特許 6298295 タンパク質発現のための細胞培養培地及びプロセス、ＰＡＭインヒビターを含む前記培地及びプロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6298295

(24)【登録日】2018年3月2日

(45)【発行日】2018年3月20日

(54)【発明の名称】タンパク質発現のための細胞培養培地及びプロセス、ＰＡＭインヒビターを含む前記培地及びプロセス

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20180312BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180312BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20180312BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/071

   C12N15/00 A

   C12P21/00 C

【請求項の数】12

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2013-538186(P2013-538186)

(86)(22)【出願日】2011年11月9日

(65)【公表番号】特表2013-541963(P2013-541963A)

(43)【公表日】2013年11月21日

(86)【国際出願番号】EP2011069756

(87)【国際公開番号】WO2012062810

(87)【国際公開日】20120518

【審査請求日】2014年8月12日

【審判番号】不服2016-12763(P2016-12763/J1)

【審判請求日】2016年8月24日

(31)【優先権主張番号】10190532.1

(32)【優先日】2010年11月9日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】513113563

【氏名又は名称】サンド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】ゾンデレッガー コリンナ

(72)【発明者】

【氏名】シュムッツハルト ユリア

(72)【発明者】

【氏名】ヘール クリスティーネ

(72)【発明者】

【氏名】シュタングラー トーマス

【合議体】

【審判長】 田村 明照

【審判官】 福井 悟

【審判官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５２９４９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０８７２５３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，１９８６年，Ｖ２６１ Ｎ２６，Ｐ１１９３８−１１９４１

【文献】 ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＡＲＣＩＮＯＧＥＮＥＳＩＳ，２００４年１２月，Ｖ４１ Ｎ４，Ｐ２３１−２４６

【文献】 ＬＵＮＧ ＣＡＮＣＥＲ，１９９９年 ３月，Ｖ２３ Ｎ３，Ｐ２０９−２２２

【文献】 Ｎａｔｒｕｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００６， Ｖｏｌ．２４， Ｎｏ．１０， ｐｐ．１２４１−１２５２

【文献】 Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ２０１０．０９， Ｖｏｌ．２４， Ｎｏ．９， ｐｐ．１８０５−１８２１

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N 5/00

ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ （ＳＴＮ）

ＪＳＴｐｌｕｓ／ＪＭＥＤｐｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０ （ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチジルグリシンαアミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）インヒビターが細胞培養培地の１成分として使用される、タンパク質の異種発現のための細胞培養プロセスであって、そして、ＰＡＭインヒビターが、アミド化アミノ酸残基の形成量を減少させる、細胞培養プロセス。

【請求項2】

前記タンパク質が、抗体又はそのフラグメント、および融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質である、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

異種発現が、哺乳類細胞に基づいた発現系において生じる、請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

前記哺乳類細胞に基づいた発現系が、下記：
●仔ハムスター腎細胞株
●チャイニーズハムスター卵巣細胞株
●ネズミ骨髄腫細胞株
●マウス骨髄腫細胞株
●ヒト胎児腎細胞株
●ヒト網膜由来細胞株及び／又は
●羊膜細胞株
からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項３に記載のプロセス。

【請求項5】

前記哺乳類細胞に基づいた発現系が、下記：
●仔ハムスター腎細胞株がＢＨＫ２１であり、
●チャイニーズハムスター卵巣細胞株がＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ若しくはＣＨＯ−ｄｈｆｒ−であり、
●ネズミ骨髄腫細胞株がＳＰ２／０であり、
●マウス骨髄腫細胞株がＮＳ０であり、
●ヒト胎児腎細胞株がＨＥＫ−２９３であり、
●ヒト網膜由来細胞株がＰＥＲ−Ｃ６であり、及び／又は
●羊膜細胞株がＣＡＰである、請求項４に記載のプロセス。

【請求項6】

前記プロセスが、下記：
●振とうフラスコ
●Ｔ型フラスコ
●回転ビン
●バッグ
●バイオリアクター及び／又は
●撹拌フラスコ
からなる群より選択される少なくとも１つのバイオリアクター又は培養容器で生じる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項7】

ＰＡＭインヒビターがＣ末端プロリンアミド残基の形成量を減少するのに役立つ、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項8】

ＰＡＭインヒビターが、４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項9】

４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）が、≧０．０１μＭから≦３Ｍの濃度で使用される、請求項８に記載のプロセス。

【請求項10】

供給培地（ｆｅｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）およびＰＡＭインヒビターを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質の異種発現のための細胞培養プロセスに用い、アミド化アミノ酸残基の形成量を減少させるための細胞培養培地。

【請求項11】

ＰＡＭインヒビターが、４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）である、請求項１０に記載の細胞培養培地。

【請求項12】

４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）が、≧０．０１μＭから≦３Ｍの濃度である、請求項１１に記載の細胞培養培地。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＡＭインヒビター又はその生理学的同等物を含む細胞培養培地及びプロセスに関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質は主にそれらのアミノ酸配列（一次構造）により特徴決定されるが、翻訳後修飾のような他の側面もタンパク質の特徴に寄与し、二次、三次及び四次構造に影響を与える。これらの翻訳後修飾の幾つかは、バイオ医薬品の安全性及び効能を含む後のタンパク質活性に有意な役割を果たす。

【0003】

タンパク質の異質性の１つの主な側面は、例えば、アスパラギンのようなアミノ酸の脱アミド化により、糖化により又はピログルタミン酸へのＮ末端グルタミンのプロセシングにより形成される酸性変種、並びに例えばＣ末端リシン変種及びアミド化アミノ酸を有する、特にＣ末端プロリンアミド残基を有する塩基性変種を含む電荷パターンである。

【0004】

しかし、Ｃ末端プロリンアミド残基の形成は、幾つかの場合において、必要とされない。例えば、望ましくない異質性の供給源として又は前記変種がタンパク質活性若しくは免疫原性に潜在的に影響を与える場合又は産生されるべきタンパク質におけるアミド化アミノ酸、例えばプロリンアミノ酸の量が標準タンパク質よりも多い若しくは少ないとき、不必要である。

【0005】

高度に制御可能な物理化学的条件下で生成される小分子薬と対照的に、タンパク質、特にバイオ医薬として使用されるタンパク質の産生は、産生が生きている細胞培養系を使用するので、制御することが困難で極めて複雑である。したがって、一定の産物品質及び一貫した高収率を提供すること、産生プロセスの効率を増加すること、産生されるタンパク質の生理学的活性及び誘導される薬剤の安全性を増加する及び／又は微調整すること、並びに／或いは産生されたタンパク質の翻訳後特性を標準タンパク質と適合させることができるために、産生されるタンパク質の特に翻訳後修飾の制御を可能にする道具を手にすることが重要である。

【0006】

これらの必要性に対処するタンパク質発現のためのプロセス及び培地を提供することが、本発明の目的である。

【0007】

これらの目的は、本発明の独立クレームによる方法及び手段によって満たされる。従属クレームは好ましい実施態様に関連する。数値により範囲設定された値の範囲は、前記範囲設定値を含むと理解されるべきである。

【発明の概要】

【0008】

本発明を詳細に記載する前に、本発明は、記載された特定のデバイスの構成部分又は記載された方法の特定のプロセス工程に限定されないことが理解されるべきであり、それはそのようなデバイス及び方法が変わりうるからである。本明細書に使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のみであり、限定的であることを意図しないことも理解されるべきである。明細書及び添付の請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明白に示される場合を除いて、単数及び／又は複数対象を含むことに注意しなければならない。数値で範囲設定されたパラメーター範囲が提示される場合、範囲はこれらの限定値を含むと見なされることが、更に理解されるべきである。

【0009】

本発明の第１の態様によると、タンパク質を発現するための細胞培養培地が提供され、この培地はＰＡＭインヒビター又はその生理学的同等物を含む。本発明の別の態様によると、タンパク質を発現するための細胞培養プロセスが提供され、このプロセスにおいて、ＰＡＭインヒビター又はその生理学的同等物が使用される。

【0010】

ＰＡＭ（ペプチジルグリシンアルファアミド化モノオキシゲナーゼ）は、順番に作用してペプチドのＣ末端切断及びアルファアミド化を触媒する２つの酵素活性を含有する、多機能タンパク質である。ペプチジルグリシンアルファヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）は、反応の第１工程を触媒し、銅（Ｃｕ）又は銅イオン、アスコルビン酸塩及び分子酸素に依存する。亜鉛依存性ペプチジルアミド−グリコレートリアーゼ（ＰＡＬ）は、Ｃ末端プロリンになったものをアミド化してプロリンアミドにする反応の第２工程を触媒する。

【0011】

ＰＡＭインヒビターは、ＰＡＭ複合体の触媒速度を低下する物質である。Ｃｈｅｗ（２００３）は、ＰＡＭインヒビターが抗増殖薬（anti-proliferative drug）として有用でありうることを示唆しおり、一方、Ｂａｕｅｒら（２００７）は、幾つかのＰＡＭインヒビターが抗炎症効果を有することを示唆している。しかしこれまでのところ、細胞培養培地又はプロセス、特にタンパク質発現、とりわけ異種タンパク質の発現におけるＰＡＭインヒビターの使用は、記載されていない。

【0012】

ＰＡＭインヒビターの幾つかの例が下記のリストに記述されている：
●Ｓ−（チオベンゾイル）チオグリコール酸
●Ｎ−（フェニルチオアセチル）アラニン
●Ｓ−（４−メチルチオベンゾイル）チオグリコール酸
●４−シアノ−４−メチル−４−チオベンゾイル−スルファニル酪酸
●Ｓ−（４−メチルチオベンゾイル）チオグリコール酸エチルエスエル
●Ｓ−（Ｎ−フェニルチオカルバモイル）−３−メルカプトプロピオン酸
●Ｓ−（フェニルチオアセチル）チオグリコール酸
●Ｓ−（Ｎ−フェニルチオカルバモイル）チオグリコール酸
●Ｓ−（３−フェニルチオプロピオニル）チオグリコール酸
●Ｎ−グリコール酸フェニルウレタン
●（Ｄ，Ｌ）−チオルファン
●（フェニルチオ）酢酸
●（２−ニトロフェニルチオ）酢酸
●Ｓ−（チオラウロイル）チオグリコレート
●ジスルフィラム
●亜硫酸ナトリウム
●４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）
●チオプロニン
●カプトプリル
●ＥＤＴＡ
●亜硫酸アンモニウム
●ヒドロシンナモイル−フェニルアラニル−ホモシステイン

【0013】

上記に記述されたように、上記のＰＡＭインヒビターの生理学的同等物も本発明に包含される。

【0014】

本発明の好ましい実施態様において、前記発現は異種タンパク質発現である。

【0015】

本発明の別の好ましい実施態様において、前記異種発現は、哺乳類細胞に基づいた発現系において生じる。好ましくは、発現したタンパク質は、下記：
●抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、
●融合タンパク質及び／或いは
●非抗体タンパク質
からなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質である。

【0016】

好ましくは、本発明のプロセス及び培地は、以下のタンパク質の１つの全て又は一部と同一である又は実質的に類似しているアミノ酸配列を含むタンパク質の（組み換え）産生に適している：Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）のような赤血球生成促進タンパク質、ダルベポエチンアルファおよびトロンボポエチンを含むダルベポエチン、、カルシトニン、レプチン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−カッパＢ（ＲＡＮＫＬ）のレセプターアクチベーターのためのリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘発性リガンド（ＴＲＡＩＬ）、胸腺間質由来リンパ球新生因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、メガカリオーテ（megakaryote）増殖及び発生因子を含む増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン及びγ−インターフェロンを含むインターフェロン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１−５）、ニューロトロフィン−３”グルカゴン、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７及びＩＬ−１８を含むインターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン−ｐ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病抑制因子、オンコスタチン−Ｍ、並びに細胞表面分子ＥＬＫ及びＨｅＫのための多様なリガンド（例えば、ｅｐｈ関連キナーゼ又はＬＥＲＫＳのリガンド）。

【0017】

本発明のプロセス及び培地を使用して産生することができる更なるタンパク質には、上記に記述されたタンパク質のいずれかのレセプターのアミノ酸配列の全て又は一部を含むタンパク質、そのような上記に記述されたタンパク質のいずれかのレセプターのアンタゴニスト及びそのようなレセプター又はアンタゴニストに実質的に類似しているタンパク質が含まれる。

【0018】

また、本発明の方法及び培地を使用して産生することができるタンパク質には、分化抗原のアミノ酸配列の全て若しくは一部を含むタンパク質（ＣＤタンパク質と呼ばれる）又はこれらのリガンド、或いはこれらのどちらかに実質的に類似しているタンパク質が含まれる。そのような抗原の例は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０及びこれらのリガンドを含む分化抗原である。

【0019】

酵素的に活性なタンパク質又はこれらのリガンドも、本発明のプロセス及び培地を使用して産生することができる。例には、以下のタンパク質の１つの全て若しくは一部を含むタンパク質又はこれらのリガンド、或いはこれらのうちの一方に実質的に類似しているタンパク質が含まれる：メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーメンバー、キナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−１、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、アルファ−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−アルファ変換酵素、上記に記述された酵素のいずれかのリガンド及び多数の他の酵素、並びにこれらのリガンド。

【0020】

本発明の方法及び培地は、また、特定の標的タンパク質に結合し、その活性を修飾するインビトロで選択されるキメラタンパク質、抗体又はその一部、キメラ抗体、すなわち１つ以上のネズミ可変部抗体免疫グロブリンドメインと結合しているヒト定常部抗体免疫グロブリンドメインを有する抗体、そのフラグメント又は実質的に類似しているタンパク質を産生するために使用することができる。本発明のプロセスを使用して、抗体及び細胞毒性又は発光性物質を含む複合体を産生することもできる。本発明の方法及び培地を使用して産生することができる抗体、インビトロ選択キメラタンパク質又は抗体／細胞毒素若しくは抗体／発光団複合体の例には、上記に記述されたタンパク質及び／又は以下の抗原のいずれかが含まれるが、これらに限定されないタンパク質のいずれか１つ又は組み合わせを認識するものが含まれる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３，ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−４レセプター、ＩＬ−６レセプター、ＩＬ−１３レセプター、ＩＬ−１８レセプターサブユニット、ＰＤＧＦ−β及びこれらの類似体、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−ｐ１、ＥＧＦレセプターＶＥＧＦレセプター、肝細胞増殖因子、オステオプロテゲリンリガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子、補体Ｃ５、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ−２、患者の血清中に高レベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳房、結腸、扁平上皮、前立腺、膵臓、肺及び／若しくは腎臓の癌細胞において、並びに／又は黒色腫、神経膠腫若しくは神経芽細胞腫の細胞において発現する癌関連エピトープ又はタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬレセプター１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、分子間接着分子３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン（leukointegrin）アドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心筋ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、Ｆｃ−ｙ−１レセプター、ＨＬＡ−ＤＲ１０ベータ、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、並びにＩＦＮ−γ。

【0021】

本発明のプロセス及び培地を使用して、上記に記述されたタンパク質又は実質的に類似しているタンパク質のいずれかを含む組み換え融合タンパク質を産生することもできる。例えば、上記に記述されたタンパク質の１つと、ロイシンジッパー、コイルドコイル、抗体のＦｃ部分又は実質的に類似しているタンパク質のようなmultimerisation domainを含む組み換え融合タンパク質は、本発明の方法及び培地を使用して産生することができる。そのような組み換え融合タンパク質のうちで特に含まれるものは、ＴＮＦＲ又はＲＡＮＫの少なくとも一部が抗体のＦｃ部分と融合しているタンパク質である。

【0022】

別の好ましい実施態様において、前記哺乳類細胞に基づいた発現系は、下記：
●仔ハムスター腎細胞株（例えば、ＢＨＫ２１）
●チャイニーズハムスター卵巣細胞株（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ若しくはＣＨＯ−ｄｈｆｒ^-）
●ネズミ骨髄腫細胞株（例えば、ＳＰ２／０）
●マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳ０）
●ヒト胎児腎細胞株（例えば、ＨＥＫ−２９３）
●ヒト網膜由来細胞株（例えば、ＰＥＲ−Ｃ６）及び／又は
●羊膜細胞株（例えば、ＣＡＰ）
からなる群より選択される少なくとも１つである。

【0023】

好ましくは、ハムスター細胞に基づいた発現系が使用される。ＢＨＫ２１（「仔ハムスター腎臓」）細胞は、新生ハムスター腎臓組織の異常に急速に増殖している初代培養のクローンの子孫であるシリアンハムスター細胞の準二倍体樹立株に属する。市販されており、本発明の文脈に使用することができるＢＨＫ−２１細胞株の非限定例は、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）；ＢＨＫ２１−ｐｃＤＮＡ３．１−ＨＣ；ＢＨＫ５７０；Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＢＨＫ細胞株；及び／又はＢＨＫ ２１（クローン１３）ハムスター細胞株である。

【0024】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞株である。これらは、多くの場合、生物学的及び医学的な研究に使用され、治療タンパク質の産生において商業的に使用されている。これらは１９６０年代に導入され、当初は単層培養で増殖された。現在は、ＣＨＯ細胞は、組み換えタンパク質治療薬の産業生産に最も一般的に使用される哺乳類宿主であり、通常は懸濁培養で増殖される。

【0025】

市販されており、本明細書の文脈で使用することができるＣＨＯ細胞株の非限定例は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＥＲ−ＣＨＯ細胞株；ＣＨＯ １−１５ ５００ ＣＨＩＮＥＳＥ ＨＡＭ；ＣＨＯ−ＤＸＢ、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ ＤＰ−１２クローン番号１９３４；ＣＨＯ−ＣＤ３６；ＣＨＯ−ＩＣＡＭ−１；ＣＨＯ−Ｋ１；Ｏｖａｒｙ；ＨｕＺＰ３−ＣＨＯＬｅｃ３．２．８．１；ｘｒｓ５；ＣＨＯ−Ｋ１／ＢＢ２細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＢＢ３細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＥＤＧ８／Ｇａｌｐｈａ１５細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／Ｍ５細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＮＫ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＮＫ３細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＮＭＵＲ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＮＴＳＲ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＯＸ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＰＡＣ１／Ｇα１５細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＰＴＡＦＲ細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／ＴＲＨ１細胞；ＣＨＯ−Ｋ１／Ｖ１Ｂ細胞；５ＨＴ１Ａ Ｇａｌｐｈａ−１５−ＮＦＡＴ−ＢＬＡ ＣＨＯ−Ｋ１細胞株；ＡＶＰＲ２ ＣＲＥ−ＢＬＡ ＣＨＯ−Ｋ１細胞株；ＣＨＯ−Ｓ細胞ＳＦＭ適応；ＤＧ４４細胞；Ｆｌｐ−Ｉｎ−ＣＨＯ細胞株；ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ−ＣＨＯ細胞株；ＮＦＡＴ−ｂｌａ ＣＨＯ−Ｋ１細胞株；Ｔ−ＲＥｘ−ＣＨＯ細胞株；ＧｅｎｏＳｔａｔ ＣＨＯ Ｋ−１安定細胞株；ＧｅｎｏＳｔａｔ ＣＨＯ Ｋ−１安定細胞株キット；ＣＨＯ−Ｋ１細胞株ハムスター、ＣＨＯ−ＰＥＰＴ１細胞株である。特に好ましい実施態様において、ハムスター細胞に基づいた発現系はＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞株である。

【0026】

別の好ましい実施態様において、前記プロセスは、下記：
●振とうフラスコ
●Ｔ型フラスコ
●バッグ
●回転ビン
●バイオリアクター及び／又は
●撹拌フラスコ
からなる群より選択される少なくとも１つのバイオリアクター又は培養容器において生じる。

【0027】

好ましくは、前記バイオリアクター又は培養容器は、５０ｍｌ〜４００００ｌの容積を有することができる。標準的なバイオリアクター又は培養容器のサイズの例は、５０ｍｌ（例えば、振とうフラスコ又はＴ型フラスコ）、５００ｍｌ、２ｌ、５ｌ、１５ｌ、１００ｌ及び３００ｌ（例えば、バイオリアクター又はバッグ）、並びに１０００ｌ、２０００ｌ、５０００ｌ、１００００ｌ、２５０００ｌ及び４００００ｌ（大型バイオリアクター）である。

【0028】

別の好ましい実施態様において、細胞の培養は接着培養、例えば単層培養で実施される。なお別の好ましい実施態様によると、細胞の培養は懸濁培養において行うこともできる。

【0029】

連続及び非連続細胞培養プロセスを本発明に利用することができる。他の既知の反応器技術、例えば灌流技術などを利用することもできる。バッチプロセス及び流加プロセスが特に好ましい実施態様である。

【0030】

ＰＡＭインヒビターがアミド化アミノ酸残基、特にＣ末端プロリンアミド残基の形成に影響を与えるのに役立つことが、特に好ましい。

【0031】

ほとんどの場合において、産生されるタンパク質のアミノ酸鎖毎のアミド化アミノ酸残基量を、＜１％まで低減させることが望ましい。

【0032】

本発明の特に好ましい実施態様において、ＰＡＭインヒビターは４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）又はその生理学的同等物である。

【0033】

ＰＢＡ（トランス−スチリル酢酸又は４−ＰＢＡとしても知られている）は、とりわけ、放線菌のストレプトマイセスコヤンゲンシス（Streptomyces koyangensis）により産生される作用物質であり、抗炎症性及び抗真菌性効果を有することが報告されている。更に、血管拡張を抑制すると思われる。

【0034】

本発明の文脈において、ＰＢＡはＣ末端グリシン残基の切断を抑制すると思われ、すなわち、ＰＡＭ複合体の１つの酵素であるペプチジルグリシンアルファヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）のインヒビターである。

【0035】

全く驚くべきことに、本発明の発明者たちは、ＰＡＭインヒビター、すなわち４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）を、細胞培養プロセス、タンパク質発現プロセス、細胞培養培地及び／又はタンパク質発現培地において単独で又は１つ以上の他の作用物質と組み合わせて使用して、アミド化アミノ酸残基、特にＣ末端プロリンアミドの量を用量依存的に制御及び／又は調整できることを初めて示した。これらの所見を支持するデータが本明細書において、例えば図１、図２及び図３、並びに対応する記載により開示されている。

【0036】

好ましくは、４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）又はその生理学的同等物は、≧０．０１μＭから≦３００μＭ（＝μＭｏｌ ｌ^-1）の濃度で使用される。より好ましくは、前記濃度範囲は≧５μＭ〜≦２００μＭ、さらにより好ましくは≧１０μＭ〜≦１５０μＭ、最も好ましくは≧４５μＭ〜≦１１０μＭである。他のＰＡＭインヒビター又はその生理学的同等物には、他の濃度範囲が当てはまることがある。

【0037】

供給液（「ショット（shot）液」とも呼ばれる）では、濃度は細胞培養培地又は細胞培養液よりも有意に高くなる、例えば３Ｍ（＝Ｍｏｌ ｌ^-1）までになりうることに留意するべきである。

【0038】

細胞集団と比較したとき、４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）又はその生理学的同等物を、細胞集団の≧０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇから細胞集団の≦１ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度で使用することができる。より好ましくは、前記濃度範囲は、細胞集団の≧０．０３ｍｍｏｌ／ｋｇから細胞集団の≦０．５ｍｍｏｌ／ｋｇである。

【0039】

供給液（「ショット液」とも呼ばれる）では、濃度は細胞培養培地又は細胞培養液よりも有意に高くなりうる、すなわち、供給液の≧０．１から≦１０ｍｍｏｌ／ｋｇ、好ましくは供給液の≧０．４から≦５ｍｍｏｌ／ｋｇになりうることに留意するべきである。

【0040】

以下の表は、ＰＢＡが５つの異なる治療タンパク質の産生においてどのように実験的に適用されたかを示す。

【0041】

【表1】

【0042】

ＰＡＭインヒビター又はその生理学的同等物を、細胞培養プロセスの開始時に培地に添加することができる。あるいは、ＰＡＭインヒビター又はその生理学的同等物を、細胞培養プロセスの際に、例えば供給培地（「供給液」又は「ショット液」とも呼ばれる）の成分として補充することができる。

【0043】

そのような細胞培養プロセルにより得られるタンパク質を、医薬調合剤の調製に使用することができる。加えて、そのような細胞培養プロセルにより得られるタンパク質を、薬学的に許容される界面活性剤、添加剤、担体、希釈剤及びビヒクルのような生物学的活性剤の他の成分と一緒に投与することができる。

【0044】

定義
用語「ＰＡＭインヒビター」は、本明細書で使用されるとき、ＰＡＭ酵素複合体の触媒速度を低下させる作用物質に関する。したがって前記ＰＡＭインヒビターは、ＰＡＭ酵素複合体それ自体に影響を与えること又はＣ末端グリシン残基を切断することに関わるペプチジルグリシンアルファヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）若しくは実際のアミド化反応に関わるペプチジルアミド−グリコレートリアーゼ（ＰＡＬ）に影響を与えることができる。

【0045】

本明細書で使用されるとき、用語「ＰＡＭインヒビターの生理学的同等物」は、生理学的設定（例えば、細胞培養液）において前記ＰＡＭインヒビターと同じ潜在的効果を有する化学ＰＡＭインヒビター誘導体に関する。例えば前記同等物は、培地において溶解して又は遍在性エステラーゼにより加水分解されて実際のＰＡＭインヒビターを形成する前記ＰＡＭインヒビターの（化学的に適切なときには）塩又はエステルである。

【0046】

用語「医薬調合剤」は、本明細書で使用されるとき、哺乳動物、特にヒトへの投与に適した又は適合された組成物を示す。

【0047】

用語「融合ペプチド」と本明細書において同義的に使用される、用語「融合タンパク質」に関しては、初めは別々のタンパク質をコードしている２つ以上の遺伝子を結合することによって作り出されるタンパク質が意味される。この融合遺伝子の翻訳は、元々のタンパク質それぞれから誘導される機能性を有する単一のポリペプチドをもたらす。この用語の意味は、キメラ及びヒト化抗体、並びに例えばレセプタードメイン及びＩｇＧ Ｆｃセグメントからなる作成物を包含する。

【0048】

本明細書で使用されるとき、用語「異種タンパク質発現」又は「異種タンパク質」は、発現系、例えば宿主により天然に産生されないタンパク質及びペプチドの両方を意味する。後者は、前記異種タンパク質を発現するために、遺伝子的に修飾される必要がある。

【0049】

本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化（camelized）抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、免疫学的に活性な抗体フラグメント（例えば、エピトープに結合することができる抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆｖフラグメント、ＶＬ若しくはＶＨドメイン又は抗原に免疫特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれかを含有するフラグメントなど）、二機能性又は多機能性抗体、ジスルフィド結合二特異性Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体（intrabodies）及び二重特異性抗体（diabodies）、並びに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを意味する。特に、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、すなわち抗原結合部位を含有する分子を包含することが意図される。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_bＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄、ＩｇＡｉ及びＩｇＡ₂）又はサブクラスのものでありうる。

【0050】

本明細書で使用されるとき、用語「非抗体タンパク質」は、抗体ではない、生理学的に活性なタンパク質に関する。そのような定義は、とりわけ、インスリン、ソマトロピン、エリスロポエチン、インターフェロンアルファ若しくはＧ−ＣＳＦ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、第ＶＩＩＩ因子及び／又はインターロイキン２、或いはこれらのフラグメント又は誘導体を包含する。

【0051】

本明細書で使用されるとき、用語「抗体のフラグメント」は、幾つかの場合において特定の抗体特性、例えば標的結合能力を保持するそのような抗体のフラグメントを意味する。そのようなフラグメントの例は、下記：
●ＣＤＲ（相補性決定領域）
●超可変部領域
●可変部ドメイン（Ｆｖ）
●ＩｇＧ重鎖（ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域からなる）
●ＩｇＧ軽鎖（ＶＬ及びＣＬ領域からなる）、並びに／又は
●Ｆａｂ及び／若しくはＦ（ａｂ）２
である。

【0052】

本明細書で使用されるとき、用語「抗体の誘導体」は、一般的な抗体の概念と構造的に異なるが依然として幾つかの構造的な関係を有し、幾つかの機能的特性を保持するタンパク質作成物、例えばｓｃＦｖ、また、二、三又はそれ以上の特異性の抗体作成物、ペグ化抗体作成物などを意味する。

【0053】

同様の概念が、本発明の意味において「タンパク質のフラグメント又は誘導体」に当てはまる。

【0054】

本明細書で使用されるとき、用語「細胞培養培地」は、細胞を培養する文脈において使用される全ての種類の培地を意味する。典型的には、細胞培養培地は、アミノ酸、エネルギー供給源として少なくとも１つの炭水化物、微量元素、ビタミン、塩及び可能であれば追加の成分を（例えば、細胞増殖及び／又は生産性及び／又は産物の品質に影響を及ぼすために）含む。

【0055】

本明細書で使用されるとき、用語「供給」、「供給培地」又は「供給液」は、通常、細胞増殖及び／又は生産性及び／又は産物の品質に影響を及ぼすためにプロセスの際に細胞培養に補充として添加される、ある種の細胞培養培地又は特定の成分の溶液を意味する。

【0056】

本明細書で使用されるとき、用語「細胞培養液」は、細胞が培養される実際の液体を意味する。これは、前記液が、上記の定義による細胞培養培地又は供給と対照的に、細胞により産生される代謝産物、細胞片、細胞タンパク質（例えば、酵素若しくは組み換えタンパク質）及び／又は前記ＰＡＭインヒビターの分解産物を含有しうること、並びにその栄養分が更に低減されうることを意味する。

【0057】

本明細書で使用されるとき、用語「アミド化アミノ酸残基の量」は、タンパク質のＣ末端でのタンパク質発現の際又は後に形成されたアミド化アミノ酸残基に関する。これは、特にアミド化プロリンの量に関する。特定の状況下では、タンパク質のプロリン残基を翻訳後にアミド化することができ、例えばプロリンアミド（Ｐｒｏ−ＮＨ₂）の形成をもたらす。このことは、幾つかの場合において、例えば産生されるべきタンパク質におけるプロリンアミドの量が標準タンパク質よりも多い又は少ない場合に望ましくない。

【0058】

ＰＡＭ酵素複合体により影響を受けたプロリンアミド化は、翻訳タンパク質のＰｒｏとＲの間のＣ末端ペプチド結合の加水分解及び酸化に基本的に依存しており、ここでＲは、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基、例えばＧｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ若しくはＰｈｅ又はＧｌｙ−Ｌｙｓでありうる。反応は、ほとんどの場合、ＰＡＭ酵素複合体（上記を参照すること）により触媒される。発現宿主及びタンパク質発現条件に応じて、少なくとも１つの翻訳後Ｐｒｏ−ＮＨ₂を担持する翻訳タンパク質の共有は、≧０〜≦１００％の範囲でありうる。前記のアミド化は、タンパク質ｐＨの上昇をもたらし、したがって塩基性変種である。

【0059】

モノクローナル抗体又はこれらの誘導体において、プロリンアミド（ＰＡ）は、典型的には、Ｃ末端リシン及びグリシンの翻訳後除去により、並びにＣ末端プロリン残基になったものの、例えばタンパク質の重鎖でのアミド化により作り出される。

【0060】

プロリンアミド化は、多様なタンパク質、例えばカルシトニンの機能にとって重要である。ｍＡｂｓにおけるその機能は、今までのところ知られていない。

【0061】

プロリンアミドの量は、電荷、疎水性又は質量のような物理化学的な差によりアミド化変種を非アミド化のものと区別する多様な分析方法により、同定及び定量化することができる。最も一般的な方法は、プロリンアミド化による電荷変更を利用するＣＥＸ−ＣＰＢ法（カルボキシペプチダーゼＢによる消化後のカチオン交換クロマトグラフィー）のようなイオン交換クロマトグラフィーである。抗体では、プロリンアミド変種とリシン変種の共溶出は、クロマトグラフィー分離の前にカルボキシペプチダーゼＢの消化を使用してリシン残基を除去することによって回避される。しかし、他の塩基性変種との追加的な共溶出が、数パーセント（例えば４％）の定量化バックグラウンドでもたらされうる。プロリンアミド変種とバックグラウンドは、１つのＣ末端リシン残基を有する抗体変種のクロマトグラフィー位置で溶出するので「Pseudo１Ｋ」と呼ばれる。「Pseudo２Ｋ」は、２つのＣ末端リシン残基を有する抗体変種のクロマトグラフィー位置で溶出する、プロリン変種とバックグラウンドを包含する。ＣＥＸ法との差（すなわち、ＣＰＢ消化によるリシン除去のないＣＥＸ）は、「リアル１Ｋ」及び「リアル２Ｋ］と呼ばれる、リシン残基を有する抗体変種の量を示している。ＣＥＸ（−ＣＰＢ）による定量化は、溶液中の全ての抗体分子に対してプロリンアミド化抗体の率を戻す。アミド化プロリン変種を明白に同定及び定量化することができる分析試験方法は、ＵＶ（紫外線）又はＭＳ（質量分析）検出を使用する、いわゆるペプチドマッピングである、エンドペプチダーゼ（例えば、ＬｙｓＣ、トリプシン）消化タンパク質のＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）である。ＲＰ−ＨＰＬＣペプチドマッピングによる定量化は、抗体において、全ての重鎖に対するプロリンアミド化重鎖の率を戻す。

【0062】

「Pseudo１Ｋ」は、抗体（ＩｇＧ）の２つの重鎖の１つがそのＣ末端にプロリンアミドを有する、ＣＥＸ−ＣＰＢにより決定された変種である。「Pseudo２Ｋ］は、モノクローナル抗体の両方の重鎖がそれらのＣ末端にプロリンアミドを有する、ＣＥＸ−ＣＰＢにより決定された変種である。

【0063】

本明細書で使用されるとき、所定の作用物質の「濃度」という用語は、細胞培養培地（例えば、細胞培養培地若しくは供給培地若しくは供給液）における又は細胞培養液における濃度に関する。

【0064】

免責条項
明細書を過度に長くすることなく包括的な開示を提供するため、出願者は、上記に参照された特許及び特許出願をそれぞれ参照として本明細書に組み込む。

【0065】

上記に詳述された実施態様の要素及び特性の特定の組み合わせは、例示のためのみであり、本明細書及び参照として組み込まれる特許／出願における他の教示によるこれらの教示の交換又は置換も、明確に考慮される。当業者には認識されるように、本明細書に記載されたものの変形、変更及び他の実施が、主張される発明の精神及び範囲を逸脱することなく当業者によって生じうる。したがって、前記の記載は、例としてのみであり、限定的であることを意図しない。本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲及びその同等物において定義される。更に、記載及び特許請求の範囲に使用される参照符号は、主張される発明の範囲を限定しない。

【0066】

本発明の目的の追加的な詳細、特性、特徴及び利点は、下位クレームにおいて、並びに例示的な様式で本発明の好ましい実施態様を示す対応する図及び実施例の以下の記載において開示されている。しかし、これらの図は、本発明の範囲を限定するものとしていかようにも理解されるべきではない。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0067】

実験：アミノ酸アミド化／プロリンアミド形成に対するＰＡＭインヒビターの効果
これらの実験において、本発明者たちは、潜在的な培地成分として、公表されたＰＡＭインヒビターに注目した。これらのうちスクリーニングした成分は、すなわち、亜硫酸ナトリウム、チオプロニン、カプトプリル、ＥＤＴＡ、亜硫酸アンモニウム、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、アンモニウムメタチオモリブデート、Ｌ−カルノシン、ペニシラミン、４−フェニル−３−ブテン酸（ＰＢＡ）である。

【0068】

２つの組み換えタンパク質を使用して、アミノ酸アミド化／プロリンアミド形成に対するＰＡＭインヒビター、すなわちモノクローナル抗体（ヒトマウスキメラＩｇＧ）及びＦｃ融合タンパク質の効果を調査した。ＣＨＯ細胞を発現系として使用した。

【0069】

ＰＢＡは、プロリンアミド形成に対して最強の効果を有するが、増殖又は他の産物品質の特性値に有意に影響を与えないことを示した。

【0070】

これらの結果に基づいて、本発明者たちは、細胞培養培地の組成をＰＢＡ（例えば、１００μＭ）の添加により適合させることができると結論付けた。別の手法では、ＰＢＡを、培地のみならず供給液にも補充することができる。例えば、培養をＰＢＡなしで又は少量のＰＢＡで開始し、、細胞培養がピーク細胞密度に達した後に、追加のＰＢＡを、主な量の組み換えタンパク質が産生される前に加えることができる。このことは、増殖相のときに既に存在する最終量のＰＢＡを有することに比べ、採取時での高いピーク細胞密度及び高い産物滴定量をもたらす。

【図面の簡単な説明】

【0071】

【図1】ＣＨＯ細胞に発現されたモノクローナル抗体（キメラＩｇＧ）におけるＣＥＸ−ＣＰＢ分析により「Pseudo１Ｋ」と定量化されたプロリンアミド（ＰＡ）形成に対するＰＡＭインヒビターの影響。ＰＢＡは、細胞培養に補充されたときにプロリンアミド形成に最強の効果を有することを示し、細胞培養培地の１０μＭ又は１００μＭの濃度は、Pseudo１Ｋの量をおよそ１０％からおよそ８％又はおよそ５％にそれぞれ減少した。ＣＥＸ−ＣＰＢによるPseudo１Ｋの５％は、ペプチドマッピングにより確認すると、重鎖１つあたり０〜２％のプロリンアミドに相当する。

【図2】ペプチドマッピングにより定量化された、ＣＨＯ細胞に発現したＦｃ融合タンパク質におけるプロリンアミド形成に対するＰＡＭインヒビターＰＢＡの影響。組み換えＣＨＯ細胞の培養に１００μＭまでの多様な濃度のＰＢＡを補充すると、プロリンアミドの量を用量依存性効果曲線でおよそ２％（ＰＢＡなし）からおよそ０．１％（１００μＭのＰＢＡ）（重鎖毎の％）に減少した。

【図3】ペプチドマッピングにより定量化された、ＣＨＯ細胞に発現したＦｃ融合タンパク質におけるプロリンアミド形成に対するＰＡＭインヒビターＰＢＡの影響。組み換えＣＨＯ細胞の培養に５０μＭ又は１００μＭのＰＢＡを補充すると、プロリンアミドの減少をそれぞれ＞４％〜＜１％及び＜０．５％（重鎖毎の％）でもたらした。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0072】

【非特許文献1】Ｃｈｅｗ，Ｇ：癌の抗増殖薬としてのペプチジルグリシンアミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）の基質に基づいたインヒビター。（Substrate-Based Inhibitors of Peptidylglycine Amidating Monooxygenase (PAM) as Anti-Proliferative Drugs for Cancer.）修士論文（南フロリダ大学），２００３年

【非特許文献2】Ｂａｕｅｒら（２００７年）：４−フェニル−３−ブテン酸及び５−（アセチルアミノ）−４−オキソ−６−フェニル−２−ヘキセン酸メチルエスエルの抗炎症性効果、ニューロペプチド生体内活性化の潜在的なインヒビター（Anti-Inflammatory Effects of 4-Phenyl-3-butenoic Acid and 5-(Acetylamino)-4-oxo-6-phenyl-2-hexenoic Acid Methyl Ester, Potential Inhibitors of Neuropeptide Bioactivation）薬理学及び実験治療学ジャーナル（J Pharmacol Exp Ther）２００７年３月 ３２０：１１７１〜１１７７

【図1】

【図2】

【図3】