特許 6302310 高純度オメガ３系脂肪酸エチルエステルの生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6302310

(24)【登録日】2018年3月9日

(45)【発行日】2018年3月28日

(54)【発明の名称】高純度オメガ３系脂肪酸エチルエステルの生産方法

(51)【国際特許分類】

   C11C 3/04 20060101AFI20180319BHJP

   C11C 3/10 20060101ALI20180319BHJP

   C11B 3/12 20060101ALI20180319BHJP

   C11B 3/10 20060101ALI20180319BHJP

   C11B 3/02 20060101ALI20180319BHJP

   C11B 5/00 20060101ALI20180319BHJP

   C12P 7/64 20060101ALI20180319BHJP

   A61K 31/232 20060101ALN20180319BHJP

   A61P 9/10 20060101ALN20180319BHJP

   A61P 3/06 20060101ALN20180319BHJP

【ＦＩ】

   C11C3/04

   C11C3/10

   C11B3/12

   C11B3/10

   C11B3/02

   C11B5/00

   C12P7/64

   !A61K31/232

   !A61P9/10 101

   !A61P3/06

【請求項の数】21

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2014-58816(P2014-58816)

(22)【出願日】2014年3月20日

(65)【公開番号】特開2015-63653(P2015-63653A)

(43)【公開日】2015年4月9日

【審査請求日】2017年2月8日

(31)【優先権主張番号】特願2013-179769(P2013-179769)

(32)【優先日】2013年8月30日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】391007356

【氏名又は名称】備前化成株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】清水 芳雄

(72)【発明者】

【氏名】瓜生 圭介

(72)【発明者】

【氏名】平 哲郎

(72)【発明者】

【氏名】藤井 淳

【審査官】 井上 恵理

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０２−０２５４４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３２４１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／０１７１０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−０５５８９３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１１Ｂ １／００−１５／００

Ｃ１１Ｃ １／００− ５／０２

Ｃ１０Ｌ １／００− １／３２

Ａ２３Ｄ ７／００− ９／０６

Ｃ０７Ｃ６７／６０

Ｃ１２Ｐ ７／６４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸を含む原料油脂からエイコサペンタエン酸エチルエステルおよびドコサヘキサエン酸エチルエステルを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）原料油脂を、脂肪酸をエチルエステル化する条件下で脂質分解酵素によって処理する工程；
（ｂ）工程（ａ）の処理物を、グリセリド画分とエチルエステル化した遊離脂肪酸画分に分画する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたグリセリド画分を、エチルエステル化する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られたエチルエステル化したグリセリド画分を精製して、
（１）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より少なく含む画分と、
（２）エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より少なく含む画分に分画する工程；
（ｅ）工程（ｂ）で得られたエチルエステル化した遊離脂肪酸画分を精製して、
（３）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｂ）のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｂ）のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より少なく含む画分と、
（４）エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｂ）のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｂ）のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より少なく含む画分に分画する工程；
（ｆ）工程（ｄ）の（１）の画分と工程（ｅ）の（３）の画分を混合する工程；
（ｇ）工程（ｄ）の（２）の画分と工程（ｅ）の（４）の画分を混合する工程；
（ｈ）工程（ｆ）の混合物をさらに精製して、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
（ｉ）工程（ｇ）の混合物をさらに精製して、エイコサペンタエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
を包含する方法。

【請求項2】

エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸を含む原料油脂からエイコサペンタエン酸エチルエステルおよびドコサヘキサエン酸エチルエステルを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）原料油脂を、脂質分解酵素によって処理する工程；
（ｂ）工程（ａ）の処理物を、グリセリド画分と遊離脂肪酸画分に分画する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたグリセリド画分および遊離脂肪酸画分のそれぞれを、エチルエステル化する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られたエチルエステル化したグリセリド画分を精製して、
（１）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より少なく含む画分と、
（２）エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より少なく含む画分に分画する工程；
（ｅ）工程（ｃ）で得られたエチルエステル化した遊離脂肪酸画分を精製して、
（３）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物より少なく含む画分と、
（４）エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物より少なく含む画分に分画する工程；
（ｆ）工程（ｄ）の（１）の画分と工程（ｅ）の（３）の画分を混合する工程；
（ｇ）工程（ｄ）の（２）の画分と工程（ｅ）の（４）の画分を混合する工程；
（ｈ）工程（ｆ）の混合物をさらに精製して、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
（ｉ）工程（ｇ）の混合物をさらに精製して、エイコサペンタエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
を包含する方法。

【請求項3】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記原料油脂が脱酸処理された原料油脂である、方法。

【請求項4】

請求項３に記載の方法であって、ここで、前記脱酸処理された原料油脂の酸価が３以下である、方法。

【請求項5】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記原料油脂が４ｗｔ％以上のエイコサペンタエン酸および４ｗｔ％以上のドコサヘキサエン酸を含む、方法。

【請求項6】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記脂質分解酵素がトリグリセリドの１位及び３位を選択的に加水分解する微生物由来リパーゼである、方法。

【請求項7】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）の分画が、流下薄膜式分子蒸留法、遠心式分子蒸留法、および、溶出法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。

【請求項8】

請求項７に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）の分画が溶出法によって行われ、ここで、ヘキサンによる溶出液がエチルエステル化遊離脂肪酸画分として回収され、そして、ジエチルエーテルによる溶出液がグリセリド画分として回収される、方法。

【請求項9】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化が、アルカリ触媒法又は酵素法によって行われる、方法。

【請求項10】

請求項２に記載の方法であって、ここで、工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化が、酸触媒法又は酵素法によって行われる、方法。

【請求項11】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、工程（ｄ）の精製が、真空精密蒸留法、尿素附加法、硝酸銀錯体法、固定層クロマトグラフィー法、および、ＳＭＢクロマトグラフィー法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。

【請求項12】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）の精製が、真空精密蒸留法、尿素附加法、硝酸銀錯体法、固定層クロマトグラフィー法、および、ＳＭＢクロマトグラフィー法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。

【請求項13】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、工程（ｈ）の精製が、真空精密蒸留法、尿素附加法、硝酸銀錯体法、固定層クロマトグラフィー法、および、ＳＭＢクロマトグラフィー法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。

【請求項14】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、工程（ｉ）の精製が、真空精密蒸留法、尿素附加法、硝酸銀錯体法、固定層クロマトグラフィー法、および、ＳＭＢクロマトグラフィー法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。

【請求項15】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、
工程（ｄ）の画分（１）のドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、
工程（ｄ）の画分（２）のエイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、
工程（ｅ）の画分（３）のドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、
工程（ｅ）の画分（４）のエイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上である、
方法。

【請求項16】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、
工程（ｆ）の混合物のドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以下であり、
工程（ｇ）の混合物のエイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、ドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以下である、
方法。

【請求項17】

請求項１または２に記載の方法であって、ここで、
工程（ｈ）の精製物におけるドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が７０ｗ％以上であり、
工程（ｉ）の精製物におけるエイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が７０ｗ％以上である、
方法。

【請求項18】

請求項１または２に記載の方法であって、さらに、以下の工程：
（ｊ）工程（ｈ）で得られた精製物を吸着剤処理して、不純物を除去する工程；および、（ｋ）工程（ｉ）で得られた精製物を吸着剤処理して、不純物を除去する工程、
を包含する方法。

【請求項19】

請求項１８に記載の方法であって、前記吸着剤が、酸性白土、活性白土、活性炭、ケイ酸、および、アルミナからなる群から選択され、そして、吸着剤処理後の過酸化物価が３以下である、方法。

【請求項20】

請求項１８に記載の方法であって、さらに、以下の工程：
（ｌ）工程（ｊ）で得られた物質に抗酸化剤を添加する工程；および、
（ｍ）工程（ｋ）で得られた物質に抗酸化剤を添加する工程、
を包含する方法。

【請求項21】

請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記抗酸化剤がトコフェロール、アスコルビン酸パルミテート、カテキン、および、ローズマリー抽出物からなる群から選択される、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はエイコサペンタエン酸（以後、「ＥＰＡ」という）および／またはドコサヘキサエン酸（以後、「ＤＨＡ」という）などのオメガ３系脂肪酸（以後、「ω３系脂肪酸」という）を含む原料油脂からＥＰＡやＤＨＡを、従来技術よりも高収率に取得する工業的生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ω３系脂肪酸であるＥＰＡやＤＨＡは循環器系疾患、神経伝達系疾患を始めとする様々な生理作用を持ち、医薬品、健康食品、食品素材、および、飼料などとして利用されている。例えば、９０ｗｔ％以上の高純度ＥＰＡエチルエステルは動脈硬化や高脂血症の治療薬として用いられ、また、ＥＰＡやＤＨＡを含む飲料は特定保健用食品としても認可されている。ＥＰＡやＤＨＡのグリセリドやエチルエステルは世界中で健康補助食品として利用されている。

【0003】

ＥＰＡやＤＨＡなどのω３系脂肪酸を含む魚油、海藻類油脂、単細胞藻類油脂などの水産油脂はガム質やリン脂質、遊離脂肪酸の他、各種の原料由来不純物を含むが、大半は脂肪酸のグリセリドであり、ＥＰＡやＤＨＡも大半はグリセリドの形で存在している。ＥＰＡやＤＨＡの多くはグリセリドの２位に結合している。これらの水産油脂は公知の方法によって脱ガム・脱酸（非特許文献１）される。

【0004】

グリセリド体のＥＰＡやＤＨＡを濃縮精製するためには、一般に低温溶媒分別結晶法やウィンタリング法などが利用されるが濃縮効率が低いため、該グリセリドの１位、３位に結合しているＥＰＡやＤＨＡ以外の脂肪酸を特異的に加水分解するリパーゼを用いてグリセリドの形態でＥＰＡやＤＨＡを効率よく濃縮する技術が産業的に多用されている（特許文献１）。さらに、生産性を高めるために反応系への水酸化カルシウム、塩化マグネシウムなどの反応添加剤添加（特許文献２）、低級アルコールを含む極性溶媒添加（特許文献３）などが提案されている。

【0005】

更に高純度のＥＰＡやＤＨＡを得るためには、まず、グリセリドに結合した脂肪酸を例えばエチルエステル化し、モノマーとすることが行われている。エチルエステル化は酵素法のほか、酸触媒法、アルカリ触媒法などが公知である（特許文献４、非特許文献２）。

【0006】

エチルエステル化されたω３系脂肪酸を含む油脂中のＥＰＡやＤＨＡなどの高度不飽和脂肪酸は、尿素付加法（特許文献５、６）、硝酸銀錯体法（特許文献７、８）、真空薄膜蒸留法を含む真空精密蒸留法（特許文献９）、液体クロマトグラフィー（以後、ＨＰＬＣという）や疑似移動相クロマト法などのクロマト法（特許文献９）などの１種類以上の組み合わせ法により比較的高純度に精製される。

【0007】

このようにして得られたＥＰＡやＤＨＡなどの高純度ω３系脂肪酸エチルエステルは、製造中に混入した異物や過酸化物、着色物質、臭い成分などの不純物成分を除くため、活性炭、活性白土、酸性白土、シリカゲル、アルミナなどが利用される（特許文献１０〜１２）。

【0008】

このようにして生産されたＥＰＡやＤＨＡなどの高純度ω３系脂肪酸エチルエステルは、健康食品、医薬品として世界で生産利用され、現在も市場拡大を続けている。

【0009】

しかしながら、従来技術により水産油脂エチルエステルの混合物からＥＰＡやＤＨＡなどのω３系脂肪酸エチルエステルをそれぞれ高純度品として、かつ、高収率に取得する場合、例えば、７０ｗｔ％以上のＥＰＡエチルエステルを調製する場合はＥＰＡエチルエステルと類似した物理化学的性質を有するａｌｌ−ｃｉｓ−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（１８：４ω３以後、「ＳＤＡ」という）エチルエステルやＤＨＡエチルエステルなどの夾雑物の除去が必要であるものの、これらの除去は一般に困難であり、その一方で、これら夾雑物の低減化を目指した場合には最終製品の収率の低下を招く、と言う技術的問題がある。

【0010】

また、７０ｗｔ％以上のＤＨＡエチルエステルを調製する場合には、ＳＤＡエチルエステルやＥＰＡエチルエステルの除去が困難となり、同様に最終製品の収率の低下を招くと言う技術的問題がある。

【0011】

ＥＰＡやＤＨＡなどのω３系脂肪酸エチルエステルをそれぞれ高純度品として、かつ、高収率に取得するためには、ＳＤＡを含む夾雑成分を効率的に除去する技術の提供が必要とされる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】特開２００２−６９４７５号公報

【特許文献2】特開２０１３−５５８９号公報

【特許文献3】特開２０１３−１２１３６６号公報

【特許文献4】特開２００６−２８８２２８号公報

【特許文献5】特開２００７−８９５２２号公報

【特許文献6】特表２００９−５０４５８８号公報

【特許文献7】特開２０１０−６４９７４号公報

【特許文献8】特開平７−２４２８９５号公報

【特許文献9】特開平１１−２０９７８６号公報

【特許文献10】特開平６−７２９５９号公報

【特許文献11】特表２００３−５１６４６６号公報

【特許文献12】特開２００３−３１３５７８号公報

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】安田耕作他、油脂製品の知識、幸書房(東京）、1977年、103-104頁

【非特許文献2】日本油化学会編、第４版油脂化学便覧、丸善(東京）、2001年、454-456頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

ＥＰＡやＤＨＡなどのω３系脂肪酸エチルエステルをそれぞれ高純度品として、かつ、高収率に取得する方法を提供することを、本発明の課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明者らはエチルエステル化されたω３系脂肪酸を含む油脂中のＥＰＡやＤＨＡなどの高度不飽和脂肪酸を高純度に精製する場合（例えば、尿素付加法、硝酸銀錯体法、真空精密蒸留法、クロマト法などの１種類以上の組み合わせ法により高純度に精製する場合）、予め脂質分解酵素によって油脂を処理し、グリセリド画分（グリセリン脂肪酸エステルを多く含む画分）と遊離脂肪酸画分（遊離脂肪酸画分は、エチルエステル化した画分であっても、エチルエステル化していない画分であってもよい）に分け、必要に応じてそれぞれの画分をエチルエステル化し、さらに精製して目的物質（目的とする脂肪酸エチルエステルまたはグリセリン脂肪酸エステルの脂肪酸部分がエチルエステル化した物質）に対するその他の脂肪酸エステルまたはグリセリン脂肪酸エステルの割合が小さい画分を調製することにより、従来法よりも高い回収率で目的物質を得ることが可能であることを見出し、本発明に至ったものである。例えば、本発明では、脂質分解酵素によって油脂を処理し、必要に応じてエチルエステル化を行い、エチルエステル化グリセリド画分（主にグリセリン脂肪酸エステルの脂肪酸部分がエチルエステル化されている）とエチルエステル化遊離脂肪酸画分に分け、エチルエステル化したグリセリド画分を（１）ＤＨＡをＥＰＡよりも多く含む画分と（２）ＥＰＡをＤＨＡよりも多く含む画分に分け、エチルエステル化した遊離脂肪酸画分を（３）ＤＨＡをＥＰＡよりも多く含む画分と（４）ＥＰＡをＤＨＡよりも多く含む画分に分け、（１）と（３）を合わせた混合物、（２）と（４）を合わせた混合物をそれぞれ調製し、これら混合物をさらに精製することによって、高純度のＥＰＡ精製物、および、高純度のＤＨＡ精製物を得ることができる。例えば、本発明では、脂肪酸をエチルエステル化する条件下（主に遊離脂肪酸がエチルエステル化される条件下）で脂質分解酵素によって予め油脂を処理し、グリセリド画分とエチルエステル化遊離脂肪酸画分に分け、グリセリド画分をエチルエステル化し、エチルエステル化したグリセリド画分（主にグリセリン脂肪酸エステルの脂肪酸部分がエチルエステル化されている）を（１）ＤＨＡをＥＰＡよりも多く含む画分と（２）ＥＰＡをＤＨＡよりも多く含む画分に分け、エチルエステル化した遊離脂肪酸画分を（３）ＤＨＡをＥＰＡよりも多く含む画分と（４）ＥＰＡをＤＨＡよりも多く含む画分に分け、（１）と（３）を合わせた混合物、（２）と（４）を合わせた混合物をそれぞれ調製し、これら混合物をさらに精製することによって、高純度のＥＰＡ精製物、および、高純度のＤＨＡ精製物を得ることができる。例えば、本発明では、予め脂質分解酵素によって油脂を処理し、グリセリド画分と遊離脂肪酸画分に分け、それぞれの画分をエチルエステル化し、エチルエステル化したグリセリド画分（主にグリセリン脂肪酸エステルの脂肪酸部分がエチルエステル化されている）を（１）ＤＨＡをＥＰＡよりも多く含む画分と（２）ＥＰＡをＤＨＡよりも多く含む画分に分け、エチルエステル化した遊離脂肪酸画分を（３）ＤＨＡをＥＰＡよりも多く含む画分と（４）ＥＰＡをＤＨＡよりも多く含む画分に分け、（１）と（３）を合わせた混合物、（２）と（４）を合わせた混合物をそれぞれ調製し、これら混合物をさらに精製することによって、高純度のＥＰＡ精製物、および、高純度のＤＨＡ精製物を得ることができる。

【0016】

例えば、本発明において、尿素付加法、硝酸銀錯体法、真空精密蒸留法、クロマト法などの１種類以上の組み合わせ法により更に高純度に精製するより前の工程において、酵素処理によりＥＰＡ純度又はＤＨＡ純度を高め、ＳＤＡを含むその他の脂肪酸の割合を少なくした水産油脂由来グリセリド画分または遊離脂肪酸画分を出発原料とすることによって、製品回収率を高めることができる。例えば、本発明において、高純度ＥＰＡ取得のために、ＥＰＡに対するＤＨＡやＳＤＡの割合を小さくし、また、高純度ＤＨＡ精製のためにはＤＨＡに対するＥＰＡやＳＤＡの割合を小さくすることにより目的成分の回収率を高めることが本発明の特徴の一つである。

【0017】

本発明は例えば以下を提供する。
（項目１）
エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸を含む原料油脂からエイコサペンタエン酸エチルエステルおよびドコサヘキサエン酸エチルエステルを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）原料油脂を、脂質分解酵素によって処理する工程；
（ｂ）工程（ａ）の処理物を分画する工程；
（ｃ）必要に応じて（例えば、工程（ｂ）で得られた画分がエチルエステル化されていない画分の場合）工程（ｂ）で得られた画分を、エチルエステル化する工程；
（ｄ）エチルエステル化したグリセリド画分を精製して、
（１）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを精製前のエチルエステル化したグリセリド画分より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを精製前のエチルエステル化したグリセリド画分より少なく含む画分と、
（２）エイコサペンタエン酸エチルエステルを精製前のエチルエステル化したグリセリド画分より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを精製前のエチルエステル化したグリセリド画分より少なく含む画分に分画する工程；
（ｅ）エチルエステル化した遊離脂肪酸画分を精製して、
（３）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを精製前のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを精製前のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より少なく含む画分と、
（４）エイコサペンタエン酸エチルエステルを精製前のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを精製前のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より少なく含む画分に分画する工程；
（ｆ）工程（ｄ）の（１）の画分と工程（ｅ）の（３）の画分を混合する工程；
（ｇ）工程（ｄ）の（２）の画分と工程（ｅ）の（４）の画分を混合する工程；
（ｈ）工程（ｆ）の混合物をさらに精製して、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
（ｉ）工程（ｇ）の混合物をさらに精製して、エイコサペンタエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
を包含する方法。
（項目２）
エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸を含む原料油脂からエイコサペンタエン酸エチルエステルおよびドコサヘキサエン酸エチルエステルを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）原料油脂を、脂肪酸をエチルエステル化する条件下で脂質分解酵素によって処理する工程；
（ｂ）工程（ａ）の処理物を、グリセリド画分とエチルエステル化した遊離脂肪酸画分に分画する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたグリセリド画分を、エチルエステル化する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られたエチルエステル化したグリセリド画分を精製して、
（１）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より少なく含む画分と、
（２）エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より少なく含む画分に分画する工程；
（ｅ）工程（ｂ）で得られたエチルエステル化した遊離脂肪酸画分を精製して、
（３）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｂ）のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｂ）のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より少なく含む画分と、
（４）エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｂ）のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｂ）のエチルエステル化した遊離脂肪酸画分より少なく含む画分に分画する工程；
（ｆ）工程（ｄ）の（１）の画分と工程（ｅ）の（３）の画分を混合する工程；
（ｇ）工程（ｄ）の（２）の画分と工程（ｅ）の（４）の画分を混合する工程；
（ｈ）工程（ｆ）の混合物をさらに精製して、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
（ｉ）工程（ｇ）の混合物をさらに精製して、エイコサペンタエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
を包含する方法。
（項目３）
エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸を含む原料油脂からエイコサペンタエン酸エチルエステルおよびドコサヘキサエン酸エチルエステルを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）原料油脂を、脂質分解酵素によって処理する工程；
（ｂ）工程（ａ）の処理物を、グリセリド画分と遊離脂肪酸画分に分画する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたグリセリド画分および遊離脂肪酸画分のそれぞれを、エチルエステル化する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られたエチルエステル化したグリセリド画分を精製して、
（１）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より少なく含む画分と、
（２）エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物より少なく含む画分に分画する工程；
（ｅ）工程（ｃ）で得られたエチルエステル化した遊離脂肪酸画分を精製して、
（３）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物より少なく含む画分と、
（４）エイコサペンタエン酸エチルエステルを工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物より少なく含む画分に分画する工程；
（ｆ）工程（ｄ）の（１）の画分と工程（ｅ）の（３）の画分を混合する工程；
（ｇ）工程（ｄ）の（２）の画分と工程（ｅ）の（４）の画分を混合する工程；
（ｈ）工程（ｆ）の混合物をさらに精製して、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
（ｉ）工程（ｇ）の混合物をさらに精製して、エイコサペンタエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程；
を包含する方法。
（項目４）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、前記原料油脂が脱酸処理された原料油脂である、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、ここで、前記脱酸処理された原料油脂の酸価が３以下である、方法。
（項目６）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、前記原料油脂が４ｗｔ％以上のエイコサペンタエン酸および４ｗｔ％以上のドコサヘキサエン酸を含む、方法。
（項目７）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、前記脂質分解酵素がトリグリセリドの１位及び３位を選択的に加水分解する微生物由来リパーゼである、方法。
（項目８）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）の分画が、流下薄膜式分子蒸留法、遠心式分子蒸留法、および、溶出法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。
（項目９）
項目8に記載の方法であって、ここで、工程（ｂ）の分画が溶出法によって行われ、ここで、ヘキサンによる溶出液がエチルエステル化遊離脂肪酸画分として回収され、そして、ジエチルエーテルによる溶出液がグリセリド画分として回収される、方法。
（項目１０）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、工程（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化が、アルカリ触媒法又は酵素法によって行われる、方法。
（項目１１）
項目１または３に記載の方法であって、ここで、工程（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化が、酸触媒法又は酵素法によって行われる、方法。
（項目１２）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、工程（ｄ）の精製が、真空精密蒸留法、尿素附加法、硝酸銀錯体法、固定層クロマトグラフィー法、および、ＳＭＢクロマトグラフィー法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。
（項目１３）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）の精製が、真空精密蒸留法、尿素附加法、硝酸銀錯体法、固定層クロマトグラフィー法、および、ＳＭＢクロマトグラフィー法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。
（項目１４）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、工程（ｈ）の精製が、真空精密蒸留法、尿素附加法、硝酸銀錯体法、固定層クロマトグラフィー法、および、ＳＭＢクロマトグラフィー法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。
（項目１５）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、工程（ｉ）の精製が、真空精密蒸留法、尿素附加法、硝酸銀錯体法、固定層クロマトグラフィー法、および、ＳＭＢクロマトグラフィー法からなる群から選択される方法によって行われる、方法。
（項目１６）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、
工程（ｄ）の画分（１）のドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、
工程（ｄ）の画分（２）のエイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、
工程（ｅ）の画分（３）のドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、
工程（ｅ）の画分（４）のエイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上である、
方法。
（項目１７）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、
工程（ｆ）の混合物のドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以下であり、
工程（ｇ）の混合物のエイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以上であり、ドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が１５ｗ％以下である、
方法。
（項目１８）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここで、
工程（ｈ）の精製物におけるドコサヘキサエン酸エチルエステル濃度が７０ｗ％以上であり、
工程（ｉ）の精製物におけるエイコサペンタエン酸エチルエステル濃度が７０ｗ％以上である、
方法。
（項目１９）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、以下の工程：
（ｊ）工程（ｈ）で得られた精製物を吸着剤処理して、不純物を除去する工程；および、（ｋ）工程（ｉ）で得られた精製物を吸着剤処理して、不純物を除去する工程、
を包含する方法。
（項目２０）
項目１９に記載の方法であって、前記吸着剤が、酸性白土、活性白土、活性炭、ケイ酸、および、アルミナからなる群から選択され、そして、吸着剤処理後の過酸化物価が３以下である、方法。
（項目２１）
項目１９に記載の方法であって、さらに、以下の工程：
（ｌ）工程（ｊ）で得られた物質に抗酸化剤を添加する工程；および、
（ｍ）工程（ｋ）で得られた物質に抗酸化剤を添加する工程、
を包含する方法。
（項目２２）
項目２１に記載の方法であって、ここで、前記抗酸化剤がトコフェロール、アスコルビン酸パルミテート、カテキン、および、ローズマリー抽出物からなる群から選択される、方法。

【発明の効果】

【0018】

本発明によって、ＥＰＡやＤＨＡなどのω３系脂肪酸エチルエステルをそれぞれ高純度品として、かつ、高収率に取得する方法が提供される。本発明により、より安価な高純度ＥＰＡやＤＨＡなどのω３系脂肪酸エチルエステルの提供が可能となる。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。また、本明細書において「ｗｔ％」は、「質量パーセント濃度」と互換可能に使用される。

【0020】

（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

【0021】

本明細書において使用される用語「原料油脂」とは、本発明の精製の原料として使用する油脂をいう。原料油脂は、脱酸処理されていても、されていなくてもよい。好ましくは、本発明の原料油脂は、脱酸処理された原料油脂である。

【0022】

本明細書において使用される用語「グリセリド」とは脂肪酸のトリグリセリド、ジグリセリド、及びモノグリセリドからなる群から選択される成分を含む。本発明において、そうでないと規定しない限り、「グリセリド」は、リン脂質や糖脂質を含まない。

【0023】

本明細書において使用される用語「脂質分解酵素」とは、脂質を分解する酵素であり、代表的には、リパーゼをいう。好ましくは、本発明の「脂質分解酵素」は、リパーゼであり、より好ましくは、トリグリセリドの1位及び３位を選択的に加水分解するリパーゼである。本発明において使用される「脂質分解酵素」は、天然の酵素であっても、組換え酵素であってもよい。また、本発明において使用される「脂質分解酵素」は、溶液の形態であっても、固定化された形態であってもよい。

【0024】

本明細書において使用される用語「グリセリド画分」とは、原料油脂を脂質分解酵素処理した後の反応液における混合油脂画分の中で、グリセリドを比較的多く含む画分、例えば、他の画分と比べて、遊離脂肪酸に対するグリセリドの割合が多い画分をいう。グリセリド画分に含まれるグリセリン脂肪酸エステル中の脂肪酸は、エチルエステル化されていても、エチルエステル化されていなくてもよい。

【0025】

本明細書において使用される用語「遊離脂肪酸画分」とは、原料油脂を脂質分解酵素処理した後の反応液における混合油脂画分の中で、遊離脂肪酸を比較的多く含む画分、例えば、他の画分と比べて、グリセリドに対する遊離脂肪酸の割合が多い画分をいう。遊離脂肪酸画分の遊離脂肪酸は、エチルエステル化されていても、エチルエステル化されていなくてもよい。

【0026】

本明細書において使用される用語「エチルエステル化」とは、グリセリドおよび／または脂肪酸をエチルアルコール存在下でエステル化する反応をいう。グリセリドをエチルエステル化する方法は、当該分野で周知である。脂肪酸をエチルエステル化する方法は、当該分野で周知である。例えば、エチルアルコール存在下で原料油脂を脂質分解酵素処理した場合、得られる遊離脂肪酸画分は、エチルエステル化された遊離脂肪酸である。

【0027】

本明細書において使用される用語「画分をエチルエステル化する」工程とは、画分に含まれる物質の少なくとも１つをエチルエステル化する工程をいう。

【0028】

本明細書において使用される用語「グリセリド画分をエチルエステル化する」工程とは、グリセリド画分中の成分をエチルエステル化（好ましくは、グリセリド画分に含まれるグリセリン脂肪酸エステルの脂肪酸部分をエチルエステル化）する工程をいう。

【0029】

本明細書において使用される用語「エチルエステル化したグリセリド画分」とは、グリセリド画分に含まれる物質がエチルエステル化（好ましくは、グリセリド画分に含まれるグリセリン脂肪酸エステルの脂肪酸部分がエチルエステル化）した画分をいう。

【0030】

本明細書において使用される用語「遊離脂肪酸画分をエチルエステル化する」工程とは、遊離脂肪酸画分（好ましくは、遊離脂肪酸画分中の遊離脂肪酸）をエチルエステル化する工程をいう。

【0031】

本明細書において使用される用語「エチルエステル化した遊離脂肪酸画分」とは、遊離脂肪酸画分に含まれる物質（好ましくは、遊離脂肪酸画分中の遊離脂肪酸）がエチルエステル化した画分をいう。

【0032】

本明細書において使用される用語「ドコサヘキサエン酸」とは、「ＤＨＡ」と互換可能に使用され、そして、遊離脂肪酸の形態と、グリセリンにエステル結合した形態のいずれも包含する。

【0033】

本明細書において使用される用語「ドコサヘキサエン酸エチルエステル」とは、「ＤＨＡエチルエステル」と互換可能に使用され、そして、エチルエステル化した遊離脂肪酸の形態と、グリセリンにエステル結合したドコサヘキサエン酸がエチルエステル化された形態のいずれも包含する。

【0034】

本明細書において使用される用語「エイコサペンタエン酸」とは、「ＥＰＡ」と互換可能に使用され、そして、遊離脂肪酸の形態と、グリセリンにエステル結合した形態とのいずれも包含する。

【0035】

本明細書において使用される用語「エイコサペンタエン酸エチルエステル」とは、「ＥＰＡエチルエステル」と互換可能に使用され、そして、エチルエステル化した遊離脂肪酸の形態と、グリセリンにエステル結合したエイコサペンタエン酸がエチルエステル化された形態のいずれも包含する。

【0036】

本明細書において使用される用語「精製」とは、精製の目的となる物質の濃度を高める任意の操作をいう。

【0037】

本明細書において使用される用語「ＳＭＢクロマトグラフィー」とは、液体クロマトグラフィーの原理を利用する分離法であって、原料中の特定の成分と、別の特定の成分に対して異なる選択的吸着能力を有する吸着剤が充填された複数の単位充填層を直列に連結するとともに、最下流部の単位充填層と最上流部の単位充填層とを連結し、無端状の循環系を形成した移動層を用いるクロマトグラフィーをいう。本願明細書において、「ＳＭＢクロマトグラフィー」は、「擬似移動層クロマトグラフィー」と互換可能に使用される。

【0038】

（本発明の精製法）
本発明は、高純度のω３系脂肪酸エチルエステル（例えば、ＥＰＡのエチルエステルおよびＤＨＡのエチルエステルが挙げられるがこれらに限定されない）を調製する方法であって、以下：
（ａ）原料油脂を、脂質分解酵素によって処理する工程（この工程によって、ＤＨＡリッチなグリセリド画分と、ＥＰＡリッチな遊離脂肪酸画分が生成される。反応条件によって、遊離脂肪酸は、エチルエステル化された遊離脂肪酸である場合と、エチルエステル化されていない遊離脂肪酸である場合がある）；
（ｂ）工程（ａ）の処理物を、グリセリド画分と遊離脂肪酸画分（遊離脂肪酸は、エチルエステル化された遊離脂肪酸であっても、エチルエステル化されていない遊離脂肪酸であってもよい）に分画する工程；
（ｃ）必要に応じて（例えば、グリセリドおよび／または遊離脂肪酸がエチルエステル化されていない場合）、工程（ｂ）で得られたグリセリド画分および／または遊離脂肪酸画分を、エチルエステル化する工程；
（ｄ）エチルエステル化したグリセリド画分を精製して、
（１）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを原料グリセリド画分のエチルエステル化物（工程（ｂ）または（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物）より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを原料グリセリド画分のエチルエステル化物（工程（ｂ）または（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物）より少なく含む画分と、
（２）エイコサペンタエン酸エチルエステルを原料グリセリド画分のエチルエステル化物（工程（ｂ）または（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物）より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを原料グリセリド画分のエチルエステル化物（工程（ｂ）または（ｃ）のグリセリド画分のエチルエステル化物）より少なく含む画分に分画する工程；
（ｅ）エチルエステル化した遊離脂肪酸画分を精製して、
（３）ドコサヘキサエン酸エチルエステルを原料遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物（工程（ｂ）または（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物）より多く含み、かつ、エイコサペンタエン酸エチルエステルを原料遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物（工程（ｂ）または（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物）より少なく含む画分と、
（４）エイコサペンタエン酸エチルエステルを原料遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物（工程（ｂ）または（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物）より多く含み、かつ、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを原料遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物（工程（ｂ）または（ｃ）の遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物）より少なく含む画分に分画する工程；
（ｆ）工程（ｄ）の（１）の画分と工程（ｅ）の（３）の画分を混合する工程；
（ｇ）工程（ｄ）の（２）の画分と工程（ｅ）の（４）の画分を混合する工程；
（ｈ）工程（ｆ）の混合物をさらに精製して、ドコサヘキサエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程（なお、この精製工程で得られたエイコサペンタエン酸エチルエステルを多く含む画分は、エイコサペンタエン酸エチルエステル精製物としても使用可能である）；
（ｉ）工程（ｇ）の混合物をさらに精製して、エイコサペンタエン酸エチルエステルを含む精製物を得る工程（なお、この精製工程で得られたドコサヘキサエン酸エチルエステルを多く含む画分は、ドコサヘキサエン酸エチルエステル精製物としても使用可能である）；
を包含する方法を提供する。

【0039】

（１．原料油脂）
上記工程（ａ）において使用する原料油脂は、好ましくは、エイコサペンタエン酸を４ｗｔ％以上かつドコサヘキサエン酸を４ｗｔ％以上含む。例えば、本発明において使用する原料油脂としては、水産物の油脂（以下、「水産油脂」という）が挙げられるがこれらに限定されない。水産油脂としては、例えば、アンチョビィ油、ピルチャード油、マイワシ油、メンヘーデン油、サケ油、ニシン油、カツオ油、マグロ油などのほか、藻類由来油脂が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において用いる魚油名は、(財)日本水産油脂協会編、魚介類の脂肪酸組成表、光琳（東京）、１９８９年に準拠する。

【0040】

本発明において原料として用いる水産油脂に含まれるＥＰＡ純度は、好ましくは、４．０ｗｔ％以上６０％以下、より好ましくは１０ｗｔ％以上６０ｗｔ％以下であるがこれらに限定されない。また、本発明において用いる水産油脂に含まれるＤＨＡ純度は、好ましくは、４．０ｗｔ％以上６０％以下、より好ましくは１０ｗｔ％以上３５ｗｔ％以下であるがこれらに限定されない。本発明において使用する原料油脂が、ＥＰＡのみを上記の濃度範囲で含有し、ＤＨＡを上記の濃度以下で含有する場合、そのような原料油脂を高純度ＥＰＡを精製するための出発材料として使用することができる。本発明において使用する原料油脂が、ＤＨＡのみを上記の濃度範囲で含有し、ＥＰＡを上記の濃度以下で含有する場合、そのような原料油脂を高純度ＤＨＡを精製するための出発材料として使用することができる。

【0041】

上記工程（ａ）において使用する原料油脂は、好ましくは、脱酸処理した油脂である。脱酸処理の方法は周知であり、例えば、非特許文献１（安田耕作他、油脂製品の知識、幸書房（東京）、１９７７年、１０３−１０４頁）に記載されている。脱酸処理された原料油脂の酸価（以後、「ＡＶ」という）は、３．０以下、好ましくは１．０以下であるがこれらに限定されない。通常、この原料油脂の９０ｗｔ％以上は脂肪酸のグリセリドであり、更にその９０ｗｔ％以上はトリグリセリドであり、残余のグリセリドはジグリセリド、モノグリセリドである。原料油脂における脂肪酸のグリセリドの濃度は原料油の由来により異なるため、本発明を制限しない。

【0042】

本明細書で用いる脂肪酸組成分析法、酸価、過酸化物価(以下、「ＰＯＶ」という)の測定法は、周知であり、例えば、２００３年版基準油脂分析試験法（（社）日本油化学会編纂）に記載されるとおりである。

【0043】

上記工程（ａ）において使用する原料油脂は、好ましくは、脱ガム処理した油脂である。脱ガム処理の方法は周知であり、例えば、非特許文献１（安田耕作他、油脂製品の知識、幸書房(東京）、1977年、103-104頁）に記載されている。脱ガム処理は必須ではないが、一般に、脱ガム処理を経た原料油脂の方が不純物が少なく、続く精製工程が容易となる。

【0044】

（２．脂質分解酵素処理）
原料油脂（代表的には、脱酸処理後の原料油脂）は脂質分解酵素によって処理される。原料魚油に含まれるＥＰＡやＤＨＡは通常はグリセリドの２位に結合している割合が多いとされる（万倉三正・鹿山 光、ＡＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡの生理機能と利用、「ＡＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡ−高度不飽和脂肪酸」、鹿山光編、恒星社厚生閣（東京）、１９９５年、２０７〜２２４頁）。そのため、本発明においては、１位選択性、および／または、３位選択性を有する脂質分解酵素（リパーゼ）を用いることが好ましい。微生物由来の脂質分解酵素（リパーゼ）としては、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｏｒａｃｅａ由来のリパーゼＯＦ（商品名、名糖産業（株）製）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．由来のリパーゼＱＬＭ、リパーゼＱＬＣ、リパーゼＰＬ（いずれも商品名、名糖産業（株）製）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ由来のリパーゼＰＳ（商品名、天野エンザイム（株）製）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のリパーゼＡＫ（商品名、天野エンザイム（株）製）などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、本発明において使用する脂質分解酵素（リパーゼ）は、トリグリセリドの１位及び３位を選択的に加水分解する微生物由来リパーゼである。本発明においては、固定化リパーゼ、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ由来の固定化リパーゼ、リポザイムＴＬＩＭ（商品名、ノボザイム社製）を用いることができるがこれに限定されない。これらのリパーゼは１、３位選択性が高いため、主に２位に結合しているＥＰＡやＤＨＡはグリセリドとして残りグリセリド画分となり、１、３位に結合しているその他の脂肪酸は遊離脂肪酸画分として系内に残る。

【0045】

脂質分解酵素処理に際しては、反応時間、温度などに制限はない。当業者は、例えば、特許文献１〜３などに記載される周知の条件を利用することができる。酵素反応の進行はＡＶ測定により管理できる。出発原料の種類、ＥＰＡ純度、ＤＨＡ純度など目標としている製品の品質により反応を停止するべきＡＶは任意に設定できるが、一般に、３０〜１３０の範囲、望ましくは７０〜１００の範囲で反応を停止する。例えば、エチルアルコール存在下で脂質分解酵素処理を行うと、脂肪酸のグリセリドが脂肪酸とグリセリドに分解され、そして、遊離脂肪酸がエチルエステル化される。

【0046】

（３．グリセリド画分と遊離脂肪酸画分への分画）
脂質分解酵素（リパーゼ）処理終了後の反応液は、グリセリド画分と遊離脂肪酸画分（脂肪酸画分中の脂肪酸は、エチルエステル化されていても、エチルエステル化されていなくてもよい）を含む混合油脂画分と水性画分に分離することができる。この分離は、例えば、２層液々分離法、遠心分離法などの周知の方法によって行うことができる。これらの方法によって反応液から水分や酵素由来不純物等を除き、グリセリド画分と遊離脂肪酸画分の混合液を取得する。

【0047】

次に、このグリセリド画分と遊離脂肪酸画分を含む混合液を、グリセリド画分と遊離脂肪酸画分に分離する。この分離は、例えば、遠心式分子蒸留法、又は、流下薄膜式分子蒸留法、又は、溶出法によって行うことが出来る。例えば、流下薄膜式分子蒸留の場合、特開２０００−３４２２９１号公報に記載されるように、真空度０．００５ｍｍＨｇ、蒸発面温度２００℃、流速３０ｇ／Ｌの条件で処理を行い、留分として遊離脂肪酸画分、残分としてグリセリド画分を取得できる。流下薄膜式分子蒸留の場合、分子蒸留操作における真空度、蒸発面温度、および／または、フィード量は、装置の型式、原料油の違いにより当業者が適宜変更することができる。溶出法の場合、代表的には、例えば、ヘキサンによる溶出液をエチルエステル化遊離脂肪酸画分として回収し、ジエチルエーテルによる溶出液をグリセリド画分として回収する。これら溶媒の組み合わせは当業者が適宜選択することができる。

【0048】

（４．エチルエステル化）
上記のとおり、脂質分解酵素の反応条件に依存して、酵素反応の結果、遊離脂肪酸がエチルエステル化される場合とエチルエステル化されない場合がある。グリセリド画分（特にグリセリド画分に含まれるグリセリン脂肪酸エステルの脂肪酸部分）および／または遊離脂肪酸画分（特に遊離脂肪酸画分中の遊離脂肪酸）がエチルエステル化されていない場合、エチルエステル化を行う。

【0049】

脂肪酸を含む画分のエチルエステル化法は、周知である。例えば、分画されたグリセリド画分中の脂肪酸はエチルアルコールとの共存下、酸触媒又はアルカリ触媒又は酵素（リパーゼ）によりエチルエステル化される。好ましくは、分画されたグリセリド画分に含まれるグリセリン脂肪酸エステル中の脂肪酸はアルカリ触媒法または酵素法によってエチルエステル化される。分画された遊離脂肪酸画分中の脂肪酸はエチルアルコールとの共存下、酸触媒又は酵素（リパーゼ）によりエチルエステル化される（非特許文献２、特許文献４）。酵素を利用する場合、添加するエチルアルコールの量は、好ましくは、酵素を失活させない量であり、好ましくは、グリセリドまたは遊離脂肪酸に対して４モル当量以下、さらに好ましくは２モル当量以下であるがこれらに限定されない。一般に、グリセリド画分はＤＨＡエチルエステルをＥＰＡエチルエステルよりも多く含み、遊離脂肪酸画分は、ＥＰＡエチルエステルをＤＨＡエチルエステルよりも多く含む。

【0050】

エチルエステル化工程は、必ずしも上記脂質分解酵素処理と別工程で行う必要はない。例えば、リパーゼのような脂質分解酵素による原料油脂の処理をエチルエステル化条件（例えば、エチルアルコール存在下でのリパーゼ処理）で行うと、脂質分解と同時にエチルエステル化を行うことができる。脂質分解酵素による原料油脂の処理とエチルエステル化を同時に行う場合、酵素処理後に再度エチルエステル化を行うことは、必ずしも必要ではない。例えば、脂質分解酵素による原料油脂の処理とエチルエステル化を同時に行った場合、酵素処理後に、エチルエステル画分と残分（グリセリド画分）に分画することができる。

【0051】

（５．エチルエステル化したグリセリド画分および／または遊離脂肪酸画分の精製）
エチルエステル化したグリセリド画分および／または遊離脂肪酸画分の精製としては、例えば、真空精密蒸留法、尿素付加法、硝酸銀錯体法、クロマト法等の精製法が挙げられるがこれらに限定されない。これら精製法は、周知である。概略を以下に述べる。

【0052】

（５．１．真空精密蒸留法）
真空精密蒸留法とは、各成分の沸点差を利用して分離する方法である。ＥＰＡの場合、ＥＰＡを含む炭素鎖数が２０の成分は魚油脂肪酸の中で中間の沸点に位置しており、バッチ式の場合、単塔式蒸留装置を用いる事が、連続蒸留の場合、二塔式装置ないしは四塔式装置が必要となる。二塔式であればＣ１９以下の成分（初留）を留出させ、その残留分を第二塔に送りＣ２０成分を（主留）を分取することにより精製を行う。

【0053】

（５．２．尿素付加法）
尿素付加法とは、溶解した尿素が結晶化する際に直鎖の分子を取り込みながら六角柱状の付加物結晶を形成する性質を利用する精製法である。例えば、原料と尿素メタノール溶液を混合し冷却し、飽和脂肪酸やモノ不飽和脂肪酸を取り込んだ尿素付加物を形成させ、これをろ別することにより精製を行う。代表的には、尿素付加物からｎ−ヘキサン抽出し、シリカゲル処理の後、ｎ−ヘキサンを留去して目的の不飽和脂肪酸を得る。

【0054】

（５．３．硝酸銀錯体法）
硝酸銀錯体法とは、脂肪酸の二重結合に対して硝酸銀溶液が錯体を形成する性質を利用する精製法である。高度不飽和脂肪酸エチルを精製する場合、原料と硝酸銀溶液を撹拌し、未反応エステルを例えばｎ−ヘキサン抽出した後に水相を希釈または加温し、遊離したエステルを再度ｎ−ヘキサンにて抽出することにより目的の高度不飽和脂肪酸エチルの濃縮・精製を行う。

【0055】

（５．４．クロマト法）
クロマト法としては、固定層クロマトグラフィーを用いる方法（固定層クロマトグラフィー法）およびＳＭＢクロマトグラフィー法（擬似移動層クロマトグラフィー法）が挙げられる。固定層クロマトグラフィー法は、カラムに充填剤を詰め、原料を溶離液で通過させることにより目的の成分を含む画分を取り出し、濃縮・精製する方法である。本発明の方法においては、好ましい充填剤としては、シリカゲル、逆相シリカゲル、硝酸銀含浸シリカゲルが挙げられるがこの限りではない。

【0056】

（５．５．代表的な精製法）
エチルエステル化したグリセリド画分からの脂肪酸エチルエステルの精製は、例えば、真空精密蒸留法、尿素付加法、硝酸銀錯体法、クロマト法等によって行うことができる（特許文献４〜９）。（１）これらのいずれかの精製法により、エチルエステル化したグリセリド画分から、１５ｗｔ％以上の濃度（好ましくは５０ｗｔ％以上、より好ましくは８０ｗｔ％以上の濃度）のＥＰＡエチルエステル画分、および、１５ｗｔ％以上の濃度（好ましくは２０ｗｔ％以上、より好ましくは３５ｗｔ％以上の濃度）のＤＨＡエチルエステル画分を得ることが出来る。（２）エチルエステル化した遊離脂肪酸画分からの脂肪酸エチルエステルの精製は、例えば、真空精密蒸留法、尿素付加法、硝酸銀錯体法、クロマト法等によって行うことができる（特許文献４〜９）。これらの精製法により、これらのいずれかの精製法により、エチルエステル化した遊離脂肪酸画分から、１５ｗｔ％以上の濃度のＥＰＡエチルエステル画分、および、１０ｗｔ％以上の濃度（好ましくは１５ｗｔ％以上の濃度）のＤＨＡエチルエステル画分を得ることが出来る。

【0057】

続けて、グリセリド画分のエチルエステル化物からのＥＰＡエチルエステルに富む画分と遊離脂肪酸画分のエチルエステル化物からのＥＰＡエチルエステルに富む画分を合わせてＥＰＡエチルエステル画分（好ましくは、純度１５ｗｔ％以上）を調製し、また、グリセリド画分からのＤＨＡエチルエステルに富む画分と遊離脂肪酸画分からのＤＨＡエチルエステルに富む画分を合わせてＤＨＡエチルエステル画分（好ましくは、純度１５ｗｔ％以上）を調製する。

【0058】

続けて、上記の画分の混合によって得られたＥＰＡエチルエステル画分と該ＤＨＡエチルエステル画分はそれぞれ、真空精密蒸留法、尿素付加法、硝酸銀錯体法、クロマト法等により、再度濃縮精製される。

【0059】

例えば、純度３０ｗｔ％以上のＥＰＡエチルエステル画分を薄膜式真空精密蒸留法とＨＰＬＣ法を組み合わせて精製することにより、純度７０ｗｔ％以上、好ましくは、純度９５ｗｔ％以上のＥＰＡエチルエステルを高収率で取得できる。残余のＤＨＡエチルエステルはＤＨＡエチルエステル画分と合わせて利用可能である。

【0060】

また、純度３０ｗｔ％以上のＤＨＡエチルエステル画分を薄膜式真空精密蒸留法とＨＰＬＣ法を組み合わせて精製することにより、純度７０ｗｔ％以上、好ましくは、純度８５ｗｔ％以上のＤＨＡエチルエステルを高収率で取得できる。残余のＥＰＡエチルエステルはＥＰＡエチルエステル画分と合わせて利用可能である。

【0061】

このようにして、濃縮精製されたＥＰＡエチルエステルとＤＨＡエチルエステルは、精製中に発生した脂質の過酸化物、着色成分、原料由来の異物などの不純物を含むため、公知の手法（特許文献１０〜１２）に基づき活性炭、活性白土、酸性白土、ケイ酸、シリカゲル、アルミナなどの吸着剤から選ばれる１種類以上の組み合わせにより吸着剤処理し、例えば、ＰＯＶを３以下、望ましくは１以下とすることができる（すなわち、脂質の過酸化物を含む不純物を除去することによって、ＰＯＶを低下させることができる）。

【0062】

このようにして取得された高純度ＥＰＡエチルエステルと高純度ＤＨＡエチルエステルには、品質保持のため抗酸化剤としてトコフェロール、アスコルビン酸パルミテート、カテキン、および、ローズマリー抽出物からなる群から選択される物質を配合してもよい。

【0063】

（６．ＳＭＢクロマトグラフィー）
ＳＭＢクロマトグラフィーでは、無端状の循環系に対して原料と溶離液とを供給し、カラム内（単位充填層）を高速で移動するＸ成分（すなわち、弱親和性成分）と、カラム内を低速で移動するＹ成分（すなわち、親和性成分）とをそれぞれ異なる位置から抜き出す。そして、ＳＭＢクロマトグラフィーは、原料供給位置、溶離液供給位置、Ｘ成分抜き出し位置、およびＹ成分抜き出し位置を、一定の位置関係に保ちながら流体循環方向下流側に順次移動させることで、原料供給を連続的に行う処理操作を擬似的に実現する。その結果、層内での各成分の分布状態はほぼ一定の幅で移動し、各成分の抜出位置も、純度・濃度ともに高い部分を取り続けることが可能な操作方式である。

【0064】

本発明のＳＭＢクロマトグラフィーは、１種類のカラムを用いても、２種類以上のカラムを用いてもよい。例えば、本発明においては、Ｃ１８カラムのみを用いてもよく（例えば、４本のＣ１８カラム）、あるいは、Ｃ１８カラム３本とＣ８カラム（あるいは、Ｃ８カラムの代わりに、Ｃ４カラムもしくはＣ１カラム）１本とを用いてもよい。カラムサイズは限定されることはないが、例えば、直径１０ｍｍ×高さ５００ｍｍのカラムを使用してもよい。クロマトグラフィーの条件は、当業者が適宜決定することができる。例えば、クロマトグラフィーの条件としては、原料油脂の供給量を１時間当り充填剤１Ｌ当り２１ｍＬ（２１ ｍＬ／Ｌ−Ｒ／ｈ）とし、溶離液（例えば、メタノール）を、溶離液量：１時間当り充填剤１Ｌ当り４００ｍＬ（０．４０ Ｌ／Ｌ−Ｒ／ｈ）で使用することが挙げられるがこれらに限定されない。

【0065】

以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0066】

（実施例１）
ペルー産アンチョビー油１００．０Ｋｇ（ＡＶ２．５、ＳＤＡ ０．７ｗｔ％，ＥＰＡ １７．５ｗｔ％，ＤＨＡ ９．２ｗｔ％）を出発原料とし、常法に従いアルカリ脱酸処理し、ＡＶ０．５の脱酸済アンチョビー油９５．０Ｋｇを得た（ＳＤＡは「ａｌｌ−ｃｉｓ−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸」を示し、「１８：４ω３」ともいう）。これに水１００リットル、リパーゼＯＦ（名糖産業）を２０００ｕｎｉｔ／ｇ加え、４０℃で撹拌しながら酵素反応を継続し、ＡＶ８５に達した時（約１２時間反応）反応を停止し、遠心分離により水分を除去した。その後、グリセリンなどの不純物を除去するため、油層を約３０リットルの水で３回洗浄し、グリセリド画分と遊離脂肪酸画分を含む９４．５Ｋｇの混合油を得た。混合油は流下薄膜式分子蒸留装置により、真空度０．００５ｍｍＨｇ、蒸発面温度２００℃で処理し、留分側に遊離脂肪酸画分４４Ｋｇ（ＳＤＡ ０．８ｗｔ％、ＥＰＡ １６．２ｗｔ％、ＤＨＡ ５．５ｗｔ％）、残分側に脂肪酸グリセリド５０Ｋｇ（ＳＤＡ ０．６％、ＥＰＡ １９．０％、ＤＨＡ １２．９％）を取得した。

【0067】

定法に従い、遊離脂肪酸画分を酸触媒法によりエチルエステル化し４６．５Ｋｇの製品を得た。グリセリド画分をアルカリ触媒法によりエチルエステル化し４９．０Ｋｇの製品を得た。

【0068】

グリセリド画分より得たエチルエステル、遊離脂肪酸画分より得たエチルエステルの両者について、特許文献９に準拠して、真空精密蒸留法によって分離精製し表１の製品を得た。

【0069】

【表1】

【0070】

各分画品から、（１）と（３）を混合したＤＨＡエチルエステル（ＤＨＡ−ＥＥ）画分１２．２Ｋｇ（ＳＤＡ ０．５％、ＥＰＡ ３．５％、ＤＨＡ ５８．９％）と、（２）と（４）を混合したＥＰＡエチルエステル（ＥＰＡ−ＥＥ）画分２１．１Ｋｇ（ＳＤＡ ２．１％、ＥＰＡ ７１．５％、ＤＨＡ ８．１％）を調製した。

【0071】

ＤＨＡエチルエステル画分とＥＰＡエチルエステル画分はそれぞれ疑似移動相クロマトグラフィー（ＳＭＢ）にて処理した。逆相（ＯＤＳ）カラム（Ｃ１８カラム４本を用いた）を装着し、溶離液にはメタノールを用いた。

【0072】

その結果、ＤＨＡエチルエステル画分から９５．２ｗｔ％ＤＨＡエチルエステルが６．８Ｋｇ（ＤＨＡ回収率７０．２％、ＰＯＶ ３．８）、ＥＰＡエチルエステル画分から９６．５ｗｔ％ＥＰＡエチルエステルが１３．６Ｋｇ（ＥＰＡ回収率７５．０％、ＰＯＶ ３．３）が回収された。

【0073】

上記ＤＨＡエチルエステル及びＥＰＡエチルエステルのそれぞれに、活性白土１．０ｗｔ％を添加し、４０℃にて１時間、減圧下で撹拌したのち、窒素ガス存在下で吸引濾過により標品を得た。この時の回収率は共に９９．０ｗｔ％（ＰＯＶ ０．５）であった。

【0074】

これら精製標品のそれぞれに、０．２ｗｔ％のＤＬ−α−トコフェロールを添加し、窒素ガス気流下で混合溶解させ製品を得た。

【0075】

（比較例１）
実施例１における酵素処理の効果を実証するために、酵素処理工程を含まないこと以外は実施例１と同様の手法で、精製を行った。なお、比較を明瞭に示すため、ＥＰＡエチルエステルの濃縮精製を追跡し、ＤＨＡエチルエステルは含めていない。

【0076】

ペルー産アンチョビー油１００．０Ｋｇ（ＡＶ ２．５、ＳＤＡ ０．７ｗｔ％、ＥＰＡ １７．５ｗｔ％、ＤＨＡ ９．２ｗｔ％）を出発原料とし、常法に従いアルカリ脱酸処理し、ＡＶ０．５の脱酸済アンチョビー油を９５．０Ｋｇ得た。

【0077】

脱酸処理した標品を、実施例１と同様にエチルエステル化し、続けて、該エチルエステルを特許文献９及び実施例１と同様に、真空精密蒸留にて分離精製し、ＥＰＡエチルエステルの中間精製品を取得した。中間精製品は、実施例１と同様にＳＭＢにて更に濃縮精製し、表２に示す結果を得た。

【0078】

【表2】

【0079】

以上の結果から、真空精密蒸留工程、クロマト工程などの濃縮精製工程において、精製純度を低下させる要因となるＳＤＡやＤＨＡの割合をＥＰＡに対して小さくすることの有効性が示されると同時に、この目的のために酵素処理工程を加えることの重要性が示された。

【0080】

（実施例２）
実施例１で用いた原料油脂とは異なる原料油脂について、酵素処理の有効性を見るために、実施例２および比較例２の実験を行った。比較を明瞭に示すため、ＥＰＡエチルエステルの濃縮精製を追跡し、ＤＨＡエチルエステルは含めていない。

【0081】

実施例２では、以下のとおり、実施例１と完全に同様の酵素処理工程を加えた処理を行った。具体的には、原料油脂として米国産メンヘーデン原油１００．０Ｋｇ（ＡＶ４．８、ＳＤＡ２．８ｗｔ％， ＥＰＡ１１．０ｗｔ％， ＤＨＡ９．１ｗｔ％）を用いた。常法に従いアルカリ脱酸処理し、ＡＶ０．５の脱酸済メンヘーデン油を９４．０Ｋｇを得た。実施例１と同様の精製を行った結果、真空精密蒸留前のＥＰＡエチルエステル画分の組成は、ＳＤＡ−ＥＥ １．２ｗｔ％、ＥＰＡ−ＥＥ ｗｔ５２．９％、ＤＨＡ １５．５ｗｔ％であったが、最終のクロマト精製後に、９５．５ｗｔ％ＥＰＡエチルエステルが４．８Ｋｇが回収された（ＥＰＡ回収率４１．４％、ＰＯＶ ３．３）。

【0082】

（比較例２）
本実施例２における酵素処理の効果を実証するために、酵素処理工程を含まないこと以外は実施例２と同様の実験を行う比較例２の実験を行った。

【0083】

実施例２と同様に、米国産メンヘーデン原油１００．０Ｋｇ（ＡＶ ４．８、ＳＤＡ ２．８ｗｔ％、ＥＰＡ １１．０ｗｔ％、ＤＨＡ ９．１ｗｔ％）を出発原料とし、常法に従いアルカリ脱酸処理し、ＡＶ０．５の脱酸済メンヘーデン油を９４．０Ｋｇを得た。

【0084】

脱酸処理した標品を比較例１と同様に、エチルエステル化し、続けて、該エチルエステルを特許文献９及び比較例１と同様に、真空精密蒸留にて分離精製し、ＥＰＡエチルエステルの中間精製品を取得した。これをクロマト法（ＳＭＢクロマトグラフィー）にて更に濃縮精製し、表３に示す結果を得た。最終のクロマト精製後に、９２．９ｗｔ％ＥＰＡエチルエステルが３．６Ｋｇが回収された（ＥＰＡ回収率３０．４％、ＰＯＶ ３．３）。

【0085】

【表3】

【0086】

以上の結果から、真空精密蒸留工程、クロマト工程などの濃縮精製工程において、精製純度を低下させる要因となるＳＤＡやＤＨＡの割合をＥＰＡに対して小さくすることの有効性が示されると同時に、この目的のために酵素処理工程を加えることの重要性が示された。

【0087】

（実施例３）
実施例１〜２で用いた原料油脂とは異なる原料油脂について、酵素処理の有効性を見るために、実施例３および比較例３の実験を行った。比較を明瞭に示すため、ＤＨＡエチルエステルの濃縮精製を追跡し、ＥＰＡエチルエステルは含めていない。

【0088】

実施例３では、以下のとおり、実施例１と完全に同様の酵素処理工程を加えた処理を行った。原料油脂として日本産カツオ原油１００．０Ｋｇ（ＡＶ ４．２、ＳＤＡ ３．３ｗｔ％、ＥＰＡ ５．６ｗｔ％、ＤＨＡ ２８．５ｗｔ％）を出発原料とし、常法に従いアルカリ脱酸処理し、ＡＶ０．３の脱酸済カツオ油を９５．０Ｋｇを得た。

【0089】

実施例１と完全に同様の酵素処理工程を加えた処理をした場合、真空精密蒸留前のＤＨＡエチルエステル画分の組成はＳＤＡ−ＥＥ ２．１ｗｔ％、ＥＰＡ−ＥＥ ｗｔ４．７％、ＤＨＡ ４７．５ｗｔ％であったが、最終のクロマト精製後に、９６．５ｗｔ％ＤＨＡエチルエステルが１７．９Ｋｇが回収された（ＥＰＡ回収率６０．１％、ＰＯＶ ３．３）。

【0090】

（比較例３）
本実施例３における酵素処理の効果を実証するために、酵素処理工程を含まないこと以外は実施例３と同様の実験を行う比較例３の実験を行った。

【0091】

脱酸処理した標品を比較例１と同様にエチルエステル化し、続けて、該エチルエステルを特許文献９及び比較例１と同様に、真空精密蒸留にて分離精製し、ＥＰＡエチルエステルの中間精製品を取得した。これをクロマト法（ＳＭＢ）にて更に濃縮精製し、表４に示す結果を得た。最終のクロマト精製後に、９９．１ｗｔ％ＤＨＡエチルエステルが１５．８Ｋｇが回収された（ＤＨＡ回収率５４．９％、ＰＯＶ ３．１）。

【0092】

【表4】

【0093】

以上の結果から、真空精密蒸留工程、クロマト工程などの濃縮精製工程において、精製純度を低下させる要因となるＳＤＡやＥＰＡの割合をＤＨＡに対して小さくすることの有効性が示されると同時に、この目的のために酵素処理工程を加えることの重要性が示された。

【0094】

（実施例４）
ペルー産アンチョビー油１００．０Ｋｇ（ＡＶ３．６、ＳＤＡ ２．９ｗｔ％，ＥＰＡ １８．３ｗｔ％，ＤＨＡ ９．０ｗｔ％）を出発原料とし、常法に従いアルカリ脱酸処理し、ＡＶ０．５の脱酸済アンチョビー油９４．０Ｋｇを得た。脱酸済アンチョビー油にエタノール１００Ｌ、リパーゼ（リパーゼＱＬＭ（名糖産業（株）製）、リパーゼＰＬ（名糖産業（株）製）、または、リポザイム（ノボザイム社製））を１０００ｕｎｉｔ／ｇ加え、４０℃で撹拌しながら約２４時間後に反応を停止し、反応液をヘキサン２００Ｌで抽出し、エタノールおよび水で洗浄した。水層（下層）は破棄した。上層（ヘキサン層）は無水硫酸ナトリウムによる脱水後、エバポレーターで濃縮した。

【0095】

濃縮物はアルミナを充填したカラムに供し、ヘキサンによる溶出液を回収し（エチルエステル化遊離脂肪酸画分）、ジエチルエーテルによる溶出液を回収した（グリセリド画分）。回収液はエバポレーターで濃縮し、それぞれの画分として回収した。グリセリド画分は６５．０ｋｇ、エチルエステル化遊離脂肪酸画分は２６．０ｋｇ取得した。

【0096】

脂質酸組成の分析は、三菱化学メディエンス株式会社 イアトロスキャンＭＫ−６Ｓを用いて行った。上記のとおり、４０℃で撹拌しながら約２４時間後に反応を停止し、停止後に回収した油の２容量％のヘキサン溶液（１μＬ）をシリカゲルロッドにスポット後、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（９０：１０：１、体積比）で３０分展開し、薄層クロマトグラフィー／ＦＩＤを用いて分析を行った。結果は、以下のとおりである。

【0097】

【表5】

【0098】

＊表中の数字はTLC/FIDによる組成％である。

【0099】

ＭＧ：モノグリセロール
ＤＧ：モノグリセロール
ＴＧ：モノグリセロール
ＥＥ：エチルエステル化。

【0100】

ＥＥ画分（エチルエステル化画分）についてのガスクロマトグラフィー分析の結果は、以下のとおりである：
ガスクロマトグラフィーは、島津製作所 ＧＣ−２０１０ｐｌｕｓを用いて行った。キャピラリーカラム等は、ＤＢ−ＷＡＸ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２５ｍｍＩＤ×３０ｍ、０．２５μｍ フィルム厚、キャリアーガス：ヘリウム、検出器：２６０℃，ＦＩＤ、注入口：２５０℃、スプリット比１：１、注入量１．５μＬ、カラム温度：２１０℃の条件で行った。

【0101】

ＧＣ分析手順は、次のとおりである。脂肪酸のエチルエステル画分については、４０℃で撹拌しながら約２４時間後に回収した油５．５μＬをヘキサン１ｍＬに溶解させＧＣで分析を行った。グリセリド画分については、グリセリド画分１６．７μＬをヘキサン２μＬに溶解させ、飽和水酸化カリウム水溶液２μＬを加えてメチル化を行い、飽和食塩水で洗浄後遠心分離し、ヘキサン層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後にＧＣで分析を行った。

【0102】

【表6】

【0103】

定法に従い、グリセリド画分をアルカリ触媒法により６４．０ｋｇのエチルエステル化グリセリドを得た。

【0104】

グリセリド画分より得たエチルエステル、遊離脂肪酸画分より得たエチルエステルの両者について、特許文献９に準拠して、真空精密蒸留法によって分離精製し表７の製品を得た。

【0105】

【表7】

【0106】

各分画品から、（１）と（３）を混合したＤＨＡエチルエステル（ＤＨＡ−ＥＥ）画分９．４Ｋｇ（ＳＤＡ ０．４％、ＥＰＡ ４．１％、ＤＨＡ ６０．４％）と、（２）と（４）を混合したＥＰＡエチルエステル（ＥＰＡ−ＥＥ）画分２１．２Ｋｇ（ＳＤＡ ３．１％、ＥＰＡ ８８．７％、ＤＨＡ ２．４％）を調製した。

【0107】

ＤＨＡエチルエステル画分とＥＰＡエチルエステル画分はそれぞれ疑似移動相クロマトグラフィー（ＳＭＢ）にて処理した。逆相（ＯＤＳ）カラム（Ｃ１８カラム４本を用いた）を装着し、溶離液にはメタノールを用いた。

【0108】

その結果、ＤＨＡエチルエステル画分から９６．１ｗｔ％ＤＨＡエチルエステルが５．５Ｋｇ（ＤＨＡ回収率５８．７％、ＰＯＶ ３．９）、ＥＰＡエチルエステル画分から９８．３ｗｔ％ＥＰＡエチルエステルが１４．２Ｋｇ（ＥＰＡ回収率７６．３％、ＰＯＶ ３．５）が回収された。

【0109】

上記ＤＨＡエチルエステル及びＥＰＡエチルエステルのそれぞれに、活性白土１．０ｗｔ％を添加し、４０℃にて１時間、減圧下で撹拌したのち、窒素ガス存在下で吸引濾過により標品を得た。この時の回収率は共に９９．０ｗｔ％（ＰＯＶ ０．５）であった。

【0110】

これら精製標品のそれぞれに、０．２ｗｔ％のＤＬ−α−トコフェロールを添加し、窒素ガス気流下で混合溶解させ製品を得た。

【0111】

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ、その範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

【産業上の利用可能性】

【0112】

本発明によって、ＥＰＡやＤＨＡなどのω３系脂肪酸エチルエステルをそれぞれ高純度品として、かつ、高収率に取得する方法が提供される。本発明により、より安価な高純度ＥＰＡやＤＨＡなどのω３系脂肪酸エチルエステルの提供が可能となる。