特許 6297573 物質曝露装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6297573

(24)【登録日】2018年3月2日

(45)【発行日】2018年3月20日

(54)【発明の名称】物質曝露装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 35/08 20060101AFI20180312BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20180312BHJP

   C12Q 1/00 20060101ALI20180312BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20180312BHJP

【ＦＩ】

   G01N35/08 A

   C12M1/00 A

   C12Q1/00

   G01N37/00 101

   G01N37/00 102

【請求項の数】20

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2015-531403(P2015-531403)

(86)(22)【出願日】2012年9月13日

(65)【公表番号】特表2015-528574(P2015-528574A)

(43)【公表日】2015年9月28日

(86)【国際出願番号】AU2012001094

(87)【国際公開番号】WO2013036997

(87)【国際公開日】20130321

【審査請求日】2015年9月11日

(73)【特許権者】

【識別番号】503319102

【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ クィーンズランド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ジャスティン・ジョン・クーパー−ホワイト

(72)【発明者】

【氏名】ドリュー・マレー・ティットマーシュ

【審査官】 長谷 潮

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−０８１０１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０２４５９５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−０４２１０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０２４７７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００８−２３３００２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１１８０３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／００８６０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５０４８１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１０７５１９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３５／００−３７／００

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｑ １／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

物質を条件へと曝露するための装置であって、
ａ）多数のウェルチャネルを含むウェルのアレイであって、各ウェルチャネルが、前記ウェルチャネルに沿って隔てられた複数のウェルを含み、前記ウェルが、使用される物質を含有するアレイと、
ｂ）複数の注入口セットであって、各注入口セットが、
ｉ）それぞれの第１の流体を受容する第１の注入口と、
ｉｉ）それぞれの第２の流体を受容する第２の注入口と、を含む、注入口セットと、
ｃ）１または複数の流体を各ウェルチャネルへと選択的に供給して、これにより、前記物質を異なる条件へと曝露し、前記条件に対する前記物質の応答を決定することを可能とするように、前記注入口セットの注入口へとカップリングされたチャネルであって、各チャネルは分岐して、流体を、少なくとも２つのウェルチャネルへと供給し、少なくとも２つのチャネルが合流して、流体の混合物を、少なくとも１つのウェルチャネルへと供給する、チャネルと、
ｄ）基板及び被覆層であって、前記被覆層は第１の層および第２の層を含み、前記チャネルは前記第１の層内の複数の第１層チャネルと前記第２の層内の複数の第２層チャネルとを含み、それぞれの流体を、前記第２の層内の前記第２層チャネルを介して前記第１の層内の前記第１層チャネルへと供給するように、前記注入口セットの注入口のうちの少なくともいくつかは前記第２の層内に装備されており、前記ウェルが、前記基板及び前記被覆層のうちの少なくとも一つに規定されている、基板及び被覆層と、
を含む装置。

【請求項2】

各ウェルチャネルが、
ａ）流体の同等の容量、
ｂ）流体の同等の流動、および
ｃ）流体の同等の比率
のうちの少なくとも１つを受容するように、各チャネルのウェルチャネル形状が配置される、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記流体のそれぞれの比率が各ウェルチャネルに供給されるように、各チャネルがそれぞれのチャネル形状を有することによって流体の相対的な流動を制御し、
前記チャネル形状が、
ａ）チャネルの外形、
ｂ）チャネルの屈曲、
ｃ）チャネルの長さ、
ｄ）チャネルの高さ、
ｅ）チャネルの幅、
ｆ）チャネルの角度、および
ｇ）チャネル内の障害物
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の装置。

【請求項4】

少なくとも２つのチャネルが混合部分の上流で合流し、前記チャネルが、その中に含有される流体を混合するための混合部分を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の装置。

【請求項5】

ａ）第１の因子の流体および緩衝液を受容するための第１の注入口セットと、
ｂ）第２の因子の流体および緩衝液を受容するための第２の注入口セットと、
ｃ）第３の因子の流体および緩衝液を受容するための第３の注入口セットと
を含み、各ウェルチャネルが、それぞれの濃度の、前記第１の因子の流体、前記第２の因子の流体、および前記第３の因子の流体の各々を受容する、請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。

【請求項6】

ａ）前記物質を含有するシーディング流体を受容するための少なくとも１つのシーディング注入口と、
ｂ）少なくとも１つのシーディング排出口と
を含み、前記少なくとも１つのシーディング注入口およびシーディング排出口が、前記ウェルチャネルと流体連絡しており、これにより、前記ウェルに前記物質をシーディングすることを可能とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。

【請求項7】

前記少なくとも１つのシーディング注入口および前記少なくとも１つのシーディング排出口のうちの少なくとも１つを前記ウェルチャネルへと接続するための多数のシーディングチャネルを含む、請求項６に記載の装置。

【請求項8】

前記少なくとも１つのシーディング注入口が、前記ウェルチャネルの、前記少なくとも１つのシーディング排出口と反対側の末端へと接続されている、請求項６または７に記載の装置。

【請求項9】

前記シーディング排出口が、前記チャネルと流体連絡しており、前記シーディング排出口が、前記ウェルチャネルのシーディング後にストッパーを使用して遮断され、これにより、それぞれの前記流体を前記ウェルチャネルへと供給することを可能とするように配置されている、請求項６から８のいずれか一項に記載の装置。

【請求項10】

ａ）ウェルチャネルおよびウェルのうちの少なくとも１つへの流体の供給、ならびに
ｂ）ウェルチャネルおよびウェルのうちの少なくとも１つからの流体および／または物質のサンプリング
のうちの少なくとも１つを選択的に制御するための少なくとも１つの制御デバイスを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。

【請求項11】

前記制御デバイスが、チャネルを選択的に遮断するための弁を含む、請求項１０に記載の装置。

【請求項12】

前記チャネルが、マイクロ流体チャネルである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の装置。

【請求項13】

前記被覆層が、成形されたポリマー材料を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の装置。

【請求項14】

前記基板および前記被覆層が、
ａ）接着カップリング、
ｂ）熱カップリング、
ｃ）機械的カップリング、
ｄ）プラズマカップリング、
ｅ）共有結合／化学的カップリング、
ｆ）静電カップリング、および
ｇ）磁性カップリング
のうちの少なくとも１つを使用してカップリングされている、請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置。

【請求項15】

少なくとも前記ウェルがコーティングされている、請求項１から１４のいずれか一項に記載の装置。

【請求項16】

前記コーティングが、
ａ）プロモーター、
ｂ）阻害剤、
ｃ）成長因子、
ｄ）凝固因子、
ｅ）ホルモン、
ｆ）シグナル伝達作用物質、
ｇ）化学組成物、
ｈ）薬物、
ｉ）タンパク質、
ｊ）リガンド、
ｋ）抗体、
ｌ）生物、
ｍ）細胞、
ｎ）ミニ細胞、
ｏ）合成細胞、
ｐ）リポソーム、
ｑ）ミセル、
ｒ）ポリマーミセル（ポリマーソーム）、
ｓ）脂質、
ｔ）ポリマー、
ｕ）界面活性剤、
ｖ）脂肪酸、
ｗ）イオン溶液、
ｘ）酸性溶液または塩基性溶液、
ｙ）検出試薬、
ｚ）ＤＮＡ分子、
ａａ）ＲＮＡ分子、
ｂｂ）ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、
ｃｃ）ヌクレオチド、
ｄｄ）ヌクレオシド、
ｅｅ）ポリペプチド、
ｆｆ）アミノ酸、
ｇｇ）ウイルス粒子、
ｈｈ）プラスミド、
ｉｉ）ナノ粒子、
ｊｊ）マイクロ粒子、
ｋｋ）磁性粒子、
ｌｌ）馴化培地、
ｍｍ）馴化培地から精製された画分、
ｎｎ）天然抽出物、
ｏｏ）培養培地成分、
ｐｐ）細胞培養添加剤、
ｑｑ）炭水化物、
ｒｒ）ビタミン、
ｓｓ）代謝物、
ｔｔ）オリゴヌクレオチド、
ｕｕ）融合タンパク質、
ｖｖ）プロテオグリカン、および
ｗｗ）病原体
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の装置。

【請求項17】

少なくとも１つの流体が、作用物質を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の装置。

【請求項18】

前記作用物質が、
ａ）プロモーター、
ｂ）阻害剤、
ｃ）成長因子、
ｄ）凝固因子、
ｅ）ホルモン、
ｆ）シグナル伝達作用物質、
ｇ）化学組成物、
ｈ）薬物、
ｉ）タンパク質、
ｊ）リガンド、
ｋ）抗体、
ｌ）生物、
ｍ）細胞、
ｎ）ミニ細胞、
ｏ）合成細胞、
ｐ）リポソーム、
ｑ）ミセル、
ｒ）ポリマーミセル（ポリマーソーム）、
ｓ）脂質、
ｔ）ポリマー、
ｕ）界面活性剤、
ｖ）脂肪酸、
ｗ）イオン溶液、
ｘ）酸性溶液または塩基性溶液、
ｙ）検出試薬、
ｚ）ＤＮＡ分子、
ａａ）ＲＮＡ分子、
ｂｂ）ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、
ｃｃ）ヌクレオチド、
ｄｄ）ヌクレオシド、
ｅｅ）ポリペプチド、
ｆｆ）アミノ酸、
ｇｇ）ウイルス粒子、
ｈｈ）プラスミド、
ｉｉ）ナノ粒子、
ｊｊ）マイクロ粒子、
ｋｋ）磁性粒子、
ｌｌ）馴化培地、
ｍｍ）馴化培地から精製された画分、
ｎｎ）天然抽出物、
ｏｏ）培養培地成分、
ｐｐ）細胞培養添加剤、
ｑｑ）炭水化物、
ｒｒ）ビタミン、
ｓｓ）代謝物、
ｔｔ）オリゴヌクレオチド、
ｕｕ）融合タンパク質、
ｖｖ）プロテオグリカン、および
ｗｗ）病原体
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１７に記載の装置。

【請求項19】

前記物質が、
ａ）プロモーター、
ｂ）阻害剤、
ｃ）成長因子、
ｄ）凝固因子、
ｅ）ホルモン、
ｆ）シグナル伝達作用物質、
ｇ）化学組成物、
ｈ）薬物、
ｉ）タンパク質、
ｊ）リガンド、
ｋ）抗体、
ｌ）生物、
ｍ）細胞、
ｎ）ミニ細胞、
ｏ）合成細胞、
ｐ）リポソーム、
ｑ）ミセル、
ｒ）ポリマーミセル（ポリマーソーム）、
ｓ）脂質、
ｔ）ポリマー、
ｕ）界面活性剤、
ｖ）脂肪酸、
ｗ）イオン溶液、
ｘ）酸性溶液または塩基性溶液、
ｙ）検出試薬、
ｚ）ＤＮＡ分子、
ａａ）ＲＮＡ分子、
ｂｂ）ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、
ｃｃ）ヌクレオチド、
ｄｄ）ヌクレオシド、
ｅｅ）ポリペプチド、
ｆｆ）アミノ酸、
ｇｇ）ウイルス粒子、
ｈｈ）プラスミド、
ｉｉ）ナノ粒子、
ｊｊ）マイクロ粒子、
ｋｋ）磁性粒子、
ｌｌ）馴化培地、
ｍｍ）馴化培地から精製された画分、
ｎｎ）天然抽出物、
ｏｏ）培養培地成分、
ｐｐ）細胞培養添加剤、
ｑｑ）炭水化物、
ｒｒ）ビタミン、
ｓｓ）代謝物、
ｔｔ）オリゴヌクレオチド、
ｕｕ）融合タンパク質、
ｖｖ）プロテオグリカン、および
ｗｗ）病原体
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の装置。

【請求項20】

ａ）作用物質に対する応答、
ｂ）細胞成長、
ｃ）細胞分化、
ｄ）細胞生存率、
ｅ）細胞形態、
ｆ）細胞シグナル伝達、
ｇ）タンパク質転移、
ｈ）細胞抗原提示、
ｉ）ＤＮＡ合成、
ｊ）細胞ゲノム、
ｋ）細胞トランスクリプトーム、
ｌ）細胞プロテオーム、
ｍ）細胞代謝、
ｎ）細胞の電気生理学的機能、
ｏ）細胞の生理学的機能、
ｐ）食作用、
ｑ）エンドサイトーシス、
ｒ）遺伝子発現、
ｓ）タンパク質発現、
ｔ）炭水化物発現、
ｕ）生体分子間相互作用、
ｖ）受容体結合、
ｗ）検出作用物質の細胞結合、
ｘ）モジュレーション作用物質の細胞取込み、
ｙ）細胞遊走、
ｚ）細胞集団の組織化、
ａａ）細胞接着、
ｂｂ）細胞間相互作用、
ｃｃ）脂質発現、
ｄｄ）ＲＮＡ合成、および
ｅｅ）組織形成
のうちの少なくとも１つをモニタリングするためのものである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、物質を条件へと曝露するための装置および方法に関し、特に、細胞などの物質を、ある範囲の異なる条件へと曝露して、これにより、条件に対する物質の応答を決定することを可能とするための方法および装置に関する。

【背景技術】

【0002】

本明細書における、任意の既往の刊行物（またはこれに由来する情報）または公知である任意の事柄に対する言及は、既往の刊行物（またはこれに由来する情報）または公知の事柄が、本明細書が関連する企図の分野における、共通の一般的知見の一部を形成することの認知もしくは容認またはその任意の形態の示唆として理解されるものではなく、そのように理解されるべきでもない。

【0003】

多能性幹細胞は、細胞移植、疾患および発症のモデル化、および前臨床薬物スクリーニングに有用な、特化した細胞型を作製するための、有望な細胞供給源である。しかし、再生医療適用および薬物スクリーニング適用におけるヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ細胞およびｈＩＰＳ細胞）の使用は、十分な数までのそれらの未分化増殖、および表現型をターゲティングするためのそれらの効率的な系列特異的分化の両方を方向付ける能力に基礎づけられている。早期発生の全体にわたり、幹細胞の、微小環境刺激の勾配への曝露は、異種の組織化された組織のパターン化をもたらす、細胞運命を決定する。

【0004】

したがって、これらの刺激についての正確な知見およびこれらの刺激の制御は、複雑な発生過程の階層的性格を組み直し、規定された細胞集団の指定および調節を直接かつ効率的に駆動する、鍵となる刺激を同定するのに重要である。しかし、現在、いくつかの問題が、これらの目標を達成しようとする試みの障害となっている。

【0005】

複数のシグナル伝達経路の活性の間の均衡は、細胞運命の転帰を決定するのに中心的であり、外因性シグナルの相対レベルに大きく依存し、ある種の因子の存在または非存在だけに依存するわけではないことが十分に確立されている。したがって、個々の刺激を最適化するだけではなく、複数の刺激の多様な相対レベルをスクリーニングする手法が要求される。また、従来の静置培養系は、幹細胞の運命を方向付ける微小環境刺激を正確に探査するのに適さない。

【0006】

かつての血清含有培地およびフィーダー層の使用では、規定されていない成分が幹細胞培養系へと導入されたが、フィーダー非含有の規定された培養条件でもなお、ｈＥＳＣは、自己再生転帰および分化転帰に影響を及ぼすことが公知の因子であって、また、分化の開始後に劇的に変化する因子を分泌する。さらに、分泌された因子および老廃物が蓄積され、外因性因子および栄養物質は枯渇するので、従来の培養物は、微小環境条件の大きな空間的−時間的ゆらぎの対象となるが、次いで、培地を再補充すると、初期条件に戻る。

【0007】

ある範囲の生物学的現象を探索するのに、マイクロスケール技術が活用されている。現在のところ、整列させた微小環境上の研究では、対象の分子をパターン化するのに高密度スポッティング法が活用されており、任意選択で、アレイをマクロスケールウェルへとカップリングすることにより、またはスポッティングされた可溶性因子をアレイ内に組み入れることにより、多様な可溶性因子を導入した、生体材料ポリマーまたは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子のコンビナトリアルアレイが組み入れられている。これらの手法は、ＥＣＭの合図はたやすく提示するが、可溶性因子提示の制御レベルは限定されている。可溶性因子をマクロスケールの培養容量へと添加する場合、微小環境の制御は、培地交換の間に存在する回分培養環境により限定される。他方、スポッティングされた可溶性因子は、シグナル伝達活性を提示するが、基板からの拡散および培地容量全体にわたる拡散／対流などの輸送現象は、細胞へと提示される可溶性因子の正確な濃度を規定することが困難であり、かつ、時間変動的であることを意味する。

【0008】

マイクロ流体デバイス内で具体化される培養系などの「閉鎖的」培養系は既に、潅流培養と組み合わされて、可溶性因子の制御された供給および良好な時間分解能を伴う条件の時間的変動を達成している。

【0009】

例えば、間葉系幹細胞を成長および分化させるための培養環境のスクリーニングへと適用される、９６個の個別の、個々にアドレス可能なマイクロバイオリアクターチャンバーのマルチプレックス化された組込みについては、Ｇｏｍｅｚ−Ｓｊｏｅｂｅｒｇ，Ｒ．、Ｌｅｙｒａｔ，Ａ．Ａ．、Ｐｉｒｏｎｅ，Ｄ．Ｍ．、Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｓ．、およびＱｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．、「Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ，Ｆｕｌｌｙ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７９、８５５７〜８５６３（２００７）において記載されている。しかし、このデバイスは、７３カ所のオフチップ接続部を要求し、培地の迅速な交換は可能であったが、複数のチャンバーへの連続的な潅流をもたらすことができなかった。にもかかわらず、マイクロ加工技術を活用して、広範なマルチプレックス化を施し、限定数の化合物に基づき、広範なスペクトルにわたる条件を作り出すことができる。

【0010】

微小環境をスクリーニングするための、マルチプレックス化されたアレイ技術における近年の進歩は、生体材料ポリマーの、スポッティングされたコンビナトリアルアレイに焦点を当てている。これらの手法は、ＥＣＭの合図に理想的な形で適し、これをたやすく提示するが、可溶性因子提示の制御レベルは、依然として限定されている。可溶性因子を、マクロスケールの培養容量へと添加する場合、微小環境の制御は、上記で詳述された点により限定される。他方、スポッティングされた可溶性因子は、シグナル伝達活性を疑いなく提示するが、基板からの拡散および培地容量全体にわたる拡散／対流などの輸送現象は、細胞へと提示される可溶性因子の正確な濃度を規定することがしばしば困難であり、かつ、時間変動的であることを意味する。

【0011】

「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｆｕｌｌ−Ｆａｃｔｏｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０４巻、６号、２００９年１２月１５日、は、入れ子の希釈構造を使用して、細胞培養条件の全因子アレイを作り出す、スケーラブルなマイクロバイオリアクターアーキテクチャーについて記載している。しかし、配置は、傍分泌シグナル伝達などのイベントの影響を評価する限定された能力をもたらすに過ぎない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ａｒｒａｙ ｆｏｒ Ｆｕｌｌ−Ｆａｃｔｏｒｉａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０４巻、６号、２００９年１２月１５日

【非特許文献2】Ｇｏｍｅｚ−Ｓｊｏｅｂｅｒｇ，Ｒ．、Ｌｅｙｒａｔ，Ａ．Ａ．、Ｐｉｒｏｎｅ，Ｄ．Ｍ．、Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｓ．、およびＱｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．、「Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ， Ｆｕｌｌｙ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ， Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７９、８５５７〜８５６３（２００７）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

第１の広範な形態において、本発明は、物質を条件へと曝露するための装置であって、
ａ）多数のウェルチャネルを含むウェルのアレイであって、各ウェルチャネルが、ウェルチャネル内に複数のウェルを含み、ウェルが、使用される物質を含有するアレイと、
ｂ）それぞれの流体を受容するための１または複数の注入口と、
ｃ）１または複数の流体を各ウェルチャネルへと選択的に供給して、これにより、物質を異なる条件へと曝露し、条件に対する物質の応答を決定することを可能とするための、１または複数の注入口へとカップリングされたチャネルと
を含む装置を提供しようとする。

【0014】

各ウェルチャネルは、ウェルチャネルに沿って隔てられた複数のウェルを含むことが典型的である。

【0015】

ウェルチャネルの第１の末端へと供給された流体は、ウェルチャネルに沿って、ウェルチャネルの第２の末端へと、流動方向に流動することが典型的である。

【0016】

少なくとも１つのウェルにおける応答は、隣接するウェル内の条件に影響を及ぼすことが典型的である。

【0017】

ウェル内で生成される少なくともいくつかの作用物質は、隣接するウェルへと移送され、これにより、隣接するウェル内の条件を少なくとも部分的に変化させることが典型的である。

【0018】

装置は、
ａ）少なくとも２つの注入口であって、各注入口が、それぞれの流体を受容するためのものである注入口と、
ｂ）それぞれの流体を注入口からウェルチャネルへと供給するための多数のチャネルであって、各チャネルが、それぞれのチャネル形状を有して、これにより、それぞれの比率の流体が、各ウェルチャネルへと供給されるように、流体の相対的な流動を制御するチャネルと
を含むことが典型的である。

【0019】

流体を流動方向に流動させるために、上流のウェル内の物質により産生される作用物質を、下流のウェルへと移送することが典型的である。

【0020】

流体を流動させないために、作用物質を、拡散により、ウェル間に移送することが典型的である。

【0021】

各ウェルチャネルが、
ａ）流体の同等の容量、
ｂ）流体の同等の流動、および
ｃ）流体の同等の比率
のうちの少なくとも１つを受容するように、各チャネルのウェルチャネル形状が配置されることが典型的である。

【0022】

チャネル形状は、
ａ）チャネルの外形、
ｂ）チャネルの屈曲、
ｃ）チャネルの長さ、
ｄ）チャネルの高さ、
ｅ）チャネルの幅、
ｆ）チャネルの角度、および
ｇ）チャネル内の障害物
のうちの少なくとも１つを含むことが典型的である。

【0023】

少なくとも１つのチャネルが分岐して、流体を、少なくとも２つのウェルチャネルへと供給することが典型的である。

【0024】

少なくとも２つのチャネルが合流して、流体の混合物を、少なくとも１つのウェルチャネルへと供給することが典型的である。

【0025】

チャネルは、その中に含有される流体を混合するための混合部分を含むことが典型的である。

【0026】

少なくとも２つのチャネルは、混合部分の上流で合流することが典型的である。

【0027】

装置は、第１の流体および第２の流体のそれぞれを受容するための第１の注入口および第２の注入口を含み、チャネルは、
ｉ）少なくとも１つのウェルチャネルが、第１の流体を受容し、
ｉｉ）少なくとも１つのウェルチャネルが、第２の流体を受容し、かつ、
ｉｉｉ）少なくとも１つのウェルチャネルが、第１の流体と第２の流体との混合物を受容する
ように配置されることが典型的である。

【0028】

装置は、第１の流体および第２の流体のそれぞれを受容するための第１の注入口および第２の注入口を含み、第１の流体は因子を含み、第２の流体は緩衝液を含み、その結果、異なるウェルチャネルが異なる濃度の因子を受容することが典型的である。

【0029】

装置は、多数の注入口セットを含み、各注入口セットは、少なくとも２つの注入口を含み、各注入口セットは、それぞれの流体を受容するためのものであることが典型的である。

【0030】

各注入口セットは、それぞれの因子を含む流体を受容することが典型的である。

【0031】

装置は、
ａ）ある数（ｎ）の注入口セットであって、各々少なくとも２つの注入口を含み、結果として合計で少なくとも２ｎの注入口をもたらす注入口セットと、
ｂ）ある数（ｎ）の注入口セットであって、各々少なくとも２つの注入口を含有し、各注入口セットの１つの注入口が、共通注入口へとさらに接合され、結果として合計で少なくともｎ＋１の注入口をもたらす注入口セットと
を含むことが典型的である。

【0032】

装置は、
ａ）第１の因子および緩衝液を受容するための第１の注入口セットと、
ｂ）第２の因子および緩衝液を受容するための第２の注入口セットと、
ｃ）第３の因子および緩衝液を受容するための第３の注入口セットと
を含み、各ウェルチャネルは、それぞれの濃度の、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の各々を受容することが典型的である。

【0033】

その後の注入口セットの流体と混合し、これにより、それぞれの流体を組み合わせることにより、１つの注入口セットからの流体を組み合わせることが典型的である。

【0034】

装置は、
ａ）物質を含有するシーディング流体を受容するための、少なくとも１つのシーディング注入口と、
ｂ）少なくとも１つのシーディング排出口と
を含み、少なくとも１つのシーディング注入口およびシーディング排出口は、ウェルチャネルと流体連絡しており、これにより、ウェルに物質をシーディングすることを可能とすることが典型的である。

【0035】

装置は、少なくともシーディング注入口および少なくとも１つのシーディング排出口の少なくとも１つをウェルチャネルへと接続するための多数のシーディングチャネルを含むことが典型的である。

【0036】

少なくとも１つのシーディング注入口は、ウェルチャネルの、少なくとも１つのシーディング排出口と反対側の末端へと接続されていることが典型的である。

【0037】

シーディング排出口は、チャネルと流体連絡しており、シーディング排出口は、ウェルチャネルのシーディング後に遮断され、これにより、それぞれの流体をウェルチャネルへと供給することを可能とするように配置されていることが典型的である。

【0038】

装置は、
ａ）ウェルチャネルおよびウェルのうちの少なくとも１つへの流体の供給、ならびに
ｂ）ウェルチャネルおよびウェルのうちの少なくとも１つからの流体および／または物質のサンプリング
のうちの少なくとも１つを選択的に制御するための少なくとも１つの制御デバイスを含むことが典型的である。

【0039】

制御デバイスは、チャネルを選択的に遮断するための弁を含むことが典型的である。

【0040】

チャネルは、マイクロ流体チャネルであることが典型的である。

【0041】

装置は、基板および被覆層を含むことが典型的である。

【0042】

被覆層は、第１の層および第２の層を含み、それぞれの流体を、第１の層内のチャネルへと供給するために、少なくともいくつかの注入口が、第２の層内に装備されていることが典型的である。

【0043】

チャネルは、被覆層内で規定されていることが典型的である。

【0044】

ウェルは、基板および被覆層のうちの少なくとも１つの中で規定されていることが典型的である。

【0045】

被覆層は、成形されたポリマー材料を含むことが典型的である。

【0046】

基板および被覆層は、
ａ）接着カップリング、
ｂ）熱カップリング、
ｃ）機械的カップリング、
ｄ）プラズマカップリング、
ｅ）共有結合／化学的カップリング、
ｆ）静電カップリング、および
ｇ）磁性カップリング
のうちの少なくとも１つを使用してカップリングされていることが典型的である。

【0047】

少なくともウェルがコーティングされていることが典型的である。

【0048】

コーティングは、
ａ）プロモーター、
ｂ）阻害剤、
ｃ）成長因子、
ｄ）凝固因子、
ｅ）ホルモン、
ｆ）シグナル伝達作用物質、
ｇ）化学組成物、
ｈ）薬物、
ｉ）タンパク質、
ｊ）リガンド、
ｋ）抗体、
ｌ）生物、
ｍ）細胞、
ｎ）ミニ細胞、
ｏ）合成細胞、
ｐ）リポソーム、
ｑ）ミセル、
ｒ）ポリマーミセル（ポリマーソーム）、
ｓ）脂質、
ｔ）ポリマー、
ｕ）界面活性剤、
ｖ）脂肪酸、
ｗ）イオン溶液、
ｘ）酸性溶液または塩基性溶液、
ｙ）検出試薬、
ｚ）ＤＮＡ分子、
ａａ）ＲＮＡ分子、
ｂｂ）ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、
ｃｃ）ヌクレオチド、
ｄｄ）ヌクレオシド、
ｅｅ）ポリペプチド、
ｆｆ）アミノ酸、
ｇｇ）ウイルス粒子、
ｈｈ）プラスミド、
ｉｉ）ナノ粒子、
ｊｊ）マイクロ粒子、
ｋｋ）磁性粒子、
ｌｌ）馴化培地、
ｍｍ）馴化培地から精製された画分、
ｎｎ）天然抽出物、
ｏｏ）培養培地成分、
ｐｐ）細胞培養添加剤、
ｑｑ）炭水化物、
ｒｒ）ビタミン、
ｓｓ）代謝物、
ｔｔ）オリゴヌクレオチド、
ｕｕ）融合タンパク質、
ｖｖ）プロテオグリカン、および
ｗｗ）病原体
のうちの少なくとも１つを含むことが典型的である。

【0049】

少なくとも１つの流体は、作用物質を含むことが典型的である。

【0050】

作用物質は、
ａ）プロモーター、
ｂ）阻害剤、
ｃ）成長因子、
ｄ）凝固因子、
ｅ）ホルモン、
ｆ）シグナル伝達作用物質、
ｇ）化学組成物、
ｈ）薬物、
ｉ）タンパク質、
ｊ）リガンド、
ｋ）抗体、
ｌ）生物、
ｍ）細胞、
ｎ）ミニ細胞、
ｏ）合成細胞、
ｐ）リポソーム、
ｑ）ミセル、
ｒ）ポリマーミセル（ポリマーソーム）、
ｓ）脂質、
ｔ）ポリマー、
ｕ）界面活性剤、
ｖ）脂肪酸、
ｗ）イオン溶液、
ｘ）酸性溶液または塩基性溶液、
ｙ）検出試薬、
ｚ）ＤＮＡ分子、
ａａ）ＲＮＡ分子、
ｂｂ）ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、
ｃｃ）ヌクレオチド、
ｄｄ）ヌクレオシド、
ｅｅ）ポリペプチド、
ｆｆ）アミノ酸、
ｇｇ）ウイルス粒子、
ｈｈ）プラスミド、
ｉｉ）ナノ粒子、
ｊｊ）マイクロ粒子、
ｋｋ）磁性粒子、
ｌｌ）馴化培地、
ｍｍ）馴化培地から精製された画分、
ｎｎ）天然抽出物、
ｏｏ）培養培地成分、
ｐｐ）細胞培養添加剤、
ｑｑ）炭水化物、
ｒｒ）ビタミン、
ｓｓ）代謝物、
ｔｔ）オリゴヌクレオチド、
ｕｕ）融合タンパク質、
ｖｖ）プロテオグリカン、および
ｗｗ）病原体
のうちの少なくとも１つを含むことが典型的である。

【0051】

物質は、
ａ）プロモーター、
ｂ）阻害剤、
ｃ）成長因子、
ｄ）凝固因子、
ｅ）ホルモン、
ｆ）シグナル伝達作用物質、
ｇ）化学組成物、
ｈ）薬物、
ｉ）タンパク質、
ｊ）リガンド、
ｋ）抗体、
ｌ）生物、
ｍ）細胞、
ｎ）ミニ細胞、
ｏ）合成細胞、
ｐ）リポソーム、
ｑ）ミセル、
ｒ）ポリマーミセル（ポリマーソーム）、
ｓ）脂質、
ｔ）ポリマー、
ｕ）界面活性剤、
ｖ）脂肪酸、
ｗ）イオン溶液、
ｘ）酸性溶液または塩基性溶液、
ｙ）検出試薬、
ｚ）ＤＮＡ分子、
ａａ）ＲＮＡ分子、
ｂｂ）ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、
ｃｃ）ヌクレオチド、
ｄｄ）ヌクレオシド、
ｅｅ）ポリペプチド、
ｆｆ）アミノ酸、
ｇｇ）ウイルス粒子、
ｈｈ）プラスミド、
ｉｉ）ナノ粒子、
ｊｊ）マイクロ粒子、
ｋｋ）磁性粒子、
ｌｌ）馴化培地、
ｍｍ）馴化培地から精製された画分、
ｎｎ）天然抽出物、
ｏｏ）培養培地成分、
ｐｐ）細胞培養添加剤、
ｑｑ）炭水化物、
ｒｒ）ビタミン、
ｓｓ）代謝物、
ｔｔ）オリゴヌクレオチド、
ｕｕ）融合タンパク質、
ｖｖ）プロテオグリカン、および
ｗｗ）病原体
のうちの少なくとも１つを含むことが典型的である。

【0052】

装置は、
ａ）作用物質に対する応答、
ｂ）細胞成長、
ｃ）細胞分化、
ｄ）細胞生存率、
ｅ）細胞形態、
ｆ）細胞シグナル伝達、
ｇ）タンパク質転移、
ｈ）細胞抗原提示、
ｉ）ＤＮＡ合成、
ｊ）細胞ゲノム、
ｋ）細胞トランスクリプトーム、
ｌ）細胞プロテオーム、
ｍ）細胞代謝、
ｎ）細胞の電気生理学的機能、
ｏ）細胞の生理学的機能、
ｐ）食作用、
ｑ）エンドサイトーシス、
ｒ）遺伝子発現、
ｓ）タンパク質発現、
ｔ）炭水化物発現、
ｕ）生体分子間相互作用、
ｖ）受容体結合、
ｗ）検出作用物質の細胞結合、
ｘ）モジュレーション作用物質の細胞取込み、
ｙ）細胞遊走、
ｚ）細胞集団の組織化、
ａａ）細胞接着、
ｂｂ）細胞間相互作用、
ｃｃ）脂質発現、
ｄｄ）ＲＮＡ合成、および
ｅｅ）組織形成
のうちの少なくとも１つをモニタリングするためのものであることが典型的である。

【0053】

ここで、付属の図面を参照しながら、本発明の例について記載する。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1A】細胞活性をモジュレートするための装置の例についての概略図である。

【図1B】細胞活性をモジュレートするための装置の例についての概略図である。

【図1C】細胞活性をモジュレートするための装置の例についての概略図である。

【図2A】細胞活性をモジュレートするための装置のさらなる例についての概略図である。

【図2B】図２Ａのチャネルミキサー部分についてのより詳細な概略図である。

【図3A】細胞活性をモジュレートするための装置の具体例についての概略図である。

【図3B】細胞活性をモジュレートするための装置の具体例についての概略図である。

【図3C】細胞活性をモジュレートするための装置の具体例についての概略図である。

【図3D】図３Ｂのウェルを通る流体の流速を示す概略図である。

【図3E】図３Ａ〜図３Ｃの装置を伴う使用のためのホルダーについての概略的な平面図および側面図である。

【図3F】図３Ａ〜図３Ｃの装置を伴う使用のためのホルダーについての概略的な平面図および側面図である。

【図4A】図３Ｂのウェル内の色素の相対濃度についての例を示す略図である。

【図4B】図３Ｂのウェル内で測定された色素の濃度を示すグラフである。

【図5A】図３Ａ〜図３Ｃの装置を使用して、ＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰ ｈＥＳＣの多能性をスクリーニングするために使用されるスクリーニング条件の例についての略図である。

【図5B】図５Ａのスクリーニング条件についてのレーザー走査共焦点ネガティブ画像の例を示す図である。

【図5C】図５Ａのスクリーニング条件のために選択されたウェルについての高倍率レーザー走査共焦点ネガティブ画像の例を示す図である。

【図5D】図５Ａのスクリーニング条件のために選択されたウェルについての高倍率レーザー走査共焦点ネガティブ画像の例を示す図である。

【図5E】図５Ａのスクリーニング条件のためのウェルアレイ内の全蛍光強度についてのヒートマップ例を示す図である。

【図5F】図５Ａのスクリーニング条件のための、発現指数に対する因子の主効果の大きさの例についてのグラフである。

【図6A】図３Ａ〜図３Ｃの装置を使用して、原始線条マーカーであるＭＩＸＬ１の誘導、および傍分泌効果のモジュレーションについて、ＨＥＳ３−ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ細胞をスクリーニングするために使用されるスクリーニング条件の例についての略図である。

【図6B】図６Ａのスクリーニング条件のための、ＧＦＰを発現させ、実験終点においてＨｏｅｃｈｓｔにより対比染色された、ＨＥＳ３−ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ ｈＥＳＣのウェルアレイについての、レーザー走査共焦点ネガティブ画像の例を示す図である。

【図6C】図６Ａのスクリーニング条件のためのアレイ内の全蛍光強度についてのヒートマップ例を示す図である。

【図6D】図６Ａのスクリーニング条件のためのアレイ内の個別のウェルについての、高倍率共焦点造影の例を示す図である。

【図6E】図６Ａのスクリーニング条件のための、発現指数に対する因子の主効果の大きさの例についてのグラフである。

【図7A】図３Ａ〜図３Ｃの装置を使用して、原始線条マーカーであるＭＩＸＬ１の誘導、および傍分泌効果のモジュレーションについて、ＨＥＳ３−ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ細胞をスクリーニングするために使用されるスクリーニング条件の第２の例についての略図である。

【図7B】図７Ａのスクリーニング条件のための、ＧＦＰを発現させ、実験終点において、ＮＣＡＭ（ＣＤ５６）についてｉｎ ｓｉｔｕにおいて共免疫染色され、Ｈｏｅｃｈｓｔにより対比染色された、ＨＥＳ３−ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ ｈＥＳＣのウェルアレイについての、レーザー走査共焦点ネガティブ画像の例を示す図である。

【図7C】図７Ａのスクリーニング条件のためのアレイ内の全蛍光強度についてのヒートマップ例を示す図である。

【図7D】異なる条件のための異なるウェル内の応答例についてのグラフである。

【図7E】異なる条件のための異なるウェル内の応答例についてのグラフである。

【図7F】異なる条件のための異なるウェル内の応答例についてのグラフである。

【図7G】異なる条件のための異なるウェル内の応答例についてのグラフである。

【図7H】図７Ａのスクリーニング条件のための、Ｗｎｔシグナルの化学的モジュレーション、および静的原始線条誘導培養の効率改善の例についてのグラフである。

【図8A】注入口構成のさらなる具体例についての概略図である。

【図8B】排出口構成のさらなる具体例についての概略図である。

【図8C】第１の層のさらなる具体例についての概略図である。

【図8D】第２の層のさらなる具体例についての概略図である。

【図8E】図８Ｃおよび図８Ｄの装置における因子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々の理論濃度についての概略図である。

【図8F】図８Ｃおよび図８Ｄの装置において、因子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々を表す４つの色を使用する結果として得られる色素分布についての概略図である。

【図8G】排出口を介して供給される単色の色素の、結果として得られる色素分布についての概略図である。

【図8H】使用される図８Ｃおよび図８Ｄの装置についての画像である。

【発明を実施するための形態】

【0055】

ここで、図１Ａを参照しながら、細胞活性をモジュレートするための装置の例について記載する。

【0056】

この例では、装置１００は、多数のウェルチャネル１３１、１３２、１３３を有するウェルアレイ１３０を含み、各ウェルチャネル１３１、１３２、１３３は、ウェルチャネル１３１、１３２、１３３内に装備され、典型的に、ウェルチャネル１３１、１３２、１３３に沿って隔てられた、複数のウェル１３１．１、１３１．２、１３１．３、１３２．１、１３２．２、１３２．３、１３３．１、１３３．２、１３３．３を含む。使用時に、ウェル１３１．１、１３１．２，…１３３．３は、異なる条件に対するその応答が決定される物質を含有する。

【0057】

この例では、各ウェルチャネル上に３つのウェルを示し、３つのウェルチャネルを示すが、これは、例だけを目的とするものであり、実際は、任意の数のウェルおよびウェルチャネルを使用しうることが察知されるであろう。ウェルは、円形、正方形、長方形、楕円形、三角形、または他の幾何学的外形もしくは非幾何学的外形など、任意の外形またはサイズであることが可能であり、円形ウェルの使用は、例だけを目的とするものである。

【0058】

装置１００はまた、１または複数の流体を受容するための１または複数の注入口１１１、１１２も含み、この例では、２つの注入口を示す。

【0059】

装置１００はまた、１または複数の流体を受容するための１または複数の注入口１１１、１１２も含み、この例では、２つの注入口を示す。注入口１１１、１１２は、チャネル１２０を介して、ウェルチャネル１３１、１３２、１３３へとカップリングされ、流体を、ウェルチャネル１３１、１３２、１３３へと選択的に供給し、これにより、物質を、異なる条件へと曝露することを可能とし、これにより、条件に対する物質の応答を決定することが可能となる。

【0060】

試料を曝露する条件は、多様な形で制御することができる。一例では、条件は、供給される流体に依存し、異なる流体が、異なるウェルチャネルへと供給される。したがって、この場合、異なるウェルチャネル内の物質は、異なる条件へと曝露され、これに応じて、異なるウェルチャネルのウェル内の物質の応答を比較して、異なる条件に対する物質の応答を決定することができる。

【0061】

代替的に、別の例では、異なる物質を異なるウェルチャネル内に準備し、異なる物質を、例えば、ウェルチャネルへと供給される流体に応じて、同じ条件へと曝露することもでき、異なる条件へと曝露することもできる。

【0062】

さらなる例では、ウェルおよび／またはウェルチャネルは、１または複数のコーティングでコーティングすることができる。例えば、コーティングは、物質がウェルの表面に結合する一助となる結合剤、検出を目的とする物質のマーキングにおける使用のためのマーキング剤、他の試薬などを含みうるであろう。コーティングの例は、タンパク質、リガンド、可溶性因子、固定化された因子、乾燥凍結させた薬物またはタンパク質、レンチウイルス粒子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛍光プローブ、ポリマー、酵素などを含む。コーティングはまた、例えば、類似の流体が異なるウェルチャネルへと供給される場合であってもなお、異なるコーティングを、異なるウェルチャネル内のウェルへと適用し、異なるウェルチャネルのウェル内の物質を、異なる条件へと曝露することを可能としうるように、ウェル内の条件に対する影響も及ぼしうる。

【0063】

上記の例のうちのいずれにおいても、ウェル内の条件に影響を及ぼす副次的効果を誘導することが可能である。この点で、物質を、特定の条件へと曝露する場合、応答は、１または複数の作用物質の産生または修飾を含むことが可能であり、次いで、これを隣接するウェルへと移送し、これにより、隣接するウェル内の条件を修飾することができる。したがって、例えば、細胞を異なる条件へと曝露する場合は、細胞を、それらが作用物質を分泌するようにモジュレートし、これを、異なるウェルへと移送し、これにより、その中に含有される細胞をさらにモジュレートすることができる。したがって、修飾とは、共通出発条件下でもなお、単一のウェルチャネル内の異なるウェル内の物質を、異なる条件へと曝露しうることを意味しうる。

【0064】

一例では、流体を、ウェルチャネルを通って流動方向に流動するように配置する。これを達成するために、この例では、注入口１１１、１１２は、ウェルチャネルの一方の末端と流体連絡しており、供給される流体が、ウェルチャネルに沿って、ウェルチャネルの他方の末端へと、矢印１５０により指し示される流動方向に流動するように、流体は、ウェルチャネル１３１、１３２、１３３の末端へと選択的に供給される。ウェルチャネルの他方の末端を、１または複数の排出口へと接続して、流体がウェルチャネルから流出することを可能としうる。排出口の存在、および流体をウェルチャネルへと選択的に移送する、チャネル１２０の作動については、下記でより詳細に記載されるであろう。この場合、ウェル内で産生または修飾される任意の作用物質は、流体の流動により、下流のウェルへと移送することができる。

【0065】

しかし、流体の流動の使用は、不可欠ではなく、代替的に、物質の曝露を、流動を伴わない条件下で行うこともでき、この場合、作用物質は、拡散など、他の輸送機構を介して移送することができる。代替的に、流体の流動は、例えば、流体の流量を調整することにより、選択的に制御することもでき、代替的に、流動を停止および／または反転させることにより、選択的に制御することもできる。流動はまた、下記でより詳細に記載される通り、制御弁などの制御デバイスを使用して、異なるウェルおよびチャネルについて選択的に制御することもできる。

【0066】

また、ウェルの選択的加熱または選択的冷却、放射線への選択的曝露など、他の機構を使用して、異なる条件を誘導しうることも察知されるであろう。例えば、加熱または冷却を、ウェルチャネル内の全てのウェルへと適用することもできるであろうし、代替的に、異なるウェルチャネルにわたるウェルの共通セット（または行）へと適用し、これにより、物質を曝露する条件の範囲をさらに増大させることもできるであろう。

【0067】

したがって、上記で記載した装置は、物質を、広範囲にわたる条件へと曝露することを可能とすることが察知されるであろう。一例では、条件は主に、流体の異なる組合せを、異なるウェルチャネルへと供給することにより制御するが、異なるウェルチャネル内に異なるコーティングを施すことにより、さらなる制御および／または代替的な制御を達成することもできる。いずれにせよ、装置は、限定された入力を使用して、広範囲にわたる条件を作り出すことを可能とし、１つのウェル内の物質の応答が、１または複数の隣接するウェル内の条件を修飾し、これにより、隣接するウェル内の物質の応答に影響を及ぼす、副次的効果を誘導することもさらに可能とする。

【0068】

装置は、多様な異なる物質を、異なる条件へと曝露するのに使用することができる。しかし、装置は、細胞、タンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡを伴わない細菌などのミニ細胞、ミセル、リポソーム、核酸、化学組成物、および薬物を含むがこれらに限定されない、化学物質および生体物質を、異なる条件へと曝露するのに理想的な形で適する。

【0069】

物質が細胞である場合、流体のうちの少なくとも１つが、細胞における応答を誘導するための作用物質、および、特に、細胞運命モジュレーターなど、細胞の活性を修飾するモジュレート作用物質を含むことが典型的である。モニタリングしうる細胞応答は、細胞成長、細胞分化、細胞生存率、細胞の電気生理学的機能、細胞の生理学的機能、検出作用物質の細胞結合、モジュレーション作用物質の細胞取込み、検出剤に対する応答、細胞遊走、細胞集団の組織化、細胞接着、細胞間相互作用、脂質の発現、ＲＮＡ合成、組織形成などを含みうるがこれらに限定されない。

【0070】

したがって、例えば、装置は、抗体の結合、トランスフェクション効率などを最適化するのに使用しうるであろう。装置はまた、（抗体または蛍光色素のような）検出剤またはプラスミドもしくはｓｉＲＮＡリポソームなどのモジュレーション剤の最適の濃度または組合せに応答する細胞の能力についてのリードアウトをもたらすのにも使用することができる。装置はまた、例えば、異なる疾患または状態（心疾患、がん、神経変性疾患など）のための薬物スクリーニング、薬物処方のデザイン、患者特異的医療（遺伝医学）などを含む、応答についての細胞ベースのスクリーニングにも使用することができる。したがって、装置は、細胞の任意の活性のモジュレーションに特に適するが、応答は、条件に対する任意の応答を含みうることが察知されるであろう。

【0071】

上記から、流体は、誘導される応答に応じて、広範囲にわたる作用物質を含有しうることが察知されるであろう。万一、細胞活性をモジュレートする場合、作用物質は、ホルモン、成長因子、凝固因子、シグナル伝達分子、プロモーター、阻害剤などを含むシグナル伝達作用物質など、細胞がそれに対して反応する任意の適切な作用物質でありうる。しかし、細胞応答に対して影響を及ぼす任意の作用物質であって、医薬などを含む作用物質を使用しうることが察知されるであろう。さらに、流体は、溶存させた固体の作用物質、懸濁させた固体の作用物質など、任意の形態の作用物質を含有しうる。

【0072】

モジュレート作用物質は、抗体、サイトカイン、ケモカイン、カルシウムイオンおよびカリウムイオンなどのイオン、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ構築物、ＲＮＡ分子、ＲＮＡ構築物、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードするウイルス粒子、融合タンパク質、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、炭水化物、代謝物、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポソーム、ミセル、ポリマー、馴化培地（個別の細胞培養物から採取される培地）、馴化培地から精製された画分、天然抽出物（自然発生の生物学的供給源から単離された組成物など）、細胞培養成分または培地成分、細胞または生物（すなわち、共培養された細胞型または病原体）でありうる。

【0073】

流体のうちの少なくとも１つは、物質の応答をモニタリングする一助となる検出剤をさらに含みうる。これは、例えば、蛍光色素など、検出試薬の使用を含みうる。

【0074】

ここで、細胞モジュレーションの具体例についてより詳細に記載する。特に、この例では、下記でより詳細に記載される通り、細胞を、典型的に、シーディング工程を使用して、ウェルアレイのウェル内に準備する。これに続き、供給された流体が、ウェルチャネルに沿って、ウェルチャネルの第２の末端へと、流動方向に流動し、これにより、細胞を、流体およびその中に含有される任意のモジュレート作用物質（外因性モジュレート作用物質と称する）へと曝露するように、１または複数の流体を、各ウェルチャネルの第１の末端へと選択的に供給する。細胞を流体へと曝露するにつれて、流体は典型的に、細胞内に応答を引き起こし、これにより、例えば、細胞によるモジュレート作用物質の分泌を介して、さらなるモジュレート作用物質（内因性モジュレート作用物質と称する）の創出をもたらしうるであろう。次いで、上流のウェル内で産生された、少なくとも一部の内因性モジュレート作用物質は、流体の流動の結果として、下流のウェルへと移され、これにより、下流のウェル内の細胞活性をさらにモジュレートする。しかし、前出の記載から、流体の流動の存在は、不可欠ではなく、内因性モジュレート作用物質は、拡散など、他の機構を使用して、ウェル間で移送しうることが察知されるであろう。

【0075】

したがって、シグナル伝達作用物質などの内因性モジュレート作用物質は、１または複数の流体中の細胞を外因性モジュレート作用物質へと曝露した後、ウェル内で分泌させることができる。内因性モジュレート作用物質は、隣接するウェル内の細胞または下流のウェル内の細胞を、外因性モジュレート作用物質および内因性モジュレート作用物質の両方へと曝露するように、外因性モジュレート作用物質と共に、隣接するウェルまたは下流のウェルへと移送する。このため、例えば、ウェル１３１．１内の細胞を、成長因子Ａへと曝露する場合、細胞は、さらなる成長因子Ｘを分泌することが可能であり、これを、下流のウェル１３１．２へと移送することは、ウェル１３１．２内の細胞を、成長因子ＡおよびＸへと曝露することを意味する。したがって、この例では、これにより、ウェルチャネル１３１のウェル内の細胞間で誘導される傍分泌効果が可能となることが察知されるであろう。

【0076】

１つのウェル内の物質が、隣接するウェル内の物質の応答による影響を受けることを可能とすることができれば、副次的効果の探索を可能とする強力な機構がもたらされる。物質が細胞である場合、これは、細胞の局所的微小環境の、細胞活性に対する影響を理解するのに特に有用である。

【0077】

活性をモジュレートしたら、次いで、過程の転帰を決定する試験を実施することができる。例えば、細胞活性の変化を同定するのに適切なマーカーを使用して、アッセイを実施することができる。加えて、かつ／または代替的に、細胞およびウェルの他の内容物を、さらなる解析のために抽出することができる。これを使用して、例えば、任意の内因性モジュレート作用物質を同定し、これにより、ある種の細胞活性をもたらす正確な条件の同定を可能とすることができる。したがって、上記で記載した装置は、細胞活性についてのある範囲の異なる種類の研究の実施を可能とし、特に、同定される特異的なモジュレート作用物質に対する細胞の応答性を可能とする。

【0078】

図１Ａの例ではまた、それぞれの流体を、注入口１１１、１１２から、ウェルチャネル１３１、１３２、１３３へと供給するための、多数のチャネル１２０も装備される。この例では、チャネル１２１が、注入口１１１から、ウェルチャネル１３１へと伸長するのに対し、チャネル１２２は、注入口１１２から、ウェルチャネル１３３へと伸長する。チャネル１２１、１２２はまた、分岐および合流して、ウェルチャネル１３２へと伸長する第３のチャネル１２３も形成する。各チャネル１２０は、それぞれのチャネル形状を有して、これにより、それぞれの比率の流体が、各ウェルチャネル１３１、１３２、１３３へと供給されるように、流体の相対的な流動を制御する。

【0079】

したがって、上記の例から察知される通り、注入口から伸長するチャネル１２０は、分岐して、流体を、少なくとも２つのウェルチャネルへと供給する場合もあり、合流して、流体の混合物を、少なくとも１つのウェルチャネルへと供給する場合もある。

【0080】

この例では、第１の流体Ａおよび第２の流体Ｂを、注入口１１１、１１２を介して供給する場合、ウェルチャネル１３１が、第１の流体Ａを受容し、ウェルチャネル１３２が、第１の流体Ａと第２の流体Ｂとの混合物を受容するのに対し、ウェルチャネル１３３は、第２の流体Ｂだけを受容する。特定の一例では、第１の流体は、因子を含み、第２の流体は、異なるウェルチャネル１３１、１３２、１３３が、異なる濃度の因子を受容するように、緩衝液を含む。

【0081】

したがって、上記の配置は、各ウェルチャネルのウェル内の細胞活性を比較することにより、異なる流体の組合せの影響を研究しうるように、異なる流体を、各ウェルチャネル１３１、１３２、１３３へと供給することを可能とすることが察知されるであろう。したがって、これは、異なるウェルチャネルに異なる流体を受容させ、よって、外因性モジュレート作用物質の異なる組合せを受容させ、かつ、各ウェルチャネルの下流のウェルを、上流のウェル内で産生される、異なる内因性モジュレート作用物質へとさらに曝露して、多次元研究を実施することを可能とする。

【0082】

しかし、これは不可欠ではなく、上述の通り、代替的に、各ウェルチャネルに同じ流体を受容させうることが察知されるであろう。この場合もやはり、例えば、異なるウェルチャネルのウェルを、異なるコーティングなどで選択的にコーティングすることによるなど、他の機構を使用して、ウェルチャネル間で環境条件の差違を誘導することにより、多次元解析を実施することができる。異なるウェルチャネルはまた、異なる温度、放射線レベルなどの異なる雰囲気条件へと曝露することもできる。

【0083】

いずれにせよ、上記で記載した装置は、広範囲にわたる異なる環境を作り出し、これらの細胞活性に対する影響を容易に比較することを可能とすることが察知されるであろう。

【0084】

ここで、上記で記載した装置のさらなる特色について記載する。

【0085】

一例では、チャネルに沿う流体の流動は、チャネルの外形、チャネルの屈曲、チャネルの長さ、チャネルの高さ、チャネルの幅、およびチャネルの角度を含むチャネル形状の１または複数の任意の側面を変化させることにより制御することができる。加えて、柱状物、ジグザグ型ヘリンボーンミキサー、多層流路などの障害物をチャネル内に組み入れることにより、制御をさらに施すこともできる。

【0086】

したがって、物質を曝露する場合は、ウェルへと供給される相対比率の異なる流体を、これに応じてチャネル形状を選択して決定する。これは、各ウェルチャネルが、等容量の流体、等流量の流体、または時間当たり等容量の流体を受容するように、各チャネルのチャネル形状を配置することを可能とする。これは、正確な比率の異なる流体が、チャネル構成に従い、正確なウェルチャネルへと供給されることを確保する一助となりうる。

【0087】

チャネル１２０内、またはウェルチャネル１３１、１３２、１３３内に装備されうる、制御弁などの制御デバイスの使用を介して、さらなる制御を実装し、異なるウェルへの流体の流動を、所望に応じて、選択的に制限し、かつ／または停止させることも可能としうる。

【0088】

チャネル１２０およびウェルチャネル１３１、１３２、１３３に沿う流体の流動はまた、流体の速度、密度、および表面張力を含む流体の特性にも依存しうる。

【0089】

チャネルは、マイクロ流体チャネルであることが典型的であり、幅が１ｍｍ以下または０．２５ｍｍ以下であることが典型的であるが、任意の適切なチャネルサイズを使用することができる。

【0090】

注入口、ウェル、およびチャネル構成の、ある範囲にわたる異なる配置を使用して、多様な外因性モジュレート作用物質を、ウェルチャネルへと供給することができる。図１Ｂの例では、流体Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを受容するための３つの注入口１１１、１１２、１１３を提示する。この例では、注入口を、チャネル１２０を介して、７つのウェルチャネル１３１、１３２、…１３７へと接続するが、注入口１１１は、ウェルチャネル１３１、１３２、１３４、１３５と流体連絡しており、注入口１１２は、ウェルチャネル１３２、１３３、１３４、１３６と流体連絡しており、注入口１１３は、ウェルチャネル１３４、１３５、１３６、１３７と流体連絡している。結果として、ウェルチャネル１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７はそれぞれ、流体Ａ、Ａ＋Ｂ、Ｂ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、およびＣの組合せを受容する。

【0091】

図１Ｃの例では、４つの注入口１１１、１１２、１１３、１１４を提示する。この例では、注入口を、２つの注入口セットで装備し、注入口１１１、１１２からの流体Ａ、Ｂを、チャネル１２１、１２２、１２３を介して、３つの流体混合物を準備するように混合し、注入口１１３、１１４からの流体Ｃ、Ｄを、チャネル１２４、１２５、１２６を介して混合および準備する。混合物は、ウェルチャネル１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９へと供給する。結果として、ウェルチャネル１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９はそれぞれ、流体の組合せＡ＋Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ｂ＋Ｃ、Ａ＋Ｃ＋Ｄ、Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ、Ｂ＋Ｃ＋Ｄ、Ａ＋Ｄ、Ａ＋Ｂ＋Ｄ、Ｂ＋Ｄを受容する。

【0092】

一例では、各注入口セットＡ、Ｂ；Ｃ、Ｄは、それぞれの因子を含む流体を受容し、個別の緩衝液流体は、異なる濃度の異なる因子を、ウェルチャネルへと供給することを可能とする。例えば、流体Ａ、Ｂが、第１の因子および緩衝液に対応するのに対し、流体Ｃ、Ｄは、第２の因子および緩衝液に対応する。したがって、この配置は、異なる濃度の第１の因子Ａおよび第２の因子Ｃを、９つのウェルチャネル１３１、１３２、…１３９の各々へと供給することを可能とする。特に、装置により、２つの因子Ａ、Ｃによる、各々３つの濃度の組合せ全てを作り出し、これにより、合計で３^２＝９の異なる条件を有する全因子アレイをもたらすことができる。

【0093】

図１Ｂおよび図１Ｃの例では、個別のチャネルが、ウェルチャネルに流入するように示されていることに注意されたい。しかし、これは、明確さを目的とするのに過ぎず、より典型的には、ウェルチャネルに流入する前に、流体が完全に混合されるように、チャネルは、ウェルチャネルの上流で合流する。

【0094】

図２Ａおよび図２Ｂの例では、図１Ａの装置を改変し、改変された装置２００は、その中に含有される流体を混合するために、チャネル１２１、１２２、１２３内に装備された混合部分２２１、２２２、２２３を含む。混合部分は、任意の適切な様式で形成することができ、攪拌器、移流エレメント、または対流エレメントなどの使用を含みうる。しかし、混合部分は、図２Ｂに示される、チャネルの蛇行部分から形成されることが典型的である。また、図２Ａにも示される通り、混合部分は、チャネルのうちのいずれかが合流する点の下流に配置され、これにより、ウェルチャネルへと供給されると、異なる流体を、適切な形で混合することを確保する。これは確実に、ウェル内の物質を、異なる流体へと均等に曝露し、特に、その中に含有される任意の作用物質へと均等に曝露する一助となる。

【0095】

ここで、図３Ａ〜図３Ｄを参照しながら、装置のさらなる例について記載する。以下の記載では、細胞活性のモジュレーションに焦点を当てることになろうが、これは、記載を容易にするために過ぎず、実際は、技法を、ある範囲の異なる物質および応答へと適用しうることが察知されるであろう。

【0096】

この例では、図３Ｃに示される通り、装置３００は、基板３０３へと取り付けられた、第１の被覆層３０１および第２の被覆層３０２を含む。第１の被覆層３０１および第２の被覆層３０２は、注入口、チャネル、およびウェルアレイを規定するように成形された、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）などのポリマー材料から形成されることが典型的である。

【0097】

第１の層および第２の層のためのチャネルおよびポートの構成を、図３Ａおよび図３Ｂのそれぞれに示し、図３Ａでは、第１の層３０１に照らした第２の層を点線で示す。層３０１、３０２は、互いおよび基板３０３と接着させることが典型的であり、接着材接着または熱接着など、適切な接着工程を使用して、ガラスなどの不活性材料から作製することが典型的である。しかし、磁性カップリング、プラズマカップリング、共有結合／化学的カップリング、静電カップリング、機械的カップリングなど、他のカップリング法も使用することができる。材料はまた、要求に応じて、例えば、ＰＤＭＳを、低分子の取込みを回避／低減するように処理するよう、それらをデバイスにおける使用に適するように処理することができる。

【0098】

一般に、材料は、細胞モジュレーション過程に対するそれらの干渉を防止するように、生物学的に不活性であるべきであるが、他の材料も、デバイスを製造するために使用しうることが察知されるであろう。加えて、特定の一例では、材料は、例えば、適切なアッセイの使用を介して、細胞モジュレーションの結果を容易に同定することを可能とするように、光学的に透明であることが好ましい。加えて、被覆層のための、ＰＤＭＳなどの材料の使用は、例えば、注射針およびシリンジなどを使用して、ウェルの内容物を装置から容易に抽出することを可能とするので、特に有益である。

【0099】

この例では、装置３００は、注入口３１１、３１２；３１３、３１４；３１５、３１６の３つのセットを含む。注入口は、チャネル３２０を介して、各々が１０個のウェルを含む２７のウェルチャネルを含み、これにより、２７０のウェルでウェルアレイを規定する、ウェルアレイ３３０と相互接続されている。

【0100】

この例において示す通り、注入口３１３、３１４、３１５、３１６は、第２の層３０２内に装備され、注入口３１１、３１２は、第１の層３０１内に装備されている。使用時に、各注入口３１３、３１４は、チャネル３２３を介して、３つのそれぞれのポート３１７．１へと接続される。第２の層３０２を、示される通りに、第１の層３０１に照らして配置する場合、ポート３１７．１は、第１の層３０１内の対応するポート３１７．２と一列に並び、これにより、注入口１１３、１１４からの流体を供給する。類似の配置を、注入口３１５、３１６と関連する１８のポート３１８．１、３１８．２についても使用する。

【0101】

この例では、注入口３１３をポート３１７．１とカップリングさせるチャネル３２３．１、３２３．２、３２３．３は、全て同じ長さであることが注意されるであろう。これを達成するために、チャネル３２３．２は、所与のチャネルの長さを維持するように、蛇行区間を含む。これは、チャネル３２３．１、３２３．２、３２３．３の各々に沿う等流動抵抗を維持し、これにより、これらのチャネルに沿う流体の等流動を維持するように実施される。

【0102】

これもまた示される通り、チャネル３２０内には、複数の混合部分３２１が装備され、これにより、その中に含有される流体の適切な混合が確保される。

【0103】

使用時に、第１の注入口セット３１１、３１２は、第１の因子および緩衝液を受容し、第２の注入口セット３１３、３１４は、第２の因子および緩衝液を受容し、第３の注入口セット３１５、３１６は、第３の因子および緩衝液を受容する。これは、下記でより詳細に記載される通り、各ウェルチャネルが、それぞれの濃度の、第１の因子、第２の因子、および第３の因子の各々を受容するように、第１の因子、第２の因子、および第３の因子のそれぞれの組合せを、２７のウェルチャネルの各々へと供給することを可能とする。

【0104】

加えて、装置は、細胞を含有するシーディング流体を受容するために使用しうる、シーディング注入口３４１をさらに含む。シーディング注入口は、シーディングチャネル３４１．１を介してウェルチャネルと流体連絡しており、これは典型的に、チャネル３２０のための接続点と反対側のウェルチャネルの末端へと接続されている。これは、シーディング注入口がまた、排出口としても機能することを可能とし、要求に応じて、ウェルチャネルを通って流動してきた流体を駆出することを可能とすることが察知されるであろう。

【0105】

また、シーディング排出口３４２も装備することができる。この例では、シーディング排出口３４２は、シーディングチャネル３４２．３を介して、シーディングポート３４２．１と流体連絡している、第２の層３０２内に装備されている。シーディングポート３４２．１は、第１の層３０１内の対応するシーディングポート３２４．２と流体連絡しており、これは、示される通りに、チャネル３２０と流体連絡している。

【0106】

使用時に、シーディング流体は、シーディング注入口３４１を介して、ウェルチャネルへと供給することができる。シーディング流体は、ウェルチャネルに沿って、矢印３５１の方向に通過し、ウェルに細胞をシーディングする。次いで、シーディング流体は、シーディングポート３４２．２、３４２．１を通過し、シーディング排出口３４２を介して流出する。シーディング流体は、十分なウェルの集団に細胞を確保する時間にわたり、ウェルを通過させることが典型的である。

【0107】

加えて、ウェルは、細胞を導入する前にコーティングすることもできる。ウェルは、ウェル内の細胞を保持すること、細胞生存率を維持することなどの一助となるように、コーティングすることができる。ウェルは、モジュレート作用物質または蛍光色素などの検出試薬のうちのいずれかでコーティングすることができる。加えて、または代替的に、これを使用して、例えば、アッセイなどにおける使用のためのマーカーを導入することができる。したがって、コーティングは、タンパク質、リガンド、抗体、ナノ粒子またはマイクロ粒子、馴化培地、馴化培地から精製された画分、自然発生の生物学的供給源から単離された組成物などの天然抽出物、ＲＮＡ分子または構築物、融合タンパク質、細胞培養成分または培地成分、炭水化物または代謝物、外因性ＤＮＡ配列または外因性ＲＮＡ配列をコードするウイルス粒子、外因性ＤＮＡ配列または外因性ＲＮＡ配列をコードするプラスミド／コスミド／細菌人工染色体または他の構築物、細胞または生物（すなわち、共培養された細胞型または病原体）など、任意の適切な材料を含みうることが察知されるであろう。

【0108】

このようなコーティングは、装置の製造時またはアセンブリー時に適用することもでき、代替的に、コーティング流体を、ウェルアレイ３３０を介して通過させることにより適用することもできる。これは、細胞をシーディングする前に、ウェルの各々が、同じコーティングを受容するように、シーディング注入口３４１およびシーディング排出口３４２を使用して達成することができる。代替的に、異なるコーティングは、注入口３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６を介しても導入し、コーティングの異なる組合せを、各ウェルチャネルへと供給することを可能とし、これにより、異なるコーティングの影響を評価することを可能としうるであろう。さらに、コーティングは、デバイスの任意の層を選択的に処理することにより、デバイスの製造時またはアセンブリーの前に適用することもできる。この処理は、ディップコーティング、スピンコーティング、リソグラフィー、エッチング、スポッティング、堆積、または既に言及されたコーティングのうちのいずれかを導入するか、またはデバイスの基板のうちのいずれかを修飾するのに適する他の工程などの工程を含みうる。次いで、例えば、この処理の後で、デバイスを、図３Ｃに示す通りにアセンブルすることができる。

【0109】

ウェルへのシーディングが完了したら、流体を、注入口３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６を介して供給する場合に、シーディング注入口３４１を、チャネル内の流体のための排出口として作動させて、流体を、ウェルチャネルへと通過させるように、例えば、ストッパーなどを使用して、シーディング排出口３４２を遮断することができる。

【0110】

特定のシーディング注入口およびシーディング排出口の配置は、例だけを目的とするものであり、実際は、代替的な構成を使用しうることが察知されるであろう。例えば、図１Ａの例で、シーディング排出口を装備させる場合であれば、チャネル１２１、１２２、１２３と流体連絡したシーディング排出口を装備させうるであろう。

【0111】

上記で記載した配置は、例だけを目的とするものであり、実際は、多数のさらなる変化形が可能であることが察知されるであろう。

【0112】

例えば、注入口および排出口の特定の構成は、要求に応じて、調整しうるであろうし、特に、注入口および排出口の位置は、要求に応じて、調整しうるであろう。これは、装置が、標準的なアーキテクチャーに準拠する、例えば、既存の流体供給系と適合することを可能とするように実施しうるであろう。これは、装置を単体のデバイスとして提供することを可能とし、次いで、これは、既存のハードウェアと共に使用することができ、これにより、備品の使用者に対する全費用が軽減される。装置はまた、標準的なハウジング内のカートリッジ内に、または、標準的なコネクターの他の任意の形態と共に装備し、既存のハードウェアへの組込みのさらなる一助とすることもできよう。これは、標準的な流体クリップ接続部を含み、これにより、外部備品の接続を容易としうる。装置が、標準的なマイクロプレートフットプリントを提示するように、装置はまた、スライドホルダーに取り付けることもでき、これにより、他の備品を伴う使用のさらなる一助となろう。配置の例を、図３Ｅおよび図３Ｆに示す。この例では、スライドホルダー３５０は、基板３０３を受容するためのウェル３５２を規定する本体３５１を含む。

【0113】

チャネルにより規定される異なる流動経路の相対抵抗は、例えば、使用される流体供給系を考慮に入れるほか、デバイスを通る相対的な流体の流動を調整するように、要求に応じて調整することができる。

【0114】

気体流カバーおよび水和プールなど、他の技法を使用して、さらなる環境制御を達成することができる。これは、デバイスの、例えば、図３Ｂに示される第２の層内に組み込みうる、等浸透圧浴層の使用を含むことが可能であり、供給は潅流による場合もあり、静置による場合もある。

【0115】

装置は、要求に応じて、流体および／または物質を、デバイスから抽出することを可能とする、培地回収オフテイクの組込みを含みうる。これは、例えば、ウェルの内容物を選択的に除去することを可能とするウェルアレイと適合する個別の層を含みうるであろう。

【0116】

装置は、バブルトラップ、ガス交換器、バブルセンシング電極、またはセンサーなど、ウェルアレイにわたる流体の一貫した送達を確保するための、さらなる制御デバイスまたはセンシングデバイスも含みうる。

【0117】

使用時に、ウェルアレイにわたり条件を平衡化するために、装置を培地によりフラッシングする工程など、プライミング工程を実施することができる。

【0118】

制御デバイスは、流体の流動をさらに制御するように、チャネルおよび／またはウェルチャネルへと組み込むことができる。これは、作用物質のウェル間の拡散を制限し、これにより、望ましくない作用物質のウェル間の拡散を伴わずに、流動を長時間にわたり停止させることを可能とする拡散バリアの使用を含みうる。これはまた、抵抗区間の長さの延長のほか、ウェルチャネル上のウェル間の隔たりの増大を使用することにより達成することもできる。加えて、弁を使用して、個々のウェルを隔離するほか、個々のウェルからの流体の抽出をもたらすこともできる。また、等抵抗（フラクタル）排出口チャネル区間を施して、流量分布を改善することもできる。

【0119】

使用しうる他の制御デバイスは、注入口および／またはチャネルを選択的に閉鎖し、これにより、デバイスを、曝露モードとシーディングモードとの間など、異なるモード間で切り換えることを可能とするプラグおよび注入口クリップの使用を含む。これはまた、例えば、使用後において、老廃生成物を含有するデバイスをシーリングするほか、ウェル内およびチャネル内の圧力を制御することを可能とするのにも使用することができる。また、このようなプラグも、複数のチャネルを同時に遮断することを可能とする、櫛形配置で装備することができる。

【0120】

ある範囲にわたる異なる検出機構を使用して、物質の応答を決定することができる。リードアウト／造影領域から伸長する個別のフルイディクス配置を施し、カバーによる遮蔽を使用することができる。これは、ウェルチャネルを曝露しながら、目視できないように残りのチャネルを不透明層によりおおわれた状態で保持することを可能とする。これは、望ましくないシグナルが、チャネル３２０内およびシーディングチャネル３４１．１内の物質から発生することを防止することにより、自動式センシング配置を使用して、ウェル内の物質を検出する場合に有用でありうる。

【0121】

流体培地、細胞、溶解物、物質などのうちの任意の１または複数のオフテイクのためには、ＳＢＳマイクロ滴定プレートを使用することができる。一例では、これは、１，５３６ウェルプレートに適合するプラグを含みうる。

【0122】

また、個々の列またはウェルに固定物または溶解物（ＲＬＴ、ＲＩＰＡなどによる）を供給することも可能である。デバイスにはまた、細胞を、個々のウェルまたはウェルのサブセットから、例えば、無傷生細胞、細胞の固定（例えば、パラホルムアルデヒドまたは適切な固定剤による）試料、細胞溶解物、またはＲＮＡ単離調製物を含む、ある範囲のフォーマットで、または緩衝液により回収する能力も組み入れることができる。

【0123】

ここで、装置３００の具体例の作動の実験例についてより詳細に記載する。

【0124】

これらの例では、スケーラブルの、階層的な入れ子状希釈ネットワークおよび抵抗流動原理を使用して装置をデザインし、ＳＵ−８ ２１００フォトリソグラフィー成形およびポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）ソフトリソグラフィー成形により、２５０μｍのチャネル高へと作製し、図３Ｃに示される構成で、第１の層および第２の層３０１、３０２と基板３０３とを接着することによりアセンブルした。

【0125】

外因性因子の全因子マルチプレックス処理は、注入口３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６およびチャネル３２０の配置だけによりコードされ、組み込まれる弁または広範な周辺機器の接続部を利用しない。

【0126】

これは、流体接続部の数をゼロ、ゼロ、または直線的増大のそれぞれとして、かつ、物理的層は増大させずに、並列もしくは直列の多連ウェルを付加すること（実験点の線形スケーリング）により、さらなる濃度レベルを付加すること（多項式スケーリング）により、またはさらなる因子を付加すること（指数関数スケーリング）により、装置３００をたやすくスケーラブルとしうることが察知されるであろう。

【0127】

装置は、３つの可溶性因子の各々による３つの濃度の組合せ全てを作り出す（全因子アレイ；６つの流体の入力だけに由来する、合計で３^３＝２７の異なる条件）。この柔軟なアーキテクチャーは、ａ：並列および／または直列の多連ウェル（実験点の線形スケーリング）、ｂ：濃度レベル（多項式スケーリング）、およびｃ：外因性因子（指数関数スケーリング）に照らしてたやすくスケーラブルであり、合計でａｂ^ｃ個の実験点をもたらすことが重要である。

【0128】

拡散による混合の後、アレイは、外因性因子を、ウェルアレイ３３０へと供給するが、これは、上記で記載した通り、培養ウェルとして作動する２７０個のウェルを含み、１５３６ウェルマイクロ滴定プレートと同様のサイズおよび配置を施される。グリッドは、１０個の直列培養ウェル２７列を含む（各列が、異なる組成の外因性因子を構成するのに対し、内因性傍分泌因子は、流体がウェルチャネルに沿って連続的に流動するにつれて、次第に蓄積される）。

【0129】

この例では、ウェルチャネルの幅は、２５０μｍであり、ウェル３３１は、直径が１．６３ｍｍであり、高さが２５０μｍである。図３Ｄに示される通り、ｈＥＳＣのための公称の流動条件下における計算流体力学モデル化は、幅２５０μｍのウェル３３１間相互接続部を、ウェル３３１を空間的に隔離するのに用いる場合、培養ウェル内の細胞を緩徐な沿面的層流へと曝露する結果として生じるせん断応力は小さいことを示す。これらの流動特徴により、モジュレート作用物質は、ウェル間で移送されうることが確認される一方で、細胞が流体の流動から受ける破壊は、最小限であることも確認される。

【0130】

［色素のローディング］
アレイにより形成される可溶性条件のスペクトルを査定するため、色素ローディング実験を実施し、ウェルの各々の中の可溶性因子レベルを決定するのに、蛍光分析による定量化を使用した。この例では、赤色、黄色、および青色の色素を使用して、注入口３１２、３１４、３１６へと供給される因子Ａ、Ｂ、Ｃをシミュレートする。注入口３１１、３１３、３１５へは、ＰＢＳ流体を供給し、これにより、３つの因子と対応する緩衝液との混合をシミュレートする。その後の希釈を可能とするように、標準化濃度を３とする原液を提供する。因子Ａ、Ｂ、Ｃの各々の理論濃度をパネル４０１に示し、結果として得られる色素分布の写真を、図４Ａのパネル４０２に示す。

【0131】

アレイ内の各列における（すなわち、各ウェルチャネルに沿う）可溶性因子レベルの、蛍光分析による定量化を実施した。因子チャネルＡ、Ｂ、およびＣは、逐次的かつ独立に定量化し、結果を図４Ｂに示す。チャネルＢおよびＣにおける、ゼロ濃度条件下の蛍光の検出は、吸着した残留色素に起因する。バーは、２回の独立の実験の平均±標準偏差を表す。結果は、ウェルアレイにわたる全因子スペクトルの条件の生成のほか、十分な、拡散による、最大で４０ｋＤａの因子の混合を確認する。全ての濃度レベルの正確な生成はまた、デバイスを通した流動分布が、デザインした流量と一致し、列間で同等であることも含意した。

【0132】

ＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｈＥＳＣ Ｌｉｎｅを使用して、多数の実験を実施した。ここで、使用される実験手順についてまとめるが、多数の実験の結果については、下記で記載する。

【0133】

［ＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｈＥＳＣ Ｌｉｎｅ］
ＰＬ−ＳＩＮ−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド２１３１３）レンチウイルスレポーター構築物は、マウス早期トランスポゾン（ＥＴｎ）プロモーターと、とりわけ多能性細胞内で高度に活性である、Ｏｃｔ４（また、Ｐｏｕ５ｆ１とも称する）遺伝子の遠位エンハンサー（保存的領域４）に由来する３ Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２結合性モチーフとを含むキメラプロモーターの制御下で、ｅＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼを発現する。ウイルス粒子を産生させるために、レンチウイルスベクターおよびパッケージングベクターを、２９３ＦＴ細胞へとトランスフェクトした。単一細胞の継代培養へと適合させたＨＥＳ３ ｈＥＳＣに、レンチウイルス粒子を遺伝子導入し、２〜２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン存在下の選択下にあるｍＴｅＳＲ−１／Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養物中で維持した。

【0134】

［アレイのスクリーニングおよび静置対照］
装置３００をオートクレーブ処理し、「チャネル−アウトガス法」に従い充填し、次いで、４００μｇ／ｍＬ（のべ１０μｇ／ｃｍ^２のタンパク質が供給される）の精製ヒトフィブロネクチン（Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）（ＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰ実験）、または付着アッセイを介して同定される限定希釈率の、ｈＥＳＣ用Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）（ＨＥＳ３−ＭＩＸＬ−ＧＦＰ実験）を単回注射することにより、表面コーティング（室温で２〜４時間にわたり）した。

【0135】

組織培養フラスコ内で維持されたｈＥＳＣを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓで引きはがし、すりつぶして、単一細胞懸濁液を準備し、次いで、ｍＴｅＳＲ−１で洗浄し、この中に、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２二塩酸塩一水和物、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を組み入れて、１ｍＬ当たりの細胞１．６×１０^６個（ＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰ実験；１ｃｍ^２当たりの細胞４×１０^４個の表面密度）で再懸濁させるか、またはＲＯＣＫ阻害剤を伴わずに、１ｍＬ当たりの細胞３．０×１０^６個（ＨＥＳ３−ＭＩＸＬ−ＧＦＰ実験；１ｃｍ^２当たりの細胞７．５×１０^４個）で再懸濁させた。

【0136】

細胞を、インキュベータ（３７℃、空気中５％のＣＯ_２）内で、８〜１０時間にわたり、ウェルアレイ３３０へと付着させ、次いで、１時間当たり６０μＬの総流量で、指定された因子条件下にある、連続的な流体の流動下に置いた。

【0137】

３または１ｍＬのシリンジ（ＮＪ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、Ｔｅｒｕｍｏ社）と、ステンレス鋼製２２ゲージブラントノーズニードルチップを注入口へのコネクターとして伴うポリエチレンチューブ（ＰＥ５０、内径０．５８ｍｍ；Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ、ＢＤ社）とを介するシリンジポンプ（ＮＥ−１８００；Ｎｅｗ Ｅｒａ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）により、容積駆動型流動をもたらした。全ての培地に、１％のｖ／ｖのペニシリン／ストレプトマイシン溶液をさらに補充した。２４ウェルプレート内の静置培養対照は、表面積当たり同等総量のタンパク質を供給するように調整された溶液濃度でコーティングし、また、同等表面密度の細胞もシーディングし、培地は実験終点まで毎日交換した（また、「補足的方法」も参照されたい）。

【0138】

装置３００における使用のために、馴化培地を、ＲＰＭＩ Ｂ２７培地中の１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４中および６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ中で分化させた静置対照から回収した。遠心分離により細胞を除去し、上清培地を４℃で保存した。１日目の培地と２日目の培地とを混合し、アレイ内での使用前に、ＢＭＰ−４およびアクチビンＡを、公称レベルの５０％で再補充した。

【0139】

［ｉｎ ｓｉｔｕ免疫蛍光染色および共焦点造影］
ｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色のために、流体の流動を開始した６．５日後（ＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰ実験）または２．５日後（ＨＥＳ３−ＭＩＸＬ−ＧＦＰ実験）にインキュベーションを終了させた。実験を実施するとき、注入口３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６は、当初プラグで閉鎖し、共通シーディング／コーティング排出口３４２は、開放のまま放置した。染色溶液と洗浄溶液との逐次的交換は、シリンジポンプにより駆動した。

【0140】

ウェルアレイ３３０をＰＢＳで洗浄し、２％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で固定した（室温で３０分間にわたり）後、０．２％のアジドナトリウムを伴う３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）／ＰＢＳ溶液でブロッキングした（室温で３０〜４５分間にわたり）。マーカーは、０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中のＴＧ３０（４μｇ／ｍＬ、Ｍｓ ＩｇＧ２ａアイソタイプ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）およびＴＲＡ−１−６０（４μｇ／ｍＬ、Ｍｓ ＩｇＭアイソタイプ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に対する一次抗体により検出した（室温で１時間にわたり）。

【0141】

次いで、ウェルアレイ３３０を、０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、その後、０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中の、アイソタイプをマッチさせた二次抗体（ヤギ抗Ｍｓ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、ヤギ抗Ｍｓ ＩｇＭ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７；いずれも４μｇ／ｍＬ；ＯＲ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）および１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）溶液で処理した（室温で１時間にわたり）。ＨＥＳ３−ＭＩＸＬ−ＧＦＰアレイは、Ｈｏｅｃｈｓｔだけで染色した。

【0142】

次いで、造影のために、ウェルアレイ３３０を、０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で洗浄した／０．３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中に取り付けた。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０レーザー走査共焦点顕微鏡システムおよびＺｅｎ ２００８収集ソフトウェア（Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）により、２７０個の培養ウェルを含む、装置３００全体の１６ビットのマルチカラータイル走査モンタージュ画像を収集した。試料の傾斜に起因する強度の変動について調整し、ｚ方向の強度が変動した核染色および膜染色を完全に捕捉するため、光学断面を収集し、次いでこれを処理して最大強度の投影とし、これを画像解析のために使用した。

【0143】

［データ処理および統計学的方法］
ＡＧＳｃａｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｕｌｃｙｂｅｒ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ａｇｓｃａｎ／）により、アレイから全蛍光強度（例えば、Ｔ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}）を抽出した。各チャネル内のスポット強度は、Ｉ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}＝（Ｔ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}−μ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}）／σ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}［式中、Ｉ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}は、特定のアレイについてのＥＯＳ−ＧＦＰの発現指数であり、μ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}は、特定のアレイについての全てのＴ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}の平均であり、σ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}は、特定のアレイについての全てのＴ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}の標準偏差である］により、個々のアレイ内のそのチャネル内の全てのスポットの平均および標準偏差について線形変換した。これにより、各スポットの強度を、大域的平均に照らした大域的標準偏差との関連で評価する発現指数（Ｉ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}、Ｉ_{ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ}）がもたらされる。

【0144】

ＭＩＮＩＴＡＢ １５ソフトウェア（Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．社）により、発現指数データについての因子解析を実施する。発現指数は応答変数として表し、可溶性因子は入力として表した。第４の入力変数である「位置」は、各培養ウェルのアレイ内の行座標に基づき規定した。次いで、別稿^４５に記載される方法に従い、ＭＩＮＩＴＡＢにより効果の大きさを求めた。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにより、ピアソンの積率相関係数（ｒ_Ｘ，Ｙ）、線形回帰の決定係数（Ｒ^２）、およびスチューデントのｔ検定統計を計算した。スチューデントのｔ検定のために、不等分散を仮定する２つの試料について、両側検定を実施し、ｐ＜０．０５の差違を有意であると考えた。

【0145】

［原始線条の誘導および化学的モジュレーション］
ｍＴｅＳＲ−１／Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養物中で維持されたＨＥＳ３−ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ ｈＥＳＣを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓにより引きはがし、１ｃｍ^２当たりの細胞７．５×１０^４個で、ｈＥＳＣ用Ｍａｔｒｉｇｅｌの限定希釈液でコーティングされた２４ウェルプレートへとシーディングし、一晩にわたり付着させたところ、その後における培養物のコンフルエンシーは、約６０％であることが典型的であった。次いで、２．５日間にわたり、５μＭのＩＷＰ−４および５μＭのＣＨＩＲ９９０２１（いずれも、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社）、または０．１％のｖ／ｖのＤＭＳＯ媒体対照を任意選択で添加した、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４および６ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（いずれも、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を伴うＲＰＭＩ Ｂ２７培地中で分化させることにより、ＭＩＸＬ１−ＧＦＰの発現を誘導した。

【0146】

ここで、各実験の結果について記載する。

【0147】

［マイクロバイオリアクターアレイ内のｈＥＳＣの多能性スクリーニング］
装置３００の性能を、生物学的スクリーニング工程において検証するために、規定された条件下におけるＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰ ｈＥＳＣの多能性スクリーニングを実施した。この実験のために、ｍＴｅＳＲ−１カスタム培地（型番０５８９２、ＢＣ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によるバックグラウンドを、維持因子であるＦＧＦ−２およびＴＧＦ−β１、ならびに精製ヒトフィブロネクチン（Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）による付着基板から差し引いた。ｈＥＳＣは、一定の流動（１時間当たりのべ６０μＬ）下で、６．５日間にわたり、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β１、およびレチノイン酸（ＲＡ）の全因子アレイ内で培養した。スクリーニング条件を図５Ａに示すが、数は、ＦＧＦ−２（ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ−β１（ｎｇ／ｍＬ）、およびＲＡ（μＭ）の相対濃度を指し示す。維持因子は、ウェルアレイ３３０を使用して、培地へと逆滴定し、レチノイン酸は、分化についての内部対照として組み入れた。

【0148】

レンチウイルスにより遺伝子導入された多能性レポーター系であるＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰによるＧＦＰ発現を、多能性状態についての高感度のリードアウトとして使用した。アレイと並行した静置対照（２４ウェルプレート）ランにおいて、多能性レポーター系の有用性を検証し、多様な維持刺激および分化刺激に応答するその感度を特徴付けた。多能性は、実験終点において、表面マーカーであるＴＧ３０およびＴＲＡ−１−６０についてのｉｎ ｓｉｔｕ共免疫染色によりさらに確認し、ＤＮＡは、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色した（「補足的方法」）。免疫検出相は、アレイ内の細胞数またはＧＦＰ蛍光にそれほど影響を及ぼさなかった。

【0149】

マルチチャネル蛍光データは、レーザー走査共焦点造影により捕捉したが、結果として得られる画像を図５Ｂに示す。列２５および列３について、アレイの行１のウェルの高倍率画像を図５Ｃおよび図５Ｄのそれぞれに示す。スケールバーは、５００μｍに対応する。アレイ内の総蛍光強度のヒートマップ（任意単位）を図５Ｅに示す。スポット強度は、個々のアレイ内の全てのスポットの平均および標準偏差について線形変換して、発現指数（例えば、ＩＥＯＳ−ＧＦＰ）を得た。この手法は、ＥＣＭアレイのために取られる手段と同様であり、１つの条件において、全ての処理の平均に照らして強い正の効果または負の効果が認められるスクリーン内の「ヒット」を明確に強調する効果を有する。大域的な標準化法は、さらなる較正器を伴わなければ、異なるアレイ対照間またはプレート対照間における絶対発現レベルの直接比較を可能としない。

【0150】

結果は、６．５日後において、ＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰレポーター系内のＧＦＰ発現は、大きなダイナミックレンジを有し、厳密な応答をもたらしていたが、５または１０μＭのＲＡで処理したところ、ＦＧＦ−２処理またはＴＧＦ−β１処理にもかかわらず、ＥＯＳ−ＧＦＰ発現は、低いベースラインレベルまで消失したことを示す。また、列１（因子を伴わない）および列４（０．２５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１）も、ＲＡ処理条件と同様のＥＯＳ−ＧＦＰ発現をもたらしたことから、維持促進シグナルが非存在または不十分であることに対する感度が示される。ＴＧ３０およびＴＲＡ−１−６０が呈示したダイナミックレンジは、ＥＯＳ−ＧＦＰよりも小さく、アレイ全体にわたり、より無差別的な発現分布を示した。

【0151】

図５Ｅおよび図５Ｆに示される通り、一部のＲＡ処理条件では、６．５日後においても、残留発現が認められたが、これは、ＦＧＦ−２処理および／またはＴＧＦ−β１処理による統合効果について表示するところが大きいと考えられた。３つの多能性マーカー全てについて、最大の応答は、第１行内の列２５において生じたが、これは、再構成されたｍＴｅＳＲ−１条件の直接的な供給に対応する。よって、検証の観点からすると、アレイは、緩徐な潅流条件の賦課下においてもなお、ｍＴｅＳＲ−１培地の有効性を追認することができた。

【0152】

結果は、共通の因子をウェルチャネルへと供給する場合でもなお、多能性マーカーの発現が位置依存性であり、特に、ウェルチャネルの長さに沿って変化することを強調することに注意されたい。本実験では、多能性マーカーの最大の発現は、アレイの第１行において生じたのに続いて、後続する下流のウェルを通じて発現勾配の減少が認められた。アレイからのこのような創発的署名を抽出するために、従来の培養フォーマットでは、他の形で明示的に取り出すことが困難な推定傍分泌効果を特徴付ける目的で、ウェルチャネル内のウェルの位置座標（行数）を、因子解析のための入力因子として組み入れた。次いで、図５Ｆに示される通り、因子解析により、個々の因子の主効果が明らかとなった。

【0153】

第１行におけるピークＥＯＳ−ＧＦＰ発現は、外因性因子が、多能性を維持するように直接作用することが可能であったことを示唆する。自家フィーダー細胞の発生または傍分泌因子の蓄積が要望されたとすれば、ＥＯＳ−ＧＦＰ発現は、下流における最大または勾配の増大を明らかにすることが予測されよう。ＨＥＳ３−ＥＯＳ−Ｃ（３＋）−ＥｉＰ細胞は、スクリーニングの前に、多能性細胞についてのピューロマイシン選択にかけたので、このような自家フィーダーが、初期培養物中に存在する可能性は小さい。結果は、ＧＦＰの減少が、ウェル間で移送される拡散可能因子の産生の結果としての減少であることを指し示す。

【0154】

アレイデータからは、位置依存性発現の有意差が、０．２５または０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１の添加から生じたのかどうかは明らかでないが、ＴＧＦ−β１を含まない列（列１０および１９）もまた、勾配の減少を示したことから、異なるエフェクターの存在が示される。さらに、代謝物からの影響も考えた。しかし、行１０および細胞密度が最大の場合において、ブドウ糖の枯渇は、約３ｍＭ（ｍＴｅＳＲ−１レベルの２２％）であり、乳酸の蓄積は、約７ｍＭ（３週間後におけるＴＲＡ−１−６０の発現を部分的に低減することが示されるレベルの３２％^１９）であると推定される。したがって、正味の分化促進効果を及ぼす分泌因子の捕捉物により、負の傍分泌効果が引き起こされると考えられる。これは、ｈＥＳＣ馴化培地中のこのような因子の検出と符合する。

【0155】

全てのＲＡ含有条件を度外視して、ＥＯＳ−ＧＦＰデータをＤＮＡに照らして標準化することにより、位置依存効果が明らかとなった。多能性マーカーの発現指数は、全ての２７０個のスポットの対応のある総強度に基づく、ｒ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ，ＴＧ３０}＝０．７７、ｒ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ，ＴＲＡ−１−６０}＝０．６４、およびｒ_{ＴＧ３０，ＴＲＡ−１−６０}＝０．７５の相関係数（ｒ_Ｘ，Ｙ）で強く相関した。また、多連のアレイ実験も、２７０個のスポット全ての対応のある総強度に基づき、ｒ_{Ａｒｒａｙ１，Ａｒｒａｙ２}＝０．６０、０．６４、および０．４１のそれぞれを示すＩ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}データ、Ｉ_ＴＧ３０データ、およびＩ_{ＴＲＡ−１−６０}データ、または行１〜５からの対応のある平均強度について、ｒ_{Ａｒｒａｙ１，Ａｒｒａｙ２}＝０．７３、０．８６、および０．４４を示す、Ｉ_{ＥＯＳ−ＧＦＰ}データ、Ｉ_ＴＧ３０データ、およびＩ_{ＴＲＡ−１−６０}データと高度に相関した。これは、スポットのサブセットから測定される平均応答についての相関係数である０．３５〜０．６５を示した、公表されているＥＣＭタンパク質アレイ実験と良好に類比される。

【0156】

［原始線条による分化スクリーニング］
ｈＥＳＣの分化プロトコールは、標的表現型の出現を駆動する胚様体（ＥＢ）を利用することが典型的である。しかし、ＥＢは、異種性であり、シグナル伝達活性の性状不明の空間的勾配を含有し、傍分泌シグナルの制御をほとんどもたらさない。分化転帰はまた、ＥＢのサイズに大きく依存し、傍分泌因子の蓄積など、局在化細胞密度から生じる微小環境パラメータを、極めて重要な関与パラメータとして含意することも示されている。これについて精査するために、レポーター遺伝子によりマークされたｍＥＳＣの強制凝集を活用する実験が試みられているが、このような手法は、胚様体内の微小環境組成の、内在的な空間的−時間的変動を覆い隠し、規定された刺激の組合せを、特異的な分化転帰と連関させることを困難とする。

【0157】

これらの機能をもたらす装置３００の能力をさらに裏付けるため、ｈＥＳＣを、転写因子であるＭＩＸＬ１でマークされた原始線条様（中内胚葉性）表現型へと分化させた。単層として成長するＨＥＳ３−ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ ｈＥＳＣ（また、ＨＥＳ３ ＭＩＸＬ１^{ＧＦＰ／ｗ}ｈＥＳＣとも称する；核型分類であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおいては奇形腫である）を、装置３００内の連続的な流動下、ＲＰＭＩ Ｂ２７培地中のＢＭＰ−４、アクチビンＡ、およびＧＳＫ−３β阻害剤／カノニカルのＷｎｔ活性化因子６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）の全因子アレイ内で、２．５日間にわたり分化させた。アレイ条件を示すスクリーニングパネルを図６Ａに示すが、数は、ＢＩＯ（μＭ）、ＢＭＰ−４（ｎｇ／ｍＬ）およびアクチビンＡ（ｎｇ／ｍＬ）の濃度を指し示す。

【0158】

ＧＦＰを発現させ、実験終点においてＨｏｅｃｈｓｔで対比染色されたＨＥＳ３−ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ ｈＥＳＣについての共焦点タイル走査画像を図６Ｂに示し、アレイ内の総蛍光強度のヒートマップを図６Ｃに示す。ウェルアレイ３３０内の個々のウェルの高倍率共焦点画像を図６Ｄに示すが、スケールバーは、５００μｍの長さを指し示す。

【0159】

終点におけるＭＩＸＬ１−ＧＦＰの発現を、緊密に定められた因子条件下で活性化させたところ、最大の発現は、列６、１５および２４において生じた（図６Ｂおよび図６Ｃに示される通り、条件は各々、０、１、または２μＭのＢＩＯのそれぞれと組み合わされた、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４および６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含有した）。不鮮明なＨｏｅｃｈｓｔ ＤＮＡ染色により特徴付けられる細胞を含有する、高ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ発現ウェルの直前には、各場合において、クラスター化した細胞層および鮮明なＤＮＡ染色により特徴付けられる「ＤＮＡ鮮明」ウェルが先行したことは注目に値する。表現型のこの周期的回帰は、外因性因子と傍分泌因子との、固有でかつ規定された組合せから生じる、個々のウェル内の（すなわち、緊密に定められた条件のセット内の）比較的同種性の中間的集団の離散的なパターン化を示唆する。図６Ａにおける通りの多連のアレイ実験の相関係数は、Ｉ_ＤＮＡおよびＩ_{ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ}のそれぞれについて、０．６６および０．６９であった。

【0160】

図６Ｅに示される通り、発現指数であるＩ_{ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ}についての因子解析は、アクチビンＡに対する直線的な正の依存性、１μＭおよび１０ｎｇ／ｍＬのそれぞれにおけるＢＩＯ濃度およびＢＭＰ−４濃度の最適値を示した。因子解析はまた、最適濃度で組み合わされた場合の、ＢＭＰ−４とアクチビンＡとの相乗作用も強調した。しかし、位置依存性が、行７において最適値を伴う「傍分泌署名」であって、発現レベルの指数関数的傾向の増大を先行させ、指数関数的傾向の減少を直後に後続させた署名を曝露したことは最も注目に値する。全アレイにわたり、相当量のＭＩＸＬ１−ＧＦＰの発現が検出されたのは、ウェルの第４行より下方だけであることから、ＢＭＰによる刺激と、アクチビンによる刺激と、カノニカルのＷｎｔによる刺激との組合せだけでは、ＭＩＸＬ１の発現を直接活性化させるのに十分でなかったことが示唆される。３．５日間にわたるアレイランは、ＧＦＰ発現の同様の分布を示したことから、初期行における欠損が、誘導時間の不足に純粋に起因したわけでなはいことが示唆される。そうではなくて、ＭＩＸＬ１の活性化には、一連の培養ウェルを通した可溶性傍分泌因子の漸進的蓄積が要求される。

【0161】

誘導馴化培地（公称の因子レベルの５０％を再補充した）をその後の実験における因子として供給したところ、ＭＩＸＬ１−ＧＦＰの発現が、用量依存的な形でアレイの最上行へとシフトすることが観察されたことは、このような移送可能な傍分泌因子の存在を強力に裏付ける。

【0162】

この一因となる因子を同定するための能力を裏付ける目的で、装置３００をさらに使用して、ＦＧＦシグナル伝達を候補傍分泌シグナルとしてスクリーニングした。

【0163】

図７Ａは、使用されるスクリーニング条件を示し、数は、誘導馴化因子補充培地［ＣＭ、最終％ ｖ／ｖ］であるＣＨＩＲ９９０２１の濃度（ＣＨＩＲ、μＭ）およびＩＷＰ−４の濃度（μＭ）を指し示す。ＧＦＰを発現させ、実験終点においてＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した、ＨＥＳ３−ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ ｈＥＳＣの共焦点タイル走査画像を図７Ｂに示し、アレイ内の総蛍光強度のヒートマップを図７Ｃに示す。

【0164】

図７Ｄは、ＣＭと位置との組合せの、ＩＭＩＸＬ１−ＧＦＰに対する効果の大きさの平均を示す相互作用効果のプロットである。これは、馴化培地が、発現レベルを改善し、かつ、発現をアレイの最上行へとシフトさせたことを強調する。図７Ｅは、ＣＨＩＲ添加の位置依存効果を示す列１９〜２１についての、ＤＮＡを標準化した総蛍光強度（ＴＭＩＸＬ１−ＧＦＰ／ＴＤＮＡ）を示す。ＣＨＩＲは、発現レベルを改善し、かつ、発現が大きく増大した行の数を増やした。図７Ｆおよび図７Ｇは、総強度およびＤＮＡについて標準化された強度のそれぞれに関する、ＣＨＩＲ添加の効果を確認する個別のアレイラン由来のデータを示す。

【0165】

図７Ｈは、ＩＷＰ−４により、静置対照におけるＭＩＸＬ１の誘導が完全に遮断されたので、Ｗｎｔの蓄積もまた要求されるが、発現をわずかながら上方にシフトさせたのはＣＨＩＲ９９０２１だけであるので、Ｗｎｔの蓄積が「制限的な」蓄積された因子である可能性は小さいことを示す。

【0166】

ＭＩＸＬ１−ＧＦＰの活性化後、下流の培養ウェルでは、発現の強度が急速に減衰したことから、ＭＩＸＬ１の誘導は、狭い濃度範囲の傍分泌因子により調節されること、または、ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ^＋集団自体が、その誘導に対してネガティブフィードバックをもたらす因子を産生することが指し示される。

【0167】

また、条件のうちの１つである列１５（１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４、６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、１μＭのＢＩＯ）において、ＭＩＸＬ１−ＧＦＰの鮮明な発現は、図５Ｂおよび図５Ｃに示される、列６内の行７において認められる蛍光の単一のピーク（同一の条件下であるがＢＩＯを伴わない）ではなく、４〜５行にわたり広がったことも注目された。これは、負のフィードバック効果が、部分的に、強化されたカノニカルのＷｎｔシグナル伝達により克服されうることを示唆した。この仮説を検証するため、細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４および６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含有するＲＰＭＩ Ｂ２７培地によるバックグラウンド中の、ＣＨＩＲ９９０２１（ＢＩＯとは対照的に、ＣＤＫ４活性に干渉しないＧＳＫ−３β阻害剤であるＣＨＩＲ）、公称レベルの５０％のＢＭＰ−４およびアクチビンＡを再補充した誘導馴化培地（ＣＭ）、およびＩＷＰ−４（Ｗｎｔ産生の阻害剤）の全因子アレイ（「補足的方法」）内で分化させた。図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｅに示される通り、ＣＨＩＲ９９０２１はまた、ＭＩＸＬ１−ＧＦＰ発現による線条の拡大ももたらしたが、これは、その作用方式（ＧＳＫ−３β／β−カテニンレベルにおける、カノニカルのＷｎｔシグナル伝達の細胞内強化）に基づくと、このフィードバックループの潜在的なメディエーターのクラスとしてのＤＫＫおよびｓＦＲＰなど、Ｗｎｔに対するアンタゴニスト性シグナルの分泌を含意する。図７Ｆ、図７Ｇに示される通り、この効果はまた、個別のアレイ実験においても顕著であった。

【0168】

このような傍分泌因子への依存性および中胚葉の特定を調節する負のフィードバックシグナルは、原始線条など、一過性のｉｎ ｖｉｖｏ構造において、明確に必要な発生駆動因子であるであるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化効率は不可避的に低減する。したがって、アレイ内の正の傍分泌調節因子および負の傍分泌調節因子をモジュレートすることの転帰が、従来の静置培養において方向付けられた分化プロトコールを最適化するように変換されうるのかどうかを調べた。実際、図７Ｈに示される通り、ＲＰＭＩ Ｂ２７＋１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４＋６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡという標準的な条件に照らして、５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加すると、ＭＩＸＬ１−ＧＦＰの誘導が、細胞のうちの５１％から８６％へと増大することが判明した。

【0169】

ここで、図３Ａ〜図３Ｃの装置の改変形を示す、図８Ａ〜図８Ｄを参照しながら、装置のさらなる具体例について記載する。

【0170】

この例でもまた、装置は、基板８０３へと取り付けられた、図８Ａおよび図８Ｂに示される、第１の被覆層８０１および第２の被覆層８０２を含む。ここでもまた、層は、適切な接着工程を使用して接着させたＰＤＭＳまたは他の類似の材料から形成することができる。前出の図３Ａ〜図３Ｃの例で記載した通り、基板は、スライドホルダーと連携して、標準的なマイクロプレートフットプリントをもたらすように適合させることが典型的である。

【0171】

この例では、装置８００は、チャネル８２０を介して、ウェルアレイ８３０と相互接続された注入口８１０を含む。注入口８１０は、第１の層８０１内に装備され、それぞれのポートを介して、第２の層８０２内のウェルアレイへと接続されている。この配置は、前出の図３Ａ〜図３Ｃの具体例の配置と同様であり、したがって、さらに詳細に記載されないことが察知されるであろう。

【0172】

この例では、装置は、４つの注入口の対８１１．１、８１１．２、８１２．１、８１２．２、８１３．１、８１３．２、８１４．１、８１４．２を含み、各注入口の対は、それぞれの因子および緩衝液を受容するためのものである。ウェルアレイ８３０は、４つの注入口の対を介して、８１のウェルチャネルにわたり供給される、４つの因子の３つの濃度レベルからなる全因子アレイを規定する。チャネルは、ウェルアレイ内で２連である。各ウェルチャネルは、５０個のウェルを含み、これにより、８１００ウェルを伴うウェルアレイを規定する。

【0173】

図８Ｃにおいて示す通り、適切なチャネルの経路変更を介して第２の層上に整列させた、４つの注入口の対８１１．１、８１１．２、８１２．１、８１２．２、８１３．１、８１３．２、８１４．１、８１４．２が提供される。整列させた構成内に注入口を装備することは、例えば、要求に応じて、使用される単一のクリップコネクターが、因子の供給および緩衝液の供給の、注入口へのカップリングを可能とすることにより、注入口を流体の供給とカップリングする一助となる。一例では、これは、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｘ Ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ（８ピン）レイアウトに対応させるのに使用することができる。

【0174】

因子および緩衝液のウェルチャネルへの一貫した送達を確保するために、これに応じて、例えば、適切な蛇行の使用を介して、チャネル３２０の抵抗をデザインし直す。

【0175】

装置８００は、細胞を含有するシーディング流体を受容するために使用しうる、シーディング注入口８４１をさらに含む。シーディング注入口は、シーディングチャネル８４２を介してウェルチャネルと流体連絡しており、これは典型的に、チャネル８２０のための接続点と反対側のウェルチャネルの末端へと接続されている。これは、シーディング注入口がまた、排出口としても機能することを可能とし、要求に応じて、ウェルチャネルを通って流動してきた流体を駆出することを可能とすることが察知されるであろう。

【0176】

この例では、シーディングチャネル８４２は、等抵抗（フラクタル）の配置で装備され、流量分布を改善する。加えて、幅を拡張した抵抗の小さなチャネル８４２．１も装備される。排出口区間として作動する、等抵抗のシーディングチャネルを組み入れることにより、作動時において均一の流動分布が確保されるほか、シーディング時における均等な細胞分布のための、抵抗の小さな細胞シーディング構造ももたらされる。

【0177】

加えて、排出口区間において長いチャネルを装備することにより、細胞シーディング構造とウェルチャネルアレイとの間に拡散障壁がもたらされ、使用されるウェルチャネルの交差汚染が防止される。

【0178】

８１のウェルチャネルの各々にわたる因子の組合せの例を、図８Ｅおよび図８Ｆに示す。緑色、赤色、黄色、および青色の色素を使用して、注入口８１１．２、８１２．２、８１３．２、８１４．２へと供給される対応する緩衝液と共に、注入口８１１．１、８１２．１、８１３．１、８１４．１へと供給される因子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄをシミュレートする。この例では、理論濃度を図８Ｅに示し、色素ローディング実験から結果として得られる実際の濃度を図８Ｆに示す。加えて、シーディング注入口８４１を介する色素ローディングの結果を図８Ｇに示すが、これにより、ウェルチャネル全体にわたる色素の均等な分布が強調される。

【0179】

したがって、上記で記載した例は、細胞活性を多様な条件下でモジュレートするための装置をもたらす。一例では、装置は、可溶性因子のスクリーニングを妥協のない形で行うために、規定された培地および付着基板を活用し、培地の連続的な潅流をもたらし、傍分泌効果を分離および造影し、時間的により安定的な微小環境をもたらし、複数の刺激の間の相互作用効果をデコンボリュートするための、培養条件の全因子捕捉物を作り出す。

【0180】

実験データは、装置を活用して、広範囲の過程にわたり、規定された刺激の組合せを、多能性幹細胞の表現型転帰へとマップしうることを裏付ける。加えて、アレイは、複数のウェルをウェルチャネルに沿って配置することにより、従来の静置培養では覆い隠されていた傍分泌効果、特に、ＥＢを空間的に分離および造影することが可能である。所与の外因性因子による刺激レジームから生じる傍分泌署名を明らかにすることにより、デバイスはまた、直接作用性可溶性因子の階層を解読するためのアッセイももたらす：例えば、推定される傍分泌因子の、アレイへの直接的な添加のほか、培地からの因子の枯渇、またはそれらのシグナル伝達経路の阻害は、分化転帰の駆動に関与する傍分泌因子の識別を明らかにするのに有効な戦略である。

【0181】

装置はまた、分化転帰をモジュレートする傍分泌効果を検討することも可能とし、これにより、階層および作用方式、または原因となる特異的な因子の同定を可能とする。

【0182】

上記で記載した装置は、マイクロ流体チップの自動化および周辺機器サポートを伴う、標準化されたプラットフォームアーキテクチャーと共に使用して、マイクロバイオリアクターアレイ技術の、多能性幹細胞の自己再生過程および分化過程を制御する微小環境シグナルの発見および最適化への広範な適用を可能とし、ひいては、多能性幹細胞の将来における潜在的可能性を切り開きうるであろうことが察知されるであろう。プラットフォームはまた、多様な生体分子および薬理学的作用物質についての汎用性の微小環境スクリーニングプラットフォームとして、他の細胞型に対しても、広範な有用性を有する。

【0183】

プロモーター、阻害剤、成長因子、凝固因子、ホルモン、シグナル伝達作用物質、化学組成物、薬物、タンパク質、リガンド、抗体、生物、細胞、ミニ細胞、合成細胞、リポソーム、ミセル、ポリマーミセル（ポリマーソーム）、脂質、ポリマー、界面活性剤、脂肪酸、イオン溶液、酸性溶液または塩基性溶液、検出試薬、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリペプチド、アミノ酸、ウイルス粒子、プラスミド、ナノ粒子、マイクロ粒子、磁性粒子、馴化培地、馴化培地から精製された画分、天然抽出物、培養培地成分、細胞培養添加剤、炭水化物、ビタミン、代謝物、オリゴヌクレオチド、融合タンパク質、プロテオグリカン、および病原体を含むがこれらに限定されない、様々な物質が想定されている。

【0184】

使用しうる細胞に関して、非限定的な例は、造血幹細胞、神経幹細胞、骨幹細胞、筋幹細胞、間葉系幹細胞、上皮幹細胞、内皮幹細胞、多能性胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、多能性胚性生殖細胞、全能性細胞を含むがこれらに限定されない幹細胞；筋芽細胞；好中球；リンパ球；マスト細胞；赤芽球；骨芽細胞；破骨細胞；軟骨細胞；好塩基球；好酸球；脂肪細胞；ニューロン；副腎髄質細胞；メラニン細胞；上皮細胞；内皮細胞；肝細胞；肺細胞；腎細胞；およびこれらのそれぞれの前駆細胞；それらの例示的な例が肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、および精巣癌を含む、腫瘍細胞、黒色腫、骨髄性白血病；幹細胞または他の細胞に由来する前駆細胞または分化細胞の中間集団；ならびに上記のうちのいずれかからなる細胞の混合物を含む。他の適切な細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳなどのほか、細菌、藻類、酵母、真菌などを含む非哺乳動物細胞型を含むがこれらに限定されない、公知の研究用細胞および研究用細胞系を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、実質的に同種性の細胞集団を形成する。他の実施形態では、細胞は、異種性の培養物を形成し傍分泌性シグナル伝達機構を介して、相互作用することが公知の細胞型を含む。

【0185】

プロモーター、阻害剤、成長因子、凝固因子、ホルモン、シグナル伝達作用物質、化学組成物、薬物、タンパク質、リガンド、抗体、生物、細胞、ミニ細胞、合成細胞、リポソーム、ミセル、ポリマーミセル（ポリマーソーム）、脂質、ポリマー、界面活性剤、脂肪酸、イオン溶液、酸性溶液または塩基性溶液、検出試薬、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリペプチド、アミノ酸、ウイルス粒子、プラスミド、ナノ粒子、マイクロ粒子、磁性粒子、馴化培地、馴化培地から精製された画分、天然抽出物、培養培地成分、細胞培養添加剤、炭水化物、ビタミン、代謝物、オリゴヌクレオチド、融合タンパク質、プロテオグリカン、および病原体を含むがこれらに限定されない、様々なコーティングが想定される。

【0186】

流体はまた、プロモーター、阻害剤、成長因子、凝固因子、ホルモン、シグナル伝達作用物質、化学組成物、薬物、タンパク質、リガンド、抗体、生物、細胞、ミニ細胞、合成細胞、リポソーム、ミセル、ポリマーミセル（ポリマーソーム）、脂質、ポリマー、界面活性剤、脂肪酸、イオン溶液、酸性溶液または塩基性溶液、検出試薬、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をコードする構築物、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリペプチド、アミノ酸、ウイルス粒子、プラスミド、ナノ粒子、マイクロ粒子、磁性粒子、馴化培地、馴化培地から精製された画分、天然抽出物、培養培地成分、細胞培養添加剤、炭水化物、ビタミン、代謝物、オリゴヌクレオチド、融合タンパク質、プロテオグリカン、および病原体を含むがこれらに限定されない作用物質も含みうる。作用物質は、流体内の溶存形態、または流体内の固体としての懸濁形態など、任意の適切な形態でありうる。

【0187】

したがって、上記で記載した例は、外因性モジュレート作用物質の全因子セットを提示する、スケーラブルの連続流マイクロバイオリアクターアレイをもたらし、加えて、個別次元に沿った内因性モジュレート作用物質の蓄積も可能とする。ヒト胚性幹細胞における多能性の維持および原始線条分化の例を使用して、上記で記載した実験は、従来の培養プラットフォームではたやすく接近可能ではない傍分泌効果を分離、造影、同定、およびモジュレートする、このプラットフォームの固有の能力を裏付ける。アレイプラットフォームは、因子間の相互作用ならびに直接作用性可溶性因子および傍分泌性シグナル伝達イベントの階層を解読し、これにより、因子効果など、微小環境の幹細胞運命に対する制御を解明することを可能とする。

【0188】

特定の一例では、アレイは、６つの流体入力だけを使用して、３つの可溶性因子の各々の３つの濃度の組合せ全て（全因子アレイ；合計で３^３＝２７の異なる条件）を作り出し、最適処理、因子間の相互作用効果の同定、ならびに傍分泌因子蓄積の分離およびその後の細胞表現型に対する分化効果の造影を可能とする。アレイは、多様な付着基板でコーティングし、ｈＥＳＣを、培養物培地の緩徐な連続潅流で、少なくとも７日間にわたり維持することができる。レポーター遺伝子の発現および／またはｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色は、細胞表現型のリードアウトを可能とする。

【0189】

上記で記載した装置は、異なる条件に対する物質の応答を評価し、特に、異なる環境条件に対する細胞の応答を、例えば、細胞モジュレート作用物質への曝露を介して評価しうることが所望である任意の状況において使用しうることが察知されるであろう。したがって、装置は、ある範囲の適用およびモジュレート作用物質へと適用することができる。例えば、装置は、細胞を培養し、インキュベートし、反応させ、アッセイし、分化させることのほか、モジュレート作用物質についての試験を実施する、例えば、細胞活性を変化させるときの薬物の有効性について調べるのにも使用することができる。他のモニタリングは、細胞生存率、細胞形態、細胞シグナル伝達、タンパク質転移、細胞抗原提示、ＤＮＡ合成、細胞ゲノム、細胞トランスクリプトーム、細胞プロテオーム、細胞代謝、細胞の電気生理学的機能、細胞の生理学的機能、食作用、エンドサイトーシス、遺伝子発現、タンパク質発現、炭水化物発現、生体分子間相互作用、受容体結合、検出作用物質の細胞結合、およびモジュレーション作用物質の細胞取込みを含みうる。

【0190】

したがって、上記で記載した例は、限定を意図するものではない。

【0191】

当業者は、多数の変更および改変が明らかとなることを察知するであろう。当業者に明らかとなる、全てのこのような変更および改変は、広範にわたり提示される本発明により記載される精神および範囲の中に収まると考えるものとする。

【符号の説明】

【0192】

１００ 装置
１１１ 注入口
１１２ 注入口
１１３ 注入口
１１４ 注入口
１２０ チャネル
１２１ チャネル
１２２ チャネル
１２３ チャネル
１２４ チャネル
１２５ チャネル
１２６ チャネル
１３０ ウェルアレイ
１３１ ウェルチャネル
１３２ ウェルチャネル
１３３ ウェルチャネル
１３４ ウェルチャネル
１３５ ウェルチャネル
１３６ ウェルチャネル
１３７ ウェルチャネル
１３８ ウェルチャネル
１３９ ウェルチャネル
１３１．１ ウェル
１３１．２ ウェル
１３１．３ ウェル
１３２．１ ウェル
１３２．２ ウェル
１３２．３ ウェル
１３３．１ ウェル
１３３．２ ウェル
１３３．３ ウェル
１５０ 矢印
２００ 装置
２２１ 混合部分
２２２ 混合部分
２２３ 混合部分
３００ 装置
３０１ 第１の被覆層、第１の層、層
３０２ 第２の被覆層、第２の層、層
３０３ 基板
３１１ 注入口
３１２ 注入口
３１３ 注入口
３１４ 注入口
３１５ 注入口
３１６ 注入口
３１１ 第１の注入口セット
３１２ 第１の注入口セット
３１３ 第２の注入口セット
３１４ 第２の注入口セット
３１５ 第３の注入口セット
３１６ 第３の注入口セット
３１７．１ ポート
３１７．２ ポート
３１８．１ ポート
３１８．２ ポート
３２０ チャネル
３２１ 混合部分
３２３ チャネル
３２３．１ チャネル
３２３．２ チャネル
３２３．３ チャネル
３３０ ウェルアレイ
３３１ ウェル
３４１ シーディング注入口
３４１．１ シーディングチャネル
３４２ シーディング排出口
３４２ シーディング／コーティング排出口
３４２．１ シーディングポート
３２４．２ シーディングポート
３４２．３ シーディングチャネル
３５０ スライドホルダー
３５１ 本体
３５１ 矢印
３５２ ウェル
４０１ パネル
４０２ パネル
８００ 装置
８０１ 第１の被覆層
８０２ 第２の被覆層
８０３ 基板
８１０ 注入口
８１１．１ 注入口
８１１．２ 注入口
８１２．１ 注入口
８１２．２ 注入口
８１３．１ 注入口
８１３．２ 注入口
８１４．１ 注入口
８１４．２ 注入口
８２０ チャネル
８３０ ウェルアレイ
８４１ シーディング注入口
８４２ シーディングチャネル
８４２．１ チャネル
Ａ 第１の流体、流体、因子、因子チャネル、成長因子
Ｂ 第２の流体、流体、因子、因子チャネル、チャネル
Ａ＋Ｂ 流体、流体の組合せ
Ａ＋Ｂ＋Ｃ 流体
Ａ＋Ｃ 流体、流体の組合せ
Ｂ＋Ｃ 流体、流体の組合せ
Ｃ 流体、因子、因子チャネル、チャネル
Ｄ 流体、因子
Ａ＋Ｃ＋Ｄ 流体の組合せ
Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ 流体の組合せ
Ｂ＋Ｃ＋Ｄ 流体の組合せ
Ａ＋Ｄ 流体の組合せ
Ａ＋Ｂ＋Ｄ 流体の組合せ
Ｂ＋Ｄ 流体の組合せ
Ａ、Ｂ 注入口セット
Ｃ、Ｄ 注入口セット
Ｘ 成長因子

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E-3F】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図8A-8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】