特許 6296381 二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマー及びその調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6296381

(24)【登録日】2018年3月2日

(45)【発行日】2018年3月20日

(54)【発明の名称】二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマー及びその調製方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 495/10 20060101AFI20180312BHJP

   A61K 47/34 20170101ALN20180312BHJP

   C08G 64/30 20060101ALN20180312BHJP

   C08G 64/02 20060101ALN20180312BHJP

   A61K 31/704 20060101ALN20180312BHJP

【ＦＩ】

   C07D495/10CSP

   !A61K47/34

   !C08G64/30

   !C08G64/02

   !A61K31/704

【請求項の数】8

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2017-514770(P2017-514770)

(86)(22)【出願日】2015年5月27日

(65)【公表番号】特表2017-517573(P2017-517573A)

(43)【公表日】2017年6月29日

(86)【国際出願番号】CN2015079998

(87)【国際公開番号】WO2015180655

(87)【国際公開日】20151203

【審査請求日】2016年12月16日

(31)【優先権主張番号】201410231697.3

(32)【優先日】2014年5月28日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】516355265

【氏名又は名称】博瑞生物医薬（蘇州）股▲分▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＢＲＩＧＨＴＧＥＮＥ ＢＩＯ−ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】孟 鳳 華

(72)【発明者】

【氏名】鄒 艷

(72)【発明者】

【氏名】鐘 志 遠

(72)【発明者】

【氏名】袁 建 棟

【審査官】 三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／００４２９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０２６５７８７３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開２００１−１３１１７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２７２８０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ４９３／００−４９７／２２

Ａ６１Ｋ ３１／３３− ３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００− ４７／６９

Ｃ０８Ｇ ６３／００− ６４／４２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーであって、その化学構造式は以下の通りであることを特徴とする、二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマー。

【化1】

【請求項2】

極性溶媒でジブロモネオペンチルグリコールと水硫化ナトリウム一水和物を反応させて下記化学構造式

【化2】

を有する化合物Ａを得るステップと、
その後、空気中で前記化合物Ａを酸化させて下記化学構造式

【化3】

を有する化合物Ｂを得るステップと、
最後に、窒素雰囲気下で、環状エーテル系溶媒で前記化合物Ｂとエチルクロロホルメートを反応させて二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーを得るステップと
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製方法。

【請求項3】

前記ジブロモネオペンチルグリコールと水硫化ナトリウム一水和物のモル比が（２.５〜１０）：１であり、前記化合物Ｂとエチルクロロホルメートのモル比が１：（２〜４）であることを特徴とする、請求項２に記載の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製方法。

【請求項4】

前記化合物Ａを調製する際の反応温度が５０℃であり、反応時間が４８時間であり、
前記化合物Ｂを調製する際の前記化合物Ａの酸化時間が２４時間であり、
環状カーボネートモノマーを調製する時の反応温度が氷水浴であり、反応時間が４時間であることを特徴とする、請求項２に記載の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製方法。

【請求項5】

前記極性溶媒がＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミドであり、環状エーテル系溶媒がテトラヒドロフラン又は１,４-ジオキサンであることを特徴とする、請求項２に記載の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製方法。

【請求項6】

前記化合物Ａをエーテル系溶媒に溶解させた後、空気中で酸化させて前記化合物Ｂを得ることを特徴とする、請求項２に記載の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製方法。

【請求項7】

前記エーテル系溶媒は、テトラヒドロフラン又は１,４-ジオキサンであることを特徴とする、請求項６に記載の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製方法。

【請求項8】

精製処理をさらに含み、
前記精製処理は、具体的には、
（１）前記化合物Ａの精製：反応終了後、減圧で反応物の溶媒を留去し、その後蒸留水で希釈し、更に酢酸エチルで抽出し、最後に有機相を回転蒸発して黄色い粘稠状の前記化合物Ａを得ることと、
（２）二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの精製：反応終了後、ろ過し、濾液が回転濃縮を経て、更にジエチルエーテルで再結晶し、黄色い結晶、即ち二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーを得ること
であることを特徴とする、請求項２に記載の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、環状カーボネートモノマーに関し、二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製及び応用に関する。

【背景技術】

【0002】

環状カーボネートモノマーは非常に独特な性能を有し、例えば簡単に合成することにより高収量、高純度の生成物を得ることができ、さらに小分子又は高分子により生分解可能なポリカーボネートを得ることができる。その重合体は、優れた性能、例えば通常良好な生体適合性を有し、体内において分解可能で、分解生成物が人体に吸収される又は人体の正常な生理的経路を経て体外へ排出されることができ、脂肪族ポリエステルと同様に例えば、手術用縫合糸、骨固定機器、生体組織工学足場材料、及び薬物の放出制御持体等の生物医学の各分野に幅広く応用されている。その中では、合成された生分解性ポリマーは、免疫原性が比較的低く、例えば生分解性及び機械的性能等を含む性能がいずれも容易にコントロールできるため特に注目されている。通常の生分解性ポリマーはトリメチレン環状カーボネート（ＴＭＣ）等の環状カーボネートモノマー、又はグリコリド（ＧＡ）、ラクチド（ＬＡ）、カプロラクトン（ＣＬ）等の環状エステルモノマーの開環重合により調製して得られ、すでに米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認が取得されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

しかしながら、ＴＭＣ、ＧＡ、ＬＡ及びＣＬなどのような従来の環状カーボネートモノマー又は環状エステルモノマーは構造が比較的単一であり、修飾に使用するための官能基が欠如しているので、調製した重合体の多くが後置修飾（Ｐｏｓｔｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）することが困難となり、医学的ニーズを満たすことが困難となり、例えば、それらの伝統的なカーボネートモノマーに基づいた重合体の薬物持体又は表面修飾コート層は安定性が劣るという致命的な欠点がある。その体内での安定性をどのように向上させるかは解決すべき課題となっている。

【0004】

また、従来技術では、環状カーボネートモノマーの調製及び／又は開環重合のプロセスにおいて、その構造には反応しやすい基が存在するため、保護と脱保護のステップが必要とすることは多く、それにより調製プロセスが複雑となる。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーを提供することを目的とする。

【0006】

上述の目的を達成するために、本発明の具体的な形態は、二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーであって、その化学構造式が以下の通りである。

【0007】

【化1】

【0008】

上述環状カーボネートモノマーの調製方法は、極性溶媒でジブロモネオペンチルグリコールと水硫化ナトリウム一水和物を反応させて化合物Ａを得るステップと、その後、空気中で化合物Ａを酸化させて化合物Ｂを得るステップと、最後に、窒素雰囲気下、環状エーテル系溶媒で化合物Ｂとエチルクロロホルメートを反応させて前記二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーを得るステップを含む。

【0009】

上述した形態においては、前記ジブロモネオペンチルグリコールと水硫化ナトリウム一水和物のモル比が（２.５〜１０）：１であり、化合物Ｂとエチルクロロホルメートのモル比が１：（２〜４）である。

【0010】

好ましい形態においては、上述二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製方法は、
（１）水硫化ナトリウム一水和物を極性溶液に溶解し、ジブロモネオペンチルグリコールを等圧滴下ロートで徐々に滴下し、５０℃の条件で４８時間反応させ、化合物Ａを得る；
前記化合物Ａの化学構造式は以下の通りである；

【0011】

【化2】

【0012】

（２）空気中で化合物Ａを酸化させて化合物Ｂを得、前記化合物Ｂの化学構造式は以下の通りである；

【0013】

【化3】

【0014】

（３）窒素雰囲気下、化合物Ｂとエチルクロロホルメートを環状エーテル系溶媒に溶解し、その後、等圧滴下ロートでトリエチルアミンを徐々に滴下し、氷水浴中で４時間反応させ、二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーを得、前記環状カーボネートモノマーの化学構造式は以下の通りである；

【0015】

【化4】

【0016】

好ましい形態においては、前記極性溶媒はＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）であり；前記エーテル系溶媒はテトラヒドロフランである。

【0017】

好ましい形態においては、化合物Ａをエーテル系溶媒に溶解させた後、空気中で酸化させて化合物Ｂを得る。このようにして、化合物Ａの酸化速度は向上した。エーテル系溶媒は、テトラヒドロフランや１,４-ジオキサンであってもよい。反応プロセスや精製反応条件を簡略化するためには、ステップ（２）で化合物Ａを溶解するための溶媒とステップ（３）で化合物Ｂを溶解するための溶媒は一致である。

【0018】

好ましい形態においては、上述ステップ（１）、ステップ（３）が終了後に精製処理を行い、具体的には：
（１）化合物Ａの精製：反応終了後、減圧で反応物の溶媒を留去し、その後蒸留水で希釈し、更に酢酸エチルで抽出し、最後に有機相を回転蒸発させて黄色い粘稠状の化合物Ａを得る；
（２）二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの精製：反応終了後、ろ過し、濾液は回転濃縮を経て、更にエーテルで再結晶し、黄色い結晶、即ち二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーを得る。

【0019】

上述減圧蒸留、抽出、回転蒸発、回転濃縮及び再結晶はいずれも従来技術に属するものであり、当業者は必要に応じて適宜選択できるものである。本発明は、化合物Ａを精製する際に、酢酸エチルで４回抽出することと、環状カーボネートを精製する際に、ジエチルエーテルで３-５回再結晶することが好ましい。

【0020】

上述二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの調製プロセスは以下のように示す。

【0021】

【化5】

【0022】

上述二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーは、開環重合により側鎖に二硫黄５員環を含むポリカーボネートが得られ、該二硫黄５員環基は開環重合に影響しないため、保護と脱保護プロセスは必要とされていない。例えば、上述環状カーボネートモノマーは、ジクロロメタンの中で、ポリエチレングリコールを開始剤とし、ビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛を触媒として開環重合し、ブロックポリマーを形成することができる。その反応式は以下の通りである。

【0023】

【化6】

【0024】

上述環状カーボネートモノマーは、さらに他の環状エステル、環状カーボネートモノマーと開環共重合反応し、ランダム共重合体及びブロック共重合体を調製することができる。前記他の環状カーボネートは、トリメチレン環状カーボネート（ＴＭＣ）を含み、前記他の環状エステルモノマーは、カプロラクトン（ε-ＣＬ）、ラクチド（ＬＡ）又はグリコリド（ＧＡ）を含む。

【0025】

該側鎖に二硫黄５員環を含む機能性ポリカーボネートは、触媒量の還元剤、例えばジチオスレイトール又はグルタチオンの触媒作用下で安定な化学的架橋を形成できるが、細胞内での還元環境下で急速に脱架橋される。したがって、該側鎖に二硫黄５員環を含む機能性ポリカーボネートは、例えば循環安定な薬物持体の調製に用いられることができ、標的細胞内において薬物を急速に放出できるというような優れた実用的価値を有する。

【発明の効果】

【0026】

上述した形態によれば、本発明は従来技術と比べて以下のようなメリットがある。
１.本発明にかかる二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーは、初めて開示されたものであって、２つの反応炉（三つのステップ）さえあれば効率よく容易に調製することができ、従来技術における保護と脱保護プロセスは必要とされていない。

【0027】

２.本発明で開示された二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーは、二硫黄５員環基が環状カーボネートモノマーの開環重合に影響しないため、従来技術における保護と脱保護プロセスを必要することなく、開環重合して側鎖に二硫黄５員環を含む機能性ポリカーボネートを得ることができる。

【0028】

３.本発明で開示された環状カーボネートモノマーの調製は簡単であり、該モノマーから簡単に開環重合して還元に敏感且つ可逆的に架橋できるという特性を有するカーボネート重合体が得られる。該重合体はさらに自己組織化することができ、薬物放出系の制御、組織工学とバイオチップに用いられ、生物材料においても良好な応用価値を有する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、実施例１の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーの核磁気スペクトログラムである。

【図2】図２は、実施例１の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーのマススペクトログラムである。

【図3】図３は、実施例１の二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマーのＵＶ吸収スペクトログラムである。

【図4】図４は、実施例３におけるブロックポリマーＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋの核磁気スペクトログラムである。

【図5】図５は、実施例４におけるブロックポリマーＰＥＧ５ｋ-Ｐ（ＣＤＣ２.５ｋ-ｃｏ-ＣＬ３.９ｋ）の核磁気スペクトログラムである。

【図6】図６は、実施例６における重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子のＲａｗ２６４.７とＭＣＦ-７細胞に対する毒性の結果を示す図である。

【図7】図７は、実施例７におけるドキソルビシン負荷の重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子の体外への放出結果を示す図である。

【図8】図８は、実施例におけるドキソルビシン負荷の重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子のＲａｗ２６４.７細胞に対する毒性の結果を示す図である。

【図9】図９は、実施例８におけるドキソルビシン負荷の重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子の、マウス体内での血液循環の結果を示す図である。

【図10】図１０は、実施例９におけるドキソルビシン負荷の重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫マウスに対する生物分布の結果を示す図である。

【図11】図１１は、実施例１０におけるドキソルビシン負荷の重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫マウスに対する腫瘍の増殖抑制の曲線図である。

【図12】図１２は、実施例１０のマウス体重変化の曲線図である。

【図13】図１３は、実施例１０のマウスの生存曲線図である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下、実施例と図面に基づいて本発明をさらに説明する。
実施例１：二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）の合成

【0031】

【化7】

【0032】

１、水硫化ナトリウム一水和物（２８.２５ｇ、３８１.７ｍｍｏｌ）を４００ｍＬ Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、５０℃で完全溶解まで加熱し、ジブロモネオペンチルグリコール（２０ｇ、７６.４ｍｍｏｌ）を一滴ずつ滴下し、４８時間反応させた。減圧で反応物の溶媒ＤＭＦを留去し、その後２００ｍＬ蒸留水で希釈し、２５０ｍＬ酢酸エチルを４回抽出し、最後に有機相を回転蒸発して黄色い粘稠状の化合物Ａを得、収率が７０％であった。

【0033】

２、４００ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した化合物Ａを空気中で２４時間放置し、分子間のメルカプト基が酸化され硫黄-硫黄結合となり、化合物Ｂを得、収率が９８％超であった；
３、窒素雰囲気下、化合物Ｂ（１１.７ｇ、７０.５ｍｍｏｌ）を干燥したＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解し、完全溶解まで攪拌した。次に、０℃まで冷却し、エチルクロロホルメート（１５.６５ｍＬ、１１９.８ｍｍｏｌ）を添加し、その後Ｅｔ_３Ｎ（２２.８３ｍＬ、１２０.０ｍｍｏｌ）を一滴ずつ滴下した。滴下終了後、該反応系は氷水浴の条件下で４ｈ反応し続けた。反応終了後、ろ過により生成したＥｔ_３Ｎ・ＨＣｌを除去し、濾液は回転濃縮を経て、最後にジエチルエーテルで複数回の再結晶を行い、黄色い結晶、即ち二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）を得、収率が６４％であった。

【0034】

図１は上述の生成物であるＣＤＣの核磁気スペクトログラムであって、^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ３.１４（ｓ、４Ｈ）、４.５１（ｓ、４Ｈ）。元素分析が：Ｃ：４１.８％、Ｈ：４.２０％、Ｏ：２４.３％（理論：Ｃ：４１.６７％、Ｈ：４.１７％、Ｏ：２５％、Ｓ：３３.３％）、ＣＤＣモノマーの質量分析：ＭＳ：１９２.５（理論分子量：１９２）、図２を参照する。図３は、異なる濃度の上述生成物のモノマーＣＤＣのテトラヒドロフラン溶液のＵＶスペクトログラムであり、モノマーでは二硫黄５員環が３３０ｎｍで吸収され、吸収強度がモノマー濃度の増大に伴い増強した。

【0035】

実施例２：二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）の合成
１、水硫化ナトリウム一水和物（２８.２５ｇ、３８１.７ｍｍｏｌ）を４００ｍＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、４０℃で完全溶解まで加熱し、ジブロモネオペンチルグリコール（２０ｇ、７６.４ｍｍｏｌ）を一滴ずつ滴下し、４８時間反応した。減圧で反応物の溶媒ＤＭＳＯを留去し、その後２００ｍＬ蒸留水で希釈し、２５０ｍＬ酢酸エチルで４回抽出し、最後に有機相回転蒸発により黄色い粘稠状の化合物Ａを得、収率が４２％であった。

【0036】

２、４００ｍＬの１,４-ジオキサンに溶解した化合物Ａを空気中で放置し、分子間のメルカプト基が酸化され硫黄-硫黄結合となり、化合物Ｂを得、収率が９８％超であった。

【0037】

３、窒素雰囲気の保護下で、化合物Ｂ（１１.７ｇ、７０.５ｍｍｏｌ）を乾燥した１,４-ジオキサン（１５０ｍＬ）に溶解し、完全溶解まで攪拌した。次に、０℃まで冷却し、エチルクロロホルメート（１５.６５ｍＬ、１１９.８ｍｍｏｌ）を添加し、その後Ｅｔ_３Ｎ（２２.８３ｍＬ、１２０.０ｍｍｏｌ）を一滴ずつ滴下した。滴下終了後、該反応系を氷水浴の条件下で４ｈ反応し続けた。反応終了後、生成したＥｔ_３Ｎ・ＨＣｌをろ過で除去し、濾液を回転濃縮し、最後にジエチルエーテルで複数回の再結晶を行い、黄色い結晶、即ち二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ） を得、収率が３２％であった。

【0038】

実施例３：ジブロックポリマーＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋの合成

【0039】

【化8】

【0040】

式中、ｍ＝１１４、ｎ＝１４.６。
窒素環境下で、０.３ｇ（１.５６ｍｍｏｌ）二硫黄５員環官能基含有環状カーボネートモノマー（ＣＤＣ）、２ｍＬジクロロメタンを封止反応器に入れ、その後分子量が５０００のポリエチレングリコール０.５ｇ（０.１ｍｍｏｌ）と触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液（０.１ｍｏｌ／Ｌ）１ｍＬを入れ、次に反応器を封止し、グローブボックスから取り出し、４０℃のオイルバスに入れて１日間反応させ、その後氷酢酸で反応を中止させ、ジエチルエーテル (無水)の中で沈殿させ、最終にろ過、真空乾燥を経て生成物である環状カーボネート重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋを得た。

【0041】

図４は前記環状カーボネート重合体の核磁気スペクトログラムである：^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：３.０８（ｓ、-ＣＣＨ_２）、３.３０（ｍ、-ＯＣＨ_３）、４.０５（ｓ、-ＣＨ_２ＯＣＯＣＨＣＨ_２-）、４.０７（ｓ、-ＯＣＨ_２ＣＣＨ_２Ｏ-）、４.３１（ｍ、-ＣＣＨ_２）。

【0042】

実施例４：ジブロックポリマーＰＥＧ５ｋ-Ｐ（ＣＤＣ２.５ｋ-ｃｏ-ＣＬ３.９ｋ）の合成

【0043】

【化9】

【0044】

式中、ｍ＝１１４、ｘ＝２１.９、ｙ＝１３.０、ｎ＝３４.９。
窒素環境下で、０.２８ｇ（１.４６ｍｍｏｌ）ＣＤＣモノマーと０.４ｇ（３.５１ｍｍｏｌ）のカプロラクトン（ε-ＣＬ）を３ｍＬジクロロメタンに溶解し、それを封止反応器に入れ、その後分子量が５０００のポリエチレングリコール０.５ｇ（０.１ｍｍｏｌ）と１ｍの触媒であるビス[ビス(トリメチルシリル)アミド]亜鉛のジクロロメタン溶液（０.１ｍｏｌ／Ｌ）を入れ、次に反応器を封止して、グローブボックスから取り出し、４０℃のオイルバスに入れて１日間反応させ、その後氷酢酸で反応を中止させ、ジエチルエーテル (無水)の中で沈殿させ、最終にろ過、真空乾燥を経て生成物である環状カーボネート重合体ＰＥＧ５ｋ-Ｐ（ＣＤＣ２.５ｋ-ｃｏ-ＣＬ３.９ｋ）を得た。

【0045】

図５は前記重合体の核磁気スペクトログラムである：^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１.４０（ｍ、-ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２-）、１.６５（ｍ、-ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２-）、２.３０（ｔ、-ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２-）、３.０８（ｓ、-ＣＣＨ_２）、３.３０（ｍ、-ＯＣＨ_３）、４.０３（ｔ、-ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ-）、４.０５（ｓ、-ＣＨ_２ＯＣＯＣＨＣＨ_２-）、４.０７（ｓ、-ＯＣＨ_２ＣＣＨ_２Ｏ-）、４.３１（ｍ、-ＣＣＨ_２）；ＧＰＣにより測定した分子量：１４.０ｋＤａ、分子量分布：１.５６。

【0046】

実施例５：重合体ミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋの調製
透析法により重合体ミセルナノ粒子を調製した。重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋをＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（２ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、２００μＬを取り出して８００μＬのリン酸緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐＨ ７.４、ＰＢ）に滴下し、透析バック（ＭＷＣＯ ３５００）に入れて一晩透析させ、水を５回交換した。透析媒体がＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ ７.４）である。最終には濃度０.２ｍｇ／ｍＬの重合体ナノ粒子を得た。

【0047】

実施例６：重合体ナノ粒子ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋの架橋、脱架橋、細胞毒性
ナノ粒子の架橋は添加した触媒量のジチオスレイトール（ＤＴＴ）により行われた。重合体ナノ粒子水溶液に窒素ガスを１０分間導入し、できるだけ空気を排除するようにした。その後、密閉反応器のナノ粒子溶液（１ｍＬ、０.２５ｍｇ／ｍＬ、３.２１×１０^-５ｍｍｏｌ）に二次水１０μＬに溶解したジチオスレイトール（ＤＴＴ）（０.００７ｍｇ、４.６７×１０^-５ｍｍｏｌ、リポ酸官能基モル数１０％）を添加し、密閉し、室温で攪拌して１日間反応させた。測定した粒子のサイズが１５０ナノメートルであり、架橋していない粒子の粒径と比べ、１５％ぐらい小さくなった。架橋後のナノ粒子は、濃度を１００倍希釈した後、その粒径と粒径分布がほとんど変化しなかったこと、及び生理条件下で安定であったことから、二硫黄原子による架橋はナノ粒子の安定性を大幅に向上させることができることが分かった。

【0048】

硫黄-硫黄結合は、還元剤、例えばグルタチオン（ＧＳＨ）の作用下で容易に開裂することができる。窒素保護及び３７℃の条件下で、架橋ナノ粒子溶液に窒素ガスを１０分間導入した後、重合体ナノ粒子溶液中の最終濃度が１０ｍＭとなるようにＧＳＨを入れた。架橋ナノ粒子の粒径は経時的に徐々に破壊される。これは、重合体における硫黄原子２個を含む環は、多量な還元物質の存在下で開裂することを示している。細胞質の中にも高濃度の還元物質ＧＳＨが存在するため、調製したナノ薬物持体が循環安定であったが、細胞内に取り込まれると急速に解離して薬物が放出された。

【0049】

ＭＴＴ法によって架橋ミセルナノ粒子に対する細胞毒性を測定した。使用した細胞はＭＣＦ-７（人乳腺がん細胞）細胞とＲａｗ ２６４.７（マウスマクロファージ）細胞であった。ＭＣＦ-７細胞又はＲａｗ ２６４.７細胞を１×１０^４個／ｍＬとなるように９６穴プレートに播種し、各穴に１００μＬであり、細胞が壁に付くまで培養し、実験組に濃度の異なる重合体ナノ粒子を含む培養液を入れ、別途細胞空白対照穴と培地空白穴を設置し、平行穴を４個にした。インキュベータの中で２４時間培養した後、９６穴プレートを取り出し、ＭＴＴ（５.０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加し、４時間培養し続け、その後に各穴に１５０μＬのＤＭＳＯで溶解して生成した結晶子を添加し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍで吸光度（Ａ）を測定し、培地の空白穴をゼロとし、細胞生存率を計算した。

【0050】

【数1】

【0051】

式中、Ａ_Ｔが試験組の４９０ｎｍにおける吸光度であり、Ａ_Ｃが空白対照組の４９２ｎｍにおける吸光度であった。重合体の濃度がそれぞれ０.１、０.２、０.３、０.４、０.５ｍｇ／ｍＬであった。図６はナノ粒子の細胞毒性の結果であり、図６から分かるように、重合体ナノ粒子の濃度が０.１ｍｇ／ｍＬから０.５ｍｇ／ｍＬまで増大した際に、Ｒａｗ２６４.７細胞とＭＣＦ-７細胞の生存率は依然として８５％より上回り、ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ重合体ナノ粒子は良好な生体適合性を有することが示された。

【0052】

実施例７：架橋ミセルナノ粒子ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋの薬物負荷、体外への放出及び細胞毒性
ドキソルビシンを薬物とした。抗がん薬物であるドキソルビシンは蛍光敏感物質であるため、すべての操作が遮光条件下で行った。まず、ドキソルビシンの塩酸塩を除去し、その操作については以下の通りである。１.２ｍｇ（０.００２ｍｍｏｌ）ドキソルビシンを２２５μＬのＤＭＳＯに溶解し、トリエチルアミン０.５８ｍＬ（ｍ＝０.４１９ｍｇ、０.００４ｍｍｏｌ）を添加して１２時間攪拌し、上層清液を吸引除去した。ドキソルビシンのＤＭＳＯ溶液の濃度が５.０ｍｇ／ｍＬであった。ナノ重合体ナノ粒ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋをＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ドキソルビシンのジメチルスルホキシド溶液と重合体ナノ粒子ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋのＤＭＦ溶液を所定の薬物と重合体の質量比で均一に混合し、攪拌しながら体積の４倍となる量の二次水（１５ｓ／ｄ）を徐々に入れ、滴下後一次水を透析した。

【0053】

薬物負荷ミセルナノ粒子の架橋も実施例５の架橋方法によって行った。１００μＬ架橋ドキソルビシン負荷の重合体ナノ粒子溶液を冷凍乾燥し、その後３.０ｍＬ ＤＭＳＯに溶解し、蛍光分光光度計で測定し、ドキソルビシンの標準曲線に合わせて包埋效率を計算した。

【0054】

以下の公式により薬物負荷量（ＤＬＣ）と包埋效率（ＤＬＥ）を計算した。
薬物負荷量（ｗｔ.％）＝（薬物重量／重合体重量）×１００％
包埋效率（％）＝（薬物負荷重量／薬物総投入量）×１００％
表１は上述計算した結果であり、重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋナノ粒子は小分子抗がん薬物であるドキソルビシンに対して優れる包埋作用を有することが分かった。

【0055】

表１はドキソルビシン負荷架橋ミセルナノ粒子における薬物負荷量、包埋效率の結果である。

【0056】

【表1】

【0057】

ドキソルビシンの放出実験は３７℃の恒温シェーカーで発振（２００ｒｐｍ）して行った。薬物の放出は二組の重複サンプルを用いて比較し、各組がそれぞれ二つの重複サンプルを有する：第１組、１０ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）を添加した疑似細胞内還元環境ＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ ７.４）における架橋ドキソルビシン負荷の重合体ナノ粒子の放出；第二組、ＰＢ（１０ｍＭ、ｐＨ ７.４）における架橋ドキソルビシン負荷の重合体ナノ粒子の放出；薬物負荷重合体ナノ粒子濃度が２５ｍｇ／Ｌであり、０.５ｍＬを取り出して放出用透析バック（ＭＷＣＯ：１２,０００-１４,０００）に入れ、各試験管に対応する透析溶媒２５ｍＬを入れて、所定の時間間隔で５.０ｍＬ透析バック外部媒体を取り出して測定に供するとともに、試験管に５.０ｍＬ対応する媒体を追加投入した。ＥＤＩＮＢＵＲＧＨ ＦＬＳ９２０蛍光光度計を用いて溶液中の薬物濃度を測定した。図７はドキソルビシンの累積放出量と時間との関係を示すものである。図から分かるように、疑似腫瘍細胞の還元性物質グルタチオン（ＧＳＨ）を入れた後、ＧＳＨ成分を入れていないものと比べて薬物の放出が明らかに速くなり、１０ｍＭ還元物質ＧＳＨの存在下で薬物負荷の架橋ナノ粒子は薬物を効率よく放出できることが示された。

【0058】

ＤＯＸ負荷のＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子のＲａｗ２６４.７細胞、ＭＣＦ-７細胞等に対する毒性についてＭＴＴ法で測定し、薬物負荷未架橋ナノ粒子及び遊離薬物を対照とした。Ｒａｗ２６４.７細胞を例として、Ｒａｗ２６４.７細胞を１×１０^４個／ｍＬで９６穴プレートに播種し、各穴に１００μＬ、細胞が壁に着くまで培養した。その後、実験組にそれぞれ０.０１、０.１、１、５、１０、５０及び１００μｇ／ｍＬのドキソルビシン負荷架橋ナノ粒子溶液、ドキソルビシン負荷未架橋ナノ粒子溶液及び遊離ドキソルビシンを含有する新鮮な培養液を入れ、別途に細胞空白対照穴と培地空白穴を設置し、各穴の平行穴を４個にした。インキュベータで４８時間培養した後、９６穴プレートを取り出し、ＭＴＴ（５.０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加し、４ｈ培養し続けた後、各穴に１５０μＬ ＤＭＳＯで溶解して生成した結晶子を添加し、マイクロプレートリーダー用いて４９２ｎｍで吸光度（Ａ）を測定し、培地の空白穴をゼロとし、細胞生存率を計算した。図８を参照したところ、ドキソルビシン負荷の架橋ナノ粒子はＲａｗ２６４.７細胞に対する半数致死濃度が４.８９μｇ／ｍＬであったため、ＤＯＸ負荷のＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子は細胞の中で効率よく薬物を放出し、またがん細胞を死滅させることできることが分かった。

【0059】

実施例８：薬物負荷ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子のマウス体内での血液循環の測定
実験で体重１８〜２０グラム程度、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（中国科学院上海生命科学院実験動物センター）を採用し、秤量後体重によって均一に組分けし、尾静脈よりマウス体内に薬物負荷ナノ粒子と自由薬物を注射し、なお、ＤＯＸの投与量が１０ｍｇ／ｋｇであり、０、０.２５、０.５、１、２、４、８、１２及び２４時間の時点に定時に約１０μＬ採血し、分散法によって血液の重量を正確に秤量し、血液に濃度１％のトリトン１００μＬとＤＭＦ（中では２０ｍＭのＤＴＴ、１ＭのＨＣｌを含む）５００μＬを入れて抽出しし、遠心分離（２００００回転／分、２０分）後、上層清液を取り、蛍光によって各時点でのＤＯＸ量を測定した。

【0060】

図９はドキソルビシン負荷の重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子のマウス体内における血液循環の結果を示す図である、横軸が時間点であり、縦軸が合計ＤＯＸ注射量（ＩＤ％／ｇ）に占める１グラム血液におけるＤＯＸ量である。図から分かるように、自由ＤＯＸの循環期間が短くて２時間までにすでにＤＯＸが検出されにくくなるが、薬物負荷架橋ナノ粒子が２４時間後に依然として４ＩＤ％／ｇを有した。計算によりそれがマウス体内の排出半減期が４.６７時間となり、一方、自由ＤＯＸがただ０.２１時間となるため、薬物負荷架橋ナノ粒子はマウス体内で安定し、比較的長い循環期間を持つことが分かった。

【0061】

実施例２１：薬物負荷ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫マウスに対する生物分布
実験で体重１８〜２０グラム程度、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを採用し、皮下注射により１×１０^６個のＢ１６黒色腫細胞を注射し、約二週間後、腫瘍の大きさが１００〜２００ｍｍ^３となった際に、尾静脈注射によりマウス体内に薬物負荷ナノ粒子と自由ＤＯＸを注射し（ＤＯＸ投与量が１０ｍｇ／ｋｇ）、６、１２及び２４時間後にマウスを死なせ、腫瘍及び心臓、肝臓、脾臓、肺臓と腎臓組織を取り出して清浄し、秤量後に５００μＬ１％のトリトンを添加し、ホモジナイザーで粉砕させ、更に９００μＬ ＤＭＦを添加して抽出（中では２０ｍＭのＤＴＴ、１ＭのＨＣｌを含む）を行った。遠心分離（２００００回転／分、２０分）後、上層清液を取り、蛍光により各時間点のＤＯＸ量を測定した。

【0062】

図１０はドキソルビシン負荷の重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫マウスに対する生物分布の結果を示した図である。横軸が組織器官であり、縦軸が合計ＤＯＸ注射量（ＩＤ％／ｇ）に占める１グラムの腫瘍又は組織におけるＤＯＸ量である。薬物負荷ナノ粒子の６、１２及び２４時間の時点における腫瘍の蓄積量がそれぞれ３.１２、２.９３、２.５２ＩＤ％／ｇであった、自由ＤＯＸの１.０５、０.５２と０.２９ＩＤ％／ｇに比べて３〜１２倍増大し、薬物負荷架橋ナノ粒子はＥＰＲ効果により腫瘍部位に多く蓄積され、且つ長時間に継続できることが示された。

【0063】

実施例２２：薬物負荷ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫マウス対する治療実験
実験で体重１８〜２０グラム程度、４〜６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを採用し、秤量後、体重によって均一に組分けし、皮下注射により１×１０^６個のＢ１６黒色腫細胞を注射し、約一週間後、腫瘍の大きさが３０〜５０ｍｍ^３になった際に、０、２、４、６及び８日間において尾静脈注射によりマウス体内に薬物負荷ナノ粒子と自由ＤＯＸを注射し、なお、薬物負荷ナノ粒子におけるＤＯＸ量が１０、２０、３０ｍｇ／ｋｇであり、自由ＤＯＸの投与量が１０ｍｇ／ｋｇであった、０日間から１５日間までに毎日各組のマウスの体重を測り、ノギスで腫瘍の体積を正確に測った。なお、腫瘍体積の計算方法は、Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）／２（式中、Ｌが腫瘍の長さ、Ｗが腫瘍の幅、Ｈが腫瘍の厚さ）である。４６日間までにマウスの生存状況を観察し続けた。

【0064】

図１１はドキソルビシン負荷の重合体ＰＥＧ５ｋ-ｂ-ＰＣＤＣ２.８ｋ架橋ナノ粒子の黒色腫マウスに対する腫瘍の増殖抑制曲線図である。図１２はマウス体重の変化曲線図である。図１３はマウスの生存曲線図である。図から、ＤＯＸ濃度が３０ｍｇ／ｋｇ、ＤＯＸ負荷したナノ粒子で１６日間治療した後、腫瘍が明らかに抑制された一方、ＤＯＸが腫瘍の増殖が抑制されたが、マウスに対して副作用が大きいことが分かった。薬物負荷ナノ粒子におけるＤＯＸの濃度が３０ｍｇ／ｋｇになったとしても、マウスの体重がほとんど変化しないため、薬物負荷ナノ粒子はマウスに対して副作用がないことが示された。それに対して、７日間にＤＯＸ組のマウス体重が２３％低下したのはＤＯＸのマウスに対する副作用が大きいことが示された。同様にＤＯＸ濃度３０ｍｇ／ｋｇであるものの、４６日間ＤＯＸ負荷のナノ粒子で治療した組ではマウスがすべて存活したが、１０日間ＤＯＸ治療したのはすべて死亡した。そして対照とするＰＢＳ組のマウスは３５日間にすべて死亡した。したがって、該薬物負荷ナノ粒子は腫瘍の増殖を効率よく抑制し、さらにマウスに対して副作用がなく、担がんマウスの生存期間も延長させることができる。

【0065】

以上の結果から、本発明のモノマーで調製して得られた重合体は、良好な生体適合性を有し、薬物持体として適用する際に、抗腫瘍薬物の体内での循環期間を増加させ、薬物が腫瘍部位の蓄積率を増加させ、薬物が正常組織への損傷を回避し、腫瘍細胞を効果的に死滅させることができるとともに正常細胞への影響が小さい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】