特許 6294666 制御性Ｔ細胞の阻害のための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6294666

(24)【登録日】2018年2月23日

(45)【発行日】2018年3月14日

(54)【発明の名称】制御性Ｔ細胞の阻害のための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20180305BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20180305BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20180305BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20180305BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20180305BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180305BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20180305BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/28

   A61K38/00

   A61K38/21

   A61K45/00

   A61P31/00

   A61P35/00

   A61P37/04

【請求項の数】6

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2013-505048(P2013-505048)

(86)(22)【出願日】2011年4月12日

(65)【公表番号】特表2013-523886(P2013-523886A)

(43)【公表日】2013年6月17日

(86)【国際出願番号】US2011032090

(87)【国際公開番号】WO2011130249

(87)【国際公開日】20111020

【審査請求日】2014年3月27日

【審判番号】不服2016-5282(P2016-5282/J1)

【審判請求日】2016年4月8日

(31)【優先権主張番号】61/323,557

(32)【優先日】2010年4月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】513276477

【氏名又は名称】イミュノバティブ セラピーズ，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ハー−ノイ マイケル

【合議体】

【審判長】 村上 騎見高

【審判官】 前田 佳与子

【審判官】 穴吹 智子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１３３６５１号（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００９／１３５１９９号（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２００７−５００２１７号公報（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３３４３０号公報（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０００４７４号（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１２６９４０号（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５２１４０９号公報（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５１４３６５号公報（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｈａｒ−Ｎｏｙ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ．， ２００９， ｖｏｌ．３３， ｎｏ．４， ｐ．５２５−５３８

【文献】 臨床免疫， ２００６， ｖｏｌ．４５， ｎｏ．６， ｐ．６８８−６９２

【文献】 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２００９， ｖｏｌ．３９， ｎｏ．５， ｐ．１２４１−１２５１

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

A61K39/00-39/44

A61K35/00-35/76

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者におけるＴｒｅｇ細胞の免疫抑制活性を低減するのに用いられる同種異系Ｔｈ１細胞を含む治療用組成物であって、
前記治療用組成物は、抗ＴＧＦ−β抗体をさらに含み、
前記治療用組成物は、疾患抗原のシャペロンリッチ細胞可溶化物をさらに含み、
前記同種異系Ｔｈ１細胞は、同種異系ｅｍＴｈ−１（エフェクター／メモリーＴｈ１）細胞であり、
ＩＦＮ−γによって仲介される前記Ｔｒｅｇ細胞の活性の低減と阻害との少なくとも一方を行うことが、ｉ）前記患者における疾患抗原の免疫寛容を低下させるか、ｉｉ）患者における疾病に対する治療効果を生じさせるか、ｉｉｉ）患者における免疫抑制機能を低減させる、組成物。

【請求項2】

前記Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋である請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性は、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−）のｉＴｒｅｇ細胞への転換を低減することにより阻害される請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性は、ｎＴｒｅｇ細胞の阻害によることである請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記治療用組成物はＩＦＮ−γをさらに含むか、前記治療用組成物はＣＤ４０Ｌをさらに含む、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

前記疾患は癌であるか、前記疾患は感染症である請求項１に記載の使用のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［背景］
癌免疫療法の主な目的は、先天性免疫反応と適応性免疫反応の活性化により腫瘍の排除を促進することであり、免疫寛容メカニズムを克服すると同時に腫瘍特異的リンパ球を誘導する二重の能力を付与されたワクチン接種戦略の進展に依存する。癌免疫療法の使用は、適切に設計された癌ワクチンで腫瘍排除、及び長期寛解を潜在的にもたらすことができる。悪性細胞を標的化し正常細胞を回避するという免疫療法における特異性はまた、最小限の毒性につながることもできる。

【0002】

免疫反応は一般的に、Ｔｈ１（Ｔヘルパー）反応とＴｈ２反応の２つの極性反応によって説明される。Ｔｈ１反応は細胞性免疫を媒介し、免疫を媒介した腫瘍根絶において重要であり、Ｔｈ２反応は液性免疫を媒介する。Ｔｈ２反応は、いくつかの感染症に対して保護することができるが、抗腫瘍反応にとっては望ましくない。Ｔｈ１反応およびＴｈ２反応は逆調節性であり、増加したＴｈ１反応はＴｈ２反応を下方調節し、その逆も同様である。

【0003】

Ｔｈ１免疫は腫瘍の根絶に不可欠であるが、ある患者においてはＴｈ１環境の存在下で腫瘍が成長し続けることができる。従って、腫瘍は、保護的なＴｈ１反応をうまく抑制し回避することができる。成功した免疫療法は、Ｔｈ１環境を促進し、また腫瘍回避メカニズムも無効にし、正常組織の免疫破壊を防止する自己寛容回路に対抗しなければならない。

【0004】

抗腫瘍免疫を阻害するメカニズムの多くは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性化の結果である。これらのＴｒｅｇ細胞は、腫瘍誘発耐性の発生と存続に大きく貢献し、初期の腫瘍進行における独占的な免疫回避メカニズムである。腫瘍進行の間に観察されるＴｒｅｇ亢進は、自然発生のＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）の増殖、またはＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＦｏｘＰ３^-Ｔ細胞のＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３⁺Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）への転換の結果であり得る。Ｔｒｅｇは、エフェクターＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能を抑制することにより、並びに樹状細胞の活性化を阻害することにより、免疫反応を弱める。Ｔｒｅｇは、免疫細胞による腫瘍根絶の主要な障壁の一つであるため、薬剤または抗体を用いて腫瘍の治療的除去または腫瘍の機能不活性化は、癌免疫療法への反応を向上させる。しかし、Ｔｒｅｇの選択的な排除または不活性化は、Ｔｒｅｇのような細胞が、活性化した通常の非抑制Ｔ細胞と同一の表面マーカーを有するため、大きな課題となる。抗体をベースとしたアプローチは、例えば、Ｔｒｅｇと活性化エフェクターＴリンパ球の両方を見分けることなく標的とする。

【0005】

ＣＲＣＬ（シャペロンリッチ細胞可溶化物）を含有する抗癌ワクチンの使用は、免疫賦活性効果を提供することがわかっている。ＣＲＣＬは、等電点電気泳動法により、腫瘍細胞可溶化物から生成される。ＣＲＣＬで処理された樹状細胞とマクロファージは、Ｔｒｅｇ阻害に対抗し、炎症誘発性サイトカインの産生と免疫賦活性能力を保持する。しかし、ＣＲＣＬへの暴露後もＴｒｅｇの生存、ＦｏｘＰ３の発現および免疫抑制機能は保持されるため、ＣＲＣＬのＴｒｅｇへの直接的な影響はないように思われる。

【0006】

いくつかの化学療法剤（例えば、シクロホスファミド、イマチニブメシル酸塩）は、癌ワクチンの有効性をさらに高めるＴｒｅｇ機能の負の調節物質として記載されてきた。また、同種異系Ｔ細胞の養子免疫伝達も、宿主免疫細胞にアジュバント「危険」シグナルを提供することにより、腫瘍免疫療法の有効性を高め得る。腫瘍免疫療法の有効性を高め得る効果は、活性化Ｔリンパ球によるサイトカイン産生が部分的に原因になり、保護的な１型免疫反応の発生を促進する。しかし、ＩＦＮ−γを含むＩ型サイトカインのＴｒｅｇへの効果は、一貫性を欠いている。細胞媒介免疫の重要なエフェクターサイトカインとして、外因性または自己分泌ＩＦＮ−γは、Ｔｒｅｇの生成を負に調節することができる。この概念と平行して、他の研究において、ＩＦＮ−γが活性化誘発細胞死を促進すること、およびＩＦＮ−γのようなサイトカインは、内因性経路および外因性経路に依存したアポトーシスを促進することによりエフェクターＴ細胞の亢進および存続を調節し得ることわかっている。
［概要］
一態様では、本発明は、患者における疾患の免疫寛容を抑制する方法に関する。本方法は、同種異系Ｔｈ１細胞を含む治療用組成物を患者に投与することによりＴｒｅｇ細胞の免疫抑制活性を低減することを含み、Ｔｒｅｇ細胞の活性を低減および／または阻害することは、患者における疾患抗原の免疫寛容を低下させる。

【0007】

別の態様では、本発明は、患者における治療的免疫効果を刺激する方法に関する。本方法は、同種異系Ｔｈ１細胞を含む治療用組成物を患者に投与することによりＴｒｅｇ細胞の免疫抑制活性を低減することを含み、Ｔｒｅｇ細胞の活性を低減および／または阻害することは、患者における疾患に対する治療効果が誘発する。

【0008】

さらなる態様では、本発明は、患者における免疫抑制機能を弱める方法に関する。本方法は、同種異系Ｔｈ１細胞を含む治療用組成物を患者に投与することによりＴｒｅｇ細胞の免疫抑制活性を低減することを含み、Ｔｒｅｇ細胞の活性を低減および／または阻害することにより、患者における免疫抑制機能を低下させる。

【0009】

さらに別の態様では、本発明は、活性化したＴｈ１細胞と疾患抗原源を投与することを含む、免疫寛容を抑制し、疾患患者における治療効果を促進する方法に関し、Ｔｈ１細胞と疾患抗原は同一箇所に投与される。

【0010】

さらなる別の態様では、本発明は、疾患抗原源とアジュバントを含む組成物に関し、疾患抗原はシャペロンタンパク質内に含有され、アジュバントは活性化同種異系Ｔｈ１細胞を含む。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】ナイーブＴ細胞を様々な腫瘍細胞株と再懸濁して活性化ｅｍＴｈ−１細胞で処理した場合のＦｏｘＰ３発現への効果を示すドットプロットである。

【図1B】ナイーブＴ細胞を様々な腫瘍細胞株と再懸濁して活性化ｅｍＴｈ−１細胞で処理した場合のＦｏｘＰ３発現への効果を示す棒グラフである。

【図2A】ナイーブＴ細胞を、ｅｍＴｈ−１上清の存在下又は不存在下にて、ＴＧＦ−β１を用いて又は用いずに、Ｔ細胞増殖刺激用ビーズを用いて培養した場合の、ＦｏｘＰ３発現への効果を示すドットプロットである。

【図2B】ナイーブＴ細胞を、ｅｍＴｈ−１上清の存在下又は不存在下にて、ＴＧＦ−β１を用いて又は用いずに、Ｔ細胞増殖刺激用ビーズを用いて培養した場合の、ＦｏｘＰ３発現への効果を示すヒストグラムである。

【図2C】総ＣＤ４⁺Ｔリンパ球中のＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＦｏｘＰ３^-活性化Ｔ細胞の割合を示す棒グラフである。

【図2D】図２Ａに示されたように培養細胞中の転写因子ＦｏｘＰ３、Ｔｂｅｔ、およびＧＡＴＡ−３の発現を示すドットプロットである。

【図2E】示された濃度のｅｍＴｈ−１上清を用いた場合の、図２Ａに示されたように培養細胞中のＦｏｘＰ３の発現の棒グラフである。

【図2F】ｅｍＴｈ−１上清の存在下において生成された残留ＦｏｘＰ３発現細胞の免疫抑制活性の棒グラフである。

【図2G】転換されたｉＴｒｅｇ細胞の抑制活性を阻害するｅｍＴｈ−１上清を示す棒グラフである。

【図3A】マウスＩＦＮ−γに対する遮断抗体を用いた又は用いない、ｅｍＴｈ−１上清の存在下又は不存在下での、ＴＧＦ−β１を用いた又は用いない、Ｔ細胞増殖刺激用ビーズを用いたナイーブＴ細胞を示す棒グラフである。

【図3B】マウスＴＮＦ−αに対する遮断抗体を用いた又は用いない、ｅｍＴｈ−１上清の存在下又は不存在下での、ＴＧＦ−β１を用いた又は用いない、Ｔ細胞増殖刺激用ビーズを用いたナイーブＴ細胞を示す棒グラフである。

【図3C】ＩＦＮ−γＲ^-/-マウス脾臓から単離され、図３Ａに記載されているように培養されたナイーブＴリンパ球中のＦｏｘＰ３発現のドットプロットである。

【図3D】ＩＦＮ−γＲ^-/-マウス脾臓から単離され図３Ａに記載されているように培養されたＦｏｘＰ３発現細胞の割合を示す棒グラフである。

【図4A】ｅｍＴｈ−１によって阻害されたｎＴｒｅｇ（ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇ）免疫抑制機能を示すプロットである。

【図4B】ｅｍＴｈ−１によって阻害されたｎＴｒｅｇ（ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇ）免疫抑制機能を示す棒グラフである。

【図4C】ｅｍＴｈ−１によって阻害されたｎＴｒｅｇ（ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇ）免疫抑制機能を示す棒グラフである。

【図4D】図４Ａに記載された細胞におけるＩＦＮ−γ濃度を示す棒グラフである。

【図4E】ヒトｅｍＴｈ−１上清は、ヒトＴｒｅｇ抑制機能を低下させ、Ｔｒｅｇ媒介阻害に対するエフェクターＴ細胞耐性を促進することを示すプロットである。

【図4F】ヒトｅｍＴｈ−１上清は、ヒトＴｒｅｇ抑制機能を低下させ、Ｔｒｅｇ媒介阻害に対するエフェクターＴ細胞耐性を促進することを示すプロットである。

【図5A】１２Ｂ１細胞を注入され、ＣＲＣＬ、ｅｍＴｈ−１、又はＣＲＣＬとｅｍＴｈ−１との両方の組み合わせを投与されたナイーブＢａｌｂ／ｃマウスへのワクチンの効果を示すグラフである。

【図5B】１２Ｂ１細胞を注入され、ＣＲＣＬ、ｅｍＴｈ−１、又はＣＲＣＬとｅｍＴｈ−１との両方の組み合わせを投与されたナイーブＢａｌｂ／ｃマウスへのワクチンの効果を示すグラフである。

【図5C】１２Ｂ１細胞を注入され、ＣＲＣＬとｅｍＴｈ−１との両方の組み合わせ、又はＣＲＣＬ、ｅｍＴｈ−１および抗アシアロＧＭ１抗体を投与されたナイーブＢａｌｂ／ｃマウスへのワクチンの効果を示すグラフである。

【図5D】Ｂ１６細胞を注入され、ｅｍＴｈ−１とＢ１６ ＣＲＣＬとの組み合わせを投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスへのワクチンの効果を示すグラフである。

【図6A-6D】マウスにおける腫瘍体積を示すプロットであり、ｅｍＴｈ−１とＣＲＣＬの免疫療法によって誘発された腫瘍特異的免疫を表している。

【図7A】ｅｍＴｈ−１とＣＲＣＬの免疫療法の抗腫瘍Ｔリンパ球への効果を示す棒グラフである。

【図7B】ｅｍＴｈ−１細胞はナイーブＴリンパ球の分化をｉｎ ｖｉｖｏでＴｒｅｇよりもＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３^-エフェクターＴ細胞の方に傾けることを示すドットプロットである。

【図7C】ｅｍＴｈ−１細胞はｉｎ ｖｉｖｏでＴｒｅｇ抑制機能を弱めることを示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

［詳細な説明］
本発明は、疾患抗原の免疫寛容を抑制すること、及び／又は患者における腫瘍免疫回避メカニズムを無効にする方法を含む。また、本方法は、疾患抗原に対する免疫、特にＴｈ１免疫を刺激することも含む。免疫寛容の抑制と抗疾患抗原免疫の刺激との両方は、疾患抗原源及び同種異系Ｔｈ１細胞、好ましくはアジュバントとしての活性化された同種異系Ｔｈ１細胞を含む治療用組成物の投与により発生されることができる。一般的に、同種異系Ｔｈ１細胞は、活性化したエフェクター／メモリーＴｈ１（ｅｍＴｈ−１）細胞である。また、この治療用組成物は、疾患関連抗原及び／又は疾患関連抗原を含有する可溶化物、好ましくはシャペロンリッチ細胞可溶化物（ＣＲＣＬ）等の疾患組織から単離されたシャペロンタンパク質の混合物、も含むことができる
本発明において、免疫寛容の抑制方法は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を弱めることを含むことができる。本方法は、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−）から、本願においてｉＴｒｅｇと称されるＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３＋）への転換を阻害することができる。自然発生のＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞とｉＴｒｅｇ細胞との両方の抑制活性を、低下または排除することができる。本発明の方法は、有利には、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を阻害すると同時に、患者における通常のエフェクターＴリンパ球の機能を促進する。治療用組成物のＴｒｅｇへの阻害活性は、ＩＦＮ−γに依存し、ＩＦＮ−γは、好ましい組成物において宿主先天性免疫細胞と宿主適応性免疫細胞からＩＦＮ−γの生成を次には増加するｅｍＴｈ１細胞によって生成される。

【0013】

本願でいう「免疫寛容の抑制」は、任意の自己寛容を含む疾患抗原の存在に寛容する患者の免疫システムの能力を抑制すること、及び／又は患者の免疫システムによる腫瘍回避の抑制に関する。

【0014】

本願に記載された方法は、患者における様々な疾患を治療するために用いられることができる。疾患は、癌性または非癌性であることができる。癌性疾患は、腫瘍を生成する癌、ならびに血液系腫瘍等の腫瘍を生成しない癌を含むことができる。非癌性疾患は、例えば、１つ以上の病原体を原因とする疾患を含むことができる。腫瘍は、乳房、肺、肝臓、胃、皮膚、膵臓等を含む患者の種々の場所に存在し得る。患者は、ヒトまたは非ヒトであることができる。

【0015】

本発明の方法は、治療用組成物を患者に投与することを含むことができ、治療用組成物の投与は、患者の免疫システムによる疾患および／または疾患抗原の寛容を抑制することができる。治療用組成物の患者への投与は、患者における腫瘍回避機構を無効にすることができ、より望ましい腫瘍根絶に導くことができる。好ましくは、治療用組成物の投与は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋であるＴｒｅｇ細胞の活性を抑制することができる。本願でいう「Ｔｒｅｇ」細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋であり、及びｎＴｒｅｇとｉＴｒｅｇとの両方を含む制御性Ｔ細胞に関する。本願でいうナイーブＴ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦｏｘＰ３−であるＴ細胞である。

【0016】

本発明の方法は、Ｔｒｅｇ細胞の活性を様々な方法で抑制することを含む。Ｔｒｅｇ細胞の活性の抑制は、例えば、ナイーブＴ細胞のｉＴｒｅｇ細胞への転換を阻害することによってなることができる。本方法は、例えば、ＦｏｘＰ３の活性を調節することによりナイーブ細胞のＴｒｅｇ細胞への転換を妨げる、本願に記載された治療用組成物の投与を含むことができる。ＦｏｘＰ３は、免疫抑制活性の原因となることができる細胞のマーカーである転写因子である。細胞のＦｏｘＰ３の不在または反転は、細胞が抑制機能を実行しないことを暗示するものである。

【0017】

また、本発明の方法は、免疫寛容の抑制を高めるために、患者のｎＴｒｅｇ細胞を負に調節することもできる。患者は、刺激に反応してナイーブＴ細胞から誘発されるｉＴｒｅｇ細胞に加え、ｎＴｒｅｇ細胞を有することができる。また、本発明の方法で使用される治療用組成物は、患者におけるｎＴｒｅｇ及び／又はｉＴｒｅｇの活性も抑制し得る。

【0018】

また、本方法は、Ｔｒｅｇ細胞の活性を抑制するためのＩＦＮ−γの投与、及び／又はＣＤ４０Ｌの包含も含むことができる。ＩＦＮ−γ及び／又はＣＤ４０Ｌは、治療用組成物の一部として使用されることができる。治療用組成物においてＩＦＮ−γ及び／又はＣＤ４０Ｌの使用は、エフェクターＴリンパ球の活性を妨げることなくＴｒｅｇの免疫抑制活性を遮断することができる。好ましくは、ＩＦＮ−γは活性化Ｔｈ１細胞から自然に生成され、それによって活性化Ｔｈ１細胞のような細胞は表面にＣＤ４０Ｌを発現し、宿主免疫細胞中のＩＬ−１２の発現を上方制御することができ、宿主ＩＦＮ−γ生成の増加につながる。

【0019】

また、本発明の方法は、ナイーブＴ細胞の分化をＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｂｅｔ＋ＧＡＴＡ３−表現型（Ｔｂｅｔ＋細胞）に傾けることも含むことができる。治療用組成物の投与は、ナイーブＴ細胞の患者におけるＴｈ１免疫環境を表すＴｂｅｔ＋細胞への転換に傾けることができる。Ｔｂｅｔ＋の存在は、Ｔｈ１環境の促進につながることができ、Ｔｒｅｇ細胞の生成から離れた促進のため免疫寛容活性の抑制につながることができる。

【0020】

本発明は、上記の方法で記載されているように、Ｔｒｅｇ細胞の活性を抑制する治療用組成物を投与することを含む。治療用組成物は、生きている免疫細胞を含むことができ、少なくとも一部はＴ細胞である。Ｔ細胞は、好ましくは、Ｔｈ１表現型（ＩＦＮ−γを生成しＩＬ−４を生成しないＣＤ４＋Ｔ細胞）のエフェクター／メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ^Lo）である。エフェクター／メモリーＴｈ１細胞は、患者に処方及び導入時に活性化され、本願においてｅｍＴｈ−１細胞と称される。好ましい活性化方法は、Ｔ細胞上でのＣＤ３とＣＤ２８の表面分子の架橋結合による。また、他の活性化方法も本発明の範囲内である。ｅｍＴｈ−１細胞は、好ましくは活性化されるとＣＤ４０Ｌを発現し、大量の炎症性サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−α等）を生成する。このようなｅｍＴｈ−１は、好ましくは患者と同種異系である。ｅｍＴｈ−１の活性化は、例えば、Ｈａｒ−Ｎｏｙへの米国特許第７，４３５，５９２号に記載されているように行われることができ、Ｈａｒ−Ｎｏｙへの米国特許第７，４０２，４３１号に記載のように緩衝液で投与のために製剤化されることができる。これらの特許はいずれも参照として本願に組み込まれる。活性化ｅｍＴｈ−１細胞は、本願に記載された治療用組成物で使用されることができる。このような活性化ｅｍＴｈ１細胞は、イスラエルのイムノベイティブ セラピーズ 社（Ｉｍｍｕｎｏｖａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｌｔｄ．）からＡＬＬＯＳＴＩＭの名称にて入手可能である。活性化ｅｍＴｈ−１細胞のような細胞と同様の機能特性を示すその他の活性化同種異系Ｔ細胞も、本発明の範囲内である。本発明の治療用組成物は、活性化ｅｍＴｈ−１細胞を含むこととして記載されるが、他の方法を用いて調製されるが同様の機能特性を有する細胞を含有する治療用組成物はすべて、本発明の範囲内である。また、ＩＦＮ−γやＣＤ４０Ｌ分子等の、ｅｍＴｈ−１細胞の非生存成分も、本発明の範囲内である。

【0021】

ｅｍＴｈ−１細胞に加えて、治療用組成物は、患者におけるＴｈ１環境の維持を高め、及び／又は患者による疾患抗原の免疫寛容を抑制する他の成分を含むことができる。いくつかの好ましい実施形態では、治療用組成物は、疾患と関連する抗原も含むことができる。治療用組成物は、１つ以上の疾患抗原を含むことができる。２つ以上の抗原が組成物中に含まれる場合、抗原は同一の抗原源からは又は異なる抗原原からであってもよい。任意の抗原源は、製剤中で使用されることができ、例えば、このような抗原源は、生きた細胞からまたは生物体から供給されることができ、源物質は、細胞全体もしくは生物体またはそれら由来の可溶化物として使用される、照射不活性化された（または他の不活性化方法で不活性化された）、凍結／解凍可溶化物であることができる。いくつかの好ましい実施形態において、腫瘍細胞または腫瘍細胞可溶化物は、抗原の細胞源物質として機能することができろ。その細胞源物質は、自己もしくは同種異系細胞源または細胞株由来であることができる。また、抗原は抗原をコードする裸のＤＮＡまたはＲＮＡからも供給されることができる。核物質は、単独で使用されることができ、またはウイルスベクターへ組み込まれることができる。抗原源の別の例は、抗原を模倣する抗イディオタイプ抗体もしくは抗原を模倣する抗イディオタイプ抗体の部分、または抗原の構造を模倣する他の方法である。抗原パルスされた、またはトランスフェクトされた樹状細胞（ＤＣ）も、医薬品組成物における抗原源であることができる。ＤＣを、ペプチドもしくはタンパク質全体、組換え型タンパク質、または抗原をコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡでパルスすることができ、またはＤＣを、抗原を含有する細胞と融合することもでき、またはＤＣを、抗原を含有するレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス等のウイルスベクターでトランスフェクトすることができ、またはこれらの抗原源成分を、ＤＣを用いずに単独で使用することもできる。

【0022】

また、１つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は医薬品組成物で使用されることもでき、ＴＡＡの例としては、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＭｅｌａｎＡ、ＴＲＰ−１、ＣＤＫ−４等の腫瘍特異的変異遺伝子産物、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ｐ５３およびｒａｓ（Ｋ−ｒａｓおよびＨ−ｒａｓ）等の癌遺伝子、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ１等の癌精巣抗原、ＭＵＣ１等の過剰発現自己抗原、サイクリンＢ１、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＷＴ、ｐ５３、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、およびＨＰＶ Ｅ７等のウイルス抗原、ＥＢＶ由来抗原およびテロメラーゼを含む。

【0023】

好ましい実施形態において、抗原性成分は、死んだ感染組織または腫瘍から単離された、１つ以上のシャペロンタンパク質（熱ショックタンパク質としても知られる）を含むことができる。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、細菌性、真菌性、および寄生虫性病原体に対する免疫反応の主要な標的に含まれる。腫瘍由来熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）−ペプチド複合体（特にｈｓｐ７０およびｇｒｐ９４／ｇｐ９６）は、有効なワクチンとして機能することが実証されており、動物およびヒトにおいて抗腫瘍免疫反応を生じさせる。このアプローチは、多くの細胞プロセスにおける分子シャペロンとしての機能を担う、ストレスタンパク質のペプチド結合特性を利用する。

【0024】

細胞外環境におけるあるシャペロンも、シャペロンポリペプチド能力、および宿主の免疫システム、特にプロフェッショナル抗原提示細胞と相互作用する能力のために、先天性免疫および適応性免疫を調節可能でもあることができる。腫瘍由来のＨＳＰワクチン接種は、抗腫瘍応答を誘発し、免疫抑制メカニズムを下方制御することができる。ＨＳＰの免疫原性は、ＨＳＰが結合する抗原性ペプチドに由来されることができる。

【0025】

抗原源として使用するためのシャペロンタンパク質の単離の好ましい方法は、米国特許第６，８７５，８４９号においてＫａｔｓａｎｔｉｓによって記載される。さらなる方法は、米国特許第６，７９７，４８０号；同第６，１８７，３１２号；同第６，１６２，４３６号；同第６，１３９，８４１号；同第６，１３６，３１５号；および同第５，８３７，２５１号においてＳｒｉｖａｓｔａｖａによって記載される。また、ＨＳＰを、ペプチド、細胞全体、または細胞可溶化物を含む抗原でパルスすることができる。

【0026】

一実施形態において、腫瘍由来シャペロンリッチ細胞可溶化物（ＣＲＣＬ）は、抗原源として使用され、下記の実施例において記載されるように自由溶液等電点電気泳動（ＦＳ−ＩＥＦ）技術を用いて、腫瘍可溶化物から主要なシャペロンタンパク質を濃縮することによって得られる。自由溶液等電点電気泳動（ＦＳ−ＩＥＦ）技術は、従来の技術と比較して、最大５倍から２０倍多い抗原性物質をより短時間で得るための迅速かつ効率的な手順である。潜在的に限られた腫瘍源からの高い収率に関して、および腫瘍の採取から患者の治療までの迅速なターンアラウンドタイムに関して、臨床的な観点から、複数のシャペロン複合体濃縮のＦＳ−ＩＥＦ法が望ましくなることがある。

【0027】

さらに、ワクチンにおいて通常使用される抗原も、本発明の医薬品組成物で使用することができ、単独で使用され、または担体タンパク質等の担体要素に結合しても使用される、生きた弱毒化微生物全体、不活性化微生物、組換え型ペプチドおよびタンパク質、糖タンパク質、糖脂質、リポペプチド、合成ペプチド、または破裂した微生物、多糖類等の、微生物全体または微生物の一部を含む。

【0028】

一般的に、疾患の治療または予防のために使用できる任意の抗原または抗原の組み合わせは、医薬品組成物において使用されることができる。また、感染性病原体由来の抗原は、抗原源として機能することができ、本願で疾患を引き起こす抗原と称され得る。抗原源となることができる疾患の例としては、ジフテリア、破傷風、ポリオ、狂犬病、百日咳、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ヘルペス１およびヘルペス２、黄熱、腸チフス、水疱、痘瘡（天然痘）、麻疹、耳下腺炎、風疹、日本脳炎、髄膜炎、インフルエンザ、肺炎球菌感染、ロタウイルス感染、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ１およびＨＩＶ２）、癌、ＨＴＬＶ１およびＨＴＬＶ２、梅毒、ＨＰＶ、結核、ライム病、ＲＳＶ感染、トリパノソーマ症、デング熱、マラリア、炭疽、エボラウイルス、野兎病、エルシニア、西ナイルウイルス、クラミジア、淋菌、肺炎球菌、カタル球菌、黄色ブドウ球菌、またはヘモフィルスインフルエンザＢ型菌を原因とする細菌性の病気、マラリア、リーシュマニア症、リステリア症等がある。

【0029】

一つの好ましい実施形態では、治療用組成物は、ｅｍＴｈ−１と、さらにＣＲＣＬ可溶化物を含む。ｅｍＴｈ−１細胞とＣＲＣＬ可溶化物は個別にＴｈ１免疫を促進するが、ｅｍＴｈ−１細胞の追加は、Ｔｈ１免疫の発達を増大させ、さらにＴｒｅｇ活性の抑制を促進するためのアジュバントを提供する。加えて、ｅｍＴｈ−１細胞とＣＲＣＬ可溶化物のような２つの成分が、その組み合わせがいずれかの成分を単独で用いるより効果的であるように治療用組成物中で組み合わされる時、相乗応答が見られる。

【0030】

治療用組成物は、Ｔｒｅｇ細胞の免疫寛容活性の低減または阻害に干渉可能なその他の成分または因子をさらに含み得る。一実施形態では、治療用組成物は、外因性ＩＦＮ−γを含んでもよい。ＩＦＮ−γは、精製されたＩＦＮ−γまたは組換え型ＩＦＮ−γであってもよい。治療用組成物は、また抗ＴＧＦ−β抗体も含み得る。ＴＧＦ−βは、一般的に、Ｔｒｅｇ細胞活性を高める。治療用組成物における抗ＴＧＦ−β抗体を含有し、Ｔｒｅｇ細胞の活性を低減することができる。

【0031】

治療用組成物は、非経口、皮内、筋肉内、皮下または粘膜経路等の通常使用される全ての経路を介して投与され得る。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、結節内または腫瘍内に投与され得る。同種異系ｅｍＴｈ−１細胞は、好ましくは、意図的なＨＬＡミスマッチドナーに由来される。治療用組成物における好ましい用量は、皮内経路用では少なくとも約１×１０⁷細胞、より好ましくは、静脈内経路用に約５×１０⁷〜１×１０⁹細胞である。所望の免疫反応を主として生成することができるこの範囲外の用量も、本発明の範囲内である。

【0032】

治療用組成物は、１回以上投与され得、投与ごとに異なる経路を用いてもよい。２回以上投与する場合、治療用組成物の２回目の投与は、１回目の投与後少なくとも３日後、好ましくは少なくとも７〜１４日後に投与され得る。さらなる用量の治療用組成物を必要に応じて投与してもよい。一つの好ましい実施形態では、最初にｅｍＴｈ−１細胞を皮内に投与し、次にＣＲＣＬ組成物を同じ場所に皮内に投与する。このような皮内注射は、約３〜１０日の間隔をおいて約３〜６回繰り返される。次に、このワクチン接種スケジュールによって生成されたメモリー細胞を活性化するため、ｅｍＴｈ−１細胞単独の静脈内注射にて投与することができる。

【0033】

また、本発明は、同種異系Ｔｈ１細胞を含む治療用組成物を患者に投与することによりＴｒｅｇ細胞の免疫抑制活性を低減することを含む、患者における治療免疫効果を刺激する方法を含み、Ｔｒｅｇ細胞の活性を低減及び／又は阻害することは、患者における疾患に対する治療効果を誘発する。また、本発明は、同種異系Ｔｈ１細胞を含む治療用組成物を患者に投与することによりＴｒｅｇ細胞の免疫抑制活性を低減することを含む、患者における免疫抑制機能を弱める方法を含み、Ｔｒｅｇ細胞の活性を低減及び／又は阻害することは、患者における免疫抑制活性を低下させる。
［実施例］
材料および方法
マウス−特定病原体を含まない条件下でマウスを収容し、アリゾナ大学動物実験委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のガイドラインに従って飼育した。国立がん研究所（メリーランド州ベセスダ）から、メスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２^d）、Ｃ５７ＢＬ６（Ｈ２^b）、重症複合免疫不全症ＳＣＩＤ（Ｈ２^d）およびＮｕｄｅ（Ｈ２^d）マウスを入手した。ジャクソン免疫研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（カリフォルニア州サクラメント）から、ＩＦＮ−γ−受容体^-/-（Ｈ２^d）マウスを購入した。ジャクソン免疫研究所から、内因性プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とＦｏｘＰ３を共発現するＦｏｘＰ３−ＥＧＦＰ（Ｈ２^d）マウスを入手した。ＧＦＰ発現は、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの正確な同定および単離を可能にする。ジャクソン免疫研究所から、コンジェニックＴｈｙ１．１マウス（Ｃｂｙ．ＰＬ（Ｂ６）−Ｔｈｙ１ａ／ＳｃｒＪ）を入手した。これらの動物は、Ｔリンパ球特異的Ｔｈｙ１．１対立遺伝子を持っている。Ｔｈｙ１．２マウスからのドナーＴ細胞は、抗＝Ｔｈｙ１．２抗体を用いて、レシピエントＴｈｙ１．１マウスＴ細胞と区別されることができる。６〜８週齢のマウスを使用した。

【0034】

同種異系活性化ｅｍＴｈ−１細胞の調製−Ｈａｒ−ＮｏｙらのＬｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００９）３３：５２５−５３８およびＨａｒ−ＮｏｙらのＬｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）３２：１９０３−１９１３に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｅｍＴｈ−１細胞を生成および活性化した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓細胞を採取し、赤血球を溶解する溶解塩化アンモニウム−カリウム（ＡＣＫ）緩衝液で処理した。次に、ＣＤ４⁺マイクロビーズとａｕｔｏＭＡＣＳ（商標）分離装置（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、カリフォルニア州オーバーン）を使用して、ＣＤ４⁺Ｔ細胞を単離した。積極的および消極的に選択された細胞を各画分の純度を評価するためにフローサイトメトリーで手順どおりに分析した。１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ジェミニ バイオ−プロダクツ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、カリフォルニア州ウッドランド）を補充したＲＰＭＩ培地（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８をコーティングした常磁性ビーズ（ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖刺激用ビーズ、ダイナル／インビトロジェン（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を初期ビーズ：ＣＤ４⁺細胞比３：１で使用し、さらに２０ＩＵ／ｍＬの組み替えマウス（ｒｍ）ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−７、１０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−１２（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州）、および１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ−４ｍＡｂ（ベクトン デッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ））の存在下で、上記ＣＤ４⁺リンパ球を増殖させた。細胞密度を一定（０．５−１×１０⁶細胞／ｍＬ）に維持するため、ｒｍＩＬ−２、ｒｍＩＬ−７、抗ＩＬ−４ｍＡｂおよびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを含有するさらなる完全培地を、上記の培地に３日目〜６日目に毎日添加した。細胞が増殖するにつれてビーズ：細胞比が１：１に維持されるように、添加するビーズの量を算出した。６日間の培養後、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の増殖は、０日目にプレートに入れられた最初の細胞数の約６０〜１００倍であった。６日目に細胞を採取し、物理的破砕および磁石上の通過によりビーズを回収した。これらの細胞は、新鮮なまま使用されたか、または将来使用するために液体窒素内で保管された。同様の手順に従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからｅｍＴｈ−１細胞を生成した。

【0035】

リンパ球分離培地（１．０７７；ユーロバイオ（Ｅｕｒｏｂｉｏ））を使用して密度勾配遠心分離により単離された健康なドナー末梢血リンパ球から、ヒトｅｍＴｈ−１細胞を生成した。次に、ヒトＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））を使ってＴ細胞を単離し、２０ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）、２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−７、１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１２（ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））、および１０ｇ／ｍＬの抗ヒトＩＬ−４ｍＡｂ（ＢＤ バイオ−サイエンス（Ｂｉｏ− ｓｃｉｅｎｃｅｓ））の存在下で、ヒトＴ細胞増殖刺激用ビーズ（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で培養した。ヒトＣＤ４Ｔ細胞培養物は、マウス細胞のために上述の段落に記載されるように維持された。ヒト研究は、治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）（ＩＲＢ００００５４４８；ＦＷＡ００００４２１８）によって承認され、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを得た。

【0036】

磁気細胞選別−ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ６マウスから単離された脾臓を採取し、解離した。取扱説明書（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、カリフォルニア州オーバーン）に従って、マウスＣＤ４⁺ＣＤ６２Ｌ⁺ナイーブＴ細胞またはＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺制御性Ｔ細胞の単離キットおよびａｕｔｏＭＡＣＳ（商標）分離装置を用いて、磁気細胞選別によりＣＤ４⁺ＣＤ６２Ｌ⁺、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔリンパ球を精製した。この技術により単離されたＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔリンパ球は、高レベルの転写因子ＦｏｘＰ３を発現し、免疫抑制特性を持っている。

【0037】

ＣＤ４⁺ＣＤ６２Ｌ⁺Ｔ細胞のＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３⁺Ｔｒｅｇへの転換−上述のようにＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ⁺ナイーブＴ細胞をＢａｌｂ／ｃマウス脾細胞から単離し、９６ウェルプレート（１ウェル当たり１００細胞）にて完全培地で培養し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｔ細胞増殖刺激用ビーズ（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をＴリンパ球：ビーズ比１：１で、ＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間３７℃にて活性化した。いくつかのウェルは、同種異系の活性化ＣＤ４⁺ｅｍＴｈ−１細胞の上清で処理された。ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３^-細胞の割合は、フローサイトメトリー分析で決定された。

【0038】

フローサイトメトリー分析および抗体−３％加熱不活性化ウシ胎児血清と０．０９％アジ化ナトリウム（シグマ ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ））を含有するＰＢＳで細胞（〜１０⁶）を洗浄し、最初にＦｃ受容体遮断Ａｂ（ＢＤ バイオサイエンシーズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ） ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）で５分間、次に蛍光色素共役Ａｂの適切な組み合わせの飽和量で４０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ファックス キャリバー（ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ）（ベクトン ディッキンソン イムノサイトメトリー システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カルフォルニア州サンノゼ）を用いて分析した。各サンプルについて最低１０，０００事象を収集し、セルクエスト プロ（ＣｅｌｌＱｗｅｓｔ Ｐｒｏ）ソフトウェア（ベクトン ディッキンソン イムノサイトメトリー システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ））を使用してデータ分析を行った。ＦｏｘＰ３検出のため、磁気細胞選別によって精製されたＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺もしくはＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転換ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇを固定し、透過させ、取扱説明書（クローン（Ｃｌｏｎｅ） ＦＪＫ−１６、イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、カリフォルニア州サンディエゴ）に従ってアロフィコシアニン（ＡＰＣ）抗マウスＦｏｘＰ３染色セットを使用して染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇを監視するため、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役抗ＣＤ４（ラットＩｇＧ２ｂ；ＢＤ バイオサイエンシーズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））抗体とフィコエリトリン（ＰＥ）共役抗ＣＤ２５（ラットＩｇＧ１；ＢＤ バイオサイエンシーズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））抗体を使用して細胞を最初に染色した。その後、上述のようにイーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のＦｏｘＰ３染色セットを使用して細胞を染色した。転写因子ＴｂｅｔおよびＧａｔａ−３の発現（それぞれＴｈ−１細胞およびＴｈ−２細胞により発現される）は、抗マウスＴｂｅｔ−フィリコエリトリンおよび抗マウスＧａｔａ−３−フィコエリトリンモノクローナル抗体（ＢＤ バイオサイエンシーズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を用いて、細胞内染色により評価された。アイソタイプコントロール抗体は、ＢＤ バイオサイエンシーズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ） ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（ＰＥ共役ラットＩｇＧ１、ＦＩＴＣ共役ラットＩｇＧ２ａ）またはイーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（ＡＰＣ共役ラットＩｇＧ１）から購入された。

【0039】

Ｔ細胞増殖および抑制分析−ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞は、ミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）単離キットを用いて、脾細胞およびリンパ節細胞から精製された。細胞は、完全培地で、または活性化ｅｍＴｈ−１細胞上清を用いて、３７℃にて９６ウェルプレート内で４８時間培養され、プレートに接着された抗ＣＤ３、可溶性抗ＣＤ２８およびＩＬ−２で活性化された。その他の実験では、処理されていない、または活性化ｅｍＴｈ−１細胞上清で前処理された、または新たに単離された、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞（１×１０⁵）は、処理済みまたは未処理のＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞（１×１０⁵）とともに、丸底の９６ウェルプレート内で４８時間共培養された。抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖刺激用ビーズ−ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を全ての共培養物中に加えた（細胞／ビーズ＝１／１）。次に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（マサチューセッツ州のミリポア コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））をさらに１２時間加えた。次に、細胞を固定化し、取扱説明書（マサチューセッツ州のミリポア コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に従ってＢｒｄＵの取り込みを酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）で検出した。培養物は６連で設定された。

【0040】

１．０７７リンパ球分離溶液を用いた密度勾配遠心分離により単離されたヒト末梢血リンパ球を用いて、同様の実験を行った。ヒト制御性Ｔ細胞単離キット（ミルテニー バイオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））を使用して、全末梢血単核球細胞からＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺およびＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞を精製した。完全培地にて、またはヒトｅｍＴｈ−１上清を用いて、細胞を２４時間９６ウェルプレートで３７℃で培養し、プレートに接着された抗ＣＤ３（５ｎｇ／ｍｌ）、可溶性抗ＣＤ２８（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）で活性化した。次に、取扱説明書（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に従ってセルトレイス バイオレット（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）細胞増殖キットを使用し、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-応答Ｔ細胞を染色した。製造業者により指示されているように、標識された細胞を、ヒト抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖刺激用ビーズ（細胞：ビーズ比１：１）でＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔ細胞（１×１０⁵）とともに共培養し、７２時間後にフローサイトメトリーにより細胞分裂を分析した。
［００７０］ ＥＬＩＳＡによるサイトカイン生成の検出−取扱説明書（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に従って、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）キットを使用し、細胞培養物上清中のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの濃度を決定した。

【0041】

１２Ｂ１白血病細胞および腫瘍生成−ヒトｂｃｒ−ａｂｌ（ｂ₃ａ₂）融合遺伝子を用いてＢＡＬＢ／ｃ骨髄細胞のレトロウイルス形質転換により、マウス白血病細胞株１２Ｂ１を得た。マウス白血病細胞株１２Ｂ１のような細胞は、ｐ２１０ｂｃｒ−ａｂｌタンパク質を発現する。これは、侵攻性の白血病であり、尾静脈注射後１００細胞で１００％致死量（ＬＤ₁₀₀）である。１０％加熱不活性化ウシ胎児血清（ジェミニ バイオ−ブロダクツ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、カリフォルニア州ウッドランド）を補充したＲＰＭＩ培地（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ、メリーランド州ゲイザースバーグ）で、細胞を培養した（３７℃、５％ＣＯ₂）。Ｗｅｉ Ｃｈｅｎ医師（クリーブランド クリニック（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ）、オハイオ州クリーブランド）から１２Ｂ１細胞を入手し、手順に従って試験を行い、マイコプラズマ汚染がないことを確認した。

【0042】

腫瘍を生成するため、最初にＰＢＳ（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ）で１２Ｂ１細胞を３回洗浄し、次に計数し、濃度を５×１０⁴細胞／ｍＬに調節した。メスＢＡＬＢ／ｃマウスは右鼠径部に０．１ｍＬ（５×１０³細胞）を皮下に注射され、腫瘍の進行を監視した。

【0043】

ＣＲＣＬの調製−１２Ｂ１腫瘍由来ＣＲＣＬを調製した。簡潔に、洗剤含有緩衝液中で腫瘍組織を均質化し、得られた高速上清にロトフォー（Ｒｏｔｏｆｏｒ）装置（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））で定電力１５ＷにてＦＳ−ＩＥＦを実施した。画分を採取し、シャペロンタンパク質の含有量を分析した。関心のある画分をプールし、透析、洗剤除去、および遠心分離濃縮によりワクチンとして調製した。ＣＲＣＬ調製物に含有される内毒素レベルは、取扱説明書に従ってカブトガニ・アメボサイト・ライセート（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ））分析キット（カムブレックス バイオ サイエンス（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、メリーランド州ウォーカーズビル）を使用して決定した。ＣＲＣＬ中の内毒素レベルは、培地対照における内毒素レベルより低かった（＜０．０１ＥＵ／μｇ）。１２Ｂ１ ＣＲＣＬは、マウスのｉｎ ｖｉｖｏワクチン接種に使用された。

【0044】

ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長および組み合わせ免疫療法−０日目にＢＡＬＢ／ｃマウスは右鼠径部に５×１０³の生存１２Ｂ１細胞を注射された。同種異系（Ｃ５７ＢＬ６）活性化ＣＤ４⁺細胞（１０⁵細胞／マウス）または１２Ｂ１由来ＣＲＣＬワクチン（２５μｇ／マウス）または細胞＋ＣＲＣＬを、３日目、７日目、１４日目に投与した。本治療は、右足蹠に合計体積１００μｌ投与された。腫瘍成長を一日おきに監視し、腫瘍体積が４０００ｍｍ³に達したときにマウスを安楽死させた。様々な治療グループ間で無腫瘍生存率を比較した。

【0045】

ｉｎ ｖｉｖｏの免疫細胞の枯渇−抗アシアロＧＭ１抗体（２５μｌ／マウス、ＰＢＳで１／８に希釈、ワコー ケミカルズ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、日本、大阪）を１日前、３日目、５日目に腹腔内注射することにより、マウスはＮＫ細胞を枯渇された。

【0046】

統計−カプランマイヤー曲線を生成し、ログランク統計によって分析し、生存率および各治療グループ間の差異を決定した。その他の実験では、スチューデントのｔ検定を使ってグループ間の有意差（ｐ＜ＸＸＸＸ）を決定した。

【0047】

磁気活性化細胞選別を用いて、マウス脾臓からＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ⁺ナイーブＴ細胞を単離した。細胞は、Ｔ細胞増殖刺激用ビーズ（細胞：ビーズ比１：１）により活性化され、様々な腫瘍細胞株（１２Ｂ１、Ｂ１６、４Ｔ１）からの培地に再懸濁され、ｅｍＴｈ−１細胞の上清で処理された。図１Ａにおいて、処理された細胞は９６ウェルプレートで３７℃にて７２時間インキュベートされ、フローサイトメトリー分析を用いてＦｏｘＰ３発現を決定した。図１Ｂは、３つの独立した実験からプールされたデータを示す。データをグラフ化し、スチューデントのｔ検定は、データの図を分析するために使用された。

【0048】

図１Ａおよび１Ｂに示されているように、Ｔｈ−１細胞上清は、腫瘍細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏのＴＧＦβによって誘発された、ナイーブＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＦｏｘＰ３^-Ｔ細胞からのＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３⁺Ｔｒｅｇの分化を弱めた。Ｔｒｅｇ亢進は、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＦｏｘＰ３^-Ｔ細胞のＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３⁺への転換、または自然発生のＴｒｅｇの増殖の結果であり得る。Ｔｒｅｇ抑制機能の誘発には転写因子ＦｏｘＰ３が必要とされ、当該非制御性細胞における発現は、当該非制御性細胞を免疫抑制細胞に転換する。エフェクター−メモリーＴｈ−１細胞により生成される可溶性因子の役割を検証した。詳細には、ＴＧＦ−βが、様々なｉｎ ｖｉｖｏのＴＧＦ−β分泌腫瘍により誘発されたナイーブＴ細胞からのＴｒｅｇの生成を負に制御し得るかどうか検証するために、研究を行った。１２Ｂ１、Ｂ１６黒色腫および４Ｔ１細胞は、培養でＴＧＦ−βを分泌することができることが公知である。１２Ｂ１、Ｂ１６黒色腫および４Ｔ１細胞のような３つの腫瘍細胞株のいずれかを用いてナイーブＣＤ４⁺ＣＤ６２Ｌ⁺Ｔ細胞の培養は、ＦｏｘＰ３⁺Ｔ細胞への分化を引き起こした（図１Ａ）。しかし、腫瘍誘発ＦｏｘＰ３発現は、培養中に活性化ｅｍＴｈ−１細胞の上清の存在により、有意に減少した（図１Ａ、１Ｂ）。

【0049】

ｅｍＴｈ−１上清（ｅｍＴｈ-１ ｓｕｐ）の存在下又は不存在下にて、ＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍＬ）を用いて又は用いずに、Ｔ細胞増殖刺激用ビーズ（細胞：ビーズ比１：１）を用いて、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ⁺ナイーブＴ細胞を７２時間培養した。次に、フローサイトメトリーにより細胞を分析した。図２Ａおよび図２Ｂは、１０の独立した実験からの代表的なドットプロットまたはヒストグラムプロットである。図Ｃは、総ＣＤ４＋Ｔリンパ球中のＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３^-で活性化したＴ細胞の割合である。Ｐ＜．０１、ｅｍＴｈ−１上清を用いずに培養された細胞と比べて有意の差。図２Ｄは、処理されたＴＧＦ−β１を用いて又は用いずに、またはｅｍＴｈ−１ ｓｕｐを用いずに、Ｔ細胞増殖刺激用ビーズを用いて７２時間培養されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ⁺Ｔ細胞において決定された、転写因子ＦｏｘＰ３、ＴｂｅｔおよびＧＡＴＡ−３の発現である。３つの実験の代表的な結果を図２Ｄに示す。
図２Ａ〜２Ｇのデータは、ＴＧＦ−βに誘発された、ナイーブＴ細胞のＦｏｘＰ３⁺Ｔリンパ球への転換を、ｅｍＴｈ−１上清が有意に阻害したことを示す（図２Ａおよび図２Ｂ）。さらに、活性化エフェクター（ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３^-）細胞数は、同種異系ｅｍＴｈ−１上清により補完された（図２Ｃ）。効果は投与量に依存して見られた（図２Ｅ）。ＦｏｘＰ３ＥＧＦＰ−トランスジェニックマウスから単離されたナイーブＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＦｏｘＰ３^-Ｔ細胞の、ＴＧＦ−βに誘発された転換が、ｅｍＴｈ−１上清の存在下又は不存在下にて行われた。次に、ＧＦＰ陽性（即ち、ＦｏｘＰ３発現）細胞を選別し、ＧＦＰ陽性（即ち、ＦｏｘＰ３発現）細胞の抑制活性を評価した。その結果、これらの残留ＦｏｘＰ３発現ｉＴｒｅｇの機能を弱めることが実証された（図２Ｆ）。加えて、すでに転換されたＦｏｘＰ３⁺ｉＴｒｅｇに添加されたｅｍＴｈ−１上清は、その免疫抑制機能を有意に弱めた（図２Ｇ）。

【0050】

エフェクター−メモリーＴｈ−１上清を評価して、エフェクター−メモリーＴｈ−１上清が、ＴＧＦ−β誘発Ｆｏｘｐ３⁺Ｔ細胞分化を炎症促進性細胞系統へ傾けるか否かを検証した。Ｔｈ１またはＴｈ２細胞によってそれぞれ転写因子Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ−３が主として発現される。フローサイトメトリー分析は、ＴＧＦ−βプラスＴｈ−１細胞上清の存在下で７２時間培養した後に得られたＣＤ４⁺Ｔ細胞の大半が低レベルのＧａｔａ−３とＦｏｘＰ３を発現したことを示した。得られた細胞のほとんどが、Ｔｈ−１極性化と一致したＴｂｅｔ陽性表現型を示した（図２Ｄ）。従って、これらの結果から、ｅｍＴｈ−１細胞は、ナイーブＴ細胞のＴＧＦ−βに依存した極性化をＦｏｘＰ３⁺Ｔｒｅｇから炎症促進性Ｔｈ−１系統に切り換えることができる可溶性因子を生成することを示した。

【0051】

マウスＩＦＮ−γ（図３Ａ）またはマウスＴＮＦ−α（図３Ｂ）に対する遮断抗体を用いて又は用いずに、ｅｍＴｈ−１上清の存在下又は不存在下にて、ＴＧＦ−β１を用いて又は用いずに、Ｔ細胞増殖刺激用ビーズを用いて、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ⁺ナイーブＴ細胞を７２時間培養した。図３Ｃおよび３Ｄにおいて、ＩＦＮ−γＲ^-/-マウス脾臓からＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＣＤ６２Ｌ⁺ナイーブＴ細胞を単離し、ＴＧＦ−β１で処理したｅｍＴｈ−１上清の存在下又は不存在下にて、およびｅｍＴｈ−１上清の存在下又は不存在下にて、ＴＧＦ−β１を用いて又は用いずに、Ｔ細胞増殖刺激用ビーズを用いて７２時間培養した。ＦｏｘＰ３発現細胞の割合は、フローサイトメーターにより決定された。

【0052】

Ｔｈ−１細胞により生成された主要なサイトカインの関与を検証した。Ｔｈ−１細胞培養物からの上清に高レベルのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが検出された。遮断抗体を用いて、ＴＮＦ−αではなくＩＦＮ−γの中和が、ｅｍＴｈ−１上清の効果を無効にし、ナイーブ細胞のＦｏｘＰ３発現Ｔ細胞へのＴＧＦ−β誘発転換を回復させた（図３Ａおよび３Ｂ）。このデータは、ＴＮＦ−αではなく、組換え型ＩＦＮ−γが、ＦｏｘＰ３⁺Ｔ細胞のＴＧＦ−β誘発生成の負の調節を弱めたことを示した（図３Ａおよび３Ｂ）。これらの結果は、ＩＦＮ−γＲ^-/-マウスを使用して確認された。図３Ｃおよび３Ｄに示されたデータは、ＩＦＮ−γＲ^-/-マウスから単離されたＣＤ４⁺ナイーブＴ細胞のＦｏｘＰ３⁺Ｔ細胞への転換が、Ｔｈ−１細胞上清によって修正されなかったことを示した（図３Ｃおよび３Ｄ）。従って、ＩＦＮ−γは、ＦｏｘＰ３⁺Ｔリンパ球生成のＴｈ−１媒介阻害を担う主要なメカニズムを表した。

【0053】

図４Ａにおいて、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ｎＴｒｅｇは、ＢＡＬＢ／ｃマウスリンパ系組織から単離され、ｅｍＴｈ−１上清を用いて又は用いずに、プレートに接着された抗ＣＤ３（５ｎｇ／ｍＬ）、可溶性抗ＣＤ２８（５ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）とともに、示された時間培養された。次に、フローサイトメトリーを用いてＦｏｘＰ３発現量を決定した。図４Ｂにおいて、ｅｍＴｈ−１上清を用いて又は用いずに、プレートに接着された抗ＣＤ３、可溶性抗ＣＤ２８、およびＩＬ−２とともに、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ｎＴｒｅｇを４８時間培養した。次に、完全培地で細胞を大規模に洗浄した。未処理ｎＴｒｅｇ（ＣＤ２５^-＋未処理ｎＴｒｅｇ）の不存在下（ＣＤ２５^-）または存在下で、またはｅｍＴｈ−１上清で処理されたｎＴｒｅｇ（ＣＤ２５^-［ｎＴｒｅｇ］_emTh-1sup）の存在下で、応答ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔリンパ球を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｔ細胞増殖用ビーズを用いて刺激した。応答ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔリンパ球増殖量は、ＢｒｄＵ取り込み分析を用いて４８時間後に決定された。ＮＳ、有意ではない；Ｐ＜．００１、未処理Ｔｒｅｇとともに培養された応答ＣＤ２５^-Ｔ細胞と比較して有意な差。図４Ｃにおいて、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔリンパ球は、最初にｅｍＴｈ−１上清で４８時間処理され（［ＣＤ２５^-］_emTh-1sup）または処理されず（未処理ＣＤ２５^-）、完全培地で大規模に洗浄され、新たに単離されたＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ｎＴｒｅｇ（＋ｎＴｒｅｇ）と４８時間共培養された。次に、ＢｒｄＵ組み込み分析を用いて、応答ＣＤ２５^-Ｔ細胞の増殖量を決定した。Ｐ＜．００１。図４Ｄにおいて、図４Ｃで記載されるように共培養物におけるＩＦＮ−γ濃度を評価した。

【0054】

図４Ｅにおいて、ヒトＰＢＭＣからＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇを単離し、ヒトｅｍＴｈ−１細胞上清に２４時間曝した。次にセル トレイス バイオレット（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）で標識されたＣＤ２５^-応答Ｔ細胞を、未処理Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５^-＋未処理Ｔｒｅｇ）またはｅｍＴｈ−１で前処理したＴｒｅｇ（ＣＤ２５^-＋［Ｔｒｅｇ］^emTh-1sup）に加えた。図４Ｆにおいて、ヒトＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔリンパ球は、最初にｅｍＴｈ−１上清で処理され（［ＣＤ２５^-］^emTh-1sup）または処理されず（未処理ＣＤ２５^-）、次にセル トレイス バイオレット（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ）で標識され、新たに単離されたＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇ（＋Ｔｒｅｇ）と共培養された。材料および方法に記載されるようにフローサイトメトリー分析を用いて、応答ＣＤ２５^-Ｔ細胞増殖量を決定した。

【0055】

図４Ａにおける結果は、ｎＴｒｅｇにおけるＦｏｘＰ３発現がｅｍＴｈ−１上清によって弱められなかったことを実証した。マウスリンパ系組織から単離されたｎＴｒｅｇは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２を用いて活性化された。細胞は、完全培地またはｅｍＴｈ−１上清のいずれかで４８時間培養され、次に新たに単離されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-細胞とさらに４８時間共培養される前に洗浄された。ｅｍＴｈ−１上清で処理された又は処理されていないｎＴｒｅｇのＣＤ４⁺ＣＤ２５^-細胞増殖を阻害する能力は、ＢｒｄＵ組み込み分析を用いて分析された。そのデータは、ｅｍＴｈ−１上清（図４Ｂ）またはＩＦＮ−γが、ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺通常Ｔ細胞の増殖を抑制するＴｒｅｇの能力を阻害したことを示した。末梢血リンパ球から単離されたヒトＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＴｒｅｇおよびＣＤ４⁺ＣＤ２５^-応答Ｔ細胞を使用した場合も、同様の結果が得られた（図４Ｅ）。

【0056】

ｅｍＴｈ−１上清とともにＴ細胞を４８時間インキュベートし、次に、新たに単離されたＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３⁺ｎＴｒｅｇと共培養した。ｅｍＴｈ−１上清で前処理されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔ細胞のＩＦＮ−γ（図４Ｄ）の増殖（図４Ｃ）および生成のいずれも、Ｔｒｅｇによって抑制されなかった。ｅｍＴｈ−１上清で前インキュベートされたヒトＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺応答Ｔ細胞をヒトＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔｒｅｇに曝した場合も、同様の結果が得られた（図４Ｆ）。これらのデータは、ｅｍＴｈ−１細胞がＴｒｅｇの阻害機能を弱めるだけでなく、Ｔｒｅｇ媒介阻害に対するエフェクターＴ細胞の耐性も誘発することを示した。

【0057】

０日目にナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスは右鼠径部に５×１０³の生きている１２Ｂ１細胞を注射された。図５Ａにおいて、３日目、７日目および１４日目にワクチン接種を行った。本治療は、「材料および方法」で記載されているように、右足蹠に投与された。マウスの生存を監視し、カプランマイヤープロットにて表示した。図５Ｂにおいて、０日目にＳＣＩＤマウスは右鼠径部に５×１０³の生きている１２Ｂ１細胞を注射され、３日目、７日目および１４日目に足蹠注射により、ＰＢＳ、活性化ｅｍＴｈ−１または活性化ｅｍＴｈ−１＋ＣＲＣＬの組み合わせのいずれかで治療された。図５Ｃにおいて、免疫適格Ｂａｌｂ／ｃマウスは腫瘍細胞を注射され、３日目、７日目および１４日目に、ＰＢＳ、または活性化ｅｍＴｈ−１＋ＣＲＣＬの組み合わせのいずれかで治療された。いくつかのマウスグループにおいて、「材料および方法」で記載されているように、１日前、３日目および５日目に抗アシアロＧＭ１抗体の腹腔内注射を用いて、ＮＫ細胞を枯渇させた。全ての実験において、マウスの生存を監視し、カプランマイヤープロットにて表示した。図５Ｄにおいて、０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスは５×１０⁵のＢ１６細胞を注射された。次に、Ｂ１６由来ＣＲＣＬプラスｅｍＴｈ−１＋Ｂ１６ ＣＲＣＬを用いて動物を治療した（３日、５日および７日）。材料および方法で記載されているように、腫瘍体積を毎日監視した。カプランマイヤー分析を用いて動物の生存率を示した。

【0058】

腫瘍特異的免疫を誘発するために、同種異系エフェクター−メモリーＴｈ−１細胞をベースとした免疫療法を、同一タイプの腫瘍に由来したＣＲＣＬのような個人化されたワクチンと組み合わせることが可能か否かについて検証し評価した。図５の結果に示されるように、同種異系ｅｍＴｈ−１細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで安全に送達され、シャペロンリッチ細胞可溶化物（ＣＲＣＬ）と効率的に組み合わされ、１２Ｂ１白血病のマウスを治療することができる。ナイーブＢａｌｂ／ｃマウスにおける確立された１２Ｂ１腫瘍が使用され、エフェクター−メモリーＴｈ−１細胞をベースとした免疫療法をＣＲＣＬワクチン接種戦略と効率的に組み合わせることにより、治療された動物の無腫瘍生存率が有意になることができることを確認した（図５Ａ）。Ｂ１６由来ＣＲＣＬプラスＢＡＬＢ／ｃマウスから生成されたｅｍＴｈ−１細胞で処理された、Ｂ１６腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスからなるＢ１６黒色腫モデルを使用して、同様の結果が得られた（図５Ｄを参照）。

【0059】

ＳＣＩＤマウスとＮＵＤＥマウスを使用することにより、ＣＲＣＬプラス活性化ｅｍＴｈ−１で誘発された抗腫瘍応答におけるＴ細胞の役割を定義した。上記の記載されるように、腫瘍細胞接種後３、７、１４日後に、ＣＲＣＬプラス活性化ｅｍＴｈ−１で１２Ｂ１腫瘍を持つＳＣＩＤマウスを処理した。ＣＲＣＬプラス活性化ｅｍＴｈ−１の免疫療法は、１２Ｂ１腫瘍を持つＳＣＩＤマウスの生存率を向上させなかった（図５Ｂ）。同様の結果がＮＵＤＥマウスを使用して得られた。これらのデータは、同種異系Ｔｈ−１プラスＣＲＣＬを組み合わせた、１２Ｂ１腫瘍に対する免疫療法の保護効果は、Ｔ細胞媒介免疫反応に依存することを示した。これらのデータと一致して、免疫適格マウスにおいて抗アシアロＧＭ１抗体を用いてｉｎ ｖｉｖｏでＮＫ細胞の枯渇は、同種異系Ｔｈ−１プラスＣＲＣＬ処理の治療的有効性を有意には弱めなかった。このことは、組み合わせ処理によって誘発される抗腫瘍免疫反応においてＮＫ細胞は主要な役割を果たしていないことを示す（図５Ｃ）。従って、同種異系活性化ｅｍＴｈ−１細胞をＣＲＣＬワクチンと組み合わせることをベースとした免疫療法の腫瘍保護効果は、Ｔリンパ球に依存する。

【0060】

図５に関して説明されるように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスは０日目に５ｘ１０³の１２Ｂ１細胞を（右鼠径部において皮下に）注射され、ワクチン接種された。次に、４５日目に、生存している腫瘍を持たないマウスに、５ｘ１０³の１２Ｂ１細胞を右鼠径部において皮下に再注射され、１ｘ１０⁶のＡ２０細胞を左鼠径部において皮下に投与された。１日おきに腫瘍体積を決定した。図６Ａにおいて、Ａ２０腫瘍体積を対照マウスで測定した。図６Ｂにおいて、Ａ２０腫瘍体積をｅｍＴｈ−１プラスＣＲＣＬで処理されたマウスで測定した。図３Ｃにおいて、１２Ｂ１体積を対照グループで測定した。図３Ｄにおいて、１２Ｂ１腫瘍体積をｅｍＴｈ−１プラスＣＲＣＬで処理された動物で測定した。結果は、２つの独立した実験を代表している。

【0061】

ＣＲＣＬプラス同種異系活性化ｅｍＴｈ−１細胞で処理された生存マウスは、右鼠径部に親１２Ｂ１腫瘍細胞を、および対向する鼠径部に無関係のＢ細胞白血病（Ａ２０、Ｈ−２Ｄ）を、再注射された。処理グループと対照グループの双方で、８匹のマウス全てにおいてＡ２０腫瘍が発生した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＣＲＣＬプラス同種異系エフェクター−メモリーＴｈ−１細胞グループでは、８匹のマウスのうち５匹が１２Ｂ１腫瘍再接種から保護され、２匹が腫瘍成長の遅れを示した。一方、全ての対照マウスは１２Ｂ１腫瘍を発生した（図６Ｃおよび６Ｄ）。このように、これらの結果は、ＣＲＣＬプラス同種異系活性化ｅｍＴｈ−１細胞からなる組み合わせ免疫療法は、治療された動物の大半において長期間継続する腫瘍特異性免疫を誘発することを示す。

【0062】

図７Ａにおいて、ｅｍＴｈ−１プラスＣＲＣＬの免疫療法は、腫瘍特異的キラーＴリンパ球を誘発する。Ｂ１６腫瘍を持つマウスは、材料および方法で記載されるように、対照ＰＢＳを注射されるか、またはＢ１６由来ＣＲＣＬと同種異系ｅｍＴｈ−１細胞で処理された。最後のワクチン接種から７日目に、脾細胞を採取し、ＣＲＣＬ（２５マイクログラム／ｍＬ）と５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を用いて３日間インキュベートした。次に、Ｔリンパ球をナイロンウールカラム上で精製し、示されているように、Ｂ１６腫瘍細胞または無関係の４Ｔ１乳癌細胞標的のいずれかとともに３６時間インキュベートした（エフェクターＴ細胞対標的腫瘍細胞比２０：１）。細胞毒性を決定した。対照Ｔ、ＰＢＳを注射されたマウスからのＴリンパ球を用いて培養された腫瘍細胞；＋Ｔ［ｅｍＴｈ−１］、ＣＲＣＬプラスｅｍＴｈ−１で処理されたマウスからのＴリンパ球を用いて培養された腫瘍細胞。図７Ｂにおいて、ｅｍＴｈ−１細胞は、ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＦｏｘＰ３^-ナイーブＴリンパ球の分化を、ｉｎ ｖｉｖｏのＴｒｅｇよりむしろＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３^-エフェクターＴ細胞の方に傾けた。Ｔｈｙ１．２ ＦｏｘＰ３ＥＧＦＰトランスジェニックＢＡＬＢ／ｃマウスから単離されたＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＦｏｘＰ３^-ナイーブＴリンパ球（１０⁷細胞）を、１２Ｂ１腫瘍を持つコンジェニックＴｈｙ１．１ ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した。動物は、ｅｍＴｈ−１細胞（＋ｅｍＴｈ−１細胞）または対照ＰＢＳ（ｅｍＴｈ−１細胞は無し）で処理された。レシピエントＴｈｙ１．１マウスの内因性Ｔ細胞は、Ｔｈｙ１．１抗原を発現するが、Ｔｈｙ１．２抗原は発現しない。これにより、Ｔｈｙ１．１マウスにおけるＴｈｙ１．２ Ｔリンパ球の特定の追跡と同定を許す。脾臓を採取して解離し、移植されたナイーブＴｈｙ１．２ ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＦｏｘＰ３^-Ｔ細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＦＰ＋（ＦｏｘＰ３発現）Ｔｒｅｇへの転換を、フローサイトメトリーを用いてＣＤ４⁺Ｔ細胞個体群上にゲーティング後にＴｈｙ１．２ ＧＦＰ＋細胞の頻度を評価することによって決定した。図７Ｃにおいて、ｅｍＴｈ−１細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏのＴｒｅｇ抑制機能を弱めた。応答ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔリンパ球は、処理されていない腫瘍を持つマウス（ＣＤ２５^-＋［Ｔｒｅｇ］未処理）またはｅｍＴｈ−１で処理された腫瘍を持つマウス（ＣＤ２５^-＋［Ｔｒｅｇ］ｅｍＴｈ−１）の流入領域リンパ節から単離されたＴｒｅｇの不存在（ＣＤ２５^-）下または存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８Ｔ細胞増殖刺激用ビーズを用いて刺激された。応答ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-Ｔリンパ球増殖量は、ＢｒｄＵ取り込み分析を用いて４８時間後に決定された。

【0063】

ＣＲＣＬプラスｅｍＴｈ−１細胞で処理されたマウスから単離されたＴ細胞の抗腫瘍機能を分析した。組み合わせ治療を受けた動物の脾臓から精製されたリンパ球は、親腫瘍細胞を特異的に殺すことができたが、無関係の標的癌細胞を殺すことはできなかった（図７Ａ）。ｅｍＴｈ−１細胞は、１２Ｂ１腫瘍を持つコンジェニックＴｈｙ１．１マウスに移植されたナイーブＴｈｙ１．２ ＣＤ４⁺ＣＤ２５^-ＦｏｘＰ３^-Ｔリンパ球の分化を、Ｔｈｙ１．２ ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３⁺ＴｒｅｇよりもむしろＴｈｙ１．２ ＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺ＦｏｘＰ３^-エフェクターＴ細胞に傾けることができた（図７Ｂ）。加えて、ｅｍＴｈ−１細胞で処理された腫瘍を持つ動物から単離されたＴｒｅｇの抑制機能は有意に低下した（図７Ｃ）。このことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された、ｅｍＴｈ−１細胞のＴｒｅｇへの効果は、ｉｎ ｖｉｖｏでも生じることを確認し、さらに、ｅｍＴｈ−１細胞がＣＲＣＬワクチン接種の有効性を増加させるメカニズムは腫瘍誘発Ｔｒｅｇの阻害に関与することを実証した。

【0064】

好ましい実施形態を参照しながら本発明を説明してきたが、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく形態および詳細を変更し得ることを理解するであろう。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A-6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】