特許 6294228 糖質酸化酵素とその製造方法並びに用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6294228

(24)【登録日】2018年2月23日

(45)【発行日】2018年3月14日

(54)【発明の名称】糖質酸化酵素とその製造方法並びに用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180305BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20180305BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180305BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180305BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180305BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180305BHJP

   C12P 7/58 20060101ALI20180305BHJP

   A23L 15/00 20160101ALI20180305BHJP

   A23L 5/00 20160101ALI20180305BHJP

   A21D 2/08 20060101ALI20180305BHJP

   A21D 8/00 20060101ALI20180305BHJP

   C12R 1/645 20060101ALN20180305BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N9/04 D

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P7/58

   A23L15/00 B

   A23L5/00 J

   A21D2/08

   A21D8/00

   C12N9/04 D

   C12R1:645

【請求項の数】21

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2014-535600(P2014-535600)

(86)(22)【出願日】2013年9月13日

(86)【国際出願番号】JP2013074810

(87)【国際公開番号】WO2014042237

(87)【国際公開日】20140320

【審査請求日】2016年7月21日

(31)【優先権主張番号】特願2012-203530(P2012-203530)

(32)【優先日】2012年9月14日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000216162

【氏名又は名称】天野エンザイム株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100112874

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邊 薫

(74)【代理人】

【識別番号】100147865

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 美和子

(72)【発明者】

【氏名】長屋 美穂

(72)【発明者】

【氏名】杉田 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】松本 直樹

(72)【発明者】

【氏名】岡田 正通

【審査官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５２６０５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／００９７４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０５−０８４０７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０７−０６７６４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biochimica Biophysica Acta, 1991, Vol. 1118, pp. 41-47

【文献】 Biochem.Biophys.Res.Commun., 1992, Vol. 186, No. 1, pp. 40-46

【文献】 Agric.Biol.Chem., 1991, Vol. 55, No. 2, pp. 471-477

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の理化学的性質を有するＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のタンパク質。
（１）作用：糖を糖酸へ酸化する。
（２）基質特異性：グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、及びセロビオースに作用する。
（３）分子質量：約６３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定）。
（４）至適ｐＨ：５．０〜９．０。

【請求項2】

［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、請求項２に記載のタンパク質。

【請求項4】

以下の理化学的性質を有するＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のタンパク質。
（１）作用：糖を糖酸へ酸化する。
（２）基質特異性：グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、及びセロビオースに作用する。
（３）至適ｐＨ：５．０〜９．０。
（４）安定ｐＨ範囲：５．０〜１０．５。
（５）至適温度：２０℃〜５５℃。
（６）温度安定性：４５℃以下で安定
（７）分子質量：約６３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定）。

【請求項5】

［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、請求項４に記載のタンパク質。

【請求項6】

０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、請求項５に記載のタンパク質。

【請求項7】

以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質。

【請求項8】

請求項７に記載のタンパク質をコードする遺伝子。

【請求項9】

以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項10】

以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号９で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項11】

請求項８から１０のいずれか一項に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。

【請求項12】

請求項１１に記載の組み換えベクターにより宿主細胞が形質転換されてなる形質転換体。

【請求項13】

請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質の生産能を有する微生物を栄養培地で培養して得られる培養物から、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質を採取するタンパク質の製造方法。

【請求項14】

請求項１２に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物から糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を採取するタンパク質の製造方法。

【請求項15】

請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質を用いて、糖質から糖酸を製造する糖酸の製造方法。

【請求項16】

食品内の糖質を酸化するための、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。

【請求項17】

請求項１６に記載のタンパク質の使用を少なくとも行う卵白の脱糖方法。

【請求項18】

請求項１７に記載の脱糖方法を用いた脱糖卵白の製造方法。

【請求項19】

請求項１６に記載のタンパク質の使用を少なくとも行うパンの品質および／またはドウの物性の改質方法。

【請求項20】

請求項１９に記載の改質方法を用いたパンの製造方法。

【請求項21】

請求項１６に記載のタンパク質の使用を少なくとも行うラクトビオン酸の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質に関する。より詳しくは、広範囲の糖に作用する糖質酸化酵素活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、形質転換体、および前記タンパク質の製造方法、並びに、前記タンパク質の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

糖質を酸化する酵素の代表的なものとして、グルコースを酸化するグルコースオキシダーゼがあり、このグルコースオキシダーゼは、様々な分野において、広く使用されている。

【0003】

例えば、乾燥卵白を製造する過程において、卵白中のグルコースを除去（脱糖）する目的でグルコースオキシダーゼが使用されている。乾燥卵白は、生卵白に比べて長期保存が可能であり、輸送コストが低く、保管スペースも少なくてすむことから、種々の食品の原料として使用されている。この乾燥卵白中のグルコースは、保存中に卵タンパク質中のアミノ基と反応してメイラード反応を起こし、褐変、不快臭が発生する。このような品質低下を防ぐため卵白中のグルコースを除去する目的でグルコースオキシダーゼや酵母などを用いた発酵法が用いられる。

【0004】

ところで、グルコースオキシダーゼは比較的温度安定性に優れるため、製品中にグルコースオキシダーゼ活性が残存する場合がある。例えば、乾燥卵白中にグルコースオキシダーゼ活性が残存していると、乾燥卵白を使用した菓子製造の際に原料中のグルコースを酸化してしまうという問題が生じる。一方でグルコースオキシダーゼが失活する条件で熱処理を行うと卵白が凝固し、乾燥卵白としての商品価値を低下させてしまうという問題が生じる。また、酵母の発酵により脱グルコースする方法では乾燥卵白製品に発酵臭が残るという問題がある。

【0005】

また、パン製造や製粉工場においては、小麦粉の焼固性を高めるためや、伸縮性を改善し望ましい強度および安定性を有する練り粉をつくるために、グルコースオキシダーゼが使用されている。この効果の背景にある機構としては、生地中のグルコースを酸化して、グルコノラクトンと過酸化水素を生成し、生成した過酸化水素が酸化剤としての役割を果たしグルテンＳ−Ｓ結合の形成に寄与するといわれている。これによりタンパク質がより安定な形を形成して、練り粉の品質、焼固製品の容量及び芯構造に改善をもたらす。

【0006】

具体的には、例えば、特許文献１には、練り粉の流動学的特徴、焼成後のパンの肌理及び外観を改善するために、穀粉にグルコースオキシダーゼを添加する技術が開示されている。また、特許文献２には、セルロース分解酵素およびグルコースオキシダーゼを含有するパンの品質を改良するための製剤が開示されている。更に、特許文献３では、グルコースオキシダーゼおよびリパーゼを含有する製パン改良剤及びそれを用いる製パン方法が開示されている。

【0007】

このようにグルコースオキシダーゼは、様々な用途で用いられているが、グルコースのみを酸化する酵素であるため、グルコースを含まない、あるいはその含有量が低いものに対しては、有効的な効果を発揮することができないという問題がある。また、ラクトースなど他の糖質を含有する場合、例えばラクターゼなどの他の糖質をグルコースへ分解可能な酵素を併用しなければ、有効的な効果を得ることができない。

【0008】

例えば練り粉及びパンを改良する添加剤としてグルコースオキシダーゼを使用するためには基質としてグルコースの存在が必要となるが一般的に小麦粉中のグルコースは０〜０．４重量％と低い含量であるため、グルコースオキシダーゼの有用性が限定される。一方、穀物粉中にはグルコース含量よりもマルトース含量の方が高いことが知られている。

【0009】

以上のような課題を解決する目的で、グルコース以外の糖質に作用する糖質酸化酵素に関心が持たれてきた。例えば、特許文献４には、Ｄ−グルコース、Ｄ−ラクトース、Ｄ−セロビオース、Ｄ−マルトトリオース、Ｄ−マルトテトラオース、Ｄ−マルトペンタオース、Ｄ−マルトヘキサオース、Ｄ−マルトヘプタオースの各基質に対して良好な反応活性を示すオリゴ糖酸化酵素に関する技術が開示されている。また、特許文献５には、グルコースよりもマルトデキストリンまたはセロデキストリンを優先的に酸化するＭｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ属に属する微生物由来の糖質酸化酵素を用いることにより、ドウまたはパンの特性を改善する技術が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特開第２７８３１５０

【特許文献2】カナダ特許第２０１２７２３

【特許文献3】特開平４−８４８４８号公報

【特許文献4】特開平５−８４０７４号公報

【特許文献5】特表２００１−５２６０５８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

グルコースのような単糖類のみならず、二糖類以上の糖質をも酸化する酵素であれば、グルコースオキシダーゼに比べて、更に広い分野における用途が期待できる。

【0012】

そこで、本発明では、様々な用途に対応し得る新規な糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を提供することを主目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本願発明者らは、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質について鋭意探索を行った結果、広範囲の糖に作用し、かつ、適度な温度安定性を有するタンパク質の生産に成功し、本発明を完成させるに至った。

【0014】

即ち、本発明では、以下の［１］乃至［３２］を提供する。
［１］ 以下の理化学的性質を有するタンパク質。
（１）作用：糖を酸化して糖酸を生成する。
（２）基質特異性：グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
（３）［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1。
［２］ ０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［１］に記載のタンパク質。
［３］ 以下の理化学的性質を有するタンパク質。
（１）作用：糖を酸化して糖酸を生成する。
（２）基質特異性：グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
（３）分子質量：約６３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定）。
［４］ ［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［３］に記載のタンパク質。
［５］ ０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［４］に記載のタンパク質。
［６］ 以下の理化学的性質を有するタンパク質。
（１）作用：糖を酸化して糖酸を生成する。
（２）基質特異性：グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
（３）至適ｐＨ：５．０〜９．０。
（４）安定ｐＨ範囲：５．０〜１０．５。
（５）至適温度：２０℃〜５５℃。
（６）温度安定性：４５℃以下で安定。
（７）分子質量：約６３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定）。
［７］ ［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［６］に記載のタンパク質。
［８］ ０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［７］に記載のタンパク質。
［９］ 以下の理化学的性質を有するＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属微生物由来のタンパク質。
（１）作用：糖を糖酸へ酸化する。
（２）基質特異性：グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
（３）［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1。
［１０］ ０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［９］に記載のタンパク質。
［１１］ 以下の理化学的性質を有するＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属微生物由来のタンパク質。
（１）作用：糖を糖酸へ酸化する。
（２）基質特異性：グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
（３）分子質量：約６３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定）。
［１２］ ［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［１１］に記載のタンパク質。
［１３］ ０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［１２］に記載のタンパク質。
［１４］ 以下の理化学的性質を有するＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属微生物由来のタンパク質。
（１）作用：糖を糖酸へ酸化する。
（２）基質特異性：グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに作用する。
（３）至適ｐＨ：５．０〜９．０。
（４）安定ｐＨ範囲：５．０〜１０．５。
（５）至適温度：２０℃〜５５℃。
（６）温度安定性：４５℃以下で安定
（７）分子質量：約６３ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による測定）。
［１５］ ［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［１４］に記載のタンパク質。
［１６］ ０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1である、［１５］に記載のタンパク質。
［１７］ 前記Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属微生物が、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍである［９］から［１６］に記載のタンパク質。
［１８］ 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質。
［１９］ ［１８］に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
［２０］ 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号６で表される塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［２１］ 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号９で表される塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号９で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［２２］ ［１９］から［２１］のいずれか一項に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
［２３］ ［２２］に記載の組み換えベクターにより宿主細胞が形質転換されてなる形質転換体。
［２４］ ［１］から［１８］のいずれか一項に記載のタンパク質の生産能を有する微生物を栄養培地で培養して得られる培養物から、［１］から［１８］のいずれか一項に記載のタンパク質を採取するタンパク質の製造方法。
［２５］ ［２３］に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物から糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を採取するタンパク質の製造方法。
［２６］ ［１］から［１８］のいずれか一項に記載のタンパク質を用いて、糖質から糖酸を製造する糖酸の製造方法。
［２７］ 食品内の糖質を酸化するための、［１］から［１８］のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
［２８］ ［２７］に記載のタンパク質の使用を少なくとも行う卵白の脱糖方法。
［２９］ ［２８］に記載の脱糖方法を用いた脱糖卵白の製造方法。
［３０］ ［２７］に記載のタンパク質の使用を少なくとも行うパンの品質および／またはドウの物性の改質方法。
［３１］ ［３０］に記載の改質方法を用いたパンの製造方法。
［３２］ ［２７］に記載のタンパク質の使用を少なくとも行うラクトビオン酸の製造方法。

【発明の効果】

【0015】

本発明に係るタンパク質は、広範囲の糖に作用し、かつ、適度な温度安定性を有するため、既存のグルコースオキシダーゼやオリゴ糖酸化酵素では対応できなかった広範囲な分野において、糖質酸化作用を機能させることが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】実施例１における糖質酸化酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図面代用グラフである。レーン１：糖質酸化酵素。

【図2】実施例３におけるｐＨに対する相対活性（％）を示す図面代用グラフである。

【図3】実施例４におけるｐＨに対する相対活性（％）を示す図面代用グラフである。

【図4】実施例５における温度に対する相対活性（％）を示す図面代用グラフである。

【図5】実施例６における温度に対する相対活性（％）を示す図面代用グラフである。

【図6】実施例９における脱糖卵白中の残存グルコース量を示す図面代用グラフである。

【図7】実施例１０において５４℃で加熱処理した際の脱糖卵白中の残存活性を示す図面代用グラフである

【図8】実施例１０において５６℃で加熱処理した際の脱糖卵白中の残存活性を示す図面代用グラフである。

【図9】実施例１０において５８℃で加熱処理した際の脱糖卵白中の残存活性を示す図面代用グラフである。

【図10】実施例１１におけるパンのボリュームを測定した結果を示す図面代用グラフである。

【図11】実施例１１におけるパンの硬さを測定した結果を示す図面代用グラフである。

【図12】実施例１３におけるラクトースを基質としたラクトビオン酸生成のクロマトグラムの結果を示す図面代用グラフである。

【図13】実施例１６における構築した発現プラスミドｐＣＳＧＯＯＸＧの構造を示す概念図である。

【図14】実施例１６における糸状菌形質転換体培養ろ液のＳＤＳ―ＰＡＧＥの結果を示す図面代用グラフである。レーン１：アスペルギルス・オリゼＢＢ―５６の培養ろ液、レーン２：糸状菌形質転換体の培養ろ液。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明を実施するための好適な形態について、詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

【0018】

＜１．糖質酸化酵素活性を有するタンパク質＞
本発明に係るタンパク質は、後述する理化学的性質を有するタンパク質である。

【0019】

本発明において、糖質酸化酵素活性の測定方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して行うことができる。本発明では、特に、後述する実施例に記載の方法によって、糖質酸化酵素活性を測定した。

【0020】

（１）作用
本発明に係るタンパク質は、酸素存在下において、後述する糖を酸化し糖酸を生成する。より詳しくは、酸素存在下において、後述する糖に本発明に係るタンパク質を作用させると、糖酸と過酸化水素が生成する。

【0021】

（２）基質特異性
本発明に係るタンパク質は、グルコース、マルトトリオース、マルトース、ガラクトース、マルトテトラオース、ラクトース、セロビオースに対し活性を示す。各基質に対する本発明に係るタンパク質の相対活性は、グルコースに対する活性を１００％とした場合、マルトトリオース：約９２％、マルトース：約８６％、ガラクトース：約７９％、マルトテトラオース：約６０％、ラクトース：約５８％、セロビオース：約５３％である（後述する実施例２参照）。
なお、本発明においては、グルコースを基質とした場合の活性を基準（１００％）としたときの相対活性が５０％以上あれば、「本酵素が良好に作用する基質である」と判断した。

【0022】

このように、本発明に係るタンパク質は、グルコースのような単糖類のみならず、二糖類以上の広範囲な糖質にも活性を示す。そのため、既存のグルコースオキシダーゼやオリゴ糖酸化酵素では対応できなかった広範囲な分野において、糖質酸化作用を機能させることが可能である。

【0023】

（３）Ｋｍ値
本発明において、タンパク質のＫｍ値（ミカエリス定数）の具体的な算出方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して算出することができる。本発明では、特に、後述する実施例８に記載の方法によって、Ｋｍ値を算出した。本発明に係るタンパク質のＫｍ値は特に限定されないが、［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦１であることが好ましく、０．４≦［グルコースのＫｍ値］／［マルトースのＫｍ値］≦1であることがより好ましい。

【0024】

（４）分子質量
本発明に係るタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子質量が約６３ｋＤａである。

【0025】

（５）至適ｐＨ
本発明に係るタンパク質は、３７℃で５分間の反応条件において、ｐＨ５．０〜９．０付近で最も糖質酸化酵素活性が高い。

【0026】

（６）安定ｐＨ範囲
本発明に係るタンパク質は、３７℃で１５分間の処理条件において、ｐＨ５．０〜１０．５付近において安定である。

【0027】

（７）至適温度
本発明に係るタンパク質は、ｐＨ７．０で５分間の反応条件において、２０℃〜５５℃付近で最も糖質酸化酵素活性が高い。

【0028】

（８）温度安定性
本発明に係るタンパク質は、ｐＨ７．０で１５分間の処理条件において、４５℃までの温度条件で処理しても８０％以上の活性を維持する。

【0029】

（９）由来について
以上説明した本発明に係るタンパク質は、前述の理化学的性質に従来にない特徴を持つため、前述の理化学的性質で特定されるタンパク質であれば、その由来は特に限定されない。本発明においては、例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物に由来するものが挙げられる。この場合、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが挙げられる。

【0030】

ここでの「Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに由来する糖質酸化酵素」とは、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに分類される微生物（野生株であっても変異株であってもよい）が生産する糖質酸化酵素、あるいは糖質酸化酵素遺伝子を利用して遺伝子工学的手法によって得られた糖質酸化酵素であることを意味する。従って、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍより取得した糖質酸化酵素遺伝子（又は当該遺伝子を改変した遺伝子）を導入した宿主微生物によって生産された組換え体も「Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに由来する糖質酸化酵素」に該当する。

【0031】

本発明に係るタンパク質がそれに由来することとなるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの例としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲ Ｃ３００５５（ＮＩＴＥ、日本）、ＡＴＣＣ１５００６（ＡＴＣＣ、アメリカ）、ＤＳＭ８８０（ＤＳＭＺ、ドイツ）を挙げることができる。

【0032】

（１０）アミノ酸配列
本発明に係るタンパク質は、前述の理化学的性質に従来にない特徴を持つため、前述の理化学的性質で特定されるタンパク質であれば、そのアミノ酸構造は限定されないが、一例を挙げると、以下のアミノ酸配列により特定することができる。

【0033】

具体的には、本発明に係るタンパク質は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列で特定することができる。

【0034】

ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ち、アミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで、本発明は他の態様として、配列番号１０で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を提供する。「アミノ酸配列を構成する１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加」とは、典型的にアミノ酸配列の一部の相違のことをいう。

【0035】

ここでのアミノ酸配列の相違は、糖質酸化酵素活性が保持されうる限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限り、アミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは、例えば、全アミノ酸配列の約３０％未満に相当する数であり、好ましくは約２０％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。
即ち、配列番号１０のアミノ酸配列と、例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、より一層好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有することを指す。

【0036】

また、好ましくは、糖質酸化酵素活性に必須でないアミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を生じさせることによって、タンパク質を得る方法がよい。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基は、その側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。

【0037】

ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの核酸（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる。この際、例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（即ち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数及びサイズも考慮に入れる。

【0038】

また、二つの配列の比較及び同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４―６８に記載され、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３―７７において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３―１０に記載のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。本発明の核酸分子に等価なヌクレオチド配列を得るには例えばＮＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２としてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行えばよい。

【0039】

本発明のポリペプチド分子に等価なアミノ酸配列を得るには、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラムでｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３としてＢＬＡＳＴポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためにはＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用可能である。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する場合は、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。

【0040】

配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（１９９８）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ． ４：１１―１７に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバー（ＩＧＨ Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス）又はＩＳＲＥＣサーバーで利用可能なＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合は例えば、ＰＡＭ１２０残基質量表を利用し、ギャップ長ペナルティ＝１２、ギャップペナルティ＝４とすることができる。

【0041】

二つのアミノ酸配列の同一性を、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスを使用し、ギャップ加重＝１２、１０、８、６又は４、ギャップ長加重＝２、３、又は４、として決定することができる。また、二つの核酸配列の相同度を、ＧＣＧソフトウェアパッケージｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムを用いて、ギャップ加重＝５０、ギャップ長加重＝３として決定することができる。

【0042】

本発明に係るタンパク質は、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。

【0043】

上記アミノ酸配列を有する本タンパク質は、遺伝子工学的手法によって容易に調製することができる。例えば、本タンパク質をコードするＤＮＡで適当な宿主細胞（例えば大腸菌）を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜調製される。このように組換えタンパク質として本タンパク質を得ることにすれば、種々の修飾が可能である。例えば、本タンパク質をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本タンパク質を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。

【0044】

＜２．遺伝子、組み換えベクター、形質転換体＞
（１）遺伝子
本発明では、前記タンパク質をコードする遺伝子を提供する。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号１０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む。当該態様の具体例は、配列番号６または配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡである。

【0045】

ところで、一般に、あるタンパク質をコードするＤＮＡの一部に改変を施した場合において、改変後のＤＮＡがコードするタンパク質が、改変前のＤＮＡがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ち、ＤＮＡ配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで、本発明では他の態様として、配列番号６または配列番号９の塩基配列と等価な塩基配列を有し、糖質酸化酵素活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「等価ＤＮＡ」ともいう）を提供する。ここでの「等価な塩基配列」とは、配列番号６または配列番号９に示す核酸と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードするタンパク質の機能（ここでは糖質酸化酵素活性）が実質的な影響を受けていない塩基配列のことをいう。

【0046】

等価ＤＮＡの具体例は、配列番号６または配列番号９の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）やＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃〜約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて約６５℃〜約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として、例えば、ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる条件を挙げることができる。

【0047】

等価ＤＮＡの他の具体例として、配列番号６または配列番号９に示す塩基配列を基準として１若しくは複数（好ましくは１〜数個）の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該ＤＮＡがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２〜４０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは２〜１０塩基である。以上のような等価ＤＮＡは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及び／又は逆位を含むように、配列番号６または配列番号９に示す塩基配列を有するＤＮＡを改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価ＤＮＡを得ることができる。

【0048】

等価ＤＮＡの更に他の例として、ＳＮＰ（一塩基多型）に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるＤＮＡを挙げることができる。

【0049】

本発明の遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって単離された状態に調製することができる。具体的には、適当なＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリー、或はＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの菌体内抽出液から、本発明の遺伝子に対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ・プライマーを適宜利用して調製することができる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーは、市販の自動化ＤＮＡ合成装置などを用いて容易に合成することができる。尚、本発明の遺伝子を調製するために用いるライブラリーの作製方法については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照できる。

【0050】

例えば、配列番号６または配列番号９の塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばＰＣＲ）を利用して増幅及び単離することができる。また、配列番号１０に示すアミノ酸配列や配列番号６または配列番号９の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子を得ることもできる(参考文献：Ｇｅｎｅ，６０（１）， １１５−１２７ （１９８７）)。

【0051】

以下、本発明の遺伝子の取得法の具体例を示す。まず、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍから本酵素（糖質酸化酵素）を単離・精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製した糖質酸化酵素を直接常法に従ってエドマン分解法〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第256巻、第７９９０〜７９９７頁（１９８１）〕によりアミノ酸配列分析〔プロテイン―シーケンサー４７６Ａ、アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製等〕に供する。タンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが有効である。

【0052】

このようにして得られる部分アミノ酸配列情報を基に糖質酸化酵素遺伝子をクローニングする。例えば、ハイブリダイゼーション法又はＰＣＲを利用してクローニングを行うことができる。ハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載の方法を用いることができる。

【0053】

ＰＣＲ法を利用する場合、以下の方法を用いることができる。まず、糖質酸化酵素を産生する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。ＰＣＲ法は、ＰＣＲテクノロジー〔ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）ＨＡ編集、ストックトンプレス社（Ｓｔｏｃｋｔｏｎｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕に記載の方法に準じて行う。更に、この増幅ＤＮＡ断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に糖質酸化酵素の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の糖質酸化酵素遺伝子の一部を取得することができる。得られた遺伝子断片をプローブとして更にハイブリダイゼーション法等を行うことによって糖質酸化酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。

【0054】

後述の実施例では、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが産生する糖質酸化酵素をコードする遺伝子の配列を、ＰＣＲ法を利用して決定した。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来の糖質酸化酵素をコードする遺伝子の全塩基配列を配列番号６に、当該酵素をコードするｃＤＮＡの全塩基配列を配列番号９に示した。また、当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を決定した（配列番号１０）。なお、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対応する塩基配列は配列番号６または配列番号９に記載したもの以外に複数存在する。

【0055】

全塩基配列が明らかにされた糖質酸化酵素遺伝子（配列番号６）の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いることによって、他の糖質酸化酵素を産生する微生物のゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから、配列番号６または配列番号９の糖質酸化酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡを選別することができる。

【0056】

同様に、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって、上記糖質酸化酵素遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出し、さらにはその遺伝子全体を得ることもできる。

【0057】

以上のようにして得られた遺伝子のタンパク質を製造し、その糖質酸化酵素活性を測定することにより、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるか否かを確認することができる。また、得られた遺伝子の塩基配列（又はそれがコードするアミノ酸配列）を上記糖質酸化酵素遺伝子の塩基配列（又はそれがコードするアミノ酸配列）と比較することで遺伝子構造や相同性を調べ、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするか否かを判定することにしてもよい。

【0058】

一次構造及び遺伝子構造が明らかとなったことから、ランダム変異あるいは部位特異的変異の導入によって改変型糖質酸化酵素（１個又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも1つが施された遺伝子）を得ることが可能である。これにより、糖質酸化酵素活性を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ、基質特異性等の性質が異なる糖質酸化酵素をコードする遺伝子を得ることが可能となる。また、遺伝子工学的に改変型糖質酸化酵素を製造することが可能となる。

【0059】

ここで、変異を導入する際の計画は、例えば、遺伝子配列上の特徴的な配列を参酌して行われる。特徴的な配列の参酌は、例えば、そのタンパク質の立体構造予測、既知のタンパク質との相同性を考慮することにより行うことができる。

【0060】

ランダム変異を導入する方法としては、例えば、ＤＮＡを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法〔プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第７９巻、第１４０８〜１４１２頁（１９８２）〕、生化学的方法として、〔α−Ｓ〕ｄＮＴＰ存在下、二本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）、第６４巻、第３１３〜３１９頁（１９８８）〕、ＰＣＲを用いる方法として、反応系にマンガンを加えてＰＣＲを行い、ヌクレオチドの取り込みの正確さを低くする方法〔アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２２４巻、第３４７〜３５３頁（１９９５）〕等が挙げられる。

【0061】

部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）法、ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、第２４号、第９４４１〜９４５６頁（１９８４）〕、制限酵素の認識部位を利用する方法〔アナリティカル バイオケミストリー、第２００巻、第８１〜８８頁（１９９２）、ジーン、第１０２巻、第６７〜７０頁（１９９１）〕、ｄｕｔ（ｄＵＴＰａｓｅ）とｕｎｇ（ウラシルＤＮＡ グリコシラーゼ）変異を利用する方法〔クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法、プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８２巻、第４８８〜４９２頁（１９８５）〕、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法〔オリゴヌクレオチド―ダイレクティッド デュアル アンバー（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｕａｌ Ａｍｂｅｒ：ＯＤＡ）法、ジーン、第１５２巻、第２７１〜２７５頁（１９９５）、特開平７−２８９２６２号公報〕、ＤＮＡの修復系を誘導させた宿主を利用する方法（特開平８−７０８７４号公報）、ＤＮＡ鎖交換反応を触媒するタンパク質を利用する方法（特開平８−１４０６８５号公報）、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法（ＵＳＰ５，５１２，４６３）、不活化薬剤耐性遺伝子を有する二本鎖ＤＮＡベクターと２種類のプライマーを用いたＰＣＲによる方法〔ジーン、第１０３巻、第７３〜７７頁（１９９１）〕、アンバー変異を利用したＰＣＲによる方法〔国際公開ＷＯ９８／０２５３５号公報〕等が挙げられる。

【0062】

その他、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することもできる。市販のキットとしては、例えば、ギャップド デュプレックス法を用いたＭｕｔａｎ（登録商標）―Ｇ（宝酒造社製）、クンケル法を用いたＭｕｔａｎ（登録商標）−Ｋ（宝酒造社製）、ＯＤＡ法を用いたＭｕｔａｎ（登録商標）−ＥｘｐｒｅｓｓＫｍ（宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼを用いたＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ〔ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製〕等を用いることができ、また、ＰＣＲ法を利用するキットとして、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（宝酒造社製）、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造社製）等を用いることができる。

【0063】

このように、本発明により糖質酸化酵素の一次構造及び遺伝子構造が提供されたことにより、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質の安価で高純度な遺伝子工学的製造が可能となる。

【0064】

（２）組み換えベクター
本発明に係る遺伝子は、適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明において用いることができるベクターの種類は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるものではない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）の形態をとり得る。

【0065】

使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例を挙げれば、大腸菌を宿主とするベクター（Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）、酵母を宿主とするベクター（ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等、昆虫細胞を宿主とするベクター（ｐＡｃ、ｐＶＬなど）、哺乳類細胞を宿主とするベクター（ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣなど) 等である。

【0066】

本発明の組換えベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。

【0067】

本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １．８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。

【0068】

（３）形質転換体
本発明に係る組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明の形質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８１， ７１６１−７１６５（１９８４））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４，７４１３−７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ， Ｍ． ＆ Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７３，３６６−３７０（１９７６））、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６， ５５７−５８０（１９８３））、酢酸リチウム法（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ， Ｒ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １６， ３３９−３４６（１９８９））、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法（Ｙｅｌｔｏｎ， Ｍ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１， １４７０−１４７４（１９８４））等によって実施することができる。

【0069】

宿主細胞は、本発明の糖質酸化酵素が発現する限りにおいて特に限定されず、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの乳酸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどのその他の細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、などの酵母、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属などの糸状菌（真菌）などが挙げられる。動物細胞としては、バキュロウイルスの系統などが挙げられる。

【0070】

＜３．糖質酸化酵素活性を有するタンパク質の製造方法＞
本発明に係る糖質酸化酵素活性を有するタンパク質の製造方法は特に限定されず、公知の方法を自由に採用することができる。具体的には、本発明に係るタンパク質は、本発明に係るタンパク質の生産能を有する微生物または本発明に係る形質転換体を栄養培地で培養して得られる培養物から、糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を採取することで製造することができる。

【0071】

本発明に係る製造方法において、用いることができる微生物は、前述した理化学的性質および糖質酸化酵素活性を有するタンパク質の生産能を有する微生物であれば、特に限定されず、公知の微生物を自由に選択して用いることができる。例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物を挙げることができる。この場合、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物としては、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが挙げられる。

【0072】

また、本発明に係る製造方法において使用する前記微生物は、野生株に限らず、上記野生株を紫外線、エックス線、放射線、各種薬品などを用いる人工的変異手段で変異した変異株であっても、前記の糖質酸化酵素活性を有する酵素の生産能を有する限り、使用することが可能である。

【0073】

本発明に係る製造方法における培養には、公知の手法を適宜採用することができ、例えば液体培養及び固体培養の何れも任意に用いることができる。

【0074】

本発明に係る製造方法における培養に際し、用いることができる培地の炭素源は特に限定されず、公知の培地に用いられる炭素源を、１種または２種以上自由に選択して用いることができる。例えば、グルコース、フルクトース、ショ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキストリン、レシチンなどを挙げることができる。

【0075】

また、窒素源も特に限定されず、公知の培地に用いられる窒素源を、１種または２種以上自由に選択して用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機窒素源や、コーングルテンミール、大豆粉、カザミノ酸、コーヒー粕、綿実油粕、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス、アミノ酸、ペプトンなどの有機窒素源など、いずれも用いることが可能である。

【0076】

更に、無機栄養源も特に限定されず、公知の培地に用いられる無機栄養源を、１種または２種以上自由に選択して用いることができる。例えば、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、鉄、亜鉛、カルシウム、マンガンの塩類の他、ビタミンなどを挙げることができる。

【0077】

本発明に係る製造方法における培養を行う具体的温度は特に限定されず、本発明の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。本発明においては特に、２０〜３５℃の温度範囲で行うことが好ましく、２５〜３０℃の温度範囲で行うことがより好ましい。

【0078】

また、培地のｐＨも特に限定されず、本発明の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。本発明においては特に、ｐＨ５〜８に設定することが好ましく、ｐＨ６〜７に設定することがより好ましい。

【0079】

本発明に係る製造方法における培養期間も特に限定されず、本発明の効果を損なわない限り、菌体濃度、培地ｐＨ、培地温度、培地の構成などに応じて自由に設定することができる。本発明においては特に、培養期間を３〜８日に設定することが好ましく、４〜７日に設定することがより好ましい。培養法としては例えば静置培養、振盪培養法、ジャー・ファーメンターなどによる好気的深部培養法が利用できる。

【0080】

このようにして、菌体を培養した後、本発明のタンパク質を精製・回収する。タンパク質の精製・回収方法は、特に限定されず、公知の方法を自由に選択して行うことができる。

【0081】

例えば、培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本タンパク質を得ることができる。

【0082】

他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより本タンパク質を得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。

【0083】

尚、発現の確認や発現産物の確認は、糖質酸化酵素に対する抗体を用いて行うことが簡便であるが、糖質酸化酵素活性を測定することにより発現の確認を行うこともできる。

【0084】

本発明の他の態様では、上記の形質転換体を用いて糖質酸化酵素を製造する。この態様の製造法ではまず、それに導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下で上記の形質転換体を培養する。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質（即ち、糖質酸化酵素）を回収する。回収及びその後の精製については、上記態様の場合と同様に行えばよい。

【0085】

＜４．本発明に係るタンパク質の使用、その用途＞
本発明のタンパク質の具体的な使用形態は特に限定されないが、例えば酵素剤の形態で提供することができる。酵素剤は、有効成分（本発明のタンパク質）の他、薬理学的に許容される添加剤を１種または２種以上自由に選択して含有させることができる。例えば、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ−グルコース、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。

【0086】

本発明に係るタンパク質を用いて、前述の基質となり得る糖質を酸化することにより、糖酸を製造することができる。本発明に係るタンパク質は、前述の基質となり得る糖質が存在すれば、あらゆる分野において糖質酸化酵素として機能させることができる。特に、本発明に係るタンパク質は、広範囲の糖に対して作用するという特徴を有しているため、複数種の糖を一度に酸化する必要性を有する場合などに好適に用いることができる。また、本発明に係るタンパク質は、適度な温度安定性を有するため、例えば、糖質を酸化して糖酸を製造した後に、その酵素活性を不活化させる必要がある場合などに好適に用いることができる。

【0087】

具体的な一例としては、例えば、食品内の糖質を酸化するために好適に使用することができる。そして、この使用方法を利用して、様々な用途に応用することができる。例えば、（１）卵白の脱糖方法、脱糖卵白の製造方法、（２）パンの品質および／またはドウの物性の改質方法、パンの製造方法、（３）ラクトビオン酸の製造方法などに好適に用いることができる。

【0088】

（１）卵白の脱糖方法、脱糖卵白の製造方法
本発明に係るタンパク質は、卵白の脱糖に好適に用いることができる。
卵白内に含まれるグルコースなどの糖は、例えば、菓子などを製造する際、メイラード反応による着色を起こすという問題がある。そこで、従来から、菓子などの製造には、脱糖卵白が使用されている。

【0089】

卵白の脱糖には、従来、グルコースオキシダーゼによる処理や、酵母などを用いた発酵法が用いられている。しかし、グルコースオキシダーゼによる処理では、一般的に温度安定性が高いため、脱糖後の卵白中で活性が残存するという問題があった。活性が残存したグルコースオキシダーゼは、例えば、菓子原料中に含まれるグルコースを酸化してしまい甘味を減少させてしまうという問題を引き起こしていた。また、発酵法では、脱糖処理後の卵白に、発酵臭がつくという問題があり、卵白の用途が制限されるという問題があった。

【0090】

また、本発明に係るタンパク質の温度安定性は高すぎることなく、適度な温度安定性を示すため、脱糖後の卵白中では、活性が低減するといった特徴がある。そのため、活性残存による最終的な食品の甘味を減少させるといった問題を低減することができる。

【0091】

更に、本発明に係るタンパク質を用いた脱糖方法は、卵白中の糖を糖酸に変化させる方法であり、発酵法とは異なるため、発酵臭などの問題も解決することが可能である。

【0092】

（２）パンの品質および／またはドウの物性の改質方法、パンの製造方法
本発明に係るタンパク質は、パンの品質および／またはドウの物性の改質に好適に用いることができる。
具体的には、製パンに用いられる材料中に含まれる糖質を酸化して過酸化水素を発生させることにより、パンの生地（ドウ）を引き締め、製造工程におけるベタつきを軽減させて、ハンドリングし易く物性改良することができる。

【0093】

従来から、小麦粉に糖質酸化酵素を添加することにより、パンの生地（ドウ）の物性改良が行われている。具体的には、パンの生地（ドウ）の引き締め効果を期待して、グルコースオキシダーゼを単独、あるいは他の酵素と併用して、パンの製造に用いられている。しかし、小麦粉中のグルコースの存在量は、一般的に０〜０．４重量％の範囲であるため、グルコースオキシダーゼのみで実際に品質向上させるのは難しく、他の酵素と併用する必要があった。

【0094】

一方、本発明に係るタンパク質は、前述の通り、グルコース以外にも広範囲の糖に作用するため、本発明に係るタンパク質のみで、パンの品質やドウの物性の優れた改質効果を発揮することができる。

【0095】

（３）ラクトビオン酸の製造方法
本発明に係るタンパク質は、ラクトースに対しても作用するため、ラクトースを酸化させてラクトビオン酸を製造する方法に好適に用いることができる。

【0096】

ラクトビオン酸は、カルシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛など無機カチオンと塩を作ることにより、ミネラルの吸収を促進することが知られている。また、化粧料分野においては酸化防止剤としてラクトビオン酸が、食品分野においては、安定剤としてラクトビオン酸カルシウムが広く使用されている。このように、本発明に係るタンパク質は、幅広い分野で使用されているラクトビオン酸の製造にも好適に利用することが可能である。

【0097】

従来、ラクトビオン酸は、乳に酢酸菌などを接種し発酵させるなどして、乳中のラクトースをラクトビオン酸に変換させるなどの方法が行われてきた。
しかし、本発明に係るタンパク質を用いることで、酵素法によるラクトビオン酸の製造が可能となる。

【実施例】

【0098】

以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するとともに、本発明の効果を検証する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。

【0099】

なお、本実施例において、特に記載しない限り、糖質酸化酵素活性の測定は、以下の方法で行った。
＜糖質酸化酵素活性測定方法＞
０．１５％（Ｗ／Ｖ）フェノール及び０．１５％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００を含む０．１Ｍリン酸一カリウム―水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌ、１０％マルトース一水和物溶液０．５ｍｌ、２５Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ溶液０．５ｍｌ、及び０．４％（Ｗ／Ｖ）４−アミノアンチピリン溶液０．１ｍｌを混合し、３７℃で１０分保温後、酵素溶液０．１ｍｌを添加し、反応を開始した。酵素反応の進行と共に、波長５５０ｎｍに吸収を持つキノンイミン色素が生成されるため、１分間あたりの波長５５０ｎｍにおける吸光度の増加を測定することにより糖質酸化活性を測定した。なお、１分間に１μｍｏｌのマルトース一水和物を酸化するのに必要な酵素量を1単位とした。

【0100】

＜実施例１：糖質酸化酵素活性を有するタンパク質の生産及び精製＞
実施例１では、本発明に係る糖質酸化酵素活性を有するタンパク質を精製した。なお、以下の実施例では、本発明に係るタンパク質の生産能を有する微生物の一例として、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属微生物であるＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを用いた。

【0101】

（１）培養
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５、ＡＴＣＣ１５００６、ＤＳＭ８８０の３株を前培養後、下記表１に示す組成の液体培地を用いて、30℃、6日間振盪培養を行った。培養後、培養液をＮｏ．２のろ紙（アドバンテック東洋製）でろ過することにより、培養ろ液を回収した。得られた培養ろ液中の糖質酸化酵素活性を、前記糖質酸化酵素活性測定法にて測定した。その結果を表２に示す。

【0102】

【表1】

【0103】

【表2】

【0104】

（２）Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５由来糖質酸化酵素の精製
前記で得られた培養ろ液を、ラヂオライトファインフローＡ（昭和化学工業製）を用いて珪藻土ろ過し、次いでＵＦ膜（ＡＩＰ−１０１３Ｄ、旭化成製）にて濃縮後、６５％飽和濃度になるよう硫酸アンモニウムを添加し、得られた上清に９０％飽和濃度となるよう硫酸アンモニウムを添加した。得られた沈殿画分を、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／１０ Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア製）に供し、２Ｍから０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾配により、吸着した糖質酸化酵素タンパク質を溶離させた。

【0105】

集めた糖質酸化酵素画分をＵＦ膜にて濃縮後、１ｍＭ塩化マンガン、１ｍＭ塩化カルシウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて透析した。得られた透析内液を１ｍＭ塩化マンガン、１ｍＭ塩化カルシウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて平衡化したＨｉＴｒａｐ ＣｏｎＡ ４Ｂカラム（ＧＥヘルスケア製）に供し、０．５Ｍ Ｍｅｔｈｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＭＤＧＰ）、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）へのステップワイズ溶出により、吸着した糖質酸化酵素タンパク質を溶離させた。

【0106】

集めた糖質酸化酵素画分をＵＦ膜にて濃縮後、２０ｍＭリン酸一カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて透析し、透析内液を２０ｍＭリン酸一カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化したＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ ５／５カラム（ＧＥヘルスケア製）に供し、０Ｍから１Ｍの塩化ナトリウム直線濃度勾配により、吸着した糖質酸化酵素タンパク質を溶離させた。

【0107】

さらに、集めた糖質酸化酵素画分をＵＦ膜にて濃縮後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて透析し、得られた透析内液を０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇカラム（ＧＥヘルスケア製）に供し、同緩衝液で溶離した。糖質酸化酵素タンパク質を集め、限外ろ過膜にて脱塩濃縮をし、精製酵素標品を得た。得られた本精製酵素は下記の諸性質の検討に供し、また内部ペプチドアミノ酸配列分析に供した。

【0108】

なお、各段階における精製の結果を下記表３に示した。最終段階の比活性は粗酵素に比較して約１６０倍となった。図１に、最終精製工程におけるサンプルを１０％のゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）した結果を示す。

【0109】

【表3】

【0110】

＜実施例２：基質特異性の検討＞
実施例２では、各基質に対する基質特異性を調べた。

【0111】

下記表４に記載の各糖質を基質として、酸素の存在下にて、前記実施例１で精製したタンパク質をｐＨ７．０、３７℃で５分間作用させ、上記糖質酸化酵素活性測定法に準じ測定した。さらに、グルコースに対する活性を１００％として、それぞれの糖質に対する相対活性値を算出することにより、基質特異性を評価した。結果を下記表４に示す。

【0112】

【表4】

【0113】

表４に示す通り、グルコース、マルトース一水和物、マルトトリオース、マルトテトラオース、ガラクトース、ラクトース一水和物、Ｄ（＋）−セロビオースに対してはよく作用した。Ｄ（−）−フルクトース、スクロースには作用しなかった。

【0114】

＜実施例３：至適ｐＨの検討＞
上記糖質酸化酵素活性測定法に準じ、各緩衝液(グリシン―塩酸緩衝液（ｐＨ２．０、ｐＨ３．０）、クエン酸―クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０）、リン酸一カリウム―リン酸二カリウム緩衝液（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０）、トリス―塩酸緩衝液（ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）、炭酸ナトリウム―炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０、ｐＨ１０．０、ｐＨ１１．０）、リン酸一カリウム―水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）)中、３７℃で５分間の反応条件下で測定した。また、リン酸一カリウム―水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いたときの活性を１００％として、それぞれの相対活性値を算出した。結果を図２の図面代用グラフに示す。至適ｐＨは５．０〜９．０であった。

【0115】

＜実施例４：安定ｐＨ範囲の検討＞
前記実施例１で精製したタンパク質溶液と、前記実施例３で用いた各ｐＨ緩衝液を等量混合し、３７℃で１５分処理後、上記糖質酸化酵素活性測定法にて活性を測定した。なお、基質としては、マルトースを用いた。また、リン酸一カリウム―水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて処理したときの活性を１００％として、それぞれの相対活性値を算出した。結果を図３の図面代用グラフに示す。ｐＨ５．０からｐＨ１０．５の範囲では、８５％以上の残存活性を有しており、ｐＨ５．０からｐＨ１０．５の範囲では安定であった。

【0116】

＜実施例５：至適温度の検討＞
マルトースを基質として、酸素の存在下にて、前記実施例１で精製したタンパク質をｐＨ７．０、反応温度を２０℃、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃及び６５℃で５分間作用させ、過酸化水素を生成させた。生成した過酸化水素に、アミノアンチピリン、ＴＯＯＳ（株式会社同仁化学研究所製）の存在下でペルオキシダーゼを作用させ、生成したキノンイミン色素の呈する色調を波長５５５ｎｍで測定し、定量した。また、反応温度を３７℃としたときの活性を１００％として、それぞれの相対活性値を算出した。結果を図４の図面代用グラフに示す。至適温度は２０℃〜５５℃であった。

【0117】

＜実施例６：温度安定性の検討＞
前記実施例１で精製したタンパク質溶液を、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃及び８０℃の各温度下、１５分間熱処理した後、残存活性を上記糖質酸化酵素活性方法にて測定した。熱に対して未処理の活性を１００％として、それぞれの残存活性値を算出した。結果を図５の図面代用グラフに示す。４５℃、１５分間の熱処理では、８０％以上の残存活性を有しており、４５℃までは安定であった。

【0118】

＜実施例７：分子質量の測定＞
前記実施例１で精製したタンパク質について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分子質量を算出した結果、約６３ｋＤａであることが分かった。

【0119】

＜実施例８：Ｋｍ値の測定＞
前記実施例１で精製したタンパク質について、グルコース、マルトースを基質として、上記糖質酸化酵素活性方法にて活性測定を行い、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから、それぞれのミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。この結果、グルコースに対するＫｍ値は８ｍＭ、マルトースに対するＫｍ値は１４ｍＭであることが判明した。

【0120】

＜実施例９：卵白の脱糖＞
実施例９では、前記実施例１で精製したタンパク質およびグルコースオキシダーゼ（「ハイデラーゼ１５」天野エンザイム株式会社製）を用いて、卵白の脱糖を行った。

【0121】

（１）卵白の調製
卵白と卵黄を分け、泡だて器で卵白が泡立たない程度で水溶卵白と濃厚卵白を混合し、駒込ピペットを用いて、２０ｍＬずつ１００ｍＬフラスコに分注した。分注したそれぞれの１００ｍＬフラスコに、攪拌子を入れ、ウォーターバス付きスターラーで強めに攪拌することにより、卵白を調製した。

【0122】

（２）卵白の脱糖反応
前記で調製した卵白に、前記実施例１で精製したタンパク質６Ｕもしくは１５Ｕ、グルコースオキシダーゼ６Ｕもしくは１５Ｕをそれぞれ添加し、水分の蒸発を防ぐためにアルミホイルでフタをして、反応をスタートさせた。

【0123】

酵素添加前、反応開始後１〜５時間まで１時間毎に、５００μＬのサンプリングを行った。その後、−３０℃で冷凍することにより反応を停止させた。

【0124】

（３）残存グルコース量の測定
前記でサンプリングしたそれぞれの卵白について、残存するグルコース量を測定した。グルコース量の測定は、処理卵白溶液中のα‐Ｄ‐グルコースをムタロターゼによりβ‐Ｄ‐グルコースとした後、β‐ＮＡＤ＋存在下、グルコースデヒドロゲナーゼでＤ‐グルコノ‐１，５‐ラクトンへと変換する。その際に生じるβ‐ＮＡＤＨ+を波長３４０ｎｍ
で測定することで定量した。

【0125】

具体的には、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウム、０．１４％ＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、０．８ｍＭβ‐ＮＡＤ＋、２Ｕ／ｍ１ＭＵＴ“ＡＭＡＮＯ”II（天野エンザイム株式会社製）、１４Ｕ／ｍｌＧＬＵＣＤＨ“ＡＭＡＮＯ” II（天野エンザイム株式会社製）を含む１００ｍＭＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）３．４ｍｌに適宜希釈した処理卵白溶液７６μｌを添加し、３７℃で１０分保温した。保温後、波長３４０nmにおける吸光度を測定することで残存グルコース量を定量した。

【0126】

（４）結果
結果を図６の図面代用グラフに示す。図６の図面代用グラフに示す通り、グルコースオキシダーゼを用いた場合に比べ、本発明に係るタンパク質を用いて脱糖を行った場合の方が、脱糖後の卵白における残存グルコースの量が、優位に低下することが分かった。

【0127】

＜実施例１０：卵白脱糖後の熱失活条件の検討＞
実施例１０では、卵白脱糖後の熱失活条件について検討を行った。
具体的には、実施例９と同様に調製した卵白に、本発明に係るタンパク質およびグルコースオキシダーゼを、それぞれ１５Ｕ添加し、５時間脱糖反応を行った。脱糖反応後の卵白１００μＬを５４、５６、５８℃の温度で、それぞれ１、３、５、８分加熱処理した後に氷冷し、各酵素の残存活性を測定した。

【0128】

５４℃の結果を図７に、５６℃の結果を図８に、５８℃の結果を図９にそれぞれ示す。図７〜９の図面代用グラフに示す通り、５４および５６℃で加熱処理した場合は、本発明に係るタンパク質およびグルコースオキシダーゼのいずれも、活性の低下があまり見られないものの、５８℃で５分以上加熱処理した場合には、グルコースオキシダーゼに比べ、本発明に係るタンパク質の活性が、明らかに低下することが分かった。

【0129】

＜実施例１１：パンの製造＞
実施例１１では、前記実施例１で精製したタンパク質、グルコースオキシダーゼ（「ハイデラーゼ１５」天野エンザイム株式会社製）およびヘミセルラーゼ（「ヘミセルラーゼ「アマノ」９０」天野エンザイム株式会社製）を用いて、パンの製造を行った。

【0130】

（１）パンの調製方法
山型パン用基本材料（強力粉２６０ｇ；砂糖１０．９ｇ；食塩５．２ｇ；ショートニング；７．８ｇ；脱脂粉乳７．８ｇ；ドライイースト３．１ｇ；精製水１９２ｍｌ）またはこの材料に前記実施例１で精製したタンパク質１０Ｕを添加したもの、同じくこの材料に前記実施例１で精製したタンパク質１０Ｕとヘミセルラーゼ１００ｐｐｍを添加したもの、グルコースオキシダーゼ１０Ｕを添加したものをそれぞれ調製し、ホームベーカリーＳＤ‐ＢＭＳ１０２（パナソニック株式会社製）に供した。

【0131】

（２）物性測定
焼きあがった各サンプルのパンの重量、ボリューム（菜種置換法）を測定した。また、焼き上がりから２時間後に、ボリューム（菜種置換法）を測定し、各サンプルのパンをそれぞれビニール袋に入れ、口を輪ゴムで縛り、２５℃で４日間保管した。保管１日目にパンを２ｃｍの厚さにスライスした。保管１日目と４日目にパンの中央部を直径４７ｍｍの円柱状にカットした。各サンプルのパンの硬さを、ＳＵＮ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＣＯＭＰＡＣ―１００II（株式会社サン科学製）を用いて圧縮スピード１ｍｍ／秒で１０ｍｍ圧縮したときの最大荷重で測定した。

【0132】

（３）結果
前記で測定したボリュームを図１０、パンの硬さを図１１に示す。図１０および１１に示す通り、グルコースオキシダーゼに比べ、本発明に係るタンパク質を用いた方が、ボリュームが減り、硬さが増す結果となった。これは、生地の引き締め効果が強いことを意味する。即ち、本発明に係るタンパク質を用いれば、従来のグルコースオキシダーゼに比べて、少ない量でパンの物性を改善できることが分かった。また、ヘミセルラーゼとの併用で酵素無添加と同程度のボリュームにすることができた。グルコースオキシダーゼに比べ、本発明に係るタンパク質を用いた方が、生地のベタつきが減少し、機械に付着しにくくなり、製造時のハンドリングが向上することも分かった。

【0133】

＜実施例１２：パン生地（ドウ）の物性改質＞
実施例１２では、前記実施例１で精製したタンパク質、グルコースオキシダーゼ（「ハイデラーゼ１５」天野エンザイム株式会社製）およびヘミセルラーゼ（「ヘミセルラーゼ「アマノ」９０」天野エンザイム株式会社製）を用いて、パンの製造を行った。

【0134】

（１）パン生地の調製方法
山型パン用基本材料（強力粉２６０ｇ；砂糖１０．９ｇ；食塩５．２ｇ；ショートニング；７．８ｇ；脱脂粉乳７．８ｇ；ドライイースト３．１ｇ；精製水１９２ｍｌ）またはこの材料に前記実施例１で精製したタンパク質１７Ｕを添加したもの、同じくこの材料にグルコースオキシダーゼ１７Ｕを添加したもの、ヘミセルラーゼ５０ｐｐｍを添加したもの、アスコルビン酸５０ｐｐｍを添加したものをそれぞれ調製し、ホームベーカリーＳＤ―ＢＭＳ１０２（パナソニック株式会社製）に供した。パン生地コースでスタートし、１時間終了後、パン生地を取り出し、トスロン密閉容器(角型)に入れ、室温にて３０分放置した。

【0135】

（２）結果
前記で調製した生地の扱いやすさを下記表５に示す。

【表5】

【0136】

表５に示す通り、本発明に係るタンパク質やアスコルビン酸を添加した生地は、機械に付着することがなく、取り出しもスムーズに行うことができた。一方、グルコースオキシダーゼを添加した生地はややべとつき、ヘミセルラーゼを添加した生地は非常にべたつき、手に残ってしまい、製造時のハンドリングが悪いことが分かった。更に、本発明に係るタンパク質を添加した生地を目視により観察すると、網目状を呈していることが確認できた。

【0137】

＜実施例１３：ラクトビオン酸の製造＞
実施例１３では、前記実施例１で精製したタンパク質を用いて、ラクトビオン酸の製造を行った。

【0138】

（１）ラクトビオン酸の製造
ラクトース一水和物０．７５ｇ、炭酸カルシウム０．２２５ｇ、前記実施例１で精製したタンパク質３Ｕを含む溶液を３ｍｌ添加し、４０℃、１６０ｒｐｍの条件で２３時間振とうした。

【0139】

（２）ラクトビオン酸生成の確認
反応後のサンプルを１０分間煮沸した後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。得られた上澄みを０．４５μｍのフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析条件は下記表６に示す通りである。

【表6】

【0140】

上記分析の結果を図１２に示す。図１２に示す通り、ラクトビオン酸の生成を確認することが出来た。この結果から、本発明に係るタンパク質を用いて酵素法によるラクトビオン酸の製造が可能であることが証明された。

【0141】

＜実施例１４：Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５由来糖質酸化酵素をコードする遺伝子断片の取得＞
（ａ）染色体ＤＮＡの単離
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５を下記表７に示すＹＰＤ培地１００ｍｌを入れた坂口フラスコを用いて、２５℃、３日間培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。

【0142】

【表7】

【0143】

前記で得た菌体を−８０℃で凍結後、凍結乾燥して得られた重量約０．３ｇの菌体を薬匙１杯の海砂とともに乳鉢、乳棒を用いて破砕し、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１%Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、０．７Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ トリス‐塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＥＤＴＡ、１%メルカプトエタノール）１２ｍｌに懸濁した。室温で３０分回転攪拌を続けた後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えて攪拌、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）して上清を得た。得られた上清に、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加えて攪拌、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）して上清を得た。その結果得られた上清に、等量のイソプロパノールを穏やかに加えた。この処理によって析出した染色体ＤＮＡを遠心分離（２０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、得られた沈殿を、７０%エタノールで洗浄し、真空乾燥した。このようにして得られた染色体ＤＮＡを、再びＴＥ４ｍｌに溶解し、１０ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡ(シグマアルドリッチ株式会社製)２００μｌ加えた後、３７℃、３０分間インキュベートした。次いで、２０ｍｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ, ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ, ＰＣＲ Ｇｒａｄｅ（ロシュ・アプライドサイエンス株式会社製）溶液４０μｌ加えて３７℃、３０分間インキュベートした後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えた。攪拌後、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）して上清を得た。この洗浄操作を２回繰り返した後、得られた上清にクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液を加えて攪拌、遠心分離（１，５００ｇ、５分、室温）を行った。その結果得られた上清に対して、１／１０容量の３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．８）と２倍容量のエタノールを加えて−８０℃で冷却することにより染色体ＤＮＡを析出させた。析出した染色体ＤＮＡを遠心分離（２０，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により回収した。回収された染色体ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、真空乾燥させ、最後に４００μｌのＴＥ溶液に溶解して濃度約１ｍｇ／ｍｌの染色体ＤＮＡを得た。

【0144】

（ｂ）部分アミノ酸配列の決定
前記実施例１で精製したタンパク質をアミノ酸配列解析に供し、内部アミノ酸配列（配列番号１、２、３）を決定した。
（ｃ）ＰＣＲによるＤＮＡプローブの作成
内部アミノ酸配列を基に２種の混合オリゴヌクレオチド（配列番号４、５）を合成し、ＰＣＲプライマーとした。これらのプライマーを用い、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５の染色体ＤＮＡを鋳型として、以下の条件にてＰＣＲ反応を行った。

【0145】

＜ＰＣＲ反応液＞
１０×ＰＣＲ反応緩衝液（ＴａＫａＲａ社製) ５．０μＬ
ｄＮＴＰ混合液（それぞれ２．５ｍＭ、ＴａＫａＲａ社製） ８．０μＬ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５．０μＬ
５０μＭ センス・プライマー ０．５μＬ
５０μＭ アンチセンス・プライマー ０．５μＬ
蒸留水 ２９．５μＬ
染色体ＤＮＡ溶液（１００μｇ/ｍＬ） １．０μＬ
Ｌａ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製） ０．５μＬ

【0146】

＜ＰＣＲ反応条件＞
ステージ１：変性（９４℃、１分） １サイクル
ステージ２：変性（９４℃、３０秒） ３０サイクル
アニール（５５℃、３０秒）
伸長（７２℃、１．５分）
ステージ３：伸長（７２℃、３分） １サイクル

【0147】

得られた約１ｋｂのＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニング後、塩基配列を確認したところ、センス・プライマーの直後とアンチセンス・プライマーの直前に、上記の部分アミノ酸配列をコードする塩基配列が見出された。本ＤＮＡ断片を全長遺伝子クローニングのためのＤＮＡプローブとした。

【0148】

（ｄ）遺伝子ライブラリーの作製
Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５の染色体ＤＮＡのサザン・ハイブリダイゼーション解析の結果、ＸｂａＩ分解物中にプローブＤＮＡとハイブリダイズする約３ｋｂのシングルバンドが確認された。この約３ｋｂのＸｂａＩＤＮＡ断片をクローニングするため、以下の様に遺伝子ライブラリーを作製した。

【0149】

上記（ａ）で調製した染色体ＤＮＡのＸｂａＩ処理を行った。染色体ＤＮＡ５０μｇ、１０×Ｍ緩衝液４０μＬ、１０×ＢＳＡ緩衝液４０μＬ、蒸留水３０２．０μＬ、及びＸｂａＩを８．０μＬ混合し、３７℃で１５時間処理した。得られた分解物をＸｂａＩ処理したｐＵＣ１９ベクター（ＴａＫａＲａ社製）にライゲーションし、遺伝子ライブラリーを得た。

【0150】

（ｅ）遺伝子ライブラリーのスクリーニング
上記（ｃ）で得た１ｋｂのＤＮＡ断片をＤＩＧ−Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてラベルした。これをＤＮＡプローブとして、（ｄ）で得た遺伝子ライブラリーをコロニー・ハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。得られたポジティブコロニーからプラスミドｐＵＣＧＯＯＸを得た。

【0151】

（ｆ）塩基配列の決定
前記で得られたプラスミドｐＵＣＧＯＯＸの塩基配列を定法に従って決定した。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５由来糖質酸化酵素をコードする塩基配列（１６８１ｂｐ）を配列番号６に示す。

【0152】

＜実施例１５：Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５由来糖質酸化酵素をコードするｃＤＮＡ断片の取得＞
（ａ）ｍＲＮＡの単離
前記実施例１に記載の培養条件でＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５を２５℃、３日間培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。この菌体を用いてＲＮｅａｓｙプラントミニキット（株式会社ＱＩＡＧＥＮ製）によりＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡをＧｅｎＥｌｕｔｅ（登録商標）ダイレクトｍＲＮＡミニプレップキット（シグマアルドリッチ株式会社製）に供し、ｍＲＮＡを得た。

【0153】

（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ
前記実施例１４で得たＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５由来糖質酸化酵素をコードする塩基配列（１６８１ｂｐ）（配列番号６）を基に２種のオリゴヌクレオチド（配列番号７、８）を合成し、ＰＣＲプライマーとした。上記（ａ）で得たｍＲＮＡを鋳型にＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて以下の条件にてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。

【0154】

＜鋳型ＲＮＡの変性・アニーリング反応液＞
ｄＮＴＰ混合液（それぞれ１０ｍＭ、ＴａＫａＲａ社製） １．０μＬ
２μＭ アンチセンスプライマー １．０μＬ
ｍＲＮＡ溶液 ４．０μＬ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ４．０μＬ

【0155】

＜鋳型ＲＮＡの変性・アニーリング条件＞
ステージ１：変性（６５℃、５分） １サイクル
ステージ２：冷却（４℃、∞） １サイクル

【0156】

＜鋳型ＲＮＡの逆転写反応液＞
変性・アニーリング済み反応液 １０μＬ
５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社製） 4μＬ
ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）（ＴａＫａＲａ社製） ０．５μＬ
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ（ｆｏｒ ２ｓｔｅｐ)（ＴａＫａＲａ社製） ０．５μＬ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ５μＬ

【0157】

＜鋳型ＲＮＡの逆転写反応条件＞
ステージ１：４２℃、３０分 １サイクル
ステージ２：９５℃、５分 １サイクル
ステージ３：４℃、∞ １サイクル

【0158】

＜ＰＣＲ反応液＞
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（２×）（ＴａＫａＲａ社製） ５０μＬ
２０μＭセンスプライマー １μＬ
２０μＭアンチセンスプライマー １μＬ
逆転写反応液 ５μＬ
滅菌水 ４３μＬ

【0159】

＜ＰＣＲ反応条件＞
ステージ１：変性（９８℃、１０秒） ３０サイクル
アニール（５５℃、５秒）
伸長（７２℃、２分）

【0160】

（ｃ）塩基配列の決定
得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片をＳｍａＩ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にクローニング後、得られたプラスミドｐＵＣｃＧＯＯＸの塩基配列を定法に従って決定した。Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５由来糖質酸化酵素をコードするｃＤＮＡ（１５１８ｂｐ）を配列番号９に示す。配列番号９によりコードされるアミノ酸配列（アミノ酸）を配列番号１０に示す。このアミノ酸配列中には、前述実施例１５（ｂ）で決定した内部アミノ酸配列（配列番号１、２、３）が見出された。

【0161】

＜実施例１６：Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５由来糖質酸化酵素の糸状菌での発現＞
（ａ）発現プラスミドの構築
前記実施例１５で使用した２種のオリゴヌクレオチド（配列番号７、８）を用い、アスペルギルス宿主細胞中での発現のためにＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＮＢＲＣ３００５５由来糖質酸化酵素をコードするｃＤＮＡを鋳型として以下の条件にてＰＣＲ反応を行った。

【0162】

＜ＰＣＲ反応液＞
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（２×）（ＴａＫａＲａ社製） ２５μＬ
２０μＭセンスプライマー １μＬ
２０μＭアンチセンスプライマー １μＬ
プラスミドｐＵＣｃＧＯＯＸ １μＬ
滅菌水 ２２μＬ

【0163】

＜ＰＣＲ反応条件＞
ステージ１：変性（９８℃、１０秒） ３３サイクル
アニール（５５℃、５秒）
伸長（７２℃、１５秒）

【0164】

得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて確認後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＥｘｔｒａｃｔII（日本ジェネティクス社製）で精製した。

【0165】

発現ベクターｐＣＳＦＧＰは調節配列として特許第４４９５９０４号に記載の改変プロモーター及びアスペルギルス・オリゼＢＢ‐５６由来フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコース脱水素酵素ターミネーター、ならびに真菌形質転換のための選択可能マーカーアスペルギルス・オリゼＢＢ‐５６由来ｐｙｒＧ遺伝子を含有する。当該発現ベクターは大腸菌中での選択のためのａｍｐ遺伝子も含有する。

【0166】

前記で得られたＤＮＡ断片をリン酸化処理し、ｐＣＳＦＧＰ中でクローン化して発現プラスミドｐＣＳＧＯＯＸＧを生じた。構築したプラスミドｐＣＳＧＯＯＸＧを図１３に示す。

【0167】

発現プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（ＴａＫａＲａ社製）中で形質転換させた。正確なプラスミドを含有する形質転換体を単離し、プラスミドＤＮＡを得た。

【0168】

（ｂ）糖質酸化酵素の糸状菌での発現
前記で得られた発現プラスミドｐＣＳＧＯＯＸＧによるアスペルギルス・オリゼの形質転換を次のように行った。ｐｙｒＧ遺伝子の欠損株であるアスペルギルス・オリゼＢＢ‐５６ｐｙｒＧ‐を、前記表７に示す培地に０．２％ウリジン、０．１％ウラシルを添加した培地で３０℃、一晩振とう培養した後、得られた菌体を細胞壁溶解液(２０ｍｇ／ｍｌ Ｙａｔａｌａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）、０．３ｍｇ／ｍｌ Ｎｏｖｏｚｙｍ−２３４（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）、０．８Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）)に懸濁し、３０℃で1〜２時間緩やかに振とうすることによりプロトプラスト化させた。そしてプロトプラストを含む懸濁液をナイロンフィルターでろ過して残存する菌体を除去した。

【0169】

尚、アスペルギルス・オリゼＢＢ‐５６ｐｙｒＧ‐はＢＢ‐５６を親株とし、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）２１０：４６０―４６１に従って５‐フルオロオロチン酸（５‐ＦＯＡ）の耐性株を分離した後ウリジン要求性変異株を選抜することによって得た。
アスペルギルス・オリゼＢＢ‐５６は以下のとおり寄託されている。
寄託機関：ＮＩＴＥバイオテクノロジー本部 特許微生物寄託センター（〒２９２‐０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２‐５‐８）
寄託日（受領日）：２００６年５月１７日
寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ‐２３６

【0170】

次に上記の方法で得られたプロトプラストを用いて、Ｔｕｒｎｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ， ３６，３２１―３３１（１９８５））によりコンピテントセルの調製及び形質転換を行い、そしてウリジンを含まないツァペック・ドックス培地（０．２％ＮａＮＯ３、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＫＣｌ、０．０５％ＭｇＳＯ４・7Ｈ２Ｏ、２％グルコース（ｐＨ５．５））で生育可能な形質転換体を数十株得た。

【0171】

得られた形質転換体を前記実施例１に記載の培養条件で３０℃、５日間培養した。培養後、培養液をＮｏ．２のろ紙（アドバンテック東洋製）でろ過することにより、培養ろ液を回収した。

【0172】

（ｃ）糖質酸化酵素の発現確認
得られたサンプルをＳＤＳ‐ＰＡＧＥに供した。その結果、図１４に示すように、ｐＣＳＧＯＯＸＧでは約６３ｋＤａ付近に糖質酸化酵素と考えられる有意なタンパク質の生産が確認された。対象であるアスペルギルス・オリゼＢＢ‐５６の培養ろ液では同様のタンパク質の生産が確認されなかったため、本タンパク質は糖質酸化酵素ｃＤＮＡの導入によるものと考えられた。

【0173】

また、同じサンプルについて上記糖質酸化酵素活性測定法に準じ活性測定を行った結果を以下の表８に示す。

【0174】

【表8】

【0175】

表８に示す通り、糖質酸化酵素ｃＤＮＡの導入によって得られたタンパク質は、対照と比べて明らかな糖質酸化酵素活性が検出され、目的の糖質酸化酵素の発現が確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]