特許 6294828 インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6294828

(24)【登録日】2018年2月23日

(45)【発行日】2018年3月14日

(54)【発明の名称】インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/11 20060101AFI20180305BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180305BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180305BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20180305BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20180305BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/11ZNA

   C12N15/00 A

   C12P21/02 C

   A61K39/145

   A61P31/16

【請求項の数】19

【全頁数】142

(21)【出願番号】特願2014-542883(P2014-542883)

(86)(22)【出願日】2012年11月27日

(65)【公表番号】特表2015-502353(P2015-502353A)

(43)【公表日】2015年1月22日

(86)【国際出願番号】EP2012073706

(87)【国際公開番号】WO2013079473

(87)【国際公開日】20130606

【審査請求日】2015年8月26日

(31)【優先権主張番号】11191003.0

(32)【優先日】2011年11月28日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/564,086

(32)【優先日】2011年11月28日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】11191009.7

(32)【優先日】2011年11月28日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/564,198

(32)【優先日】2011年11月28日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】12166268.8

(32)【優先日】2012年5月1日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/720,281

(32)【優先日】2012年10月30日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516257833

【氏名又は名称】ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー

【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ＆ ＰＲＥＶＥＮＴＩＯＮ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100135943

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 規樹

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ウィレム メーイベルク

(72)【発明者】

【氏名】アントニエッタ インパフリアッツォ

(72)【発明者】

【氏名】ロナルド フォヘルス

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ハインツ エドワルド フリーセン

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ アラール

(72)【発明者】

【氏名】ステファン ラフェリックス

(72)【発明者】

【氏名】カタリナ ラドシェヴィッチ

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０２８９４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１３０６３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１１７７８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１２３４９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平７−８９９９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PNAS[online]，２０１０年 ７月 ６日，Vol.107, No.31，pp.13701-13706,SI，doi:10.1073/pnas.1007465107, [2016年8月15日検索]インターネット，<URL:http://www.pnas.org/content/107/31/13701.full.pdf?sid=2803da4e-0490-4529-b2be-5265f49edd6e>,<URL:http://www.pnas.org/content/suppl/2010/07/02/1007465107.DCSupplemental/pnas.1007465107_SI.pdf>

【文献】 PNAS，２０１０年１１月 ２日，Vol.107, No.44，pp.18979-18984

【文献】 J. Gen. Virol.，１９９６年，Vol.77，pp.1483-1487

【文献】 mBio，２０１０年，Vol.1, Issue1，e00018-10

【文献】 J. Virol.，２００９年，Vol.83，pp.1742-1753

【文献】 J. Virol.，２００５年，Vol.79，pp.7380-7388

【文献】 Virus Res.，２０１１年，Vol.162，pp.31-38

【文献】 PNAS，２０１０年，Vol.107，pp.13563-13564

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １４／１１

Ａ６１Ｋ ３９／１４５

Ａ６１Ｐ ３１／１６

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）０〜１０アミノ酸残基の結合配列によりＨＡ１の３２１位〜末端のアミノ酸を含むＨ１ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに共有結合しているアミノ酸１〜５２を含むＨ１ＨＡ１Ｎ末端セグメント、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、
前記ポリペプチドを構成する各ドメインが、Ｎ末端からＣ末端の方向で、Ｈ１ＨＡ１Ｎ末端セグメント、Ｈ１ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメント、インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインの順番に配置され、
前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸であり、４０６、４０９、４１３および４１６位のアミノ酸の１つ以上は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸に変化しており、前記ポリペプチドが、３２４位のアミノ酸と４３６位のアミノ酸との間のジスルフィド架橋を含み、ＨＡ１のアミノ酸５３〜３２０は欠失しており、番号付与は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付与に基づく、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド。

【請求項2】

インフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）またはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（配列番号１５９）のＨＡからの、またはそれをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含む、請求項１に記載のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド。

【請求項3】

（ａ）０〜１０アミノ酸残基の結合配列によりＨＡ１の３２３位〜末端のアミノ酸を含むＨ３ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに共有結合しているアミノ酸１〜６１を含むＨ３ＨＡ１Ｎ末端セグメント、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、
前記ポリペプチドを構成する各ドメインが、Ｎ末端からＣ末端の方向で、Ｈ３ＨＡ１Ｎ末端セグメント、Ｈ３ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメント、インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインの順番に配置され、
前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸であり、４０１、４０８、４１１、４１５および４１８位のアミノ酸の１つ以上は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸に変化しており、前記ポリペプチドが、３２６位のアミノ酸と４３８位のアミノ酸との間のジスルフィド架橋を含み、ＨＡ１のアミノ酸６２〜３２２は欠失しており、番号付与は、Ｈ３Ｎ２インフルエンザ株Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号：８９）のアミノ酸の番号付与に基づくインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド。

【請求項4】

Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）またはＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８（配列番号１２１）のＨＡドメインを含む、請求項３に記載のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド。

【請求項5】

前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド。

【請求項6】

グリコシル化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

表７のインフルエンザＡウイルスからなる群から選択されるＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルスからのインフルエンザヘマグルチニンをベースとするインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１および／またはＨＡ２ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記ＨＡ１ドメインおよび／または前記ＨＡ２ドメイン中の１つ以上のさらなる突然変異を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項9】

シグナル配列を含まない、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項10】

ＨＡの細胞内および膜貫通配列を含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記ＨＡ２ドメインの５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９または５３０位〜Ｃ末端のアミノ酸配列が、除去されている、請求項１０に記載のポリペプチド。

【請求項12】

抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合し、抗体ＣＲ８０５７に結合せず、
抗体ＣＲ９１１４が、配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２領域及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、
請求項１、２および請求項５〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項13】

抗体ＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合し、抗体ＣＲ８０５７に結合せず、
抗体ＣＲ９１１４が、配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３領域、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２領域及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、
請求項４〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

（ａ）インフルエンザＨ１のＨＡ０アミノ酸配列を提供するステップ；
（ｂ）ＨＡ１のＣ末端アミノ酸を、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外のアミノ酸に変異させることにより、ＨＡ１およびＨＡ２の間の開裂部位を除去するステップ；
（ｃ）球状頭部ドメインの５３位から３２０位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列をＨＡ０配列から除去し、残る配列部分を直接または１〜１０アミノ酸の長さのリンカー配列を導入することにより連結するステップ；
（ｄ）へリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列中に１つ以上の突然変異を導入するステップ；および
（ｅ）ＨＡステムドメインにおいて、配列番号１の３２４位および４３６位のアミノ酸に相当する各アミノ酸の間で少なくともジスルフィド結合を導入するステップを含む、インフルエンザＨ１のヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する方法。

【請求項15】

（ａ）インフルエンザＨ３のＨＡ０アミノ酸配列を提供するステップ；
（ｂ）ＨＡ１のＣ末端アミノ酸を、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外のアミノ酸に変異させることにより、ＨＡ１およびＨＡ２の間の開裂部位を除去するステップ；
（ｃ）球状頭部ドメインの６２位から３２２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列をＨＡ０配列から除去し、残る配列部分を直接または１〜１０アミノ酸の長さのリンカー配列を導入することにより連結するステップ；
（ｄ）へリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列中に１つ以上の突然変異を導入するステップ；および
（ｅ）ＨＡステムドメインにおいて、配列番号８９の３２６位および４３８位のアミノ酸に相当する各アミノ酸の間で少なくともジスルフィド結合を導入するステップを含む、
インフルエンザＨ３のヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する方法。

【請求項16】

請求項１４または１５に記載の方法により得られるインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド。

【請求項17】

請求項１〜１３および請求項１６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。

【請求項18】

請求項１〜１３および請求項１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、および／または請求項１７に記載の核酸分子を含む免疫原性組成物。

【請求項19】

医薬品として使用される、請求項１〜１３および請求項１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１７に記載の核酸、および／または請求項１８に記載の免疫原性組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬の分野に関する。本明細書において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、ヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する方法、それを含む組成物、それを含むワクチンならびに特にインフルエンザの検出、予防および／または治療におけるそれらの使用方法が提供される。

【背景技術】

【0002】

インフルエンザウイルスは、主要なヒト病原体であり、無症状感染から死亡をもたらし得る原発性ウイルス肺炎まで重症度に幅がある呼吸器疾患（一般に「インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）」または「インフルエンザ（ｔｈｅ ｆｌｕ）」と称される）を引き起こす。感染の臨床効果は、インフルエンザ株の病原性ならびに宿主の曝露、既往歴、年齢、および免疫状態により変動する。毎年、世界中で約１０億人の人々がインフルエンザウイルスによる感染を受け、３〜５百万症例の重病および推定３００，０００から５００，０００のインフルエンザ関連死をもたらすことが推定されている。これらの感染の大部分は、Ｈ１またはＨ３ヘマグルチニン亜型を担持するインフルエンザＡウイルスに起因し得、インフルエンザＢウイルスからの寄与は小さく、したがって、３つ全ての代表物は季節性ワクチンに含まれる。現在の予防接種実施は、有効な季節性インフルエンザワクチンの適時産生を可能とするための循環インフルエンザウイルスの早期同定に依存する。次の季節の間に優性となる株の予測の固有の困難性とは別に、抗ウイルス耐性および免疫回避も、現在のワクチンが罹患および死亡を予防することができない一因である。これに加え、病原体保有動物から生じ、ヒトからヒトへの拡散を増加させるようにリアソートされた高度に病原性のウイルス株により引き起こされる流行病の可能性は、グローバルヘルスにとって顕著で現実的な脅威となる。

【0003】

インフルエンザＡウイルスは、天然に広く分布しており、種々の鳥類および哺乳動物に感染し得る。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の科に属するエンベロープＲＮＡウイルスである。これらのゲノムは、１１の異なるタンパク質、１つの核タンパク質（ＮＰ）、３つのポリメラーゼタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２）、２つのマトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、３つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２、およびＰＢ１−Ｆ２）、および２つの外部糖タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする８つの一本鎖ＲＮＡセグメントからなる。ウイルスは、ＨＡおよびＮＡタンパク質の抗原構造の差に基づき分類され、それらの異なる組合せは、規定のインフルエンザウイルス株にさらに分類されるユニークなウイルス亜型を表す。全ての公知の亜型は鳥類において見出すことができるが、現在循環するヒトインフルエンザＡ亜型は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２である。系統発生分析は、ヘマグルチニンの２つの主群への下位分類を実証した：とりわけ系統発生グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜型およびとりわけ系統発生グループ２におけるＨ３、Ｈ４およびＨ７亜型。

【0004】

インフルエンザＢ型ウイルス株は、厳密にはヒトである。インフルエンザＢ型ウイルス株内のＨＡにおける抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものよりも小さい。２つの遺伝的および抗原的に区別されるインフルエンザＢウイルスの系統は、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａとも称される）およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）系統により表わされるとおり、ヒトにおいて循環している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。インフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患のスペクトルは、インフルエンザＡウイルスにより引き起こされるものよりも一般に軽度であるが、インフルエンザＢ感染について入院を要する重病が依然として頻繁に観察される。

【0005】

インフルエンザを中和する抗体が主としてヘマグルチニン（ＨＡ）に対して指向されることは公知である。ヘマグルチニンまたはＨＡは、ウイルスコートにアンカリングされ、二重の機能を有する三量体糖タンパク質であり：それは細胞表面受容体シアル酸への結合を担い、取り込み後、それはウイルスおよびエンドソーム膜の融合を媒介し、細胞の細胞質ゾル中でのウイルスＲＮＡの放出をもたらす。ＨＡは、大型の頭部ドメインおよびより小型のステムドメインを含む。ウイルス膜への付着は、ステムドメインに連結されたＣ末端アンカリング配列により媒介される。タンパク質は、特定のループで翻訳後開裂されて２つのポリペプチドＨＡ１およびＨＡ２を生じさせる（全配列は、ＨＡ０と称される）。膜遠位頭部領域は、主としてＨＡ１に由来し、膜近位ステム領域は、主としてＨＡ２に由来する（図１）。

【0006】

季節性インフルエンザワクチンを毎年アップデートしなければならない理由は、ウイルスの大きい変異性である。ヘマグルチニン分子において、この変異は、抗原ドリフトおよびシフトが多数の異なるバリアントをもたらした頭部ドメイン中で特に顕在化される。これは、免疫優性の区域でもあるため、ほとんどの中和抗体はこのドメインに対して指向され、受容体結合を妨げることにより作用する。頭部ドメインの免疫優性および大きい変異の組合せは、なぜ特定の株による感染が他の株に対する免疫をもたらさないかも説明し：第１の感染により誘発される抗体は、一次感染のウイルスと密接に関連する限定数の株を認識するにすぎない。

【0007】

近年、全てまたは実質的に全てのインフルエンザヘマグルチニン球状頭部ドメインを欠くインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドが記載されており、ステムドメインポリペプチドの１つ以上の保存エピトープに対する免疫応答を生成するために使用されている。ステムドメインポリペプチドのエピトープは、球状頭部ドメインの高度に免疫原性の領域よりも免疫原性でなく、したがってステムドメインポリペプチド中の球状頭部ドメインの不存在がステムドメインポリペプチドの１つ以上のエピトープに対する免疫応答の発現を許容し得ると考えられている（Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。したがって、Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ１のアミノ酸残基５３から２７６をＨＡ一次配列から欠失させ、これを短いフレキシブル結合配列ＧＧＧＧにより置き換えることにより新規分子を作出した。Ｈ３ＨＫ６８構築物によるマウスのワクチン接種は、グループ１のＨＡと交差反応性の抗血清を誘発しなかった。さらに、以下の実施例において示されるとおり、ステムドメインポリペプチドは高度に不安定であり、ステム領域中の保存エピトープに結合することが示された抗体の結合の欠落により証明されるとおり、正確な立体構造を採用しなかった。

【0008】

さらに、Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）は、ＨＡ２のアミノ酸残基１〜１７２、７アミノ酸リンカー（ＧＳＡＧＳＡＧ）、ＨＡ１のアミノ酸残基７〜４６、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡに続くＨＡ１の残基２９０〜３２１を、ＨＡ１中の突然変異Ｖ２９７Ｔ、Ｉ３００Ｅ、Ｙ３０２ＴおよびＣ３０５Ｔとともに含むＨＡ２ベースポリペプチドを記載した。設計は、Ｈ３ＨＡ（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１９６８）の配列をベースとした。このポリペプチドは、Ｈ３亜型内の別のインフルエンザウイルス株に対する交差保護を提供したにすぎなかった（Ａ／Ｐｈｉｌ／２／８２に対して提供したが、Ｈ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４に対しては提供しなかった）。

【0009】

したがって、強固な広域中和抗体応答の産生を刺激し、広範な現在および将来のインフルエンザウイルス株（季節性および流行性の両方）に対する保護を提供する、特にインフルエンザの有効な予防および治療のために系統発生グループ１および／またはグループ２内の１つ以上のインフルエンザＡウイルス亜型に対する保護を提供する安全で有効なユニバーサルワクチンが依然として必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本明細書において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、ステムドメインポリペプチドを提供する方法、それを含む組成物、それを含むワクチンおよびそれらの使用方法が提供される。

【0011】

第１の態様において、本発明は、インフルエンザ（ＨＡ）ステムドメインポリペプチドと称される、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインを含み、球状頭部を欠く新規免疫原性ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、対象、特にヒト対象に投与された場合に免疫応答を誘導し得る。本発明のポリペプチドは、膜近位ステムドメインＨＡ分子の保存エピトープを、膜遠位頭部ドメイン中に存在する優性エピトープの不存在下で免疫系に提示する。この目的のため、頭部ドメインを構成するＨＡ０タンパク質の一次配列の一部を除去し、残留アミノ酸配列を直接的にまたは、一部の実施形態において、短いフレキシブル結合配列（「リンカー」）を導入することにより再連結させてアミノ酸鎖の連続性を回復させる。得られた配列を、ＨＡ０分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する規定の突然変異を導入することによりさらに改変する。免疫原性ポリペプチドは、インフルエンザウイルスの全長ＨＡ１および／またはＨＡ２を含まない。

【0012】

インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、ヒトインフルエンザワクチン産生に一般に使用されるインフルエンザウイルス株のＨＡをベースとする。特に、ポリペプチドは、Ｈ１、Ｈ５および／またはＨ３亜型のインフルエンザＡウイルスのＨＡをベースとする。

【0013】

ある実施形態において、本発明は、（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメイン、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、ＨＡ１およびＨＡ２間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性であり、ＨＡ２のＡへリックスおよびへリックスＣＤを連結するアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が野生型インフルエンザＨＡ２ドメインと比較して突然変異しているヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する。好ましくは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、Ｈ１、Ｈ５およびＨ３亜型からなる群から選択されるインフルエンザＡウイルスに由来する。

【0014】

本発明のポリペプチドは、図１に示されるへリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の突然変異を含む。ある実施形態において、前記ＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸、例えば、極性および／もしくは荷電アミノ酸、またはフレキシブルアミノ酸グリシン（Ｇ）により置換されている。

【0015】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜ｘを含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜末端（すなわち、ＨＡ１のＣ末端アミノ酸）を含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１セグメントの欠失は、ｘ＋１位におけるアミノ酸からｙ−１位におけるアミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ〜ｘを含み、ｐは、成熟ＨＡ分子の最初のアミノ酸である（例えば、配列番号１の場合、ｐ＝１８）。当業者は、シグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１７）を有さない本明細書に記載のポリペプチドを調製することができる。ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含まない。ある実施形態において、細胞内および膜貫通配列、例えば、ＨＡ２ドメインの５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはそれらの相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列が除去されている。

【0016】

本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１を含まない。

【0017】

ある実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化されている。

【0018】

ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、ＨＡ０よりも実質的に小型であり、好ましくは、全てまたは実質的に全てのＨＡの球状頭部を欠く。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、３６０アミノ酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３００、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約２６０から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０、好ましくは、約２７０から約３３０アミノ酸長である。

【0019】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインがベースとするＨＡのアミノ酸配列と比較してＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の追加の突然変異をさらに含む。

【0020】

本発明は、
（ａ）インフルエンザＨＡ０アミノ酸配列を提供するステップ；
（ｂ）ＨＡ１〜ＨＡ２の開裂部位を除去するステップ；
（ｃ）球状頭部ドメインのアミノ酸配列、特にｘ＋１から出発してｙ−１位までのアミノ酸配列を前記ＨＡ０配列から除去するステップ；
（ｄ）へリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列中に１つ以上の突然変異を導入するステップ；および
（ｅ）ＨＡステムドメインポリペプチド中に１つ以上のジスルフィド架橋を導入するステップ
の一般的ステップを含むインフルエンザヘマグルチニンステムポリペプチドを提供する方法も提供する。

【0021】

このような方法により得られるポリペプチドも、本発明の一部である。

【0022】

ある実施形態において、ポリペプチドは、グループ１交差中和抗体ＣＲ６２６１（国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットに開示）および／または抗体ＣＲ９１１４（以下、および同時係属出願のＥＰ１１１７３９５３．８号明細書に記載）、グループ１およびグループ２インフルエンザＡウイルスの両方、ならびにインフルエンザＢウイルスに結合し、中和し得る抗体の保存ステムドメインエピトープを含む。したがって、抗体ＣＲ６２６１および／または抗体ＣＲ９１１４に結合するＨＡステムドメインポリペプチドを提供することは、本発明の別の態様である。一実施形態において、ポリペプチドは、ＣＲ８０５７（国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）、Ｈ３インフルエンザウイルスのみに結合するモノクローナル抗体に結合しない。ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３および／またはＣＲ９１１４に結合する。本発明に提供されるインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザウイルスＡおよび／またはＢ株に対する免疫応答を生成し得る免疫原性組成物（例えば、ワクチン）における使用に好適である。一実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、系統発生グループ１および／またはグループ２のインフルエンザＡウイルス株、特に系統発生グループ１およびグループ２の両方のインフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。一実施形態において、ポリペプチドは、同種インフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。一実施形態において、ポリペプチドは、同一およびまたは異なる亜型の異種インフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、系統発生グループ１およびグループ２の両方のインフルエンザウイルス株ならびにインフルエンザＢウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。

【0023】

本発明によるポリペプチドは、例えば、インフルエンザウイルス、特に系統発生グループ１もしくは２インフルエンザＡウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患または病態のスタンドアロン療法および／もしくは予防および／もしくは診断において、または他の予防および／もしくは治療処置、例えば、（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／もしくはモノクローナル抗体との組合せで使用することができる。

【0024】

さらなる態様において、本発明は、インフルエンザＨＡステムドメインポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。さらに別の態様において、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。

【0025】

さらなる態様において、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に本発明によるポリペプチドおよび／または核酸分子を投与することを含む方法を提供する。

【0026】

さらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドおよび／または核酸分子を含む免疫原性組成物を提供する。本明細書に提供される免疫原性組成物は、対象、例えば、マウス、フェレットまたはヒトへの組成物の投与を可能とする任意の形態であり得る。具体的な実施形態において、免疫原性組成物は、ヒト投与に好適である。ポリペプチド、核酸分子および組成物は、インフルエンザウイルス疾患を予防および／もしくは治療する方法において、ならびに／または診断目的に使用することができる。組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、アジュバントを含み、またはアジュバントとの組合せで投与される。

【0027】

別の態様において、本発明は、ワクチンとして使用されるポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を提供する。本発明は、特に、系統発生グループ１および／もしくは２のインフルエンザウイルスＡ亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患または病態の予防および／または治療においてワクチンとして使用される免疫原性ポリペプチド、核酸、および／または免疫原性組成物に関する。
本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、（ａ）ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜末端（ｙは、Ｈ１ＨＡ１の２９０位上のアミノ酸〜３２５位上のアミノ酸の任意のアミノ酸である）を含むＨ１ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているアミノ酸１〜ｘ（ｘは、４７位上のアミノ酸〜６０位上のアミノ酸の任意のアミノ酸である）を含むＨ１ＨＡ１Ｎ末端セグメント、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸であり、ＨＡ２のＡへリックスのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が、野生型インフルエンザＨＡ２と比較して突然変異しており、ＡへリックスのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結する前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）（配列番号１７）を含むインフルエンザＨＡ２の残基４０２〜４１８のアミノ酸配列を含み、４０６、４０９、４１３および４１６位上のアミノ酸の１つ以上は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸に変化しており、３２４位のアミノ酸と４３６位のアミノ酸との間のジスルフィド架橋を含み；番号付与は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付与に基づくことを特徴とする。
本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、インフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）またはＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（配列番号１５９）のＨＡからの、またはそれをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含むことが好ましい。
本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、（ａ）ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜末端（ｙは、Ｈ３ＨＡ１の２９２位上のアミノ酸〜３２５位上のアミノ酸の任意のアミノ酸である）を含むＨ３ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているアミノ酸１〜ｘ（ｘは、５６位上のアミノ酸〜６９位上のアミノ酸の任意のアミノ酸である）を含むＨ３ＨＡ１Ｎ末端セグメント、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸であり、ＨＡ２のＡへリックスのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が、野生型インフルエンザＨＡ２ドメインと比較して突然変異しており、ＡへリックスのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結する前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列Ｉ（Ｅ／Ｇ）ＫＴＮＥＫＦＨＱＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧＲ（配列番号１０４）を含み、４０１、４０８、４１１、４１５および４１８位上のアミノ酸の１つ以上は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸に変化しており、３２６位のアミノ酸と４３８位のアミノ酸との間のジスルフィド架橋を含み；番号付与は、Ｈ３Ｎ２インフルエンザ株Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号：８９）のアミノ酸の番号付与に基づくことが好ましい。
本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）またはＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１／１９６８（配列番号１２１）のＨＡドメインを含むことが好ましい。
本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、前記ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１ドメインを含まないことが好ましい。
本発明のポリペプチドは、グリコシル化されていることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、表７のインフルエンザＡウイルスからなる群から選択されるＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルスからのインフルエンザヘマグルチニンをベースとするインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１および／またはＨＡ２ドメインを含むことが好ましい。
本発明のポリペプチドは、前記ＨＡ１ドメインおよび／または前記ＨＡ２ドメイン中の１つ以上のさらなる突然変異を含むことが好ましい。
本発明のポリペプチドは、シグナル配列を含まないことが好ましい。
本発明のポリペプチドは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜末端を含むＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１のアミノ酸ｐ〜ｘを含むＨＡ１Ｎ末端セグメント、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含み、ｐ＝成熟ＨＡの最初のアミノ酸であることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内および膜貫通配列を含まないことが好ましい。
本発明のポリペプチドは、前記ＨＡ２ドメインの５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９または５３０位〜Ｃ末端のアミノ酸配列が、除去されていることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合し、抗体ＣＲ８０５７に結合しないことが好ましい。
本発明のポリペプチドは、抗体ＣＲ８０２０、ＣＲ８４３および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合することが好ましい。
本発明の、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する方法は、（ａ）インフルエンザＨ１またはＨ３ ＨＡ０アミノ酸配列を提供するステップ；
（ｂ）ＨＡ１〜ＨＡ２の開裂部位を除去するステップ；
（ｃ）球状頭部ドメインのアミノ酸配列を前記ＨＡ０配列から除去するステップ；
（ｄ）へリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列中に１つ以上の突然変異を導入するステップ；および
（ｅ）ＨＡステムドメインに１つ以上のジスルフィド結合を導入するステップ
を含むことを特徴とする。
本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、本発明の方法により得られることが好ましい。
本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードすることを特徴とする。
本発明の免疫原性組成物は、本発明のポリペプチド、および／または本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
本発明の免疫原性組成物、本発明のポリペプチド、本発明の核酸は、医薬品として使用され、特にワクチンとして使用されることが好ましい。

【0028】

本発明によるポリペプチドの種々の実施形態および使用は、以下の本発明の詳細な説明から明確になる。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】天然三量体中に存在する融合前状態のＨＡ単量体のモデルを示す。ＨＡ１を淡灰色で示し、ＨＡ２を暗灰色で示す。へリックスＡ（ＣＲ６２６１のエピトープの重要部分）およびへリックスＣＤ（三量体界面の部分）を示し、ループがそれらの二次構造エレメントを連結する。

【図2】ＦＡＣＳにより分析された、全長ＨＡおよび本発明によるＨＡステムドメインポリペプチドへのモノクローナル抗体の結合。Ａ：染色後陽性の細胞の割合。Ｂ：平均蛍光強度。Ｈ１−Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ（配列番号１）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌ１（配列番号３）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌ１＋２（配列番号４）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌ１＋３（配列番号５）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌ１＋４（配列番号６）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌ１＋２＋３（配列番号７）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌ１＋２＋３＋４（配列番号８）。

【図3】ＦＡＣＳにより分析された、全長ＨＡおよびＨＡステムドメインポリペプチドへのモノクローナル抗体の結合。Ａ：染色後陽性の細胞の割合。Ｂ：平均蛍光強度。Ｈ１−Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ（配列番号１）、ｍｉｎｉＨＡ（配列番号２）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌ１（配列番号３）。

【図4A】ＨＥＫ２９３Ｆ発現全長ＨＡおよび本発明のポリペプチドへの血清抗体の結合。Ａ：平均蛍光強度。Ｂ：染色後陽性の細胞の割合。Ｈ１−ＦＬ（配列番号１）、ＣＬ１（配列番号３）、ＣＬ１＋２（配列番号４）およびＣＬ１＋４（配列番号６）。ｃＭ２は、陰性対照である。

【図4B】ＨＥＫ２９３Ｆ発現全長ＨＡおよび本発明のポリペプチドへの血清抗体の結合。Ａ：平均蛍光強度。Ｂ：染色後陽性の細胞の割合。Ｈ１−ＦＬ（配列番号１）、ＣＬ１（配列番号３）、ＣＬ１＋２（配列番号４）およびＣＬ１＋４（配列番号６）。ｃＭ２は、陰性対照である。

【図5】ＦＡＣＳにより分析された、全長ＨＡおよびＨＡステムドメインポリペプチドへのモノクローナル抗体の結合。上図：染色後陽性の細胞の割合。下図：平均蛍光強度。Ｈ１−Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ（配列番号１）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌ１（配列番号３）、Ｈ１−ｍｉｎｉ１−ｃｌ１１（配列番号９）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１１（配列番号１０）、Ｈ１−ｍｉｎｉ３−ｃｌ１１（配列番号１１）、Ｈ１−ｍｉｎｉ４−ｃｌ１１（配列番号１２）、Ｈ１−ｍｉｎｉ１−ｃｌ１１＋５（配列番号１３）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１１＋５（配列番号１４）、Ｈ１ｍｉｎｉ３−ｃｌ１１＋５（配列番号１５）、およびＨ１−ｍｉｎｉ４−ｃｌ１１＋５（配列番号１６）。

【図6A】ＨＡＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１０）、Ｍｉｎｉ１−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１３）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）およびｃＭ２（コンセンサスＭ２配列）をコードするＤＮＡによる筋肉内免疫化またはＨＡＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）およびｃＭ２（コンセンサスＭ２配列）をコードするＤＮＡの遺伝子銃免疫化後のＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ５９／２００７からの全長ＨＡのエクトドメインへの血清抗体の結合。パネルＡ：最初の免疫化から２８日後。パネルＢ：免疫化から４９日後。

【図6B】ＨＡＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１０）、Ｍｉｎｉ１−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１３）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）およびｃＭ２（コンセンサスＭ２配列）をコードするＤＮＡによる筋肉内免疫化またはＨＡＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）およびｃＭ２（コンセンサスＭ２配列）をコードするＤＮＡの遺伝子銃免疫化後のＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ５９／２００７からの全長ＨＡのエクトドメインへの血清抗体の結合。パネルＡ：最初の免疫化から２８日後。パネルＢ：免疫化から４９日後。

【図7】ＦＡＣＳにより分析された、全長ＨＡおよびＨＡステムドメインポリペプチドへのモノクローナル抗体の結合。上図：染色後陽性の細胞の割合。下図：平均蛍光強度。Ｈ１−Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ（配列番号１）、ｍｉｎｉＨＡ（配列番号２）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１１＋５（配列番号１４）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１＋５（配列番号４８）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１＋５＋６（配列番号４６）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１１＋５＋６（配列番号４７）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１＋５＋６−ｔｒｉｍ（配列番号４４）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）。

【図8A】ＦＡＣＳにより分析された、全長ＨＡおよびＨＡステムドメインポリペプチドへのモノクローナル抗体の結合。Ａ：染色後陽性の細胞の割合。Ｂ：平均蛍光強度。

【図8B】ＦＡＣＳにより分析された、全長ＨＡおよびＨＡステムドメインポリペプチドへのモノクローナル抗体の結合。Ａ：染色後陽性の細胞の割合。Ｂ：平均蛍光強度。

【図9A】ＦＡＣＳにより分析された、全長ＨＡおよびＨＡステムドメインポリペプチドへのモノクローナル抗体の結合。Ａ：染色後陽性の細胞の割合。Ｂ：平均蛍光強度。

【図9B】ＦＡＣＳにより分析された、全長ＨＡおよびＨＡステムドメインポリペプチドへのモノクローナル抗体の結合。Ａ：染色後陽性の細胞の割合。Ｂ：平均蛍光強度。

【図10A】細胞表面上でのＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８ベース構築物の発現。

【図10B】細胞表面上でのＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８ベース構築物の発現。

【図11A】本発明のいくつかのポリペプチドの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ−Ｄ）およびウエスタンブロット（Ｅ−Ｆ）分析。ウエスタンブロットについては、ｈｉｓタグに対して指向される抗体を検出に使用した。

【図11B】本発明のいくつかのポリペプチドの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ−Ｄ）およびウエスタンブロット（Ｅ−Ｆ）分析。ウエスタンブロットについては、ｈｉｓタグに対して指向される抗体を検出に使用した。

【図11C】本発明のいくつかのポリペプチドの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ−Ｄ）およびウエスタンブロット（Ｅ−Ｆ）分析。ウエスタンブロットについては、ｈｉｓタグに対して指向される抗体を検出に使用した。

【図11D】本発明のいくつかのポリペプチドの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ−Ｄ）およびウエスタンブロット（Ｅ−Ｆ）分析。ウエスタンブロットについては、ｈｉｓタグに対して指向される抗体を検出に使用した。

【図11E】本発明のいくつかのポリペプチドの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ−Ｄ）およびウエスタンブロット（Ｅ−Ｆ）分析。ウエスタンブロットについては、ｈｉｓタグに対して指向される抗体を検出に使用した。

【図11F】本発明のいくつかのポリペプチドの精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ−Ｄ）およびウエスタンブロット（Ｅ−Ｆ）分析。ウエスタンブロットについては、ｈｉｓタグに対して指向される抗体を検出に使用した。

【図12A】Ｅｌｉｓａにより検出された、本発明のいくつかのポリペプチドへのモノクローナル抗体ＣＲ９１１４（Ａ）、ＣＲ８０２０（Ｂ）およびポリクローナル抗Ｈ１ＨＡ血清（Ｃ）の結合。

【図12B】Ｅｌｉｓａにより検出された、本発明のいくつかのポリペプチドへのモノクローナル抗体ＣＲ９１１４（Ａ）、ＣＲ８０２０（Ｂ）およびポリクローナル抗Ｈ１ＨＡ血清（Ｃ）の結合。

【図12C】Ｅｌｉｓａにより検出された、本発明のいくつかのポリペプチドへのモノクローナル抗体ＣＲ９１１４（Ａ）、ＣＲ８０２０（Ｂ）およびポリクローナル抗Ｈ１ＨＡ血清（Ｃ）の結合。

【図13A】本発明のポリペプチドのグリコシル化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびウエスタンブロット（Ｂ）分析。脱グリコシル化時、拡散バンドが予測分子量において集まる。ウエスタンブロットについては、Ｈ１ＨＡに対して指向されるポリクローナル血清を検出に使用した。

【図13B】本発明のポリペプチドのグリコシル化のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびウエスタンブロット（Ｂ）分析。脱グリコシル化時、拡散バンドが予測分子量において集まる。ウエスタンブロットについては、Ｈ１ＨＡに対して指向されるポリクローナル血清を検出に使用した。

【図14】本発明のポリペプチドのＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析。トレースを配列番号により標識する。

【図15】Ａ：配列番号１４５を発現する細胞の上清のウエスタンブロット分析。ウエスタンブロットについては、ｈｉｓタグに対して指向される抗体を検出に使用した。Ｂ：Ｅｌｉｓａにより検出された、配列番号１４５へのモノクローナル抗体ＣＲ９１１４（四角）、ＣＲ６２６１（丸）、ＣＲ８０２０（正三角）およびＦＩ６ｖ３（逆三角）の結合。

【図16】Ｈｉｓトラップカラム上での培養物上清からの配列番号１４５の精製の溶出プロファイル。本発明のポリペプチドは、１００ｍＭ（ピークＡ）および２００ｍＭ（ピークＢ）のイミダゾールにおいてそれぞれ溶出する。

【図17】Ａ−Ｂ：サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００）による配列番号１４５の精製の溶出プロファイル。ピークＡおよびＢの両方は、本発明のポリペプチドを含有する。Ｃ：サイズ排除クロマトグラフィーからのフラクションのネイティブＰＡＧＥ分析。大多数の精製タンパク質は、タンパク質の単量体形態と一致する分子量においてランする。Ｄ：サイズ排除クロマトグラフィーからのフラクションのＳＤＳＰＡＧＥ分析。

【図18】本出願に記載のＤＮＡ免疫化スケジュールの結果としての同種全長タンパク質のエクトドメインに対するＩｇＧ応答の経時変化。

【図19A】同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ａ）および異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｂ）からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｂ）からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図19B】同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ａ）および異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｂ）からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｂ）からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図20A】同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ａ）、異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｂ）異種亜型株Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｃ）および異種亜型株Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（Ｄ）からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図20B】同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ａ）、異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｂ）異種亜型株Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｃ）および異種亜型株Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（Ｄ）からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図20C】同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ａ）、異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｂ）異種亜型株Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｃ）および異種亜型株Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（Ｄ）からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図20D】同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ａ）、異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｂ）異種亜型株Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｃ）および異種亜型株Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（Ｄ）からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図21】Ｈ３ＨＡをベースとするステムドメインポリペプチドのＦＡＣＳアッセイ。平均蛍光強度（Ａ）および％陽性細胞（Ｂ）を示す。

【図22A】同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（パネルＡ）、異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（パネルＢ）および異種亜型株Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（パネルＣ）からの全長ヘマグルチニンに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図22B】同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（パネルＡ）、異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（パネルＢ）および異種亜型株Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（パネルＣ）からの全長ヘマグルチニンに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図22C】同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（パネルＡ）、異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（パネルＢ）および異種亜型株Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（パネルＣ）からの全長ヘマグルチニンに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図23】全長ＨＡおよび本発明の対応するポリペプチドへのｍＡｂのＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０２０およびＣＲ９０２０、ならびにポリクローナル抗Ｈ１血清の結合のＦＡＣＳ分析。上図：平均蛍光強度。下図：陽性細胞の割合。黒色のバーは、全長タンパク質を表し、縞模様のバーは、本発明のポリペプチドを表す。全長ＨＡおよびその配列に由来する本発明の対応するポリペプチドは、同一のバックグラウンドの色を有する。

【図24A】実施例２１に記載のインフルエンザチャレンジ実験についてのカプラン・マイヤー生存曲線（Ａ）、体重変化（Ｂ）および臨床スコア中央値（Ｃ）。

【図24B】実施例２１に記載のインフルエンザチャレンジ実験についてのカプラン・マイヤー生存曲線（Ａ）、体重変化（Ｂ）および臨床スコア中央値（Ｃ）。

【図24C】実施例２１に記載のインフルエンザチャレンジ実験についてのカプラン・マイヤー生存曲線（Ａ）、体重変化（Ｂ）および臨床スコア中央値（Ｃ）。

【図25】実施例２２により選択されたＨ１Ｎ１配列のアラインメント。

【図26】実施例２２により選択されたＨ１ＨＡをベースとするステムドメインポリペプチドのＦＡＣＳアッセイ。平均蛍光強度を示す。

【図27】バイオレイヤー干渉法により測定された、固定化モノクローナル抗体ＣＲ６２６１（Ａ）、ＣＲ９１１４（Ｂ）およびＣＲ８０２０（Ｃ）への三量体および単量体形態の全長Ｈ１ＨＡ（配列番号１４９）ならびにｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）の結合のカイネティクス。

【図28】固定化ＣＲ６２６１（Ａ）およびＣＲ９１１４（Ｂ）へのｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）の結合の定常状態力価測定に続くバイオレイヤー干渉法。

【図29】ＥＬＩＳＡにより測定された、４９日目におけるＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からのＨＡのエクトドメインに対するＩｇＧ応答。実験の詳細を実施例２４に記載する。白色記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図30A】実施例２４に記載のインフルエンザチャレンジ実験についてのカプラン・マイヤー生存曲線（Ａ）、体重変化（Ｂ）および臨床スコア中央値（Ｃ）。

【図30B】実施例２４に記載のインフルエンザチャレンジ実験についてのカプラン・マイヤー生存曲線（Ａ）、体重変化（Ｂ）および臨床スコア中央値（Ｃ）。

【図30C】実施例２４に記載のインフルエンザチャレンジ実験についてのカプラン・マイヤー生存曲線（Ａ）、体重変化（Ｂ）および臨床スコア中央値（Ｃ）。

【図31】実施例２５により選択されたＨ１ＨＡをベースとするステムドメインポリペプチドのＦＡＣＳアッセイ。平均蛍光強度を示す。

【図32A】Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ａ）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（Ｂ）およびＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｃ）からのＨＡにより測定された、ＨＡのエクトドメインに対する４９日後のＩｇＧ応答。実験の詳細を実施例２６に記載する。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図32B】Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ａ）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（Ｂ）およびＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｃ）からのＨＡにより測定された、ＨＡのエクトドメインに対する４９日後のＩｇＧ応答。実験の詳細を実施例２６に記載する。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図32C】Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ａ）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（Ｂ）およびＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｃ）からのＨＡにより測定された、ＨＡのエクトドメインに対する４９日後のＩｇＧ応答。実験の詳細を実施例２６に記載する。白丸記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図33】ＥＬＩＳＡにより測定された、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からのＨＡのエクトドメインに対する４９日後のＩｇＧ応答。実験の詳細を実施例２７に記載する。白色記号は、アッセイの検出限界未満の値に対応する。

【図34】実施例２８により選択されたＨ１ＨＡをベースとするステムドメインポリペプチドのＦＡＣＳアッセイ。平均蛍光強度を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

定義
本発明において使用される用語の定義を以下に挙げる。

【0031】

本発明によるアミノ酸は、２０の天然（または「標準」アミノ酸）またはそのバリアント、例えば、Ｄ−プロリン（プロリンのＤ−エナンチオマー）など、またはタンパク質に天然に見出されない任意のバリアント、例えば、ノルロイシンなどのいずれかであり得る。標準アミノ酸は、それらの特性に基づきいくつかのグループに分割することができる。重要な因子は、電荷、親水性または疎水性、サイズおよび官能基である。これらの特性は、タンパク質構造およびタンパク質−タンパク質相互作用にとって重要である。一部のアミノ酸は、特別な特性を有し、例えば、システインは、他のシステイン残基への共有ジスルフィド結合（またはジスルフィド架橋）を形成し得、プロリンは、ポリペプチド骨格への周期性を形成し、グリシンは、他のアミノ酸よりもフレキシブルである。表５は、標準アミノ酸の略語および特性を示す。

【0032】

用語「アミノ酸配列同一性」は、通常、割合として表現される一対のアラインされたアミノ酸配列間の同一性または類似性の程度を指す。同一性パーセントは、同一（すなわち、アラインメント中の所与の位置におけるアミノ酸残基は、同一残基である）または類似（すなわち、アラインメント中の所与の位置におけるアミノ酸置換は、以下に論じる保存的置換である）の候補配列中のアミノ酸残基と、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列相同性を達成した後のペプチド中の対応するアミノ酸残基との割合である。配列相同性、例として配列同一性および類似性の割合は、当分野において周知の配列アラインメント技術を使用して、例えば、目視調査および数学的計算により決定され、またはより好ましくは、比較は、コンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することにより行われる。例示的な好ましいコンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４））である。

【0033】

「保存的置換」は、あるクラスのアミノ酸の同一クラスの別のアミノ酸による置換を指す。特定の実施形態において、保存的置換は、本発明のポリペプチドの構造もしくは機能、またはその両方を変化させない。保存的置換の目的のためのアミノ酸のクラスには、疎水性（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ）、中性親水性（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、酸性（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、立体構造破壊物質（例えば、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）および芳香族（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ）が含まれる。

【0034】

本明細書において使用される用語「疾患」および「障害」は、対象における病態を指すために互換的に使用される。一部の実施形態において、病態は、ウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染である。具体的な実施形態において、用語「疾患」は、細胞もしくは対象におけるウイルスの存在から生じ、またはウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲による病理的状態を指す。ある実施形態において、病態は、免疫原性組成物の投与を介して対象において免疫応答を誘導することにより重症度が減少される対象における疾患である。

【0035】

治療物を対象に投与する文脈における本明細書において使用される用語「有効量」は、予防および／または治療効果を有する治療物の量を指す。ある実施形態において、治療物を対象に投与する文脈における「有効量」は、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の重症度の低減もしくは改善、例えば、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の持続時間の低減、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の進行の予防、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の発現もしくは発症もしくは再発の予防、ある対象から別の対象へのインフルエンザウイルスの拡散の予防もしくは低減、対象の入院および／もしくは入院期間の低減、インフルエンザウイルス感染もしくはそれに伴う疾患を有する対象の生存率の増加、インフルエンザウイルス感染もしくはそれに伴う疾患の排除、インフルエンザウイルス複製の阻害もしくは低減、インフルエンザウイルス力価の低減；および／または別の治療物の予防もしくは治療効果の向上および／もしくは改善を達成するために十分な治療物の量を指す。ある実施形態において、有効量は、インフルエンザウイルス疾患からの完全な保護をもたらさないが、未治療対象と比較してより低い力価または低減数のインフルエンザウイルスをもたらす。インフルエンザウイルスの力価、数または総負荷の低減の利益には、限定されるものではないが、より軽度の感染症状、より少ない感染症状および感染に伴う疾患の期間の低減が含まれる。

【0036】

本明細書において使用される用語「宿主」は、ベクター、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターが導入された生物または細胞を指すものとする。生物または細胞は、原核または真核であり得る。好ましくは、宿主は、単離宿主細胞、例えば、培養物中の宿主細胞を含む。用語「宿主細胞」は、細胞が本発明のポリペプチドの（過剰）発現のために改変されていることを単に意味するにすぎない。宿主という用語は、特定の対象生物または細胞を指すだけでなく、そのような生物または細胞の子孫も同様に指すものとすることを理解すべきである。ある改変が突然変異または環境的影響のいずれかに起因して後続世代において生じ得るため、そのような子孫は、事実上、親生物または細胞と同一であり得ないが、依然として本明細書において使用される用語「宿主」の範囲内に含まれる。

【0037】

本明細書において使用される用語「含まれる」または「例として」の後には、語「限定されるものではないが」が続くものとみなされる。

【0038】

本明細書において使用される用語「感染」は、細胞または対象におけるウイルスの繁殖および／または存在による侵襲を意味する。一実施形態において、感染は、「活性」感染、すなわち、ウイルスが細胞または対象において複製しているものである。このような感染は、ウイルスにより最初に感染された細胞、組織、および／または器官から他の細胞、組織、および／または器官へのウイルスの拡散を特徴とする。感染は、潜伏感染、すなわち、ウイルスが複製していないものでもあり得る。ある実施形態において、感染は、細胞もしくは対象中のウイルスの存在から生じ、またはウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲による病理学的状態を指す。

【0039】

インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス型：Ａ、ＢおよびＣ属に分類される。本明細書において使用される用語「インフルエンザウイルス亜型」は、ヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質の組合せを特徴とするインフルエンザＡウイルスバリアントを指す。本発明によれば、インフルエンザウイルス亜型は、それらのＨ番号、例えば、「Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」、「Ｈ３亜型のインフルエンザウイルス」または「Ｈ３インフルエンザ」など、またはＨ番号およびＮ番号の組合せ、例えば、「インフルエンザウイルス亜型Ｈ３Ｎ２」もしくは「Ｈ３Ｎ２」などにより称することができる。用語「亜型」には、具体的には、通常、突然変異から生し、異なる病原プロファイルを示すそれぞれの亜型内の全ての個々の「株」、例として、天然分離株および人工突然変異体またはリアソータントなどが含まれる。このような株は、ウイルス亜型の種々の「分離株」と称することもできる。したがって、本明細書において使用される用語「株」および「分離株」は、互換的に使用することができる。ヒトインフルエンザウイルス株または分離株についての現在の命名法には、ウイルスの型（属）、すなわち、Ａ、ＢまたはＣ、最初の分離の地理的場所、株番号および分離年度に通常括弧内に挙げられるＨＡおよびＮＡの抗原の記載が含まれ、例えば、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／００（Ｈ３Ｎ２）である。非ヒト株には、命名法において起源の宿主も含まれる。インフルエンザＡウイルス亜型は、それらの系統発生グループを参照することによりさらに分類することができる。系統分析は、ヘマグルチニンの２つの主要グループへの下位分類を実証した：とりわけ系統発生グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜型（「グループ１」インフルエンザウイルス）およびとりわけ系統発生グループ２におけるＨ３、Ｈ４、Ｈ７およびＨ１０亜型（「グループ２」インフルエンザウイルス」）。

【0040】

本明細書において使用される用語「インフルエンザウイルス疾患」は、細胞もしくは対象中のインフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡもしくはＢウイルスの存在またはインフルエンザウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲から生じる病理学的状態を指す。具体的な実施形態において、この用語は、インフルエンザウイルスにより引き起こされる呼吸器疾病を指す。

【0041】

本明細書において使用される用語「核酸」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログが含まれるものとする。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、化学的もしくは生化学的に改変することができ、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得、それは当業者により容易に認識される。このような改変には、例えば、標識、メチル化、アナログによる天然ヌクレオチドの１つ以上の置換、ヌクレオチド間改変、例えば、未荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、懸垂部分（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレート化剤、アルキル化剤、および改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が含まれる。核酸配列への言及は、特に記載のない限り、その相補物を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補的配列を有するその相補鎖を包含すると理解すべきである。相補鎖も、例えばアンチセンス療法、ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマーに有用である。

【0042】

ある実施形態において、本明細書において使用されるＨＡ中のアミノ酸の番号付与は、野生型インフルエンザウイルスのＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付与に基づく。したがって、本発明において使用される語「ＨＡ中の「ｘ」位におけるアミノ酸」は、特定の野生型インフルエンザウイルス、例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１；ＨＡ２ドメインのアミノ酸をイタリックで示した）のＨＡ０中のｘ位におけるアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。他のインフルエンザウイルス株および／または亜型中の相当アミノ酸を多重配列アラインメントにより決定することができることが当業者により理解される（例えば、表８参照）。本出願全体にわたり使用される番号付与系において、１は、未成熟ＨＡ０タンパク質（配列番号１）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意されたい。成熟配列は、例えば、配列番号１の１８位上で開始する。ある実施形態において、相当アミノ酸の番号付与は、Ｈ３ＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、特にＨ３Ｎ２インフルエンザ株Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）のアミノ酸の番号付与に基づく。他のＨ３ＨＡ配列中の相当アミノ酸は、アラインメントにより決定することができる。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（例えば、配列番号８９のアミノ酸１〜１７に対応）は一般に、例えば、ワクチンにおいて使用される最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。したがって、ある実施形態において、本発明によるポリペプチドは、リーダー配列を有さないアミノ酸配列を含み、すなわち、アミノ酸配列は、シグナル配列を有さないＨＡ０のアミノ酸配列をベースとする。

【0043】

「ポリペプチド」は、当業者により公知のアミド結合により結合しているアミノ酸の重合体を指す。本明細書において使用されるこの用語は、共有アミド結合により結合している単一ポリペプチド鎖を指し得る。この用語は、非共有相互作用、例えば、イオン接触、水素結合、ファン・デル・ワールス接触および疎水性接触により会合している複数のポリペプチド鎖も指し得る。当業者は、この用語には、例えば、翻訳後プロセシング、例えば、シグナルペプチド開裂、ジスルフィド結合形成、グリコシル化（例えば、Ｎ結合グリコシル化）、プロテアーゼ開裂および脂質改変（例えば、Ｓ−パルミトイル化）により改変されたポリペプチドが含まれることを認識する。

【0044】

「ステムドメインポリペプチド」は、天然（または野生型）ヘマグルチニン（ＨＡ）のステムドメインを構成する１つ以上のポリペプチド鎖を含むポリペプチドを指す。典型的には、ステムドメインポリペプチドは、単一ポリペプチド鎖（すなわち、ヘマグルチニンＨＡ０ポリペプチドのステムドメインに対応）または２つのポリペプチド鎖（すなわち、ヘマグルチニンＨＡ２ポリペプチドと会合しているヘマグルチニンＨＡ１ポリペプチドのステムドメインに対応）である。本発明によれば、ステムドメインポリペプチドは、野生型ＨＡ分子と比較して１つ以上の突然変異を含み、特に野生型ＨＡの１つ以上のアミノ酸残基が特定の野生型ＨＡ中の対応位置上で天然に生じない他のアミノ酸により置換されていてよい。本発明によるステムドメインポリペプチドは、下記の１つ以上の結合配列をさらに含み得る。

【0045】

用語「ベクター」は、複製され、一部の場合に発現される、宿主中への導入のために第２の核酸分子を挿入することができる核酸分子を示す。換言すると、ベクターは、それが結合した核酸分子を輸送し得る。クローニングおよび発現ベクターは、本明細書において使用される用語「ベクター」により企図される。ベクターには、限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）ならびにバクテリオファージまたは植物または動物（例として、ヒト）ウイルスに由来するベクターが含まれる。ベクターは、提示される宿主により認識される複製起源および発現ベクターの場合、宿主により認識されるプロモーターおよび他の調節領域を含む。あるベクターは、それらが導入された宿主中で自律複製し得る（例えば、細菌の複製起源を有するベクターは、細菌中で複製し得る）。他のベクターは宿主中への導入時に宿主のゲノム中に組み込むことができ、それによりベクターは宿主ゲノムに沿って複製される。本明細書において使用される、ウイルスの文脈における用語「野生型」は、高頻度であり、天然に循環し、典型的な疾患の蔓延を発生させているインフルエンザウイルスを指す。

【0046】

詳細な説明
インフルエンザウイルスは、世界規模の公衆衛生に対して顕著な影響を及ぼし、毎年数百万の重病の症例、数千人の死亡、およびかなりの経済的損失を引き起こす。現在の三価インフルエンザワクチンは、ワクチン株および密接に関連する分離株に対する強力な中和抗体応答を誘発するが、ある亜型内のより分岐した株または他の亜型に及ぶことはほとんどない。さらに、適切なワクチン株の選択は多くの困難を提示し、準最適保護を頻繁にもたらす。さらに、次の流行性ウイルスの亜型の予測は、それがいつどこで生じるかを含め、現在では不可能である。

【0047】

ヘマグルチニン（ＨＡ）は、中和抗体の主要な標的であるインフルエンザＡウイルスからの主要なエンベロープ糖タンパク質である。ヘマグルチニンは、流入プロセスの間の２つの主要な機能を有する。第１に、ヘマグルチニンは、シアル酸受容体との相互作用を介して標的細胞の表面へのウイルスの付着を媒介する。第２に、ウイルスのエンドサイトーシス後、ヘマグルチニンは、続いてウイルスおよびエンドソーム膜の融合を生んでそのゲノムを標的細胞の細胞質中に放出させる。ＨＡは、宿主由来酵素により開裂されてジスルフィド結合により結合したままの２つのポリペプチドを生成する約５００アミノ酸の大型エクトドメインを含む。大多数のＮ末端断片（ＨＡ１、３２０〜３３０アミノ酸）は、受容体結合部位およびウイルス中和抗体により認識されるほとんどの抗原決定基を含有する膜遠位球状ドメインを形成する。より小型のＣ末端部分（ＨＡ２、約１８０アミノ酸）は、球状ドメインを細胞またはウイルス膜にアンカリングするステム様構造を形成する。亜型間の配列相同性の程度は、ＨＡ１ポリペプチド（３４％〜５９％の亜型間相同性）がＨＡ２ポリペプチド（５１〜８０％の相同性）よりも小さい。ほとんどの保存領域は、開裂部位周囲の配列、特にＨＡ２Ｎ末端２３アミノ酸であり、それは全てのインフルエンザＡウイルス亜型で保存される（Ｌｏｒｉｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。この領域の一部は、ＨＡ前駆体分子（ＨＡ０）中で表面ループとして曝露されるが、ＨＡ０がＨＡ１およびＨＡ２に開裂された場合に接近不可能になる。

【0048】

ほとんどの中和抗体は、受容体結合部位を包囲するループに結合し、受容体結合および付着を妨げる。これらのループは高度に変異性であるため、それらの領域を標的化するほとんどの抗体は、株特異的であり、なぜ現在のワクチンがそのような限定された株特異的免疫を誘発するかを説明する。しかしながら、近年、広域交差中和効力を有するインフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する完全ヒトモノクローナル抗体が生成された。機能および構造分析は、それらの抗体が膜融合プロセスを妨げ、インフルエンザＨＡタンパク質のステムドメイン中の高度に保存されたエピトープに対して指向されることを明らかにした（Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２００９、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット、国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレット）。

【0049】

本発明によれば、広範のインフルエンザ株に対する保護を誘導するユニバーサルなエピトープベースのワクチンを作出するためにそれらのエピトープを含有する新規ＨＡステムドメインポリペプチドを設計した。本質的には、高度に変異性で免疫優性の部分、すなわち、頭部ドメインを最初に全長ＨＡ分子から除去してｍｉｎｉ−ＨＡとも称されるステムドメインポリペプチドを作出する。このように、免疫応答は、広域中和抗体についてのエピトープが局在するステムドメインに対して再指向される。上記の広域中和抗体を使用して新たに作出された分子の正確なフォールディングを調べ、中和エピトープの存在を確認した。

【0050】

本発明のステムドメインポリペプチドは、膜近位ステムドメインＨＡ分子の保存エピトープを、膜遠位頭部ドメイン中に存在する優性エピトープの不存在下で免疫系に提示し得る。この目的のため、頭部ドメインを構成するＨＡ０タンパク質の一次配列の一部を除去し、直接的に、または一部の実施形態において、短いフレキシブル結合配列（「リンカー」）を導入することにより再連結させてポリペプチド鎖の連続性を回復させる。得られたポリペプチド配列を、ＨＡ０分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する規定の突然変異を導入することによりさらに改変する。

【0051】

したがって、本発明は、（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメイン、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むポリペプチドであって、ＨＡ２ドメイン中の１つ以上のアミノ酸が突然変異しているポリペプチドを提供する。したがって、本発明のポリペプチドにおいて、ＨＡ２ドメインは、ＨＡステムドメインポリペプチドがベースとする野生型インフルエンザヘマグルチニンのＨＡ２ドメインと比較して１つ以上の突然変異を含む。

【0052】

インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、一般に、ヒトインフルエンザウイルスワクチンにおいて使用されるインフルエンザＡウイルス亜型のＨＡをベースとする。好ましい実施形態において、ステムドメインポリペプチドは、Ｈ１、Ｈ５および／またはＨ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスのＨＡをベースとする。

【0053】

本発明は、特に、（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメイン、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、ＨＡ１およびＨＡ２間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性であり、ＨＡ２のＡへリックスおよびへリックスＣＤを連結するアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が野生型インフルエンザＨＡ２ドメインと比較して突然変異しているヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する。好ましくは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、Ｈ１、Ｈ５およびＨ３からなる群から選択されるインフルエンザＡウイルス亜型に由来する。

【0054】

したがって、本発明のポリペプチドは、図１に示されるへリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の突然変異を含む。ある実施形態において、前記ＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸、例えば、極性および／もしくは荷電アミノ酸、またはフレキシブルアミノ酸グリシン（Ｇ）により置換されている。

【0055】

本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１を含まない。

【0056】

ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、ＨＡ０よりも実質的に小型であり、好ましくは、全てまたは実質的に全てのＨＡの球状頭部を欠く。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、３６０アミノ酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３００、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約２６０から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０、好ましくは、約２７０から約３３０アミノ酸長である。

【0057】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインが由来するＨＡのアミノ酸配列と比較してＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の追加の突然変異をさらに含む。したがって、ステムポリペプチドの安定性はさらに増加される。

【0058】

本発明によれば、「ＨＡ１Ｎ末端セグメント」は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）分子のＨＡ１ドメインのアミノ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ポリペプチドセグメントは、ＨＡ１ドメインの１位からｘ位のアミノ酸を含み、ｘ位上のアミノ酸は、ＨＡ１内のアミノ酸残基である。用語「ＨＡ１Ｃ末端セグメント」は、インフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインのカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ポリペプチドセグメントは、ＨＡ１ドメインのｙ位からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸を含み、ｙ位上のアミノ酸は、ＨＡ１内のアミノ酸残基である。本発明によれば、ｙは、ｘよりも大きく、したがって、ＨＡ１Ｎ末端セグメントおよびＨＡ１Ｃ末端セグメント間、すなわち、ＨＡ１のｘ位上のアミノ酸およびｙ位上のアミノ酸間のＨＡ１ドメインのセグメントが欠失しており、一部の実施形態において、結合配列により置き換えられている。

【0059】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜ｘを含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜末端を含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１セグメントの欠失は、ｘ＋１位におけるアミノ酸からｙ−１位におけるアミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸配列を含む。

【0060】

ある実施形態において、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ〜ｘを含み、ｐは、成熟ＨＡ分子の最初のアミノ酸である（例えば、配列番号１の場合、ｐ＝１８）。当業者は、シグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１７）を有さない本明細書に記載のポリペプチドを調製することができる。ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含まない。ある実施形態において、細胞内および膜貫通配列、例えば、ＨＡ２ドメインの５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはその相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列は、除去されている。

【0061】

本発明によれば、ヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性である。ＨＡ１およびＨＡ２に及ぶＡｒｇ（Ｒ）〜Ｇｌｙ（Ｇ）配列は、トリプシンおよびトリプシン様プロテアーゼについての認識部位であり、典型的には、ヘマグルチニン活性化のために開裂されることが当業者に公知である。本明細書に記載のＨＡステムドメインポリペプチドは活性化すべきでないため、本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドはプロテアーゼ開裂に耐性である。したがって、本発明によれば、プロテアーゼ開裂部位が除去され、またはＨＡ１およびＨＡ２に及ぶプロテアーゼ部位がプロテアーゼ開裂に耐性である配列に突然変異される。

【0062】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端アミノ酸は、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、グルタミン（Ｑ）である。

【0063】

ある実施形態において、ポリペプチドはグリコシル化されている。

【0064】

インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、ヒトインフルエンザワクチンにおいて使用される亜型の任意の天然インフルエンザＡヘマグルチニンウイルスのＨＡをベースとし得る。インフルエンザワクチンにおいて一般に使用されるインフルエンザＡウイルス亜型は、Ｈ１、Ｈ３またはＨ５亜型のインフルエンザＡウイルスである。「ベースとする」は、ＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメインのＮ末端セグメント、および／またはＣ末端セグメントが、当業者に公知のまたは後に発見されるＨ１、Ｈ３および／またはＨ５亜型の任意の天然インフルエンザヘマグルチニンのＨＡ１および／またはＨＡ２ドメインの対応するＮ末端および／またはＣ末端セグメントと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。ある実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、グループ１インフルエンザＡウイルスのインフルエンザヘマグルチニンをベースとする。ある実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、グループ２インフルエンザＡウイルスのインフルエンザヘマグルチニンをベースとする。一部の実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザ株または亜型からのセグメントおよび／またはドメインを含み、またはそれらからなるハイブリッドまたはキメラポリペプチドである。例えば、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、異なるインフルエンザＡウイルスＨＡ亜型からのＨＡ１Ｎ末端およびＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントおよび／またはＨＡ２ドメインを含み得る。

【0065】

ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ１ＨＡをベースとする。特定の実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス、例えば、下記のインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号１）からのＨＡからの、またはそれをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含む。Ｈ１亜型のＨＡを含む他のインフルエンザＡウイルスも本発明により使用することができることが当業者により理解される。ある実施形態において、ポリペプチドは、表７から選択されるインフルエンザＡＨ１ウイルスのＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含む。

【0066】

ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ１ＨＡドメインの１位からｘ位のアミノ酸を含むＨＡ１Ｎ末端ポリペプチドセグメントを含み、ｘは、４６位上のアミノ酸〜６０位上のアミノ酸の任意のアミノ酸、例えば、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９位上のアミノ酸であり、好ましくは、ｘは、５２、５３、５５または５９である。好ましくは、ポリペプチドは、シグナル配列を有さないＨＡ１Ｎ末端セグメント、すなわち、ＨＡ１ドメインの１８位（例えば、Ｈ１ＨＡについて、例えば、配列番号１）、または他のＨ１インフルエンザウイルス株中の相当位置からｘ位のアミノ酸を含むＨＡ１Ｎ末端セグメントを含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１ドメインのｐ位（配列番号１のＨ１ＨＡについてｐ＝１８、または他のＨ１ＨＡ上の相当位置）からｘ位のアミノ酸を含む。

【0067】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ポリペプチドセグメントは、Ｈ１ＨＡ１ドメインのｙ位からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸を含み、ｙは、Ｈ１ＨＡ１の２９０位上のアミノ酸〜３２５位上のアミノ酸の任意のアミノ酸であり、好ましくは、ｙは、２９１、３０３、３１８、または３２１である。本発明によれば、ＨＡ２ドメインは、へリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の突然変異を含む（図１）。ある実施形態において、前記ＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の疎水性アミノ酸は、親水性アミノ酸、例えば、極性および／または荷電アミノ酸により置換されている。ある実施形態（例えば、Ｈ１ＨＡについて、例えば、配列番号１）において、へリックスＡのＣ末端残基およびへリックスＣＤのＮ末端残基を連結するＨＡ２アミノ酸配列は、インフルエンザＨＡ２の残基４０２〜４１８のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、へリックスＡのＣ末端残基およびへリックスＣＤのＮ末端残基を連結するＨＡ２アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）（配列番号１７）を含む。

【0068】

ある実施形態において、ｘは、５９であり、ｙは、２９１である。

【0069】

ある実施形態において、ｘは、５２であり、ｙは、３２１である。

【0070】

ある実施形態において、ｘは、５３であり、ｙは、３０３である。

【0071】

ある実施形態において、ｘは、５５であり、ｙは、３１８である。

【0072】

一実施形態において、へリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列は、配列番号１のＨＡ２の４０２位上のアミノ酸〜４１８位上のアミノ酸のアミノ酸配列に対応し、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸４０２から４１８に及ぶアミノ酸配列中の１つ以上の突然変異を含む。血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡの残基４０２〜４１８のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）（配列番号１７）を含む。ある実施形態において、血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡの残基４０２〜４１８のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＭＮＴＱＸ_１ＴＡＸ_２ＧＫＥＸ_３Ｎ（Ｈ／Ｋ）Ｘ_４Ｅ（Ｋ／Ｒ）を含む。

【0073】

したがって、ある実施形態において、ポリペプチドは、表６に示されるＨ１ＨＡ２ドメイン中の突然変異の１つ以上を含む。ある実施形態において、４０６、４０９、４１３および４１６位上のアミノ酸の１つ以上、すなわち、アミノ酸Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３およびＸ_４の１つ以上は、突然変異している（番号付与は、配列番号１を指す）。ある実施形態において、４０６位上のアミノ酸、すなわち、Ｘ_１は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、およびＧからなる群から選択されるアミノ酸に変化しており、好ましくは、Ｓである。ある実施形態において、４０９位上のアミノ酸、すなわち、Ｘ_２は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、およびＧからなる群から選択されるアミノ酸に変化しており、好ましくは、Ｔ、ＱまたはＧである。ある実施形態において、４１３位上のアミノ酸、すなわち、Ｘ_３は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｇからなる群から選択されるアミノ酸に変化しており、好ましくは、Ｓである。ある実施形態において、４１６位上のアミノ酸、すなわち、Ｘ_４は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｇからなる群から選択されるアミノ酸に変化しており、好ましくは、Ｓである。これらの突然変異の組合せも可能である。

【0074】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５９を含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基２９１〜３４３を含み、３４３位上のアミノ酸、すなわち、Ｒ３４３は、突然変異しており、Ｒ以外のアミノ酸であり、好ましくは、グルタミン（Ｑ）である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５９からなり、ＨＡ１Ｃ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基２９１〜３４３からなる。アミノ酸の番号付与は、Ｈ１ＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、特にＨ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付与に基づくことに留意される。異なるインフルエンザ亜型／株のＨＡ配列は互いと比較して頭部領域中の挿入または欠失を有し得るため、番号付与は常に同一でないことに留意される。当業者は、異なるインフルエンザウイルス株および／または亜型のＨＡ配列中の相当アミノ酸位置を配列アラインメントにより決定することができる。

【0075】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ポリペプチドセグメントは、シグナル配列を含まない。好ましい実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１ドメインの１８位から５９位のアミノ酸を含む。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１ドメインのアミノ酸１８〜５９からなる。

【0076】

一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上のさらなる突然変異、すなわち、アミノ酸置換を含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１ドメインは、以下の突然変異：Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４ＴおよびＩ３１６Ｔの１つ以上をさらに含む。ここでも、アミノ酸の番号付与は、Ｈ１ＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、特に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付与に基づくことに留意される。当業者は、他のインフルエンザＨ１ウイルスのＨＡ中の相当アミノ酸を決定することができ、したがって、相当突然変異を決定することができる。

【0077】

具体的な実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、およびＩ３１６Ｔを含み、ＨＡ２ドメインは、以下の突然変異：Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、およびＬ４１６Ｓの１つ以上を含む。

【0078】

ある実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｋ３２１Ｃをさらに含み、および／またはＨＡ２ドメインは、以下の突然変異：Ｑ４０５Ｃ、Ｆ４１３Ｃ、Ｅ４２１Ｃ、およびＹ５０２Ｓの１つ以上をさらに含む。

【0079】

具体的な実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｔ、およびＫ３２１Ｃを含み、ＨＡ２ドメインは、突然変異：Ｑ４０５Ｃ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、およびＬ４１６Ｓを含む。

【0080】

具体的な実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、およびＩ３１６Ｔを含み、ＨＡ２ドメインは、突然変異：Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｆ４１３Ｃ、Ｌ４１６ＳおよびＥ４２１Ｃを含む。

【0081】

具体的な実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、およびＩ３１６Ｔを含み、ＨＡ２ドメインは、突然変異：Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ、およびＹ５０２Ｓを含む。

【0082】

具体的な実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｔ、およびＫ３２１Ｃを含み、ＨＡ２ドメインは、突然変異：Ｑ４０５Ｃ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｆ４１３Ｃ、Ｌ４１６ＳおよびＥ４２１Ｃを含む。

【0083】

具体的な実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｔ、およびＫ３２１Ｃを含み、ＨＡ２ドメインは、突然変異：Ｑ４０５Ｃ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｆ４１３Ｃ、Ｌ４１６Ｓ、Ｅ４２１ＣおよびＹ５０２Ｓを含む。

【0084】

他の実施形態において、ＨＡ２ドメインは、突然変異Ｍ４２０ＩおよびＶ４２１Ｉ、または相当突然変異の１つ以上をさらに含む。

【0085】

具体的な実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、およびＩ３１６Ｔを含み、ＨＡ２ドメインは、以下の突然変異：Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ、Ｍ４２０ＩおよびＶ４２１Ｉの１つ以上を含む。

【0086】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５２、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５２を含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３２１〜３４３を含み、３４３位上のアミノ酸、すなわち、Ｒ３４３は、突然変異しており、Ｒ以外のアミノ酸、好ましくは、グルタミン（Ｑ）であり、ＨＡ２ドメインは、突然変異Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ、Ｍ４２０ＩおよびＶ４２１Ｉを含む。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５２、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５２からなり、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３２１〜３４３からなる。

【0087】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５３、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５３を含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３０３〜３４３を含み、３４３位上のアミノ酸、すなわち、Ｒ３４３は、突然変異しており、Ｒ以外のアミノ酸、好ましくは、グルタミン（Ｑ）である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５３、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５３からなり、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３０３〜３４３からなる。具体的な実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｖ３１４ＴおよびＩ３１６Ｔを含み、ＨＡ２ドメインは、以下の突然変異：Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ、Ｍ４２０ＩおよびＶ４２１Ｉの１つ以上を含む。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

【0088】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５５、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５５を含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３１８〜３４３を含み、３４３位上のアミノ酸、すなわち、Ｒ３４３は、突然変異しており、Ｒ以外のアミノ酸であり、好ましくは、グルタミン（Ｑ）である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５５、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５５からなり、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３１８〜３４３からなる。一実施形態において、ＨＡ２ドメインは、突然変異Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ、Ｍ４２０ＩおよびＶ４２１Ｉを含む。

【0089】

ある実施形態において、ポリペプチドは、ＨＡ１ドメイン中の突然変異Ｒ３２４ＣおよびＨＡ２ドメイン中のＴ４３６Ｃをさらに含む。

【0090】

具体的な実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｔ、およびＲ３２４Ｃを含み、ＨＡ２ドメインは、以下の突然変異：Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ、Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２１ＩおよびＴ４３６Ｃの１つ以上を含む。

【0091】

一実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｒ３２４Ｃを含み、ＨＡ２ドメインは、突然変異Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ、Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２１ＩおよびＴ４３６Ｃを含む。

【0092】

別の実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６ＴおよびＲ３２４Ｃを含み、ＨＡ２ドメインは、以下の突然変異：Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ、Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２１ＩおよびＴ４３６Ｃの１つ以上を含む。

【0093】

一実施形態において、ＨＡ１ドメインは、突然変異Ｒ３２４Ｃを含み、ＨＡ２ドメインは、突然変異Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ、Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２１ＩおよびＴ４３６Ｃを含む。

【0094】

ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、細胞内および膜貫通配列、例えば、ＨＡ２ドメインの５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはそれらの相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列（配列番号１による番号付与）が除去されている。ある実施形態において、ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬ（配列番号１４３）（「ｆｏｌｄｏｎ」配列）を場合によりリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化される。リンカーは、当業者に周知のプロトコルに従って後で処理するための開裂部位を場合により含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、短いリンカー、例えば、ＥＧＲを介して連結されたタグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ）を付加することができる。一部の実施形態において、リンカーおよびｈｉｓタグ配列は、ｆｏｌｄｏｎ配列を存在させることなく付加される。

【0095】

ある実施形態において、ＨＡ２ドメインの５３０位（またはその相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列（配列番号１による番号付与）が除去されている。ある実施形態において、細胞内および膜貫通配列は、アミノ酸配列ＡＧＲＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８１）またはＳＧＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８２）により置き換えられている。

【0096】

ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する。一実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ８０５７に結合しない。一実施形態において、ＣＲ６２６１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；ＣＲ９１１４は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＲ８０５７は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0097】

上記のとおり、ポリペプチドは、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインを含む。結合配列は、天然ＨＡにおいても野生型ＨＡにおいても生じない。ある実施形態において、リンカーは、１つのアミノ酸残基、２つ以下のアミノ酸残基、３つ以下のアミノ酸残基、４つ以下のアミノ酸残基、５つ以下のアミノ酸残基、１０以下のアミノ酸残基、１５以下のアミノ酸残基、または２０以下のアミノ酸残基または３０以下のアミノ酸残基または４０以下のアミノ酸残基または５０以下のアミノ酸残基を含むペプチドである。具体的な実施形態において、結合配列は、Ｇ、ＧＳ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＡ、ＧＳＧＳ、ＧＳＡＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡＧＳ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧ、およびＧＳＧＳＧＳＧからなる群から選択される配列である。

【0098】

本発明は、本発明のポリペプチドを提供する方法、特に本発明によるＨ１ＨＡステムドメインポリペプチドを提供する方法、およびそれらの方法により得られるまたは得られたポリペプチドも提供する。ある実施形態において、本方法は：
（ａ）インフルエンザＨＡ０アミノ酸配列、特に、血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡ０アミノ酸配列を提供するステップ；
（ｂ）好ましくは、ＨＡ１のＣ末端アミノ酸をアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外のアミノ酸に突然変異させることにより、ＨＡ１およびＨＡ２間の開裂部位を除去するステップ；
（ｃ）球状頭部ドメインのアミノ酸配列をＨＡ０配列から除去するステップ（このステップは、ｘ位上のアミノ酸およびｙ位上のアミノ酸間のＨＡ１ドメインのセグメントを欠失させ、こうして得られたＨＡ１のＮ末端セグメント（ＨＡ１の１位上のアミノ酸からｘ位上のアミノ酸（そのアミノ酸を含む）に及ぶ）およびＣ末端セグメント（ＨＡ１のアミノ酸ｙからＣ末端アミノ酸に及ぶ）を場合により０〜５０アミノ酸の結合配列を介して再連結させることにより行う。ある実施形態において、ｘは、ＨＡ１の４６〜６０位の任意の位置上のアミノ酸、好ましくは、５２、５３、５５または５９位上のアミノ酸であり、ｙは、ＨＡ１の２９０〜３２５位の任意の位置上のアミノ酸、好ましくは、２９１、３０３、３１８、または３２１位上のアミノ酸である。ここでも、使用される番号付与は、配列番号１を指す。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１７に対応）は、一般に、例えば、ワクチンにおいて使用される最終ポリペプチド中には存在しないことが当業者により理解される。したがって、ある実施形態において、本発明によるポリペプチドは、リーダー配列を有さないＨＡ１Ｎ末端セグメントを含む）；
（ｄ）好ましくは、へリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列中、好ましくは、特に、ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）（配列番号１７）のアミノ酸配列を含む配列番号１のアミノ酸４０２〜４１８に及ぶアミノ酸配列中に１つ以上の突然変異を導入することにより、改変ＨＡの融合前立体構造の安定性を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるステップ（突然変異は、好ましくは、疎水性アミノ酸残基の親水性アミノ酸残基への置換を含む）；
（ｅ）ＨＡステムドメインポリペプチド中に１つ以上のジスルフィド架橋を導入するステップ
を含む。

【0099】

本発明によれば、ＨＡ１およびＨＡ２間の開裂部位の除去は、Ｐ１位におけるＲ（わずかな場合においてＫ）のＱへの突然変異により達成することができる（例えば、開裂部位（配列番号１中の３４３位）の命名法の説明については、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，２０１０参照。Ｑへの突然変異が好ましいが、Ｓ、Ｔ、Ｎ、ＤまたはＥも代替例である。

【0100】

頭部ドメインの除去は、例えば、配列番号１からのアミノ酸５３から３２０、または他のインフルエンザウイルスからのＨＡ中の相当位置におけるアミノ酸を欠失させることにより達成することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。配列の残留部分を直接的に結合させることができ、またはフレキシブルリンカーを導入することができる。リンカー配列は、１から５０アミノ酸長であり得る。限定された長さ（１０アミノ酸以下）のフレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡ、ＧＳＡＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧまたは類似物が好ましい。欠失の長さは、例えば、欠失を（ｘ）位（の相当物）において、例えば、５４、５５、５６、５７もしくは５８位において開始することにより、または欠失の長さを増加させるため、４７、４８、４９、５０、５１、もしくは５２位において切断することにより変えることもできる。同様に、欠失させるべき最後のアミノ酸は、（ｙ）位（の相当物）、例えば、３１５、３１６、３１７、３１８もしくは３１９位におけるもの、または欠失の長さを増加させるため、３２１、３２２、３２３、３２４、もしくは３２５位（の相当物）におけるものであり得る。欠失の長さの変化は、リンカー配列の長さを合致させることにより部分的に補うことができることを理解することは重要であり、すなわち、より大きい欠失はより長いリンカーと合致させることができ、逆もまた同様である。これらのポリペプチドも本発明により包含される。

【0101】

本発明によれば、ＡへリックスおよびＣＤへリックス間のループの溶解度が増加される。このループは、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の残基４０２から４１８（の相当物）により形成される。したがって、改変ＨＡの融合前立体構造の安定性が増加され、融合後立体構造が脱安定化される。このループは、以下の表６において確認することができるとおり、Ｈ１配列中で高度に保存される。これは、例えば、前記ループ中のアミノ酸Ｉ、Ｌ、ＦまたはＶを親水性相当物により置き換えることにより達成することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。グリシンへの突然変異は、融合後立体構造を脱安定化させる。それというのも、このアミノ酸の高いフレキシビリティがこのＨＡ配列の一部により形成され得る融合後へリックスの安定性の減少をもたらすためである。血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡの残基４０２〜４１８のループを記載するコンセンサス配列は、（配列番号１７）ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）である。本発明のポリペプチドにおいて、４０６、４０９、４１３位および／または４１６位におけるアミノ酸（または配列アラインメントから決定されたそれらの相当物）は、極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）またはフレキシブル（Ｇ）アミノ酸である。これらの部位における突然変異の組合せも可能であり、例えば、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓである。一部の場合、コンセンサスアミノ酸を回復させるための突然変異が好ましく、例えば、ＶもしくはＭが４０４位（Ｔへ）、Ｖが４０８位（Ａへ）もしくは４１０位（Ｇへ）またはＩが４１４位（Ｎへ）における場合であり；これらの特定のアミノ酸を有する配列の発生率は極めて低い。本発明のポリペプチドを特性決定する上記の突然変異の概要を表６に挙げる。

【0102】

本発明によれば、１つ以上のジスルフィド架橋がステムドメインポリペプチド中に、好ましくは、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７中の３２４および４３６位（またはそれらの相当物）のアミノ酸間に導入される。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。

【0103】

天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。本発明によれば、三量体コイルドコイルの形成のためのコンセンサス配列、例えば、ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥ（配列番号８３）を、本発明のポリペプチド中に４１８から４３３位（の相当物）において導入することができる。ある実施形態において、ＧＣＮ４に由来し、さらに三量体化することが公知の配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号８４）が、４１９〜４３３位（の相当物）において導入される。ある実施形態において、三量体界面は、Ｍ４２０、Ｌ４２３、Ｖ４２７、Ｇ４３０をイソロイシンに改変することにより安定化される。

【0104】

ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｈ１ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、細胞内および膜貫通配列、例えば、ＨＡ２ドメインの５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはそれらの相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列（配列番号１による番号付与）は、細胞中の発現後に可溶性ポリペプチドを産生させるために除去されている。ある実施形態において、ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬ（配列番号８０）を、場合によりリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化される。リンカーは、当業者に周知のプロトコルに従って後で処理するための開裂部位を場合により含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、短いリンカー、例えば、ＥＧＲを介して連結されたタグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ）を付加することができる。一部の実施形態において、リンカーおよびｈｉｓタグ配列は、ｆｏｌｄｏｎ配列を存在させることなく付加される。ある実施形態において、細胞内および膜貫通配列は、アミノ酸配列ＡＧＲＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号９７）またはＳＧＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８２）により置き換えられている。

【0105】

本出願人らは、一部がグループ１インフルエンザウイルスについて特異的（例えば、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットに記載のＣＲ６２６１）および一部がグループ２インフルエンザウイルスについて特異的（例えば、国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載のＣＲ８０２０）であったワクチン接種された個体からの一次ヒトＢ細胞から単離された広域中和抗体を既に同定している。これらのモノクローナル抗体の詳細なエピトープの分析により、それらの特異的抗体の交差反応性の欠落の理由が明らかになった。両方の場合、異なる位置上のグループ１またはグループ２ＨＡ分子中のグリカンの存在により、抗体がグループ特異的である事実が少なくとも部分的に説明された。以下に記載の多くのグループ１および２ＨＡ分子と交差反応するＣＲ９１１４様抗体の同定により、ヒト免疫系がインフルエンザウイルスに対する極めて広域の中和抗体を誘発することが可能であることが明らかになった。しかしながら、毎年のワクチン接種スキームの必要性を考慮すると、それらの抗体は、亜型Ｈ１および／またはＨ３の（季節性）インフルエンザウイルスによる感染後にもワクチン接種後にも明らかに誘発されず、または極めて低い程度に誘発されるにすぎない。したがって、ある実施形態において、本発明は、広域中和抗体を誘発するエピトープが免疫優性可変領域の不存在下で免疫系に提示されるように立体構造的に正確な様式のＨＡのステム領域を提示するポリペプチドを提供する。グリカンのパターンはＨ１ＨＡおよびＨ３ＨＡ間で異なることが公知であり、この差はよりグループ限定抗体応答をもたらし得ることが公知であるため、異なる実施形態において、本発明のポリペプチドは、グループ２ＨＡ分子（例えば、Ｈ３のＨＡ）をベースとする。以下の実施例３に示されるとおり、ＣＲ９１１４のインビトロ中和能は、Ｈ１亜型がＨ３亜型と比較して高い。したがって、ＣＲ９１１４のエピトープは、Ｈ１がＨ３ＨＡ分子と比較して接近可能であることが仮定され、それは多くのグループ２ＨＡ亜型に共通するＨＡ１中のＮ３８上のグリカンに起因し得る。この理論に拘束されるものではないが、本発明のポリペプチドがＨ１をベースとする場合、得られる抗体は、グループ２ＨＡ分子上のＮ３８上のグリカンにより障害を受ける可能性がより高く、したがって、グループ２インフルエンザウイルスに対していくぶん活性に欠けることを推定することができる。したがって、グループ１およびグループ２インフルエンザウイルスの両方に対して良好な活性で作用する広域中和抗体の誘発を可能とするため、ある実施形態において、本発明のステムドメインポリペプチドは、Ｈ３ＨＡ亜型をベースとする。

【0106】

ヒトは、Ｈ１またはＨ３亜型のＨＡを含む季節性インフルエンザウイルスにより頻繁に感染される。これらのインフルエンザウイルスへの曝露にもかかわらず、広域中和抗体は、天然状況では生じないことが多いことは明らかである。この理由の１つは、ＨＡ中の可変頭部領域の存在に加え、既に確認されたものと密接に関連する新たな亜型への曝露により何らかの形で応答が広域にならないことであり得る。したがって、個体をより未関連の亜型配列に曝露させることが好ましい場合がある。したがって、さらに別の実施形態において、本発明のステムドメインポリペプチドは、ＨＡ１中の３８位上のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ３８）を含有し、Ｈ３亜型でないグループ２亜型のＨＡをベースとする。

【0107】

ある実施形態において、ポリペプチドは、インフルエンザＡウイルス亜型をベースとする。ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ７ＨＡをベースとしない。

【0108】

上記のとおり、本発明のポリペプチドは、グループ１のインフルエンザワクチンウイルス亜型（例えば、Ｈ１およびＨ５など）からの親ＨＡ配列をベースとして設計されるだけでなく、グループ２からのインフルエンザ亜型、特にインフルエンザワクチンに使用されるグループ２のインフルエンザウイルス亜型、例えば、Ｈ３のＨＡ配列もベースとし得る。本発明によれば、ＣＲ８０２０およびＣＲ８０４３のエピトープを保存するポリペプチドを構築した。それというのも、これらの抗体は広範なグループ２株を中和し得るためである（国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレット）。これらのポリペプチドにおいて、ステム領域の底部におけるベータシートおよびその周辺を可能な限り保存すべきである。それというのも、これはＣＲ８０２０およびＣＲ８０４３がＨ３ＨＡに結合する領域であるためである。

【0109】

ある実施形態において、ＨＡドメインは、Ｈ３亜型のもの、好ましくは、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）、またはＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（配列番号１２１）のものである。Ｈ３亜型のＨＡを含む他のインフルエンザＡウイルスも本発明により使用することができることが当業者により理解される。

【0110】

ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ３ＨＡ１ドメインの１位からｘ位のアミノ酸、好ましくは、ＨＡ１ドメインのｐ位からｘ位のアミノ酸を含むＨＡ１Ｎ末端ポリペプチドセグメントを含み、またはそれからなり、ｘは、Ｈ３ＨＡ１の５６〜６９位の任意のアミノ酸であり、例えば、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７または６８位であり、好ましくは、ｘは、６１、６２、６３または６８である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ポリペプチドセグメントは、Ｈ３ＨＡ１ドメインのｙ位からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸を含み、ｙは、Ｈ３ＨＡ１の２９２〜３２５位（それを含む）の任意のアミノ酸であり、好ましくは、ｙは、２９３、３０６、３１８または３２３である。

【0111】

ある実施形態において、ＨＡドメインは、Ｈ３亜型のもの、好ましくは、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）、またはＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（配列番号１２１）のものである。

【0112】

本発明によれば、頭部ドメインは、ＨＡ１配列の大部分を欠失させ、ＮおよびＣ末端配列を短いリンカーを介して再連結させることにより除去されている。欠失は、長さを変えることができるが、結合配列を介する歪みの導入を回避するためにＨＡ１のＮ末端配列の最後の残基およびＣ末端配列の最初の残基は空間的に近接することが好ましい。Ｈ３配列において、欠失は、Ｓ６２〜Ｐ３２２、Ｓ６３〜Ｐ３０５およびＴ６４〜Ｔ３１７（の相当位置）において導入することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。配列の残留部分を直接的に結合させることができ、またはフレキシブルリンカーを導入することができる。リンカー配列は、１から５０アミノ酸長であり得る。限定された長さ（１０アミノ酸以下）のフレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡ、ＧＳＡＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧまたは類似物が好ましい。欠失の長さは、例えば、６３、６４、６５、６６、６７位（の相当物）において開始することにより欠失の残基数を減少させることにより、または欠失の長さを増加させるため、５７、５８、５９、６０もしくは６１位において切断することにより変えることもできる。同様に、欠失させるべき最後のアミノ酸は、３１７、３１８、３１９、３２０、もしくは３２１位（の相当物）におけるもの、または欠失の長さを増加させるため、３２３、３２４、３２５、３２６、もしくは３２７位（の相当物）におけるものであり得る。欠失の長さの変化は、リンカー配列の長さを合致させることにより部分的に補うことができることを理解することは重要であり、すなわち、より大きい欠失はより長いリンカーと合致させることができ、逆もまた同様である。これらのポリペプチドも本発明に含まれる。

【0113】

ある実施形態において、ｘは６１であり、ｙは３２３である。

【0114】

ある実施形態において、ｘは６２であり、ｙは３０６である。

【0115】

ある実施形態において、ｘは６３であり、ｙは３１８である。

【0116】

ある実施形態において、ｘは、６２、６３、６４、６５、６６位（の相当物）、または５６、５７、５８、５９もしくは６０位である。

【0117】

ある実施形態において、ｙは、３０６、３１８、３１９、３２０、３２１もしくは３２２位（の相当物）、または３２４、３２５、３２６、３２７、もしくは３２８位（の相当物）である。

【0118】

一実施形態において、へリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列は、配列番号８９のＨＡ２の４００位上のアミノ酸〜４２０位上のアミノ酸のアミノ酸配列、または他のＨ３ウイルス株中の相当位置上のアミノ酸残基に対応し、ポリペプチドは、へリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列、すなわち、配列番号８９のアミノ酸４００〜４２０、または他のＨ３インフルエンザウイルス株中の相当アミノ酸残基に及ぶアミノ酸配列中の１つ以上の突然変異を含む。

【0119】

ある実施形態において、血清型Ｈ３のインフルエンザＨＡのへリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む。

【0120】

本発明によれば、ポリペプチドは、へリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列中の１つ以上の突然変異を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、表８の１つ以上の突然変異、またはＨ３亜型の他のインフルエンザウイルス株中の相当突然変異を含む。

【0121】

本発明によれば、ＨＡ１およびＨＡ２間の開裂部位は除去されている。ある実施形態において、３４５位（番号付与は、配列番号８９を指す）における開裂部位の除去は、ＨＡ０からのＨＡ１およびＨＡ２の形成を防止するために突然変異（Ｒ３４５Ｑ）している。場合により、残基３４７〜３５１（ＩＦＧＡＩ、融合ペプチドの一部）をさらに欠失させて水性溶媒への疎水性残基の曝露を最小化することができる。開裂における陽性電荷はＨ３において１００％保存され、したがって、この突然変異は全ての配列中に適用することができる。

【0122】

頭部ドメインの欠失により、残基４００〜４２０のＢループが水性溶媒に目下曝露されたままとなる。Ｈ３ＨＡにおいて、このループは高度に保存される（例えば、表９）。コンセンサス配列は：４０１Ｉ（Ｅ／Ｇ）ＫＴＮＥＫＦＨＱＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧＲ４２１（配列番号１０４；番号付与は、配列番号８９を指す）である。融合前立体構造の本発明のポリペプチドのためにこのループの溶解度を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるため、一部の疎水性残基を極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電アミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）に改変しなければならず、またはＧへの突然変異によりフレキシビリティを増加させなければならない。具体的には、４０１、４０８、４１１、４１５、４１８位（番号付与は、配列番号８９を指す）における突然変異は、本発明のポリペプチドの安定性に寄与する。

【0123】

本発明のポリペプチドの融合前立体構造を安定化させるため、一次配列中で遠位であるがフォールドした融合前立体構造中で近い２つの部分間に共有結合が導入される。この目的のため、ジスルフィド架橋を本発明のポリペプチド中で、好ましくは、Ｈ３Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）中の３２６および４３８位（の相当物）間で遺伝子操作することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。代替的システイン架橋は、Ｈ３Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）中の３３４位から３９３位（の相当物）の間でそれらの残基のシステインへの突然変異により作出することができる。一部の場合、３２１位（の相当物）におけるシステインは、不所望なジスルフィド架橋の形成を回避するためにグリシンに改変される。

【0124】

ある実施形態において、ポリペプチドは、以下の突然変異：Ｆ４０８Ｓ、Ｉ４１１Ｔ、Ｆ４１５Ｓ、Ｖ４１８Ｇ、Ｉ４０１Ｒ、Ｋ３２６Ｃ、Ｓ４３８Ｃ、Ｔ３３４Ｃ、Ｉ３９３Ｃ、Ｃ３２１Ｇの１つ以上を含む。

【0125】

天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。三量体コイルドコイルの形成のためのコンセンサス配列ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫが、４２１〜４４１位（の相当物）において導入される。３２６〜４３８位のジスルフィド架橋の形成の妨害を回避するため、代替的なより短い配列ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩも４２１〜４３５位（の相当物）において使用した。代替例は、ＧＣＮ４に由来し、三量体化することが公知の配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮを４２１〜４４１位において、またはより短い配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫを４２１〜４３５位において導入することである。

【0126】

本発明のポリペプチドは、得られるポリペプチドが細胞中での発現時に細胞表面上に提示されるようにＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有し得る。他の実施形態において、５２２位（の相当物）からＣ末端の細胞質配列および膜貫通配列は、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中での発現後に産生されるように除去されている。場合により、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８または５２９（の相当物）から配列を欠失させることによりいくつかの追加の残基を可溶性タンパク質中に含めることができる。可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬ（配列番号１４３）（「ｆｏｌｄｏｎ」配列）を場合によりリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化させることができる。リンカーは、当業者に周知のプロトコルに従って後で処理するための開裂部位を場合により含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、短いリンカー、例えば、ＥＧＲを介して連結されたタグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ）を付加することができる。一部の実施形態において、リンカーおよびｈｉｓタグ配列は、ｆｏｌｄｏｎ配列を存在させることなく付加される。

【0127】

本発明によれば、ＨＡ２ドメインの５３０位（配列番号１による番号付与）からＣ末端アミノ酸のアミノ酸配列を除去し、以下の配列ＥＧＲＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８１）、またはＳＧＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８２）により置き換えることができる。

【0128】

ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、シグナル配列を含まない。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（例えば、配列番号８９のアミノ酸１〜１７に対応）は一般に、例えば、ワクチンにおいて使用される最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。したがって、ある実施形態において、本発明によるポリペプチドは、リーダー配列を有さないアミノ酸配列を含む。

【0129】

本発明によれば、ポリペプチドは、インフルエンザＢのＨＡ分子をベースとしない。インフルエンザＢ型ウイルス株は、厳密には、ヒトである。インフルエンザＢ型ウイルス株内のＨＡ中の抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものよりも小さい。２つの遺伝的および抗原的に区別されるインフルエンザＢウイルスの系統は、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａとも称される）およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）系統により表わされるとおり、ヒトにおいて循環している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。インフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患のスペクトルは一般にインフルエンザＡウイルスにより引き起こされるものよりも軽度であるが、インフルエンザＢ感染について入院を要する重病が依然として頻繁に観察される。

【0130】

本発明によれば、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の特異的エピトープを模倣し、例えば、単独で、または他の予防および／もしくは治療的治療との組合せでインビボで投与された場合、交差中和抗体を誘発するために免疫原性ポリペプチドとして使用することができるポリペプチドが提供される。「交差中和抗体」は、少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、４つ、もしくは５つの系統発生グループ１のインフルエンザＡウイルスの異なる亜型、および／または少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、４つ、もしくは５つの系統発生グループ２のインフルエンザＡウイルスの異なる亜型、および／または少なくとも２つのインフルエンザＢウイルスの異なる亜型、特に、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４により中和される少なくとも全てのウイルス株を中和し得る抗体を意味する。

【0131】

本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１を含まない。ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、ＨＡ０よりも実質的に小型であり、好ましくは、全てまたは実質的に全てのＨＡの球状頭部を欠く。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、３６０アミノ酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３００、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。一実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約２６０から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０、好ましくは、約２７０から約３３０アミノ酸長である。

【0132】

ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する。一実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ８０５７に結合しない。一実施形態において、ＣＲ６２６１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；ＣＲ９１１４は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＲ８０５７は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0133】

上記のとおり、ポリペプチドは、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインを含む。結合配列は、天然ＨＡにおいても野生型ＨＡにおいても生じない。ある実施形態において、リンカーは、１つのアミノ酸残基、２つ以下のアミノ酸残基、３つ以下のアミノ酸残基、４つ以下のアミノ酸残基、５つ以下のアミノ酸残基、１０以下のアミノ酸残基、１５以下のアミノ酸残基、または２０以下のアミノ酸残基または３０以下のアミノ酸残基または４０以下のアミノ酸残基または５０以下のアミノ酸残基を含むペプチドである。具体的な実施形態において、結合配列は、Ｇ、ＧＳ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＡ、ＧＳＧＳ、ＧＳＡＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡＧＳ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧ、およびＧＳＧＳＧＳＧからなる群から選択される配列である。

【0134】

本発明は、本発明のポリペプチドを提供する方法、特に本発明によるＨＡステムドメインポリペプチドのアミノ酸配列を提供する方法、およびそれらの方法により得られるまたは得られたポリペプチドも提供する。ある実施形態において、本方法は：
−インフルエンザＨＡ０アミノ酸配列、例えば、血清型Ｈ１、Ｈ５またはＨ３のインフルエンザＨＡ０配列を提供するステップ；
−好ましくは、ＨＡ１のＣ末端アミノ酸をアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外のアミノ酸に突然変異させることにより、ＨＡ１およびＨＡ２間の開裂部位を除去するステップ；
−球状頭部ドメインのアミノ酸配列をＨＡ０配列から除去するステップ（このステップは、ｘ位上のアミノ酸およびｙ位上のアミノ酸間のＨＡ１ドメインのセグメントを欠失させ、こうして得られたＨＡ１のＮ末端セグメント（ＨＡ１の１位上のアミノ酸からｘ位上のアミノ酸（そのアミノ酸を含む）に及ぶ）およびＣ末端セグメント（ＨＡ１のアミノ酸ｙからＣ末端アミノ酸に及ぶ）を場合により０〜５０アミノ酸の結合配列を介して再連結させることにより行う）；
−好ましくは、へリックスＡのＣ末端残基をへリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列中、好ましくは、特に、ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）（配列番号１７）またはＨ３ＨＡについてはＩ（Ｅ／Ｇ）ＫＴＮＥＫＦＨＱＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧＲ４２１（配列番号１０４）のアミノ酸配列を含むＨ１ＨＡのアミノ酸４０２〜４１８に及ぶアミノ酸配列中に１つ以上の突然変異を導入することにより、改変ＨＡの融合前立体構造の安定性を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるステップ（突然変異は、好ましくは、疎水性アミノ酸残基の親水性アミノ酸残基への置換を含む）；
−ＨＡステムドメインポリペプチド中に１つ以上のジスルフィド架橋を導入するステップ
を含む。

【0135】

本発明によれば、ＨＡ１およびＨＡ２間の開裂部位の除去は、Ｐ１位におけるＲ（わずかな場合においてＫ）のＱへの突然変異により達成することができる（例えば、開裂部位（配列番号１中の３４３位）の命名法の説明については、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，２０１０参照。Ｑへの突然変異が好ましいが、Ｓ、Ｔ、Ｎ、ＤまたはＥも代替例である。

【0136】

頭部ドメインの除去は、例えば、配列番号１からのアミノ酸５３から３２０を欠失させることにより達成することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。配列の残留部分を直接的に結合させることができ、またはフレキシブルリンカーを導入することができる。リンカー配列は、１から５０アミノ酸長であり得る。限定された長さ（１０アミノ酸以下）のフレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡ、ＧＳＡＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧまたは類似物が好ましい。欠失の長さは、例えば、欠失を（ｘ）位（の相当物）において、例えば、５４、５５、５６、５７もしくは５８位において開始することにより、または欠失の長さを増加させるため、４７、４８、４９、５０、５１、もしくは５２位において切断することにより変えることもできる。同様に、欠失させるべき最後のアミノ酸は、（ｙ）位（の相当物）、例えば、３１５、３１６、３１７、３１８もしくは３１９位におけるもの、または欠失の長さを増加させるため、３２１、３２２、３２３、３２４、もしくは３２５位（の相当物）におけるものであり得る。欠失の長さの変化は、リンカー配列の長さを合致させることにより部分的に補うことができることを理解することは重要であり、すなわち、より大きい欠失はより長いリンカーと合致させることができ、逆もまた同様である。これらのポリペプチドも本発明により包含される。

【0137】

本発明によれば、ＡへリックスおよびＣＤへリックス間のループの溶解度が増加される。このループは、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の残基４０２から４１８（の相当物）により形成される。したがって、改変ＨＡの融合前立体構造の安定性が増加され、融合後立体構造が脱安定化される。このループは、以下の表６において確認することができるとおり、Ｈ１配列中で高度に保存される。これは、例えば、前記ループ中のアミノ酸Ｉ、Ｌ、ＦまたはＶを親水性相当物により置き換えることにより達成することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。グリシンへの突然変異は、融合後立体構造を脱安定化させる。それというのも、このアミノ酸の高いフレキシビリティがこのＨＡ配列の一部により形成され得る融合後へリックスの安定性の減少をもたらすためである。血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡの４０２〜４１８のループを記載するコンセンサス配列は、（配列番号１７）ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）である。本発明のあるポリペプチドにおいて、４０６、４０９、４１３位および／または４１６位におけるアミノ酸（または配列アラインメントから決定されたそれらの相当物）は、極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）またはフレキシブル（Ｇ）アミノ酸である。これらの部位における突然変異の組合せも可能であり、例えば、配列番号１０および配列番号１４におけるＦ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓである。一部の場合、コンセンサスアミノ酸を回復させるための突然変異が好ましく、例えば、ＶもしくはＭが４０４位（Ｔへ）、Ｖが４０８位（Ａへ）もしくは４１０位（Ｇへ）またはＩが４１４位（Ｎへ）における場合であり；これらの特定のアミノ酸を有する配列の発生率は極めて低い。本発明のポリペプチドを特性決定する上記の突然変異の概要を表６に挙げる。

【0138】

本発明によれば、１つ以上のジスルフィド架橋がステムドメインポリペプチド中に、好ましくは、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７：配列番号１３〜１６中の３２４および４３６位（またはそれらの相当物）のアミノ酸間に導入される。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。

【0139】

前記方法により得られるポリペプチドも本発明の一部である。

【0140】

天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。本発明によれば、三量体コイルドコイルの形成のためのコンセンサス配列、ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥ（配列番号８３）を、本発明のポリペプチド中に４１８から４３３位（の相当物）において導入することができる。ある実施形態において、ＧＣＮ４に由来し、さらに三量体化することが公知の配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号８４）が、４１９〜４３位（の相当物）において導入される。ある実施形態において、三量体界面は、Ｍ４２０、Ｌ４２３、Ｖ４２７、Ｇ４３０をイソロイシンに改変することにより安定化される。

【0141】

ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３〜１６、配列番号４４〜５３、配列番号１１１〜１１４、配列番号１１９〜１２０、配列番号１２５、１２６、１３０、配列番号１４４〜１７５および配列番号１７７〜１８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0142】

ある実施形態において、ポリペプチドは、配列番号４５、配列番号１１３および配列番号１３０からなる群から選択される。

【0143】

産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１７に対応）は一般に、例えば、ワクチンにおいて使用される最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。したがって、ある実施形態において、本発明によるポリペプチドは、リーダー配列を有さないアミノ酸配列を含む。

【0144】

インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、当業者に好適と考えられる任意の技術、例として、下記の技術に従って調製することができる。

【0145】

したがって、本発明の免疫原性ポリペプチドは、当分野において公知の標準的方法によりＤＮＡ配列として合成し、当分野において公知の好適な制限酵素および方法を使用してクローニングし、続いてインビトロまたはインビボで発現させることができる。したがって、本発明はまた、上記のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。ある実施形態において、本発明による核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミドの一部である。このようなベクターは、当業者に周知の方法により容易に操作することができ、例えば、原核および／または真核細胞中で複製し得るように設計することができる。さらに、多くのベクターは、直接的に、またはそれから単離された所望の断片の形態で真核細胞の形質転換に使用することができ、全部または一部としてそのような細胞のゲノム中に組み込まれ、所望の核酸をゲノム中に含む安定な宿主細胞をもたらす。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに好適であり、関心対象の核酸の転写に使用することができる任意のベクターであり得る。宿主細胞が使用される場合、ベクターは組込みベクターであることが好ましい。あるいは、ベクターは、エピソーム複製ベクターであり得る。

【0146】

当業者は、好適な発現ベクターを選択し、本発明の核酸配列を機能的に挿入することができる。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を得るため、発現を駆動し得る配列を、ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合させ、タンパク質またはポリペプチドを発現可能なフォーマットでコードする組換え核酸分子をもたらすことができることは当業者に周知である。一般に、プロモーター配列が、発現させるべき配列の上流に配置される。多くの発現ベクターが当分野において利用可能であり、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクター系、ＢＤ ＳｃｉｅｎｃｅｓからのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ−Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどであり、それらを使用して好適なプロモーターおよび／または転写終結配列、ポリＡ配列などを得ることができる。関心対象のポリペプチドをコードする配列が、コードされるポリペプチドの転写および翻訳を支配する配列に関して適切に挿入される場合、得られる発現カセットは、関心対象のポリペプチドを産生するために有用であり、それは発現と称される。発現を駆動する配列には、プロモーター、エンハンサーなど、およびそれらの組合せが含まれ得る。これらは、宿主細胞中で機能し得、それによりそれらに機能的に結合している核酸配列の発現を駆動し得るべきである。当業者は、宿主細胞中での遺伝子の発現を得るために種々のプロモーターを使用することができることを把握する。プロモーターは、構成的または調節的であり得、種々の資源、例として、ウイルス、原核、もしくは真核資源から得ることができ、または人工的に設計することができる。関心対象の核酸の発現は、天然プロモーターもしくはその誘導体から、または完全に異種のプロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ，２０００）からのものであり得る。一部の周知で、真核細胞中での発現にかなり使用されるプロモーターは、ウイルス、例えば、アデノウイルスに由来するプロモーター、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター（本発明においてＣＭＶプロモーターと称される）（例えば、ｐｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーター（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ，１９８５）などを含む。好適なプロモーターは、真核細胞からも由来し得、例えば、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）、ユビキチンＣまたはＵＢ６プロモーター（Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどである。プロモーター機能およびプロモーターの強度についての試験は、当業者の定型事項であり、一般に、例えば、試験遺伝子、例えば、プロモーター配列後方のｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰなどのクローニング、および試験遺伝子の発現試験を包含し得る。無論、プロモーターは、その配列の欠失、付加、突然変異により変え、機能性について試験して新たな、減衰した、または改善されたプロモーター配列を見出すことができる。本発明によれば、最適な真核細胞中で高い転写レベルを付与する強力なプロモーターが好ましい。

【0147】

当業者に周知の方法を使用して構築物を真核細胞（例えば、植物、真菌、酵母または動物細胞）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な原核発現系中に形質移入することができる。一部の場合、好適な「タグ」配列（例えば、限定されるものではないが、ｈｉｓ、ｍｙｃ、ｓｔｒｅｐ、またはｆｌａｇタグなど）または完全タンパク質（例えば、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質またはグルタチオンＳトランスフェラーゼなど）を本発明の配列に付加して細胞または上清からのポリペプチドの精製および／または同定を可能とすることができる。場合により、特異的タンパク質分解部位を含有する配列を含めて後でタグをタンパク質分解消化により除去することができる。

【0148】

精製ポリペプチドは、当分野において公知の分光法（例えば、円偏光二色分光法、フーリエ変換赤外分光法およびＮＭＲ分光法またはＸ線結晶分析法）により分析してへリックスおよびベータシートなどの所望の構造の存在を調査することができる。以前に記載された広域中和抗体（ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０５７）への本発明のポリペプチドの結合を調査するためにＥＬＩＳＡ、ＯｃｔｅｔおよびＦＡＣＳなどを使用することができる。したがって、正確な立体構造を有する本発明によるポリペプチドを選択することができる。

【0149】

本発明はさらに、治療有効量の本発明のポリペプチドおよび／または核酸の少なくとも１つを含む免疫原性組成物に関する。ある実施形態において、組成物は、１つのインフルエンザ亜型のＨＡからの（またはそれをベースとする）、例えば、Ｈ１またはＨ７亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスのＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含むポリペプチドを含む。ある実施形態において、組成物は、２つ以上の異なるインフルエンザ亜型のＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含むポリペプチドを含み、例えば、組成物は、Ｈ１亜型のＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含むポリペプチドおよびＨ７亜型のＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含むポリペプチドの両方を含む。

【0150】

免疫原性組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。本文脈において、用語「薬学的に許容可能な」は、担体が用いられる投与量および濃度において、それが投与される対象中で不所望な効果も有害効果も引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容可能な担体および賦形剤は、当分野において周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０００］参照）。用語「担体」は、組成物がともに投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。生理食塩溶液および水性デキストローズおよびグリセロール溶液は、例えば、特に注射溶液のための液体担体として用いることができる。正確な配合は、投与の様式に適合すべきである。ポリペプチドおよび／または核酸分子は、好ましくは、滅菌溶液として配合および投与される。滅菌溶液は、滅菌濾過により、または当分野において自体公知の他の方法により調製される。次いで、溶液は、凍結乾燥または医薬投与容器中に充填することができる。溶液のｐＨは、一般に、ｐＨ３．０から９．５、例えば、ｐＨ５．０から７．５の範囲である。

【0151】

本発明はまた、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に上記のポリペプチド、核酸分子および／または免疫原性組成物を投与することを含む方法に関する。本発明による対象は、好ましくは、感染性疾患惹起作用物質、特にインフルエンザウイルスにより感染され得、またはそうでなければ免疫応答の誘導から利益を受け得る哺乳動物であり、そのような対象は、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、フェレット、または家庭もしくは農場動物、または非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、対象は、ヒト対象である。したがって、本発明は、特にグループ１および／もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ７および／もしくはＨ１０亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス、ならびに／またはインフルエンザＢウイルスのインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に対する免疫応答を、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を利用する対象において誘導する方法を提供する。一部の実施形態において、誘導される免疫応答は、グループ１および／もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防および／または治療するために有効である。一部の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物により誘導される免疫応答は、インフルエンザＡウイルスの２、３、４、５もしくは６つの亜型および／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされるインフルエンザＡおよび／またはＢウイルス感染を予防および／または治療するために有効である。

【0152】

小型タンパク質および／または核酸分子は強力な免疫応答を常に有効に誘導するわけではないことが周知であるため、アジュバントを添加することによりポリペプチドおよび／または核酸分子の免疫原性を増加させることが必要であり得る。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、アジュバントを含み、またはそれとの組合せで投与される。本明細書に記載の組成物との組合せ投与のためのアジュバントは、前記組成物の投与前、投与と同時に、または投与後に投与することができる。好適なアジュバントの例には、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム；油−エマルション組成物（または水中油型組成物）、例として、スクアレン−水エマルション、例えば、ＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレット参照）；サポニン配合物、例えば、ＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレット参照）；細菌または微生物誘導体が含まれ、その例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその突然変異体、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ、百日咳毒素ＰＴ、または破傷風トキソイドＴＴ、Ｍａｔｒｉｘ Ｍ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）である。さらに、公知の免疫強化技術、例えば、免疫応答を向上させることが当分野において公知のタンパク質（例えば、破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７、ｒＣＴＢ、細菌性フラジェリンなど）への本発明のポリペプチドの融合またはビロソーム中へのポリペプチドの包含、またはそれらの組合せを使用することができる。使用することができる他の非限定的な例は、例えば、Ｃｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）により開示されている。

【0153】

一実施形態において、本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベクター中に取り込まれる。ＶＬＰは、一般に、典型的には、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＬＰは、複製し得ない。ある実施形態において、ＶＬＰは、ウイルスの全ゲノムを欠き得、またはウイルスのゲノムの一部を含み得る。一部の実施形態において、ＶＬＰは、細胞に感染し得ない。一部の実施形態において、ＶＬＰは、それらの表面上で当業者に公知のウイルス（例えば、ウイルス表面糖タンパク質）または非ウイルス（例えば、抗体またはタンパク質）標的化部分の１つ以上を発現させる。

【0154】

具体的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、ビロソーム中に取り込まれる。本発明によるポリペプチドを含有するビロソームは、当業者に公知の技術を使用して産生することができる。例えば、ビロソームは、精製ウイルスを破壊し、ゲノムを抽出し、粒子をウイルスタンパク質（例えば、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド）および脂質とリアソートさせてウイルスタンパク質を含有する脂質粒子を形成することにより産生することができる。

【0155】

本発明はまた、特にワクチンとして使用される、インフルエンザＨＡに対する対象における免疫応答を誘導するための上記のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物に関する。したがって、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸を含むベクターまたは本明細書に記載のポリペプチドは、インフルエンザウイルスに対する、例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのステム領域に対する中和抗体を誘発させるために使用することができる。本発明は特に、系統発生グループ１および／もしくは系統発生グループ２のインフルエンザＡウイルスならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患または病態の予防および／または治療においてワクチンとして使用される上記のポリペプチド、核酸、および／または免疫原性組成物に関する。一実施形態において、ワクチンは、系統発生グループ１および／または２の２、３、４、５、６もしくはそれより多い異なる亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療において使用することができる。本発明のポリペプチドは、合成後にインビトロで、または好適な細胞発現系、例として、細菌および真核細胞中で使用することができ、またはインビボでそれが必要とされる対象中で、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を発現させることにより発現させることができる。このような核酸ワクチンは、任意の形態、例として、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクター、例として、アデノウイルスベクターを取り得る。

【0156】

本発明によるポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物の投与は、標準的な投与経路を使用して実施することができる。非限定的な例には、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、経皮、筋肉内、皮下など、または粘膜投与、例えば、鼻腔内、経口などが含まれる。当業者は、本発明によるポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物を投与して免疫応答を誘導する種々の可能性を決定することができる。ある実施形態において、ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物（またはワクチン）は、２回以上、すなわち、いわゆる同種プライムブーストレジメンで投与される。ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物が２回以上投与されるある実施形態において、第２の用量の投与は、例えば、第１の用量の投与後１週間以上の時間間隔後、第１の用量の投与後２週間以上、第１の用量の投与後３週間以上、第１の用量の投与後１ヵ月以上、第１の用量の投与後６週間以上、第１の用量の投与後２ヵ月以上、第１の用量の投与後３ヵ月以上、第１の用量の投与後４ヵ月以上など、ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物の第１の用量の投与後数年まで実施することができる。ワクチンを第１のプライミング投与後に２回以上のブースト投与が続くように３回以上、例えば、３回、４回など投与することも可能である。他の実施形態において、本発明によるポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物は、１回のみ投与される。

【0157】

ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物は、プライムまたはブーストのいずれかとして、異種プライム−ブーストレジメンで投与することもできる。

【0158】

本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または組成物を利用して対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防および／または治療する方法をさらに提供する。具体的な実施形態において、対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防および／または治療する方法は、それが必要とされる対象に有効量の上記のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を投与することを含む。治療有効量は、グループ１もしくは２インフルエンザＡウイルス、および／またはインフルエンザＢウイルスによる感染から生じる疾患または病態の予防、改善および／または治療に有効な本明細書に定義のポリペプチド、核酸、および／または組成物の量を指す。予防は、インフルエンザウイルスの拡散の阻害もしくは低減またはインフルエンザウイルスによる感染に伴う症状の１つ以上の発症、発現もしくは進行の阻害もしくは低減を包含する。本明細書において使用される改善は、可視もしくは知覚疾患症状、ウイルス血症、または任意の他の計測可能なインフルエンザ感染の症候の低減を指し得る。

【0159】

治療が必要とされる者には、グループ１もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス、またはインフルエンザＢウイルスによる感染から生じた病態により既に苦痛を受ける者、およびインフルエンザウイルスによる感染を予防すべき者が含まれる。したがって、本発明のポリペプチド、核酸および／または組成物は、未投薬の対象、すなわち、インフルエンザウイルス感染により引き起こされる疾患を有さない、もしくはインフルエンザウイルス感染により感染されたことがなく、現在も感染されていない対象、またはインフルエンザウイルスにより既に感染され、および／または感染されたことのある対象に投与することができる。

【0160】

一実施形態において、予防および／または治療は、インフルエンザウイルス感染を受けやすい患者群において標的化することができる。このような患者群には、限定されるものではないが、例えば、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは、≧６５歳）、若年（例えば、≦５歳、≦１歳）、入院患者および抗ウイルス化合物により治療されたが、不適切な抗ウイルス応答を示した患者が含まれる。

【0161】

別の実施形態において、ポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物は、対象に１つ以上の他の活性剤、例えば、既存または将来のインフルエンザワクチン、モノクローナル抗体および／または抗ウイルス剤、および／または抗菌剤、および／または免疫調節剤との組合せで投与することができる。１つ以上の他の活性剤は、インフルエンザウイルス疾患の治療および／または予防において有益であり得、またはインフルエンザウイルス疾患に伴う症状または病態を改善し得る。一部の実施形態において、１つ以上の他の活性剤は、鎮痛剤、抗発熱薬、または呼吸を緩和もしくは補助する治療物である。

【0162】

本発明のポリペプチドおよび／または核酸分子の投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整することができる。好適な投与量範囲は、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。用いるべきポリペプチドおよび／または核酸分子の正確な投与量は、例えば、投与経路、および感染またはそれにより引き起こされる疾患の重症度に依存し、医師の判断および各対象の状況に従って決定すべきである。例えば、有効用量は、患者の標的部位、生理学的状態（例として、年齢、体重、健康）に応じて変動し、治療が予防的または治療的であるかを問わない。通常、患者は、ヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例として、トランスジェニック哺乳動物を治療することもできる。治療投与量は、安全性および効力を最適化するように最適に力価測定される。

【0163】

本発明のポリペプチドは、潜在的な治療候補物として同定されたモノクローナル抗体の結合を確認するために使用することもできる。さらに、本発明のポリペプチドは、診断ツールとして、例えば、本発明のポリペプチドに結合し得るそのような個体の血清中の抗体が存在するか否かを確認することにより個体の免疫状態を試験するために使用することができる。したがって、本発明はまた、患者におけるインフルエンザ感染の存在を検出するインビトロ診断法であって、ａ）前記患者から得られた生物学的試料を本発明によるポリペプチドと接触させるステップ；およびｂ）抗体−抗原複合体の存在を検出するステップを含む方法に関する。

【0164】

本発明のポリペプチドは、新たな結合分子を同定するため、または既存の結合分子、例えば、モノクローナル抗体および抗ウイルス剤を改善するために使用することもできる。

【0165】

本発明を以下の実施例および図面においてさらに説明する。実施例は、本発明の範囲を決して限定するものではない。

【実施例】

【0166】

実施例１
新規グループ１およびグループ２交差中和抗体：ＣＲ９１１４の同定
末梢血を正常健常ドナーから静脈穿刺によりＥＤＴＡ抗凝固試料管中に回収した。ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーを、本質的に本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットに記載のとおりに得た。選択は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）、Ｈ３（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５）、Ｈ４（Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２４／１９７６）、Ｈ５（Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／２８／２００３）、Ｈ７（Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３）およびＨ９（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９）の組換えヘマグルチニン（ＨＡ）に対して実施した。２つの連続選択ラウンドを個々の一本鎖ファージ抗体の単離前に実施した。第２の選択ラウンド後、個々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを使用してモノクローナルファージ抗体を調製した。上記のスクリーニングにおいて得られた一本鎖ファージ抗体を含有する選択上清を、ＥＬＩＳＡにおいて特異性、すなわち、異なるＨＡ抗原への結合についてバリデートした。この目的のため、バキュロウイルス発現組換えＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）、Ｈ３（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５）、Ｈ５（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）Ｈ７（Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３）、およびＢ（Ｂ／Ｏｈｉｏ／０１／２００５）ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＴ，ＵＳＡ）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレートにコートした。得られた一本鎖ファージ抗体のうち、一本鎖ファージ抗体ＳＣ０９−１１４は、組換えインフルエンザＡＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびインフルエンザＢＨＡに特異的に結合することが示された。ＳＣ０９−１１４の結合および特異性をＦＡＣＳ分析によりバリデートした。この目的のため、全長組換えインフルエンザＡ亜型Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）、Ｈ３（Ａ／Ｗｉｓｏｎｓｉｎ／６７／２００５）およびＨ７（Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３）ＨＡを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の表面上で発現させた。ＳＣ０９−１１４は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、Ｈ３およびＨ７ＨＡに特異的に結合することが示された。ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖可変領域を既に記載（国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット）のとおりクローニングした。ヒトＩｇＧ１重鎖および軽鎖をコードする得られた発現構築物を、２９３Ｔ細胞との組合せで一過的に発現させ、ヒトＩｇＧ１抗体ＣＲ９１１４を含有する上清を得、それを標準的な精製手順を使用して産生した。ＣＲ９１１４の重鎖および軽鎖のＣＤＲのアミノ酸配列を表１に挙げる。重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下に挙げる。

【0167】

実施例２
ＣＲ９１１４の交差結合反応性
ＣＲ９１１４を、ＥＬＩＳＡにおいて結合特異性、すなわち、異なるＨＡ抗原への結合についてバリデートした。この目的のため、バキュロウイルス発現組換えＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）、Ｈ３（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５）、Ｈ５（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４、Ｈ７（Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３）およびＨ９（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９）ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＴ，ＵＳＡ）をＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレートにコートした。対照として、未関連ＩｇＧのＣＲ４０９８を使用した。ＣＲ１１４は、試験された全ての組換えＨＡに対する異種亜型交差結合活性を有することが示された。表２参照。

【0168】

さらに、抗体を異種亜型結合についてＦＡＣＳ分析により試験した。この目的のため、全長組換えインフルエンザＡ亜型Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）、Ｈ３（Ａ／Ｗｉｓｏｎｓｉｎ／６７／２００５）およびＨ７（Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／２１９／２００３）ＨＡを、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の表面上で発現させた。細胞をＣＲ９１１４と１時間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋０．１％のＢＳＡによる３回の洗浄ステップを行った。結合した抗体は、ＰＥコンジュゲート抗ヒト抗体を使用して検出した。対照として、未形質移入ＰＥＲ．Ｃ６細胞を使用した。ＣＲ９１１４は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、Ｈ３およびＨ７ＨＡに対する交差結合活性を示したが、野生型ＰＥＲ．Ｃ６細胞は示さなかった。表２参照。

【0169】

実施例３
ＣＲ９１１４の交差中和活性
ＣＲ９１１４が複数のインフルエンザＡ株を遮断し得たか否かを決定するため、追加のインビトロウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）を実施した。ＶＮＡは、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）について実施した。ＭＤＣＫ細胞をＭＤＣＫ細胞培養培地（抗生物質、２０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび０．１５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウムが補給されたＭＥＭ培地（完全ＭＥＭ培地）に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清が補給されたもの）中で培養した。アッセイにおいて使用されたＨ１（Ａ／ＷＳＮ／３３、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／ＩＶＲ−１４５（Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６の高増殖リアソータント）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ａ／ＮＹＭＣ／Ｘ−１８１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９の高増殖リアソータント）、Ｈ２（Ａ／Ｅｎｖ／ＭＰＵ３１５６／０５）、Ｈ３（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／６８、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／９４、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２０００／１９９９、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ／５２／２００５、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７）、Ｈ４（Ａ／ＷＦ／ＨＫ／ＭＰＡ８９２／０６）、Ｈ５（ＰＲ８−Ｈ５Ｎ１−ＨＫ９７（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７およびＡ／ＰＲ／８／３４の６：２リアソータント）およびＡ／Ｅｕｒａｓｉａｎ Ｗｉｇｅｏｎ／ＭＰＦ４６１／０７）、Ｈ６（Ａ／Ｅｕｒａｓｉａｎ Ｗｉｇｅｏｎ／ＭＰＤ４１１／０７）、Ｈ７（ＮＩＢＲＧ−６０（Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／１２／２０００の６：２リアソータント）およびＰＲ８−Ｈ７Ｎ７−ＮＹ（Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１０７／２００３（Ｈ７Ｎ７）およびＡ／ＰＲ／８／３４の７：１リアソータント））、Ｈ８（Ａ／Ｅｕｒａｓｉａｎ Ｗｉｇｅｏｎ／ＭＰＨ５７１／０８）Ｈ９（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９およびＡ／Ｃｈｉｃｋ／ＨＫ／ＳＳＰ１７６／０９）、Ｈ１０（Ａ／Ｃｈｉｃｋ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／４９）およびＨ１４（ＰＲ８−Ｈ１４Ｎ５（Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／Ａｓｔｒａｋｈａｎ／２６３／１９８２（Ｈ１４Ｎ５）およびＡ／ＰＲ／８／３４の６：２リアソータント））株を全て５．７×１０^３ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（１ｍｌ当たりの５０％組織培養感染用量）の力価に希釈し、力価は、ＳｐｅａｒｍａｎおよびＫａｒｂｅｒの方法に従って計算した。ＩｇＧ調製物（２００μｇ／ｍｌ）を完全ＭＥＭ培地中で４つ組のウェル中で段階的に２倍希釈（１：２〜１：５１２）した。それぞれのＩｇＧ希釈物の２５μｌを、ウイルス懸濁液（１００ＴＣＩＤ５０／２５μｌ）の２５μｌと混合し、３７℃において１時間インキュベートした。次いで、懸濁液を、５０μｌの完全ＭＥＭ培地中でコンフルエントＭＤＣＫ培養物を含有する９６ウェルプレート上に２つ組で移した。使用前、ＭＤＣＫ細胞をＭＤＣＫ細胞培養培地中で１ウェル当たり３×１０^４個の細胞において播種し、細胞がコンフルエントに達するまで増殖させ、３００〜３５０μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４により洗浄し、最後に５０μｌの完全ＭＥＭ培地をそれぞれのウェルに添加した。接種した細胞を３７℃において３〜４日間培養し、細胞変性効果（ＣＰＥ）の発現について毎日観察した。ＣＰＥを陽性対照と比較した。

【0170】

ＣＲ９１１４は、全ての試験インフルエンザＡ亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９およびＨ１０ウイルスの代表株に対する異種亜型交差中和活性を有することが示された。表３参照。

【0171】

実施例４
Ｈ１ＨＡをベースとするＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドの設計
広域交差中和効力を有するインフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する完全ヒトモノクローナル抗体を事前に同定した。ＣＲ６２６１（国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットに記載）は、系統発生グループ１のインフルエンザＡウイルスに対する広域交差中和活性を有することが示された。さらに、上記のＣＲ９１１４は、系統発生グループ１および２の両方のインフルエンザＡウイルスならびにインフルエンザＢウイルスに結合し、中和し得ることが示されている。機能的および構造的分析は、これらの抗体が膜融合プロセスを妨げ、インフルエンザＨＡタンパク質のステムドメイン中で高度に保存されたエピトープに対して指向されることを明らかにした（Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）；Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット、および同時係属出願ＥＰ１１１７３９５３．８号明細書）。

【0172】

本発明をもたらした研究において、これらのエピトープを含有するＨＡのステムドメインを含む新たな分子を設計し、例えば、広範囲のインフルエンザ株に対する保護を誘導するワクチンとして使用することができるユニバーサルエピトープベース免疫原性ポリペプチドを作出した。本質的には、高度に変異性の免疫優性部分、すなわち、頭部ドメインを最初に全長ＨＡ分子から除去して「ｍｉｎｉ−ＨＡ」とも称されるＨＡステムドメインポリペプチドを作出する。このように、免疫応答は、広域中和抗体についてのエピトープが局在するステムドメインに対して再指向される。抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４は、新たに作出された分子の正確なフォールディングを調べるため、および中和エピトープの存在を確認するために使用される。

【0173】

したがって、本発明のポリペプチドは、膜近位ステムドメインＨＡ分子の保存エピトープを、膜遠位頭部ドメイン中に存在する優性エピトープの不存在下で免疫系に提示する。この目的のため、頭部ドメインを構成するＨＡ０タンパク質の一次配列の一部を除去し、直接的に、または短いフレキシブル結合配列（「リンカー」）を導入することにより再連結させて鎖の連続性を回復させる。得られた配列を、ＨＡ０分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する規定の突然変異を導入することによりさらに改変する。

【0174】

ウイルス中のＨＡ分子の機能は、細胞表面受容体シアル酸に結合し、エンドソーム中への取り込み後、ウイルスおよびエンドソーム膜の融合を媒介し、細胞中へのウイルスＲＮＡの放出をもたらすことである。融合プロセスにおける不可欠なステップは、融合ペプチドが曝露されるように分子の二次構造エレメントを再配置するＨＡ分子の大きい立体構造変化である。結果的に、三次構造に関して極めて異なるＨＡ分子の２つの立体構造（融合前および後）が存在する。ウイルスＨＡタンパク質は融合前状態で主として免疫系に曝露されるため、本発明のポリペプチドがこの立体構造を採用することを確認することが重要である。この要件は、融合前立体構造を安定化させ、同時に融合後立体構造を脱安定化させることにより満たすことができる。この安定化／脱安定化は、必須である。それというのも、融合前立体構造は準安定性であり、融合後立体構造の採用は安定な立体構造、すなわち、低いエネルギー極小をもたらすためである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）。

【0175】

この実施例において、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）からのＨＡを一次（または野生型）配列としてみなして本発明のポリペプチドを作出する。

【0176】

最初のステップにおいて、本発明のポリペプチドは、５９〜２９１位のＨＡ１配列を除去することにより構築する（番号付与は、配列番号１に示されるＨＡ０配列中の位置を指す。ある実施形態において、ＨＡ１部分は、アミノ酸１８〜３４３を含み、ＨＡ２部分は、アミノ酸残基３４４〜５６５を含み；それというのも、配列番号１は、シグナルペプチドを含み、ＨＡ１部分は、１８位において開始するためである）。このことは、ＨＡ０の残基６０から２９０の除去をもたらす。これらの残基は、ＧＧＧＧ結合配列により置き換えた。次に、融合前および融合後立体構造の両方のそれぞれの残基の接近可能な表面積を、Ｂｒｕｇｅｌ（Ｄｅｌｈａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４）により計算した。それぞれの残基の曝露および埋込の程度を、融合前立体構造中で曝露され、融合後立体構造中で埋め込まれる残基に焦点を当てるＳａｍａｎｔｈａ ｅｔ ａｌ（２００２）に記載のとおり決定した。これらの残基のさらなる分析は、これらのアミノ酸残基の一部を、突然変異が融合前立体構造に対する影響を有さず、融合後立体構造を脱安定化させるように突然変異させることができることを示した。これらの残基は、一般に、疎水性側鎖を有し、融合後立体構造中のコイルドコイルの形成に関与する。これらのアミノ酸残基の親水性アミノ酸への突然変異は、コイルドコイル特性を撹乱し（コイルドコイル中のへリックス間の接触は、一般に、疎水性である）、したがって融合後立体構造を脱安定化させる。

【0177】

この推定に従って、配列のＨＡ２部分において、いくつかの突然変異：Ｐｈｅ４０６のＳｅｒへの（Ｆ４０６Ｓ）、Ｖａｌ４０９のＴｈｒへの（Ｖ４０９Ｔ）、Ｌｅｕ４１６のＳｅｒへの（Ｌ４１６Ｓ）およびＴｙｒ５０２のＳｅｒへの（Ｙ５０２Ｓ）突然変異を導入した。これらは、ＨＡの表面から疎水性残基を除去する突然変異である。Ｌ４１６のＳまたはＴのいずれかへの突然変異は、コンセンサスＮ−グリコシル化部位（コンセンサス配列は、ＮＸ（Ｓ／Ｔである）も導入することに留意すべきである。この位置におけるグリコシル化は、この領域の溶解度をさらに増加させる。さらに、Ｌｅｕ５８をＴｈｒ（Ｌ５８Ｔ）に、Ｖａｌ３１４をＴｈｒ（Ｖ３１４Ｔ）に、Ｉｌｅ３１６をＴｈｒ（Ｉ３１６Ｔ）に突然変異させ；これらの突然変異は、全てＨＡ１ドメイン、すなわち、天然ＨＡ０鎖の開裂後のＨＡ１に対応する配列の部分中に存在する。最後の２つの突然変異は、側鎖のベータ分枝を維持するが、表面から疎水性残基を除去する。以下に示されるとおり、これらの突然変異の一部を全てのバリアント中に導入し、他を別個のポリペプチド中で試験して突然変異が互いに不所望に影響するか否かを調査した。

【0178】

ポリペプチドの安定性を増加させるため、ＨＡを融合前立体構造で固定するために２つのジスルフィド架橋を調査した。ジスルフィド架橋は、（全長ＨＡ分子中で）互いから空間的に適切な距離において存在し、ジスルフィド架橋を形成させるために既に正確な位置においてＣベータ原子を有する残基間で形成させる。提案される第１のジスルフィド架橋は、３２１位（ＨＡ１ドメイン）および４０５位（ＨＡ２ドメイン）間に存在する。ＨＡ２ドメイン内で、ジスルフィド架橋を４１３および４２１位間に作出した。

【0179】

Ｒ３４３位におけるＨＡの開裂は、立体構造変化が本発明のポリペプチド中で生じ得るために不可欠なステップであるため、Ａｒｇ（Ｒ）のＧｌｎ（Ｑ）への突然変異を導入することにより開裂部位を除去した。本発明による別の解決策は、ＡｒｇをＧｌｎを変化させ、ＨＡ２の融合ペプチドの小部分の残基３４５から３５０を欠失させることである。これらの（疎水性）配列の除去は、ポリペプチドをさらに安定化させる。

【0180】

ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、ＨＡ２の５２３、５２４、５２５、５２６、５２６、５２７、５２８、５２９、または５３０位（またはそれらの相当物）からＨＡ２のＣ末端（配列番号１による番号付与）の細胞質配列および膜貫通配列は、例えば、ワクチンにおいて使用することができる分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中での発現後に生成されるように除去した。可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬ（配列番号１４３）を場合によりリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化させた。リンカーは、当業者に周知のプロトコルに従って後で処理するための開裂部位を場合により含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、短いリンカー、例えば、ＥＧＲを介して連結されたタグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ）を付加することができる。一部の実施形態において、リンカーおよびｈｉｓタグ配列は、ｆｏｌｄｏｎ配列を存在させることなく付加する。本発明によれば、ＨＡ２ドメインの５３０位（配列番号１による番号付与）からＣ末端アミノ酸のアミノ酸配列を除去し、以下の配列：
短いリンカーおよびｈｉｓタグを含むＥＧＲＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８１）、または
トロンビン開裂部位、三量体化ドメイン、およびｈｉｓタグを含むＳＧＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８２）により置き換えた。

【0181】

上記突然変異を、ＨＡステムポリペプチドの三次元構造中のそれらの機能および局在に従ってクラスターに分類した。全てのポリペプチドは、Ｈ１ＨＡ配列１〜５９および２９１〜５６５ならびにＲ３４３Ｑ突然変異を、以下の追加の突然変異：Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｔ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ（配列番号３；ｃｌｕｓｔｅｒ１と命名）とともに含有する。さらに、追加の突然変異を有するバリアントを作製した：
Ｃｌｕｓｔｅｒ２：Ｋ３２１Ｃ、Ｑ４０５Ｃ（配列番号４）
Ｃｌｕｓｔｅｒ３：Ｆ４１３Ｃ、Ｅ４２１Ｃ（配列番号５）
Ｃｌｕｓｔｅｒ４：ＨＡ２ Ｙ５０２Ｓ（配列番号６）。

【0182】

さらに、ｃｌｕｓｔｅｒ１配列ならびにさらにｃｌｕｓｔｅｒ２および３（配列番号７）またはｃｌｕｓｔｅｒ２、３および４（配列番号８）の突然変異を含有する２つのバリアントを作製した。

【0183】

一般に当業者に公知の方法を使用して上記のタンパク質配列をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４中にクローニングした。比較の理由のため、全長配列（配列番号１）およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４配列をベースとするＳｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ（２０１０）により記載された配列（Ｈ１−ＰＲ８−ｄＨ１；配列番号２４）を実験に含めた。

【0184】

形質移入剤として４０μｌの２９３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎを使用してＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）懸濁細胞（１０^６個の細胞／ｍｌ、３０ｍｌ）に発現ベクター（１μｇ／ｍｌ）を形質移入させ、さらに２日間増殖させた。細胞を回収し、アリコート化し（０．３ｍｌ、約３^＊１０^５個の細胞）、アリコートを、発現を調べるためのＨ１ＨＡに対して生じたポリクローナル血清またはＨＡ特異的モノクローナル抗体（５マイクログラム／ｍｌ）のいずれかおよび染色に使用される二次抗体により処理した。次いで、発現を調べるためのＨ１ＨＡに対して生じたポリクローナル血清を使用して細胞を本発明の膜付着ＨＡステムドメインポリペプチドの発現について蛍光結合細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）により分析した。全長タンパク質に結合する公知の特異性のモノクローナル抗体のパネル（例えば、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４）を使用して保存エピトープの存在、ならびに推論により全長ＨＡおよび本発明のｍｉｎｉ−ＨＡポリペプチドの正確なフォールディングを調べた。結果を陽性細胞の割合および平均蛍光強度として表現し、図２に示す。

【0185】

結果は、全ての構築物が細胞表面上で発現されることを示す。それというのも、ポリクローナル血清（抗Ｈ１ポリ）との反応が、未形質移入細胞についての約４％と比較して全ての分析細胞の７５％以上が陽性であることをもたらすためである。これは、ポリクローナル血清による処理後の全ての構築物について類似する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値により確認される。標識抗ヒトＩｇＧまたは無関連ｍＡｂのみを使用するＩｇＧの不存在下の対照実験は、全て陰性である。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７およびＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４全長ＨＡタンパク質の両方は、モノクローナル抗体ＣＲ６２６１、ＣＲ６２５４、ＣＲ６３２８（全てＨ１ＨＡに結合し、それを中和することが公知；Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット）、ＣＲ９１１４（上記）、ＣＲ８００１（Ｈ１ＨＡに結合するが、Ｈ１を中和しない；国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）により認識されるが、ＣＲ８０５７（一部のＨ３株にのみ結合、これも国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）およびＣＲ６３０７（Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット）により認識されない。

【0186】

ＣＲ６２６１エピトープ（Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ．２００９）の不連続および立体構造特徴を考慮すると、全長タンパク質の両方はそれらの天然三次元立体構造で存在することが結論づけられる。この実験において試験される新たに設計された本発明のポリペプチドについて、モノクローナル抗体のパネルによる同一の認識パターン：ＣＲ６２６１、ＣＲ６２５４、ＣＲ６３２８、ＣＲ９１１４およびＣＲ８００１による結合が観察されたが、ＣＲ６３０７およびＣＲ８０５７による結合は観察されなかった。これは、陽性細胞の割合に基づくデータにおいて最も明らかであるが、平均蛍光強度データにおいても観察される。最良の結果は、％陽性細胞および平均蛍光強度の両方に関してｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１について得られる。

【0187】

さらなる改変の追加、例えば、上記のジスルフィド架橋（ｃｌｕｓｔｅｒ２および３）およびｃｌｕｓｔｅｒ４のＹ５０２Ｓ突然変異（またはそれらの組合せは、陽性細胞の割合の減少およびより低い平均強度をもたらした。頭部ドメインを欠失するがさらなる改変を欠くＳｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０）（配列番号２４）により記載された構築物は、この実験において使用される抗体のいずれによってもバックグラウンドレベルを上回って認識されない。したがって、ＤＮＡ形質移入後にこのタンパク質はそれがＨＡ中で有する天然三次元立体構造でディスプレイされないことが結論づけられる。

【0188】

上記の結果は、ＨＡ分子のＡへリックスおよび長い骨格へリックス（ＣＤ）を連結する残基４０２から４１８により形成されるループならびにその周辺区域の親水性特徴を増加させるｃｌｕｓｔｅｒ１突然変異の重要性を指す。本発明のポリペプチドの安定性およびフォールディングに対するｃｌｕｓｔｅｒ１の突然変異の有益な効果をさらに確認するため、ｍｉｎｉＨＡ（配列番号２；Ｓｔｅｅｌによるが、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅをベースとするポリペプチド）およびｍｉｎｉＨＡ＿ｃｌｕｓｔｅｒ１（本発明によるポリペプチド；配列番号３）の別個の実験において比較した（図３）。

【0189】

ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１が形質移入された細胞の約６０％が、ＣＲ６２６１、ＣＲ６２５４、ＣＲ６３２８およびＣＲ９１１４の結合後に陽性である一方、ｍｉｎｉＨＡによる形質移入（Ｓｔｅｅｌによるが、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅをベースとするポリペプチド；配列番号２）は、バックグラウンドレベル（１〜３％）に極めて近い値をもたらす。本発明者らは、ｃｌｕｓｔｅｒ１の突然変異が、これらの突然変異を欠く未改変ｍｉｎｉタンパク質（配列番号２）と比較して本発明によるポリペプチドの適切なフォールディングおよび安定性に良好に寄与することを結論づける。

【0190】

Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．は、Ｈ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４およびＨ３ＨＫ６８株のＨＡ１のアミノ酸残基５３から２７６を一次配列から欠失させ、これを短いフレキシブルリンカーにより置き換えることにより新たな分子を作出した。この実施例において示されるとおり、これは、ステム領域中の保存エピトープに結合することが既に示された抗体の結合の欠落により証明されるとおり、正確な立体構造を調整しない高度に不安定な分子をもたらす。不正確なフォールディングは、通常は全長ＨＡ分子中で球状頭部によりシールドされる大きい区域の溶媒曝露により引き起こされる。この区域は天然で疎水性であるため、分子はもはや安定でなく、したがって適合が必要である。

【0191】

本発明のポリペプチドにおいて行われた疎水性残基の親水性残基についての交換は、この効果を弱め、ＨＡステムドメインポリペプチドを安定化させる。ステムドメインの天然三次元フォールドのさらなる安定化は、ジスルフィド架橋を適切な位置に導入して天然三次構造中で空間的に近いが一次構造中で離隔される残基を密接に連結させることにより達成される。

【0192】

実施例５
実施例４のＨＡステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長Ｈ１（配列番号１）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋２（配列番号４）およびｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋４（配列番号６）をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。比較の理由のため、Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１０）によるｍｉｎｉＨＡ設計（ｍｉｎｉ−ＰＲ８；配列番号２４）およびＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４からの対応する全長タンパク質ＨＡも実験に含めた。ｃＭ２をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。

【0193】

４匹のマウス（ＢＡＬＢ＼ｃ）の群を、５０μｇの構築物＋５０μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）により筋肉内で１、２１および４２日目に免疫化した。４９日目、最後の採血を実施し、血清を回収した。血清をＦＡＣＳアッセイにより分析した。ＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）懸濁細胞（１０^６個の細胞／ｍｌ、３０ｍｌ）に、形質移入剤として４０マイクロリットルの２９３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎを使用して発現ベクター（１マイクログラム／ｍｌ）を形質移入し、さらに２日間増殖させた。細胞を回収し、アリコート化（０．３ｍｌ、約３^＊１０^５個の細胞）し、アリコートを構築物特異的血清により処理し、二次抗体により染色し、蛍光結合細胞選別により分析した。結果を図４に示す。

【0194】

予測されるとおり、％陽性細胞およびＭＦＩにより証明されるとおり、ｃＭ２特異的血清（陰性対照）はｃＭ２を認識するが、全長ＨＡもステムドメインポリペプチドも認識しない。対照的に、全長ＨＡ特異的血清は、対応する全長ＨＡ（配列番号１）を発現する細胞を染色するが、より低いレベル（全長についての約８０％に対して約４０％の陽性細胞、全長についての約７０００に対して約１０００のＭＦＩ）ではあるが、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋２（配列番号４）およびｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋４（配列番号６）も染色する。逆も当てはまり；ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋２（配列番号４）およびｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋４（配列番号６）に特異的な血清は、対応する構築物および全長ＨＡ（配列番号１）を発現する細胞を認識する。結果を以下の表４にまとめる。

【0195】

ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋２（配列番号４）およびｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋４（配列番号６）についての上記結果と対照的に、全長ＰＲ８により免疫化されたマウスから得られた血清は、Ｈ１−ＰＲ８−ｄＨ１（配列番号２４）が形質移入された細胞に十分結合しなかった。陽性細胞の割合は、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）およびｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋２（配列番号４）についての４０〜５０％と比較して約２０％であった。結果は、バックグラウンドレベルをわずかに上回る平均蛍光強度において観察されるものにおいても反映される。

【0196】

まとめると、データは、本発明のポリペプチドが全長ＨＡに対して指向される免疫応答を誘導し得ることを示す。特に、残基４０２〜４１８（配列番号１による番号付与）の領域中の改変は、安定な分子を作出するために重要である。

【0197】

実施例６
第２世代のステムドメインポリペプチドの調製
実施例４に記載のステムドメインポリペプチドの平均蛍光強度は、全ての場合において、対応する全長タンパク質について観察されるものよりも低く；実際、最良の設計、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）は、モノクローナル抗体との結合後に全長構築物の平均強度の１０％のオーダーである強度を有する。これは、細胞表面上のステムドメインポリペプチドの発現および／またはフォールディングが、全長タンパク質について観察されるものよりも低いことならびに設計をさらに改善することができることを示す。第１世代から得られた結果は第１世代構築物の改善が可能であることを示し、したがって、第２の設計ラウンドを開始した。

【0198】

実施例４に記載のポリペプチドは、ＨＡ０鎖の同一の欠失、すなわち、残基Ｌ６０からＫ２９０の欠失（ｍｉｎｉ１；番号付与は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長ＨＡ０；配列番号１中の位置を指す）をベースとした。このアプローチは、頭部ドメインに目下もはや付着していない長い非構造化ループを作出する。このループは、全タンパク質安定性に寄与しておらず、ポリペプチドの他の部分のフォールディングに影響を与えずにかなり短縮することができることが推定された。３つの追加の欠失を設計し、上記のとおりＧＧＧＧリンカー配列により置き換え、上記のｃｌｕｓｔｅｒ１の突然変異と組み合わせた。欠失は、Ｓ５３からＰ３２０（ｍｉｎｉ２）、Ｈ５４からＩ３０２（ｍｉｎｉ３）、Ｇ５６からＧ３１７（ｍｉｎｉ４）である。上記のｃｌｕｓｔｅｒ１と同一の追加の改変（Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｔ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ）を導入した。このクラスターに属する残基の一部は、欠失配列の一部であり、したがって、もはや改変することができない（以下参照）。さらに、２つの追加の突然変異を、融合前状態で三量体コイルドコイルを形成する長いへリックスＣ中で作出した。三量体コイルドコイルは、この構造モチーフの特質である７残基リピート配列の４２０ａおよびｄ位におけるＩｌｅにより安定化されることが当分野において周知である（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）；Ｗｏｏｌｆｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５））。この知見を、Ｉｌｅを４２０位（Ｍ４２０Ｉ）および４２７位（Ｖ４２７Ｉ）において導入することにより適用した。これらの２つの突然変異およびｃｌｕｓｔｅｒ１の突然変異の組合せをｃｌｕｓｔｅｒ１１と命名し；分類のため、組合せを以下に列記する：
Ｍｉｎｉ１：欠失Ｌ６０からＫ２９０ ｃｌｕｓｔｅｒ１１：Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２７Ｉ、Ｌ５８Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｔ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ
Ｍｉｎｉ２：欠失Ｓ５３からＰ３２０ ｃｌｕｓｔｅｒ１１：Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２７Ｉ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ
Ｍｉｎｉ３：欠失Ｈ５４からＩ３０２ ｃｌｕｓｔｅｒ１１：Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２７Ｉ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｔ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ
Ｍｉｎｉ４：欠失Ｇ５６からＧ３１７ ｃｌｕｓｔｅｒ１１：Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２７Ｉ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ

【0199】

ステムドメインポリペプチドの融合前状態をさらに安定化させるため、追加のジスルフィド架橋を３２４および４３６位間に導入し（ｃｌｕｓｔｅｒ５：Ｒ３２４Ｃ、Ｔ４３６Ｃ）、異なる欠失突然変異体と組み合わせた。以下の組合せを合成し、上記のＦＡＣＳアッセイにおいて結合について試験した：
Ｍｉｎｉ１−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号９）
Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１０）
Ｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１１）
Ｍｉｎｉ４−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１２）
Ｍｉｎｉ１−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１３）
Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）
Ｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１５）
Ｍｉｎｉ４−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１６）

【0200】

比較の理由のため、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）も実験に含めた。結果を図５に示す。

【0201】

全ての場合において、ステムドメインポリペプチドは、ポリクローナル抗Ｈ１血清による処理後の陽性細胞の割合（９０％以上）により証明されるとおり、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞中への発現ベクターの形質移入後に細胞表面上に存在した。

【0202】

この実験における全てのＨＡステムドメインポリペプチドは、ＣＲ６２６１、ＣＲ６２５４、ＣＲ６３２８およびＣＲ９１１４により認識されたが、ＣＲ８０５７により認識されず；最後のものは予測される。それというのも、このｍＡｂは、Ｈ３ＨＡに特異的であるためである。しかしながら、異なる抗体について陽性の細胞の割合およびＭＦＩの明確な差が存在する。特性決定された最良の抗体は、エピトープの詳細が公知のＣＲ６２６１である。エピトープは不連続および立体構造的であり、したがって、この抗体の結合は、ＨＡステムドメインポリペプチドの正確なフォールディングのストリンジェントな試験としてみなすことができる。ＣＲ９１１４は、広域中和性であり、グループ１および２の両方からの株をカバーする（表３）。ＣＲ６３２８およびＣＲ６２５４のエピトープについて、詳細は公知でないが、％陽性細胞およびＭＦＩについて見出されるより高い値、ならびにデータのより小さい拡散に基づき、これらの抗体の結合は、ＣＲ６２６１よりも感受性が小さい、正確なフォールディングのプローブであると考えられる。

【0203】

陽性細胞の割合を比較（全ての抗体についてのデータを考慮）すると、Ｍｉｎｉ１から４構築物をランク付けすることができる（最大から最小％）
ｃｌｕｓｔｅｒ１１との組合せについてＭｉｎｉ２＞Ｍｉｎｉ１＞Ｍｉｎｉ４＞Ｍｉｎｉ３および
ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５との組合せについてＭｉｎｉ２＞Ｍｉｎｉ１＝Ｍｉｎｉ４＞Ｍｉｎｉ３

【0204】

このランク付けは、ＭＦＩに関するデータにおいても反映され、Ｍｉｎｉ２構築物、Ｓ５３からＰ３２０の欠失がこの組からの正確な立体構造で細胞表面上でディスプレイされる最大レベルのタンパク質をもたらすという結論をもたらす。

【0205】

ＭｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）をｍｉｎｉ１−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号９）と比較すると、追加の突然変異Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２７Ｉは、構築物の追加の安定化をもたらすと考えられず；どちらかと言えば、それらは、より低い陽性細胞の割合およびＭＦＩ値をもたらすが、差は小さい。

【0206】

ジスルフィド架橋の導入Ｒ３２４Ｃ、Ｔ４３６Ｃ（ｃｌｕｓｔｅｒ５）は、細胞表面上の正確にフォールドされたタンパク質の増加を、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１０）およびｍｉｎｉ４−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１２）についてもたらすが、ｍｉｎｉ１−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号９）およびｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１１）については最小の改善をもたらし、または改善をもたらさない。全体的な最良の結果は、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）について得られる。これは、特に、この構築物について全長構築物についての値の約５０％であるＭＦＩ値から明らかである。

【0207】

ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、ＨＡ２の５２３、５２４、５２５、５２６、５２６、５２７、５２８、５２９、または５３０位（またはそれらの相当物）からＣ末端の細胞質配列および膜貫通配列（配列番号１による番号付与）を除去し、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬ（配列番号１４３）を場合によりリンカーを介して連結させて導入することにより場合により置き換える。リンカーは、当業者に周知のプロトコルに従って後で処理するための開裂部位を場合により含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、短いリンカー、例えば、ＥＧＲを介して連結されたタグ配列、例えば、ｈｉｓタグＨＨＨＨＨＨＨを付加することができる。本発明によれば、ＨＡ２ドメインの５３０位（配列番号１による番号付与）からＣ末端アミノ酸のアミノ酸配列を除去し、配列番号８１または配列番号８２により置き換えた。

【0208】

実施例７
第２世代ＨＡステムドメインポリペプチドの免疫原性
実施例６のステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長Ｈ１（配列番号１）、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１０）、Ｍｉｎｉ１−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１３）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。ｃＭ２をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。

【0209】

４匹のマウス（ＢＡＬＢ＼ｃ）の群を、５０μｇの構築物＋５０μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）により筋肉内で１、２１および４２日目に免疫化した。４９日目、最後の採血を実施し、血清を回収した。全長ＨＡ０（配列番号１）、陰性対照ｃＭ２およびＭｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）も、約１０μｇの構築物＋約２μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）および同一の免疫化スキームを使用して遺伝子銃によりマウスの別個の群に投与した。血清を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７株からの全長ＨＡの組換えエクトドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから入手）を抗原として使用してＥｌｉｓａにより分析した。手短に述べると、９６ウェルプレートを５０ｎｇのＨＡにより４℃において一晩コートし、次いでブロック緩衝液（１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４＋２％のスキムミルク）と室温において１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０により洗浄し、血清の２０倍希釈から出発するブロック緩衝液中の１００μｌの２倍希釈系列を添加する。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、当分野において十分確立された標準的プロトコルを使用して結合抗体を検出した。ｍＡｂの３ＡＨ１ＩｎＡ１３４（Ｈｙｔｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して力価を標準曲線と比較してＥｌｉｓａ単位／ｍｌ（ＥＵ／ｍｌ）を導いた。

【0210】

２８および４９日後のＥｌｉｓａの結果を図６ＡおよびＢにそれぞれ示す。Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）をコードするＤＮＡにより免疫化されたマウスから得られた血清は、遺伝子銃を使用する免疫化２８および４９日後ならびにさらに筋肉内で免疫化した場合に４９日後にエクトドメイン全長ＨＡへの明確な結合を示す。Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１０）およびＭｉｎｉ１−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１３）について、応答は、４匹のマウスのうち１匹について検出された一方、ｍｉｎｉＨＡ−ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号３）について結合は検出されなかった。

【0211】

まとめると、データは、本発明のポリペプチドが全長ＨＡに対して指向される免疫応答を誘導し得ることを示す。特に、残基４０２〜４１８（配列番号１による番号付与）の領域中の改変、欠失Ｓ５３からＰ３２０は、ジスルフィド架橋Ｒ３２４Ｃ、Ｔ４３６Ｃとの組合せで、安定な分子を作出するために重要である。

【0212】

実施例８
第３世代ステムドメインポリペプチドの調製
ステムドメインポリペプチドの設計をさらに改善するため、第３の設計ラウンドを実行した。全長ＨＡ中で埋め込まれるが、ステムドメインポリペプチド中で埋め込まれない表面の親水性を増加させる追加の突然変異を、４１３位において導入し、Ｆ４１３Ｇ（配列番号１により番号付与）、ｃｌｕｓｔｅｒ６と命名した。このクラスターを、ｍｉｎｉ−２の欠失（Ｓ５３からＰ３２０）、ｃｌｕｓｔｅｒ５（Ｒ３２４Ｃ、Ｔ４３６Ｃ）のジスルフィド架橋およびｃｌｕｓｔｅｒ１（すなわち、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ；配列番号４６）またはｃｌｕｓｔｅｒ１１（Ｍ４２０Ｉ、Ｖ４２７Ｉ、Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ；配列番号４７）のいずれかの突然変異と組み合わせた。ｍｉｎｉ−２欠失（Ｓ５３からＰ３２０）とｃｌｕｓｔｅｒ１（Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓ）およびｃｌｕｓｔｅｒ５（Ｒ３２４Ｃ、Ｔ４３６Ｃ）との組合せも、参照のためにこの実験に含める（配列番号４８）。

【0213】

天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。本発明によれば、三量体コイルドコイルの形成のためのコンセンサス配列、ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥ（配列番号８３）が、本発明のポリペプチド中にＨ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７中の４１８から４３３位（配列番号４４）（配列番号１による番号付与）（の相当物）において導入される。代替例は、ＧＣＮ４に由来し、三量体化することが公知の配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号８４）を、４１９〜４３３位（配列番号４５）において導入することである。

【0214】

配列番号４４から配列番号４８により記載されるステムドメインポリペプチドの場合において、全てのタンパク質は、ポリクローナル抗Ｈ１血清による処理後の陽性細胞の割合（９０％以上）により証明されるとおり、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞中への発現ベクターの形質移入後に細胞表面上に存在した。結果を図７に示す。

【0215】

この実験における全てのＨＡステムドメインポリペプチドは、ｍｉｎｉＨＡ（配列番号２）を除き、ＣＲ６２６１、ＣＲ６３２８およびＣＲ９１１４により認識されたが、ＣＲ８０２０により認識されず；最後のものは予測される。それというのも、このｍＡｂは、Ｈ３ＨＡに特異的であるためである。陽性細胞の割合は、染色にＣＲ６２６１、ＣＲ６３２８およびＣＲ９１１４を使用してステムドメインポリペプチドについて約８０％であり、ポリクローナル抗Ｈ１血清によってのみ認識されるｍｉｎｉＨＡを除く。ここでも、これは、この特定の構築物の適切なフォールディングの欠損を示す。しかしながら、異なる抗体についてＭＦＩの明確な差が存在する。特性決定された最良の抗体は、エピトープの詳細が公知のＣＲ６２６１である。エピトープは不連続および立体構造的であり、したがって、この抗体の結合は、ＨＡステムドメインポリペプチドの正確なフォールディングのストリンジェントな試験としてみなすことができる。ＣＲ９１１４は、広域中和性であり、グループ１および２の両方からの株をカバーする（表３）。ＣＲ６３２８のエピトープについて、詳細は公知でないが、全長ＨＡに関する結合試験においてＣＲ６２６１との競合が観察される。

【0216】

実験において使用されるモノクローナル抗体にかかわらず、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１１＋５（配列番号１４）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１＋５（配列番号４８）、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１＋５＋６（配列番号４６）およびＨ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌ１１＋５＋６（配列番号４７）についてのＭＦＩは極めて類似する。コンセンサス三量体化ドメイン（配列番号４４）残基の包含は、三量体化ドメインを有さない相当配列（すなわち、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６；配列番号４６）と比較してＭＦＩを３から４倍だけ低減させるが、結果は、依然として頭部ドメインの欠失後のステムポリペプチドの改変の不存在下よりも明らかに良好である（ｍｉｎｉＨＡ結果参照）。ＧＣＮ４三量体化配列（配列番号４５）の付加は、ＭＦＩを全長タンパク質と同等のレベルに増加させる。

【0217】

実施例９
ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の保存ステムドメインエピトープを含むさらなるステムドメインポリペプチドの設計
上記の手順に従って設計された本発明のポリペプチドは、安定性を増加させるためにさらに改変することができる。このような改変は、単量体および／または二量体種と比べて本発明のポリペプチドの三量体形態の形成を向上させるために導入することができる。上記のとおり、天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。

【0218】

本発明によれば、三量体コイルドコイルの形成のためのコンセンサス配列、ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥ（配列番号８３）を、本発明のポリペプチド中にＨ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７中の４１８から４３３位（配列番号４４）（配列番号１による番号付与）（の相当物）において導入した。あるいは、ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩ（配列番号８５）を４１９〜４３３（配列番号４９）において、またはＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫ（配列番号８６）を４２０〜４３３（配列番号５０）において導入することができる。代替例は、ＧＣＮ４に由来し、三量体化することが公知の配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号８４）を、４１９〜４３３位（配列番号４５）において導入することである。あるいは、ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号８７）を４２０〜４３３位（配列番号５１）において、またはＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号８８）を４１７〜４３３位（配列番号５２）において導入することができる。同様に、三量体界面は、Ｍ４２０、Ｌ４２３、Ｖ４２７、Ｇ４３０をイソロイシンに改変することにより増強される（配列番号５３）。

【0219】

全てのペプチドは、ＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１に結合することが示された。

【0220】

ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、上記のとおりシグナル配列および／またはＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有しない。

【0221】

実施例１０
Ｈ７ＨＡをベースとするＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドの設計
本発明のポリペプチドを設計する上記の手順を、Ｈ７にも適用した。この実施例において、血清型Ｈ７に基づく本発明のポリペプチドの設計を記載する。Ｈ７インフルエンザウイルスＡ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／１２／２０００のＨＡ（配列番号３１）を親配列として使用したが、当業者は、他のＨ７配列の使用も同様に可能であったことを理解する。それというのも、この配列は特にステム領域が十分保存されるためである。

【0222】

配列の第１の改変は、ＲをＱに突然変異（Ｒ３３９Ｑ）させることにより３３９位（番号付与は、配列番号３１を指すにおける開裂部位を除去してＨＡ０からのＨＡ１およびＨＡ２の形成を防止することである。場合により、残基３４１から３４５（ＬＦＧＡＩ、融合ペプチドの一部）をさらに欠失させて水性溶媒への疎水性残基の曝露を最小化することができる。開裂における陽性電荷はＨ７において１００％保存され、したがって、この突然変異は全ての配列中に適用することができる。

【0223】

第２の改変は、ＨＡ１配列の大部分を欠失させ、ＮおよびＣ末端配列を短いリンカーを介して再連結させることにより頭部ドメインを除去することである。欠失は、長さを変えることができるが、結合配列を介する歪みの導入を回避するためにＨＡ１のＮ末端配列の最後の残基およびＣ末端配列の最初の残基が空間的に近接することが好ましい。Ｈ７配列において、欠失は、Ｈ７Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／１２／２０００（配列番号３１）中のＲ５３〜Ｐ３１５（ｍｉｎｉ２；配列番号３３）（の相当位置）において導入することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。配列の残留部分を直接的に結合させることができ、またはフレキシブルリンカーを導入することができる。リンカー配列は、１から５０アミノ酸長であり得る。限定された長さ（１０アミノ酸以下）のフレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡ、ＧＳＡＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧまたは類似物が好ましい。

【0224】

配列番号４０は、Ｔ５４〜Ｃ３１４を欠失するそのような本発明のポリペプチド（ｍｉｎｉ５；配列番号４０）を記載する。上記の欠失は、残基２８０〜３１０により形成される非構造化領域も除去されることを確保し；これは、本発明のポリペプチドの全安定性に有益である。類似の効果がＨ１配列に由来する本発明のポリペプチドについて観察された（上記参照）。

【0225】

頭部ドメインの欠失により、残基３９４〜４１４のループが水性溶媒に目下曝露されたままとなる。Ｈ７ＨＡにおいて、このループは高度に保存される（表７参照）。コンセンサス配列は：ＬＩ（Ｅ／Ｄ／Ｇ）ＫＴＮＱＱＦＥＬＩＤＮＥＦ（Ｎ／Ｔ／Ｓ）Ｅ（Ｉ／Ｖ）Ｅ（Ｑ／Ｋ）（配列番号３２）である。

【0226】

融合前立体構造の本発明のポリペプチドのためにこのループの溶解度を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるため、いくつかの疎水性残基を極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電アミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）に改変し、またはＧへの突然変異によりフレキシビリティを増加させた。具体的には、４０２、４０４、４０５、４０９、４１２位（番号付与は、配列番号３１を指す）における突然変異は、本発明のポリペプチドの安定性に寄与する。

【0227】

Ｆ４０２およびＦ４０９位について、Ｓへの突然変異が好ましいが、他の極性（Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）および高度にフレキシブルなアミノ酸（Ｇ）が同一効果を有する。４０４位（９６％Ｌ）について、ＮまたはＳへの突然変異が好ましく；後者のアミノ酸は低頻度ではあるが天然でも生じ、その場合、この位置の突然変異は不要である。他の極性（Ｔ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）および高度にフレキシブルなアミノ酸（Ｇ）は、同一効果を有する。４０５位（９９％Ｉ）について、ＴまたはＤへの突然変異が好ましい。Ｄも天然で生じ、その場合、この位置の突然変異は不要である。他の極性（Ｓ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、）および高度にフレキシブルなアミノ酸（Ｇ）は、同一効果を有する。４１２位（ＩまたはＶ）について、Ｎへの突然変異が好ましいが、他の極性（Ｓ、Ｔ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）またはフレキシブル（Ｇ）残基も可能である。したがって、ポリペプチドは上記の突然変異の少なくとも１つを含有する。例えば、配列番号３４〜３９および４１〜４３に示されるとおり、２つ以上の突然変異の組合せも適用した。

【0228】

本発明のポリペプチドの融合前立体構造を安定化させるため、一次配列中で遠位であるがフォールドした融合前立体構造中で近い２つの部分間に共有結合を導入した。この目的のため、ジスルフィド架橋を本発明のポリペプチド中で、好ましくは、Ｈ７Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／１２／２０００（配列番号３６〜３９、４２、４３）中の３１９および４３２位（の相当物）間で遺伝子操作した。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。

【0229】

上記のとおり、天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。三量体コイルドコイルは、この構造モチーフの特質である７残基リピート配列のａおよびｄ位におけるＩｌｅにより安定化されることが当分野において周知である。ここで、この知見を、Ｉｌｅを４１９、４２３、４２６および４３０位（配列番号３８、４３）（の相当物）において導入することにより適用した。あるいは、三量体コイルドコイルの形成のためのコンセンサス配列ＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩを、４１７から４２６位（配列番号３９）（の相当物）において導入する。

【0230】

これらの配列（配列番号３３〜４３）を、上記の蛍光結合細胞選別アッセイに供した。しかしながら、モノクローナル抗体ＣＲ８０２０も、ＣＲ８０４３も、ＣＲ９１１４も、ＣＲ８９５７も、その結合を検出することができなかった。本発明者らは、これらの配列はこれらの抗体のエピトープを提示せず、結果的に細胞膜上に存在するタンパク質がそれらの天然三次元構造にフォールドされないことを結論づけた。

【0231】

実施例１１
Ｈ３ＨＡをベースとするＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３およびＣＲ９１１４の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドの設計
第１のステップにおいて、本発明のポリペプチドを表す配列を、親配列としてのＨ３Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５からのＨＡ（配列番号８９）を使用してＳｔｅｅｌら（Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ ２０１０）による記載と類似させて構築した。ＨＡの頭部をアミノ酸Ｄ６９からアミノ酸Ｋ２９２のＨＡ１の一部の欠失により除去する。

【0232】

これらの残基を３または４つのＧｌｙにより置き換えることができる。４ＧｌｙリンカーがＳｔｅｅｌらにより試験され、良好な発現結果が生じ、ここで採用してｍｉｎｉ−Ｈ３（配列番号９０）を作出した。全長ＨＡタンパク質についての正常の翻訳後プロセシングステップであるポリペプチド鎖の開裂を防止するため、３４５位（アルギニン）における開裂部位をグルタミンに突然変異させた（Ｒ３４５Ｑ）。

【0233】

次に、構築されたｍｉｎｉ−ＨＡおよび融合後立体構造の両方のそれぞれの残基の接近可能な表面積をＢｒｕｇｅｌにより計算した。それぞれの残基の曝露および埋込の程度を、Ｓａｍａｎｔｈａら（Ｓａｍａｎｔｈａ ｅｔ ａｌ．，２００２）に記載のとおり決定した。融合前立体構造中で曝露され、融合後立体構造中で埋め込まれる残基に焦点を当てた。これらの残基のさらなる分析は、これらの一部を、突然変異が融合前立体構造に対する影響を有さず、融合後立体構造を脱安定化させるように改変させることができることが示す。一般に、これらの残基は、疎水性鎖を有し、融合後立体構造中のコイルドコイルの形成に関与する。親水性側鎖を含めるためのこれらの残基の突然変異は、コイルドコイル特性を撹乱し（コイルドコイル中のへリックス間の接触は、一般に、疎水性である）、したがって融合後立体構造を脱安定化させる。融合前立体構造中で曝露され、融合立体構造中で埋め込まれ、突然変異後に融合後立体構造に対する脱安定化効果を有することが予測される残基は、Ｌ３９７、Ｉ４０１およびＬ４２５（配列番号８９による番号付与）である。ここでは、Ｌ３９７ＫおよびＩ４０１Ｔを含める。

【0234】

へリックスＡ（残基３８３から４００）を中央へリックスＣＤ（残基４２１から４７０）と連結するループ（Ｂループ、残基４０１から４２０）は、融合後状態の採用時に立体構造を変化させ；それはヘリカルになり、伸長された三量体コイルドコイルの一部である。このリンカーの融合前ループ立体構造を安定化させ、および／またはその融合後立体構造を脱安定化させるため、コイルドコイルのコアの形成に関与する全ての残基を突然変異させることが十分なはずであることが推定された。Ｎ４０５位について、いくつかの突然変異、特に負電荷を担持する残基を設計する（ＡｓｐおよびＧｌｕ、Ｎ４０５Ｄ、Ｎ４０５Ｅ）。それというのも、この余剰電荷は、融合前立体構造中で観察されるイオンネットワークを強化するためである。中性Ａｌａへの突然変異（Ｎ４０５Ａ）もこの試験に含める。本発明者らはまた、Ｐｈｅ４０８をＴｈｒに、Ｈｉｓ４０９をＳｅｒに、およびＶａｌ４１８をＳｅｒに（配列番号８９による番号付与；Ｆ４０８Ｔ、Ｈ４０９Ｓ、Ｖ４１８Ｓ）に突然変異させて頭部ドメインの除去後に新たに曝露される表面の溶解度をさらに増加させた。

【0235】

ＨＡを融合前立体構造で固定するために５つのジスルフィド架橋を設計した。これらの架橋は、互いから空間的に適切な距離において存在し、ジスルフィド架橋を形成させるために既に正確な位置においてＣβ原子を有する残基間で形成させる。これらを、３２０および４０６位間（Ａ３２０Ｃ、Ｅ４０６Ｃ；配列番号８９による番号付与）、３２６および４３８位間（Ｋ３２６Ｃ、Ｓ４３８Ｃ）および４１５および４２３位間（Ｆ４１５Ｃ、Ｑ４２３Ｃ）に導入する。最初の２つは、鎖のＨＡ１およびＨＡ２部分間の架橋である一方、最後のものはＢループの頂部を一緒に共有結合的に連結する。Ｋ３２６Ｃ、Ｓ４３８Ｃジスルフィド架橋には、Ａｓｐ４３５のＡｌａへ突然変異（Ｄ４３５Ａ）が付随する。ジスルフィド架橋Ｆ３４７Ｃ／Ｎ４６１ＣおよびＳ３８５Ｃ／Ｌ４６３ＣをＢｏｍｍａｋａｎｔｉ ｅｔ ａｌ（２０１０）による論文から採択し、それも試験において使用した。

【0236】

新たに曝露される疎水性残基を溶媒から除去するため、いくつかの追加の突然変異を設計する。６７位（配列番号８９による番号付与）におけるＩｌｅをＴｈｒに突然変異させる（Ｉ６７Ｔ）。この突然変異は、側鎖のベータ分枝を維持するが、疎水性残基を表面から除去する。同じことは、Ｉｌｅ２９８のＴｈｒへの突然変異（Ｉ２９８Ｔ）について述べることができる。別の突然変異を天然配列中の３１６位のイソロイシンにおいて導入する。直観的に、この残基をＴｈｒに突然変異させてベータ分枝を維持するが疎水性を表面から除去することが提案される。しかしながら、この突然変異は、余剰Ｎ−グリコシル化部位（３１４位は、Ａｓｎである）の導入をもたらし、したがって、Ｇｌｎへの突然変異を導入する（Ｉ３１６Ｑ）。

【0237】

Ｇｌｙ４９５もＧｌｕに突然変異させた（Ｇ４９５Ｅ）。この突然変異は、イオン架橋を導入するために設計する。それというのも、陽性電荷が周囲に存在するためである。天然でＧｌｕをこの位置に有する一部のＨ３株が既に提供された。

【0238】

ＨＡの重要な残基は３４５位（Ａｒｇ）である。それというのも、この残基はプロテアーゼ開裂が生じてタンパク質融合を可能にする位置であるためである。このＡｒｇのＧｌｎへの突然変異（Ｒ３４５Ｑ）は、開裂が生じることを防止し、それによりタンパク質を融合前状態で固定する。

【0239】

上記の突然変異を下記のとおりクラスター化した：
Ｃｌｕｓｔｅｒ１：Ｉ６７Ｔ、Ｉ９８Ｔ、Ｉ３１６Ｑ、Ｆ４０８Ｔ、Ｈ４０９Ｓ、Ｖ４１８Ｓ
Ｃｌｕｓｔｅｒ２：Ａ３２０Ｃ、Ｅ４０６Ｃ
Ｃｌｕｓｔｅｒ３ Ｋ３２６Ｃ、Ｄ４３５Ａ、Ｓ４３８Ｃ
Ｃｌｕｓｔｅｒ４ Ｌ３９７Ｋ、Ｉ４０１Ｔ
Ｃｌｕｓｔｅｒ５ Ｎ４０５ＤまたはＮ４０５ＥまたはＮ４０５Ａ
Ｃｌｕｓｔｅｒ６ Ｆ４１５Ｃ、Ｑ４２３Ｃ
Ｃｌｕｓｔｅｒ７ Ｇ４９５Ｅ
Ｃｌｕｓｔｅｒ８ Ｆ３４７Ｃ、Ｓ３８５Ｃ、Ｎ４６１Ｃ、Ｌ４６３Ｃ

【0240】

本発明のポリペプチドを得るため、クラスターを下記のスキームに従って欠失Ｄ６９からＫ２９２およびＲ３４５Ｑ突然変異と組み合わせた。
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１（配列番号９１）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋２（配列番号９２）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋３（配列番号９３）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋４（配列番号９４）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５Ｎ４０５Ａ（配列番号９５）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５Ｎ４０５Ｄ（配列番号９６）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５Ｎ４０５Ｅ（配列番号９７）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋６（配列番号９８）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋７（配列番号９９）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋２＋３＋４＋５＋６＋７−Ｎ４０５Ｅ（配列番号１００）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋２＋３＋４＋５＋６＋７−Ｎ４０５Ａ（配列番号１０１）Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋２＋３＋４＋５＋６＋７−Ｎ４０５Ｄ（配列番号１０２）
Ｈ３ Ｍｉｎｉ−ＨＡ ｃｌｕｓｔｅｒ１＋８（配列番号１０３）

【0241】

一般に当業者に公知の方法を使用して上記のタンパク質配列をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４中にクローニングした。比較の理由のため、Ｈ３Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５の全長ＨＡ配列、および開裂部位突然変異Ｒ３４３Ｑを含有するＨ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７の全長ＨＡ配列を実験に含めた。

【0242】

形質移入剤として４０μｌの２９３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎを使用してＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）懸濁細胞（１０^６個の細胞／ｍｌ、３０ｍｌ）に発現ベクター（１μｇ／ｍｌ）を形質移入させ、さらに２日間増殖させた。細胞を回収し、アリコート化し（０．３ｍｌ、約３^＊１０^５個の細胞）、アリコートを、発現を調べるためのＨ３ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）に対して生じたポリクローナル血清またはＨＡ特異的モノクローナル抗体（５マイクログラム／ｍｌ）のいずれかおよび染色に使用される二次抗体により処理した。次いで、発現を調べるためのＨ３ＨＡまたはＨ１ＨＡに対して生じたポリクローナル血清を使用して細胞を本発明の膜付着ＨＡステムドメインポリペプチドの発現について蛍光結合細胞選別（ＦＡＣＳ）により分析した。全長タンパク質に結合する公知の特異性のモノクローナル抗体のパネル（ＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３およびＣＲ９１１４）を使用して保存エピトープの存在、ならびに推論により全長ＨＡおよび本発明のｍｉｎｉ−ＨＡポリペプチドの正確なフォールディングを調べた。モノクローナル抗体ＣＲ６２６１（Ｈ３ＨＡに結合しないことが公知）およびＣＲ８０５７（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５からのＨＡの頭部ドメインに結合する）も実験に含めた。結果を陽性細胞の割合として表現し、図８に示す。

【0243】

結果は、全ての構築物が細胞表面上で発現されることを示す。それというのも、Ｈ３ポリクローナル血清との反応が、未形質移入細胞についての４％未満と比較してＨ３ベース配列について全ての分析細胞の８０〜９０％および全長Ｈ１配列について５０％超が陽性であることをもたらすためである。抗Ｈ１ポリクローナルを使用すると、全ての細胞の６０〜７０％が陽性であり、但し１００％アプローチする全長Ｈ１配列を除く。標識抗ヒトまたは抗ウサギＩｇＧのみを使用するＩｇＧの不存在下の対照実験は、全て陰性である。Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７全長ＨＡタンパク質の両方は、この両方の株を中和し得ることが公知のモノクローナル抗体ＣＲ９１１４により認識される。Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５全長ＨＡは、ＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３、およびＣＲ８０５７（一部のＨ３株にのみ結合する、国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）にさらに結合するが、ＣＲ６２６１（Ｔｈｒｏｓｂｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット）には結合しない。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長ＨＡについては逆のことが当てはまり；それはＣＲ６２６１に結合するが、ＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３およびＣＲ８０５７には結合しない。

【0244】

配列番号９１から配列番号１０３に記載のポリペプチドは、図８においてバックグラウンドを上回るシグナルの欠落により証明されるとおり、いずれの場合にもＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３およびＣＲ９１１４に結合し得ない。したがって、これらの配列は、これらの抗体のエピトープを提示しないこと、および結果的に細胞膜上に存在するタンパク質がそれらの天然三次元構造にフォールドされないことが結論づけられた。

【0245】

実施例１２
Ｈ３ＨＡをベースとするＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３およびＣＲ９１１４の保存ステムドメインエピトープを含むさらなるステムドメインポリペプチドの設計
この実施例において、血清型Ｈ３に基づく本発明のさらなるポリペプチドの設計を記載する。Ｈ３インフルエンザウイルスＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）およびＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（配列番号１２１）のＨＡを親配列として使用した。

【0246】

第１の配列の改変は、ＲをＱに突然変異（Ｒ３４５Ｑ）させることにより３４５位（番号付与は、配列番号８９を指すにおける開裂部位を除去してＨＡ０からのＨＡ１およびＨＡ２の形成を防止することである。場合により、残基３４７〜３５１（ＩＦＧＡＩ、融合ペプチドの一部）をさらに欠失させて水性溶媒への疎水性残基の曝露を最小化することができる。開裂における陽性電荷はＨ３において１００％保存され、したがって、この突然変異は全ての配列中に適用することができる。

【0247】

第２の改変は、ＨＡ１配列の大部分を欠失させ、ＮおよびＣ末端配列を短いリンカーを介して再連結させることにより頭部ドメインを除去することである。欠失は、長さを変えることができるが、結合配列を介する歪みの導入を回避するため、ＨＡ１のＮ末端配列の最後の残基およびＣ末端配列の最初の残基が空間的に近接することが好ましい。Ｈ３配列において、欠失は、Ｓ６２〜Ｐ３２２（ｍｉｎｉ２；配列番号１０５）、Ｓ６３〜Ｐ３０５（ｍｉｎｉ３；配列番号１１９）およびＴ６４〜Ｔ３１７（ｍｉｎｉ４；配列番号１２０（の相当位置）において導入することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。配列の残留部分を直接的に結合させることができ、またはフレキシブルリンカーを導入することができる。リンカー配列は、１から５０アミノ酸長であり得る。限定された長さ（１０アミノ酸以下）のフレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡ、ＧＳＡＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧまたは類似物が好ましい。欠失の長さは、例えば、欠失を６３、６４、６５、６６、６７位（の相当物）において開始することにより欠失の残基数を減少させることにより、または欠失の長さを増加させるため、５７、５８、５９、６０もしくは６１位において切断することにより変えることもできる。同様に、欠失させるべき最後のアミノ酸は、３１７、３１８、３１９、３２０もしくは３２１位（の相当物）におけるもの、または欠失の長さを増加させるため、３２３、３２４、３２５、３２６、もしくは３２７位（の相当物）におけるものであり得る。欠失の長さの変化は、リンカー配列の長さを合致させることにより部分的に補うことができることを理解することは重要であり、すなわち、より大きい欠失はより長いリンカーと合致させることができ、逆もまた同様である。これらのポリペプチドも本発明により包含される。

【0248】

頭部ドメインの欠失により、残基４００〜４２０のＢループが水性溶媒に目下曝露されたままとなる。Ｈ３ＨＡにおいて、このループは高度に保存される（表９参照）。コンセンサス配列は：４０１Ｉ（Ｅ／Ｇ）ＫＴＮＥＫＦＨＱＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧＲ４２１（配列番号１０４；番号付与は、配列番号８９を指す）である。融合前立体構造の本発明のポリペプチドのためにこのループの溶解度を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるため、いくつかの疎水性残基を極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電アミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）に改変しなければならず、またはＧへの突然変異によりフレキシビリティを増加させなければならない。具体的には、４０１、４０８、４１１、４１５、４１８位（番号付与は、配列番号８９を指す）における突然変異は、本発明のポリペプチドの安定性に寄与する。

【0249】

Ｆ４０８およびＦ４１５位について、Ｓへの突然変異が好ましいが、他の極性（Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）および高度にフレキシブルなアミノ酸（Ｇ）が同一効果を有する。４１１位（Ｉ）について、Ｔへの突然変異が好ましく；他の極性（Ｓ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）および高度にフレキシブルなアミノ酸（Ｇ）は、同一効果を有し、したがってこれも本発明に含まれる。４１８位（Ｖ）について、Ｇへの突然変異が好ましい。他の極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）は、同一効果を有し、したがって、これも本発明に含まれる。４０１位（Ｉ）について、Ｒへの突然変異が好ましいが、他の極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）またはフレキシブル（Ｇ）残基も可能である。したがって、本発明のポリペプチドは上記の突然変異の少なくとも１つを含有する。例えば、配列番号１２３〜１２７および１２９〜１３１に示されるとおり、２つ以上の突然変異の組合せも可能である。

【0250】

本発明のポリペプチドの融合前立体構造を安定化させるため、一次配列中で遠位であるがフォールドした融合前立体構造中で近い２つの部分間に共有結合を導入する。この目的のため、ジスルフィド架橋を本発明のポリペプチド中で、好ましくは、Ｈ３Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）中の３２６および４３８位（の相当物）間で遺伝子操作する。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。代替的なシステイン架橋をＨ３Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）中の３３４および３９３位（の相当物）間にこれらの残基のシステインへの突然変異により作出することができる。一部の場合、３２１位（の相当物）におけるシステインをグリシンに改変して不所望なジスルフィド架橋の形成を回避する。

【0251】

天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。三量体コイルドコイルの形成のためのコンセンサス配列、ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫを、４２１〜４４１位（の相当物）において導入する。３２６〜４３８位のジスルフィド架橋の形成の妨害を回避するため、代替的なより短い配列ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩも４２１〜４３５位（の相当物）において使用した。代替例は、ＧＣＮ４に由来し、三量体化することが公知の配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮを４２１〜４４１位において、またはより短い配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫを４２１〜４３５位において導入することである。

【0252】

本発明のポリペプチドは、得られるポリペプチドが細胞中での発現時に細胞表面上に提示されるようにＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有し得る。他の実施形態において、５２２位（の相当物）からＣ末端の細胞質配列および膜貫通配列は、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中での発現後に産生されるように除去されている。場合により、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８または５２９（の相当物）から配列を欠失させることによりいくつかの追加の残基を可溶性タンパク質中に含めることができる。可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬ（配列番号１４３）（「ｆｏｌｄｏｎ」配列）を場合によりリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化させることができる。リンカーは、当業者に周知のプロトコルに従って後で処理するための開裂部位を場合により含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、短いリンカー、例えば、ＥＧＲを介して連結されたタグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ）を付加することができる。一部の実施形態において、リンカーおよびｈｉｓタグ配列は、ｆｏｌｄｏｎ配列を存在させることなく付加する。

【0253】

ＨＡの重要な残基は３４５位（Ａｒｇ）である。それというのも、この残基は、プロテアーゼ開裂が生じてタンパク質融合を可能にする位置であるためである。このＡｒｇのＧｌｎへの突然変異（Ｒ３４５Ｑ）は、開裂が生じることを防止し、それによりタンパク質を融合前状態で固定する。

【0254】

上記の突然変異を下記のとおりクラスター化した：
Ｃｌｕｓｔｅｒ９ Ｆ４０８Ｓ、Ｉ４１１Ｔ、Ｆ４１５Ｓ
Ｃｌｕｓｔｅｒ１０ Ｖ４１８Ｇ
Ｃｌｕｓｔｅｒ１１ Ｉ４０１Ｒ
Ｃｌｕｓｔｅｒ１２ Ｋ３２６Ｃ、Ｓ４３８Ｃ
Ｃｌｕｓｔｅｒ１３ Ｔ３３４Ｃ、Ｉ３９３Ｃ
Ｃｌｕｓｔｅｒ１４ Ｃ３２１Ｇ
ＧＣＮ４ ４２１から４４１位におけるＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮ
または４２１から４３５位におけるＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ
ｔｒｉ ４２１から４４１位におけるＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫ
または４２１から４３５位におけるＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩ

【0255】

Ｈ３Ｎ２Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５からの全長ＨＡの配列を出発点として使用して、上記のクラスターをＳ６２〜Ｐ３２２欠失（ｍｉｎｉ２；配列番号１０５）と組み合わせて本発明のポリペプチドを得た。
配列番号１０５：Ｈ３−ｍｉｎｉ２
配列番号１０６：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０
配列番号１０７：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１１
配列番号１０８：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１
配列番号１０９：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１−ｔｒｉ（４２１〜４４１位におけるｔｒｉ配列）
配列番号１１０：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１−ＧＣＮ４（４２１〜４４１位におけるＧＣＮ４配列）
配列番号１１１：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２
配列番号１１２：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１２
配列番号１１３：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４（４２１〜４３５位における短いＧＣＮ４配列）
配列番号１１４：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ｔｒｉ（４２１〜４３５位における短いｔｒｉ配列）
配列番号１１５：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１３
配列番号１１６：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１３
配列番号１１７：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１３−ＧＣＮ４（４２１〜４４１位におけるＧＣＮ４配列）
配列番号１１８：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１３−ｔｒｉ（４２１〜４４１位におけるｔｒｉ配列）

【0256】

さらに、欠失Ｓ６３〜Ｐ３０５（ｍｉｎｉ３）およびＴ６４〜Ｔ３１７（ｍｉｎｉ４）を、ｃｌｕｓｔｅｒ９、１０、１１および１４と組み合わせて本発明のポリペプチドを作出した。
配列番号１１９：Ｈ３−ｍｉｎｉ３−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２＋１４
配列番号１２０：Ｈ３−ｍｉｎｉ４−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２＋１４

【0257】

Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からの全長ＨＡの配列を出発点として使用して、上記のクラスターをＳ６２〜Ｐ３２２欠失と組み合わせて本発明のポリペプチドを得た。
配列番号１２１：Ｈ３ Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８
配列番号１２２：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９
配列番号１２３：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０
配列番号１２４：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１
配列番号１２５：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１２
配列番号１２６：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２
配列番号１２７：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１３
配列番号１２８：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ｔｒｉ（４２１〜４３５位における短いｔｒｉ配列）
配列番号１２９：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１３−ｔｒｉ（４２１〜４４１位におけるｔｒｉ配列）
配列番号１３０：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４（４２１〜４３５位における短いＧＣＮ４配列）
配列番号１３１：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１３−ＧＣＮ４（４２１〜４４１位におけるＧＣＮ４配列）。

【0258】

一般に当業者に公知の方法を使用して上記のタンパク質配列をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４中にクローニングした。比較の理由のため、Ｈ３Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５、および／またはＨ３Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８の全長ＨＡ配列を実験に含めた。

【0259】

形質移入剤として４０μｌの２９３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎを使用してＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）懸濁細胞（１０^６個の細胞／ｍｌ、３０ｍｌ）に発現ベクター（１μｇ／ｍｌ）を形質移入させ、さらに２日間増殖させた。細胞を回収し、アリコート化し（０．３ｍｌ、約３^＊１０^５個の細胞）、アリコートを、発現を調べるためのＨ３ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）に対して生じたポリクローナル血清またはＨＡ特異的モノクローナル抗体（５マイクログラム／ｍｌ）のいずれかおよび染色に使用される二次抗体により処理した。次いで、発現を調べるためのＨ３ＨＡまたはＨ１ＨＡに対して生じたポリクローナル血清を使用して細胞を本発明の膜付着ＨＡステムドメインポリペプチドの発現について蛍光結合細胞選別（ＦＡＣＳ）により分析した。全長タンパク質に結合する公知の特異性のモノクローナル抗体のパネル（ＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３およびＣＲ９１１４）を使用して保存エピトープの存在、ならびに推論により全長ＨＡおよび本発明のｍｉｎｉ−ＨＡポリペプチドの正確なフォールディングを調べた。モノクローナル抗体ＣＲ６２６１（Ｈ３ＨＡに結合しないことが公知）およびＣＲ８０５７（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５からのＨＡの頭部ドメインに結合する）も実験に含めた。結果を陽性細胞の割合として表現し、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５のＨ３ＨＡベース配列については図９に示し、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８のＨ３ＨＡベース配列については図１０に示す。

【0260】

結果は、全てのＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５ベース構築物（図９）が細胞表面上で発現されることを示す。それというのも、Ｈ３ポリクローナル血清との反応が、未形質移入細胞についての５％未満と比較して全ての分析細胞の約８０％以上が陽性であることをもたらすためである。標識抗ヒトまたは抗ウサギＩｇＧのみを使用するＩｇＧの不存在下の対照実験は、全て陰性である。Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５全長ＨＡは、このタンパク質に結合し得ることが公知のモノクローナル抗体ＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３、ＣＲ８０５７（一部のＨ３株にのみ結合する、国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）およびＣＲ９１１４により認識されるが、ｍＡｂのＣＲ６２６１により認識されない。対照的に、ステムドメインポリペプチドのほとんどが、ＣＲ８０２０によっても、ＣＲ８０４３によっても、ＣＲ９１１４によっても認識されないが、いくつかの明らかな例外がある。ｃｌｕｓｔｅｒ１２突然変異を含むポリペプチドは、ＣＲ８０２０および／またはＣＲ８０４３により認識された。Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２（配列番号１１１）、Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１２（配列番号１１２）、Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４（配列番号１１３）およびＨ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ｔｒｉ（配列番号１１４）は、ＣＲ８０２０（約１０〜６０％の範囲の陽性細胞の割合）およびＣＲ８０４３（４０〜７０％）（矢印により示す）による認識を示す。４つの陽性構築物のうち、このアッセイにおいてＨ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４（配列番号１１３）が最大応答を示す。同一の結果が、パネルＢにおいて示される平均蛍光強度から得られる（図９）。Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２（配列番号１１１）、Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１２（配列番号１１２）、Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４（配列番号１１３）およびＨ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ｔｒｉ（配列番号１１４）は、ＣＲ８０２０およびＣＲ８０４３への曝露および染色後にバックグラウンドを十分上回る平均蛍光強度を示し、Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４（配列番号１１３）について最大応答を示す。Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５からのＨＡをベースとするポリペプチドはいずれも、ＣＲ９１１４を認識し得ない。

【0261】

図１０は、全てのＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８ベース構築物（図１０）が細胞表面上で発現されることを示す。それというのも、ほとんどの構築物についてのＨ３ポリクローナル血清との反応が、未形質移入細胞についての５％未満と比較して全ての分析細胞の約４０〜６０％が陽性であることをもたらすためである。標識抗ヒトまたは抗ウサギＩｇＧのみを使用するＩｇＧの不存在下の対照実験は、全て陰性である。ポリクローナル血清による処理後のＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からの全長タンパク質についての陽性細胞の割合は低い（約１０％）が、ＣＲ８０２０、ＣＲ８０４３およびＣＲ９１１４の結合から得られる強力なシグナルは、タンパク質が細胞表面上に存在することを示す。ＣＲ８０５７は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８ベース配列を認識せず、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５からの全長タンパク質のみを認識する。４つの構築物（ｃｌｕｓｔｅｒ１２突然変異を含有）、すなわち、ＨＫ６８ Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１２（配列番号１２５）、ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２（配列番号１２６）、ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ｔｒｉ（４２１〜４３５位における短縮ｔｒｉ配列を含有する配列番号１２８）およびＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４（４２１〜４３５位における短いＧＣＮ４配列を含有する配列番号１３０）が、％陽性細胞（１５％以上）およびバックグラウンドを明確に上回るＭＦＩにより示されるとおり、ＣＲ８０２０およびＣＲ８０４３により認識される。最大シグナル（ＭＦＩ）は、ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４（配列番号１３０）について得られ；このステムドメインポリペプチド構築物もＣＲ９１１４への検出可能な結合を示す。

【0262】

まとめると、本発明者らは、上記の方法に従って、本発明のステムドメインポリペプチドをグループ２の血清型、特にＨ３亜型のインフルエンザＡウイルスについて得ることができることを示した。

【0263】

実施例１３
保存ステムドメインエピトープを含む可溶性ステムドメインポリペプチドの設計、発現および部分精製
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、得られるポリペプチドが細胞中での発現時に細胞表面上に提示されるようにＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、ＨＡ２の５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９または５３０位（配列番号１による番号付与）（の相当物）からＣ末端の細胞質配列および膜貫通配列は、細胞中での発現が、例えば、ワクチンにおいて使用することができる分泌（可溶性）ポリペプチドをもたらすように除去した。可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列（「ｆｏｌｄｏｎ」としても公知）、すなわち、ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬ（配列番号１４３）を場合によりリンカー（例えば、ＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ）を介して連結させて導入することによりさらに安定化させることができる。リンカーは、当業者に周知のプロトコルに従って精製後に処理するための開裂部位を場合により含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、短いリンカー、例えば、ＥＧＲを介して連結されたタグ配列、例えば、ヒスチジンタグ（６または７つの連続ヒスチジン）を付加することができる。一部の実施形態において、リンカーおよびヒスチジンタグは、ｆｏｌｄｏｎ配列を存在させることなく付加する。

【0264】

本発明によれば、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長ＨＡのＨＡ２ドメインの５３０位（配列番号１による番号付与）からＣ末端アミノ酸のアミノ酸配列を除去し、短いリンカーおよびヒスチジンタグを含む以下の配列ＥＧＲＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号８１）により置き換えた。この交換を、配列番号４４：Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｔｒｉｍ（配列番号１４４：ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｔｒｉｍをもたらす）、配列番号４５：Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５：ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４をもたらす）、配列番号４６：ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）（配列番号１４６：ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６をもたらす）、配列番号４７：ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５＋６（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）（配列番号１４７：ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５＋６をもたらす）、配列番号４８：ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）（配列番号１４８：ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５をもたらす）に適用した。

【0265】

同様に、比較の理由のため、交換を配列番号１：Ｈ１ Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）に適用し、さらにアルギニン３４３をグルタミンに改変（Ｒ３４３Ｑ突然変異）して配列番号１４９：ｓ−Ｈ１ Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ Ｒ３４３Ｑを生じさせることによりＨＡ開裂部位を損傷させた。さらに、本発明の２つのポリペプチドを、ＨＡ１のＮ末端およびＣ末端部分間に異なるリンカーを用いて作出した：ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５０）およびｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２（配列番号１５１）。

【0266】

一般に当業者に公知の方法を使用して上記のタンパク質配列をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４ｎｅｏ中にクローニングした。当分野において周知のプロトコルに従って形質移入剤として＼２９３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎを使用してＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）懸濁細胞に発現ベクターを形質移入させ、さらに７日間増殖させた。細胞を遠心分離により培養培地から分離し、廃棄した一方、本発明の可溶性ポリペプチドを含有する上清をさらなる処理のために回収した。上清をＮｉ−ＮＴＡカラム上での固定化金属親和性クロマトグラフィーにより精製して本発明のＨｉｓタグ化ポリペプチドを樹脂に結合させ、フロースルーを回収した。カラムを３〜１０カラム容量の２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール（「洗浄液」）、５〜１５カラム容量の２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのイミダゾール（「ストリンジェント洗浄液」）により洗浄し、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾールにより溶出させた。個々の場合において、緩衝組成物または使用容量を、純度もしくは収量を増加させるように適合させ、または段階勾配に代えて線形勾配を使用した。フラクションを完全に回収し、ポリクローナル抗Ｈ１ＨＡ血清を検出に使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット上で分析した（図１１ａ〜ｈ参照）。結果は、出発物質と比較して溶出物中の本発明のポリペプチドの明確な濃縮を示す。

【0267】

本発明の精製ポリペプチドの適切なフォールディングおよび機能性を確認するため、調製物をモノクローナル抗体ＣＲ９１１４の結合について試験した。この目的のため、タンパク質のＣ末端におけるＨｉｓタグ（６または７つの連続ヒスチジン）に結合し得るモノクローナル抗体を標準的な９６ウェルプレート上に、１００マイクロリットルの１μｇ／ｍｌ抗体溶液をそれぞれのウェルにアプライし、４℃において一晩インキュベートすることによりコートした。過剰溶液の除去および洗浄後、プレートを１５０マイクロリットルの２％スキムミルク溶液により室温において１時間ブロッキングした。ブロッキング剤の除去および洗浄後、１００マイクロリットルの本発明ポリペプチドの１μｇ／ｍｌ溶液、および対応する全長タンパク質（配列番号１４９）のエクトドメインを添加し、室温において２時間インキュベートした。本発明の過剰ポリペプチドの除去後、ｍＡｂのＣＲ９１１４、ｍＡｂのＣＲ８０２０（陰性対照）またはウサギ中でＨ１ＨＡに対して生じたポリクローナル血清（陽性対照）を、２および２０μｇ／ｍｌ間で変動する濃度において添加し、室温において２時間インキュベートした。結合は、当分野において周知のプロトコルを使用してＨＲＰコンジュゲート抗ヒト抗体を介して検出した。

【0268】

結果（図１２）は、モノクローナル抗体ＣＲ９１１４が本発明の精製可溶性ポリペプチドおよび全長エクトドメインに結合している（図１２ａ）一方、モノクローナル抗体ＣＲ８０２０が結合していない（図１２ｂ）ことを示す。ポリクローナル抗Ｈ１血清も本発明のポリペプチドおよび全長エクトドメインに極めて類似して結合する（図１２ｃ）。したがって、ＣＲ９１１４の広域中和エピトープは、本発明のポリペプチド中で保存されること、ならびにこのエピトープの不連続および立体構造的性質を考慮すると、ステムドメインは、適切にフォールドされ、天然全長ＨＡの立体構造と同等または極めて類似の三次元立体構造を採用することが結論づけられる。

【0269】

本発明のポリペプチドの調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット結果から決定されるとおり、サイズが不均一であった。本発明者らは、このバリエーションが個々のタンパク質分子間のタンパク質グリコシル化パターンのバリエーションに起因すると仮定した。これを確認するため、タンパク質調製物の小さいアリコートを３単位のＮ−グリコシダーゼＦ（Ｎ−結合炭水化物部分をアスパラギン残基から除去する酵素）により３７℃において１８時間処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより分析した。結果（図１３ａおよび１３ｂ）は、Ｎ−グリコシダーゼによる処理が本発明のポリペプチドの拡散バンドをアミノ酸配列から計算された予測分子量における単一バンドに集めることを示す。これは、観察されたサイズ不均一性が実際にグリコシル化パターンのバリエーションから生じる明確な証拠である。

【0270】

本発明のポリペプチドの調製物をＨＰ−ＳＥＣによりさらに特性決定した。この目的のため、約４０μｇの本発明のポリペプチドを、４３〜６３μｌの容量（０．６４〜０．９３ｍｇ／ｍｌのポリペプチドの濃度）で、多角度光散乱検出器に連結されたＴｏｓｏｈ ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ２０００ ＳＷｘｌカラムにアプライした。結果を図１４に示す。メインピーク（滞留時間約８分間）は、本発明のポリペプチドから生じ、より大きい種から十分に分離され、このことは、さらなる精製を達成することができることを示す。多角度光散乱検出器のデータに基づくと、メインピークは、試験される本発明のポリペプチドに応じて５０〜８０キロダルトンの分子量を有する分子種に対応する（表９参照）。上記のポリペプチドグリコシル化のサイズ不均一性およびバリエーション、ならびに分子の流体力学的形状に対する結果の依存性に照らし、これらの数字は単なる表示として解釈すべきである。

【0271】

実施例１４
モノクローナル抗体ＣＲ９１１４、ＣＲ６２６１およびＦＩ６ｖ３の保存ステムドメインエピトープを含む可溶性ステムドメインポリペプチドの発現および部分精製
本発明のポリペプチドの高度に純粋な調製物を得るため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）をコードする遺伝子を含有する発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４を形質移入させた。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（配列番号１４５のアミノ酸１〜１７に対応）は、分泌最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。この目的のため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３００ｇにおいて５分間スピンダウンさせ、ＳＦ１０００を介して３００ｍＬの予備加温Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地中で再懸濁することにより１．０^＊１０^６ｖｃ／ｍＬを播種した。この培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ_２、１１０ｒｐｍにおいて１時間インキュベートした。１時間後、プラスミドＤＮＡを９．９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中で３００ｍＬの培養容量中１．０μｇ／ｍＬの濃度にピペッティングした。並行して、４４０μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を９．９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中でピペッティングし、室温において５分間インキュベートした。５分後、プラスミドＤＮＡ／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物を２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物に添加し、室温において２０分間インキュベートした。インキュベーション後、プラスミドＤＮＡ／２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）混合物を細胞懸濁液に滴加した。形質移入培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ_２および１１０ｒｐｍにおいてインキュベートした。７日目、細胞を培養培地から遠心分離（３０００ｇにおいて３０分間）により分離した一方、本発明の可溶性ポリペプチドを含有する上清をさらなる処理のために０．２μｍボトルトップフィルター上で濾過した。

【0272】

本発明のポリペプチドの存在を確認するため、上清の小アリコートを、検出のためのｈｉｓタグに対して指向されるモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロットにより分析した（図１５ａ）。３７〜５０ｋＤａの見かけの分子量においていくつかのバンドが観察され、それはタンパク質のアミノ酸組成に基づき計算された分子量に近く、またはそれを上回る。サイズ不均一性は、グリコシル化パターンのバリエーションにより引き起こされる。それというのも、Ｎ−グリコシダーゼＦによりこのタンパク質を処理して付着Ｎ−結合グリカンをタンパク質から除去することが、予測分子量におけるバンドの集合をもたらすことをより早期実験が示しているためである。

【0273】

本発明のポリペプチド上の広域中和エピトープの存在は、広域中和抗体ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＦＩ６ｖ３をプローブとして使用してＥＬＩＳＡにより確認した。比較の理由のため、モノクローナル抗体ＣＲ８０２０も陰性対照として実験に含め；この抗体は、グループ２ウイルスからのＨＡ分子（例えば、Ｈ３およびＨ７ＨＡ）に結合し得るが、グループ１からのＨＡ分子（例えば、Ｈ１およびＨ５ＨＡ）には結合し得ない。この目的のため、タンパク質のＣ末端におけるＨｉｓタグ（６または７つの連続ヒスチジン）に結合し得るモノクローナル抗体を、標準的な９６ウェルプレート上に、１００マイクロリットルの１μｇ／ｍｌ抗体溶液をそれぞれのウェルにアプライし、４℃において一晩インキュベートすることによりコートした。過剰溶液の除去および洗浄後、プレートを１５０マイクロリットルの２％スキムミルク溶液により室温において１時間ブロッキングした。ブロッキング剤の除去および洗浄後、１００マイクロリットルの上清を添加し、室温において２時間インキュベートした。本発明の過剰のポリペプチドの除去後、ｍＡｂのＣＲ９１１４を添加し、５μｇ／ｍｌ濃度において出発する１：２希釈系列で添加し、室温において２時間インキュベートした。結合は、当分野において周知のプロトコルを使用してＨＲＰコンジュゲート抗ヒト抗体を介して検出した。本発明のポリペプチドへのＣＲ９１１４、ＦＩ６ｖ３およびより小程度でＣＲ６２６１の明確な結合が観察される一方、ＣＲ８０２０について応答は観察されず、このことは、観察される結合が試験モノクローナル抗体に特異的であることを示す（図１５ｂ）。

【0274】

精製目的のため、２５０ｍｌの培養上清を５ｍｌのＨｉｓトラップカラムにアプライし、７５ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）により洗浄し、段階的勾配のイミダゾール（洗浄緩衝液中１０、５０、１００、２００、３００および５００ｍＭ）により溶出させた。クロマトグラム（図１６）は、複数のピークを示し、本発明のポリペプチドは、１００ｍＭのイミダゾール（ピークＡ）および２００ｍＭのイミダゾール（ピークＢ）において溶出する。両方のピークを回収し、濃縮し、さらなる精製のためにサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）にアプライした。溶出プロファイルを図１７ａおよび１７ｂに示す。フラクションを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した（図１７ｃおよびｄ）。ピークＡおよびＢの両方に由来するフラクション３は、本発明の高度に純粋なポリペプチドを含有する。最終収量は、約１０μｇ／ｍｌの培養上清であった。精製バッチは、エンドトキシン不含であり（５ｍｇ／ｋｇにおいて投与；＜１ＥＵ／ｍｇ）において投与；ＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃＬＡＬ）；バイオバーデンは１ＣＦＵ／５０μｇ未満である。

【0275】

実施例１５
インフルエンザＢＨＡをベースとするＣＲ９１１４の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドの設計
本発明のポリペプチドを設計する上記の手順をインフルエンザＢにも適用した。この実施例において、公知の系統、すなわち、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統）およびＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）の両方のウイルス株から採取されるＨＡ配列に基づく本発明のポリペプチドを記載する。当業者は、他のインフルエンザＢＨＡ配列の使用も可能であることを理解する。それというのも、この配列は、特にステム領域が十分保存されるためである。したがって、下記による他のインフルエンザＢＨＡ配列に由来するポリペプチドも本発明により包含される。

【0276】

Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のＨＡ配列の第１の改変は、Ｒ（または限定数の場合においてＫ）をＱに突然変異（Ｒ３６１Ｑ）させることにより３６１位（番号付与は、配列番号１３２を指す）における開裂部位を除去してＨＡ０からのＨＡ１およびＨＡ２の形成を防止することである。場合により、残基３６３から３６７（ＧＦＧＡＩ、融合ペプチドの一部）をさらに欠失させて水性溶媒への疎水性残基の曝露を最小化することができる。開裂における陽性電荷はインフルエンザＢからのＨＡにおいて１００％保存され、したがって、この突然変異は全ての配列中に適用することができる。

【0277】

第２の改変は、ＨＡ１配列の大部分を欠失させ、ＮおよびＣ末端配列を短いリンカーを介して再連結させることにより頭部ドメインを除去することである。欠失は、長さを変えることができるが、結合配列を介する歪みの導入を回避するため、ＨＡ１のＮ末端配列の最後の残基およびＣ末端配列の最初の残基が空間的に近接することが好ましい。Ｂ配列において、欠失は、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（配列番号１３２）中のＰ５１〜Ｉ３３６（ｍ２；配列番号１３３）（の相当位置）において導入することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。配列の残留部分を直接的に結合させることができ、またはフレキシブルリンカーを導入することができる。リンカー配列は、１〜５０アミノ酸長であり得る。限定された長さ（１０アミノ酸以下）のフレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡ、ＧＳＡＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧまたは類似物が好ましい。

【0278】

配列番号１３３は、欠失Ｐ５１〜Ｉ３３２（ｍ２；配列番号１３３）を含有するこのような本発明のポリペプチドを記載する。上記の欠失は、Ｐ５１およびＮ５８間ならびにＥ３０６〜Ｉ３３７の残基により形成される非構造化領域も除去されることを確保し；これは、本発明のポリペプチドの全安定性に有益である。類似の効果がＨ１配列に由来する本発明のポリペプチドについて観察された（上記参照）。

【0279】

頭部ドメインの欠失により、残基４１６〜４３６のループが水性溶媒に目下曝露されたままとなる。ＢＨＡにおいて、このループは高度に保存される（表１０参照）。コンセンサス配列は：ＬＳＥＬＥＶＫＮＬＱＲＬＳＧＡＭＤＥＬＨＮである。

【0280】

融合前立体構造の本発明のポリペプチドのためにこのループの溶解度を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるため、いくつかの疎水性残基を極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電アミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）に改変し、またはＧへの突然変異によりフレキシビリティを増加させなければならない。具体的には、４２１、４２４、４２７、４３４位（番号付与は、配列番号１３２を指す）における突然変異は、本発明のポリペプチドの安定性に寄与する。

【0281】

Ｖ４２１およびＬ４２７について、Ｔへの突然変異が好ましいが、他の極性（Ｓ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）および高度にフレキシブルなアミノ酸（Ｇ）が同一効果を有する。４２４位について、Ｓへの突然変異が好ましい。他の極性（Ｎ、Ｔ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）および高度にフレキシブルなアミノ酸（Ｇ）は、同一効果を有する。Ｌ４３４位について、Ｇへの突然変異が好ましい。他の極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）は、同一効果を有する。上記の突然変異の少なくとも１つを含有するポリペプチドを作製した。例えば、配列番号１３４〜１３６に示されるとおり、２つ以上の突然変異の組合せも可能である。

【0282】

本発明のポリペプチドの融合前立体構造を安定化させるため、一次配列中で遠位であるがフォールドした融合前立体構造中で近い２つの部分間に共有結合を導入した。この目的のため、ジスルフィド架橋をポリペプチド中で、好ましくは、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（配列番号１３４〜１３６）からのＨＡ中のＫ３４０およびＳ４５４位間（の相当物）で遺伝子操作する。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。

【0283】

ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。ＧＣＮ４に由来する三量体コイルドコイルの形成を支持する配列、ＲＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩを４３６〜４５２位（配列番号１３５）（の相当物）において、またはＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩを４３６〜４５１位（配列番号１３６）において導入する。

【0284】

同一の手順をＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（配列番号１３７）からのＨＡについて行ってポリペプチドを提供した。Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６からのＨＡと比較して、このＨＡは、１７８位において挿入された追加のアスパラギン残基を有し、それは２つの配列のアラインメントにおいて容易に把握することができる。結果的に、開裂部位は３６２位において存在し、開裂を防止するための対応する突然変異はＲ３６２Ｑである。この場合における頭部領域を除去するための欠失は、例えば、Ｐ５１〜Ｉ３３７（ｍ２；配列番号１３８）である。ここでも、配列の残留部分を直接的に結合させることができ、またはフレキシブルリンカーを導入することができる。リンカー配列は、１〜５０アミノ酸長であり得る。限定された長さ（１０アミノ酸以下）のフレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡ、ＧＳＡＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧまたは類似物が好ましい。

【0285】

配列番号１３８は、欠失Ｐ５１〜Ｉ３３２（ｍ２；配列番号１３８）を含有するこのようなポリペプチドを記載する。上記の欠失は、Ｐ５１〜Ｎ５８ならびにＥ３０７〜Ｉ３３８の残基により形成される非構造化領域も除去されることを確保し；これは、本発明のポリペプチドの全安定性に有益である。類似の効果がＨ１配列に由来する本発明のポリペプチドについて観察された（上記参照）。

【0286】

頭部ドメインの欠失により、残基Ｌ４２０〜Ｈ４３６のループが水性溶媒に目下曝露されたままとなる。ＢＨＡにおいて、このループは高度に保存される（表ｘ参照）。コンセンサス配列は：ＬＳＥＬＥＶＫＮＬＱＲＬＳＧＡＭＤＥＬＨＮである。

【0287】

融合前立体構造のこのループの溶解度を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるため、いくつかの疎水性残基を極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電アミノ酸（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）に改変し、またはＧへの突然変異によりフレキシビリティを増加させなければならない。具体的には、４２２、４２５、４２８、４３５位（番号付与は、配列番号１３７を指す）における突然変異を試験した。

【0288】

Ｖ４２２およびＬ４２８位について、Ｔへの突然変異が好ましいが、他の極性（Ｓ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）および高度にフレキシブルなアミノ酸（Ｇ）が同一効果を有する。４２５位について、Ｓへの突然変異が好ましい。他の極性（Ｎ、Ｔ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）および高度にフレキシブルなアミノ酸（Ｇ）は、同一効果を有する。Ｌ４３５位について、Ｇへの突然変異が好ましい。他の極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）は、同一効果を有する。上記の突然変異の少なくとも１つを含有するポリペプチドを作製した。例えば、配列番号１３９〜１４１に示されるとおり、２つ以上の突然変異の組合せも可能である。

【0289】

本発明のポリペプチドの融合前立体構造を安定化させるため、一次配列中で遠位であるがフォールドした融合前立体構造中で近い２つの部分間に共有結合を導入する。この目的のため、ジスルフィド架橋を本発明のポリペプチド中で、好ましくは、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（配列番号１３９〜１４１）からのＨＡ中のＫ３４１およびＳ４５５位（の相当物）間で遺伝子操作する。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。

【0290】

上記のとおり、天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。ＧＣＮ４に由来する三量体コイルドコイルの形成を支持する配列、ＲＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩを４３７〜４５３位（配列番号１３５）（の相当物）において、またはＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＩを４３７〜４５２位（配列番号１３６）において導入する。

【0291】

インフルエンザＢヘマグルチニンをベースとするポリペプチド配列番号１３３〜１３６および１３８〜１４１を、ＣＲ９１１４のエピトープの存在について上記の蛍光結合細胞選別により試験した。しかしながら、これらの構築物についてｍＡｂのＣＲ９１１４の結合は観察されなかった。

【0292】

実施例１６
第３世代ＨＡステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、マウスをＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長Ｈ１（配列番号１）、Ｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１１）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５（配列番号４８）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６（配列番号４６）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５２）をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。ｃＭ２をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。

【0293】

４匹のマウス（ＢＡＬＢ＼ｃ）の群を、５０μｇの構築物＋５０μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）により筋肉内で１、２１および４２日目に免疫化した。４９日目、最後の採血を実施し、血清を回収した。血清を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９株からの全長ＨＡの組換えエクトドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから入手）を抗原として使用してＥｌｉｓａにより分析した。手短に述べると、９６ウェルプレートを５０ｎｇのＨＡにより４℃において一晩コートし、次いでブロック緩衝液（１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４＋２％のスキムミルク）と室温において１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０により洗浄し、血清の２０倍希釈から出発するブロック緩衝液中の１００μｌの２倍希釈系列を添加する。結合抗体は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、当分野において十分確立された標準的プロトコルを使用して結合抗体を検出する。ｍＡｂの３ＡＨ１ＩｎＡ１３４（Ｈｙｔｅｓｔ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して力価を標準曲線と比較してＥｌｉｓａ単位／ｍｌ（ＥＵ／ｍｌ）を導く。

【0294】

上記の免疫化スケジュールにより誘導された同種全長タンパク質のエクトドメインに対するＩｇＧ応答の時間経過を図１８に示す。高い応答は、４週間後に全長タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１）により免疫化されたマウスについて既に観察することができる。応答は、７週間における力価の増加から示されるとおり、ブースト注射により増加される。本発明のポリペプチドｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５（配列番号４８）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６（配列番号４６）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５２）をコードするＤＮＡによる免疫化は、７週目における力価から証明されるとおり、ブースター免疫化時にさらに増加される中間力価をもたらす。Ｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１１）および陰性対照ｃＭ２をコードするＤＮＡによる免疫化は、このアッセイにおいて検出可能な応答をもたらさない。

【0295】

図１９は、同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（パネルＡ）および異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答を示す。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ本発明のポリペプチドをコードするｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５（配列番号４８）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６（配列番号４６）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５２）をコードするＤＮＡにより誘導された抗体は、同種および異種株に由来するヘマグルチニンのエクトドメインに同等に十分結合する。対照的に、全長タンパク質（配列番号１）をコードするＤＮＡによる免疫化は、同種ヘマグルチニンに対しては高い力価をもたらす（本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡによる免疫化について観察される力価よりも１桁を超えて高い）が、異種ヘマグルチニンのエクトドメインに対しては低い力価をもたらす。Ｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１１）および陰性対照ｃＭ２をコードするＤＮＡによる免疫化は、このアッセイにおいてヘマグルチニンエクトドメインのいずれに対しても検出可能な応答をもたらさない。

【0296】

まとめると、本発明のポリペプチドｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５（配列番号４８）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６（配列番号４６）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５２）に対して生じた抗体は、全長ヘマグルチニンを認識し得る。これらのエピトープは、ヘマグルチニンステムドメイン上に局在し、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からの全長ヘマグルチニン間で保存されることが必要である。

【0297】

実施例１７
第３世代ＨＡステムドメインポリペプチドｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４の免疫原性
本発明のステムドメインポリペプチドの免疫原性をさらに評価するため、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）コードする発現ベクターによりマウスを１回免疫化し（プライム）、精製タンパク質ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）により３週間間隔において２回ブーストした。比較の理由のため、別個の群を、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）およびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長Ｈ１（配列番号１）をコードする発現ベクターによる３週間間隔の免疫化において３回免疫化した。ｃＭ２をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。

【0298】

４匹のマウス（ＢＡＬＢ＼ｃ）の群を、１日目に、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）をコードする１０００μｇの構築物＋１００μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）により、および２１および４２日目に、ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５；１００μｇの精製タンパク質）により１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍをアジュバント添加して筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化した。１つの群は、第２および第３の免疫化を皮下で受けた一方、別の群は、第２および第３の免疫化を筋肉内で受けた。さらに第３の群を、上記のとおり１日目に、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）をコードする１００μｇの構築物＋１００μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）によりプライミングし、２１および４１日目に、ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５；１００μｇの精製タンパク質）にＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−７２０（１：１ｖ／ｖ）をアジュバント添加するブースター免疫化を受けた。比較のため、１、２１および４２日目に、４匹のマウス（ＢＡＬＢ＼ｃ）の群を、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長Ｈ１（配列番号１）またはｃＭ２をコードする１００μｇの構築物により筋肉内で免疫化し、１００μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）によりアジュバント添加した。

【0299】

４９日目、最後の採血を実施し、血清を回収した。血清を、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４およびＨ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／／１９６８株からの組換え全長ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから入手）を抗原として使用してＥＬＩＳＡにより分析した。手短に述べると、９６ウェルプレートを５０ｎｇのＨＡにより４℃において一晩コートし、次いでブロック緩衝液（１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４＋２％のスキムミルク）と室温において１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０により洗浄し、血清の２０倍希釈から出発するブロック緩衝液中の１００μｌの２倍希釈系列を添加する。結合抗体は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、当分野において十分確立された標準的プロトコルを使用して結合抗体を検出する。力価を、ＨＡ抗原に結合するマウスモノクローナル抗体の系列希釈物から構成される標準曲線と比較し、１ｍｌ当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍｌ）として表現する。図２０は、同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（パネルＡ）、異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（パネルＢ）異種亜型株Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（パネルＣ）および異種亜型株Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（パネルＤ）からの全長ヘマグルチニンのエクトドメインに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答を示す。本発明のポリペプチドｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）をコードするＤＮＡによる免疫化により誘導された抗体は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９およびより少程度でＨ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４のＨＡを認識し得る。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長Ｈ１（配列番号１）をコードするＤＮＡによる免疫化により誘発された抗体は、同種タンパク質を極めて十分に認識するが、図１７ＢおよびＣにおいてより低い力価により証明されるとおり、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からの異種ＨＡ、およびＨ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からの異種亜型ＨＡをそれほど認識しない。ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５；プライム）をコードするＤＮＡにより免疫化され、次いでｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）タンパク質によりブースター免疫化されたマウスの群は、同種Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、異種Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９および異種亜型Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４に由来するＨＡのエクトドメイン対して高い力価を示す。

【0300】

図２０Ｄは、Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からのＨＡのエクトドメインに対する７週目におけるＩｇＧ応答を示す。インフルエンザグループ１に属する株のＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７のＨＡに由来するｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）およびｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）とは異なり、Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８はインフルエンザグループ２に属し、したがって、この実験において使用される本発明のポリペプチドを設計するために使用される親配列から系統発生的に遠い。ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）またはＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長ＨＡ（配列番号１）をコードするＤＮＡによる３回の免疫化は、この抗原に対するＥＬＩＳＡにより検出可能なＩｇＧレベルをもたらさない。対照的に、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）をコードするＤＮＡにより免疫化し、次いで精製タンパク質ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）により２回ブースター免疫化することは、Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からのＨＡに対して高い力価をもたらす。この結果は、使用される免疫化経路（すなわち、筋肉内と皮下）ともタンパク質ブースト免疫化に添加されるアジュバント（Ｍａｔｒｉｘ−ＭまたはＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−７２０）とも無関係に得られる。

【0301】

まとめると、本発明のポリペプチドによる免疫化は、広範のインフルエンザ株、例としてインフルエンザグループ１からの同種、異種、および異種亜型株ならびにインフルエンザグループ２からの株からのＨＡを認識し得るＩｇＧを誘発し得る。対照的に、全長ＨＡによる免疫化は、同種株のＨＡに対する高い力価、異種および異種亜型株に対する低減された力価ならびにインフルエンザグループ２からの株についての検出限界未満のＩｇＧレベルをもたらす。

【0302】

実施例１８
ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の保存ステムドメインエピトープを含むさらなるステムドメインポリペプチドの設計
上記の手順に従って設計された本発明のポリペプチドは、安定性を増加させるためにさらに改変することができる。このような改変は、単量体および／または二量体種と比べて本発明のポリペプチドの三量体形態の形成を向上させるために導入することができる。上記のとおり、天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は三量体形態の安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体の形成により媒介される。ステムドメイン中のコイルドコイルモチーフの増強により、より安定な三量体形態を達成することができる。

【0303】

本発明によれば、三量体コイルドコイルの形成のためのコンセンサス配列、ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥ（配列番号８３）を、本発明のポリペプチド中にＨ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７中の４１８〜４３３位（配列番号４４）（配列番号１による番号付与）（の相当物）において導入する。あるいは、ＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩ（配列番号８５）を４１９〜４３３（配列番号４９）において、またはＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫ（配列番号８６）を４２０〜４３３（配列番号５０）において導入することができる。代替例は、ＧＣＮ４に由来し、三量体化することが公知の配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号８４）を、４１９〜４３３位（配列番号４５）において導入することである。あるいは、ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号８７）を４２０〜４３３位（配列番号５１）において、またはＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫ（配列番号８８）を４１７〜４３３位（配列番号５２）において導入することができる。同様に、三量体界面は、Ｍ４２０、Ｌ４２３、Ｖ４２７、Ｇ４３０をイソロイシンに改変することにより増強することができる（配列番号５３）。

【0304】

ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、Ｈ１ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、ＨＡ２の５２３、５２４、５２５、５２６、５２６、５２７、５２８、５２９、または５３０位（配列番号１による番号付与）（またはそれらの相当物）からＨＡ２のＣ末端の細胞質配列および膜貫通配列は、分泌（可溶性）ポリペプチドが産生されるように除去する。可溶性ポリペプチドは、上記のとおりさらに安定化することができる。

【0305】

リンカーバリアントの説明
一般に当業者に公知の方法を使用して上記のタンパク質配列（配列番号４４〜４６；配列番号４９〜５３および配列番号１５２〜１５７をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４中にクローニングした。比較の理由のため、全長配列（配列番号１）およびｃＭ２をコードする発現ベクターを実験に含めた。

【0306】

形質移入剤として４０μｌの２９３−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎを使用してＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）懸濁細胞（１０^６個の細胞／ｍｌ、３０ｍｌ）に発現ベクター（１μｇ／ｍｌ）を形質移入させ、さらに２日間増殖させた。細胞を回収し；アリコート化し（０．３ｍｌ、約３^＊１０^５個の細胞）、アリコートを、発現を調べるためのＨ１ＨＡに対して生じたポリクローナル血清またはＨＡ特異的モノクローナル抗体（５マイクログラム／ｍｌ）のいずれかおよび染色に使用される二次抗体により処理した。次いで、発現を調べるためのＨ１ＨＡに対して生じたポリクローナル血清を使用して細胞を本発明の膜付着ＨＡステムドメインポリペプチドの発現について蛍光結合細胞選別（ＦＡＣＳ）により分析した。全長タンパク質に結合する公知の特異性のモノクローナル抗体のパネル（ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、ＣＲ９０２０およびＣＲ８０２０）を使用して保存エピトープの存在、ならびに推論により全長ＨＡおよび本発明のｍｉｎｉ−ＨＡポリペプチドの正確なフォールディングを調べた。結果を、陽性細胞の割合および平均蛍光強度として表現し、図２１に示す。

【0307】

結果は、ポリクローナル抗Ｈ１血清からの陽性応答により証明されるとおり、全ての試験バリアントが細胞表面上で発現されることを示す。Ｈ３ＨＡ特異的抗体ＣＲ８０２０は、実験に含まれる構築物のいずれも認識しない一方、Ｈ１ＨＡの頭部ドメインに結合するＣＲ９０２０は、全長タンパク質のみに明確に認識する。本発明の全てのポリペプチド、および全長タンパク質はＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４により認識され、このことは、対応するエピトープが本発明のポリペプチド中に野生型タンパク質と同一の立体構造で存在することを示す。へリックスＣＤ（図１参照）中に含まれる追加の三量体モチーフを有する本発明のポリペプチドのうち、ＧＣＮ４由来配列の配列番号８４、８７および８８を含有する配列番号４５、５１および５２は、それぞれ、配列番号８３、８５および８６のコンセンサス三量体配列を含有する配列番号４４、４９および５０と同等以上の応答（ＭＦＩ）をもたらす。

【0308】

本発明のポリペプチド中のアミノ酸５２および３２１（番号付与は、配列番号１を指す）を連結するリンカーの組成のバリエーションは、モノクローナル抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の認識の大きい変化をもたらさない。最大変化は、配列番号４６中のＧＧＧＧをＨＮＧＫにより置き換えた場合（配列番号１５２をもたらす）に観察され、それは、ＣＲ６２６１に対するいくぶん低い応答をもたらすが、ＣＲ９１１４に対する応答に影響しない。リンカーの除去および配列番号１のアミノ酸５３〜５６（ＳＨＮＧ）の導入、すなわち、リンカーを配列番号４６（配列番号１５３をもたらす）、配列番号４５（配列番号１５４をもたらす）または配列番号５０（配列番号１５５をもたらす）中に有さない本発明のポリペプチドの作出は、ＦＡＣＳアッセイにおける応答に影響を与えず、このことはリンカー配列が重要でないことを示す。

【0309】

配列番号１５６は、配列番号４６から、突然変異Ｉ３３７Ｎ、Ｉ３４０ＮおよびＦ３５２Ｙを導入することによりに誘導する一方、配列番号１５７は、３５３位における追加の突然変異、すなわち、Ｉ３５３Ｎを含有する。これらの突然変異は、図２１に示されるＦＡＣＳアッセイにおけるＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４に対する応答の改善をもたらさない。

【0310】

ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、ＨＡ２の５２３、５２４、５２５、５２６、５２６、５２７、５２８、５２９、または５３０位（配列番号１による番号付与）（またはそれらの相当物）からＨＡ２のＣ末端の細胞質配列および膜貫通配列を除去し、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬ（配列番号１４３）を場合によりリンカーを介して連結させて導入することにより場合により置き換える。リンカーは、当業者に周知のプロトコルに従って後で処理するための開裂部位を場合により含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、短いリンカー、例えば、ＥＧＲを介して連結されたタグ配列、例えば、ＨｉｓタグＨＨＨＨＨＨＨを付加することができる。本発明によれば、アミノ酸配列は、ＨＡ２ドメインの５３０位（配列番号１による番号付与）からＣ末端アミノ酸のアミノ酸配列を除去し、配列番号８１または配列番号８２により置き換えた。

【0311】

実施例１９
第３世代ＨＡステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長Ｈ１（配列番号１）、Ｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１１）、Ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６（配列番号４６）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５２）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２（配列番号１５３）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２ｓ−ＧＣＮ４（配列番号１５４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５１）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ３（配列番号５２）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６＋１２（配列番号１５６）およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６＋１２＋１３（配列番号１５７）をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。ｃＭ２をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。

【0312】

４匹のマウス（ＢＡＬＢ＼ｃ）の群を、１００μｇの構築物＋１００μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）により筋肉内で１、２１および４２日目に免疫化した。４９日目、最後の採血を実施し、血清を回収した。血清を、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９およびＨ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４株からの組換え全長ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから入手）を抗原として使用してＥＬＩＳＡにより分析した。手短に述べると、９６ウェルプレートを５０ｎｇのＨＡにより４℃において一晩コートし、次いでブロック緩衝液（１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４＋２％のスキムミルク）と室温において１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０により洗浄し、血清の５０倍希釈から出発するブロック緩衝液中の１００μｌの２倍希釈系列を添加する。結合抗体は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、当分野において十分確立された標準的プロトコルを使用して検出する。力価を、ＨＡ抗原に結合するマウスモノクローナル抗体の系列希釈物から構成される標準曲線と比較し、１ｍｌ当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍｌ）として表現する。

【0313】

図２２は、同種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（パネルＡ）、異種株Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（パネルＢ）および異種亜型株Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（パネルＣ）からの全長ヘマグルチニンに対する個々のマウスについての最初の免疫化後７週目におけるＩｇＧ応答を示す。本発明のポリペプチドＭｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６（配列番号４６）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５２）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２（配列番号１５３）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２ｓ−ＧＣＮ４（配列番号１５４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５１）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ３（配列番号５２）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６＋１２（配列番号１５６）およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６＋１２＋１３（配列番号１５７）をコードするＤＮＡによる免疫化により誘導された抗体は、同種Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７および異種Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９株に由来するヘマグルチニンのエクトドメインに同等に十分結合する（図２２ＡおよびＢ）。最大力価は、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５１）およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２ｓ−ＧＣＮ４（配列番号１５４）について観察される。対照的に、全長タンパク質（配列番号１）をコードするＤＮＡによる免疫化は、同種ヘマグルチニンに対しては高い力価をもたらす（本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡによる免疫化について観察される力価よりも１桁を超えて高い）が、異種ヘマグルチニンのエクトドメインに対しては低い力価をもたらす（１桁を超える）。Ｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１１）および陰性対照ｃＭ２をコードするＤＮＡによる免疫化は、このアッセイにおいてヘマグルチニンエクトドメインのいずれに対しても検出可能な応答をもたらさない。

【0314】

Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からの異種亜型ヘマグルチニンのエクトドメインに対する力価（図２２Ｃ）は、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５１）についての明確な応答を示す。観察可能な力価はまた、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）をコードするＤＮＡによる免疫化後の４匹のマウスのうち２匹について、およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５２）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２（配列番号１５３）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２ｓ−ＧＣＮ４（配列番号１５４）について４匹のマウスのうち１匹について得られる。驚くべきことに、本発明者らは、Ｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１１）およびＭｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）をコードするＤＮＡによる免疫化後に検出可能な力価も見出す。最初の構築物は、同種および異種Ｈ１ＨＡに対するいかなる検出可能な抗体力価も誘導しなかった一方、最後のものは、穏やかな応答のみを誘導した（図２２ＡおよびＢ）。この実験における全ての構築物の配列およびＨ５ＨＡの比較は、長いＣＤへリックスの膜遠位末端において局在する推定直鎖エピトープを示す（図１参照）。配列番号１１中の１７５位および配列番号１４中の１５６位におけるメチオニンのイソロイシンへの突然変異は、直鎖配列ＥＲＲＩＥＮＬＮＫＫ（配列番号１１中の１７２〜１８１位；配列番号１４中の１５３〜１６２位）をもたらす。この配列は、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からのＨＡ中にも存在するが、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からのＨＡ中には存在せず、そこで対応する配列はそれぞれＥＲＲＭＥＮＬＮＫＫおよびＥＫＲＩＥＮＬＮＫＫである。

【0315】

まとめると、本発明のポリペプチドｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６（配列番号４６）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５２）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２（配列番号１５３）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２ｓ−ＧＣＮ４（配列番号１５４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ３（配列番号５２）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５１）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６＋１２（配列番号１５６）およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６＋１２＋１３（配列番号１５７）に対して生じた抗体は、全長ヘマグルチニンを認識し得る。これらの抗体のエピトープは、ヘマグルチニンステムドメイン上に局在するはずであり、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からの全長ヘマグルチニン間で保存される。ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４ｔ２（配列番号５１）、およびより小程度でｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１１＋５（配列番号１４）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号４５）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ（配列番号１５２）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２（配列番号１５３）、ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ｎｌ２ｓ−ＧＣＮ４（配列番号１５４）およびｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６＋１２（配列番号１５６）をコードするＤＮＡによる免疫化を介して誘発された抗体も、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からのＨＡのエクトドメインを認識し得る。本発明のポリペプチドは、Ｍｉｎｉ３−ｃｌｕｓｔｅｒ１１（配列番号１１）は、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からのＨＡのエクトドメインを認識する抗体を誘導し得る。

【0316】

実施例２０
ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドを設計する一般的方法
上記の結果に基づき、本発明のポリペプチドをインフルエンザウイルスＨＡ０配列から、特に血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡ０配列から作出する一般的方法を定義する。この方法は、以下のステップを含む：
１．ＨＡ１〜ＨＡ２の開裂部位の除去。この除去は、Ｐ１位におけるＲ（わずかな場合においてＫ）のＱへの突然変異により達成することができる（例えば、開裂部位（配列番号１中の３４３位）の命名法の説明については、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，２０１０参照。Ｑへの突然変異が好ましいが、Ｓ、Ｔ、Ｎ、ＤまたはＥも代替例である。
２．配列番号１からのアミノ酸５３〜３２０、または他のインフルエンザウイルスからのＨＡ中の相当位置を欠失させることによる頭部ドメインの除去。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。配列の残留部分を直接的に、またはフレキシブルリンカーを導入することにより結合させることができる。リンカー配列は、１〜５０アミノ酸長であり得る。限定された長さ（１０アミノ酸以下）のフレキシブルリンカー、例えば、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡ、ＧＳＡＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧまたは類似物が好ましい。欠失の長さは、例えば、欠失を５４、５５、５６、５７もしくは５８位（の相当物）において開始することにより、または欠失の長さを増加させるため、４７、４８、４９、５０、５１、もしくは５２位において切断することにより変えることもできる。同様に、欠失させるべき最後のアミノ酸は、３１５、３１６、３１７、３１８もしくは３１９位（の相当物）におけるもの、または欠失の長さを増加させるため、３２１、３２２、３２３、３２４、もしくは３２５位（の相当物）におけるものであり得る。欠失の長さの変化は、リンカー配列の長さを合致させることにより部分的に補うことができることを理解することは重要であり、すなわち、より大きい欠失はより長いリンカーと合致させることができ、逆もまた同様である。これらのポリペプチドも本発明により包含される。
３．Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の残基４０２〜４１８（の相当物）により形成されるループ（ＡへリックスおよびＣＤへリックス間）の溶解度を増加させて改変ＨＡの融合前立体構造の安定性を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させること。このループは、以下の表６において確認することができるとおり、Ｈ１配列中で高度に保存される。これは、例えば、前記ループ中のアミノ酸Ｉ、Ｌ、ＦまたはＶ残基を親水性相当物により置き換えることにより達成することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌまたはＭｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。グリシンへの突然変異は、融合後立体構造を脱安定化させる。それというのも、このアミノ酸の高いフレキシビリティがこのＨＡ配列の一部により形成され得る融合後へリックスの安定性の減少をもたらすためである。血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡの残基４０２〜４１８のループを記載するコンセンサス配列は、（配列番号１７）ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）である。本発明のポリペプチドにおいて、４０６、４０９、４１３位および／または４１６位におけるアミノ酸（または配列アラインメントから決定されたそれらの相当物）は、極性（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ）、荷電（Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ）またはフレキシブル（Ｇ）アミノ酸である。Ｌ４１６のＳまたはＴのいずれかへの突然変異もコンセンサスＮ−グリコシル化部位（コンセンサス配列は、ＮＸ（Ｓ／Ｔ）である）を導入することに留意すべきである。この位置におけるアスパラギンのグリコシル化は、この領域の溶解度をさらに増加させる。これらの部位における突然変異の組合せも可能であり、例えば、配列番号１０および配列番号１４中のＦ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｌ４１６Ｓである。一部の場合、コンセンサスアミノ酸を回復させるための突然変異が好ましく、例えば、ＶもしくはＭが４０４位（Ｔへ）、Ｖが４０８位（Ａへ）もしくは４１０位（Ｇへ）またはＩが４１４位（Ｎへ）における場合であり；これらの特定のアミノ酸を有する配列の発生率は極めて低い。本発明のポリペプチドを特性決定する上記の突然変異の概要を表６に挙げる。
４．ジスルフィド架橋を本発明のポリペプチド中に、好ましくは、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７中の３２４および４３６位（の相当物）のアミノ酸間に導入すること；配列番号１３〜１６。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。

【0317】

上記の本発明による一般的方法を使用して、本発明のポリペプチドをＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（配列番号１５９）、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（配列番号５６）、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（配列番号７８）、およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１（配列番号６４）のＨＡ０配列をベースとして作出した。さらに、この方法をグループ１の一部である別の亜型、すなわち、Ｈ５からのＨＡに、Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４からのＨＡ（配列番号１５８）を使用して適用した。

【0318】

Ｈ１ｍｉｎｉ−ＨＡＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（配列番号１６０）を、以下によりＨ１ＦＬＨＡＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（配列番号５６）から作出する。
１．開裂部位を除去すること：突然変異Ｒ３４４Ｑ（番号付与は、配列番号５６を指す。
２．残基Ｋ５３からＰ３２１を欠失させ、ＧＧＧＧリンカーをＤ５２およびＫ３２２（番号付与は、配列番号５６を指す）間に導入すること
３．Ａへリックス〜ＣＤへリックスのループ（配列番号５６中の残基４０３〜４１９）中でセリン残基を４０７、４１７位において（Ｆ４０７Ｓ、Ｌ４１７Ｓ；番号付与は、配列番号２を指す）、トレオニンを４１０位において（Ｖ４１０Ｔ；番号付与は、配列番号５６を指す）およびグリシン残基を４１４位において（Ｆ４１４Ｇ；番号付与は、配列番号２を指す）導入すること
４．ジスルフィド架橋を、残基リジン３２５およびトレオニン４３７をシステインに突然変異させることにより導入すること（Ｋ３２５Ｃ、Ｔ４３７Ｃ；番号付与は、配列番号５６を指す）
５．追加の安定化エレメントを、４１９ＫＲＩＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤ４３４（番号付与は、配列番号５６を指す）を配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱにより置き換えることにより導入した。

【0319】

Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９からの全長ＨＡ（配列番号１５９）をベースとするｍｉｎｉ−ＨＡ配列は、同一の様式で作出することができ、Ｈ１ｍｉｎｉ−ＨＡＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（配列番号１６０）の配列と同一である。

【0320】

同様に、Ｈ１ｍｉｎｉ−ＨＡＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（配列番号１６１）を、以下によりＨ１ＦＬＨＡＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（配列番号７８）から作出する。
１．開裂部位を除去すること：突然変異Ｒ３４３Ｑ（番号付与は、配列番号７８を指す）
２．残基Ｋ５３からＰ３２０を欠失させ、ＧＧＧＧリンカーをＤ５２およびＫ３２１（番号付与は、配列番号７８を指す）間に導入すること
３．Ａへリックス〜ＣＤへリックスのループ（配列番号７８中の残基４０２〜４１８）中でセリン残基を４０６、４１６位において（Ｆ４０６Ｓ、Ｌ４１６Ｓ；番号付与は、配列番号７８を指す）トレオニンを４０９位において（Ｖ４０９Ｔ；番号付与は、配列番号７８を指す）およびグリシン残基を４１３位において（Ｆ４１３Ｇ；番号付与は、配列番号７８を指す）導入すること
４．ジスルフィド架橋を、残基アルギニン３２４およびトレオニン４３６をシステインに突然変異させることにより導入すること（Ｒ３２４Ｃ、Ｔ４３６Ｃ；番号付与は、配列番号７８を指す）
５．追加の安定化エレメントを、４１８ＫＲＭＥＮＬＮＮＫＶＤＤＧＦＬＤ４３３（番号付与は、配列番号７８を指す）を配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱにより置き換えることにより導入した。

【0321】

Ｈ１ｍｉｎｉ−ＨＡＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（配列番号１６１）とＨ１ＦＬＨＡＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（配列番号７８）との間の追加の差は、３９７位であり、全長タンパク質（配列番号７８）中でセリンであるが、配列番号１６１の本発明のポリペプチド中でトレオニンである（Ｓ３９７Ｔ突然変異）。これは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４配列中の天然変異であり、したがって、この突然変異を含有する配列も本発明に含まれる。

【0322】

Ｈ１ｍｉｎｉ−ＨＡＡ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１（配列番号１６２）を、以下によりＨ１ＦＬＨＡＡ／Ｔｅｘａｓ／３６／１９９１（配列番号６４）から作出する。
１．開裂部位を除去すること：突然変異Ｒ３４４Ｑ（番号付与は、配列番号６４を指す）
２．残基Ｓ５３からＰ３２１を欠失させ、ＧＧＧＧリンカーをＤ５２およびＫ３２２（番号付与は、配列番号６４を指す）間に導入すること
３．Ａへリックス〜ＣＤへリックスのループ（配列番号６４中の残基４０３〜４１９）中でセリン残基を４０７、４１７位において（Ｆ４０７Ｓ、Ｌ４１７Ｓ；番号付与は、配列番号６４を指す）、トレオニンを４１０位において（Ｖ４１０Ｔ；番号付与は、配列番号６４を指す）およびグリシン残基を４１４位において（Ｆ４１４Ｇ；番号付与は、配列番号６４を指す）導入すること
４．ジスルフィド架橋を、残基アルギニン３２５およびトレオニン４３７をシステインに突然変異させることにより導入すること（Ｒ３２５Ｃ、Ｔ４３７Ｃ；番号付与は、配列番号６４を指す）
５．追加の安定化エレメントを、４１９ＲＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤ４３４（番号付与は、配列番号６４を指す）を配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱにより置き換えることにより導入した。

【0323】

Ｈ５ｍｉｎｉ−ＨＡＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（配列番号１６３）を、以下によりＨ５ＦＬＨＡＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（配列番号１５８）から作出する。
１．開裂部位の除去。Ｈ５ＦＬＨＡＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（配列番号１５８）は、多塩基開裂部位（３４１ＲＲＲＫＫＲ３４６）を含有するため、単一部位突然変異は、タンパク質開裂を防止するため十分でない。代わりに３４１ＲＲＲＫＫ３４５を欠失させ、Ｒ３４６Ｑ突然変異を導入する。
２．残基Ｋ５２からＰ３１９を欠失させ、ＧＧＧＧリンカーをＫ５１およびＫ３２０（番号付与は、配列番号１５８を指す）間に導入すること
３．Ａへリックス〜ＣＤへリックスのループ（配列番号１５８中の残基４０５〜４２１）中でセリン残基を４０９、４１９位において（Ｆ４０９Ｓ、Ｌ４１９Ｓ；番号付与は、配列番号１５８を指す）、トレオニンを４１２位において（Ｖ４１２Ｔ；番号付与は、配列番号１５８を指す）およびグリシン残基を４１６位において（Ｆ４１６Ｇ；番号付与は、配列番号１５８を指す）導入すること
４．ジスルフィド架橋を、残基リジン３２３およびトレオニン４３９をシステインに突然変異させることにより導入すること（Ｋ３２３Ｃ、Ｔ４３９Ｃ；番号付与は、配列番号１５８を指す）
５．追加の安定化エレメントを、４２１ＲＲＩＥＮＬＮＫＫＭＥＤＧＦＬＤＶ４３７（番号付与は、配列番号１５８を指す）を配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＩにより置き換えることにより導入した。

【0324】

当業者に一般に公知の方法を使用して配列番号５６、１６０、７８、１６１、１６２、１５８および１６３のタンパク質配列をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４中にクローニングした。比較の理由のため、Ｈ３Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８の全長ＨＡ配列（配列番号１２１）、および追加の開裂部位突然変異Ｒ３４３Ｑを有するＨ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）の全長ＨＡ配列を実験に含めた。

【0325】

形質移入剤として４０μｌの２９３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎを使用してＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）懸濁細胞（１０^６個の細胞／ｍｌ、３０ｍｌ）に発現ベクター（１μｇ／ｍｌ）を形質移入させ、さらに２日間増殖させた。細胞を回収し；アリコート化し（０．３ｍｌ、約３^＊１０^５個の細胞）、アリコートを、発現を調べるためのＨ１ＨＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）に対して生じたポリクローナル血清またはＨＡ特異的モノクローナル抗体（５マイクログラム／ｍｌ）のいずれかおよび染色に使用される二次抗体により処理した。次いで、細胞を細胞表面上の本発明の膜付着ＨＡステムドメインポリペプチドの発現について蛍光結合細胞選別（ＦＡＣＳ）により分析した。全長タンパク質中のステムドメインに結合する公知の特異性のモノクローナル抗体のパネル（ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４）を使用して保存エピトープの存在、ならびに推論により全長ＨＡおよび本発明のｍｉｎｉ−ＨＡポリペプチドの正確なフォールディングを調べた。モノクローナル抗体ＣＲ８０２０（Ｈ１およびＨ５ＨＡに結合しないことが公知）およびＣＲ９０２０（Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＨＡの頭部ドメインに結合する）も実験に含めた。結果を、陽性細胞の割合および平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表現し、図２３に示す。

【0326】

ポリクローナル抗Ｈ１血清による形質移入細胞の処理は、全長ＨＡ（黒色のバー）について２０〜８０％の陽性細胞およびｍｉｎｉ−ＨＡについて４０〜５０％の陽性細胞をもたらす。陰性対照ＦＬＨ３Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８およびｃＭ２は、極めて少数の陽性細胞を示すにすぎない。このことは、全てのＨ１全長ＨＡタンパク質について明確に検出可能なシグナルを示す平均蛍光強度（下パネル）により反映される。全長Ｈ５ＨＡについてのシグナルは低いままであり；しかしながら、このことは、ポリクローナルＨ１血清による認識の低減との組合せでのより少数の形質移入細胞により説明することができる。陰性対照ＦＬＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８およびｃＭ２は、バックグラウンドレベルにおける強度を示す。

【0327】

強力なグループ１ステムバインダーであることが公知のＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４は両方とも、多数の陽性細胞（約５０〜約９５％）および高いＭＦＩにより示されるとおり、全てのグループ１全長ＨＡおよびｍｉｎｉ−ＨＡタンパク質を認識する。このことは、これらの抗体の中和エピトープがｍｉｎｉ−ＨＡタンパク質中に存在する強力な証拠であり、このことは、全長ＨＡ中のＨＡステムドメインの天然構造に強く共通する三次元構造を示す。予測されるとおり、陰性対照ＣＲ８０２０（グループ２ＨＡに特異的）は、Ｈ１およびＨ５全長ＨＡにもＨ１およびＨ５ｍｉｎｉ−ＨＡにも結合せず、このことは、ｍｉｎｉ−ＨＡタンパク質へのＣＲ６２６１／ＣＲ９１１４中和抗体の観察される結合がａ特異的タンパク質−タンパク質相互作用から生じないことを示す。Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からの全長Ｈ３ＨＡとＣＲ９１１４またはＣＲ８０２０との間の結合は、陽性細胞の割合およびＭＦＩの両方から明確に観察され、より早期の観察と一致し、これらのモノクローナル抗体の機能性を証明する。同様に、陰性対照抗体ＣＲ９０２０（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７についてのＨＡ頭部バインダー）は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からのＨＡを除きｍｉｎｉ−ＨＡも全長ＨＡタンパク質も認識せず、このことは、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４間で観察される結合の特異性をさらに裏付ける。

【0328】

まとめると、ＨＡ頭部ドメインの不存在下で中和ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４抗体により認識されるエピトープを含有することが示された本発明の４つの新規ＨＡ由来ポリペプチドを作出した。

【0329】

実施例２１
本発明のポリペプチドによるマウスにおける致死インフルエンザチャレンジに対する保護
本発明のポリペプチドがマウスを他の場合に致死性のインフルエンザウイルスへの曝露時の死亡から保護する免疫応答を誘導し得るか否かを決定するため、インフルエンザチャレンジ実験を実施した。配列番号７８、１６１、４５および６、ならびに開裂部位を除去するための追加のＲ３４３Ｑ突然変異を含有するＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長ＨＡ（配列番号１）をコードする発現ベクターによりマウスを筋肉内で免疫化した。ｃＭ２をコードする発現ベクターを陰性対照として含めた。免疫化は、５０μｇの発現構築物＋５０μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）を使用して以下の試験プロトコルに従って実施した。

【0330】

試験プロトコル
１日目 採血。
０日目 ワクチンの投与（筋肉内）。
２１日目 ワクチンの投与（筋肉内）。
２８日目 採血。
４２日目 ワクチンの投与（筋肉内）。
４７日目 採血。
４８日目 体重、体温、臨床スコアおよび致死率の計測。
４９日目 致死用量のインフルエンザウイルス感染によるチャレンジ（経鼻）。
４９日目 残留接種材料をウイルスの逆力価測定（ｂａｃｋ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）に利用する。
４９〜７０日目 体重、体温、臨床スコアおよび致死率の毎日の計測。
臨床スコア≧３を有する動物を１日２回モニタリングする。
臨床スコア≧４または体温’’３２℃を有する動物を、どの動物が最初に該当しようとも、試験から直ちに除去する。
７０日目 全てのマウスの安楽死。
群１〜６：ＰＲ８（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ８／３４、Ｈ１Ｎ１）によるチャレンジ
群１：配列番号７８
群２：配列番号１６１
群３：配列番号１Ｒ３４３Ｑ
群４：配列番号４５
群５：配列番号６
群６：空のベクター
１群当たり１０匹のマウス。合計６０匹のマウス。ＢＡＬＢ／ｃ。

【0331】

材料および方法：
ウイルス株および源：
インフルエンザウイルス株ＰＲ８（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ８／３４、Ｈ１Ｎ１）は、Ｖｉｒａｐｕｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）から供給された。原液１×１０ｅ８ ｐｆｕ／ｍｌ バッチ＃Ｅ２００４Ｂ。
貯蔵条件：−７５℃±１０℃。フリーザー：−８６℃ＵＣＴフリーザー。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍ．Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

【0332】

動物：
マウス、ＢＡＬＢ／ｃ（特定病原体不在；ＳＰＦ）、雌、試験０日目に６〜８週齢約１７〜１９グラム。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから供給され、「耳識別」により識別する。全ての動物を馴化させ、実験の開始前１１日間維持した。

【0333】

ＤＮＡ投与
接種材料再構成の方法
上記列記の適切なＤＮＡ配合物を調製し、アリコート化し、−２０℃において貯蔵した。１つの構築物当たり１つのアリコートを注射直前に室温に解凍し、注射器中に抜き取り、注射した。それぞれのアリコートの残部は、それぞれの免疫化ラウンドの全ての注射の完了後に廃棄した。

【0334】

用量レベルおよび投与方法
マウスを、体重１ｋｇ当たり９．７５ｍｇのＸｙｌａｓｏｌ（Ｇｒａｅｕｂ Ｅ Ｄｒ．ＡＧ（ｗｗｗ．ｇｒａｅｕｂ．ｃｏｍ）；カタログ番号：７６３．０２）および４８．７５ｍｇのＫｅｔａｓｏｌ（Ｇｒａｅｕｂ Ｅ Ｄｒ．ＡＧ（ｗｗｗ．ｇｒａｅｕｂ．ｃｏｍ）；カタログ番号：６６８．５１）を用いて腹腔内注射により麻酔した。Ｇ２９針を有する０．５ｍｌの注射器を使用して５０μｌのＤＮＡ溶液をそれぞれの後足の大腿四頭筋中に筋肉内（ｉ．ｍ．）注射し、１匹のマウス当たり１００μｌの注射合計容量を生じさせた。それぞれのアリコートの残部は、それぞれの免疫化ラウンドの全ての注射の完了後に廃棄した。

【0335】

ウイルス投与：
接種材料再構成の方法
ウイルス材料を−７５℃±１０℃において貯蔵し、投与前に解凍した。解凍したら、材料を低温ＰＢＳ（４℃）中で、Ａ／ＰＲ／８／３４チャレンジについて５ＬＤ５０／５０μｌに対応させて希釈した。希釈ウイルスをマウスへの投与まで氷上で保持した。

【0336】

用量レベルおよび投与方法
動物を、１ｋｇの体重当たり９．７５ｍｇのＸｙｌａｓｏｌおよび４８．７５ｍｇのＫｅｔａｓｏｌを用いて腹腔内注射により麻酔し、それぞれの動物は５０μｌのウイルス溶液を鼻腔内により受けた。未使用材料は逆力価測定のために実験室に戻した。

【0337】

採血および血清調製
上記の試験プロトコルに規定された日数において、血液試料を採取した（中間採血：眼窩後カニューレ挿入を介する１００〜１５０μｌ、心臓穿刺を介する最終採血：約３００〜５００μｌ）。血清を、この血液から１４０００ｇにおける５分間の遠心分離により単離し、輸送までドライアイス上で−２０℃において貯蔵した。

【0338】

臨床スコアリング
ウイルスチャレンジ後の臨床徴候を、スコアリング系（健常マウスについて１点；不快感の徴候、例として、わずかな立毛、歩容のわずかな変化および歩行の増加を示すマウスについて２点；強い立毛、腹部収縮、歩容変化、不活動期間、呼吸速度の増加および時々の水泡音（弾発音／有響ノイズ）の徴候を示すマウスについて３点；前述の群の特徴の増大を有するが、活動をほとんど示さず、瀕死になるマウスについて４点；死亡マウスについて５点）によりスコアリングした。動物を、それらが３のスコアを受ける限り１日２回調査した。スコアリングは単一調査者により実施し、部分的に２つのスコアにより表わされる症状を有するマウスはスコア＋／−０．５であった。

【0339】

秤量
全ての動物を、４８日目から開始して毎日秤量した（確認番号２２１６）。動物を、死亡の場合において試験終了前、すなわち、試験からの除去時においても秤量した。体重をグラム（ｇ）で記録した。

【0340】

ウイルス逆力価測定
投与されるウイルスの用量は、動物の接種が完了した後に残留する接種材料からの８つのレプリケート試料を力価測定することにより決定した。ウイルス逆力価測定のため、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ １９．１１．７」に概略されたプロトコルに従ってＴＣＩＤ５０計測を利用した。

【0341】

結果：
試験を、技術的困難なしで、定義された試験プロトコルと一致させて実施した。インフルエンザウイルス株ＰＲ８（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ８／３４，Ｈ１Ｎ１）の接種材料の逆力価測定は、以下のＴＣＩＤ５０：ＰＲ８（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ８／３４、Ｈ１Ｎ１）：３．２×１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌをもたらした。

【0342】

図２４Ａは、この実験についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。本発明のポリペプチド配列番号４５、６および１６１をコードするＤＮＡによる免疫化は、致死用量のインフルエンザにより感染されたマウスの５０、４０および４０％の生存率をそれぞれもたらし、このことは、本発明のポリペプチドによる免疫化が保護免疫応答を実際に誘導し得ることを示す。対照的に、空のベクター対照により免疫化されたマウスは全て、ウイルスチャレンジから８日後に感染により死亡する。チャレンジ株と同種の全長ＨＡ（配列番号７８）をコードするＤＮＡによる免疫化は、致死チャレンジから全ての動物を完全に保護する（すなわち、１００％の生存率）一方、追加の開裂部位突然変異（Ｒ３４３Ｑ；番号付与は、配列番号１を指す）を含有する異種株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来する全長ＨＡ（配列番号１）をコードするＤＮＡによる免疫化は、感染動物の９０％の生存率をもたらす。

【0343】

生存曲線から得られる結果は、図２４Ｂおよび２４Ｃにおいて示されるそれぞれの群についての平均体重変化および臨床スコア中央値においても反映される。本発明のポリペプチド配列番号４５、６および１６１により免疫化された動物は、最大２５〜３０％の体重損失を示すが、感染後９日後に生存する動物は体重増加を示す。配列番号４５により免疫化された動物については、４から３への臨床スコアの降下も観察される。チャレンジ株と同種の全長ＨＡ（配列番号７８）をコードするＤＮＡにより免疫化された動物は体重損失を示さない一方、追加の開裂部位突然変異（Ｒ３４３Ｑ；番号付与は、配列番号１を指す）を含有する異種株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来する全長ＨＡ（配列番号１）をコードするＤＮＡにより免疫化された動物は体重損失および臨床症状を経験するが、生存動物は完全にカバーする。最大体重損失および臨床症状は、空のベクターにより免疫化された対照群について観察され、それらの動物の生存の欠落と一致する。

【0344】

まとめると、本発明のポリペプチド配列番号６、４５および７８は、マウスにおけるＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４による致死チャレンジに対する保護応答を誘導し得る。本発明のポリペプチド配列番号６および４５はチャレンジ株と異種のＨＡ分子に由来する一方、配列番号７８は、同種インフルエンザ株に由来することに留意される。したがって、本発明のポリペプチドは、同種および異種のインフルエンザ感染の両方に対する保護を誘導し得る。

【0345】

実施例２２
代表的なＨ１Ｎ１ＨＡ配列のパネルの選択およびそれらの配列をベースとする本発明のポリペプチドの設計
実施例２０に記載の設計方法の広い適用可能性を示すため、この方法を、Ｈ１Ｎ１ウイルスにおいて見出される天然配列変異の大部分をカバーする選択ＨＡ０配列のパネルに適用した。この実施例における公知のヒトＨ１Ｎ１ＨＡ配列のプールからの代表的なＨＡ配列のパネルの選択は、最大の代表性を有する最少数の株を選択する目的を有する。この目的を達成するため、インフルエンザウイルス配列データベース中に存在するヒトＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスのＨＡ配列間の全ての差を定量し、これらの差の構造を調査し、均一な下位群を同定した。このような群のそれぞれから、パネルに寄与する最も代表的な配列を選択した。

【0346】

この手順の初期ステップは、考慮される配列データベース中のそれぞれのペアまたは配列間の差の定量である。逆ＰＡＭ２５０（ｒＰＡＭ２５０）行列（Ｘｕ，２００４）を使用してそれぞれのアミノ酸位置における差を定量する。次いで、ユークリッド加算を使用してそのペアについての合計差を定量する。全てのペアワイズ差を使用して差の対称ｎ×ｎ行列（ｎは、考慮されるウイルス株の数と等しい）を形成する。

【0347】

主座標分析（ＰＣＡ）を使用して差の行列を構造化する（Ｈｉｇｇｉｎｓ，１９９２）。ＰＣＡは、次元縮小に基づく。入力行列は、ｎ次元空間（ｎは、考慮される株の数と等しい）中の分布とみなす。次いで、変異性を分析し、ほとんど（または全て）の変異性をカバーするために最少の次元が要求されるように構造化する。結果は、ｍ次元座標系（ｍは、ほとんどまたは全ての変異性をカバーするための次元数である）であり、最大変異は第１の軸上であり、次いで減少する。全ての考慮される配列をその座標系内に配置する。二または三次元のみが必要とされる場合、結果は、完全に２Ｄまたは３Ｄグラフでそれぞれプロットすることができ、そこで株間の差を可視化することができる。より多くの次元が必要とされる場合、さらに３Ｄプロットを第１の３つの軸から構築することができるが、そのグラフは全ての変異性をカバーするものではない。それというのも、変異の一部は第四およびより高次元中に存在するためである。

【0348】

次いで、階層およびｋ平均クラスタリングの両方を使用してｍ次元空間中の配列をクラスタリングする。群内の平均連結を使用して類似の内部変異性を有する群を得、単一株クラスターの大部分を回避する。クラスタリングは、１（１つのクラスター中の全ての株）において開始し、ｎ（それ自体のクラスターを形成するそれぞれの株）まで全てのレベルにおいて行う。それぞれのクラスターから、最も中心的な株を最も代表的なものとして選択する。次いで、最も中心的な株の組は、そのレベルクラスタリングについての代表株のパネルを形成する。クラスタリングのそれぞれのレベルについて、カバレッジ（または説明される変異の割合）を、それぞれの株の座標系の中心までの平方距離の合計と比較してそれぞれの株のその中心株までの平方距離の合計をコンピュータ処理することにより推定する。次いで、達成すべきカバレッジの最少レベルを、代表パネルの最少要求サイズになるように設定する。

【0349】

さらに、ＸｕのｒＰＡＭ２５０行列に、（挿入または欠失に起因して）２つの配列の一方がある位置上にギャップを有した場合、小さい値を差について割り当てた。さらに、重み因子を手順に含めて年間を通した分離株の数の大きい差を説明した。この変異は、部分的には真の発生変異であり、部分的にはサーベイランス／認識の異なるレベルにより駆動されるとみなした。したがって、重み因子を、特定の年の観察の数の平方根により割ったものにおいて設定した。この重み因子は、クラスター分析および中心点の選択の間に、およびカバーされる変異のレベルの推定においてｍ次元空間を構築する場合に考慮した。

【0350】

この実施例においては、本発明のポリペプチドをコードするＨＡの一部からなる構築配列を使用する。構築配列の２つの異なる組を作出した。第１の組において、シグナル配列（例えば、アミノ酸１〜１８）、アミノ酸５３〜３２０（ＨＡ頭部ドメイン）、膜貫通配列（アミノ酸５３０からＣ末端アミノ酸）（番号付与は、配列番号１を指す）または他の配列中のこれらの位置の相当物を除外して天然配列を考慮した。第２の組において、４０６、４０９、４１６、３２４、４３６、４１３位（またはそれらの相当位置）におけるアミノ酸も考慮しなかった。それというのも、これらは実施例２０に記載の一般的方法に従って改変されるためである。さらに、実施例９に記載の本発明のポリペプチド中のＧＣＮ４ベース安定化配列の付加を反映する４１９〜４３３位（の相当物）も第２の組において考慮しなかった。

【0351】

上記の方法を使用して、配列変異の７５％をカバーする７つのＨＡ配列を構築配列組１から選択し、配列変異の７４％をカバーする８つのＨＡ配列を構築配列組２から選択した。株を表１０に列記する。選択配列の３つが両方の組において現れるため、１３のユニークＨＡ配列が残留する。これらの配列を使用して実施例２０に記載の方法に従って本発明のポリペプチドを設計した。さらに、安定化ＧＣＮ４配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号８４）を、実施例９に記載のとおり、４１９〜４３３位（番号付与は、配列番号１を指す）の相当物において導入する。Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／２０／１９７８およびＨ１Ｎ１Ａ／ＵＳＳＲ／９２／１９７７のＨＡ配列に基づき設計された本発明のポリペプチドは同一であり、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６２９−Ｄ０１４１５／２００９およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／ＤＤ３−５５／２０１０のＨＡ配列に基づき設計された本発明のポリペプチドと同様である。したがって、合計１０の本発明のユニークポリペプチドを設計し、これらの配列のアラインメントを図２５に示す。

【0352】

本発明のポリペプチド配列番号１６４〜配列番号１７３、ならびにＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７のＨＡ配列をベースとする本発明のポリペプチド配列番号４５および追加の開裂部位Ｒ３４３Ｑを有する対応する全長ＨＡ配列番号１をコードするＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４中で含有する発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞の形質移入に使用し、細胞を上記のとおりＦＡＣＳにより分析した。ヒトモノクローナル抗体ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０に加え、さらにインフルエンザＡＨ１およびＨ２株を中和することが公知（Ｏｋｕｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）のマウスモノクローナル抗体Ｃ１７９を実験に含めた。結果を図２６に示す。

【0353】

本発明の全てのポリペプチドおよびＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７の全長配列は、細胞表面上で発現され、広域中和抗体ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣ１７９により認識されるが、ＣＲ８０２０により認識されない。最後のものは、インフルエンザＡグループ２からのＨＡにのみ結合することが公知である。抗体ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣ１７９の結合は、広域中和エピトープが本発明のポリペプチド中で十分保存されることを示す。これらの配列中でカバーされる配列変異を考慮すると、このことは、広域中和エピトープを含有する本発明のポリペプチドを生成する本発明者らの設計方法の一般的な適用可能性の明確な証拠である。

【0354】

実施例２３
本発明のポリペプチドｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）の特性決定
本発明の精製ポリペプチドｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）を、実施例１３に記載のとおりに得た。ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の立体構造的エピトープの存在を確認するため、これらの抗体と精製タンパク質との結合をバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ^３８４，Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）により試験した。この目的のため、ビオチン化ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０をストレプトアビジンコートセンサ上で固定化し、センサを最初に本発明の精製ポリペプチド（２５０ｎＭ）の溶液に曝露させて会合速度を計測し、次いで洗浄溶液に曝露させて解離速度を計測した。比較の理由のため、実験を全長タンパク質（配列番号１４９）を用いてその三量体および単量体形態の両方で繰り返した。結果を図２７に示す。

【0355】

固定化されたＣＲ６２６１は、溶液中のこれらのタンパク質への曝露後の明確な応答により証明されるとおり、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長ＨＡのエクトドメインの単量体および三量体形態の両方を認識する（図２７Ａ）。三量体タンパク質について観察される応答は、同一配列を有する単量体について観察されるものよりも大きく（約１．３ｎｍと０．９）、三量体と比較して小さいサイズの単量体により（少なくとも部分的に）引き起こされる効果である。ｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）へのＣＲ６２６１の結合は、約０．２５ｎｍの最大応答をもたらす。洗浄溶液への曝露時、複合体の解離が３つ全ての分析物について観察され、本発明のポリペプチドｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）について観察される放出最速であり、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長ＨＡ（配列番号１４９）のエクトドメインの三量体形態について最も遅い。

【0356】

ＣＲ６２６１と同様に、固定化ＣＲ９１１４も、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７からの全長ＨＡのエクトドメインの三量体および単量体形態の両方、ならびに本発明のポリペプチドｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）を認識する。応答は、３つ全ての分析物についてＣＲ６２６１（三量体、単量体全長ＨＡ（配列番号１４９）およびステムドメインポリペプチドｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）について、それぞれ１．５、１．４および０．８ｎｍ）と比較して強力であり、３つ全ての場合において洗浄緩衝液への複合体の曝露時に抗原の放出は最小または検出不可能である。ＣＲ８０２０について、応答は、分析物のいずれについても観察されず、この抗体のインフルエンザグループ２ステムドメイン特異性と一致した。

【0357】

精製ステムドメインポリペプチドへのＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の結合をさらに特性決定するため、力価測定を実施した。この目的のため、固定化ＣＲ６２６１含有センサを、それぞれ５００、２５０、１２５、６３、３１、１６および８ｎＭの濃度におけるｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）溶液に曝露させ、１４０００ｓ後の最終応答を記録した。応答をステムドメインポリペプチド濃度の関数としてプロットし、定常状態１：１結合モデルへのフィットを実施し、ＣＲ６２６１／ステムドメインポリペプチド複合体について約１９０ｎＭの解離定数Ｋ_ｄを生じさせた、図２８Ａ。同様に、固定化ＣＲ９１１４により改変されたセンサを、それぞれ８０、４０、２０、１０、５、２．５および１．３ｎＭの濃度におけるｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）に曝露させ、１０８００ｓ後の最終応答を記録した。ステムドメインポリペプチド濃度の関数としての最終応答のフィッティングにより、ＣＲ９１１４／ステムドメインポリペプチド複合体について５．４ｎＭのＫ_ｄ値を生じさせた（図２８Ｂ）。

【0358】

まとめると、本発明のポリペプチドｓ−Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号１４５）は、広域中和モノクローナル抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４に結合し得、このことは、このステムドメインポリペプチド中の対応する中和エピトープの存在を裏付ける。

【0359】

実施例２４
本発明のポリペプチドによるマウスにおける致死インフルエンザチャレンジに対する保護
本発明のポリペプチドがマウスを他の場合に致死性のインフルエンザウイルスへの曝露時に死亡から保護する免疫応答を誘導し得るか否かを決定するため、インフルエンザチャレンジ実験を実施した。Ｈ３全長Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（配列番号１２１）、ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１（配列番号１２４）およびＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４配列番号１３０をコードする発現ベクターによりマウスを筋肉内で免疫化した。免疫化を、５０μｇの発現構築物＋５０μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）を以下の試験プロトコルに従って使用して実施した。

【0360】

試験プロトコル
１日目 採血。
０日目 ワクチンの投与（筋肉内）。
２１日目 ワクチンの投与（筋肉内）。
２８日目 採血。
４２日目 ワクチンの投与（筋肉内）。
４７日目 採血。
４８日目 体重、体温、臨床スコアおよび致死率の計測。
４９日目 致死用量のインフルエンザウイルス感染によるチャレンジ（経鼻）。
４９日目 残留接種材料をウイルスの逆力価測定に利用する。
４９〜７０日目 体重、体温、臨床スコアおよび致死率の毎日の計測。
臨床スコア≧３を有する動物を１日２回モニタリングする。
臨床スコア≧４または体温’’３２℃を有する動物を、どの動物が最初に該当しようとも、試験から直ちに除去する。
７０日目 全てのマウスの安楽死。
群７〜１０：ＨＫ６８（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／６８、Ｈ３Ｎ２）によるチャレンジ
群７：配列番号１２１
群８：配列番号１３０
群９：配列番号１２４
群１０：空のベクター
１群当たり１０匹のマウス。合計４０匹のマウス。ＢＡＬＢ／ｃ。

【0361】

材料および方法：
ウイルス株および源
インフルエンザウイルス株ＨＫ６８（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／６８）を、Ｐｒｏｆ Ｊ．Ｋａｔｚ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ，ＵＳＡ）により提供し、次いでＶｉｒａｐｕｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）により増殖させた。ウイルスをマウス肺中で複数回継代してマウスにおける病原性を向上させた。このウイルスについての好適な参照は、Ｆｒａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １９９９；１７：２２３７である。原液３×１０ｅ８ ｐｆｕ／ｍｌ。バッチ＃Ｆ１１０９Ａ。
貯蔵条件：−７５℃±１０℃。フリーザー：−８６℃ＵＣＴフリーザー。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍ．Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

【0362】

動物：
マウス、ＢＡＬＢ／ｃ（特定病原体不在；ＳＰＦ）、雌、試験０日目に６〜８週齢約１７〜１９グラム。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから供給され、「耳識別」により識別する。全ての動物を馴化させ、実験の開始前１１日間維持した。

【0363】

ＤＮＡ投与
接種材料再構成の方法
上記列記の適切なＤＮＡ配合物を調製し、アリコート化し、−２０℃において貯蔵した。１つの構築物当たり１つのアリコートを注射直前に室温に解凍し、注射器中に抜き取り、注射した。それぞれのアリコートの残部は、それぞれの免疫化ラウンドの全ての注射の完了後に廃棄した。

【0364】

用量レベルおよび投与方法
マウスを、体重１ｋｇ当たり９．７５ｍｇのＸｙｌａｓｏｌ（Ｇｒａｅｕｂ Ｅ Ｄｒ．ＡＧ（ｗｗｗ．ｇｒａｅｕｂ．ｃｏｍ）；カタログ番号：７６３．０２）および４８．７５ｍｇのＫｅｔａｓｏｌ（Ｇｒａｅｕｂ Ｅ Ｄｒ．ＡＧ（ｗｗｗ．ｇｒａｅｕｂ．ｃｏｍ）；カタログ番号：６６８．５１）を用いて腹腔内注射により麻酔した。Ｇ２９針を有する０．５ｍｌの注射器を使用して５０μｌのＤＮＡ溶液をそれぞれの後足の大腿四頭筋中に筋肉内（ｉ．ｍ．）注射し、１匹のマウス当たり１００μｌの注射合計容量を生じさせた。それぞれのアリコートの残部は、それぞれの免疫化ラウンドの全ての注射の完了後に廃棄した。

【0365】

ウイルス投与：
接種材料再構成の方法
ウイルス材料を−７５℃±１０℃において貯蔵し、投与前に解凍した。解凍したら、材料を低温ＰＢＳ（４℃）中で、Ａ／ＨＫ／１／６８チャレンジについて１０ＬＤ５０／５０μｌに対応させて希釈した。希釈ウイルスをマウスへの投与まで氷上で保持した。

【0366】

用量レベルおよび投与方法
動物を、１ｋｇの体重当たり９．７５ｍｇのＸｙｌａｓｏｌおよび４８．７５ｍｇのＫｅｔａｓｏｌを用いて腹腔内注射により麻酔し、それぞれの動物は５０μｌのウイルス溶液を鼻腔内により受けた。未使用材料は逆力価測定のために実験室に戻した。

【0367】

採血および血清調製
上記の試験プロトコルに規定された日数において、血液試料を採取した（中間採血：眼窩後カニューレ挿入を介する１００〜１５０μｌ、心臓穿刺を介する最終採血：約３００〜５００μｌ）。血清を、この血液から１４０００ｇにおける５分間の遠心分離により単離し、輸送までドライアイス上で−２０℃において貯蔵した。

【0368】

臨床スコアリング
ウイルスチャレンジ後の臨床徴候を、スコアリング系（健常マウスについて１点；不快感の徴候、例として、わずかな立毛、歩容のわずかな変化および歩行の増加を示すマウスについて２点；強い立毛、腹部収縮、歩容変化、不活動期間、呼吸速度の増加および時々の水泡音（弾発音／有響ノイズ）の徴候を示すマウスについて３点；前述の群の特徴の増大を有するが、活動をほとんど示さず、瀕死になるマウスについて４点；死亡マウスについて５点）によりスコアリングした。動物を、それらが３のスコアを受ける限り１日２回調査した。スコアリングは単一調査者により実施し、部分的に２つのスコアにより表わされる症状を有するマウスはスコア＋／−０．５であった。

【0369】

秤量
全ての動物を、４８日目から開始して毎日秤量した（確認番号２２１６）。動物を、死亡の場合において試験終了前、すなわち、試験からの除去時においても秤量した。体重をグラム（ｇ）で記録した。

【0370】

ウイルス逆力価測定
投与されるウイルスの用量は、動物の接種が完了した後に残留する接種材料からの８つのレプリケート試料を力価測定することにより決定した。ウイルス逆力価測定のため、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ １９．１１．７」に概略されたプロトコルに従ってＴＣＩＤ５０計測を利用した。

【0371】

結果：
試験を、技術的困難なしで、定義された試験プロトコルと一致させて実施した。インフルエンザウイルス株ＨＫ６８（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／６８、Ｈ３Ｎ２）の接種材料の逆力価測定は、以下のＴＣＩＤ５０：ＨＫ６８（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／６８）：１×１０^３ＴＣＩＤ５０／ｍｌをもたらした。

【0372】

図２９は、ＥＬＩＳＡにより測定された４９日目におけるＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からのＨＡのエクトドメインに対するＩｇＧ応答を示す。本発明のポリペプチドを配列番号１２４および配列番号１３０をコードするＤＮＡによる免疫化は、Ｈ３ＨＡＨＫ６８エクトドメインに対する明確に検出可能な応答を誘導する一方、空のベクター陰性対照について応答は検出されない。予測されるとおり、最大応答は、Ｈ３全長Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（配列番号１２１）による免疫化について観察される。

【0373】

図３０Ａは、この実験についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。本発明のポリペプチド配列番号１２４および１３０をコードするＤＮＡによる免疫化は、致死用量のインフルエンザにより感染されたマウスの４０および２０％の生存率をそれぞれもたらし、このことは、本発明のポリペプチドによる免疫化が保護免疫応答を実際に誘導し得ることを示す。対照的に、空のベクター対照により免疫化されたマウスは全て、ウイルスチャレンジから１０日後に感染により全て死亡する。チャレンジ株と同種の全長ＨＡ（配列番号１２１）をコードするＤＮＡによる免疫化は、致死チャレンジから全ての動物を完全に保護する（すなわち、１００％の生存率）。

【0374】

生存曲線から得られる結果は、図３０Ｂおよび３０Ｃにおいて示されるそれぞれの群についての平均体重変化および臨床スコア中央値においても反映される。本発明のポリペプチド配列番号１２４および１３０をコードするＤＮＡにより免疫化された動物は、最大２０％の体重損失を示すが、感染後９日後に生存する動物は体重増加を示す。全長ＨＡ（配列番号１２１）をコードするＤＮＡにより免疫化されたマウスは、体重損失を示さない。最大体重損失および臨床症状は、空のベクターにより免疫化された対照群について観察され、それらの動物の生存の欠落と一致する。

【0375】

まとめると、本発明のポリペプチド配列番号１２４および１３０は、免疫原性であり、マウスにおけるＨ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８による致死チャレンジに対する保護応答を誘導し得る。

【0376】

実施例２５
Ｈ３ＨＡをベースとするステムドメインポリペプチドの設計および特性決定
実施例１２に記載のステムドメインポリペプチドをさらに改善するため、構築物の追加の組を設計した。５３および３３４位（Ｔ５３Ｃ、Ｇ３３４Ｃ；ｃｌｕｓｔｅｒ１６）ならびに３９および５１位（Ｇ３９Ｃ−Ｅ５１Ｃ；ｃｌｕｓｔｅｒ１７）（番号付与は、配列番号１２１を指す）における安定化ジスルフィド架橋の形成を可能とするシステイン突然変異の２つの追加の組を設計した。さらに４２０〜４２１位の間、すなわち、長いＣＤへリックス（図１参照）のＮ末端側において挿入すべき２つの配列を設計した。挿入配列を、それらが三量体分子中の個々の単量体間の単量体間ジスルフィド架橋の形成を容易にするように設計した。２つの異なる配列、すなわち、ＮＡＴＧＧＣＣＧＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒ１８）およびＧＳＧＫＣＣＧＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒ１９）を設計した。ｃｌｕｓｔｅｒ１８の配列は、ステムドメインポリペプチド中にグリコシル化部位（すなわち、ＮＡＴ）を導入する配列も含む。一部の場合、グリコシル化部位は、４１７〜４１９位においてもＮＡＴへの突然変異により導入する。Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からの全長ＨＡの配列を出発点として使用して、上記の改変をＳ６２〜Ｐ３２２欠失と組み合わせて以下のステムドメインポリペプチドを得た：
配列番号１７４：Ｈ３ＨＫｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ＋ｃｌ９＋１０＋１１＋１２＋ＧＣＮ４Ｔ−ＣＧ７−１
配列番号１７５：ＨＫ６８Ｈ３ｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ＋ｃｌ９＿＋１０＋１２＋１８＋ＧＣＮ４Ｔ
配列番号１７６：ＨＫ６８Ｈ３ｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ＋ｃｌ９＿＋１０＋１２＋１６＋ＣＧ７−ＧＣＮ４Ｔ
配列番号１７７：ＨＫ６８Ｈ３ｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ＋ｃｌ９＿＋１０＋１２＋１９＋ＧＣＮ４Ｔ
配列番号１７８：ＨＫ６８Ｈ３ｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ＋ｃｌ９＿＋１０＋１２＋１７＋ＣＧ７−ＧＣＮ４Ｔ
配列番号１７９：Ｈ３ＨＫ６８ｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ２＋ｃｌ９＿＋１０＋１２＋ＧＣＮ４Ｔ

【0377】

一般に当業者に公知の方法を使用して上記のタンパク質配列をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４中にクローニングした。細胞表面上での発現およびモノクローナル抗体の結合を、上記のとおり蛍光結合細胞選別により分析した。比較の理由のため、さらに、開裂部位中のＲ３４５Ｑ突然変異をさらに含有するＨ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８（配列番号１２１）の全長ＨＡ、および配列番号１３０（ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４）ならびに陰性対照ｃＭ２も実験に含めた。

【0378】

図３１は、この実験の結果を示す。ポリクローナル抗Ｈ３血清について観察される応答（ＭＦＩ、パネルＡ；陽性細胞の割合、パネルＢ）により証明されるとおり、全ての構築物が細胞表面上で発現される。ＣＲ８０４３およびＣＲ８０２０の結合は、配列番号１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１２１および１３０について観察され、このことは、ｃｌｕｓｔｅｒ１６の突然変異がそれらの抗体の立体構造的エピトープの安定化に寄与しないことを示す。ｍＡｂのＣＲ９１１４について、バックグラウンドを上回る結合は、配列番号１７４：Ｈ３ＨＫｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ＋ｃｌ９＋１０＋１１＋１２＋ＧＣＮ４Ｔ−ＣＧ７−１およびより小程度で配列番号１７７：ＨＫ６８Ｈ３ｍｉｎｉ２ａ−ｌｉｎｋｅｒ＋ｃｌ９＿＋１０＋１２＋１７＋ＣＧ７−ＧＣＮ４Ｔについてのみ観察することができる。両方の配列は、Ｂループ中の追加のグリコシル化部位を含有し、このことは、ＣＲ９１１４の立体構造的中和エピトープに対するこの改変の安定化効果を示す。

【0379】

まとめると、本発明者らは、上記の方法に従って、本発明のステムドメインポリペプチドをグループ２の血清型、特にＨ３亜型について得ることができることを示した。これらのステムドメインポリペプチドのさらなる安定化は、Ｂループ中のグリコシル化部位を導入することにより達成することができる。これらの配列も本発明により包含される。

【0380】

実施例２６
Ｈ３ＨＡをベースとするＨＡステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（配列番号８９）からの全長Ｈ３、配列番号１０５：Ｈ３−ｍｉｎｉ２、配列番号１０８：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１、配列番号１１２：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１２、配列番号１１１：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２、配列番号１１４：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ｔｒｉ、配列番号１１３：Ｈ３−ｍｉｎｉ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４、配列番号１１９：Ｈ３−ｍｉｎｉ３−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２＋１４、配列番号１２０：Ｈ３−ｍｉｎｉ４−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２＋１４をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。ｃＭ２をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。

【0381】

４匹のマウス（ＢＡＬＢ＼ｃ）の群を、５０μｇの構築物＋５０μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）により筋肉内で１、２１および４２日目に免疫化した。４９日目、最後の採血を実施し、血清を回収した。陰性対照プラスミドｃＭ２を、約１０μｇの構築物＋約２μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）および同一の免疫化スキームを使用して遺伝子銃により投与した。Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５およびＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からの組換え全長ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから入手）を抗原として使用して血清をＥＬＩＳＡにより分析した。手短に述べると、９６ウェルプレートを５０ｎｇのＨＡにより４℃において一晩コートし、次いでブロック緩衝液（１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４＋２％のスキムミルク）と室温において１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０により洗浄し、血清の５０倍希釈から出発するブロック緩衝液中の１００μｌの２倍希釈系列を添加する。結合抗体は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、当分野において十分確立された標準的プロトコルを使用して検出する。力価を、ＨＡ抗原に結合するマウスモノクローナル抗体の系列希釈物から構成される標準曲線と比較し、１ｍｌ当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍｌ）として表現する。４９日後のＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８およびＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９からのＨＡを使用するＥＬＩＳＡの結果を図３２Ａ、ＢおよびＣにそれぞれ示す。この実験に含められるステムドメインポリペプチドをコードするＤＮＡにより免疫化されたマウスから得られた血清は、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５からの同種全長ＨＡおよび類似の程度でＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からの異種全長ＨＡを認識し得る。対照的に、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５からの全長ＨＡ（配列番号８９）により免疫化されたマウスから得られた血清は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８およびＡ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９からの異種ＨＡよりも同種ＨＡに対する高い応答を示す。

【0382】

まとめると、データは、Ｈ３ＨＡに由来する本発明のポリペプチドが全長ＨＡに対して指向される免疫応答を誘導し得ることを示す。

【0383】

実施例２７
Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８のＨ３ＨＡをベースとするＨＡステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からの全長Ｈ３（配列番号１２１）、配列番号１２４：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１、配列番号１２５：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１２、配列番号１２６：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２、配列番号１２８：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ｔｒｉ、配列番号１３０：ＨＫ６８Ｈ３ｍ２−ｃｌ９＋１０＋１１＋１２−ＧＣＮ４をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。ｃＭ２をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。

【0384】

４匹のマウス（ＢＡＬＢ＼ｃ）の群を、１００μｇの構築物＋１００μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）により筋肉内で１、２１および４２日目に免疫化した。４９日目、最後の採血を実施し、血清を回収した。陰性対照プラスミドｃＭ２を、約１０μｇの構築物＋約２μｇのアジュバント（ｐＵＭＣＶ１−ＧＭ−ＣＳＦ）および同一の免疫化スキームを使用して遺伝子銃により投与した。血清を、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からの組換え全長ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから入手）を抗原として使用してＥＬＩＳＡにより分析した。手短に述べると、９６ウェルプレートを５０ｎｇのＨＡにより４℃において一晩コートし、次いでブロック緩衝液（１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４＋２％のスキムミルク）と室温において１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０により洗浄し、血清の５０倍希釈から出発するブロック緩衝液中の１００μｌの２倍希釈系列を添加する。結合抗体は、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、当分野において十分確立された標準的プロトコルを使用して検出する。力価を、ＨＡ抗原に結合するマウスモノクローナル抗体の系列希釈物から構成される標準曲線と比較し、１ｍｌ当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍｌ）として表現する。

【0385】

４９日後のＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からのＨＡを使用するＥＬＩＳＡの結果を図３３に示す。この実験に含められるステムドメインポリペプチドをコードするＤＮＡにより免疫化されたマウスから得られた血清は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８からの同種全長ＨＡを認識し得る。予測されるとおり、全長ＨＡをコードするＤＮＡによる免疫化は、同種ＨＡタンパク質に対しては高い抗体力価をもたらす一方、ｃＭ２をコードする陰性対照発現ベクターによる免疫化は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８の全長ＨＡを認識する抗体を誘導しない。

【0386】

まとめると、データは、Ｈ３ＨＡに由来する本発明のポリペプチドが全長Ｈ３ＨＡに対して指向される免疫応答を誘導し得ることを示す。

【0387】

実施例２８
グループ１およびグループ２インフルエンザウイルスを中和する抗体を誘発し得るＨ１ＨＡをベースとする別のステムドメインポリペプチドの設計
実施例４および６は、広域中和ＣＲ６２６１抗体のエピトープを安定的に曝露させるＨ１配列をベースとするポリペプチドを開示する。ＣＲ６２６１がもっぱら系統発生グループ１からのインフルエンザウイルスを中和するという事実を考慮すると、このエピトープに対して設計されたポリペプチドは、系統発生グループ２インフルエンザウイルスに対する強力な反応を誘発し得ない。このような広域交差中和抗体を誘導する本発明によるポリペプチドを設計する別の手法は、エピトープ中の重要なアミノ酸の構造および生化学的特徴に関してＨ３ＨＡ配列により密接に類似するＨ１ＨＡ配列バリアントを使用することである。グループ特異的抗体および分子（ＣＲ６２６１、Ｆ１０およびＨＢ３６）ならびに結晶化ｐａｎインフルエンザ抗体ＦＩ６（Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ，２０１１）の構造間の比較に基づき、本発明者らは、グループ１−グループ２Ｔ４９Ｎ（ＨＡ２）突然変異を立体衝突の導入なしでＦＩ６によってのみ提供することができることを見出した。ＨＡ２の４９位におけるアスパラギンは、ＮＣＢＩインフルエンザデータベース：Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｕｂｅｉ／Ｓ１／２００９（ＡＣＹ０６６２３）およびＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｈａｓｅｌｕｅｎｎｅ／ＩＤＴ２６１７／２００３（ＡＢＶ６０６９７）の２つのグループ１ウイルス中に存在する。したがって、一実施形態において、実施例４、６および９に開示される本発明の基礎を構成するＨ１配列は、それらのＮ４９含有ＨＡ配列のものである。あるいは、実施例４、６および９に記載の本発明による配列は、ＴをＮアミノ酸に変化させるためのＨＡ２中の４９位における追加の突然変異を有する。表７は、本発明のポリペプチドのための出発配列として使用することができる例示的Ｈ１ＨＡ配列の配列アラインメントを示す。

【0388】

配列番号１８０は、突然変異Ｔ３９２Ｎ（番号付与は、配列番号１を指す）により配列番号４５に由来する。配列番号１中のＴ３９２は、上記のとおりＨＡ２中の４９位におけるトレオニンに対応する。当業者に周知の方法を使用して、本発明のこのポリペプチドをコードする遺伝子を合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４中にクローニングした。ＣＲ９１１４およびＣＲ６２６１の中和エピトープの存在を、上記のとおり蛍光結合細胞選別により確認した。結果を図３４に示す。配列番号１８０についてのＭＦＩは、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４結合について配列番号４５および配列番号１について観察されるＭＦＩと同等である一方、ＣＲ９０２０（全長ＨＡ分子の頭部領域に結合することが公知）は、配列番号１のみを認識し、ＣＲ８０２０（インフルエンザＡグループ２のＨＡに特異的）は、配列番号１８０も、配列番号１も、配列番号４５も認識しない。陰性対照ｃＭ２は、この実験において使用されるモノクローナル抗体のいずれによっても認識されない。

【0389】

まとめると、突然変異Ｔ３９２Ｎを含有する配列番号１８０は、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の中和エピトープを含む。

【0390】

実施例２９
膜貫通配列を欠く本発明の追加のポリペプチドの設計
天然形態のインフルエンザＨＡは、細胞またはウイルス膜上で三量体として存在する。ある実施形態において、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中での発現後に生成されるように細胞内および膜貫通配列を除去する。ＨＡの分泌エクトドメインを発現させ、精製する方法は記載されている（例えば、Ｄｏｐｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ ２００９；Ｅｋｉｅｒｔ ｅｔ ａｌ ２００９，２０１１；Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ ２００４，２００６；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ １９８１参照）。当業者は、これらの方法を本発明のステムドメインポリペプチドに直接適用して分泌（可溶性）ポリペプチドの発現を達成することもできることを理解する。したがって、これらのポリペプチドも本発明に包含される。例えば、グループ１インフルエンザウイルスのＨＡ配列に由来する本発明のポリペプチドの場合、本発明の可溶性ポリペプチドは、残基５１４（の相当物）からＣ末端（番号付与は、配列番号１を指す）のポリペプチド配列の欠失により作出することができる。あるいは、追加の残基を本発明のポリペプチド中に、例えば、残基５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１または５２２から配列を欠失させることにより含めることができる。場合によりｈｉｓタグ配列（ＨＨＨＨＨＨまたはＨＨＨＨＨＨＨ）を精製目的のため、場合によりリンカーを介して連結させて付加することができる。場合により、リンカーは、精製後にｈｉｓタグを除去するためのタンパク質分解開裂部位を含有し得る。可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、例えば、ｆｏｌｄｏｎ配列を導入することによりさらに安定化させることができる。上記のとおり得られたポリペプチドも本発明に包含される。

【0391】

配列番号１８１〜１８５は、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７のＨＡ配列に由来する本発明の可溶性ポリペプチドの配列を示す。同様に、配列番号１８６〜１８７は、Ｈ３Ｎ２Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１／１９６８のＨＡ配列に由来する本発明の可溶性ポリペプチドの配列を示す。当業者は、例えば、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５亜型の他のインフルエンザＡワクチン株の他のＨＡ配列に由来する本発明のポリペプチドについての相当配列を設計することができることを理解する。Ｃ末端の６つのヒスチジンを精製目的のために付着させることも当業者には明確である。このタグを使用しない他の精製方法が存在するため、６つのヒスチジン配列は任意選択であり、この精製タグを欠く配列も本発明に包含される。

【0392】

【表1】

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【0393】

【表2】

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【0394】

【表3】

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【0395】

【表4】

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【0397】

【表6】

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【0398】

【表7】

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【0399】

【表8】

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【0400】

【表9】

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【0401】

【表10】

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【表18】

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【0410】

【表19】

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【0411】

【表20】

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【0412】

Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ

【0413】

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【図1】

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【図2】

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【図3】

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【図4A】

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【図4B】

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【図5】

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【図6A】

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【図6B】

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【図7】

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【図8A】

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【図8B】

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【図9A】

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【図9B】

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【図10A】

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【図11A】

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【図11B】

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【図11C】

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【図11D】

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【図11E】

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【図11F】

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【図12A】

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【図12B】

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【図12C】

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【図13A】

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【図14】

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【図15】

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【図16】

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【図17】

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【図18】

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【図19A】

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【図20A】

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【図20B】

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【図20C】

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【図20D】

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【図22C】

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【図25】

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【図27】

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【図28】

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【図29】

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【図30A】

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【図30B】

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【図30C】

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【図31】

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【図32A】

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【図32B】

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【図32C】

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【図33】

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【図34】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]