特許 6298178 子宮頸癌の誘導に関与するアクチニン−４の薬剤学的用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6298178

(24)【登録日】2018年3月2日

(45)【発行日】2018年3月20日

(54)【発明の名称】子宮頸癌の誘導に関与するアクチニン−４の薬剤学的用途

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20180312BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20180312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180312BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20180312BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20180312BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20180312BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180312BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20180312BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20180312BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20180312BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20180312BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20180312BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   A61P15/00

   A61P35/00

   A61K48/00

   A61K31/7088

   A61K31/713

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   C12N15/00 G

   G01N33/53 M

   G01N33/53 D

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

   !C12Q1/02

【請求項の数】7

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2016-565308(P2016-565308)

(86)(22)【出願日】2015年4月27日

(65)【公表番号】特表2017-520238(P2017-520238A)

(43)【公表日】2017年7月27日

(86)【国際出願番号】KR2015004160

(87)【国際公開番号】WO2015167183

(87)【国際公開日】20151105

【審査請求日】2016年10月28日

(31)【優先権主張番号】10-2014-0051608

(32)【優先日】2014年4月29日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】314000442

【氏名又は名称】高麗大学校産学協力団

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ジェ・サン・コ

(72)【発明者】

【氏名】ヒョン−テ・アン

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１３−１９８４９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３８３６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１００７３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１３６４８６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Annals of Oncology，２０１２年 ８月１０日，Vol. 24, No. 1，pp. 84-90

【文献】 Laboratory Investigation，２００８年，Vol. 88，pp. 602-614

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｑ １／０２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質水準を測定する製剤を含むヒトパピローマウイルス16または18型陽性子宮頸癌診断用組成物。

【請求項2】

前記遺伝子のｍＲＮＡを測定する製剤は、前記遺伝子のｍＲＮＡに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の子宮頸癌診断用組成物。

【請求項3】

前記タンパク質の水準を測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体を含む、請求項１に記載の子宮頸癌診断用組成物。

【請求項4】

アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）阻害剤を含むヒトパピローマウイルス16または18型陽性子宮頸癌の予防または治療用薬学組成物。

【請求項5】

アクチニン−４阻害剤は、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはこれを含むベクター；または、抗体のうちいずれか１つである、請求項４に記載の子宮頸癌の予防または治療用薬学組成物。

【請求項6】

アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）遺伝子を候補物質と人体外で接触させ、前記候補物質が前記遺伝子の発現を促進するかまたは抑制するかを判断し、ヒトパピローマウイルス16または18型陽性子宮頸癌を予防または治療するための薬剤として、アクニチン−４遺伝子の発現を抑制する候補物質を選択することを含むヒトパピローマウイルス16または18型陽性子宮頸癌の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。

【請求項7】

アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）タンパク質を候補物質と人体外で接触させ、前記候補物質が前記タンパク質の機能または活性を増進するかまたは抑制するかを判断し、ヒトパピローマウイルス16または18型陽性子宮頸癌を予防または治療するための薬剤として、アクニチン−４タンパク質の機能または活性を抑制する候補物質を選択することを含むヒトパピローマウイルス16または18型陽性子宮頸癌の予防または治療用医薬のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、子宮頸癌のマーカータンパク質として、子宮頸癌の診断、予防または治療のためのアクチニン−４の薬剤学的用途に関する。

【背景技術】

【0002】

上皮間葉転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）とは、上皮細胞が間葉細胞に変わる過程を言う。すなわち上皮細胞の形態を失い、間葉細胞の特徴を有するようになる変異過程であって、個体形成の発達に重要な過程であると知られている。また、最近の研究結果によれば、この過程が癌細胞の生長（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）、浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）等と関連していることが明らかにされている。

【0003】

細胞骨格タンパク質（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）として知られたアクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）は、いくつかの癌細胞で過発現されているだけでなく、細胞の移動性及び生長を誘導するのに関与するものとして知られている。しかし、現在まで子宮頸癌においてマーカータンパク質としてのアクチニン−４の役目は、糾明されたことがない。

【0004】

したがって、本発明者らは、多様な癌細胞でアクチニン−４の発現程度を確認し、子宮頸癌細胞で過発現されたアクチニン−４のＡＫＴ−Ｓｎａｉｌ信号伝逹機作における役目、細胞増殖、移動性と浸潤性、腫瘍形成を糾明することによって、本発明を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】US2009/0136486A1

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、子宮頸癌のマーカータンパク質としてのアクチニン−４の役目を糾明することによって、子宮頸癌の診断、予防、または治療のためのアクチニン−４の薬剤学的用途を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記目的を達成するために、本発明は、アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質水準を測定する製剤を含む子宮頸癌診断用組成物を提供する。
また、本発明は、アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）阻害剤を含む子宮頸癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0008】

また、本発明は、子宮頸癌の予防または治療用薬学組成物の製造のためのアクチニン−４阻害剤の用途を提供する。

【0009】

また、本発明は、アクチニン−４阻害剤を含む子宮頸癌の予防または治療用薬学組成物の薬剤学的有効量を子宮頸癌個体に投与する段階を含む子宮頸癌を治療する方法を提供する。

【0010】

また、本発明は、アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）遺伝子を候補物質と人体外で接触させ、前記候補物質が前記遺伝子の発現を促進するかまたは抑制するかを判断することを含む子宮頸癌の予防または治療用医薬のスクリーニング方法を提供する。

【0011】

また、本発明は、アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）タンパク質を候補物質と人体外で接触させ、前記候補物質が前記タンパク質の機能または活性を増進するかまたは抑制するかを判断することを含む子宮頸癌の予防または治療用医薬のスクリーニング方法を提供する。

【発明の効果】

【0012】

本発明は、子宮頸癌で過発現され、細胞増殖、移動性と浸潤性及び腫瘍形成に関与するアクチニン−４を抑制する場合、このような効果が喪失され、腫瘍形成が抑制されるため、アクチニン−４の阻害を通じて子宮頸癌の診断、予防または治療に使用できる効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、多様な癌細胞（前立腺癌−ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＰＣ３、乳房癌−ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、肺癌−Ａ５４９、Ｈ４６０、大腸癌−ＨＣＴ１１６、肝癌−ＨｅｐＧ２、子宮頸癌−ＨｅＬａ）におけるアクチニン−４発現量の比較（Ａ）及び子宮頸癌腫ＨｅＬａ、ＳｉＨａ及びＭＥ−１８０細胞でアクチニン−４とＥ−カドヘリンの発現様相（Ｂ）を示す図である。

【図2】図２は、子宮頸癌細胞であるＳｉＨａ細胞でアクチニン−４が過発現及び発現抑制によるＡＫＴ−Ｓｎａｉｌ信号機作の確認結果（Ａ）及びＳｎａｉｌ結合部位の有無によるＥ−カドヘリンプロモーターの転写活性（Ｂ及びＣ）を示す図である。

【図3】図３は、子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ、ＳｉＨａ細胞でアクチニン−４発現抑制細胞及びＭＥ−１８０過発現細胞を製作し、それによるＥ−カドヘリン、Ｓｎａｉｌ発現または細胞表現型を比較した図である。

【図4】図４は、子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞でアクチニン−４の過発現による細胞の移動性を示す図である。

【図5】図５は、子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞でアクチニン−４の発現抑制細胞における移動性（Ａ）及び浸潤性（Ｂ）を示す図である。

【図6】図６は、アクチニン−４発現抑制細胞培地における移動性・浸潤性（Ａ）及び細胞増殖（Ｂ）の結果である。

【図7】図７は、アクチニン−４の過発現によるβ−カテニンの発現増加（Ａ）及びアクチニン−４のβ−カテニン分解抑制及び安定化（Ｂ及びＣ）を確認した結果である。

【図8】図８は、アクチニン−４の過発現によるβ−カテニンのプロテオソーム分解抑制（Ａ）及びβ−カテニンのターゲットサイクリンＤ１の転写活性増加（Ｂ）を確認した結果である。

【図9】図９は、アクチニン−４の発現抑制によるコロニー形成減少（Ａ及びＢ）及び過発現によるコロニー形成増加（Ｃ）を確認した結果である。

【図10】図１０は、アクチニン−４の発現抑制による細胞成長を比較した図である。

【図11】図１１は、アクチニン−４発現抑制細胞におけるＰＩ染色分析を用いた細胞増殖抑制確認結果である。

【図12】図１２は、アクチニン−４発現抑制細胞を注射したマウスにおける日付別の腫瘍形成（Ａ）及び癌が形成されたマウス写真（Ｂ）である。

【図13】図１３は、アクチニン−４発現抑制細胞を注射したマウスから抽出した癌（Ａ）、癌のサイズと重さ（Ｂ）及び癌細胞の注射後のマウス体重（Ｃ）を比較した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明の構成を具体的に説明する。
本発明は、アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）遺伝子のｍＲＮＡまたはそのタンパク質水準を測定する製剤を含む子宮頸癌診断用組成物に関する。

【0015】

本発明の一具体例によれば、アクチニン−４は、子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞で過発現され（図１Ａ）、子宮頸癌細胞腫であるＨｅＬａ、ＳｉＨａ及びＭＥ−１８０細胞を利用してアクチニン−４とＥ−カドヘリンの発現量を比較した結果、ＨｅＬａ細胞では、アクチニン−４が多く発現されているが、ＭＥ−１８０細胞では、ほとんど発現されていなかった。一方、アクチニン−４発現が少ないＭＥ−１８０細胞は、Ｅ−カドヘリンの発現が多く認められた（図１Ｂ）。

【0016】

また、アクチニン−４の増加によってＡＫＴの活性化の増加及び転写因子Ｓｎａｉｌの発現増加を示すが、アクチニン−４の発現抑制は、ＡＫＴの活性化を減少させ、Ｓｎａｉｌの発現も減少した（図２Ａ）。Ｓｎａｉｌは、Ｅ−カドヘリンのプロモーターに結合して、当該発現を抑制するため、Ｅ−カドヘリンプロモーターの転写活性を測定することによって、アクチニン−４は、子宮頸癌細胞でＳｎａｉｌを増加させることによって、Ｅ−カドヘリンの発現を調節することを確認した（図２）。

【0017】

アクチニン−４は、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＭＥ−１８０の順に少なく発現されるため、ＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞では、アクチニン−４の発現抑制細胞を製作し、アクチニン−４の発現がほとんどないＭＥ−１８０細胞には、過発現細胞を製作して実験した結果、アクチニン−４の発現抑制細胞であるＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞では、Ｓｎａｉｌの発現が減少し、Ｅ−カドヘリンは、反対に増加することを確認した（図３）。ＨｅＬａ細胞の場合、Ｅ−カドヘリンが発現されない細胞であり、アクチニン−４を発現抑制しても、さらに増加しなかった。これは、アクチニン−４がＳｎａｉｌ発現を用いたＥ−カドヘリンの発現調節と関連しているが、細胞内の他の様々な因子によるＥ−カドヘリンの発現抑制もなされているからであると認められる。また、アクチニン−４が過発現されたＭＥ−１８０細胞では、Ｅ−カドヘリンが減少する様相を示した。この細胞の表現型を確認した結果、発現抑制細胞で形態がＥＭＴの反対現象であるＭＥＴ表現型、すなわち、細胞−細胞間の結合となる表現型に変わって現われた（図３の下段）。

【0018】

また、アクチニン−４の過発現による細胞の移動性増加を確認した結果、アクチニン−４の過発現が子宮頸癌細胞で移動性を増加させた（図４）。移動性と浸潤性は、癌細胞の転移において非常に重要な過程中の１つであるため、アクチニン−４の発現が癌細胞の移動性及び浸潤性に関与するかを確認するために、トランスウェル移動及びマトリゲル浸潤分析を進行した結果、アクチニン−４の発現抑制細胞は、対照群細胞に比べて移動が減少した（図５Ａ）。マトリゲル浸潤の分析結果、アクチニン−４の発現抑制細胞で浸潤された細胞の数が減少した（図５Ｂ）。また、アクチニン−４は、Ｓｎａｉｌを通じてＭＭＰ−９の発現を増加させるため、アクチニン−４発現抑制細胞であるＳｉＨａ細胞から得た培地を利用してトランスウェル移動による移動性を確認した結果、発現抑制細胞から得た培地の場合、対照群培地に比べて細胞の移動性が減少した（図６Ａ）。このような移動性の減少が細胞の増殖に起因して発生するかを確認するために、同一培地を利用してＭＴＴ分析を進行した結果、各培地による細胞の増殖には変化がなかった（図６Ｂ）。したがって、アクチニン−４の発現は、ＡＫＴ−Ｓｎａｉｌ−ＭＭＰ−９増加またはＡＫＴ−ｓｎａｉｌ−Ｅ−カドヘリン抑制の機作を用いた細胞のＥＭＴ及び移動性を増加させる役目をする重要な癌マーカータンパク質であると認められる。

【0019】

また、アクチニン−４の過発現細胞であるＭＤＣＫ細胞でβ−カテニンの発現が増加しており、また、β−カテニンのターゲットタンパク質であるビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎｅ）が増加した（図７Ａ）。β−カテニンは、細胞の増殖を誘導し、通常、細胞−細胞間の結合に関与するＥ−カドヘリンに結合して存在するが、Ｅ−カドヘリンの減少は、β−カテニンの減少につながる。しかし、本発明においてアクチニン−４の過発現細胞では、Ｅ−カドヘリンの発現が抑制されて消えるにもかかわらず、β−カテニンの発現は増加している。したがって、アクチニン−４の増加がβ−カテニンの安定化に関与するものと判断され、ｓｉＲＮＡを利用してＥ−カドヘリンの発現を減少させるとき、アクチニン−４によってβ−カテニンの分解が抑制されるかを確認した結果、Ｅ−カドヘリンが減少することによるβ−カテニンの減少がアクチニン−４の過発現によって抑制された（図７Ｂ）。また、トランスレーション抑制剤であるサイクロヘキサマイドを処理してタンパク質の合成を抑制し、β−カテニンの分解がアクチニン−４によって抑制されるかを時間別に確認した結果、アクチニン−４の過発現の場合、対照群（ｍｏｃｋ）に比べて分解がさらに遅延され、β−カテニンのターゲットタンパク質であるｃ−ｍｙｃの減少も遅延された（図７Ｃ）。細胞内でβ−カテニンの分解は、プロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）によって起きる現象であるため、アクチニン−４がプロテオソーム分解による分解を抑制して、β−カテニンの安定化を誘導するかを確認するために、プロテオソーム抑制剤であるＡＬＬＮを処理して確認した結果、アクチニン−４の過発現時に、β−カテニンのプロテオソーム分解が抑制され、さらに安定化され、量が増加していることを確認した（図８Ａ）。また、β−カテニンのターゲットタンパク質であるサイクリンＤ１の転写活性を確認した結果、アクチニン−４の発現濃度別にその活性が増加した（図８Ｂ）。β−カテニン及びそのターゲットタンパク質であるサイクリンＤ１の増加は、細胞の増殖を誘導するため、アクチニン−４の発現は、細胞増殖に関与するものと判断され、コロニー形成分析を利用して細胞増殖を確認した結果、アクチニン−４発現抑制細胞であるＨｅＬａとＳｉＨａ細胞の場合、コロニー形成が抑制され（図９Ａ及びＢ）、反対に、アクチニン−４が過発現されたＭＥ−１８０細胞では、コロニー形成が増加された（図９Ｃ）。したがって、アクチニン−４の過発現は、細胞の増殖を増加させて、癌の形成を誘導するものと考えられる。アクチニン−４発現抑制細胞でコロニー形成分析を通じて細胞の増殖が減少することを確認したことがあり、アクチニン−４の低い発現が細胞増殖に関与するかをＭＴＴ分析を通じて細胞の成長を確認した結果、ＨｅＬａとＳｉＨａ細胞がいずれも対照群に比べて細胞成長が減少した（図１０）。細胞の成長や増殖を確認できるＰＩ染色分析結果、図１１のように、ＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞のアクチニン−４発現抑制細胞の場合、Ｓ期の比率が減少した。前記結果から、アクチニン−４は、癌で誘導される細胞の成長を促進する役目をするものと判断される。これは、動物実験でも立証され、アクチニン−４の発現が抑制されたＳｉＨａ細胞をマウスに注射して腫瘍形成を確認した結果、アクチニン−４発現抑制細胞で対照群細胞に比べて癌形成が抑制され（図１２Ａ）、腫瘍のサイズも対照群に比べて小さかった（図１２Ｂ）。また、アクチニン−４の発現抑制細胞を注射したマウスから除去した腫瘍を比較した結果、対照群に比べてサイズが小さく（図１３Ａ）、癌のサイズ及び重さも、格別に減少した（図１３Ｂ）。

【0020】

したがって、アクチニン−４は、子宮頸癌を診断するためのバイオマーカーとして使用できる。

【0021】

用語「診断」は、病理状態を確認することを意味するものであって、本発明の目的上、前記診断は、子宮頸癌診断マーカーの発現有無を確認して、子宮頸癌の発病可否、進展及び軽減可否を確認することを意味する。

【0022】

用語「診断用マーカー（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｍａｒｋｅｒ）」とは、子宮頸癌の細胞を正常細胞と区分して診断できる物質を意味し、正常細胞に比べて子宮頸癌の細胞で増加または減少を見せるポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ等）、脂質、糖脂質、糖蛋白質、糖（単糖類、二糖類、オリゴ糖類等）等のような有機生体分子等を含む。本発明において提供する子宮頸癌診断用マーカーは、正常細胞に比べて子宮頸癌の細胞で発現量が増加するアクチニン−４遺伝子から発現されたタンパク質であることができる。

【0023】

本発明の子宮頸癌診断用組成物は、アクチニン−４遺伝子のｍＲＮＡの発現水準または前記遺伝子から発現されたタンパク質の量を測定する製剤を含み、このような製剤として、アクチニン−４ｍＲＮＡに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、例えば、アクチニン−４ｍＲＮＡに特異的に結合するプライマーまたは核酸プローブや、アクチニン−４タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。

【0024】

前記プライマーは、適合な温度及び適合な緩衝液内で適合な条件（すなわち、４種の異なるヌクレオチドトリホスフェート及び重合反応酵素）の下で鋳型−指示ＤＮＡ合成の開始点として作用できる単一ストランドオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの適合な長さは、多様な要素、例えば、温度とプライマーの用途によって変化があり得る。また、プライマーの配列は、鋳型の一部配列と完全に相補的な配列を有する必要がなく、鋳型と混成化されて、プライマー固有の作用が可能な範囲内において十分な相補性を有すれば十分である。したがって、本発明におけるプライマーは、鋳型である遺伝子のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列を有する必要がなく、この遺伝子配列に混成化されて、プライマー作用が可能な範囲内で十分な相補性を有すれば十分である。また、本発明によるプライマーは、遺伝子増幅反応に用いられるものが好適である。前記増幅反応は、核酸分子を増幅する反応を言い、このような遺伝子の増幅反応に対しては、当業界によく知られており、例えば、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）等が含まれることができる。

【0025】

前記核酸プローブは、自然のまたは変形されたモノマーまたは連鎖（ｌｉｎｋａｇｅｓ）の線形オリゴマーを意味し、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含み、ターゲットヌクレオチド配列に特異的に混成化でき、自然的に存在するかまたは人為的に合成されたものを言う。本発明によるプローブは、単一鎖であってもよく、好ましくは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい。本発明のプローブは、自然ｄＮＭＰ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、ヌクレオチド類似体または誘導体を含むことができる。また、本発明のプローブは、リボヌクレオチドをも含むことができる。例えば、本発明のプローブは、骨格変形されたヌクレオチド、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロジチオエートＤＮＡ、ホスホロアミダートＤＮＡ、アミド−連結されたＤＮＡ、ＭＭＩ−連結されたＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、アルファ−ＤＮＡ及びメチルホスホネートＤＮＡ、糖変形されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、２’−アミノＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＤＮＡ、２’−Ｏ−アリールＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキニルＤＮＡ、ヘキソースＤＮＡ、ピラノシルＲＮＡ及びアンヒドロヘキシトールＤＮＡ、及び塩基変形を有するヌクレオチド、例えば、Ｃ−５置換されたピリミジン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、エチニル−、プロピニル−、アルキニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−を含む）、Ｃ−７置換基を有する７−デアザプリン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、アルキニル−、アルケニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−）、イノシン及びジアミノプリンを含むことができる。

【0026】

前記アクチニン−４に特異的な抗体は、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、ヒト抗体及びヒト化抗体を使用できる。

【0027】

前記抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ディアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；線形抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；単一鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体等が含まれる。

【0028】

抗体をパパイン（ｐａｐａｉｎ）で分解すれば、２個の同一の抗原結合断片、すなわち単一抗原結合部位がある各「Ｆａｂ」断片、及びその残りである「Ｆｃ」断片が生成される。ペプシンを処理すれば、２個の抗原結合部位があり、相変らず抗原に交差結合できるＦ（ａｂ’）２断片が生成される。Ｆｖは、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小限の抗体断片である。この部位は、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域の二量体で構成され、非共有結合で堅く結合されている。

【0029】

ポリクロナル抗体の製造方法は、当業者に公知されている。ポリクロナル抗体は、哺乳動物に１回以上免疫化剤を注入し、必要な場合、免疫補強剤とともに注入して製造できる。通常、免疫化剤及び（または）免疫補強剤は、哺乳動物に皮下注射または腹腔内注射で数回注入される。免疫化剤は、本発明のタンパク質またはその融合タンパク質であることができる。免疫化される哺乳動物に免疫原性があるものと公知されたタンパク質とともに免疫化剤を注射することが効果的なことがある。

【0030】

本発明によるモノクロナル抗体は、文献（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５））に記載されたハイブリドーマ方法で製造できるか、または再組合ＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５７６号参照）で製造できる。モノクロナル抗体は、また、例えば、文献（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１））に記載された技術を利用してファージ抗体ライブラリから単離できる。

【0031】

本発明におけるモノクロナル抗体は、具体的に、目的する活性を発揮すると、重鎖及び（または）軽鎖の一部分が特定の種から由来した抗体または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一であるか、相同性があるが、鎖の残りは、他の種から由来した抗体または他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体またはそれら抗体の断片と同一であるか、相同性がある「キメラ」抗体を含む（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４））。

【0032】

非ヒト（例えば、ネズミ科動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合配列）である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を所望する特異性、親和度及び能力を有するマウス、ネズミまたはウサギのようなヒト以外の種（供与者抗体）のＣＤＲ残基で置換させたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）を含む。いくつかの場合に、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、相当する非ヒト残基によって置換される。また、ヒト化抗体は、受容抗体、または導入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列で発見されない残基を含むことができる。一般的に、ヒト化抗体は、１つ以上、一般的に２つ以上の可変ドメインを実質的にすべて含み、ここで、すべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、すべてのまたは実質的にすべてのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン配列の領域に該当する。また、ヒト化抗体は、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にヒト免疫グロブリン領域の一部を含む（Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。

【0033】

本発明の子宮頸癌診断用組成物は、キットの形態で含まれることができる。
前記キットは、アクチニン−４遺伝子の発現水準またはタンパク質の量を測定できるプライマー、プローブまたは抗体を含むことができ、これらの定義は、前述した通りである。

【0034】

前記キットがＰＣＲ増幅過程に適用される場合、選択的に、ＰＣＲ増幅に必要な試薬、例えば、緩衝液、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓまたはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）から収得した熱安定性ＤＮＡ重合酵素）、ＤＮＡ重合酵素補助因子及びｄＮＴＰｓを含むことができ、前記キットが免疫分析に適用される場合、本発明のキットは、選択的に、二次抗体及び標識の基質を含むことができる。さらに、本発明によるキットは、前述した試薬成分を含む多数の別途パッケージングまたはコンパートメントで製作され得る。

【0035】

また、本発明の子宮頸癌診断用組成物は、マイクロアレイの形態で含まれることができる。

【0036】

本発明のマイクロアレイにおいて、前記アクチニン−４タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現水準を測定できるプライマー、プローブまたは抗体は、混成化アレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用され、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に固定化される。好ましい基質は、適合な堅固性または半堅固性支持体であって、例えば、膜、フィルタ、チップ、スライド、ウェーハ、ファイバー、磁気性ビーズまたは非磁気性ビーズ、ゲル、チュービング、プレート、高分子、微小粒子及び毛細管を含むことができる。前記混成化アレイ要素は、前記基質上に配列されて固定化され、このような固定化は、化学的結合方法またはＵＶのような共有結合的方法によって行われることができる。例えば、前記混成化アレイ要素は、エポキシ化合物またはアルデヒド基を含むように変形されたガラス表面に結合され得、また、ポリリジンコーティング表面でＵＶによって結合され得る。また、前記混成化アレイ要素は、リンカー（例：エチレングリコールオリゴマー及びジアミン）を介して基質に結合され得る。

【0037】

一方、本発明のマイクロアレイに適用される試料が核酸の場合には、標識され得、マイクロアレイ上のアレイ要素と混成化され得る。混成化条件は、多様であることができ、混成化程度の検出及び分析は、標識物質によって多様に実施され得る。

【0038】

また、本発明は、前記アクチニン−４遺伝子の発現水準またはその発現タンパク質水準を測定する方法を通じて子宮頸癌を診断する方法を提供し、より具体的に、前記方法は、（ａ）子宮頸癌疑心患者の生物学的試料からアクチニン−４遺伝子の発現水準またはその発現タンパク質の量を測定する段階と；（ｂ）正常対照群試料から前記遺伝子の発現水準またはその発現タンパク質の量を測定して、前記（ａ）段階の測定結果と比較する段階とを含むことができる。

【0039】

前記で遺伝子の発現水準またはタンパク質の量を測定する方法は、公知の技術を利用して生物学的試料からｍＲＮＡまたはタンパク質を分離する公知の工程を含んで行われることができる。

【0040】

前記生物学的試料は、子宮頸癌発生または進行程度による前記遺伝子の発現水準またはタンパク質の水準が正常対照群とは異なる、生体から採取された試料を言い、前記試料としては、例えば、これに制限されないが、組織、細胞、血液、血清、血しょう、唾液及び尿等が含まれることができる。

【0041】

前記遺伝子の発現水準の測定は、好ましくは、ｍＲＮＡの水準を測定することであり、ｍＲＮＡの水準を測定する方法としては、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写重合酵素連鎖反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロット及びＤＮＡチップ等があるが、これに制限されない。

【0042】

前記タンパク質水準の測定は、抗体を利用でき、このような場合、生物学的試料内の前記アクチニン−４タンパク質とこれに特異的な抗体は、結合物、すなわち抗原−抗体複合体を形成し、抗原−抗体複合体の形成量は、検出ラベル（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌａｂｅｌ）のシグナルのサイズを通じて定量的に測定できる。このような検出ラベルは、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、レドックス分子及び放射線同位元素よりなるグループの中から選択でき、これに制限されるものではない。タンパク質水準を測定するための分析方法としては、これに制限されないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射線免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ等がある。

【0043】

したがって、本発明は、前記のような検出方法を通じて、対照群のｍＲＮＡ発現量またはタンパク質の量と子宮頸癌患者、または子宮頸癌疑心患者におけるｍＲＮＡ発現量またはタンパク質の量を確認でき、前記発現量の程度を対照群と比較することによって、子宮頸癌の発病可否、進行段階等を診断できる。

【0044】

また、本発明による前記子宮頸癌の診断方法は、本発明によるアクチニン−４遺伝子の発現水準またはその発現タンパク質の量が正常対照群試料に比べて増加した場合、子宮頸癌が誘発されたものと判断できる。

【0045】

また、本発明は、アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）阻害剤を含む子宮頸癌の予防または治療用薬学組成物に関する。

【0046】

また、本発明は、子宮頸癌の予防または治療用薬学組成物の製造のためのアクチニン−４阻害剤の用途を提供する。

【0047】

本発明によれば、アクチニン−４は、前述したように、子宮頸癌細胞で過発現され、アクチニン−４の発現は、ＡＫＴ−Ｓｎａｉｌ−ＭＭＰ−９増加またはＡＫＴ−Ｓｎａｉｌ−Ｅ−カドヘリン抑制機作を通じて細胞のＥＭＴ及び移動性を増加させ、細胞の増殖に関与するβ−カテニンの分解を抑制して、そのターゲットタンパク質であるｃ−ｍｙｃの減少をも遅延させ、サイクリンＤ１の転写活性を増加させて、細胞の増殖を増加させることによって、癌形成を誘導するが、アクチニン−４の発現を抑制する場合、ＭＥＴ表現型、すなわち、細胞−細胞間の結合となる表現型を示し、細胞の移動性と浸潤性が減少し、細胞増殖が減少し、動物モデルで腫瘍形成を抑制し、形成された腫瘍のサイズも、対照群に比べて小さかった。したがって、アクチニン−４の阻害剤は、子宮頸癌の治療に使用できる。

【0048】

したがって、本発明の子宮頸癌の予防または治療用組成物は、アクチニン−４遺伝子のｍＲＮＡ発現またはそのタンパク質の発現を減少させるか、機能または活性を減少させる製剤を含むことができる。

【0049】

前記アクチニン−４タンパク質阻害剤は、アクチニン−４タンパク質と結合して神経分化経路の信号を調節するペプチドまたは化合物等であることができる。このような阻害剤は、タンパク質構造分析等の下記例示されたスクリーニング方法を通じて選定され得、当業界に公知された方法を利用して設計され得る。

【0050】

また、前記タンパク質阻害剤は、アクチニン−４タンパク質に対するポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、ヒト抗体及びヒト化抗体を使用でき、前記抗体の定義は、前述した通りである。

【0051】

前記抗体を利用して細胞内のアクチニン−４の機能を抑制することによって、子宮頸癌を予防または治療できる。

【0052】

本発明のアクチニン−４タンパク質の機能または活性阻害剤は、リポソーム、ウイルス、遺伝子ガン（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）、ポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）、超音波、電気衝撃を利用して伝達され得るが、これに特に制限されるものではない。

【0053】

前記アクチニン−４遺伝子は、これらをコーディングするＤＮＡまたはこれから転写されるｍＲＮＡであることができる。したがって、前記遺伝子に対する阻害剤は、遺伝子自体に結合して転写を妨害するか、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡに結合してｍＲＮＡの解読を妨害する阻害剤であることができる。

【0054】

したがって、前記アクチニン−４遺伝子の阻害剤は、アクチニン−４遺伝子の発現を阻害する阻害剤をすべて含む。例えば、このような阻害剤は、前記遺伝子に結合するペプチド、核酸または化合物等であることができる。このような阻害剤は、細胞基盤スクリーニング等の下記例示されたスクリーニング方法を通じて選定され得、当業界に公知された方法を利用して設計され得る。

【0055】

一具体例で、前記阻害剤は、アクチニン−４遺伝子に対するアンチセンス−オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはこれらを含むベクターであることができる。このようなアンチセンス−オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはこれらを含むベクターは、当業界に公知された方法を利用して製作できる。

【0056】

本明細書で、「ｓｉＲＮＡ」は、標的遺伝子のｍＲＮＡの切断を通じてＲＮＡ干渉現象を誘導する二本鎖ＲＮＡを意味し、標的遺伝子のｍＲＮＡのような配列を有するセンス配列のＲＮＡストランドと、これと相補的な配列を有するアンチセンス配列のＲＮＡストランドで構成される。

【0057】

前記ｓｉＲＮＡは、試験管内で合成したｓｉＲＮＡ自体またはｓｉＲＮＡをコーディングする塩基配列を発現ベクターに挿入して発現される形態を含むことができる。

【0058】

本発明において、前記「ベクター」は、ポリペプチドを暗号化するゲノム内に挿入された外部ＤＮＡを含む遺伝子作製物を言う。

【0059】

本発明と関連したベクターは、前記遺伝子を阻害する核酸配列がゲノム内に挿入されたベクターであって、これらのベクターは、ＤＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、酵母ベクター、またはウイルスベクターが例示できる。

【0060】

また、前記アンチセンスは、アクチニン−４遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡ配列全体または一部と相補的な配列を有し、前記ｍＲＮＡと結合して前記アクチニン−４遺伝子または断片の発現を抑制できる。

【0061】

また、前記ｓｈＲＮＡｉ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡｉ）は、ヒトまたはマウスのｓｈＲＮＡｉ共通塩基配列部位を標的にして通常の方法によって製作されたものを使用できる。

【0062】

また、本発明の医薬組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。
前記薬剤学的に許容可能な担体は、医薬分野で通常使用される担体及びビヒクルを含み、具体的に、イオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、各種リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例えば、プロタミンスルフェート、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム及び亜鉛塩）、膠質性シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコールまたは羊毛脂等を含むが、これに制限されない。

【0063】

また、本発明の組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、または保存剤等をさらに含むことができる。

【0064】

１つの様態として、本発明による組成物は、非経口投与のための水溶性溶液で製造でき、好ましくは、ハンクス溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンゲル溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または物理的に緩衝された塩水のような緩衝溶液を使用できる。水溶性注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）懸濁液は、ソジウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのように懸濁液の粘度を増加させることができる基質を添加できる。

【0065】

本発明の組成物は、全身または局所的に投与され得、このような投与のために公知の技術で適合な剤形に製剤化され得る。例えば、経口投与時には、不活性希釈剤または食用担体と混合するか、硬質または軟質ゼラチンカプセルに密封されるかまたは錠剤に圧縮成形して投与することができる。経口投与用の場合、活性化合物は、賦形剤と混合されて、摂取型錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリクシール、サスペンション、シロップ、ウェーハ等の形態で使用され得る。

【0066】

注射用、非経口投与用等の各種剤形は、当該技術分野に公知された技法または通用される技法によって製造できる。アクチニン−４は、食塩水または緩衝液によく溶解されるので、冷凍乾燥状態で保管した後、有効量のアクチニン−４を静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与等に適合な形態で食塩水または緩衝液に投与直前に溶液に製剤化して投与してもよい。

【0067】

本発明の医薬組成物の有効成分の有効量は、疾患の予防、抑制または軽減効果を奏するのに要求される量を意味する。

【0068】

したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物を含めた多様な因子によって調節され得る。これに制限されるものではないが、例えば、大人の場合、本発明の阻害剤は、１日１回〜数回投与時に、化合物の場合、０．１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、ポリペプチド、タンパク質または抗体の場合、０．１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、アンチセンス−オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡの場合、０．０１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの用量で投与できる。

【0069】

本発明は、また、アクチニン−４阻害剤を含む子宮頸癌の予防または治療用薬学組成物の薬剤学的有効量を子宮頸癌個体に投与する段階を含む子宮頸癌を治療する方法を提供する。

【0070】

前記子宮頸癌の治療方法に使用される薬学的組成物及び投与方法は、前記で説明したので、これら２つの間に共通された内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

【0071】

一方、前記子宮頸癌の予防または治療用薬学的組成物を投与できる個体は、すべての動物を含む。例えば、犬、猫、マウスのようなヒトを除いた動物であることができる。

【0072】

また、本発明は、アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）遺伝子を候補物質と人体外で接触させ、前記候補物質が前記遺伝子の発現を促進するかまたは抑制するかを判断することを含む子宮頸癌の予防または治療用医薬のスクリーニング方法を提供する。

【0073】

また、本発明は、アクチニン−４（ａｃｔｉｎｉｎ−４）タンパク質を候補物質と人体外で接触させ、前記候補物質が前記タンパク質の機能または活性を増進するかまたは抑制するかを判断することを含む子宮頸癌の予防または治療用医薬のスクリーニング方法を提供する。

【0074】

本発明のスクリーニング方法によれば、まず、前記遺伝子またはタンパク質を含む子宮頸癌細胞に、分析しようとする候補物質を接触させることができる。

【0075】

前記候補物質は、通常的な選定方式によってアクチニン−４遺伝子塩基配列でｍＲＮＡ、タンパク質への転写、翻訳を促進するかまたは抑制する物質、あるいはアクチニン−４タンパク質の機能または活性を増進するかまたは抑制する医薬としての可能性を有するものと推定されるかまたは無作為的に選定された個別的な核酸、タンパク質、ペプチド、その他抽出物または天産物、化合物等になり得る。

【0076】

その後、候補物質が処理された細胞から前記遺伝子の発現量、タンパク質の量またはタンパク質の活性を測定でき、測定結果、前記遺伝子の発現量、タンパク質の量またはタンパク質の活性が増加または減少することが測定されれば、前記候補物質は、子宮頸癌を治療または予防できる物質として判断できる。

【0077】

前記で遺伝子の発現量、タンパク質の量またはタンパク質の活性を測定する方法は、当業界に公知された多様な方法を通じて行われることができ、例えば、これに制限されないが、逆転写重合酵素連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リアルタイム重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）及び免疫沈降分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）等を利用して行うことができる。

【0078】

本発明のスクリーニング方法を通じて得た、遺伝子発現を抑制させるか、タンパク質の機能を抑制する活性を示す候補物質は、子宮頸癌治療剤の候補物質になり得る。

【0079】

このような子宮頸癌治療剤の候補物質は、以後の子宮頸癌治療剤の開発過程で先導物質（ｌｅａｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として作用するようになり、先導物質がアクチニン−４遺伝子またはそれから発現されるタンパク質の機能を促進または抑制効果を示すことができるように、その構造を変形させ、最適化することによって、新しい子宮頸癌治療剤を開発できる。

【0080】

本発明で遺伝工学的技術と関連した事項は、サムブルック等の文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１））及びフレドリック等の文献（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １、２、３、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９４））に開示されている内容によってさらに明確になる。

【0081】

本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で具現され得、ただ本実施例は、本発明の開示を完全にし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。

【0082】

以下、実験に使用された試薬、培地等の入手先は、次の通りである：
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。

【0083】

抗−ＡＣＴＮ４、抗−ビメンチン、抗−Ｎ−カドヘリン、抗−β−アクチン及び抗−ＡＫＴ１抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入し、抗−ｐ−ＧＳＫ３β、抗−ｓｎａｉｌ及び抗−ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、抗−Ｅ−カドヘリン、抗−β−カテニン抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓから購入した。モノクロナル抗−Ｆｌａｇ−Ｍ２抗体は、Ａｌｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。

【0084】

ｓｈ−ＡＣＴＮ４プラスミドは、Ｏｐｅｎ−ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入した。

【0085】

トリファンブルー（Ｔｒｙｐｈａｎ ｂｌｕｅ）及び３−（４、５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２、５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。

【0086】

〈実施例１〉多様な癌細胞におけるアクチニン−４発現及び子宮頸癌細胞における発現比較
多様な癌細胞におけるアクチニン−４の発現量を比較するために、ウェスタンブロットを利用してタンパク質発現量を比較した。

【0087】

このために、一般細胞であるヒト胎児腎臓細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ、ＨＥＫ−２９３Ｔ）を含んで、様々な癌細胞（前立腺癌：ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＰＣ３／乳房癌：ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／肺癌：Ａ５４９、Ｈ４６０／大腸癌：ＨＣＴ１１６／肝癌：ＨｅｐＧ２／子宮頸癌：ＨｅＬａ）におけるアクチニン−４の発現を比較した。各細胞の蛋白質量は、３０μｇと１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用し、アクチニン−４の抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）は、１：３０００比率で使用した。各タンパク質検出のために、Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して暗室で確認した。チューブリン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）は、各細胞のタンパク質を同一量で比較したかを把握できる対照群であって、１：３０００比率で処理した。

【0088】

図１Ａに示されたように、他の癌細胞に比べて子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞で過量のアクチニン−４が発現された。

【0089】

前記結果に基づいて子宮頸癌細胞腫であるＨｅＬａ、ＳｉＨａ及びＭＥ−１８０細胞を利用してアクチニン−４の発現量を比較し、発現量によるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の発現を確認した。

【0090】

このために、子宮癌細胞に含まれる３つの子宮癌細胞（ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＭＥ−１８０）から得た３０μｇのタンパク質をウェスタンブロットを利用してアクチニン−４とＥ−カドヘリン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ）のタンパク質発現量を比較した。Ｅ−カドヘリン抗体は、１：５０００比率で使用した。

【0091】

図１Ｂに示されたように、ＨｅＬａ細胞では、アクチニン−４が多く発現されており、ＭＥ−１８０細胞では、ほとんど発現されていなかった。一方、アクチニン−４発現が少ないＭＥ−１８０細胞は、Ｅ−カドヘリンが多く発現されていた。

【0092】

このような結果は、アクチニン−４の過発現によるＥ−カドヘリンの発現調節によるものと認められる。

【0093】

〈実施例２〉子宮頸癌細胞でアクチニン−４の発現によるＡＫＴ−Ｓｎａｉｌ信号機作及びＥ−カドヘリンの転写活性の調査
先行研究報告において、ＭＤＣＫ細胞でアクチニン−４の発現によるＡＫＴ−Ｓｎａｉｌの信号機作を確認したことがある。したがって、子宮頸癌細胞でも、同じ機作が起きるかを確認した。

【0094】

このために、ＳｉＨａ細胞にｆｌａｇ−アクチニン−４ＤＮＡ（１μｇ）またはｓｈ−アクチニン−４（１．５μｇ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用してトランスフェクションした。ＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００の比率は、１：２で使用し、方法は、製造メーカのマニュアルによって行った。ｓｈ−アクチニン−４の場合、Ｏｐｅｎ−ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから購入して使用した。当該細胞からＲＩＰＡライシスバッファーを利用してタンパク質を抽出した後、３０μｇのタンパク質をウェスタンブロットでそれぞれ（ＦＬＡＧ：Ａｌｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐ−ＡＫＴ：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＫＴ：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｐ−ＧＳＫ３β、ｓｎａｉｌ：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及びβ−アクチン：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の抗体を使用してタンパク質の発現を確認し、それぞれの抗体は、１：３０００比率で使用した。

【0095】

また、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１２−ウェルプレートに各ウェル当たり２×１０^５細胞をシーディングした後、０．５μｇのＥ−カドヘリンプロモーター構造物（全長サイズ：−４２７〜＋５３、Ｄｅｌ−ｍｕｔａｎｔ：−７８〜＋５３）とＦｌａｇ−ＡＣＴＮ４（０．５μｇ）またはｓｈ−ＡＣＴＮ４（０．５μｇ）を同時にトランスフェクションした。Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔの製作は、全長プロモーターでｓｎａｉｌ結合部位を含む−２０７〜−１９４部分を除いた−７８〜＋５３部分をクローニングして製作した。ｓｎは、ｓｎａｉｌの結合部位（−２０７〜−１９４）を示す。当該細胞をｉｃｅ−ｃｏｌｄ ＰＢＳで洗浄及びレポーターライシスバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でウェル当たり８０μＬを使用して細胞を壊した後、１０，０００×ｇに４℃で１０分間遠心分離して、上澄み液を収集し、ルシフェラーゼ活性を測定した。機器は、Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ２０／２０^ｎ（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用した。標準化（Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）のために、ｐＳＶ４０−β−ガラクトシダーゼを一緒にトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）した。収集された上澄み液は、β−ガラクトシダーゼ活性を測定してルシフェラーゼ活性を補正し、値をグラフで示した。これにβ−ガラクトシダーゼ酵素分析システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が使用され、ＤＵ５３０ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して分析した。

【0096】

図２Ａに示されたように、アクチニン−４の増加によってＡＫＴの活性化増加及びＳｎａｉｌの発現増加を示すが、アクチニン−４の発現抑制は、ＡＫＴの活性化を減少させ、Ｓｎａｉｌの発現をも減少させた。

【0097】

転写因子Ｓｎａｉｌは、Ｅ−カドヘリンのプロモーターに結合し、当該発現を抑制する役目をする。したがって、Ｓｎａｉｌの結合部位を含むかまたは除去された２つのＥ−カドヘリンプロモーターの転写活性を測定した結果、Ｓｎａｉｌ部位が含まれたプロモーターでは、転写活性が減少し、除去された場合は、転写活性がアクチニン−４の有無による変化がなかった（図２Ｂ）。また、アクチニン−４の発現を抑制した場合、Ｅ−カドヘリンの転写活性が増加した（図２Ｃ）。

【0098】

このような結果を見れば、アクチニン−４は、子宮頸癌細胞でＳｎａｉｌを増加させることによって、Ｅ−カドヘリンの発現を調節するものと認められる。

【0099】

〈実施例３〉子宮頸癌細胞腫であるＨｅＬａ、ＳｉＨａ及びＭＥ−１８０細胞にアクチニン−４発現抑制細胞及び過発現細胞の製作によるＳｎａｉｌとＥ−カドヘリンの発現様相の調査
実施例１でアクチニン−４は、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＭＥ−１８０の順に少なく発現された。したがって、ＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞では、アクチニン−４の発現抑制細胞を製作し、アクチニン−４の発現がほとんどないＭＥ−１８０細胞には、過発現細胞を製作した。

【0100】

アクチニン−４発現抑制安定化細胞を製作するために、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ細胞にｓｈＡＣＴＮ４プラスミド（１．５μｇ）をトランスフェクションし、２週間プロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）（２μｇ／ｍＬ）で選別した。当該細胞からタンパク質を抽出した後、ウェスタンブロットを利用してアクチニン−４とＳｎａｉｌのタンパク質発現量を確認した。また、ＭＥ−１８０細胞では、アクチニン−４の過発現安定化細胞を製作するために、Ｆｌａｇ−ＡＣＴＮ４プラスミドをトランスフェクションした後、２週間Ｇ−４１８（４００μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）を処理することによって選別した。当該細胞の表現型（細胞形態）を確認するために、顕微鏡を用いて写真を撮った（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００；倍率×１０）。

【0101】

図３に示されたように、アクチニン−４の発現抑制細胞であるＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞では、Ｓｎａｉｌの発現が減少し、Ｅ−カドヘリンは、反対に増加した。ＨｅＬａ細胞は、Ｅ−カドヘリンが発現されない細胞であり、アクチニン−４を発現抑制しても、さらに増加しなかった。これは、アクチニン−４がＳｎａｉｌ発現によるＥ−カドヘリンの発現調節と関連しているが、細胞内に他の様々な因子によるＥ−カドヘリンの発現抑制も行われているからであると考えられる。

【0102】

次に、アクチニン−４が過発現されたＭＥ−１８０細胞では、Ｅ−カドヘリンが減少する様相を示した。この細胞の表現型を確認した結果、発現抑制細胞で形態がＥＭＴの反対現象であるＭＥＴ表現型、すなわち、細胞−細胞間の結合になる表現型に変わって現われることを確認した（図３の下段）。

【0103】

〈実施例４〉子宮頸癌細胞でアクチニン−４の過発現による細胞の移動性の調査
子宮頸癌細胞でアクチニン−４の過発現による細胞の移動性を確認するために、創傷傷治癒分析（ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）を進行した。
創傷傷治癒分析のために、６−ウェルプレートに各ウェル当たりＨｅＬａ及びＳｉＨａ ５×１０^５細胞をシーディングしてアクチニン−４（１μｇ）をトランスフェクションした後、各ウェルの細胞を２００ｐチップを利用して直線で細胞を掻き出した後、細胞が除去された位置に各表面の細胞が移動する程度を比較した（ＨｅＬａ ２４ｈ、ＳｉＨａ４８ｈ）。

【0104】

図４のように、アクチニン−４の過発現が細胞の移動性を増加させた。
移動性と浸潤性は、癌細胞の転移において非常に重要な過程中の１つである。したがって、アクチニン−４の発現が癌細胞の移動性及び浸潤性に関与するかを確認するために、アクチニン−４発現抑制細胞でトランスウェル移動（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及びマトリゲル浸潤分析（ｍａｔｒｉｇｅｌ ｉｎｖａｓｉｏｎａｓｓａｙ）を進行した。

【0105】

細胞の移動性測定（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）のために、アクチニン−４の発現抑制安定化細胞（ＨｅＬａ−ＫＤ、ＳｉＨａ−ＫＤ）を利用してトランスウェル移動を進行した。８μｍ−気孔サイズの孔があるトランスウェルインサート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にコラーゲンＩ（２０μｇ）を１時間コーティングした。その後、ＨｅＬａ（対照群とＫＤ細胞：３×１０^５）とＳｉＨａ（対照群とＫＤ細胞：５×１０^５）細胞をインサートにシーディングして、３６時間後に気孔の反対側に移った細胞の数を測定し、グラフで示した。

【0106】

図５Ａに示されたように、アクチニン−４の発現抑制細胞が対照群細胞に比べて移動が減少した。

【0107】

マトリゲル浸潤分析は、１つの癌組織の細胞から他の生体器官に転移される場合、血管または組織に浸透できる能力が必要であるため、そのように能力を調べるために使用する実験である。マトリゲルを経てメンブレインの反対に移動する細胞数を測定した。

【0108】

このために、８μｍ−気孔サイズの孔があるインサートプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にマトリゲル（２ｍｇ／ｍＬ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１時間コーティングした。その後、ＨｅＬａ（対照群とＫＤ細胞：５×１０^５）とＳｉＨａ（対照群とＫＤ細胞：５×１０^５）細胞をインサートプレートにシーディングして、３６時間後に気孔の反対側に移った細胞の数を測定し、グラフで示した。

【0109】

図５Ｂに示されたように、アクチニン−４の発現抑制細胞で浸潤された細胞の数が減少した。

【0110】

また、アクチニン−４は、Ｓｎａｉｌを通じてＭＭＰ−９の発現を増加させるので、アクチニン−４発現抑制細胞から得た培地も、細胞の移動性を抑制するものと考えられ、アクチニン−４発現抑制細胞であるＳｉＨａ細胞から得た培地を利用してトランスウェル移動による移動性を確認した。

【0111】

このために、アクチニン−４発現抑制細胞から得たならし培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＭ）をＨｅＬａとＳｉＨａ細胞に処理し、細胞の移動性（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）をトランスウェル移動方法を利用して実験した。ＣＭは、アクチニン−４発現抑制ＳｉＨａ細胞を６−ウェルプレートにウェル当たり５×１０^５細胞をシーディングした後、無血清ＤＭＥＭを４８時間処理後、その培地を収集して、５００×ｇに５分間遠心分離して残っている細胞を除去し、培地だけを回収した。細胞移動性（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）実験方法は、前述した移動性実験と同一に行った。

【0112】

また、当該培地（ＣＭ）が細胞の成長に関与するかを確認するために、９６−ウェルプレートにＨｅＬａ及びＳｉＨａそれぞれ１×１０^４数の細胞をシーディングした後、ＳｉＨａ−アクチニン−４発現抑制細胞から得たＣＭ（対照群ＣＭまたはＡＣＴＮ４−ＫＤ ＣＭ）を処理して、時間別（０−４８ｈ）に細胞数を測定してグラフで示し、それぞれ３回ずつ実験を進行した。それぞれのウェルにＭＴＴ溶液１００μＬ（５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を６時間処理した後、反応を停止するために、１００ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を付加した。５９０ｎｍ波長でＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）を利用して測定した。

【0113】

図６Ａに示されたように、発現抑制細胞から得た培地は、対照群培地に比べて細胞の移動性が減少した。

【0114】

このような移動性の減少が、細胞の増殖に起因して発生するかを確認するために、同一培地を利用してＭＴＴ分析を進行した結果、各培地による細胞の増殖には変化がなかった（図６Ｂ）。

【0115】

したがって、アクチニン−４の発現は、ＡＫＴ−Ｓｎａｉｌ−ＭＭＰ−９増加またはＡＫＴ−ｓｎａｉｌ−Ｅ−カドヘリン抑制の機作を用いた細胞のＥＭＴ及び移動性を増加させる役目をする重要な癌マーカータンパク質であるものと確認された。

【0116】

〈実施例５〉アクチニン−４の過発現細胞でβ−カテニンの発現の調査
アクチニン−４の過発現細胞であるＭＤＣＫ細胞でβ−カテニンの発現を調査するために、ＭＤＣＫ細胞でアクチニン−４の過発現安定化細胞を製作した。このために、Ｆｌａｇ−ＡＣＴＮ４プラスミドをトランスフェクションした後、２週間Ｇ−４１８（４００μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）を処理することによって選別した。当該細胞でＲＩＰＡライシスを進行して、タンパク質を抽出した後、３０μｇのタンパク質を使用してウェスタンブロットでβ−カテニン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅｓ）とそのターゲット遺伝子であるビメンチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）の発現を確認した。それぞれの抗体は、１：３０００比率で確認した。

【0117】

驚くべきことに、アクチニン−４の過発現細胞であるＭＤＣＫ細胞でβ−カテニンの発現が増加し、β−カテニンのターゲットタンパク質であるビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎｅ）も増加した（図７Ａ）。

【0118】

β−カテニンの細胞における役目は、細胞の増殖を誘導することであり、β−カテニンは、通常、細胞−細胞間の結合に関与するＥ−カドヘリンに結合されて存在する。しかし、Ｅ−カドヘリンの減少は、β−カテニンの減少につながる。しかし、アクチニン−４の過発現細胞では、Ｅ−カドヘリンの発現が抑制されて消えるにもかかわらず、β−カテニンの発現は増加している。したがって、アクチニン−４の増加がβ−カテニンの安定化に関与するものと考えられ、ｓｉＲＮＡを利用してＥ−カドヘリンの発現を減少させるとき、アクチニン−４によってβ−カテニンの分解が抑制されるかを確認した。

【0119】

このために、ｓｉ−Ｅ−カドヘリン（ｏｌｉｇ ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＣＡＧＡＣＡＡＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＵＡ、Ｂｉｏｎｅｅｒ）を製作した。ＳｉＨａ細胞にｓｉ−Ｅ−カドヘリン（１００ｎＭ）とアクチニン−４（１μｇ）遺伝子をトランスフェクションしてＥ−カドヘリンの発現が抑制される場合、β−カテニンとビメンチンの発現量をウェスタンブロットを利用して確認した。各当該抗体は、１：３０００比率で使用した。

【0120】

図７Ｂに示されたように、Ｅ−カドヘリンが減少することによるβ−カテニンの減少がアクチニン−４の過発現によって抑制された。

【0121】

また、アクチニン−４によってβ−カテニンの分解が抑制されるかを確認するために、タンパク質合成抑制剤であるサイクロヘキサマイド（Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｅ、ＣＨＸ、４０μｇ／ｍＬ）を時間別（０−３６ｈ）に処理して、アクチニン−４の過発現による変化を確認した。ウェスタンブロットを利用してβ−カテニンとそのターゲットタンパク質であるｃ−ｍｙｃを確認した。各抗体は、１：３０００比率で使用した。

【0122】

その結果、アクチニン−４の過発現の場合、対照群（ｍｏｃｋ）に比べて分解がさらに遅延され、β−カテニンのターゲットタンパク質であるｃ−ｍｙｃ減少も、遅延された（図７Ｃ）。

【0123】

細胞内でβ−カテニンの分解は、プロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）によって起きる現象である。したがって、アクチニン−４がプロテオソーム分解による分解を抑制して、β−カテニンの安定化を誘導するかを確認するために、プロテオソーム抑制剤であるＡＬＬＮ（２０μＭ／ｍＬ、Ｃａｌｂｉｏｃａｍ）を６ｈ処理して、アクチニン−４によってβ−カテニンの分解が抑制されるかをウェスタンブロットを利用して確認した。

【0124】

また、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にアクチニン−４を濃度別（０、０．０５、０．１、０．２５及び０．５μｇ）に発現させた後、サイクリンＤ１（０．５μｇ、ＣＣＮＤ１）のプロモータールシフェラーゼ活性を測定した。

【0125】

その結果、アクチニン−４の過発現時にβ−カテニン（β−カテニン）のプロテオソーム分解が抑制され、さらに安定化されて、量が増加した（図８Ａ）。また、β−カテニンのターゲットタンパク質であるサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）の転写活性も、アクチニン−４の発現濃度別に増加した（図８Ｂ）。

【0126】

〈実施例６〉アクチニン−４発現抑制細胞及び過発現細胞の増殖の調査
β−カテニン及びそのターゲットタンパク質であるサイクリンＤ１の増加は、細胞の増殖を誘導するので、アクチニン−４の発現は、細胞増殖に関与するものと考えられ、ＨｅＬａとＳｉＨａのアクチニン−４発現抑制安定化細胞（ＨｅＬａ−ＫＤ、ＳｉＨａ−ＫＤ）の増殖をコロニー形成分析を利用して確認した。１２−ウェルプレートにそれぞれの細胞を３×１０^３数をシーディングして、５日間維持した後、コロニーが形成された数を確認した。また、アクチニン−４の過発現安定化細胞であるＭＥ−１８０−ＯＶ＃３細胞を利用して細胞増殖程度をコロニー形成実験を通じて確認した。このために、１２−ウェルプレートにそれぞれの細胞を３×１０^３数をシーディングして、５日間維持した後、コロニーが形成された数を確認した。コロニーの染色は、０．０５％クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）で２４時間染色後、蒸留水（ＤＷ）で洗浄した後、Ｎｉｋｏｎ ＣＯＯＬＰＩＸ Ｐ３００ ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｍｅｒａ（１２．２ Ｍｅｇａ−ｐｉｘｅｌ；Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で写真を撮った。

【0127】

その結果、アクチニン−４発現抑制細胞であるＨｅＬａとＳｉＨａ細胞の場合、コロニー形成が抑制されたが（図９Ａ及び図９Ｂ）、反対にアクチニン−４が過発現されたＭＥ−１８０細胞では、コロニー形成が増加した（図９Ｃ）。したがって、アクチニン−４の過発現は、細胞の増殖を増加させて、癌形成を誘導するものと考えられた。

【0128】

前記でアクチニン−４発現抑制細胞でコロニー形成分析を通じて細胞の増殖が減少し、子宮頸癌細胞であるＨｅＬａとＳｉＨａ−アクチニン−４発現抑制安定化細胞でアクチニン−４の細胞増殖関与可否を確認するために、ＭＴＴ分析を行った。このために、９６−ウェルプレートにＨｅＬａ及びＳｉＨａ発現抑制細胞それぞれ１×１０^４数をシーディングした後、時間別（１２−３６ｈ）に測定してグラフで示し、それぞれ３回ずつ実験を進行した。それぞれのウェルにＭＴＴ溶液１００μＬ（５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を６ｈ処理した後、反応を停止するために、１００ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を付加した。５９０ｎｍ波長でＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）を利用して測定した。

【0129】

図１０に示されたように、ＨｅＬａとＳｉＨａ細胞がいずれも対照群に比べて細胞成長が減少した。

【0130】

また、細胞の成長や増殖を確認できる実験として、プロピジウムイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、ＰＩ）染色分析がある。これは、細胞の分化過程を確認できる実験であって、Ｇ０、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期の細胞を区別して、その数を測定する方法である。前記結果のように、細胞の成長及び増殖が増加すれば、細胞の分裂が増加する場合、Ｓ期の細胞数が増加し、反対に増殖が減少する場合、Ｓ期の細胞数が減少する原理を利用した実験である。このために、ＨｅＬａとＳｉＨａの対照群細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）と発現抑制細胞（ＫＤ）を１００ｍｍディッシュに２×１０^６細胞をシーディングした後、細胞固定のために７０％エタノールに−２０℃で１時間固定作業を進行した。固定された細胞は、ＲＮａｓｅを含むプロピジウムイオダイド（Ｓｉｇｍａ）を５０μｇ／ｍＬの濃度で付加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。３０分後、当該細胞をＦＡＣＳａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）を利用して各細胞周期別に細胞数（％）を確認した。

【0131】

図１１のように、ＨｅＬａ及びＳｉＨａ細胞のアクチニン−４発現抑制細胞の場合、Ｓ期の比率が減少した。

【0132】

これから、アクチニン−４は、癌で誘導される細胞の成長を促進する役目をするものと判断される。

【0133】

〈実施例７〉アクチニン−４の発現抑制細胞を注射したマウスで腫瘍形成の調査
前記実施例６でアクチニン−４の過発現が細胞の成長を増加させるので、マウスモデルでこの効果を実験した。

【0134】

このために、アクチニン−４発現抑制細胞と対照群細胞を利用して実験用ヌードマウスで癌組織の形成有無を確認するために、ＳｉＨａ−対照群またはＳｉＨａ−ＫＤ（０．１ｍＬのＰＢＳで３×１０^６個の細胞数）細胞を皮下注射（Ｓ．Ｃ．）した。４週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を使用し、各細胞ごとに５匹ずつ使用した（ｎ＝５）。癌細胞を注射した後、マウスは、２２±２℃の温度及び５０±１０％の湿度で１２ ｈ ｌｉｇｈｔ／１２ ｈ ｄａｒｋを維持した。生成された癌のサイズの測定は、注射後、１〜２８日間デジタルカリパー（ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して毎日測定し、ボリュームは、Ｖ＝０．５×（ｗｉｄｔｈ^２×ｌｅｎｇｔｈ）で計算した。

【0135】

また、癌細胞注射２８日後、ＳｉＨａ−対照群とＳｉＨａ−発現抑制群のヌードマウスに形成された癌のサイズを、写真を撮って比較した。写真は、Ｎｉｋｏｎ ＣＯＯＬＰＩＸ Ｐ３００ ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｍｅｒａ（１２．２ Ｍｅｇａ−ｐｉｘｅｌ；Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用した。

【0136】

前記で形成された各群の癌組織を抽出してサイズを比較するために、写真を撮り、写真は、Ｎｉｋｏｎ ＣＯＯＬＰＩＸ Ｐ３００ ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｍｅｒａ（１２．２ Ｍｅｇａ−ｐｉｘｅｌ；Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用した。

【0137】

また、形成された癌のサイズ（ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｌｉｐｅｒ、Ｖ＝０．５×（ｗｉｄｔｈ^２×ｌｅｎｇｔｈ））と重さ（Ａｄｖｅｎｔｕｒｅｒ^ＴＭ、ＯＨＡＵＳ Ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）を測定し、癌細胞注射後、日付別に各マウス群の体重を比較した。

【0138】

アクチニン−４の発現が抑制されたＳｉＨａ細胞をマウスに注射して腫瘍形成を時間別に確認した結果、アクチニン−４発現抑制細胞が対照群細胞に比べて癌形成が抑制された（図１２Ａ）。また、注射２８日後に、マウスで生成された腫瘍形成を確認した結果、対照群に比べて、見られるサイズも小さかった（図１２Ｂ）。

【0139】

また、アクチニン−４の発現抑制細胞を注射したマウスで除去された腫瘍を比較した結果、対照群に比べてサイズが小さかった（図１３Ａ）。マウスから抽出された癌を比較した結果、アクチニン−４発現抑制細胞の場合、癌のサイズと重さが確実に減少した（図１３Ｂ）。しかし、癌細胞を注射したマウスの体重には変化がなかった（図１３Ｃ）。

【産業上の利用可能性】

【0140】

本発明は、子宮頸癌の診断用キット、予防または治療剤に使用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】