特許 6297648 網膜変性処置のための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6297648

(24)【登録日】2018年3月2日

(45)【発行日】2018年3月20日

(54)【発明の名称】網膜変性処置のための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20180312BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20180312BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/28

   A61P27/02

【請求項の数】18

【外国語出願】

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2016-180260(P2016-180260)

(22)【出願日】2016年9月15日

(62)【分割の表示】特願2015-535647(P2015-535647)の分割

【原出願日】2013年3月13日

(65)【公開番号】特開2016-210813(P2016-210813A)

(43)【公開日】2016年12月15日

【審査請求日】2016年9月15日

(31)【優先権主張番号】61/711,665

(32)【優先日】2012年10月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503235673

【氏名又は名称】サンバイオ，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ケイシー シー． ケース

(72)【発明者】

【氏名】川西 徹

(72)【発明者】

【氏名】久納 紀之

【審査官】 伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５０５７９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１０６７８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０１２８０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 TATE, C. C. et al.，Cell Transplant，２０１１年，Vol.20, Suppl.1，p.588，ISSN 1555-3892

【文献】 TATE, C. C. et al.，Cell Transplant，２０１２年 ４月，Vol.21，Suppl.1，p.794，ISSN 1555-3892

【文献】 INOUE, Y. et al.，Exp Eye Re，２００７年，Vol.85，p.234-41，ISSN 0014-4835

【文献】 HUO, D. M. et al.，Int J Ophthalmol，２０１０年，Vol.3，p.216-9，ISSN 2222-3959

【文献】 PROCKOP, D. J.，FASEB J，２０１２年 ４月，Vol.26, No.1，Suppl.335.1，ISSN 1530-6860

【文献】 NUZZI, R. et al.，Stem Cell Int，２０１２年 ５月，Vol.2012, Article ID 946090，p.1-11

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験体における網膜の外顆粒層の細胞の喪失を防止するための組成物であって、外因性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインを発現するように操作された骨髄接着性幹細胞（ＭＡＳＣ）の系統である細胞を含む、組成物。

【請求項2】

外因性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインを発現するように操作された骨髄接着性幹細胞の系統である前記細胞が、前記被験体の眼に移植されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記移植が硝子体中である、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記移植が網膜下である、請求項２に記載の組成物。

【請求項5】

前記被験体が網膜色素変性を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。

【請求項6】

前記被験体が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。

【請求項7】

前記被験体がアッシャー症候群、シュタルガルト病、レーバー先天性黒内障、先天性脈絡膜欠如、バルデー・ビードル症候群またはレフサム病を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。

【請求項8】

前記被験体がベスト病、錐体杆体網膜ジストロフィー、脳回転状萎縮症、小口病、若年性網膜分離症、バッセン・コーンツヴァイク病（無ベータリポ蛋白血症）、青錐体１色型色覚異常、ドミナントドルーゼン、ゴールドマン・ファーブル硝子体網膜性ジストロフィー（Ｓ錐体増強症候群）、カーンズ・セイヤー症候群、ローレンス・ムーン症候群、乳頭周囲脈絡膜萎縮症、色素パターンジストロフィー、ソースビー黄斑ジストロフィー、スティックラー症候群またはヴァーグナー症候群（硝子体網膜性ジストロフィー）を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。

【請求項9】

前記色素パターンジストロフィーが、中心窩の蝶形網膜ジストロフィー、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、巨大網状ジストロフィー、クモ状ジストロフィーおよびシェーグレン網状色素上皮ジストロフィーからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

被験体における網膜から視覚皮質への視覚シグナルの伝達を増強するための組成物であって、外因性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインを発現するように操作された骨髄接着性幹細胞（ＭＡＳＣ）の系統である細胞を含む、組成物。

【請求項11】

前記外因性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインを発現するように操作された骨髄接着性幹細胞の系統である細胞が、前記被験体の眼に移植されることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記移植が硝子体中である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記移植が網膜下である、請求項１１に記載の組成物。

【請求項14】

前記被験体が網膜色素変性を有する、請求項１０〜１３のいずれかに記載の組成物。

【請求項15】

前記被験体が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を有する、請求項１０〜１３のいずれかに記載の組成物。

【請求項16】

前記被験体がアッシャー症候群、シュタルガルト病、レーバー先天性黒内障、先天性脈絡膜欠如、バルデー・ビードル症候群またはレフサム病を有する、請求項１０〜１３のいずれかに記載の組成物。

【請求項17】

前記被験体がベスト病、錐体杆体網膜ジストロフィー、脳回転状萎縮症、小口病、若年性網膜分離症、バッセン・コーンツヴァイク病（無ベータリポ蛋白血症）、青錐体１色型色覚異常、ドミナントドルーゼン、ゴールドマン・ファーブル硝子体網膜性ジストロフィー（Ｓ錐体増強症候群）、カーンズ・セイヤー症候群、ローレンス・ムーン症候群、乳頭周囲脈絡膜萎縮症、色素パターンジストロフィー、ソースビー黄斑ジストロフィー、スティックラー症候群またはヴァーグナー症候群（硝子体網膜性ジストロフィー）を有する、請求項１０〜１３のいずれかに記載の組成物。

【請求項18】

前記色素パターンジストロフィーが、中心窩の蝶形網膜ジストロフィー、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、巨大網状ジストロフィー、クモ状ジストロフィーおよびシェーグレン網状色素上皮ジストロフィーからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の引用）
本願は、２０１２年１０月９日に出願した米国仮出願第６１／７１１，６６５号の利益を主張する。米国仮出願第６１／７１１，６６５号の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

【0002】

（連邦政府支援に関する陳述）
適用なし

【0003】

（分野）
本出願は、例えば、網膜色素変性および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）で起こるような網膜変性の細胞治療の分野にある。

【背景技術】

【0004】

（背景）
網膜変性（例えば、脈絡膜血管新生から生じるもの（「ウェット型ＡＭＤ」）もしくは網膜と脈絡膜の間の細胞破片の付着から生じるもの（「ドライ型ＡＭＤ」））は、現在、世界における失明の大きな原因のうちの１つである。Ｃａｉ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ． １７：１９７６−９５。同様に、網膜色素変性で起こるような光受容細胞（桿体細胞および錐体細胞）の変性および死滅はまた、視力の悪化および／もしくは喪失をもたらし得る。よって、網膜変性を妨げるおよび／もしくは逆転させる処置、特に、光受容体機能を回復させる処置が必要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｃａｉ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ． １７：１９７６−９５

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

（要旨）
本明細書で開示されるのは、網膜変性を、外因性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインを発現するように操作された骨髄接着性幹細胞（ＭＡＳＣ）の系統である細胞を使用して処置するための方法および組成物である。このような細胞は、本開示の目的のためにＳＢ６２３細胞と称される。

【0007】

一局面において、本明細書で開示されるのは、網膜変性を処置する必要性のある被験体の眼にＳＢ６２３細胞を投与することによって、網膜変性を処置するための方法である。

【0008】

別の局面において、本明細書で開示されるのは、被験体の眼における光受容体活性を増大させる方法であり、上記方法は、光受容体活性が増大するように、ＳＢ６２３細胞を上記被験体の眼に投与する工程を包含する。

【0009】

別の局面において、本明細書で開示されるのは、被験体の眼における光受容体機能を増強する方法であり、上記方法は、光受容体機能が増強するように、上記被験体の眼にＳＢ６２３細胞を投与する工程を包含する。

【0010】

別の局面において、本明細書で開示されるのは、網膜から脳の視覚野への視覚シグナルの伝達を増強する方法であり、上記方法は、網膜から脳の視覚野への視覚シグナルの伝達が増強されるように、ＳＢ６２３細胞を上記被験体の眼に投与する工程を包含する。

【0011】

本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおいて、上記細胞は、任意の送達法（直接注射、局所投与などが挙げられる）によって投与され得る。特定の実施形態において、上記ＳＢ６２３細胞は、例えば、１種以上の薬学的キャリアと組み合わせて上記細胞を含む組成物（もしくは製剤）として投与される。さらに、上記方法は、同じ製剤もしくは異なる製剤の中でのＳＢ６２３細胞の反復投与を包含し得る。

【0012】

よって、本開示は、とりわけ、以下の実施形態を提供する：
実施形態１。網膜変性を処置する必要性のある被験体における網膜変性を処置するための方法であって、該方法は、ＳＢ６２３細胞を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
実施形態２。ＳＢ６２３細胞は、前記被験体の眼に移植される、実施形態１に記載の方法。
実施形態３。前記移植は、硝子体中である、実施形態２に記載の方法。
実施形態４。前記移植は、網膜下である、実施形態２に記載の方法。
実施形態５。前記網膜変性は、網膜色素変性で起こる、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
実施形態６。前記網膜変性は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）で起こる、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
網膜変性を処置する必要性のある被験体における網膜変性を処置するための方法であって、該方法は、ＳＢ６２３細胞を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
ＳＢ６２３細胞は、前記被験体の眼に移植される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記移植は、硝子体中である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記移植は、網膜下である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記網膜変性は、網膜色素変性で起こる、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記網膜変性は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）で起こる、項目１〜４のいずれかに記載の方法。

【0013】

これらおよび他の局面は、全体として本開示に鑑みれば、当業者に容易に明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、生後４週間（処置前、パネルの上のセット）、生後８週間（処置後４週間、パネルの上から２番目のセット）および生後１２週間（処置後８週間、パネルの上から３番目のセット）でのＲＣＳラットの眼の代表的網膜電位図（ＥＲＧ）記録を示す。ラットを、生後４週間で、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞（右パネル）もしくはＰＢＳ（左パネル）のいずれかの硝子体内注射によって処置した。パネルの一番下のセットは、生後４週間で、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞（右パネル）もしくはＰＢＳ（左パネル）のいずれかの硝子体内注射によって処置したラットに対して、生後１２週間（処置後８週間）でのアジド応答によってアッセイされた場合の光受容体活性を示す。

【0015】

【図2】図２、パネルＡおよびパネルＢは、生後４週間、生後５週間、生後６週間、生後８週間および生後１２週間（すなわち、処置前および処置後１週間、処置後２週間、処置後４週間および処置後８週間）でとられたＲＣＳラットの網膜電位図からのａ波（図２Ａ）およびｂ波（図２Ｂ）の相対的振幅を示すグラフセットを示す。バーの各セットに関して、最も左側のバーは、ナイーブ（すなわち、未処置）動物の値を表す。右方向に進んで、残りのバーは、ビヒクル、０．３７５×１０^５ ＳＢ６２３細胞、０．７５×１０^５ ＳＢ６２３細胞および１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の硝子体内注射によって処置した動物の値を表す。括弧中の数字は、分析した眼の数を示す。処置前の値を１００％として設定した。

【0016】

【図3】図３は、生後１２週間（処置後８週間）でのＲＣＳラットの眼におけるアジド応答の振幅（マイクロボルト単位）を示すグラフである。動物を、４週齢で、未処置（「ナイーブ」）か、またはＰＢＳ（「ビヒクル」）、０．３７５×１０^５ ＳＢ６２３細胞、０．７５×１０^５ ＳＢ６２３細胞、もしくは１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の硝子体内注射に供した。括弧中の数字は、分析した眼の数を示す。

【0017】

【図4】図４、パネルＡおよびパネルＢは、処置後９週間でのＲＣＳラット網膜のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片を示す。図４Ｂは、生後４週間で１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の硝子体内注射によって処置したラットの眼の切片を示す。図４Ａは、ＰＢＳを生後４週間で注射したコントロールラットの眼の切片を示す。十分に発生した外顆粒層（図面では「ＯＮＬ」と示される）はＳＢ６２３処置した眼に存在するが、ビヒクル処置した眼にはない。

【0018】

【図5】図５、パネルＡ〜Ｄは、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の硝子体内注射の９週間後（生後１３週間）の、ＲＣＳラットに由来する網膜の切片を示す。図５Ａおよび５Ｃは、Ｈ＆Ｅ染色した切片を示し；図５Ｂおよび５Ｄは、抗ヒトミトコンドリア抗体（緑）で染色し、核特異的色素ＤＡＰＩ（青）で対比染色した切片を示す。上側の２つのパネルは、硝子体中のＳＢ６２３細胞の塊を含む切片を示す。下側の２つのパネルは、ＳＢ６２３細胞が網膜の内境界膜上に認められ得る網膜切片を示す。

【0019】

【図6】図６は、生後４週間（処置前、パネルの上のセット）、生後８週間（処置後４週間、上から２番目のパネルのセット）および生後２８週間（処置後２４週間、上から３番目のパネルのセット）でのＲＣＳラットの眼の代表的網膜電位図（ＥＲＧ）記録を示す。ラットを、生後４週間で、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞（右パネル）もしくはＰＢＳ（左パネル）のいずれかの網膜下注射によって処置した。最も下のパネルのセットは、生後４週間で１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞（右パネル）もしくはＰＢＳ（左パネル）のいずれかの網膜下注射によって処置したラットに対して、生後２８週間（処置後２４週間）でのアジド応答によって測定した場合の光受容体活性を示す。

【0020】

【図7】図７、パネルＡおよびパネルＢは、処置前、ならびに処置後４週間、処置後８週間、処置後１２週間、処置後１６週間、処置後２０週間および処置後２４週間でとったＲＣＳラットの網膜電位図のａ波（図７Ａ）およびｂ波（図７Ｂ）の相対的振幅を示すグラフセットを示す。バーの各セットに関して、最も左のバーは、ナイーブ（すなわち、未処置）動物の値を表し；真ん中のバーは、ビヒクルの網膜下注射によって処置した動物の値を表し；最も右のバーは、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の網膜下注射によって処置した動物の値を表す。括弧中の数字は、分析した眼の数を示す。処置前振幅を１００％として設定した。

【0021】

【図8】図８は、処置後４週間、処置後８週間、処置後１２週間、処置後１６週間、処置後２０週間および処置後２４週間でのＲＣＳラットの眼におけるアジド応答の振幅（マイクロボルト単位）を示すグラフである。３つのバーの各セットに関して、最も左側のバーは、ナイーブ（すなわち、未処置）動物の値を表し；真ん中のバーは、ビヒクルの網膜下注射によって処置した動物の値を表し；最も右のバーは、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の網膜下注射によって処置した動物の値を表す。括弧中の数字は、分析した眼の数を示す。

【0022】

【図9】図９は、ナイーブのＲＣＳラット、ビヒクル処置したＲＣＳラット、およびＳＢ６２３細胞処置したＲＣＳラットから、網膜下移植後２６週間でとった視覚誘発電位（ＶＥＰ）の記録を示す。

【0023】

【図10】図１０、パネルＡおよびパネルＢは、処置後２７週間で、ＲＣＳラット網膜のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した切片を示す。図１０Ｂは、生後４週間で、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の網膜下注射によって処置したラットの眼の切片を示す。図１０Ａは、ＰＢＳを生後４週間で注射したコントロールラットの眼の切片を示す。十分に発生した外顆粒層（図では「ＯＮＬ」と示される）はＳＢ６２３処置した眼に存在するが、ビヒクル処置した眼にはない。

【0024】

【図11】図１１、パネルＡおよびパネルＢは、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の網膜下注射後２７週間（生後３１週間）のＲＣＳラットの網膜の切片を示す。図１１Ａは、Ｈ＆Ｅ染色した切片を示し；図１１Ｂは、抗ヒトミトコンドリア抗体（緑）で染色し、核特異的色素ＤＡＰＩ（青）で対比染色した切片を示す。移植したＳＢ６２３細胞は、図１１Ａで視認できる（矢尻）。

【発明を実施するための形態】

【0025】

（詳細な説明）
本明細書で開示されるのは、網膜変性および網膜変性状態の処置のための方法および組成物である。特に、ＳＢ６２３細胞（Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列で間葉系幹細胞をトランスフェクトすることによって得られた細胞）の、網膜変性を受けている（もしくは網膜変性状態を被っている）被験体の眼への移植は、網膜変性を防止し、網膜機能の長期間の救出を生じる。

【0026】

本開示の実施は、別段示されなければ、当該分野の技術範囲内であるような細胞生物学、毒物学、分子生物学、生化学、細胞培養、免疫学、腫瘍学、組換えＤＮＡの分野および関連分野の標準法および従来技術を使用する。このような技術は、文献中に記載されており、よって当業者に利用可能である。例えば、以下を参照のこと：Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，”第５版， Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ２００８； Ｖｏｅｔ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． “Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｌｉｆｅ ａｔ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｅｖｅｌ，”第３版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ， ２００８； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”第３版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，” Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．， “Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”第４版， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｓｏｍｅｒｓｅｔ， ＮＪ， ２０００；およびシリーズ“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ．

【0027】

（網膜変性）
最も一般に起こる網膜変性状態のうちの２つは、網膜色素変性（ＲＰ）および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。網膜色素変性は、網膜の光受容細胞（桿体および錐体としても公知）の変性から生じる。黄斑は、網膜の中心部に与えられた名称であり、視覚の周辺ではなく、視覚の中心を担う。ＡＭＤには２つの形態がある。より一般的な形態であるドライ型ＡＭＤは、網膜と脈絡膜（網膜の直ぐ下にある眼の層）との間の細胞破片（ドルーゼン）の付着によって引き起こされ、光受容細胞の萎縮をもたらす。他の形態のＡＭＤであるウェット型ＡＭＤは、脈絡膜における血管の異常な増殖から生じる。これら血管は漏れる可能性があり、脈絡膜および網膜に損傷が生じる。ＡＭＤに関する他の用語としては、脈絡膜新生血管、網膜下血管新生、滲出型および円板状変性が挙げられる。

【0028】

網膜変性状態の他のタイプとしては、以下が挙げられる：アッシャー症候群（聴覚喪失およびＲＰからの進行性の視覚喪失によって特徴付けられる遺伝的状態）、シュタルガルト病（遺伝性若年性黄斑変性）、レーバー先天性黒内障（出生時の視覚喪失によって特徴付けられる遺伝性疾患）、先天性脈絡膜欠如（脈絡膜および網膜の変性に起因して進行性の視覚喪失を引き起こす遺伝性の状態）、バルデー・ビードル症候群（網膜変性を含み、多指症および腎疾患をも含み得る障害の複合体）、およびレフサム病（とりわけ、ＲＰによって特徴付けられる、フィタン酸を代謝できないことによって引き起こされる障害）。例えば、以下を参照のこと： Ｇｏｏｄｗｉｎ （２００８） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １９（３）：２５５−６２； Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ２５（１）：４２−９； Ｃｏｕｓｓａ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｇｅｎｅｔ． ３３（２）：５７−６５。

【0029】

本明細書で記載される方法および組成物を使用して処置され得る他の希の網膜変性状態としては、以下が挙げられる：ベスト病、錐体杆体網膜ジストロフィー（ｃｏｎｅ−ｒｏｄ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、脳回転状萎縮症、小口病、若年性網膜分離症、バッセン・コーンツヴァイク病（無ベータリポ蛋白血症）、青錐体１色型色覚異常（ｂｌｕｅ ｃｏｎｅ ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｓｍ ｄｉｓｅａｓｅ）、ドミナントドルーゼン（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｒｕｓｅｎ）、ゴールドマン・ファーブル硝子体網膜性ジストロフィー（Ｓ錐体増強症候群）、カーンズ・セイヤー症候群、ローレンス・ムーン症候群、乳頭周囲脈絡膜萎縮症、色素パターンジストロフィー（ｐｉｇｍｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（中心窩の蝶形網膜ジストロフィー（Ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ−ｓｈａｐｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｖｅａ）、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、巨大網状ジストロフィー（ｍａｃｒｏ−ｒｅｔｉｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、クモ状ジストロフィー（ｓｐｉｄｅｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）およびシェーグレン網状色素上皮ジストロフィー（Ｓｊｏｇｒｅｎ ｒｅｔｉｃｕｌａｒ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）が挙げられる）、ソースビー黄斑ジストロフィー、スティックラー症候群およびヴァーグナー症候群（Ｗａｇｎｅｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（硝子体網膜性ジストロフィー））。

【0030】

（ＳＢ６２３細胞）
本開示は、ＳＢ６２３細胞を、網膜変性を処置する必要性のある被験体、すなわち、網膜変性が起こっている被験体の眼に移植することによって、網膜変性を処置するための方法を提供する。ＳＢ６２３細胞は、骨髄接着性間質細胞（ＭＡＳＣ）（間葉系幹細胞（ＭＳＣ）としても公知）においてＮｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインを発現させることによって、ＭＡＳＣから得られる。ＭＡＳＣは、骨髄から接着性細胞を選択することによって得られる。

【0031】

一実施形態において、ＭＡＳＣの培養物は、ＮＩＣＤをコードする配列を含むポリヌクレオチドと（例えば、トランスフェクションによって）接触させられ、続いて、薬物選択およびさらなる培養によってトランスフェクトされた細胞が富化される。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号（２０１０年３月２３日発行）；米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）；およびＷＯ ２００９／０２３２５１（２００９年２月１９日）を参照のこと；これらの開示は全て、間葉系幹細胞の単離および間葉系幹細胞をＳＢ６２３細胞（それら文書中で「神経前駆細胞」および「神経再生細胞」と称される）へと変換を記載する目的で、それらの全体において参考として援用される。実施例１（下記）もまた参照のこと。

【0032】

これら方法において、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする任意のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）が使用され得、トランスフェクトされた細胞の選択および富化のための任意の方法が、使用され得る。例えば、特定の実施形態において、ＭＡＳＣは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むとともに薬物耐性マーカー（例えば、Ｇ４１８への耐性）をコードする配列をも含むベクターでトランスフェクトされる。さらなる実施形態において、２種類のベクター（一方は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含み、他方は、薬物耐性マーカーをコードする配列を含む）が、ＭＡＳＣのトランスフェクションのために使用される。これら実施形態において、選択は、細胞培養物を上記ベクターでトランスフェクトした後に、選択因子（例えば、Ｇ４１８）を、上記ベクターを含まない細胞を死滅させるが上記ベクターを含む細胞を残しておくために十分な量で上記細胞培養物に添加することによって、達成される。選択がなければ、上記選択因子を除去することもしくはその濃度を上記ベクターを含まない細胞を死滅させないレベルへと低下させることが必要である。選択（例えば、７日間にわたる）後に、上記選択因子は除去され、上記細胞は、（例えば、２継代にわたって）さらに培養される。

【0033】

ＳＢ６２３細胞の調製は、従って、ＭＳＣにおける外因性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの一過性の発現を要する。この目的のために、ＭＳＣは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列（ここでこの配列は、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしない）を含むベクターでトランスフェクトされ得る。全てのこのような配列は周知であり、当業者にとって容易に利用可能である。例えば、Ｄｅｌ Ａｍｏ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １５：２５９−２６４は、マウスＮｏｔｃｈタンパク質の完全アミノ酸配列を示す；その一方で、Ｍｕｍｍ ａｎｄ Ｋｏｐａｎ （２０００） Ｄｅｖｅｌ． Ｂｉｏｌ． ２２８：１５１−１６５は、マウスＮｏｔｃｈタンパク質由来の細胞内ドメインを切り離すいわゆるＳ３切断部位を取り囲むアミノ酸配列を提供する。まとめると、これら参考文献は、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質ではないＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを含む各ペプチドおよびあらゆるペプチドを当業者に提供する；それによって、同様に、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むあらゆるポリヌクレオチドを当業者に提供する。前述の文書（Ｄｅｌ Ａｍｏ ａｎｄ Ｍｕｍｍ）は、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質のアミノ酸配列およびＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアミノ酸配列をそれぞれ開示する目的で、それらの全体において参考として援用される。

【0034】

同様の情報が、さらなる種（ラット、Ｘｅｎｏｐｕｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびヒトを含む）に由来するＮｏｔｃｈタンパク質および核酸について入手可能である。例えば、Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１３：１９９−２０５； Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３：３８２−３８６； ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎｏ． ＮＭ＿０１７１６７（およびそこで引用される参考文献）； ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ４６５３１（およびそこで引用される参考文献）； ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ０１７０５（およびそこで引用される参考文献）；およびＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ４０７３３（およびそこで引用される参考文献）を参照のこと。前述の参考文献は、多くの異なる種における全長Ｎｏｔｃｈタンパク質のアミノ酸配列およびＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアミノ酸配列を開示する目的で、それらの全体において参考として援用される。

【0035】

さらなる実施形態において、ＳＢ６２３細胞は、ＭＳＣが外因性Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメインを発現しないように、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含む核酸をＭＳＣへと導入することによって調製される。上記は、例えば、ＭＳＣをＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列（ここでその配列は、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしない）を含むベクターでトランスフェクトすることによって達成され得る。

【0036】

ＳＢ６２３細胞の調製および本明細書で開示される方法において使用され得るＳＢ６２３細胞のものに類似の特性を有する細胞を作製するための方法に関するさらなる詳細は、米国特許第７，６８２，８２５号；ならびに米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号および同第２０１１／０２２９４４２号に見いだされる；これらの開示は、ＳＢ６２３細胞の調製に関してさらなる詳細を提供する目的で、およびＳＢ６２３細胞のものに類似の特性を有する細胞を作製するための方法を提供するために、本明細書に参考として援用される。Ｄｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１３：１７０１−１７１０もまた参照のこと。

【0037】

（製剤、キットおよび投与経路）
本明細書で開示されるとおりのＳＢ６２３細胞を含む治療組成物もまた、提供される。このような組成物は、代表的には、ＳＢ６２３細胞および薬学的に受容可能なキャリアを含む。

【0038】

本明細書で開示される治療組成物は、とりわけ、網膜変性の進行を低減する、網膜変性を逆転させる、および／もしくは光受容体機能を回復させるために有用である。よって、ＳＢ６２３細胞を含む組成物の「治療上有効な量」とは、網膜変性を防止するかもしくは改善する、および／または光受容体機能を回復させる任意の量であり得る。例えば、投与量は、例えば、１日あたり１回、１週間あたり２回、１週間あたり１回、１ヶ月あたり２回、１ヶ月あたり１回の投与頻度で、例えば、体重、投与経路、疾患の重篤度などに依存して、約１００個；５００個；１，０００個；２，５００個；５，０００個；１０，０００個；２０，０００個；５０；０００個；１００，０００個；５００，０００個；１，０００，０００個；５，０００，０００個から１０，０００，０００個の細胞もしくはより多く（またはこれらの間の任意の整数値）まで変動し得る。

【0039】

種々の薬学的組成物、ならびにこれらの調製および使用のための技術は、本開示に鑑みれば、当業者に公知である。適切な薬理学的組成物ならびにその投与のための技術の詳細な列挙に関しては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１７版 １９８５； Ｂｒｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， 「Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， ２００５； Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （編）， 「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００５； ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （編）， 「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００８のようなテキストが参照され得る。

【0040】

本明細書で記載される細胞は、移植用の生理学的に適合性のキャリア中で懸濁され得る。本明細書で使用される場合、用語「生理学的に適合性のキャリア」とは、上記製剤の他の成分と適合性でありかつそのレシピエントに対して有害でないキャリアをいう。当業者は、生理学的に適合性のキャリアに精通している。適切なキャリアの例としては、細胞培養培地（例えば、イーグル最小必須培地）、リン酸緩衝化食塩水、ハンクス平衡塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）±グルコース（ＨＢＳＳ）、および複数の電解質溶液（例えば、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ^ＴＭ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ））が挙げられる。

【0041】

被験体に投与されるＳＢ６２３細胞懸濁物の体積は、移植部位、処置目的およびとけた細胞数に依存して変動する。代表的には、投与される細胞の量は、治療上有効な量である。本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」もしくは「有効量」とは、特定の障害の処置をもたらす、すなわち、その障害と関連する症状の量および／もしくは重篤度の低減を生じるために必要とされる移植される細胞の数をいう。例えば、ＡＭＤの処置の場合には、ＳＢ６２３細胞の治療上有効な量の移植は、代表的には、網膜変性の防止もしくは逆転および／または光受容体機能の回復を生じる。治療上有効な量は、網膜変性のタイプおよび程度に伴って変動し、そしてまた、被験体の状態全体に依存して変動し得る。

【0042】

開示される治療組成物はまた、薬学的に受容可能な物質、組成物もしくはビヒクル（例えば、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒もしくは被包物質（すなわち、キャリア））を含み得る。これらキャリアは、例えば、ＳＢ６２３細胞を安定化を安定化し得、そして／または身体でのＳＢ６２３細胞の生存を促進し得る。各キャリアは、上記製剤の他の成分と適合性であって上記被験体に対して有害でないという意味で「受容可能」であるべきである。薬学的に受容可能なキャリアとして働き得る物質のいくつかの例としては、以下が挙げられる：糖（例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース）；デンプン（例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤（例えば、カカオ脂および坐剤用ワックス）；油（例えば、ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油）；グリコール（例えば、プロピレングリコール）；ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）；エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル）；アガー；緩衝化剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝化食塩水；および薬学的製剤で使用される他の非毒性の適合性物質。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭剤（flavoring and perfuming agent）、保存剤、および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。

【0043】

例示的な製剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない： 非経口投与（例えば、肺内投与、静脈内投与、動脈内投与、眼内投与、頭蓋内投与、髄膜下（ｓｕｂｍｅｎｉｎｇｉａｌ）投与、もしくは皮下投与）に適したもの（ミセル、リポソームもしくは薬物放出カプセル（活性薬剤が徐放用に設計された生体適合性のコーティング内に組みこまれている）に被包された製剤；経口摂取用製剤（ｉｎｇｅｓｔｉｂｌｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）；局所使用のための製剤（例えば、点眼剤、クリーム剤、軟膏剤およびゲル）；ならびに他の製剤（例えば、吸入薬、エアロゾルおよびスプレー）が挙げられる）。本開示の組成物の投与量は、処置の必要性の程度および重症度、投与される組成物の活性、被験体の全体的な健康状態、ならびに当業者に周知の他の考慮事項に従って変動する。

【0044】

さらなる実施形態において、本明細書で記載される組成物は、局所送達される。局所送達は、上記組成物を非全身的に送達し、それによって、全身送達と比較して上記組成物の身体負荷を低減することを可能にする。このような局所送達は、種々の医学的に移植されたデバイス（ステントおよびカテーテルが挙げられるが、これらに限定されない）の使用を通じて達成され得るか、または吸入、瀉血、注射もしくは手術によって達成され得る。所望の薬剤を医療用デバイス（例えば、ステントおよびカテーテル）にコーティングする、移植する（ｉｍｐｌａｎｔ）、埋め込む（ｅｍｂｅｄ）、および別の方法で取り付けるための方法は、当該分野で確立されており、本明細書で企図される。局所送達はまた、例えば、眼内注射によって、もしくは点眼剤の適用によって達成され得る。

【0045】

本開示の別の局面は、被験体へのＳＢ６２３細胞の投与を実施するためのキットに関する。一実施形態において、キットは、適切なように（例えば、薬学的なキャリア中に）、１種以上の別個の薬学的調製物中で製剤化されたＳＢ６２３細胞の組成物を含む。

【0046】

（投与）
網膜変性（例えば、ＡＭＤ）をＳＢ６２３細胞で処置するために、眼への物質の送達に関して当該分野で公知の任意の方法が利用され得る。本開示の目的のために、「移植」とは、任意の方法による、被験体の眼へのＳＢ６２３細胞の移入をいう。例えば、眼への直接注射は、ＳＢ６２３細胞の懸濁物の送達のために使用され得る。特定の実施形態において、ＳＢ６２３細胞の懸濁物は、硝子体液の中に注射される。他の実施形態において、網膜下注射が使用される。さらなる実施形態において、局所投与が使用される；例えば、治療組成物は、点眼剤として使用される予定の溶液の中に製剤化され得る。さらに他の実施形態において、懸濁物、ゲルなどの局所適用は、ＳＢ６２３細胞の投与のために利用され得る。

【実施例】

【0047】

光受容細胞の適切な機能は、光受容体外節（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｕｔｅｒ
ｓｅｇｍｅｎｔｓ）の継続的な合成および脱落（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を含む。網膜色素上皮の細胞（ＲＰＥ細胞）は、脱落した外節を貪食することによって、ならびにレチノイドおよび膜脂質を再循環させることによって、このプロセスを補助する。

【0048】

Ｒｏｙａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｏｎｓラット（「ＲＣＳラット」）は、網膜変性が、光受容体外節を貪食できない欠陥ＲＰＥ細胞から生じる遺伝性網膜変性の動物モデルである。Ｄ’Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９（４）：６４５−６５１。組織学的には、ＲＣＳラットの網膜は、光受容細胞外節層と網膜色素上皮との間の外節破片の異常な蓄積によって特徴付けられる。蓄積は、光受容細胞の死の前に、およびその死と同時に起こる。ＲＣＳラットは、生後、進行性に光受容細胞が喪失することおよび付随して視覚喪失を経験する。

【0049】

網膜電図記録法は、電極を角膜上に配置し、眼を閃光によって刺激し、光受容細胞の電気活動を電極によって測定するプロセスである。Ｏｄｏｍ ＪＶ， Ｌｅｙｓ Ｍ， Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ＧＷ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｉｓｕａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． Ｉｎ： Ｔａｓｍａｎ Ｗ， Ｊａｅｇｅｒ ＥＡ，編 Ｄｕａｎｅ’ｓ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ． 第１５版 Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ： Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；２００９：ｃｈａｐ ５； Ｂａｌｏｈ ＲＷ， Ｊｅｎ Ｊ． Ｎｅｕｒｏ−ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ． Ｉｎ： Ｇｏｌｄｍａｎ Ｌ， Ｓｃｈａｆｅｒ ＡＩ，編 Ｃｅｃｉｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． 第２４版 Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ： Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ； ２０１１：ｃｈａｐ ４３２； Ｃｌｅａｒｙ ＴＳ， Ｒｅｉｃｈｅｌ Ｅ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． Ｉｎ： Ｙａｎｏｆｆ Ｍ， Ｄｕｋｅｒ ＪＳ，編 Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ． 第３版 Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ： Ｍｏｓｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ； ２００８：ｃｈａｐ ６．９。

【0050】

網膜造影法（ｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｙ）によって測定され得る光受容体機能の別の尺度は、アジ化ナトリウムの全身導入後の０．０５Ｈｚ〜５０Ｈｚの電気活動のピーク（アジド応答として公知）である。

【0051】

（実施例１：ＳＢ６２３細胞懸濁物の調製）
ＳＢ６２３細胞を、ヒトＮｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインをコードするＤＮＡで、ヒト骨髄接着性幹細胞（ＭＡＳＣ）をトランスフェクトすることによって得た。ＭＡＳＣを、以下のようにヒト骨髄から得た。ヒト成人骨髄吸引物を、Ｌｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から購入した。細胞を１回洗浄し、増殖培地：１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を補充したα−ＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ， Ｈｅｒｎｄｏｎ， ＶＡ）中で、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｔ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｉｎｃ． Ｌｏｗｅｌｌ， ＭＡ．）にプレートした。３日後、付着しなかった細胞を除去した；そのＭＡＳＣ培養物を、増殖培地中で約２週間維持した。その期間の間に、０．２５％ トリプシン／ＥＤＴＡを使用して細胞を２回継代した。

【0052】

ＳＢ６２３細胞を作製するために、上記ＭＡＳＣを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を製造業者の説明書に従って使用して、ｐＮ−２プラスミド（これは、ヒトＮｏｔｃｈ１細胞内ドメイン（ＣＭＶプロモーターの転写制御下にある）およびネオマイシン耐性遺伝子（ＳＶ４０プロモーターの転写制御下にある）をコードする配列を含む）でトランスフェクトした。簡潔には、細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ６／プラスミドＤＮＡ複合体とともに２４時間インキュベートした。翌日、培地を、１００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を含む増殖培地（上記の成分）と置換し、７日間にわたって選択を継続した。Ｇ４１８選択培地を除去した後、培養物を増殖培地中で維持し、２継代にわたって増殖させた。ＳＢ６２３細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して採取し、凍結培地中で細胞密度７．５×１０^３細胞／ｍｌ、１．５×１０^４細胞／ｍｌおよび３×１０^４細胞／ｍｌに調合して、凍結保存した。凍結したＳＢ６２３細胞を、必要になるまで液体Ｎ_２ユニットの気相の中で貯蔵した。

【0053】

（実施例２：硝子体内移植）
ＲＣＳラットを、生後２日目に開始して移植まで継続する経口シクロスポリンＡ（飲料水中２００ｍｇ／ｌ）の投与によって免疫抑制した。注射によるＳＢ６２３細胞の移植を、生後４週間で行った。移植の前に、動物を、キシラジン塩酸塩（Ｃｅｌａｃｔａｌ^{（登録商標）}， Ｂａｙｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｌｔｄ．）およびケタミン塩酸塩（Ｋｅｔａｌａｒ^{（登録商標）}， Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）の混合物で全身麻酔し、０．４％ オキシブプロカイン塩酸塩（Ｂｅｎｏｘｙｌ^{（登録商標）}， Ｓａｎｔｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）で局所麻酔した。５μｌのＳＢ６２３細胞懸濁物を硝子体腔へと注射する前に、トロピカミドおよびフェニレフリン塩酸塩（Ｍｙｄｒｉｎ−Ｐ^{（登録商標）}， Ｓａｎｔｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）で瞳孔を開かせた。３０ゲージ針を付けたＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して注射を行った。コントロールコホートには、ビヒクル（ＰＢＳ）を注射したか、または未処置のまま（ナイーブ）であった。実験デザインを表１に示す。

【表1】

【0054】

４週齢でＳＢ６２３細胞を移植した後、動物を、網膜電図記録法によって５週齢、６週齢、８週齢および１２週齢で（すなわち、移植の１週間後、２週間後、４週間後および８週間後）試験し、アジド応答に関しては１２週齢（移植後８週間）で試験した。１３週齢（処置後９週間）で、動物を屠殺し、彼らの眼を組織学検査のために摘出した。

【0055】

網膜電図記録法のために、ラットを１時間暗順応させ、次いで、キシラジン塩酸塩（Ｃｅｌａｃｔａｌ^{（登録商標）}， Ｂａｙｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｌｔｄ．）およびケタミン塩酸塩（Ｋｅｔａｌａｒ^{（登録商標）}， Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）の混合物で全身麻酔した。トロピカミドおよびフェニレフリン塩酸塩（Ｍｙｄｒｉｎ−Ｐ^{（登録商標）}， Ｓａｎｔｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）で瞳孔を開かせた。網膜電位図（ＥＲＧ）を、角膜に配置した接触電極および鼻に配置した接地電極で記録した。応答を白色ＬＥＤ閃光（３，１６２ｃｄ／ｍ^２， １０ｍｓ継続時間）で誘発し、Ｎｅｕｒｏｐａｃｋ Ｓ１ ＮＥＢ９４０４（Ｎｉｈｏｎ Ｋｏｈｄｅｎ Ｃｏｒｐ．）で記録した。

【0056】

図１（パネルの上側３つの対）は、移植直前（生後４週間）、移植後４週間および移植後８週間で得た、ビヒクル処置動物（左パネル）および片眼あたり１．５×１０^５ＳＢ６２３細胞で処置した動物（右パネル）の代表的ＥＲＧ記録を示す。ビヒクル処置動物では、処置後４週間および処置後８週間において、ａ波もｂ波も認められなかった；一方で、ＳＢ６２３処置動物では、これらの時点で電気活動が保持されていた。ＥＲＧによって測定される、受容体細胞電気活動の定量的評価を、図２に示す。試験した全ての時点において、ＳＢ６２３処置動物は、ナイーブ動物もしくはビヒクル処置動物のいずれよりも大きな光受容細胞電気活動を保持していた。

【0057】

移植後８週間でのアジド応答の決定に関しては、ＲＣＳラットを１時間暗順応させ、次いで、キシラジン塩酸塩（Ｃｅｌａｃｔａｌ^{（登録商標）}， Ｂａｙｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｌｔｄ．）およびケタミン塩酸塩（Ｋｅｔａｌａｒ^{（登録商標）}， Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）の混合物で全身麻酔し、０．４％ オキシブプロカイン塩酸塩（Ｂｅｎｏｘｙｌ^{（登録商標）}， Ｓａｎｔｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）で局所麻酔した。接触電極を角膜に配置し、０．１ｍｌの０．１％ アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）を尾静脈に注射した。Ｎｅｕｒｏｐａｃｋ Ｓ１ ＮＥＢ９４０４（Ｎｉｈｏｎ Ｋｏｈｄｅｎ Ｃｏｒｐ．）で応答を記録し、０．０５Ｈｚ〜５０Ｈｚの間の領域で増幅した。ベースラインから正のピークまでの振幅を測定したところ、ピークは、アジド溶液の注射後に約４秒間出現した。

【0058】

図１中の下側のパネルの対は、処置後８週間で、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の硝子体内注射によって処置されたＲＣＳラットの眼において（右下パネル）アジド応答が保持されていたが、ＰＢＳを注射したラットでは失われた（左下パネル）ことを示す。図３は、ＳＢ６２３処置した眼およびコントロールの眼における応答の振幅の測定値を示す。示されるように、１．５×１０^５ ＳＢ６２３細胞の注射は、処置後８週間でのアジド応答の振幅において統計的に有意な増大を生じた。

【0059】

組織学的分析に関しては、ラットを屠殺し、彼らの眼を摘出した。４％ パラホルムアルデヒド中で固定した後、眼を、製造業者の説明書に従ってＴｅｃｈｎｏｖｉｔ^{（登録商標）} ８１００樹脂（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｋｕｌｚｅｒ， Ｗｅｒｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中に包埋した。簡潔には、４℃において、６．８％ スクロースを含むＰＢＳ中で眼を一晩洗浄し、１００％ アセトン中で脱水し、Ｃｒｙｏｍｏｌｄ^{（登録商標）}（ＥＭＳ， Ｈａｔｆｉｅｌｄ， ＰＡ）中に包埋した。重合したブロックを、接着剤で木製のブロック上に固定し、使い捨てナイフ付きの滑走式ミクロトーム（ＨＭ４４０Ｅ， ＭＩＣＲＯＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ， Ｗａｌｌｄｏｒｆ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して切り出した。３μｍの切片を、ヒト抗ミトコンドリア抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ１２７３）での免疫染色に使用した。

【0060】

組織学的分析から、ビヒクル処置マウスでは、網膜の外顆粒層の細胞の大部分は、処置後９週間までになくなったことが明らかになった（図４Ａ）。対照的に、ＳＢ６２３処置マウスでは、外顆粒層の細胞は十分に保存されていた（図４Ｂ）。移植したＳＢ６２３細胞の塊が、硝子体の中で認められ（図５Ａおよび図５Ｂ）、ＳＢ６２３細胞は、網膜の内境界膜にも認められた（図５Ｃおよび図５Ｄ）。さらなる実験において、ＳＢ６２３細胞の硝子体内移植は処置後最大２５週間までの間にわたって外顆粒層細胞の喪失を防止すること、およびＳＢ６２３細胞はこの時点で硝子体の中に残っていることが認められた。

【0061】

上記で示される電気生理学的分析および形態分析の両方の結果から、ＳＢ６２３細胞の硝子体内移植は、網膜機能を保存することが示される。

【0062】

（実施例３：網膜下移植）
ＳＢ６２３細胞を、実施例１に記載されるとおりに調製し、密度３×１０^４ 細胞／μｌへとＰＢＳ中に懸濁した。ＲＣＳラットの免疫抑制、全身麻酔および局所麻酔、ならびに瞳孔拡大を、全て実施例２に記載されるとおりに行った。ＳＢ６２３細胞の移植を、３０ゲージ針を付けたＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して、網膜下腔へと硝子体内に５μｌのＳＢ６２３細胞懸濁物を注射することによって生後４週間で行った。コントロールコホートにはビヒクル（ＰＢＳ）を注射したか、または注射しないまま（ナイーブ）であった。実験デザインを表２に示す。この実験では、処置後より長期間にわたって分析を継続した：網膜電図記録法およびアジド応答測定を、２４週間にわたって継続し、処置後２７週間で得た標本に対して組織学および免疫組織化学法を行った。

【表2】

【0063】

網膜電図記録法およびアジド応答の決定を、実施例２に記載されるとおりに行った。代表的結果を図６に示す。大部分のビヒクル処置ラットでは、ＥＲＧは、処置後４週間で記録できなかった（図６，左パネル）。しかし、ＳＢ６２３処置動物では、ＥＲＧおよびアジド応答の両方が、処置後２４週間でも保持されていた（図６，右パネル）。

【0064】

図７は、移植後最大２４週間まで、４週間間隔でＥＲＧ振幅の変化の時間経過を示す。処置後８週間までに、ナイーブラットおよびビヒクル処置ラットからは、ａ波もｂ波も眼で検出できなかった；しかし、ＳＢ６２３細胞の網膜下注射を受けたラットでは、ａ波およびｂ波の両方が、処置後最大で２４週間まで保持されていた。

【0065】

図８は、移植後最大２４週間まで、４週間間隔でアジド応答の変化の時間経過を示す。ナイーブ動物およびビヒクル注射動物では、全ての時点で応答が低減される。ＳＢ６２３細胞の網膜下注射を受けたラットでは、処置後最大で２４週間までに全ての時点でナイーブラットおよびビヒクル注射ラットと比較して統計的に有意なアジド応答の増大が認められた。

【0066】

これら電気生理学的試験の結果から、ＳＢ６２３細胞の移植は、長期間にわたって網膜機能を保存することが示される。

【0067】

視覚シグナルが網膜から脳の視覚皮質へと伝達されたか否かを決定するために、処置ＲＣＳラットおよび未処置ＲＣＳラットにおいて処置後２６週間で視覚誘発電位（ＶＥＰ）を測定した。ＶＥＰ記録の７日前に、スクリュー電極を、ブレグマから６．８ｍｍ後方および正中線から３．２ｍｍ外側で、頭部の各側の硬膜外に配置し、基準電極を、ブレグマから１１．８ｍｍ後方の正中線上で、硬膜外に配置した。ＶＥＰ記録のその日に、ラットを１時間暗順応させ、次いで、キシラジン塩酸塩（Ｃｅｌａｃｔａｌ^{（登録商標）}， Ｂａｙｅｒ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｌｔｄ．）およびケタミン塩酸塩（Ｋｅｔａｌａｒ^{（登録商標）}， Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）の混合物で全身麻酔した。トロピカミドおよびフェニレフリン塩酸塩（Ｍｙｄｒｉｎ−Ｐ^{（登録商標）}， Ｓａｎｔｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）で瞳孔を開かせた。ＶＥＰ応答を、白色ＬＥＤ閃光（３，１６２ｃｄ／ｍ^２， １０ｍｓ持続時間）で誘発し、Ｎｅｕｒｏｐａｃｋ Ｓ１ ＮＥＢ９４０４（Ｎｉｈｏｎ Ｋｏｈｄｅｎ Ｃｏｒｐ．）で記録した。１００の応答を測定し、結果を平均化した。代表的結果を図９に示す。ナイーブ動物およびビヒクル注射動物では、ＶＥＰを検出できなかった。対照的に、ＳＢ６２３細胞を網膜下注射したラットでは、処置後２６週間でＶＥＰ応答はよく保存されていた。これら結果は、ＳＢ６２３細胞での処置が視覚シグナルを視覚皮質に送る能力を回復させることを示す。

【0068】

組織学および免疫化学法を、処置後２７週間で得られた標本に対して実施例２に記載されるとおりに行った。図１０に示されるように、移植後２７週間までに、外顆粒層（ＯＮＬ）の細胞は、あるとしてもごく僅かしかビヒクル処置ラットには存在しなかった。しかし、ＳＢ６２３処置ラットでは、ＯＮＬの細胞が２７週間でよく保存されていた。さらに、移植したＳＢ６２３細胞は、抗ヒトミトコンドリア抗体での免疫染色によって検出され、網膜下空間において認められた（図１１）。

【0069】

これらの結果は、網膜下注射後にＳＢ６２３細胞が長期間持続することを実証し、移植したＳＢ６２３細胞が光受容細胞の死を防止できたことを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】