特許 6298052 低分子量および超低分子量ヘパリンの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6298052

(24)【登録日】2018年3月2日

(45)【発行日】2018年3月20日

(54)【発明の名称】低分子量および超低分子量ヘパリンの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/10 20060101AFI20180312BHJP

   A61K 31/727 20060101ALN20180312BHJP

   A61P 7/02 20060101ALN20180312BHJP

【ＦＩ】

   C08B37/10

   !A61K31/727

   !A61P7/02

【請求項の数】10

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2015-524817(P2015-524817)

(86)(22)【出願日】2013年8月2日

(65)【公表番号】特表2015-523451(P2015-523451A)

(43)【公表日】2015年8月13日

(86)【国際出願番号】ES2013070575

(87)【国際公開番号】WO2014020227

(87)【国際公開日】20140206

【審査請求日】2016年2月23日

(31)【優先権主張番号】P201231257

(32)【優先日】2012年8月2日

(33)【優先権主張国】ES

(73)【特許権者】

【識別番号】515030152

【氏名又は名称】ラボラトリオス ファルマセウティコス ロビ エス． エー．

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(74)【代理人】

【識別番号】100163038

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 武志

(72)【発明者】

【氏名】ギレルモ・フランコ・ロドリゲス

(72)【発明者】

【氏名】イボン・グティエロ・アドゥリス

【審査官】 土橋 敬介

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５１７１８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２９６２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５０９３３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−１８７８０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５０４４５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１６１２３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 VISKOV C ET AL，Description of the chemical and pharmacological characteristics of a new hemisynthetic ultra-low-molecular-weight heparin, AVE5026，JOURNAL OF THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS，２００９年，vol. 7, no. 7，p.1143-1151

【文献】 Y. XU ET AL，Chemoenzymatic Synthesis of Homogeneous Ultralow Molecular Weight Heparins，SCIENCE，２０１１年，vol. 334, no. 6055，p.498-501

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｂ ３７／１０

Ａ６１Ｋ ３１／７２７

Ａ６１Ｐ ７／０２

Ｃ０８Ｂ ３７／１０

Ａ６１Ｋ ３１／７２７

Ａ６１Ｐ ７／０２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＶＬＭＷＨおよび／またはＬＭＷＨ組成物を得るための方法であって、
ａ）アルカリ金属ヘパリンまたはアルカリ土類金属ヘパリンのヘパリン酸ベンザルコニウムへの塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と、
ｂ）ホスファゼン塩基またはグアニジンから派生する塩基の添加を伴う、有機溶媒中での解重合と、
ｃ）アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を形成する塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とを備え、
前記有機溶媒が、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミドおよび／またはホルムアミドから選択されることを特徴とする方法。

【請求項2】

工程ｂ）と工程ｃ）との間において、工程ｂ）で得られた生成物を過酸化水素で処理する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程ｃ）の後に得られた生成物を精製する請求項１から２のいずれかに記載の方法。

【請求項4】

工程ｃ）後に得られた生成物を７．５％〜１２．５％（ｗ／ｖ）の濃度で水に溶解することによって精製し、６．５と７．２５の間の値にｐＨ調整し、５％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度の塩化ナトリウムを添加し、メタノールを使用して沈殿させる請求項３に記載の方法。

【請求項5】

解重合工程が、ジクロロメタン中で、２０〜４０℃の温度で行われる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

工程ｂ）において、ヘパリン酸ベンザルコニウムおよび各添加の塩基との質量容積比は、１：０．５〜１：０．０５である請求項１に記載の方法。

【請求項7】

工程ｂ）において、ヘパリン酸ベンザルコニウムおよび各添加の塩基との質量容積比は、１：０．３〜１：０．１である請求項１に記載の方法。

【請求項8】

工程ｂ）と工程ｃ）との間の前記処理において、ヘパリン酸ベンザルコニウムおよび過酸化水素との質量容積比は、１：１〜１：０．０１である請求項２に記載の方法。

【請求項9】

工程ｂ）と工程ｃ）との間の前記処理において、ヘパリン酸ベンザルコニウムおよび過酸化水素との質量容積比は、１：０．２〜１：０．０５である請求項２に記載の方法。

【請求項10】

平均分子量が２９０３ Ｄａであり、抗第Ｘａ因子活性（抗ＦＸａ活性）が１９３ ＩＵ／ｍｇであり、抗第ＩＩａ因子活性（抗ＦＩＩａ活性）が９．３ ＩＵ／ｍｇであるＬＭＷＨ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）および超低分子量ヘパリン（ＶＬＭＷＨ）の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヘパリンはグリコサミノグリカンとよばれる多糖類に属し、ウロン酸（Ｌ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸）とＤ−グルコサミンから成り、交互に結合している。Ｌ−イズロン酸は、２−Ｏ硫酸化（２−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅｄ）することができ、Ｄ−グルコサミンは、Ｎ硫酸化および／または６−Ｏ硫酸化（６−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅｄ）することができ、より軽度にＮ−アセチル化または３−Ｏ硫酸化（３−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｅｄ）する（非特許文献１）。
ヘパリンは、好ましくは、ナトリウム塩として使用されるが、他のアルカリ金属塩又はアルカリ塩として使用され、主に抗凝固剤および抗血栓剤として使用される（非特許文献２）。

【0003】

ヘパリンは、その分子量に応じて、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、超低分子量ヘパリン（ＶＬＭＷＨ）に分類することができる。ＬＭＷＨとＶＬＭＷＨはＵＦＨの元の分子の解重合からなる。

【0004】

ＬＭＷＨの抗血栓作用は、その他のヘパリンと同様に、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の存在を必要とする。ヘパリンは、三元複合ＬＭＷＨ−ＡＴＩＩＩ−Ｘａ因子を形成し特定の五糖配列により、アンチトロンビンに結合する。この阻害は、抗血栓作用として知られている。これとは対照的に、抗凝固作用において、トロンビンの中和には三元複合体、ＬＭＷＨ−ＡＴＩＩＩ−第ＩＩａ因子の形成を必要とし、そのためには、少なくとも１８の糖類が必要とされる。

【0005】

ヘパリンナトリウムに関するＬＭＷＨの改良は、ＬＭＷＨはヘパリンナトリウムに比べ広範囲なＡＴＩＩＩ活性化部位での濃縮に起因している。

【0006】

さらに、未分画ヘパリンおよび既知の解重合方法（酵素、亜硝酸、β脱離など）によって得られる各種ＬＭＷＨまたはＶＬＭＷＨにおいて、五糖類の特異的かつ排他的な二糖単位の含有量の定量化により、一般構造内の五糖類の量の決定を可能にする手段があり、Ｎ−スルホ−３−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコサミン（ＡＮＳ、３Ｓ）に結合されるＤ−グルクロン酸（Ｇ）に対応する。この手段により、この二糖の割合とヘパリン構造内の五糖類、したがって、対象ヘパリンの抗ＦＸａ活性の含量との間の良好な相関を築くことができる（非特許文献３）。

【0007】

従来技術ではＬＭＷＨの調製のための種々の方法が記載されている。特許文献１には、以下の段階を含むＬＭＷＨを得る工程が記載されている。ベンゼトニウムヘパリネートの作用によるヘパリン塩の塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、塩化ベンジルの作用によるベンゼトニウムヘパリネートのエステル化、ヘパリンベンジルエステルのナトリウム塩の精製および製造、ベンゼトニウム塩の作用によるヘパリンベンジルエステルの塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、有機媒体中の強塩基による解重合、エステルのケン化および必要に応じて、その生成物の精製が行われる。本発明では、ヘパリンのベンジルエステル中間体の事前形成が必要であり、それと同時に、塩基として機能する、対応する第四級アンモニウムのヘパリンを生成しなければならない。本発明の方法は単純で、ベンジルエステル中間体を調製する必要性を排除することにより、合理的に工程のコストおよび時間を節約することができる。

【0008】

特許文献２には、以下の平均分子量の特性を有する低分子量ヘパリンを得るための方法が記載されている。２０００−４０００（Ｄａ）、抗ＦＸａ活性１００〜１５０（ＩＵ／ｍｇ）、抗第ＩＩａ因子活性１０（ＩＵ／ｍｇ）以下のＬＭＷＨは、以下の工程を含む、非水性媒体中で、ヘパリン酸ベンザルコニウム処理によって得られる。ヘパリン酸ベンザルコニウムの作用によるヘパリンナトリウムの塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、有機媒体塩基の第一解重合、ナトリウム塩の作用によるベンザルコニウム塩の塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、第一解重合後に得られるベンザルコニウム中間体の塩形成、有機媒体塩基の第二解重合、ナトリウム塩の作用によるベンザルコニウム塩の塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、最終精製を行う。

【0009】

最後に、特許文献３には前述の特許文献２と同様の方法が記載されているが、異なる点は形成される塩がベンゼトニウムヘパリンであることである。この方法で使用される塩基は、トリトンＢ、水酸化第四級アンモニウムであり、文献にはいずれの水酸化第四級アンモニウムも使用可能とあるが、この方法において塩基にどのように影響を及ぼすことができるかが教示されておらず、いずれの塩基が使用できるため、決定的要因ではないことが説明されている。

【0010】

従って、従来技術で知られているＬＭＷＨとＶＬＭＷＨの調製の効率的な代替方法の開発は、業界にとって非常に有益となる可能性がある。ＡＴＩＩＩ特定五糖配列を最大限に尊重する方法を提供でき、塩化ベンジルの作用によるベンゼトニウムヘパリネートのエステル化、ベンゼトニウム塩の作用によるヘパリンベンジルエステルの塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、前記エステルの後続のケン化などの段階を省ける可能性がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】欧州特許第０１９５５４３６号公報

【特許文献2】欧州特許第１０７０５０３号公報

【特許文献3】スペイン特許第２００３１９７号公報

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９８８）Ｖｏｌ．２５４，ｐｐ．７８１−７８７

【非特許文献2】Ｂａｓｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００６）ｐｐ．１６７３−１６８８

【非特許文献3】Ｓｅｍｉｎｅａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ（２００７）Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．４７８−４８７

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは、ＬＭＷＨとＶＬＭＷＨを製造するための高収率かつ位置選択性の高い、より精選された新方法を発見した。さらに、本発明の工程は、他の既知の方法よりも単純である。

【0014】

本発明者らは、β−排除のメカニズムによるＬＭＷＨとＶＬＭＷＨの半合成工程において、ヘパリン酸ベンザルコニウムの解重合のための基質として特別に利用することは、強塩基の作用および、立体障害としてＡＴＩＩＩの活性化五糖を保持するための能力を生み出すことであり、この五糖はその構造中に三硫酸化単糖が存在するため、したがって、硫酸化の程度が低い単糖に存在する分子破損の可能性よりも立体障害があることを実証した。

【0015】

本方法は、塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の第一段階によって特徴付けられる。つまり、別の塩への塩変換の反応であり、ホスファゼン塩基を用いた解重合またはグアニジン誘導体の塩基そして、最後の塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。

【0016】

したがって、本発明の第一の態様は、以下の工程を含む本発明の組成物を製造する方法に関する。
ａ） アルカリ金属ヘパリンまたはアルカリ土類金属ヘパリンのヘパリン酸ベンザルコニウムへの塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、
ｂ） ホスファゼン塩基またはグアニジンから派生する塩基の添加による有機媒体基の解重合、
ｃ） アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を形成する塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。

【0017】

本明細書に、好ましい実施形態の例示的な図面を添付するが、本発明を限定するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】重水素水（Ｄ_２Ｏ）において２９８Ｋで記録された、実施例４に記載されるトリトンＢで解重合される生成物の^１３Ｃ−^１Ｈ ＨＳＱＣスペクトルのアノマーシグナル（Ｈ１−Ｃ１相互関係）の領域を示す。

【図2】重水素水（Ｄ_２Ｏ）において２９８Ｋで記録された、実施例４に記載されるＢＥＭＰで解重合される生成物の^１３Ｃ−^１Ｈ ＨＳＱＣスペクトルのアノマーシグナル（Ｈ１−Ｃ１相互関係）の領域を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

図１は、重水素水（Ｄ_２Ｏ）において２９８Ｋで記録された、実施例４に記載されるトリトンＢで解重合される生成物の^１３Ｃ−^１Ｈ ＨＳＱＣスペクトルのアノマーシグナル（Ｈ１−Ｃ１相互関係）の領域を示す。スペクトルにおいて、五糖を形成する５種の単糖類に対応する５種の相互関係ピークが観察され得る。ＡＮＳｒｅｄ、還元端のＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン；Ｉ２Ｓ、Ｌ−イズロン酸２−硫酸塩；ＡＮＳ、３Ｓ、Ｎ−スルホ−３−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコサミン；Ｇ−（ＡＮＳ，３Ｓ）、ＡＮＳ，３ＳユニットおよびＡＮＳ−（Ｇ）を先行するＤ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸環を先行するＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンである。Ｇ−（ＡＮＳ，３Ｓ）ユニットのＨ１−Ｃ１相互関係ピークは、円により強調され（なぜならば、それは五糖の最も特徴的なシグナルであるからである）、そして種々のサンプルにおけるその存在を定量化するために基準として取られるであろう。

【0020】

図２は、重水素水（Ｄ_２Ｏ）において２９８Ｋで記録された、実施例４に記載されるＢＥＭＰで解重合される生成物の^１３Ｃ−^１Ｈ ＨＳＱＣスペクトルのアノマーシグナル（Ｈ１−Ｃ１相互関係）の領域を示す。スペクトルにおいて、五糖を形成する５種の単糖類に対応する５種の相互関係ピークが観察され得る。ＡＮＳｒｅｄ、還元端のＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン；Ｉ２Ｓ、Ｌ−イズロン酸２−硫酸塩；ＡＮＳ、３Ｓ、Ｎ−スルホ−３−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコサミン；Ｇ−（ＡＮＳ，３Ｓ）、ＡＮＳ，３ＳユニットおよびＡＮＳ−（Ｇ）を先行するＤ−グルクロン酸、Ｄ−グルクロン酸環を先行するＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンである。Ｇ−（ＡＮＳ，３Ｓ）ユニットのＨ１−Ｃ１相互関係ピークは、円により強調され（なぜならば、それは五糖の最も特徴的なシグナルであるからである）、そして種々のサンプルにおけるその存在を定量化するために基準として取られるであろう。

【0021】

本発明において、用語「ホスファゼン塩基またはグアニジンから誘導される塩基」は、中性で強く、穏やかな求核性を有する塩基を示し、例えば、Ｐ１−ｔ−Ｂｕ、Ｐ２−ｔ−Ｂｕ、ｔ−ＢｕＰ４、ＢＥＭＰ（２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチル−ペルヒドロ−１，３−ジアザ−２−ホスホリン）、ＴＴＭＧ（２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン）であり、非プロトン性溶媒中で強塩基（ＭｅＣＮ ｐＫａ ＢＥＭＰ＝２７．６，ＤＭＳＯ ｐＫａ ｔ−ＢｕＰ４Ｈ^＋＝３２）である。
前記の本発明の第一の態様は、以下の工程を含むＶＬＭＷＨ組成物および／またはＬＭＷＨを得るための方法に関する。
ａ） アルカリ金属ヘパリンまたはアルカリ土類金属ヘパリンのヘパリン酸ベンザルコニウムへの塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、
ｂ） ホスファゼン塩基またはグアニジンから派生する塩基の添加による有機媒体基の解重合、
ｃ） アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を形成する塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。

【0022】

最終生成物が工程ｂ）および工程ｃ）間に精製される必要がある場合には、有機過酸化物および／または無機過酸化物が添加される。

【0023】

好ましくは、工程ａ）のアルカリ金属またはアルカリ土類金属のヘパリンは、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の未分画ヘパリンである。

【0024】

好ましくは、使用される過酸化物は、過酸化水素である。有機過酸化物の他の例としては、メチルエチルケトンペルオキシド、ベンゾイルペルオキシド、アセトンペルオキシドが挙げられる。無機過酸化物の例としては、（Ｏ_２）^−２とＩＡおよびＩＩＡ族の金属の存在によって特徴付けられる化合物である。

【0025】

好ましくは、工程ｃ）の後に得られた生成物は、精製される。好ましくは、生成物の精製は、５％〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で水に生成物を溶解すること、６と７．５の間の値にｐＨ調整、３％〜１５％（ｗ／ｖ）の濃度の塩化ナトリウムの添加、アルコールによる沈殿によって行われる。好ましくは、生成物は７．５％〜１２．５％（ｗ／ｖ）の濃度で水に溶解させ、６．５％〜７．２５％の間の値にｐＨ調整、５％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度の塩化ナトリウムの添加、メタノールによる沈殿によって行われる。

【0026】

解重合の工程は、有機溶媒中で行われ、好ましくは、有機溶媒は、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミドおよび／またはホルムアミドである。特に、有機溶剤は２０〜４０℃間の温度のジクロロメタンである。

【0027】

工程ｂ）の解重合は、好ましくは、塩基の少なくとも２つの連続添加で行われる。特に、塩基の３回連続添加が行われる。

【0028】

ヘパリン酸ベンザルコニウムおよび各添加の塩基との質量容積比は、１：０．５〜１：０．０５であり、好ましくは、１：０．３〜１：０．１である。

【0029】

ヘパリン酸ベンザルコニウムおよび過酸化水素との質量容積比は、１：１〜１：０．０１であり、好ましくは、１：０．２〜１：０．０５である。

【0030】

好ましくは、工程ｃ）の塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、酢酸ナトリウムのアルコール溶液への反応媒体の沈殿により行われ、好ましくは、メタノール溶液の酢酸ナトリウム溶液１０％（ｗ／ｖ）で行われる。

【0031】

本発明の第二の態様は、大きな五糖画分を含む本発明の方法によって得られた生成物であり、強い抗血栓活性を有する。

【実施例】

【0032】

下記に提供される次の特定の例は、本発明の性質を例示するよう作用する。それらの例は、例示的目的のためにのみ包含され、そして本発明を制限するものではない。

【0033】

（実施例１）
ヘパリンナトリウム１００ｇを水７２５ｍｌに溶解させ、その溶液に、５０％（ｗ／ｖ）濃度の塩化ベンザルコニウムの溶液８８０ｍｌを添加した。生成物を濾過し、水で洗浄し、凍結乾燥した。２３３ｇのヘパリン酸ベンザルコニウムが得られた。

【0034】

先の工程で得られた１０ｇのヘパリン酸ベンザルコニウムをジクロロメタン３０ｍｌに溶解し、３５℃に加温した。その溶液に２−ｔｅｒｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチル−ペルヒドロ−１，３−ジアザ−２−ホスホリン、ＢＥＭＰ、を以下の３つに添加した。
− ＢＥＭＰ １．７２ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ １．７２ｍｌ、３５℃で１６時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ １．７２ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。

【0035】

その溶液に、過酸化水素の溶液１ｍｌを添加し、１６時間３５℃で反応を維持し、その後メタノール中１０％（ｗ／ｖ）の酢酸ナトリウムの溶液６０ｍｌ中に沈殿させた。沈殿物を遠心分離により回収し、メタノールで洗浄した。得られた生成物を５ｍｌの水に溶解し、中和し、塩化ナトリウムを１０％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加し、メタノール１２５ｍｌ中で沈殿させた。沈殿物を濾過により回収し、メタノールで洗浄し、３５℃の真空オーブンで乾燥させた。生成物３．３９ｇが得られた。

【0036】

解重合生成物２ｇを、水１４．５ｍｌに溶解させ、その溶液に、５０％（ｗ／ｖ）の濃度の塩化ベンザルコニウムの水溶液１７．６ｍｌを添加した。生成物を濾過し、水で洗浄し、凍結乾燥した。得られた生成物４．８４ｇを１４．５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、３５℃に加温した。ＢＥＭＰ ０．８３ｍｌを添加し、３５℃で１６時間反応が維持された。時間経過後、２６ｍｌのメタノール中の酢酸ナトリウムの溶液１０％（ｗ／ｖ）に沈殿させた。沈殿物を遠心分離により回収し、メタノールで洗浄した。得られた生成物を５ｍｌの水に溶解し、中和し、塩化ナトリウムを１０％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加し、メタノール５０ｍｌ中で沈殿させた。沈殿物を濾過により回収し、メタノールで洗浄し、３５℃の真空オーブンで乾燥させた。生成物１．３２ｇ（収率５２．１％）が得られた。得られた生成物の特性は以下の通りであった。
− 平均分子量：２９０３ Ｄａ
− 抗ＦＸａ活性：１９３ ＩＵ／ｍｇ
− 抗第ＩＩａ因子活性：９．３ ＩＵ／ｍｇ

【0037】

（実施例２）
ヘパリンナトリウム５０ｇを水３６５ｍｌに溶解させ、その溶液に、５０％（ｗ／ｖ）の濃度の塩化ベンザルコニウムの溶液２２１ｇを加えた。生成物を濾過し、水で洗浄し、凍結乾燥した。１２８．１８ｇのヘパリン酸ベンザルコニウムが得られた。

【0038】

先の工程で得られた５ｇのヘパリン酸ベンザルコニウムをジクロロメタン１５ｍｌに溶解し、３５℃に加温した。その溶液にＢＥＭＰを以下の３つに添加した。
− ＢＥＭＰ ０．８６ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ ０．８６ｍｌ、３５℃で１６時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ ０．８６ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。

【0039】

その溶液に、過酸化水素の溶液０．５０ｍｌを添加し、１６時間３５℃で反応を維持し、その後メタノール中の酢酸ナトリウムの溶液３０ｍｌ中１０％（ｗ／ｖ）に沈殿させた。沈殿物を遠心分離により回収し、メタノールで洗浄した。得られた生成物を２．５ｍｌの水に溶解し、中和し、塩化ナトリウムを１０％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加し、メタノール７５ｍｌ中で沈殿させた。沈殿物を濾過により回収し、メタノールで洗浄し、３５℃の真空オーブンで乾燥させた。生成物１．４０ｇが得られた。

【0040】

解重合生成物１．４０ｇを、水１０ｍｌに溶解させ、その溶液に、５０％（ｗ／ｖ）の濃度の塩化ベンザルコニウムの溶液６．１８ｇを添加した。生成物を濾過し、水で洗浄し、凍結乾燥した。得られた３．４０ｇを１０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、３５℃に加温した。その溶液にＢＥＭＰを以下の３つに添加した。
− ＢＥＭＰ ０．５８ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ ０．５８ｍｌ、３５℃で１６時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ ０．５８ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。

【0041】

その溶液に、過酸化水素の溶液０．３４ｍｌを添加し、１６時間３５℃で反応を維持し、その後メタノール中の酢酸ナトリウムの溶液２０ｍｌ中１０％（ｗ／ｖ）に沈殿させた。沈殿物を遠心分離により回収し、メタノールで洗浄した。得られた生成物を１．７ｍｌの水に溶解し、中和し、塩化ナトリウムを１０％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加し、メタノール５０ｍｌ中で沈殿させた。沈殿物を濾過により回収し、メタノールで洗浄し、３５℃の真空オーブンで乾燥させた。生成物０．８５ｇが得られた（収率４３．６％）。得られた生成物の特性は次の通りである。
− 平均分子量：２７８７ Ｄａ
− 抗ＦＸａ活性：１２１．５ ＩＵ／ｍｇ
− 抗第ＩＩａ因子活性：８．２ ＩＵ／ｍｇ

【0042】

（実施例３）
実施例２で得られた生成物０．５０ｇを５ｍｌの水に溶解し、中和し、塩化ナトリウムを１０％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加し、メタノール６ｍｌ中で沈殿させた。沈殿物を濾過により回収し、メタノールで洗浄し、３５℃の真空オーブンで乾燥させた。生成物０．１３ｇが得られた。得られた生成物の特性は次の通りである。
− 平均分子量：３５３４ Ｄａ
− 抗ＦＸａ活性：１２５．２ ＩＵ／ｍｇ
− 抗第ＩＩａ因子活性：１９．４ ＩＵ／ｍｇ

【0043】

前の段落と同じ工程を繰り返したが、塩基をＢＥＭＰからＴＴＭＧに変更した。

【0044】

得られた生成物の特性は次の通りである。
− 平均分子量：３７０４ Ｄａ
− 抗ＦＸａ活性：１１８．５ ＩＵ／ｍｇ
− 抗第ＩＩａ因子活性：１６．２ ＩＵ／ｍｇ

【0045】

（実施例４、比較例）
この例では、本発明の方法における塩基の変更の影響が調査された。本発明の方法におけるホスファゼン塩基の使用の影響を実証するため、トリトンＢとＢＥＭＰと同様の試験を実施した。

【0046】

ヘパリンナトリウム５０ｇを水に溶解させ、その溶液に、５０％（ｗ／ｖ）の濃度の塩化ベンザルコニウムの溶液２２１ｇを添加した。生成物を濾過し、水で洗浄し、凍結乾燥した。１２８．１８ｇのヘパリン酸ベンザルコニウムが得られた。

【0047】

先の工程で得られた２５ｇのヘパリン酸ベンザルコニウムをジクロロメタン７５ｍｌに溶解し、３５℃に加温した。その溶液にトリトンＢを以下の３つに添加した。
− トリトンＢ ６．２５ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。
− トリトンＢ ６．２５ｍｌ、３５℃で１６時間反応が維持された。
− トリトンＢ ６．２５ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。

【0048】

その溶液に、過酸化水素の溶液２．５ｍｌを添加し、続いて、対応するナトリウム塩を得るために精製した。得られた生成物は、前記の条件と比率に従い、ベンザルコニウム塩を得るために、塩転移反応させる。

【0049】

先の工程で得られた１５．６８ｇのヘパリン酸ベンザルコニウムをジクロロメタン４７ｍｌに溶解し、３５℃に加温した。その溶液にトリトンＢを以下の３つに添加した。
− トリトンＢ ３．９２ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。
− トリトンＢ ３．９２ｍｌ、３５℃で１６時間反応が維持された。
− トリトンＢ ３．９２ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。

【0050】

以下によって特徴づけられる生成物が得られた。
− 平均分子量：２３８７ Ｄａ
− 抗ＦＸａ活性：９４ ＩＵ／ｍｇ

【0051】

同様の試験を行ったが、塩基性ＢＥＭＰを解重合に使用した。

【0052】

５ｇのヘパリン酸ベンザルコニウムをジクロロメタン１５ｍｌに溶解し、３５℃に加温した。その溶液にＢＥＭＰを以下の３つに添加した。
− ＢＥＭＰ ０．８６ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ ０．８６ｍｌ、３５℃で１６時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ ０．８６ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。

【0053】

その溶液に、過酸化水素の溶液０．５ｍｌを添加し、続いて、対応するナトリウム塩を得るために精製した。得られた生成物は、前記の条件と比率に従い、ベンザルコニウム塩を得るために、塩転移反応させる。

【0054】

先の工程で得られた３．４０ｇのヘパリン酸ベンザルコニウムをジクロロメタン１０ｍｌに溶解し、３５℃に加温した。その溶液にＢＥＭＰを以下の３つに添加した。
− ＢＥＭＰ ０．５８ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ ０．５８ｍｌ、３５℃で１６時間反応が維持された。
− ＢＥＭＰ ０．５８ｍｌ、３５℃で８時間反応が維持された。
以下によって特徴づけられる生成物が得られた。
− 平均分子量：２７８７ Ｄａ
− 抗ＦＸａ活性：１２１．５ ＩＵ／ｍｇ

【0055】

本比較例では、ホスファゼン塩基が本工程内で、得られた生成物の抗ＦＸａ活性を非常に著しく増加させて行くことを確認できる。

【0056】

サンプル中の単糖類の平均含有量は、Ｍａｒｃｏ Ｇｕｅｒｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．に記載の方法により^１３Ｃ−^１Ｈ ＨＳＱＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）定量的二次元検定を用いて、核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術によって決定される。二次元で達成される解像度の増加は、一次元スペクトルに重複するシグナルを定量化するため、本技術は、複合炭水化物の研究にとって特に重要である。これらの分子は、一次元^１Ｈスペクトルにおいて重大な重複を有し、定量化の１Ｄにおいて分離されたピーク面積の決定を妨げる。

【0057】

天然のヘパリンから得られたＧＡＧ中に存在するＮ−スルホ−３−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコサミンＧ−（ＡＮＳ、３Ｓ）に結合されるＤ−グルクロン酸の単位の量は、Ｍ．Ｇｕｅｒｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．によって記載されているように、その抗Ｘａ活性と直接相互作用できる。この二糖は、抗トロンビンＩＩＩとの相互作用を担当する五糖に属し、活性配列でのみ検出される。直接結合した水素とグルクロン酸のこの種のアノマー炭素の相関信号は、特徴領域に現れ、ＨＳＱＣスペクトルにおいて重複がなく、したがってサンプル中五糖の割合を定量化することができる。

【0058】

トリトンＢおよびＢＥＭＰを解重合することにより得られた生成物の^１３Ｃ−^１Ｈ ＨＳＱＣは、添付の図１および２にそれぞれ示されているが、各図では五糖の酸単位グルクロンに対応するアノマープロトンの相関信号^１Ｈ−^１３Ｃが、円により強調されている。

【0059】

スペクトルにおけるこのシグナル強度測定により五糖の割合を決定することが可能になる。

【0060】

〔表１〕トリトンＢおよびＢＥＭＰを用いた異なる分画

【0061】

【表1】

【0062】

表１に示すように、トリトンＢの代わりに塩基ＢＥＭＰを使用することは、ＡＴＩＩＩの活性化五糖類を多く維持する解重合反応において高い選択性が得られ、そして、トリトンＢで解重合したものと比較し、ＢＥＭＰで解重合した生成物中で、ＡＮＳ、３Ｓの％は、ほぼ９３％、およびＧ−ＡＮＳ、３Ｓの％は、２５％増加したが、この五糖画分は、本発明に係る方法によって得られる生成物に明確に保持され、これらの生成物に高い活性を与え、反応選択率を高めることによって、本発明に係る方法の収率を達成し得る。

【図1】

【図2】