決定が読み出しに使用される場合、ＦＷおよびＲＶ配列決定プライミング部位は、ＭＮもしくはＣＡ形成の前後に、または実験を実行した後に、またはそれらを組合せて、たとえば分子クローニング、ＰＣＲもしくはＤＮＡライゲーションの技術を用いて、導入することができる。

【0089】

バーコード化したＭＮライブラリーの１つの変形においては（図１０ａ）、後のｉｏｎＴｏｒｒｅｎ（登録商標）配列決定装置（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）を使用する次世代配列決定読み出しに適合する３０ｂｐ ＦＷプライミング部位、ＭＮバリアントをコードする６ｂｐバーコード、４ｂｐリンカー、１４７ｂｐのヌクレオソーム性６０１ ＤＮＡ（Ｌｏｗａｒｙ ＆ Ｗｉｄｏｍ、１９９８）および３’末端に短い３ｂｐの付加物を含有する１９０ｂｐの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ領域が、ヌクレオソーム性６０１配列を鋳型に使用してＰＣＲによって調製される。

【0090】

バーコード化したＭＮライブラリーの別の変形において、Ｗｉｄｏｍ ６０１ヌクレオソーム性ＤＮＡ（Ｌｏｗａｒｙ ＆ Ｗｉｄｏｍ、１９９８）を含有し、下側の鎖の５’末端に５’−ＡＡ−３’突出および上側の鎖の３’末端に５’−ＣＡＣ−３’突出（「ＢＣ−６０１」；図１０ｂ）を有する１７７ｂｐのｄｓ ＤＮＡ領域を、（１）１２マーリピートとして環状プラスミドにクローニングされたまたはＰＣＲによって作製されたかいずれかのヌクレオソーム性６０１配列をＢｓａＩおよびＤｒａＩＩＩを使用して遊離させることと；（２）ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔフォワードプライミング部位のｎｔ １０〜３０にわたる相補的一本鎖ＤＮＡ（「ＦＷ−ｉＴ_10〜30」）（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）とそれぞれの６ｂｐ ＭＮバーコード（「ＢＣ−ＭＮ」；下の鎖は、３’末端に５’−ＡＡ−３’突出および５’末端に５’−ＣＡＴＣ−３’突出を含有する）とをアニーリングすることと；（３）これらのハイブリダイズしたＤＮＡ配列をヌクレオソーム性６０１ ＤＮＡと組み合わせることと；（４）Ｔ４ ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用するｉｎ ｓｉｔｕリン酸化と；（５）Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して「ＢＣ−６０１」を得るライゲーションと；（６）最終ＤＮＡ産物の精製、とによって調製する（図１０ｂ）。最終ＤＮＡ産物の濃度は、３４０ｎｍでのバックグラウンド除去を伴う２６０ｎｍでのｄｓ ＤＮＡの紫外線吸収によって決定され、算出された消衰係数は、一般的なウェブサイト、たとえばワールドワイドウェブサイトｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ.ｉｄｔｄｎａ.ｃｏｍ／ＵＶＳｐｅｃｔｒｕｍ．ｈｔｍｌを使用することによって得ることができる。

【0091】

（４）ＭＮ形成
モノヌクレオソームは、それぞれのＳＥＣ精製した八量体バリアントに、バーコード化したヌクレオソーム性ＤＮＡを添加し、その次に記載された方法を使用して、高から低塩緩衝液へと透析することによって会合させることができる（Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）。精製工程、たとえば分取ゲル電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィーをその後に続けてもよい。

【0092】

良好なＭＮまたはＣＡ会合のための適切なＤＮＡ対八量体比は、実験的に決定することができる（Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）。比が予め決められている大規模生産の場合、その方法は自動化によって促進できる。

【0093】

別法として、ＭＮ会合は、緩衝ＤＮＡ、たとえばＭＭＴＶ（Ｆｌａｕｓ ＆ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、１９９８）ＤＮＡ配列、の使用に基づく新たな手順を用いて、わずか３日間で、高スループット様式で実行することができる。ＰＣＲによって、ビオチン親和性ハンドルがＭＭＴＶ ＤＮＡの５’末端に取り付けられ（図９ｂ）、このハンドルによって、誤って会合したヒストン−ＭＭＴＶ複合体および潜在的に含まれないＭＭＴＶ ＤＮＡの除去が容易になり、したがって、以下の時間−および材料−制限工程が省かれる：（１）たとえばＳＥＣによって、ヌクレオソーム会合の前にヒストン八量体を精製する必要性；および（２）経験的なＤＮＡ対八量体比試験。この新たな手順は、数十、数百および潜在的に数千ものヌクレオソームバリアントを高度に並列化した様式において、極めて少量のヒストン八量体およびヌクレオソーム会合規模（各ヒストン１ｎｍｏｌだが、必要に応じてさらに増減できる）での材料調製を可能にする。通常、ヌクレオソーム会合は、数十ｐｍｏｌ規模（たとえば、４９ｐｍｏｌ）で実行されるが、必要な用途に応じてこの規模を拡大縮小することができる。通常、再折りたたみ緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、４℃でｐＨ ７．５、２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）中に約０．７μＭの八量体の濃度（たとえば、約７０μＭ ｐｍｏｌの合計体積）で、それぞれの八量体（たとえば３９マー八量体ライブラリー由来）１当量（ｅｑ）（たとえば、４９ｐｍｏｌ）を、バーコード化したＤＮＡ（「ＢＣ−６０１」）０．６ｅｑ（ヌクレオソーム性６０１ ＤＮＡの八量体に対して）（たとえば、２９ｐｍｏｌ）およびＢＩＯ−ＭＭＴＶ ＤＮＡ ０．４ｅｑ（八量体に対する）（たとえば、２０ｐｍｏｌ）と、４℃で別々に組み合わせる。記載の通り、ＭＮ会合は、（１）希釈、（２）段階的透析、または（３）連続透析法を使用して実行することができる（Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）。この特定の場合には、蠕動ポンプを使用する連続透析を利用した。たとえば、ＭＮ会合混合物を小型透析ボタン中に置き、ＭＮ開始緩衝液（１．４Ｍ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）２００ｍＬに対して、攪拌下に４℃で１時間透析することができる。およそ６時間過ぎたら、ＭＮ終了緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）３２０ｍＬを攪拌下に１．０ｍＬ／分の速度で添加し、混合物を、得られた緩衝液に対して攪拌下に４℃でさらに数時間透析する。続いて、混合物を、ＭＮ終了緩衝液２ｘ２００ｍＬに対して透析する（１工程１時間、その他は攪拌下に４℃で少なくとも４時間）。混合物をエッペンドルフチューブへ移し、１７，０００ｇで、４℃で少なくとも５分間遠沈して沈殿物を除去し、上清を新たなチューブに移し、プロテアーゼ阻害剤、たとえば０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を補充する。溶液を十分な量のストレプトアビジンコーティングしたビーズとエンドツーエンド撹拌装置上で、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートすることにより、会合したＭＮをＭＭＴＶ ＤＮＡ（遊離型および／またはヒストンに結合している）から取り出す。ビーズから溶液を取りだし、１７，０００ｇで、４℃で少なくとも５分間遠沈して、沈殿物を除去する。上清を新たなチューブに移す。３４０ｎｍでのバックグラウンド除去を伴う２６０ｎｍでのｄｓヌクレオソーム性ＤＮＡの吸光度を使用して、最終ＭＮの定量化を実行する。算出された消衰係数は、一般的なウェブサイト、たとえばワールドワイドウェブサイトｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ.ｉｄｔｄｎａ.ｃｏｍ／ＵＶＳｐｅｃｔｒｕｍ．ｈｔｍｌを使用することによって得ることができる。得られたＭＮの品質を分析するために、通常は、０．５ｐｍｏｌの得られたＭＮを約１５（ｖ／ｖ）％スクロースで補充し、無変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＥｔＢｒによる染色によって分析する。可視化は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実行される。貯蔵する場合、２０（ｖ／ｖ）％グリセリンを添加し、ＭＮを、３ｐｍｏｌアリコートに分割し、急速冷凍し、別々に−８０℃で貯蔵するかまたは等モル比で組み合わせ、タンパク質濃縮装置（Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５００、カットオフ１０，０００Ｄａ）を使用しておよそ１．０μＭ（合計ヌクレオソーム濃度）に濃縮し、３ｐｍｏｌアリコートに分割し、急速冷凍し、−８０℃で貯蔵するかいずれかである。全体として、組換えおよび／または合成ヒストンから開始して、高度に並列化した様式で、利用可能なロボット工学を用いて記載された期間内に数十、数百および潜在的に数千ものバリアントの規模で、ヌクレオソームをわずか３日間で調製することができる。

【0094】

（５）ＣＡ形成
１つのＭＮサブユニット型（または、バリアント）だけの均一のアレイを、上の（４）と同様に会合させることができる。不均一なアレイにおいては、２つ以上のＭＮサブユニット型が存在し、ＭＮは別々に会合され、固有のＤＮＡ突出を用いるＤＮＡライゲーションを使用して定義された配列に互いにライゲーションされる（Ｂｌａｃｋｅｔｅｒ、Ｆｅｅｌｙ ＆ Ｓｈｏｇｒｅｎ−Ｋｎａａｋ、２０１０）。いくつかのアレイにおいて、各ＭＮはその修飾において固有であってもよい。

【0095】

（６）ＭＮまたはＣＡライブラリー形成：望ましい修飾されたＭＮの望ましい濃度でのプーリング
ライブラリーは、一意的にＤＮＡバーコード化したＭＮ／ＣＡを添加して、望ましい組成のライブラリーを得ることによって形成することができる。ライブラリーメンバーの比は、等モルかまたは非等モルのいずれかであり、たとえば異なる分布のＭＮ／ＣＡ型、すなわちクロマチン状態、をｉｎ ｖｉｖｏで再現することができる。

【0096】

必要に応じて、精製工程、たとえば分取ゲル電気泳動、イオン交換またはゲル濾過による、を使用してライブラリーメンバーを精製することができる（Ｂａｏ、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｙ、Ｍｕｔｈｕｒａｊａｎ ＆ Ｌｕｇｅｒ、２００３）。ＭＮおよびＣＡはバーコード化されているので、得られたプールされたライブラリーは１工程で精製されてもよい。

【0097】

ライブラリーは、各ＭＮまたはＣＡメンバーに対して別々の容器を含んでもよく、または単一の容器に複数のＭＮまたはＣＡメンバーを含んでもよく、または単一の容器にライブラリーまたはサブライブラリーの全てのメンバーを含んでもよい。ライブラリーは、ＭＮとＣＡの両方を含んでもよい。

【0098】

（７）望ましい生化学的または生物物理学的特性を有するライブラリーメンバーの単離、識別および定量化
（ａ）コードされているＭＮ／ＣＡライブラリーに対する生化学的または生物物理学的アッセイ。以下の生化学的または生物物理学的アッセイ法は、ＭＮライブラリーについて記載するが、同じくＣＡライブラリーに適用することができる。

【0099】

（ｉ）クロマチンリーダーの結合プロファイリング
たとえば親和性タグまたは免疫沈降によって、クロマチンリーダー（組換えまたは有核細胞抽出物から得られる）を固体支持体に固定し、標準的なタンパク質緩衝液中でヌクレオソームライブラリーとインキュベートする。これらは、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）緩衝液、リン酸緩衝液、および４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液を中性近くのｐＨ（たとえば６．５〜８）で含み、（ａ）ヌクレオソーム安定性および完全性（たとえば還元試薬、プロテアーゼ阻害剤）、クロマチンリーダーの安定性（たとえばグリセリン、塩）、ならびに（ｃ）結合事象の特異性（たとえば塩または界面活性剤）に必要とされる全ての試薬および追加的な補因子を含有するべきである。インキュベーションは、低数百μＬ体積に数十ｎＭの合計ヌクレオソーム濃度で通常実行されるが、両方の数は増減することができる。インキュベーション温度は通常４℃であるが、４℃からヌクレオソームおよびクロマチンリーダーによってなお許容される温度の範囲、たとえば３７℃であり得る。実験を４℃で実行する場合、インキュベーション時間は通常４時間であるが、特定の実験に適合させることができる。別法として、クロマチンリーダーとヌクレオソームの間の結合事象は、最初に溶液中で実行することができ、クロマチンリーダー−ヌクレオソーム複合体の固定化をその後に実行することができる。

【0100】

（ｉｉ）クロマチンライターおよびイレーサーの酵素的修飾パターン
クロマチンライター（組換えまたは有核細胞抽出物から得られる）を、標準的なタンパク質緩衝液中でヌクレオソームライブラリーとインキュベートする。これらは、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）緩衝液、リン酸緩衝液、および４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液を中性近くのｐＨ（たとえば６．５〜８）で含み、（ａ）ヌクレオソーム安定性および完全性（たとえば還元試薬、プロテアーゼ阻害剤）、（ｂ）酵素反応（たとえば基質、たとえばＡＴＰ、ＳＡＭおよび／またはＡｃＣｏＡ）、（ｃ）酵素の安定性（たとえば塩またはグリセリン）、（ｄ）反応産物の安定性（たとえば、リバーサル反応の阻害剤、たとえばヒストンアセチルトランスフェラーゼ反応の後の場合、ＨＤＡＣ阻害剤）、ならびに（ｅ）下流の免疫沈降工程の特異性（たとえば塩、グリセリンまたは界面活性剤）に必要とされる全ての試薬および追加的な補因子を含有するべきである。反応は、低数十μＬの体積に数十ｎＭの合計ヌクレオソーム濃度で、適切な酵素濃度で通常実行されるが、必要なだけ増減することができる。インキュベーション温度は通常２５〜３７℃であるが、４℃からヌクレオソームおよびクロマチンライターによってなお許容される温度の範囲であり得る。実験を３０℃で実行する場合、インキュベーション時間は通常１０〜６０分間であるが、特定の実験に適合させることができる。続いて、ヒストン配列内にある酵素的に修飾されたアミノ酸を結合している抗体を、通常は低数十μｇ／ｍＬの濃度で、ＲＴで１時間添加した。続いて、通常はＲＴで１．５時間インキュベーションすることにより、タンパク質ＧまたはＡビーズで抗体−ヌクレオソーム複合体を捕捉する。別法として、抗体と酵素的に修飾されたヌクレオソームとの結合工程は溶液中で実行することができ、抗体−ヌクレオソーム複合体の固定化は、その後に実行することができる。したがってイレーサーの場合、修飾されていないヌクレオソーム基質は、除去されたマークに対する抗体を用いる免疫沈降によって減らされる。

【0101】

（ｂ）ＤＮＡ単離
結合タンパク質からのヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡの分離は、標準的な方法、たとえばタンパク質消化、たとえばプロテイナーゼＫ処理によって、それに続くＤＮＡ精製（たとえばＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット）によって実行することができる。絶対的ＤＮＡ量は、たとえば紫外線分光測定、または蛍光プローブのハイブリダイゼーション、たとえばＱｕｂｉｔ、またはｑＰＣＲによるＤＮＡ定量化技術を使用して決定することができる。

【0102】

（ｃ）マイクロアレイハイブリダイゼーションを使用するバーコード解読
解読は、標準的な手順（Ｈｅｌｌｅｒ、２００２）を使用して固定化したＤＮＡ配列を有するマイクロアレイチップを用いて達成することができる。

【0103】

（ｄ）ＤＮＡ配列決定を使用する多重化およびバーコード解読
フォワード（ＦＷ）およびリバース（ＲＶ）配列決定プライミング部位は、ヌクレオソーム性またはアレイＤＮＡ調製の間に、たとえばＰＣＲ、分子クローニングまたはＤＮＡライゲーションといった方法論を使用して含めることができる。別法として、プライミング部位は、ＭＮまたはＣＡ形成の後に付加されてもよく、ＰＣＲもしくはＤＮＡライゲーションを使用する結合または酵素実験により、特定の実験をコードしている多重化バーコードの同時挿入が可能になる。プライミング部位の実験前および後の付着の組み合せが、実行可能である。得られたＤＮＡライブラリー、したがって所与の生化学的または生物物理学的特性を有するヌクレオソームのバーコードを含有する、をプールし、次世代配列決定装置に供することができ、配列決定リードの解読（示した具体例においてｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）配列決定によって例示される通り）は、最初に実験多重化バーコードの一覧に従ってデータを仕分けすることと、続いてヌクレオソームバーコードの一覧に従って仕分けすることと、たとえばバーコード除去ツールであるＦａｓｔｘ Ｔｏｏｌｋｉｔ、ウェブサイトｈａｎｎｏｎｌａｂ.ｃｓｈｌ.ｅｄｕ／ｆａｓｔｘｔｏｏｌｋｉｔ／ｉｎｄ３ｅｘ.ｈｔｍｌによるライブラリー入力に対する標準化とにより、達成できる（図１０ｄ）。

【0104】

図１０ａおよび１０ｂに示す態様において、ＦＷプライミング部位（ｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）によるその後の次世代配列決定工程に適合している）は、３０ｂｐ ＦＷプライミング部位を有するバーコード化したヌクレオソーム性６０１ ＤＮＡを生成するためのＰＣＲ工程の間に含められる（図１０ａ）、またはＴ４ ＤＮＡライゲーションによってヌクレオソームバーコードと一緒に６０１ヌクレオソーム性６０１構成単位（「ＢＣ−６０１」、図１０ｂ）にライゲーションされる。適切な生化学的実験後のＤＮＡ単離の後に、その後のｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）次世代配列決定装置（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）と適合する２３ｂｐ ＲＶアダプタープライミング部位および６ｂｐ多重化（実験）バーコードならびにｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）のＦＷプライミング部位の最初の１０ｂｐが、次のＰＣＲ工程によって付加される（図１０ｃ）。

【0105】

読み出しにＤＮＡ配列決定を使用する場合、最小限の材料しか必要としない。しかし、ヒストン八量体およびＭＮを作製するには、ならびにたとえばビーズを使用するプルダウン実験、および高スループットの結果を得るのに使用できる他の技術には、一定量を必要とする。これらは、マイクロ流体工学装置（Ｗｅｉｂｅｌ ＆ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、２００６；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、２００６）を実行して、八量体およびＭＮの形成を並列化ならびに小型化することと、また、プロファイリングおよびスクリーニング試験にライブラリーを使用して高スループット動作を提供することとを含む。

【0106】

本発明の態様は、クロマチン相互作用物質および／または修飾物質をプロファイリングし、その活性をモジュレートする分子をスクリーニングするために作製され、流通され、使用することができる定義されたＭＮもしくはＣＡライブラリーを含有するキットを含む。本発明のキット、組成物ならびに方法は、既存のまたは新たなクロマチン相互作用物質および／もしくは修飾物質を発見し、プロファイリングするために；ヒト癌患者から得られるものを含めて、所与の細胞系のエピジェネティックシグネチャーの分析用診断ツールとして；ならびに既存のまたは新たなエピジェネティック薬物を発見し、プロファイリングするために使用できる。

【0107】

ヒストンおよび非ヒストンタンパク質、ヌクレオソーム性もしくはアレイＤＮＡ、またはその組合せかどうかにかかわらず、ここで記載される技術を使用して、型および数において任意の望ましい修飾を有するモノヌクレオソームおよびクロマチンアレイが調製されてもよい。ヒストンタンパク質単独で約１００個までの修飾が有り得る場合、組み合わせ理論は非常に高くなる。しかし、限られた数の修飾および組合せしか生物学的に重要でない。したがって、選択されたライブラリーは、通常真核生物に見出される生物学的に重要な修飾の限られた組に対応する数１００種類の組合せのヒストン修飾しかなくてもよい。すなわち、効率性および生物学的妥当性のためには、ライブラリーは、モノヌクレオソーム中の非天然の翻訳後ヒストン修飾およびＤＮＡの非天然の修飾を除外してもよい。たとえば、修飾は、ヒトおよび／または酵母に見出されるものに基づいていてもよい。

【0108】

モノヌクレオソームおよびクロマチンアレイは、ヌクレオソームもしくはアレイの合成および修飾と関連する合成バーコード、強力な合成ＮＰＳ、ＤＮＡ認識部位ならびに／または他の合成ＤＮＡ配列の使用を含めた、様々な方法で天然のクロマチンと異なっていてもよい。それらは非常に高い安定性および均一性を有するので、交絡変数、たとえば各ヌクレオソームにおいて異なるＤＮＡ配列、またはタンパク質からのＤＮＡの分離および合成モノヌクレオソームの「スクランブリング」無しに制御された実験が可能になる。クロマチンアレイは、厳密な設定数Ｎのヌクレオソーム単位を有してもよく、Ｎは２〜９６である。これら特徴の全てが、高スループット分析に重要である。

【0109】

本発明の他の側面は、いくつかの高スループット分析、たとえば多数のＤＮＡ配列の結果の分析、に必要とされる可能性がある大量のデータを分析するためのコンピュータの使用を含む。

【0110】

たとえば、本発明の一側面は、コンピュータによって実行される場合に、コンピュータに
ａ）特定の実験（多重化、または実験バーコード）をコードしている対象のバーコードの存在および位置を同定させ、
ｂ）特定の実験についてインデックスを付けられたバーコードのデータベースとａ）において得られたバーコードとを比較させ、
ｃ）対象のヒストン相互作用物質または修飾物質と相互作用した合成ヌクレオソーム由来ヌクレオソームＤＮＡ中の対象のバーコード（たとえば、ヌクレオソームＤＮＡ中の一定の出発点からＤＮＡ配列決定することによって得られるＤＮＡ配列中にある）の存在および位置を同定させ、
ｄ）ヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾の特定のパターンについてインデックスを付けられたバーコードのデータベースとｃ）において得られたバーコードとを比較させ、
ｅ）バーコードに関連するヌクレオソーム修飾のパターンを同定させる
命令を含み、それによって、相互作用物質または修飾物質に関連する修飾を決定する、非一時的コンピュータ読み込み可能な媒体である。

【0111】

当業者は、コンピュータを実行するための追加的な工程、または本発明の他の方法を実施するための他の一連の工程を認識しよう。

【0112】

本発明の別の側面は、対象の相互作用物質または修飾物質と関連するヌクレオソーム修飾を確定する方法であって、
ａ）特定の実験（多重化または実験バーコード）をコードしている対象のバーコードの存在および位置をコンピュータによって（上で）同定することと、
ｂ）特定の実験についてインデックスを付けられたバーコードのデータベースとａ）において得られたバーコードとを比較することと、
ｃ）対象のヒストン相互作用物質または修飾物質と相互作用した合成ヌクレオソーム由来ヌクレオソームＤＮＡ中の対象のバーコード（たとえば、ヌクレオソームＤＮＡ中の一定の出発点からＤＮＡ配列決定することによって得られるＤＮＡ配列中にある）の存在および位置を同定すること、
ｄ）ヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾の特定のパターンについてインデックスを付けられたバーコードのデータベースとｃ）において得られたバーコードとを比較することと、
ｅ）バーコードに関連するヌクレオソーム修飾のパターンを同定することを含み、それによって、相互作用物質または修飾物質に関連する修飾を決定する方法である。

【0113】

本発明の別の側面は、対象の相互作用物質または修飾物質と関連するヌクレオソーム修飾を確定するシステムであって、
メモリと、
ａ）特定の実験（多重化、または実験バーコード）をコードしている対象のバーコードの存在および位置を同定し、
ｂ）特定の実験についてインデックスを付けられたバーコードのデータベースとａ）において得られたバーコードとを比較し、
ｃ）対象のヒストン相互作用物質または修飾物質と相互作用した合成ヌクレオソーム由来ヌクレオソームＤＮＡ中の対象のバーコード（たとえば、ヌクレオソームＤＮＡ中の一定の出発点からＤＮＡ配列決定することによって得られるＤＮＡ配列中にある）の存在および位置を同定し、
ｄ）ヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾の特定のパターンについてインデックスを付けられたバーコード（たとえば、特定の実験についての、たとえば多重化または実験バーコード）のデータベースとｃ）において得られたバーコードとを比較し、
ｅ）バーコードに関連するヌクレオソーム修飾のパターンを同定し、それによって、相互作用物質または修飾物質に関連する修飾を決定する
ように構成されているプロセッサとを含むシステムである。

【0114】

図１７は、１つ以上の態様に従ってコンピュータ１７００を実行するための典型的なアーキテクチャについて記載しており、それを使用して、任意の装置、または任意の他のコンピュータシステムもしくはそのコンピュータ構成要素を実行してもよい。コンピュータ１７００と共に使用することができる他の装置、たとえばクライアントまたはサーバが同様に構成されてもよいことはいうまでもない。図１７に例示するように、コンピュータ１７００は、バス１７１０、プロセッサ１７２０、メモリ１７３０、読出し専用メモリ（ＲＯＭ）１７４０、記憶装置１７５０、入力装置１７６０、出力装置１７７０および通信インタフェース１７８０を含んでもよい。

【0115】

バス１７１０は、コンピュータ１７００の構成要素の間の通信を可能にする１つ以上の相互接続を含んでもよい。プロセッサ１７２０は、命令を翻訳し、実行できる任意の型のプロセッサ、マイクロプロセッサまたは処理論理（たとえば、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ））を含んでもよい。プロセッサ１７２０は、単一の装置（たとえば、シングルコア）および／または装置のグループ（たとえば、マルチコア）を含んでもよい。メモリ１７３０は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）またはプロセッサ１７２０による実行のための情報および命令を記憶できる別の型の動的記憶装置を含んでもよい。また、プロセッサ１７２０による命令を実行中の一時変数または他の中間情報を記憶するためにメモリ１７３０を使用してもよい。

【0116】

ＲＯＭ１７４０は、ＲＯＭ装置ならびに／またはプロセッサ１７２０のための静的情報および命令を記憶することができる別の型の静的記憶装置を含んでもよい。記憶装置１７５０は、情報および／または命令を記憶するための磁気ディスクおよび／または光学ディスクならびに対応する駆動装置を含んでもよい。記憶装置１７５０は、単一の記憶装置または複数の記憶装置を含んでもよく、たとえば複数の記憶装置は並列で動作する。さらに、記憶装置１７５０は、コンピュータ１７００上に局所的に存在してもよく、ならびに／またはサーバから離れており、ネットワークおよび／もしくは別の型の接続、たとえば専用のリンクもしくはチャネルを介してそれと接続されていてもよい。

【0117】

入力装置１７６０は、操作者がコンピュータ１７００に情報を入力することができる任意の機構または機構の組合せ、たとえばキーボード、マウス、タッチセンシティブディスプレイ装置、マイクロホン、ペン型ポインティングデバイスならびに／または生物測定入力装置、たとえば音声認識装置および／もしくは指紋スキャニング装置を含んでもよい。出力装置１７７０は、ディスプレイ、プリンタ、スピーカーなどを含めた、操作者に情報を出力する任意の機構または機構の組合せを含んでもよい。

【0118】

通信インタフェース１７８０は、コンピュータ１７００が他の装置および／またはシステム、たとえばクライアント、サーバ、ライセンスマネージャ、ベンダーなどと通信可能にする任意の送受信装置−様の機構を含んでもよい。たとえば、通信インタフェース１７８０は、１つ以上のインタフェース、たとえばネットワークに接続している第１のインタフェースおよび／またはライセンスマネージャに接続している第２のインタフェースを含んでもよい。別法として、通信インタフェース１７８０は、ネットワークを経由して通信するための他の機構（たとえば、無線インターフェース）、たとえば無線ネットワークを含んでもよい。一実装において、通信インタフェース１７８０は、送信先装置、たとえば汎用ハードウェア（たとえば、パーソナルコンピュータフォームファクター）、専用のハードウェア（たとえば、モデルまたはモデルの一部のコンパイルされたバージョンを実行するように適合されているデジタル信号処理（ＤＳＰ）装置）などを含むことができる標的装置、にコードを送信するための論理を含んでもよい。

【0119】

コンピュータ１７００は、コンピュータ読み込み可能な媒体、たとえばメモリ１７３０に含有されるソフトウェア命令を実行しているプロセッサ１７２０に応答する一定の機能を実行してもよい。別の態様において、物理的に組み込まれた回路をソフトウェア命令の代わりにまたは組み合わせて使用して、本開示の原理と一致する特徴を実行してもよい。したがって、本開示の原理と一致する実装は、ハードウェア回路およびソフトウェアの任意の特定の組合せに限定されない。

【0120】

典型的な態様は、ソフトウェア構成要素として多くの異なる方法に包含されてもよい。たとえば、それは独立型ソフトウェアパッケージ、ソフトウェアパッケージの組合せでもよく、またはより大きなソフトウェア製品の中の「ツール」として組み込まれているソフトウェアパッケージでもよい。それは、独立型製品としてまたは既存のソフトウェアアプリケーションに組み込むためのアドインパッケージとして、ネットワーク、たとえばウェブサイトからダウンロード可能であってもよい。また、それはクライアントサーバソフトウェアアプリケーションとして、またはウェブ対応ソフトウェアアプリケーションとして利用可能であってもよい。またそれは、ハードウェア装置にインストールされているソフトウェアパッケージとして包含されてもよい。

【0121】

態様の完全な理解を提供するために、数多くの特定の詳細を説明した。しかし、本態様がこれら特定の詳細なしに実行されてもよいことは理解されよう。他の実例において、周知の動作、構成要素および回線は、態様をあいまいにしないために詳細に記載しなかった。特定の構造的および機能的詳細は代表例であり、本態様の範囲を制限するとは限らないと認識できる。

【0122】

いくつかの態様は、様々な動作を実行する典型的で機能的な構成要素またはモジュールを含むように例示され、記載されてもよいが、そのような構成要素またはモジュールが、１つ以上のハードウェア構成要素、ソフトウェア構成要素および／もしくはその組合せによって実行されてもよいことを認識できる。機能的構成要素および／またはモジュールは、たとえば論理装置（たとえば、プロセッサ）によって実行されるべき論理（たとえば、命令、データおよび／またはコード）によって実行されてもよい。そのような論理は、１種類以上のコンピュータ読み込み可能な記憶媒体の論理装置に内部的にまたは外部的に記憶されてもよい。

【0123】

いくつかの態様は、製品を含んでもよい。製品は、論理を記憶するための記憶媒体を含んでもよい。記憶媒体の例としては、揮発性メモリまたは不揮発性メモリ、取り外し式のまたは固定式のメモリ、消去可能なまたは消去不能なメモリ、書き込み可能なまたは再書き込み可能なメモリ等を含めた、電子データを記憶することができる１種類以上のコンピュータ読み込み可能な記憶媒体を含んでもよい。記憶媒体の例としては、ハードディスク、ディスク駆動装置、ソリッドステートドライブおよび他の任意の有形の記憶媒体がある。

【0124】

記載された態様は、典型的な実装を例示しており、機能的構成要素および／またはモジュールが、記載された態様と一致する様々な他の方法で実行されてもよいことも認識されるべきである。さらに、そのような構成要素もしくはモジュールによって実行される動作は、所与の実装と組み合わされてもおよび／または分離されてもよく、より多数のまたはより少数の構成要素またはモジュールによって実行されてもよい。

【0125】

図のいくつかは、フロー図を含んでもよい。そのような図は特定の論理フローを含んでもよいが、論理フローは、一般的な機能性の典型的な実装を単に提供するだけであることを認識できる。さらに、特に明記しない限り、論理フローは提示された順で実行されなければならないとは限らない。加えて、論理フローは、ハードウェアエレメント、プロセッサによって実行されるソフトウェアエレメントまたはその任意の組合せによって実行されてもよい。

【0126】

［実施例］
以下の実験は、ヒストンリーダー、ヒストンライターのヌクレオソーム性構成における好ましいＰＴＭパターン、ならびにヒト２９３Ｔ細胞から得られる有核細胞溶解物の一体化したヒストンリーディング、ライティングおよびイレーシング活性を識別するＭＮバリアントの組成をコードするためのバーコード化戦略の実現可能性について実証しており、それは、利用可能な組換えおよび／または合成ヒストンから開始して、１週間以内に達成することができる（１１ａおよびｂ）。

【0127】

ｗｔヒストンならびに／または修飾ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４（図１２ａ）の組合せを含有する別々にバーコード化したＭＮバリアントの３９種類のメンバーのライブラリーを生成した。

【0128】

ｗｔヒトヒストンを大腸菌で発現させ、記載されている方法論を使用して精製した（Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｌｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９）。修飾されているヒトＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４ヒストンを、固相ペプチド合成によって作製したＮ末端ペプチドと、以下のＰＴＭを有するＮ末端システインを含む組換えＮ末端短縮ヒストンとのＮＣＬを使用して調製した（図９ａ）（Ｄａｗｓｏｎ ＆ Ｋｅｎｔ、２０００；Ｆｉｅｒｚ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｆｉｅｒｚ、Ｋｉｌｉｃ、Ｈｉｅｂ、Ｌｕｇｅｒ ＆ Ｍｕｉｒ、２０１２）：Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂについては、それぞれＫ１１９およびＫ１２０におけるリシンユビキチン化（ｕｂ）、Ｈ３については、Ｋ４、Ｋ９、Ｋ２７におけるリシントリメチル化（ｍｅ３）ならびにリシンペンタアセチル化（ａｃＰｏｌｙ、Ｋ９／１４／１８／２３／２７ａｃ）、Ｈ４については、Ｋ５、Ｋ８、Ｋ１２、Ｋ１６、Ｋ２０におけるリシンモノアセチル化（ａｃ）ならびにリシンペンタアセチル化（Ｈ４Ｋａｃ₅、Ｋ５／８／１２／１６／２０ａｃ）。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣによって、ＥＳＩ−ＭＳによって判断して純度９５％超にまでタンンパク質を精製した。ヒストンを組み合わせて、異なるＰＴＭの組合せを有する３９種類のヌクレオソームを形成した（完全な一覧については、図１２ｂを参照のこと）。

【0129】

Ｔ４ ＤＮＡライゲーションを使用して、ヌクレオソーム性６０１ ＤＮＡ配列の５’末端にｉｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（登録商標）配列決定装置（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）に適合するＦＷプライミング部位のヌクレオチド１０〜３０と一緒にＭＮバーコードを付着させ、それによって各固有のＭＮバリアントをコードさせ、その結果２０ｂｐ ＦＷプライミング部位（下側のＤＮＡ鎖の３’末端に一本鎖（ｓｓ）５’−ＡＡ−３’突出を有する）、６ｂｐバーコード（それぞれのＭＮバリアントのいずれかをコードしている）、４ｂｐリンカー（非パリンドローム性のＢｓａＩ ＤＮＡライゲーション部位に由来する）、１４７ｂｐ ６０１ヌクレオソーム性ＤＮＡ配列、および上側のＤＮＡ鎖の３’末端に６０１ヌクレオソーム性ＤＮＡのＤｒａＩＩＩ制限消化の結果得られる３ｎｔの５’−ＣＡＣ−３’付加物を含有しているＤＮＡ分子が得られる（図１０ｂ）。特には、５’−ＢｓａＩおよび３’−ＤｒａＩＩＩ突出を含有する１４７ｂｐ ６０１構成単位を、（ａ）６０１ ＤＮＡ鋳型を使用するＰｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲによって作製されるＤＮＡ断片（Ｌｏｗａｒｙ ＆ Ｗｉｄｏｍ、１９９８）（ＨＰＬＣ精製プライマー；ＦＷプライマー：５’−ＡＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号２）、ＲＶプライマー：５’−ＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＧＴＧＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＣＴＧＡＣＡＣＧＴＧＣＣＴＧＧ−３’）（配列番号３）、または（ｂ）１２コピーの望ましい配列を含有するプラスミド（いずれかの部位にＥｃｏＲＶ部位が隣接する；１つの反復単位の完全な配列：５’−ＧＡＴＡＴＣＡＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＴＧＧＴＣＧＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＴＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＡＡＣＧＣＡＣＧＴＡＣＧＣＧＣＴＧＴＣＣＣＣＣＧＣＧＴＴＴＴＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＴＡＣＴＣＣＣＴＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＡＣＧＴＧＴＣＡＧＡＴＡＴＡＴＡＣＡＴＣＣＴＧＴＣＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣ−３’）（配列番号４）の消化によって調製した。ＰＣＲ産物を５００ｍｇ規模で作製し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。ＰＣＲ産物を、ＢｓａＩおよびＤｒａＩＩＩを用いて２０℃で２０時間消化して（各制限酵素１００Ｕ／ｍＬを含有する合計体積０．５ｍＬ中にＤＮＡ０．５ｍｇ）１４７ｂｐ ６０１配列を遊離させ、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、エタノール（７０体積％）沈殿し、溶離緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、ＥＢ）に再溶解し、３４０ｎｍでのバックグラウンド除去を伴う２６０ｎｍでの紫外線分光法によって定量化し（ε=２４０７００２Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1）、−８０℃で、アリコートで貯蔵した。プラスミドをＤＨ５αコンピテント細胞において１Ｌ規模で作製し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａキットを使用して精製した。プラスミドを、ＢｓａＩおよびＤｒａＩＩＩを用いて２０℃で２０時間消化して（各制限酵素１００Ｕ／ｍＬを含有する合計体積５ｍＬ中にＤＮＡ５ｍｇ）１４７ｂｐ ６０１配列を遊離させた。消化反応物をアクリルアミド電気泳動によって精製し、７０体積％のエタノールを使用して精製した産物を沈殿させた。ペレットをＥＢに再溶解し、３４０ｎｍでのバックグラウンド除去を伴う２６０ｎｍでの紫外線分光学によって定量化し（ε=２４０７００２Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1）、−８０℃で、アリコートで貯蔵した。等量の５’−ＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＨＸＸＸＸＨ−３’（配列番号５）（上側の鎖）と５’−ＣＡＴＣＤＸＸＸＸＤＣＴＧＡＧＴＣＧＧＡＧＡＣＡＣＧＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号６）（下側の鎖）とを９５℃で５分間インキュベーションし、ＲＴで１時間ゆっくりと冷却することによってハイブリダイズさせて、ｄｓ ＦＷ−ｉＴ_10〜30−ＢＣ−ＭＮ ＤＮＡを作製した（図１０ｂ）。典型的なライゲーション反応において、１．２５μＭ ６０１構成単位を１．１ｅｑ ｄｓ ＦＷ−ｉＴ_10〜30と組み合わせ、Ｔ４リガーゼ緩衝液８００μＬの体積中で、０．１Ｕ／μＬポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）と３７℃で１時間インキュベートした。続いて、１０Ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、ＲＴで１時間インキュベートした（図１０ｂ）。ライゲーション反応を、無変性ゲル電気泳動、それに続く臭化エチジウムＤＮＡ染色によって観察した（５％アクリルアミドゲル、２００Ｖ、４０分間；図１２ｃ）。終末産物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、ＥＢ ５０μＬで溶出し、３４０ｎｍでのバックグラウンド除去を伴う２６０ｎｍでの紫外線分光学によって定量化した（ε=２８８６６２９Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1）。ＢＩＯ−ＭＭＴＶ ＤＮＡを、以下のプライマーと共にＭＭＴＶ ＤＮＡ鋳型を使用するＰｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲ（Ｆｌａｕｓ ＆ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、１９９８）によって調製した：５’−ビオチン−ＴＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣＣＴＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＴＣ−３’（配列番号７）（ＦＷプライマー）および５’−ＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＧＣＡＧＴＣＧＧ−３’（配列番号８）（ＲＶプライマー）。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、続いて７０体積％のエタノールを使用して沈殿させ、ＥＢにペレットを再溶解し、３４０ｎｍでのバックグラウンド除去を伴う２６０ｎｍでの紫外線分光学によって定量化し（ε=２４１４９２５Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1）、−８０℃で、アリコートで貯蔵した。

【0130】

それ以上精製することなく、化学量論量の、ＧｄｍＨＣｌ由来の個々のヒストンを１ｎｍｏｌ規模で再折りたたみすることによって、それぞれのヒストンバリアントを含む八量体を会合させた（ヒストンバリアントに応じて、各ヒストンバリアントに対して、合計ヒストンおよそ５０μｇ）（図９ｂ）。２８０ｎｍでの紫外線分光測定および３００ｎｍでのバックグラウンド除去によって濃度を測定した（消衰係数：ε_H2A=４４７０Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1；ε_H2B=７４５０Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1；ε_H3=４４７０Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1；ε_H4=５９６０Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1）。ヒストンを、氷上で、展開緩衝液（６Ｍ塩化グアニジウム、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、４℃でｐＨ７．５、１ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）およそ５５μＬ中に等モル比で混合して、約１ｍｇ／ｍＬの合計タンパク質濃度を得た。混合物を小型透析ボタン（カットオフ３，５００Ｄａ）の中に置き、再折りたたみ緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、４℃でｐＨ７．５、１ｍＭ Ｎａ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）３ｘ６００ｍＬに対して、各４℃で少なくとも４時間、１回の透析工程は終夜で透析した。翌日、混合物をエッペンドルフチューブへ移し、１７，０００ｇで、４℃で少なくとも５分間遠沈して、沈殿物を除去した。上清を、新たなチューブに移した。５０％（ｖ／ｖ）グリセリンを添加し、紫外線吸収を使用して八量体濃度を測定し（ε_octamer=３５７６０Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1）、通常は２〜５μＭの範囲であった。八量体の画分を、ＭＮ会合に直接処理し、残りを−２０℃で貯蔵した。典型的な収率は６０〜８０％であり、約３００〜４００ｐｍｏｌのヒストン八量体が得られた。

【0131】

この特定の場合において、利用可能なヒストン八量体の画分だけを、さらなるヌクレオソーム会合に使用した。再構成緩衝液７０μＬ中に約１．０μＭの濃度の適切なヒストン八量体を、０．６μＭバーコード化「ＢＣ−６０１」ＤＮＡ（図９ｂ）および０．４μＭ ＢＩＯ−ＭＭＴＶ緩衝ＤＮＡと４℃で混合した。混合物をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ透析ユニットに移し、１．４Ｍ ＫＣｌ ２００ｍＬを含有する再構成緩衝液に対して４℃で１時間透析した。その後、１０ｍＭ ＫＣｌを含有する緩衝液３３０ｍＬを１ｍＬ／分の速度で添加し、続いて１０ｍＭ ＫＣｌを含有する再構成緩衝液に対して最終の透析工程を２回した（１時間および終夜）。非生産的に会合したヒストン複合体および潜在的に含まないＢＩＯ−ＭＭＴＶの精製を、ＭｙＯｎｅ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０ｕＬをＲＴで１時間使用するストレプトアビジン親和性精製によって達成し、続いて２０体積％グリセリンおよび０．５ｍＭ ＰＭＳＦを添加した。０．５ｘトリス／ボレート／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中で流す５％アクリルアミドゲルでの分離（２００Ｖ、４０分間）、それに続く臭化エチジウムを用いるＤＮＡ染色により、ヌクレオソームの品質を評価した（図１３、左）。ＭＮを、３４０ｎｍでのバックグラウンド除去を伴う２６０ｎｍでの紫外線分光学によって定量化した（ε=２８８６６２９Ｌ*ｍｏｌ^-1*ｃｍ^-1）。バーコード化したヌクレオソームを、等モル比で組み合わせてライブラリーを形成し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００遠心フィルタユニット（カットオフ分子量１０，０００Ｄａ）を使用して濃縮した。ヌクレオソームライブラリーを、およそ１μＭの濃度で、アリコートでショックフリーズし、−８０℃で貯蔵した。典型的な収率は６０％近くであり、個々のヒストンから開始して約４０％の全収率を得られた。たとえば、１ｎｍｏｌの各ヒストンは、最終的なヌクレオソームを約２００ｐｍｏｌ産生することになり、これは、およそ１０００回のヒストンリーダー結合実験（例１Ａおよび１Ｂを参照のこと）、または１０，０００回超の酵素的ヒストンライター実験（例２および３を参照のこと）に十分な量である。

【0132】

４℃で１カ月間以上に貯蔵を延長した後に、プールしたＭＮライブラリーの完全性を無変性ＰＡＧＥ、それに続く臭化エチジウムＤＮＡ染色によって評価した（図１３、右）。加えて、個々のヌクレオソームを、溶液中でのその安定性、特にはＤＮＡスクランブリングについて調べた。したがって、予め組み込まれているマークに対する特異的抗体α−Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（ａｂｃａｍ、ａｂ８５８０）を用いてライブラリーを免疫沈降した。緩衝液（５０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１００ｍＭ Ｎａ−酪酸、１０％グリセリン、１ｍＭ ＤＴＴ）中の３０ｎＭ（合計）ライブラリーヌクレオソーム混合物（すなわち、抗体プルダウン当たり各ＭＮバリアント１２ｆｍｏｌ）１５μＬを、抗体（ＡＢ）緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）合計体積１００μＬ中のα−Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体で補充して、最終抗体濃度１５μｇ／ｍＬを得て、エンドツーエンド回転装置上で、ＲＴで１時間インキュベートした。その後、ＡＢ緩衝液１００μＬおよびタンパク質Ｇビーズスラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μＬを添加し、混合物をエンドツーエンド回転装置上で、ＲＴで１時間インキュベートした。ビーズをＡＢ緩衝液２００μＬで４回洗浄し、ＤＮＡを、ＤＮＡ溶離緩衝液（１００ｍＭ トリス、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール（βＭＥ）、２００μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ、ＮＥＢ）１００μＬを使用して５０℃で１．５時間溶出し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。得られたプルダウンＤＮＡを、ＥＢ緩衝液５０μＬで溶出し、Ｑｕｂｉｔ高感度ＤＮＡ定量化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量化した。ＤＮＡを、Ｈ₂Ｏで２ｐｇ／μＬの最終濃度に希釈した（それぞれの実験の希釈係数は、配列決定データ分析の間に後から考慮した、以下を参照のこと）。入力サンプル（実験に応じて初期ライブラリー入力の１０〜５０％）を同じく処理した。多重化ＰＣＲ工程の内部標準混合物を、６０１鋳型および以下のプライマーを使用してＰｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲによって作製した：ＦＷ：５’−ＰＣＲ工程を、６０１鋳型および以下のプライマーを使用するＰｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲによって作製した：ＦＷ：５’−ＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＸＸＸＸＸＸＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＴＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＡＧＧ−３’（配列番号９）（標準Ａ：ＣＴＣＡＧＴ、標準Ｂ：ＣＡＴＧＣＴ、標準Ｃ：ＴＧＡＧＴＣ、標準Ｄ：ＡＣＴＧＣＡ）；ＲＶ：５’−ＧＴＧＡＣＡＧＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＣＴＧＡＣＡＣＧＴＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１０）。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ精製キットを使用して精製し、ＤＮＡ ＥＢ緩衝液で溶出し、Ｑｕｂｉｔ高感度ＤＮＡ定量化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して定量化し、ＥＢ中で合計ＤＮＡ濃度２ｐｇ／μＬになるように以下の配分で混合した：１，０００ｅｑ標準Ａ、１００ｅｑ標準Ｂ、１０ｅｑ標準Ｃおよび１ｅｑ標準Ｄ。

【0133】

典型的な多重化ＰＣＲ反応において、０．０１Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、各々０．５μＭのＦＷプライマー（ＦＷ−ｉＴ：５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ−３’）（配列番号１１）およびそれぞれのバーコード化したＲＶプライマー（ＲＶ−６０１ーＢＣ−ＥＸＰ−ＲＶ−ｉＴ：５’−ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴＢＸＸＸＸＤＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＡＣＣＡＡＴＴＧＡＧＣ−３’（配列番号１２）；ＰＣＲサイクルプログラム：最初の変性、３０秒／９８℃；変性、１０秒／９８℃；アニーリング、１５秒／６２℃；伸長、５秒／７２℃；合計１５サイクル；最終の伸長、７分間／７２℃；図１０ｃ）の存在下で、各プルダウンＤＮＡ ９ｐｇを１ｐｇの内部標準混合物と組み合わせた。ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、ＥＢ ５０μＬで溶出した。多重化ＤＮＡ配列を等体積でプールし、製造業者の指示に従ってＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｃｈｉｎｅを使用して配列決定した（Ｍｅｒｒｉｍａｎ、Ｒ Ｄ Ｔｅａｍ ＆ Ｒｏｔｈｂｅｒｇ、２０１２；Ｒｏｔｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）。データ分析については、生配列決定リードを、３’実験的バーコードに従って最初に仕分けした。その後、リードを５’ＭＮバーコードに従って仕分けした（図１０ｄ）。各ＭＮバリアントの個々のリードに、それぞれのプルダウン実験のＤＮＡサンプルのＤＮＡ希釈係数を乗算した。最後に、これらの修正されたリードを、ライブラリー入力の個々のＭＮのリードに対して標準化した（少なくとも２つの入力サンプルから平均された）。得られた値は、それぞれの実験における％入力として表示される個々のＭＮのプルダウン効率を表した。ある場合には、プルダウン効率を、１つのバリアントのプルダウン効率に対してさらに標準化した。

【0134】

α−Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体をプルダウンに使用した場合、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３バーコードを保有するヌクレオソームだけが単離され（入力と比較して５０〜６０％のプルダウン効率）；異なるＰＴＭを備えているヌクレオソームは、バックグラウンドレベル（入力と比較して０．５％未満のプルダウン効率）でしか結合しないということは、ライブラリーを凍結融解サイクルに暴露したまたは４℃で数か月間に貯蔵を延長した場合でさえ、ライブラリーメンバーの間でＤＮＡ交換が観察されなかったことを示唆している（図１４ａ）。

【0135】

例１Ａ： 組換え的に発現させたブロモドメイン植物ホメオドメイン（ＰＨＤ）フィンガー転写因子ＢＰＴＦの隣接する２つのヒストンリーダーモジュールのプロファイリング：
所有している、多様に修飾され安定なヌクレオソームライブラリーについて、ＢＰＴＦの結合特性をプロファイリングしようと試みた。ＭＮの集合は、ＢＰＴＦの構成（Ｒｕｔｈｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）において以前に調査されていなかったバリアント、たとえばＨ３もしくはＨ４上のＫａｃ₅、Ｈ３の９位および２７位のＫｍｅ３またはＨ２ＡおよびＨ２Ｂ上のＫｕｂを保有するバリアント、を包含する（図１２ａおよびｂ）（Ｒｕｔｈｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）ので、ライブラリーにより、より大きな基質サンプリングサイズで組織的にＢＰＴＦの多価ヌクレオソーム性結合挙動を調べることが可能になった。加えて、全てのヌクレオソームを、１回の単一実験でＢＰＴＦ結合に対して同時にプローブした場合、実験変動を最小限に抑えられたことは、バーコード化したヌクレオソームの固有の重要な利点である。

【0136】

ＰＨＤ−ＢＤ結合モジュールまたはそれぞれの単一ドメイン（およそ２００ｐｍｏｌ、図１３ｂ）のいずれかを含有する、Ｎ末端で融合されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ＢＰＴＦ構築物の過剰量を、グルタチオン樹脂スラリー３μＬに固定し（１時間、ＲＴ）、ＧＤＰ３００緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、３０ｍＭ ＫＣｌ、２０％ｗ／ｖグリセリン、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ ＮＰ−４０；最終ヌクレオソーム濃度：２４ｎＭ）の体積２００μＬ中でコードされたヌクレオソームライブラリー（各ＭＮバリアント０．１２５ｐｍｏｌ）とエンドツーエンド撹拌装置上で、４℃で４時間インキュベートした。ビーズを、ＧＤＰ３００緩衝液２００μＬで４回洗浄した。ＤＮＡ単離、精製、多重化、解読および標準化を、上記の通り実行した。試験した条件下でＧＳＴタグ付けしたＢＰＴＦ−ＢＤが、アセチル化ヌクレオソームと相互作用しなかったことは、過去の研究結果と一致する（図１４ｃ）。対照的に、同じヌクレオソーム中に他のマークが存在するかどうかとは無関係に、ＧＳＴタグ付けしたＢＰＴＦ−ＰＨＤは、Ｈ３Ｋ４上でトリメチル化されているヌクレオソームを認識した。Ｋｍｅ３がＨ３テール内の他の位置に組み込まれたか、または嵩高いＫｕｂマークがＨ２ＡもしくはＨ２Ｂに付着したかいずれかの場合には、結合は観察されなかった（図１３ｄ、赤、右）。ＰＨＤ−ＢＤダブルドメインをベイトとして使用した場合、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３マークを有する全てのヌクレオソームが単離されたが、アセチル化リシンしか保有しないものは単離されなかった（図１３ｄ、赤、左）。しかし、同じヌクレオソーム内にＨ３Ｋ４ｍｅ３とＨ４Ｋａｃが共存すると、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３単独（Ｋ５、Ｋ８、Ｋ１２、Ｋ１６またはＫ２０での単一のマーク）と比較して、１．５〜３．５倍まで結合効率が増大した（図１３ｄ、赤）。ヌクレオソーム性結合において２〜３倍の増加が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３−Ｈ４Ｋ１６ａｃで修飾されているヌクレオソームで以前に観察されているが、多価性に対するＫａｃの寄与は、Ｈ４テールの隣接する部位ではあまり顕著でなかった（Ｒｕｔｈｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）。この場合に、以前に特徴づけられていないバリアント、Ｈ４Ｋａｃ５含有ヌクレオソームでは約７倍の強力な増大が見られるが、この位置依存性は平坦化される（図１３ｄ、赤）。ＢＰＴＦのＢＤのＫａｃ結合ポケットは、１つのアセチル化リシンしか収容できないので、親和性の増大は、Ｈ４テールにある複数のアセチル化リシンに起因する結合親和力の結果である可能性がある。従来の単離されたプルダウン実験を使用してこれらの発見を確認し、類似の結合挙動を見いだした。

【0137】

例１Ｂ：組換え的に発現させたヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００の隣接する２つの（潜在的）ヒストンリーダーモジュールのプロファイリング：
速やかにＢＰＴＦの多価結合挙動を精査する技術の能力が実証されたので、転写活性化補助因子ｐ３００まで調査を広げることにした。組換えＧＳＴタグ付けしたｐ３００−ＢＤ−ＰＨＤ（図１５ａ）を、例１Ｂに記載の通りヌクレオソームライブラリーとインキュベートした。ヌクレオソーム結合体単離、ＤＮＡ単離、精製、多重化、解読および標準化を、上記の通り実行した。使用した条件下で、ヌクレオソーム結合は、ＢＰＴＦに対してより弱かったが、ＧＳＴタグ付けしたｐ３００ ＢＤ−ＰＨＤモジュールとＨ４Ｋａｃ₅含有ヌクレオソームとの強力な会合が検出された（図１５ｂ、赤）。追加的なＫｍｅ３マークは、会合の強度を強めも弱めもしなかったので、この新たな発見は、ＰＨＤフィンガーがトリメチル化したまたは修飾されていないＨ３Ｋ４のいずれにも結合しないことを提唱している。アセチル化ヌクレオソームとの結合に対するＢＤおよびＰＨＤフィンガーの個々の寄与を分析するために、各ドメインだけを含む実験を繰り返した。ＰＨＤフィンガーはどのヌクレオソームバリアントに対しても検出可能な相互作用を示さなかった（図１５ｃ）が、ＢＤはＢＤ−ＰＨＤモジュールと類似の結合挙動を表した（図１４ｄ）ことは、ＰＨＤフィンガーがこの結合に重要でないことを示唆している。より初期の報告と合わせると、ライブラリープルダウンデータから、ｐ３００がそれ自身のマークに結合することによってか、および／または潜在的にそのＢＤによるＫａｃ媒介アロステリック制御によってかいずれかの正のフィードバックループを介して動作してもよいという仮説が得られた。開発した技術は、同じヌクレオソームライブラリーを使用して結合と酵素アッセイとを組み合わせるそのモジュラリティーおよび能力のため、そのような原理を直接試験するのにとても適している。

【0138】

例２： 組換え的に発現させたヒストンライター、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００のプロファイリング：
コードされているヌクレオソーム（３０ｎＭの濃度）を、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）緩衝液（５０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ Ｎａ−酪酸、１０％グリセリン、１ｍＭ ＤＴＴ）中で、１０μＭ ＡｃＣｏＡの無しまたは有りで、Ｓｆ９昆虫細胞で調製した３ｎＭ組換え全長ヒトｐ３００と３０℃で１時間インキュベートした。反応産物またはそのサブセットを、Ｈ４Ｋ５ａｃおよびＨ３Ｋ１８ａｃ特異的抗体を使用して免疫沈降によって単離した（図１６ａおよびｂ）。要約すると、１５μＬの反応を、それぞれの抗体、この場合α−Ｈ３Ｋ１８ａｃまたはα−Ｈ４Ｋ５ａｃ抗体で補充し（すなわち反応および抗体プルダウン当たり各ＭＮバリアント１２ｆｍｏｌ）、ＡＢ緩衝液で合計体積１００μＬに調節し、最終抗体濃度１５μｇ／ｍＬを得て、エンドツーエンド回転装置上で、ＲＴで１時間インキュベートした。その後、ＡＢ緩衝液１００μＬおよびタンパク質Ｇビーズスラリー１０μＬを添加し、エンドツーエンド回転装置上で、ＲＴで１．５時間インキュベートした。ビーズをＡＢ緩衝液２００μＬで４回洗浄した。抗体プルダウン、ＤＮＡ単離、精製、多重化、解読および標準化を上記の通り実行した。ライブラリーをＡｃＣｏＡで処理し、α−Ｈ３Ｋ１８ａｃで免疫沈降した場合、ｗｔヌクレオソームで０．３％から約４％入力へのプルダウンの増加が観察され、それは、ｐ３００によって生じたその部位でのリシンアセチル化の増加を反映していた（図１６ａ）。アセチル化の程度は、Ｋｍｅ３またはＫｕｂマークの存在に影響されなかった。しかし、Ｈ４テールにおいてポリアセチル化されたヌクレオソームに著しく強力なＨ３アセチル化（図１６ａ、ｗｔと比較して１３倍）が見いだされ、それは、ライブラリー結合データと一致している（図１５ａ）。興味深いことに、より低い効率であるが、Ｈ４上のわずか１個のＫａｃマークが、このＨ４ＫａｃとＨ３Ｋａｃとのクロストークを再現する可能性がある。この効果は、テール内にあるマークの厳密な位置によって決まり、Ｈ４Ｋ１２ａｃに対して最も顕著であった（図１６ａ）。このクロストークが逆方向に存在するかどうか試験するために、α−Ｈ４Ｋ５ａｃ抗体を用いて反応混合物を免疫沈降させた（図１６ｂ）。ＡｃＣｏＡ（０．５〜０．９％入力）の存在下で、ｗｔヌクレオソームでアセチル化のわずかな増加が観察されたが、ＫｕｂまたはＫｍｅ３修飾に影響されなかった（図１６ｂ、右）。対照的に、Ｈ３Ｋａｃ₅ヌクレオソームがより容易に修飾された（図１６ｂ、ｗｔと比較して６倍の増加）ことは、同様にＨ３ＫａｃからＨ４Ｋａｃへのテール間クロストークを示唆している。加えて、既存のＫ１２ａｃマークを含むヌクレオソームが、プルダウン効率の上昇をもたらした（４．４％入力、図１６ｂ、右）ことは、Ｈ４テール内における追加的なテール内クロストークを提唱している。しかし、この増加は、モノアセチル化ヌクレオソームと比較して、ポリアセチル化に対するより高い抗体親和性の結果である可能性もある。実験は、位置依存的な、Ｋａｃ媒介テール間および潜在的なテール内クロストークによる正のフィードバック機構を介してｐ３００が動作することを示している。したがって、抗体非依存的方法、たとえば放射性ゲルベースの酵素アッセイおよび質量分析法により、Ｈ３またはＨ４テール内に予め組み込まれたＫａｃマークを含有する従来通りの単一の修飾されたヌクレオソームを含むこれらの新たな発見を精査し、ライブラリースクリーニングの結果を確認した。

【0139】

例３：ヒト２９３Ｔ細胞から得られた有核細胞抽出物のヒストンリーダー、ライターおよびイレーサーのプロファイリング：
所与の細胞系のエピジェネティックシグネチャーを調査するために、前に記載した通りに調製したヒト２９３Ｔ細胞から得られる核抽出物を用いて、バーコード化したヌクレオソームライブラリーをプロファイリングした（Ｄｉｇｎａｍ、Ｌｅｂｏｖｉｔｚ ＆ Ｒｏｅｄｅｒ、１９８３）。２０μＭ ＡｃＣｏＡ、１０μＭ ＳＡＭおよび１０μＭ ＡＴＰの存在下で、コードされているヌクレオソームライブラリー（濃度３０ｎＭ、すなわち反応および抗体プルダウン当たり各ＭＮバリアント１２ｆｍｏｌ）１５μＬを核抽出物７．５μＬとＨＡＴ緩衝液中で、３０℃で１時間インキュベートした。核抽出物中にある内在性ＨＡＴのアセチルトランスフェラーゼ活性によりＨ３Ｋ１４でアセチル化されたヌクレオソームを、α−Ｈ３Ｋ１４ａｃ抗体を使用して単離した。抗体プルダウン、ＤＮＡ単離、精製、多重化、解読および標準化を上記の通り実行した。未だ特徴づけされていないＨＡＴ、潜在的にｐ３００、のＨ３Ｋ１４アセチル化の増加をｗｔヌクレオソームで観察した。アセチル化の程度が、予め組み込まれているＨ３Ｋ４ｍｅ３および／またはＨ４テール内にある複数のＫａｃマークのうちの１つだけを保有するＭＮバリアントに対して著しく高まった（図１６ｃ）ことは、ヒストンライター、イレーサーおよび／またはリーダー間の酵素的クロストークを示唆している。これらの結果は、迅速かつ効率的な診断ツールとしてこの実験的手順を利用して、ヒト癌患者から得られるものを含む所与の細胞系のエピジェネティックシグネチャーを調査できることを実証しているので興味深い。

【0140】

前述の説明から、当業者はこの発明の重要な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲を逸脱しない範囲で、本発明の変更および修正を作製して、様々な使用法および条件にそれを適合させることならびに本発明をその最も完全な範囲に利用することができる。前述の好ましい特定の態様は、単なる例示であり、どんな任意の方法も本発明の範囲を制限するものではないと解釈されるべきである。２０１２年６月６日出願の米国特許仮出願第６１／６５６，２３３号、および２０１２年１０月１０日に出願の米国特許仮出願第６１／７１２，１４８号を含めた、前述した全ての出願、特許および刊行物の開示全体を、特に本出願において引用される開示に関して、参照によりその全体をここで組み込む。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］ ２種類以上のモノヌクレオソームを含む合成モノヌクレオソームのライブラリーであって、各モノヌクレオソームが、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンＨ１を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と、
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）強力なヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、
（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のＤＮＡバーコードと、任意に
（ｉｉｉ）前記ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内でのＤＮＡ延長部とを含み、前記ＤＮＡが修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ中の前記ヌクレオチドのうち少なくとも１つが修飾されてＤＮＡ修飾の固有のパターンを形成している、ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質との複合体を含み、
前記ライブラリー中の各モノヌクレオソームが、（ｉ）ヒストン修飾の固有のパターンおよび／またはＤＮＡ修飾の固有のパターンを有し、それによって、ヌクレオソーム修飾の固有のパターンを形成し、（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置が前記モノヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾の前記固有のパターンを示す１つ以上の固有のバーコードを有する、ライブラリー。
［２］ 定義されたＤＮＡ分子によって互いに結合している２つ以上の合成モノヌクレオソームを含む合成ポリヌクレオソームであって、前記モノヌクレオソームが定義された接続性を有し、各モノヌクレオソームが、
（ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンＨ１を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてモノヌクレオソーム性ヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と；
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）強力なヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、任意に
（ｉｉ）前記ＮＰＳの５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内でのＤＮＡ延長部とを含み、前記ＤＮＡが修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ中の前記ヌクレオチドのうち少なくとも１つが修飾されてモノヌクレオソーム性ＤＮＡ修飾の固有のパターンを形成している、モノヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質との複合体を含み、
モノヌクレオソーム性ヒストン修飾の前記パターンおよび／または前記ポリヌクレオソーム中のモノヌクレオソーム性ＤＮＡ修飾の前記パターンが、均一であってもよく、または異なっていて、ポリヌクレオソーム性修飾の固有のパターンを得られてもよく；
前記ポリヌクレオソームが、前記ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の配列および位置がポリヌクレオソーム性修飾の前記固有のパターンを示す前記ポリヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のバーコードを含む、合成ポリヌクレオソーム。
［３］ ［２］に記載の合成ポリヌクレオソームを２つ以上含む合成ポリヌクレオソームのライブラリーであって、
前記ライブラリーの各メンバーが、ポリヌクレオソーム性修飾の固有のパターンを示す１つ以上の固有のバーコードを有する、ライブラリー。
［４］ 前記ヒストンの前記修飾が、ヒストンアイソフォーム、翻訳後修飾（ＰＴＭ）および／もしくは非天然のアミノ酸を含む、［１］または［３］に記載のライブラリー。
［５］ （ａ）前記ヒストンアイソフォームが、タンパク質配列内の１つ以上のアミノ酸置換もしくはアミノ酸挿入またはタンパク質配列の末端の延長部を含み；および／または
（ｂ）前記ＰＴＭが、ヌクレオソーム当たり１つの部位の修飾または２つ以上の部位の修飾を有する、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰ−リボシル化、グリコシル化、アルキル化、アシル化、プロリルシス／トランス異性化、ニトロシル化、および酸化を含めた、任意の天然に存在するヒストン修飾から選択され、および／または
（ｃ）前記非天然のアミノ酸が、化学的および生化学的に不活性な、光架橋剤、蛍光標識または同位体標識であり得るＰＴＭの合成類似体から選択される、［４］に記載のライブラリー。
［６］ 前記ＤＮＡ分子の前記修飾が、天然に存在する修飾を有するＤＮＡ塩基もしくは人工的な修飾を有する塩基を１つ以上含む、［１］または［３］に記載のライブラリー。
［７］ ［１］または［３］に記載のライブラリーを含むキットであって、モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームが、任意に１つ以上の容器の中にある、キット。
［８］ ヒストン修飾の各固有のバーコードと固有のパターンの間の相関を示す一覧をさらに含む、［７］に記載のキット。
［９］ 前記容器が、試験管、マルチウエルプレートのウェルまたは微小流体装置の反応チャンバーである、［７］に記載のキット。
［１０］ 組換えに由来する、および／もしくは有核細胞抽出物から抽出された１つ以上のクロマチンリーダーの認識パターンならびに親和性の特異性を決定する、または組換えに由来する、および／もしくは１つ以上の細胞系の有核細胞抽出物から抽出されたクロマチン修飾物質の特異性ならびにクロマチン修飾クロストークを決定する方法であって、
（ｉ）［１］または［３］に記載のライブラリーを前記クロマチンリーダーまたは前記クロマチン修飾物質と接触させる（たとえば、インキュベートする）ことと、
（ｉｉ）結合したおよび／または修飾されたライブラリーメンバーを単離することと、
（ｉｉｉ）前記結合したまたは修飾されたライブラリーメンバーおよび任意の付加されたマークまたは除去されたマークを同定および／または定量化することとを含む方法。
［１１］ 相互作用物質または修飾物質に関連する修飾を同定する方法であって、
［１］または［３］に記載のモノヌクレオソームまたはポリヌクレオソームのライブラリーを用いて１を超える数のクロマチン相互作用物質および／または修飾物質を多重化することと、前記修飾に従って前記ライブラリーを同数のサブライブラリーに分けることと、各相互作用物質または修飾物質に関連する前記修飾を同定することとを含む方法。
［１２］ エピジェネティック薬物の特異性を同定し、プロファイリングする方法であって、
候補分子を［１］または［３］に記載のライブラリーと組み合わせることと、
ヌクレオソーム修飾のモジュレーションを検出することとを含み、それによって、ヌクレオソーム修飾をモジュレートする候補エピジェネティック薬物を同定する、方法。
［１３］ ＤＮＡバーコードおよび関連するヌクレオソーム修飾ならびにバーコード化した各ヌクレオソームの組成の一覧と組み合わせたヌクレオソームのライブラリー。
［１４］ 前記ＤＮＡ分子の前記５’および／もしくは３’末端にまたはその中にＤＮＡバーコードを含む、合成モノヌクレオソームまたはポリヌクレオソーム。
［１５］ （ａ）ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、任意にリンカーヒストンＨ１を各々２コピー含有するタンパク質八量体であって、前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されていない、および／または前記ヒストンのうち少なくとも１つが修飾されてヒストン修飾のパターンを形成している、タンパク質八量体と、
（ｂ）ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子であって、
（ｉ）強力なヌクレオソーム位置決定配列（ＮＰＳ）と、
（ｉｉ）前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の定義された位置に位置する１つ以上のＤＮＡバーコードと、任意に
（ｉｉｉ）前記ＮＰＳの前記５’および／もしくは３’末端でのならびに／または前記ＮＰＳ内でのＤＮＡ延長部とを含み、前記ＤＮＡが修飾されていない、および／または前記ＤＮＡ中の前記ヌクレオチドのうち少なくとも１つが修飾されてＤＮＡ修飾の固有のパターンを形成している、ヌクレオソーム性ＤＮＡ分子と、任意に
（ｃ）１つ以上の非ヒストンクロマチン関連タンパク質との複合体を含み、
前記モノヌクレオソームが、ヒストン修飾の固有のパターンおよび／またはＤＮＡ修飾の固有のパターンを有し、それによって、ヌクレオソーム修飾の固有のパターンを形成し、
前記ヌクレオソーム性ＤＮＡ中の前記バーコードの前記配列および位置が、前記モノヌクレオソーム中のヌクレオソーム修飾の前記固有のパターンを示す、合成モノヌクレオソーム。
［１６］ ヒストンタンパク質およびバーコード化したヌクレオソーム性ＤＮＡとビオチンタグ付けしたＭＭＴＶ緩衝ＤＮＡとを既定の比で組み合わせることを含む、［１５］に記載のモノヌクレオソームを会合させる方法。
［１７］ 前記ライブラリーが安定するように前記ＮＰＳが十分に強力であり、４℃で少なくとも１カ月間貯蔵した後でも、モノヌクレオソームとポリヌクレオソームライブラリーメンバーの間で有意なＤＮＡスクランブリングが発生しない、［１］または［３］に記載のライブラリー。
［１８］ 前記ヒストンおよび／またはＤＮＡ修飾が、生物学的に重要なクロマチン状態の代表的なセットを含む、［１］または［３］に記載のライブラリー。
［１９］ 前記モノヌクレオソームとポリヌクレオソームライブラリーメンバーの比が、等モル（各ライブラリーメンバーについて１：１）であるかまたは等モルでなく、固定された既定の比でライブラリーメンバーの１つまたはサブセットに対して１〜１０００の範囲である、［１］または［３］に記載のライブラリー。

【0141】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]