特許 6303017 芳香族アミノ酸を精製する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6303017

(24)【登録日】2018年3月9日

(45)【発行日】2018年3月28日

(54)【発明の名称】芳香族アミノ酸を精製する方法

(51)【国際特許分類】

   C07C 227/40 20060101AFI20180319BHJP

   C07C 229/36 20060101ALI20180319BHJP

   C07D 209/20 20060101ALI20180319BHJP

   C07D 233/64 20060101ALI20180319BHJP

   C12P 13/22 20060101ALI20180319BHJP

   C12P 13/24 20060101ALI20180319BHJP

【ＦＩ】

   C07C227/40

   C07C229/36

   C07D209/20

   C07D233/64 106

   C12P13/22 A

   C12P13/22 C

   C12P13/24 C

【請求項の数】17

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2016-545823(P2016-545823)

(86)(22)【出願日】2014年1月7日

(65)【公表番号】特表2017-506620(P2017-506620A)

(43)【公表日】2017年3月9日

(86)【国際出願番号】FR2014050015

(87)【国際公開番号】WO2015104464

(87)【国際公開日】20150716

【審査請求日】2016年12月9日

(73)【特許権者】

【識別番号】516204044

【氏名又は名称】ノヴァセプ プロセス

【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＡＳＥＰ ＰＲＯＣＥＳＳ

(74)【代理人】

【識別番号】100137800

【弁理士】

【氏名又は名称】吉田 正義

(74)【代理人】

【識別番号】100148253

【弁理士】

【氏名又は名称】今枝 弘充

(74)【代理人】

【識別番号】100148079

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 裕明

(74)【代理人】

【識別番号】100188581

【弁理士】

【氏名又は名称】堀切 康平

(74)【代理人】

【識別番号】100158241

【弁理士】

【氏名又は名称】吉田 安子

(72)【発明者】

【氏名】ダミアン ブリシャン

(72)【発明者】

【氏名】フレデリク シャブ

(72)【発明者】

【氏名】スタニスラス ボードアン

(72)【発明者】

【氏名】ヴィンセント オリーズ

【審査官】 斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／１１９３６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 欧州特許出願公開第０１１０６６０２（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 特開昭５９−０２８４８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６２−２１５５６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５６−０７３０５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０３−２２７９６３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ Ｃ０７Ｄ

Ｃ１２Ｐ１３／２２，１３／２４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

初期混合物からアミノ酸を精製する方法であって、該アミノ酸が芳香環を有し且つ酸解離定数Ｋａを有し、
該初期混合物をｐＫａ以上のｐＨで強カチオン性樹脂と接触させる第一工程；及び
第一工程での該ｐＨより高いｐＨを有し、塩基の水溶液である溶出溶液を用いて溶出し、該アミノ酸が富化された流れを回収することを可能とする第二工程を含み、
該第二工程で使用される該溶出溶液中の塩基のモル数の、該第一工程で接触させられる該初期混合物中のアミノ酸のモル数に対する比が３以下である方法。

【請求項2】

該初期混合物が、糖及び／又は塩をさらに含み、該アミノ酸が富化された該流れは、該初期混合物よりも少ない糖及び／又は塩を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

該第二工程が定組成溶出工程である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

該アミノ酸が塩基解離定数Ｋｂを有し、及び、該第一工程の間、該ｐＨがｐＫｂ−３以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

該第二工程が、中間のリンス無しに、該第一工程に直接続いて実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

該塩基は、苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニア、又はこれらの混合物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

該塩基の該溶出溶液中の濃度が０．０１〜５０ｇ／Ｌである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

該アミノ酸はトリプトファン又はフェニルアラニン又はチロシン又はヒスチジンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

該強カチオン性樹脂はポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

該強カチオン性樹脂は５〜１２％の架橋度を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

該強カチオン性樹脂は一価カチオン型である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

該方法が、複数カラムクロマトグラフィー装置に適用され、該装置は最大３０カラムを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

該方法が、非固定床を備えるクロマトグラフィー装置に適用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

該初期混合物は原料混合物の処理の末端で得られ、該原料混合物は発酵性、合成又は酵素性液であり、及び、前記処理は、遠心分離、フロント濾過、結晶化、タンジェンシャル濾過、精密濾過、及び限外濾過から選ばれる一又は二以上の工程を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

該方法は該アミノ酸が富化された流れを濃縮する一または二以上の濃縮工程を含み、該濃縮工程が、蒸発による濃縮、多重効用蒸発による濃縮、膜濃縮から選ばれる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

該濃縮工程の終わりに、一方で濃縮されたアミノ酸の流れと、及び他方で該溶出溶液の流れが回収され、該方法はこの溶出溶液の流れを該第二工程で再使用することを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

該第二工程で使用される該溶出溶液の該ｐＨと、該第一工程での該ｐＨとの差が２以上である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、芳香族アミノ酸、即ち芳香環を有するアミノ酸、及び主としてトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン及びヒスチジン、を精製する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

芳香族アミノ酸は、発酵により、酵素反応により、又は合成経路により製造することができる。

【0003】

トリプトファン、フェニルアラニン、及びヒスチジンは（子供にとって）必須アミノ酸の一種である：そのため、それらは栄養補助食品として使用されている。

【0004】

発酵、合成又は酵素的経路により製造されたアミノ酸液は不純物を含み、それらのうちには糖、残留基質、ミネラル、顔料などがある。商業的な使用において要求される純度を達成するために、これらの不純物は除去されなければならない。

【0005】

芳香族アミノ酸を精製するために種々の精製方法が開発されている。それらは、以下の主な技術に基づく：結晶化、液／液抽出及び樹脂上への結合。

【0006】

結晶化による精製は、水又は溶媒の使用により行われる。該結晶の純度を高めるために、結晶化の予備処理工程が時々用いられる。これは、活性炭による精製工程であり得る（中国特許公開第１０１２４５０４７号公報、及び中国特許公開第１０２１４６０５２号公報）；ステンレス鋼フィルター上での膜濾過工程（中国特許公開第１０１３７６６４６号公報）；限外濾過工程（中国特許公開第１０１６９１３４９号公報）；又は、いくつかの種類の不純物を除去するための、いくつかの連続濾過の組合わせ、例えば精密濾過／限外濾過／ナノ濾過連続法（中国特許公開第１０１８１２００９号公報）。

【0007】

より高い純度を達成するために、結晶化の間、時々、溶媒、例えば酢酸（日本国特許第２０９７８０１号公報及び欧州特許公開第１ ７５６ ０５５号公報）又は脂肪族アルコール（欧州特許公開第０ ２７４ ７２８号公報）が添加される。これらの溶媒の使用は、製造コスト及び母液の処理もしくは再使用のコストの増大を招く。

【0008】

第二の精製経路は、アミノ酸の液／液抽出処理からなる。例えば、逆ミセル相を形成するために界面活性剤を使用する（中国特許公開第１０２３８２０３０号公報）、又はトルエンを使用する（欧州特許公開第０ ２９９ ７１５号公報）、トリプトファンの精製法が提案されている。これらの技術は、それ自体では高純度を達成するのには決して十分ではない。前及び後処理工程が必要である。さらに、相当な量の溶媒の使用は、数キロトン／年／ユニットの工業的規模の量でアミノ酸を処理するのには経済的に不向きである。

【0009】

最後に第三の経路はポリマー樹脂上での処理である。
中国特許公開第１０１８１２４８８号公報、中国特許公開第１０１９４８４２０号公報、及び米国特許公開第２０１３／００７９５２７号公報には、アミノ酸を樹脂吸着剤（従って、中性）上で捕捉し及び結合し、次いでエタノール（最初の２つの文献中）又は塩（第三番目の文献）で溶出する。

【0010】

フランス国特許公開第２ ５８１ ６５４号公報は、低架橋度の強カチオン性ポリスチレン樹脂上へのトリプトファンの吸着を記載する。目的化合物を沈澱させ、酸溶液、とりわけｐＨ１〜２を有する硫酸溶液又は塩酸溶液に溶解させる。該酸溶液は、次いで、カチオン性イオン交換樹脂と接触させられ、それが水でリンスされた後、塩基により溶出される。この「バッチ」型の方法が、工業的に今日使用されている経路である。

【0011】

フランス国特許公開第１ ５０２ ８１４号公報は、トリプトファンの強カチオン性樹脂又は強アニオン性樹脂上の吸着を記載する。両方の場合において、選択された樹脂は低架橋度を有する。強カチオン性樹脂の場合、トリプトファンを含む混合物のｐＨが該樹脂に接触させる前に２に調整される。溶出は、二段階で行われる：汚染アミノ酸を除去するための中性塩溶液による第一溶出、及び次いで、トリプトファンを脱着させるための塩基性溶液による溶出。この方法は、二つの別々の溶出液と相当な量の再生剤を必要とする。

【0012】

上記樹脂による処理方法の欠点は、結合後にアミノ酸を溶出させるための、濃い（通常、２〜１０質量％）化学的再生剤の大量の消費を要することである。再生剤と等しい量の廃液も同様に引き起こされる。

【0013】

米国特許第５，３００，６５３号明細書は、最初にアルカリ金属で塩型に転換されたゲル型強カチオン性樹脂の単一カラム上での少なくとも一の芳香族アミノ酸の、他の非芳香族アミノ酸からのバッチ毎の分離を記載する。該アミノ酸を含む溶液は、好ましくはｐＨ２〜１２を有する。該アミノ酸は該溶液が該樹脂上を通過するときに吸着され、次いで、酸又は塩基又は有機溶剤を使用せずに、水によって脱着される。

【0014】

この方法の欠点は、溶出モードにおいて樹脂のイオン型の制御が可能ではない事である。実際、処理される該溶液中に存在する該カチオン種は、アルカリ金属に交換され得、いかなる溶出液も初期のイオン型を維持することはできない。アミノ酸間の分離性能は、これらの時宜を逸したイオン交換機構に影響される：従って、時間が経つと、生成されるアミノ酸の収率及び純度が制御されない態様で減じ又は変化する危険性がある。

【0015】

樹脂上でのこれらの処理の大抵のものは、「バッチ」型の適用、即ち、非連続的適用に基づく。該樹脂がカラムに装備され、次々と溶出液（アミノ酸を含む液；リンス水；再生溶液−塩、塩基、酸又はアルコール溶液）が該カラムを通して連続的に注がれる。

【0016】

しかし、上記文献米国特許公開第２０１３／００７９５２７号公報は、３つの分離ゾーンを有する疑似移動床（ＳＭＢ）を含むクロマトグラフィーシステムにおけるＸＡＤ７型吸着樹脂上での半連続的分離を記載する。該システムは、水又は塩により溶出される。この方法は、吸着樹脂、従ってイオン交換樹脂より高価な樹脂上での操作の欠点を有する。吸着樹脂は速く汚染され易い。これらの使用は、該汚染の原因である不純物を除くため、アルコール、塩基、及び酸での洗浄を必要とし、それはコスト及び設置された装置の点で操作上の制限を増す。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0017】

【特許文献1】中国特許公開第１０１２４５０４７号公報

【特許文献2】中国特許公開第１０２１４６０５２号公報

【特許文献3】中国特許公開第１０１３７６６４６号公報

【特許文献4】中国特許公開第１０１６９１３４９号公報

【特許文献5】中国特許公開第１０１８１２００９号公報

【特許文献6】日本国特許第２０９７８０１号公報

【特許文献7】欧州特許公開第１ ７５６ ０５５号公報

【特許文献8】欧州特許公開第０ ２７４ ７２８号公報

【特許文献9】中国特許公開第１０２３８２０３０号公報

【特許文献10】欧州特許公開第０ ２９９ ７１５号公報

【特許文献11】中国特許公開第１０１８１２４８８号公報、

【特許文献12】中国特許公開第１０１９４８４２０号公報

【特許文献13】米国特許公開第２０１３／００７９５２７号公報

【特許文献14】フランス国特許公開第２ ５８１ ６５４号公報

【特許文献15】フランス国特許公開第１ ５０２ ８１４号公報

【特許文献16】米国特許第５，３００，６５３号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

従って、芳香族アミノ酸を精製するための改良された方法、特に最低限の化学物質の消費で、標的アミノ酸と不純物、例えば塩、糖、色との分離を可能とする方法、を開発する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明は、第一に初期混合物からアミノ酸を精製する方法であって、該アミノ酸が芳香環を有し且つ酸解離定数Ｋａを有する方法に関し、該方法は以下を含む：
該初期混合物をｐＫａ以上のｐＨで強カチオン性樹脂と接触させる第一工程；
第一工程での該ｐＨより高いｐＨを有する溶出液水溶液を用いて溶出し、該アミノ酸が富化された流れを回収することを可能とする第二溶出工程。

【0020】

一の実施態様に従い、該初期混合物は糖及び／又は塩をさらに含み、該アミノ酸が富化された該流れは、該初期混合物よりも少ない糖及び／又は塩を含む。

【0021】

一の実施態様に従い、該第二溶出工程は、定組成溶出工程である。

【0022】

一の実施態様に従い、該アミノ酸が塩基解離定数Ｋｂを有し、及び、該第一工程の間、該ｐＨがｐＫｂ−３以下、好ましくはｐＫｂ−４以下、最も好ましくはｐＫｂ−５以下であり、及び理想的にはｐＫｂ−６以下である。

【0023】

一の実施態様に従い、該第二溶出工程が、中間のリンス無しに、第一接触工程に直接続いて実施される。

【0024】

一の実施態様に従い、該溶出溶液は、塩基の水溶液であり、該塩基は、好ましくは苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニア、又はこれらの混合物であり、及びより特に好ましくはアンモニアである。

【0025】

一の実施態様に従い、該塩基の該溶出溶液中の濃度が０．０１〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２０ｇ／Ｌ、より特に０．５〜１０ｇ／Ｌ、及び最も特に１〜５ｇ／Ｌである。

【0026】

一の実施態様に従い、該第二工程で使用される該溶出溶液中の塩基のモル数の、該第一工程で接触させられる該初期混合物中のアミノ酸のモル数に対する比が３以下、好ましくは２以下、好ましくは１．５以下、好ましくは１以下、好ましくは０．９以下、好ましくは０．８以下、好ましくは０．７以下、好ましくは０．６以下、好ましくは０．５以下、好ましくは０．４以下である。

【0027】

一の実施態様に従い、該アミノ酸はトリプトファン又はフェニルアラニン又はチロシン又はヒスチジンである。

【0028】

一の実施態様に従い、該強カチオン性樹脂はポリスチレン−ジビニルベンゼン共重合体である。

【0029】

一の実施態様に従い、該強カチオン性樹脂は５〜１２％、好ましくは６〜１１％、より特に７〜１０％、好ましくは８〜９％の架橋度を有する。

【0030】

一の実施態様に従い、該強カチオン性樹脂は一価カチオン型、好ましくはＮａ^＋又はＫ^＋又はＮＨ_４^＋型であり、及び最も好ましくはＮＨ_４^＋型である。

【0031】

一の実施態様に従い、該方法は複数カラムクロマトグラフィー装置に適用され、該装置は好ましくは最大３０カラム、より好ましくは最大２０カラム、又は最大１２カラム、又は最大８カラム、又は最大６カラムを含む。

【0032】

一の実施態様に従い、該方法は非固定床を備えるクロマトグラフィー装置に適用され、及び好ましくは疑似移動床、又は真性移動床、又は改良された疑似移動床、又は連続的疑似移動床、及び好ましくは連続的疑似移動床、を備えるクロマトグラフィー装置に適用される。

【0033】

一の実施態様に従い、該初期混合物は原料混合物の処理の末端で得られ、該原料混合物は好ましくは発酵性、合成又は酵素性液であり、及び、前記処理は好ましくは、遠心分離、フロント濾過、結晶化、タンジェンシャル濾過、精密濾過、及び限外濾過から選ばれる一又は二以上の工程を含む。

【0034】

一の実施態様に従い、該方法はアミノ酸が富化された流れを濃縮する一または二以上の工程を含み、好ましくは蒸発による濃縮、及びとりわけ流下膜による蒸発、多重効用蒸発による濃縮、膜濃縮、及びとりわけナノ濾過から選ばれる。

【0035】

一の実施態様に従い、該濃縮工程の終わりに、一方で濃縮されたアミノ酸の流れと、及び他方で溶出溶液の流れが回収され、該方法はこの溶出溶液の流れを第二溶出工程で再使用することを含む。

【0036】

一の実施態様に従い、該第二工程で使用される該溶出溶液のｐＨと、該第一工程のｐＨとの差が２以上、好ましくは４以上、より特に６以上、及びとりわけ８以上である。

【発明の効果】

【0037】

本発明によれば、先行技術の欠点を克服することが可能である。該発明は、芳香族アミノ酸を精製する改良された方法をより特に提供し、とりわけ標的アミノ酸と不純物、例えば塩、糖、色との分離を最低限の化学物質の消費で可能とする。

【0038】

これは強カチオン性樹脂（イオン交換樹脂）の使用によって達成され、それはイオン交換モードでは使用されない。該発明はクロマトグラフィー溶出モードに基づき、該芳香族アミノ酸は該樹脂との親和性による遅延現象によって、その初期溶液から分離される。このようにして、該発明はそのほとんどが両性イオンの形態である該アミノ酸を、（該アミノ酸のｐＫａ以上のｐＨで）該樹脂と接触させ、次いで、より高いｐＨの溶液で溶出させることを企図する。

【0039】

該動作モードは、該アミノ酸の固定化による捕捉現象、及びそれに続く濃再生溶出液を用いた脱着を適用する既存の方法と異なる。

【0040】

いかなる理論にも束縛される意図ではないが、本発明者らは、適用される分離機構は、おそらく芳香族基のパイ結合及び／又はアミノ酸の環に存在する窒素原子の電子対（ｄｏｕｂｌｅｔ）と、該樹脂マトリックスの疎水性官能基の間の疎水性相互作用による吸着現象と考える。従って該分離はイオン交換による分離から成るものではない。

【0041】

本発明は、とりわけ希薄溶出溶液と、より低い溶出液／アミノ酸比を適用することによって、化学物質の消費及び廃液の量を最小限にすることを可能とする。

【0042】

該発明は、生成されるアミノ酸の収率及び純度の実質的な変動が無い、制御された様式での精製機構の実施を可能とする。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】図１は本発明に従う方法の実施が可能である装置を概略的に示す。

【図2】図２は、クロマトグラフィー分離カラム中への注入体積（横軸はＢＶ又は「ベッド体積」、即ち床体積の倍数）に対するトリプトファン濃度（ｇ／Ｌ、○）、導電率（ｍＳ／ｃｍ、Ｘ）、及び固形分（Ｂｒｉｘ度、■）の経時変化を示す。動作条件は、実施例１に明記される。

【図3】図３はＳＳＭＢ型精製システムのいくつかのクロマトグラフィーカラム上（横軸、カラム番号）でのトリプトファン濃度（ｇ／Ｌ、左軸、○）、導電率（ｍＳ／ｃｍ、左軸、Ｘ）、及び固形分（Ｂｒｉｘ度、右軸、■）の経時変化を示す。動作条件は、実施例２に明記される。

【図4】図４はクロマトグラフィー分離カラム中への注入体積（横軸はＢＶ）に対するフェニルアラニン濃度（ｇ／Ｌ、○）、導電率（ｍＳ／ｃｍ、Ｘ）、及び固形分（Ｂｒｉｘ度、■）の経時変化を示す。動作条件は、実施例３に明記される。

【図5】図５はクロマトグラフィー分離カラム中への注入体積（横軸はＢＶ）に対するヒスチジン濃度（ｇ／Ｌ、○）、導電率（ｍＳ／ｃｍ、Ｘ）、及び固形分（Ｂｒｉｘ度、■）の経時変化を示す。動作条件は、実施例４に明記される。

【発明を実施するための形態】

【0044】

本発明がより詳細に及び非限定的な様式で以下に記載される。

【0045】

本発明は、一般に種々の性質の不純物：色素、塩／ミネラル、糖を含む水溶液（発酵された、合成の、又は酵素反応からの液）である、初期混合物中の芳香族アミノ酸を精製された形態で回収することを可能とする。

【0046】

従って、一の実施態様に従い、初期混合物は、糖、例えば発酵栄養物（グルコース及び／又は蔗糖等）及び／又は代謝物を含む。初期混合物中の糖の合計含有量（及び特に単糖類及び二糖類の含有量）は、従って、例えば０．０１〜１００ｇ／Ｌ及び好ましくは０．１〜１５ｇ／Ｌであってよい。

【0047】

一の実施態様に従い、初期混合物は塩を含み、それはミネラル塩及び／又は有機塩であってよい。初期混合物中の塩の合計含有量は、従って例えば０．０１〜８０ｇ／Ｌ及び好ましくは０．５〜２０ｇ／Ｌであってよい。

【0048】

初期混合物の導電率は、例えば１〜２００ｍＳ／ｃｍ、好ましくは２〜１００ｍＳ／ｃｍ及びとりわけ５〜５０ｍＳ／ｃｍであってよい。

【0049】

一の実施態様に従い、初期混合物は培養液（又は酵素反応）の清澄化による予備処理の終端で得られる。この清澄化操作は種々の技術で行われて良い：
−デカンテーション／遠心分離。
−カットオフ閾値が典型的には２，０００〜３００，０００Ｄａの平面又はらせん状有機膜でのタンジェンシャル濾過。
−カットオフ閾値が典型的には１０，０００Ｄａより大きいセラミック膜でのタンジェンシャル濾過。
−ステンレス鋼フィルターでの濾過。
−上記操作の組合わせ、但し、その順番は該初期混合物の性質及び該方法の目的に依存して適宜調整される。

【0050】

芳香族アミノ酸は好ましくはフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン又はそれらの誘導体である。芳香族アミノ酸の混合物の回収も好ましくあり得る。

【0051】

本発明は強カチオン性樹脂上でのクロマトグラフィー分離を提供する。「強カチオン性樹脂」は、グラフトされた強酸性の酸官能基を有する樹脂を意味する。

【0052】

一の好ましい実施態様において、「強カチオン性樹脂」は、スルホン酸官能基を有する樹脂を意味する。

【0053】

一の実施態様に従い、カチオン性樹脂は強カチオン性ポリスチレン−ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）樹脂である。

【0054】

一の実施態様に従い、樹脂は粒子の形態であり、その体積平均径（Ｄｖ５０）が好ましくは２０〜６００μｍ、とりわけ２００〜３５０μｍである。好ましくは、粒子の体積径の分布は唯一のピーク（単分散）を有する。この分布の均等係数は例えば１．５以下、又は１．３以下、又は１．１５以下である。この樹脂粒子サイズ分布は、レーザー粒度分析計（ＮＦ１３３２０標準）により求めてよい。

【0055】

樹脂は、好ましくはマクロ架橋樹脂（及び従って、ゲル型樹脂ではない）である。そこで、本発明の実施態様に従い、樹脂の架橋度（樹脂が上記共重合体の場合にはジビニルベンゼン（ＤＶＢ）比）は５〜６％；又は６〜７％；又は７〜８％；又は８〜９％；又は９〜１０％；又は１０〜１１％；又は１１〜１２％である。架橋度は、樹脂の製造において用いられる架橋剤モノマー（例えばＤＶＢモノマー）の量の、合計モノマー量（例えばＤＶＢモノマーと樹脂の他のモノマー）に対する比（これらの量はモル量で表される）である。

【0056】

一実施態様に従い、樹脂は一価型である。例えばそれはＮａ^＋、Ｋ^＋又は好ましくはＮＨ_４^＋型であってよい。

【0057】

所望により、本発明の方法は、樹脂を所望のイオン型、とりわけＮａ^＋、Ｋ^＋又は好ましくはＮＨ_４^＋型にする、コンディショニング準備工程を含んでよい。準備工程は、とりわけ、好適な塩又は塩基溶液を樹脂の上を通過させることによって実施してよい。

【0058】

アミノ酸は弱酸及び弱塩基として振る舞う。それらは酸解離定数Ｋａ及び塩基解離定数Ｋｂを有する。ｐＫａ＝−ｌｏｇ_１０（Ｋａ）及びｐＫｂ＝−ｌｏｇ_１０（Ｋｂ）と定義される。ｐＫａ及びｐＫｂは半解離ｐＨ、即ち酸官能基及び塩基官能基が夫々半分イオン化されているｐＨである。

【0059】

酸官能基及びアミン（塩基）官能基の双方がイオン化されているアミノ酸の形態は両性イオンと呼ばれる。

【0060】

上記四種の芳香族アミノ酸のｐＫａ及びｐＫｂ値は、以下のとおりである：
フェニルアラニン：ｐＫａ＝１．８及びｐＫｂ＝９．１。
トリプトファン：ｐＫａ＝２．４及びｐＫｂ＝９．４。
チロシン：ｐＫａ＝２．２及びｐＫｂ＝９．１。
ヒスチジン：ｐＫａ＝１．８及びｐＫｂ＝９．２。

【0061】

本発明は、初期混合物（又は負荷又は原料製品）をクロマトグラフィー樹脂と接触させ、次いで溶出する工程を提供する。

【0062】

第一工程において、アミノ酸が顕著に両性イオンの形態であることを確実にするために、ｐＨは所望の芳香族アミノ酸のｐＫａ（又は所望の芳香族アミノ酸がいくつかある場合には、それらのｐＫａ）以上である。

【0063】

いくつかの実施態様に従い、第一工程の間のｐＨはｐＫａ＋０．５以上；又はｐＫａ＋１以上；又はｐＫａ＋１．５以上；又はｐＫａ＋２以上；又はｐＫａ＋２．５以上；又はｐＫａ＋３以上である。

【0064】

但し、第一工程の間のｐＨは、ｐＫａ＋３以下；又はｐＫａ＋２．５以下；又はｐＫａ＋２以下；又はｐＫａ＋１．５以下；又はｐＫａ＋１以下；又はｐＫａ＋０．５以下であってもよい。

【0065】

いくつかの実施態様に従い、第一工程の間のｐＨはｐＫｂ−３以下；又はｐＫｂ−３．５以下；又はｐＫｂ−４以下；又はｐＫｂ−４．５以下；又はｐＫｂ−５以下；又はｐＫｂ−５．５以下；又はｐＫｂ−６以下である。

【0066】

例えば、第一工程の間のｐＨは、ｐＫａとｐＫｂ−３の間、又はｐＫａとｐＫｂ−４の間、又はｐＫａとｐＫｂ−５の間、又はｐＫａとｐＫｂ−６の間である。

【0067】

いくつかの実施態様に従い、第一工程の間のｐＨは、１．８〜１．９；又は１．９〜２．０；又は２．０〜２．１；又は２．１〜２．２；又は２．２〜２．３；又は２．３〜２．４；又は２．４〜２．５；又は２．５〜２．６；又は２．６〜２．７；又は２．７〜２．８；又は２．８〜２．９；又は２．９〜３．０；又は３．０〜３．２；又は３．２〜３．４；又は３．４〜３．６；又は３．６〜３．８；又は３．８〜４．０；又は４．０〜４．５；又は４．５〜５．０；又は５．０〜５．５；又は５．５〜６．０；又は６．０〜６．５；又は６．５〜７．０である。

【0068】

原料（初期混合物）のｐＨは、樹脂と接触させる前に酸又は塩基を添加することによって調整してよい。

【0069】

第二工程において、溶出液は第一工程でのｐＨより大きいｐＨを有する水溶液である。溶出液は、塩基性水溶液、例えば、とりわけＮＨ_３又はＮａＯＨ溶液であり得る。

【0070】

第二工程と第一工程のｐＨの差（ΔｐＨ）は、０．５〜１．０；又は１．０〜１．５；又は１．５〜２．０；又は２．０〜２．５；又は２．５〜３．０；又は３．０〜３．５；又は３．５〜４．０；又は４．０〜４．５；又は４．５〜５．０；又は５．０〜５．５；又は５．５〜６．０；又は６．０〜６．５；又は６．５〜７．０；又は７．０〜７．５；又は７．５〜８．０；又は８．０〜８．５；又は８．５〜９．０；又は９．０〜９．５；又は９．５〜１０．０；又は１０．０〜１０．５；又は１０．５〜１１．０；又は１１．０〜１１．５；又は１１．５〜１２．０であってよい。

【0071】

溶出液のｐＨ（第二工程）は、とりわけ、７．０〜７．５；又は７．５〜８．０；又は８．０〜８．５；又は８．５〜９．０；又は９．０〜９．５；又は９．５〜１０．０；又は１０．０〜１０．５；又は１０．５〜１１．０；又は１１．０〜１１．５；又は１１．５〜１２．０；又は１２．０〜１２．５；又は１２．５〜１３．０；又は１３．０〜１３．５；又は１３．５〜１４．０であってよい。

【0072】

溶出液は、塩基、例えばＮａＯＨ又はＮＨ_３、の水溶液であってよく、その濃度は０．００１〜０．０１ｇ／Ｌ；又は０．０１〜０．１ｇ／Ｌ；又は０．１〜０．５ｇ／Ｌ；又は０．５〜１ｇ／Ｌ；又は１〜２ｇ／Ｌ；又は２〜３ｇ／Ｌ；又は３〜４ｇ／Ｌ；又は４〜５ｇ／Ｌ；又は５〜６ｇ／Ｌ；又は６〜７ｇ／Ｌ；又は７〜８ｇ／Ｌ；又は８〜９ｇ／Ｌ；又は９〜１０ｇ／Ｌ；又は１０〜１５ｇ／Ｌ；又は１５〜２０ｇ／Ｌ；又は２０〜２５ｇ／Ｌ；又は２５〜５０ｇ／Ｌ；又は５０〜１００ｇ／Ｌであってよい。

【0073】

一の実施態様において、溶出に使用される塩基のモル数の、注入されたアミノ酸のモル数に対する比は、３以下、又は２以下、又は１．５以下、又は１以下、又は０．９以下、又は０．８以下、又は０．７以下、又は０．６以下、又は０．５以下、又は０．４以下である。

【0074】

溶出は、好ましくは定組成溶出であり、即ち溶出液の組成は時間で変化しない。

【0075】

好ましい実施態様において、溶出に使用される塩基のカチオンは、樹脂のカチオンである。従って、例えば、仮に樹脂がＮａ^＋型であれば、溶出液はＮａＯＨの水溶液であり；仮に樹脂がＫ^＋型であれば、溶出液はＫＯＨの水溶液であり；及び仮に樹脂がＮＨ_４^＋型であれば、溶出液はアンモニアの水溶液である。

【0076】

塩基による溶出は、樹脂のイオン型を維持することを可能とし、さもなくば原料溶液中に存在するミネラル塩によって変わり得る。さらに、何らの理論にも縛られないが、本発明者は樹脂に対する浸透性電荷効果（ｅｆｆｅｔ ｄｅ ｃｈａｒｇｅ ｏｓｍｏｔｉｑｕｅ）も吸着種を放出する傾向があると推測する。

【0077】

所望の芳香族アミノ酸は、大抵の他の不純物よりも樹脂に対して強い親和性を有する。従って、アミノ酸が抽出分で回収される一方、不純物（例えば糖及び塩）がラフィネート（ｒａｆｆｉｎａｔ）画分で回収される。

【0078】

一の実施態様に従い、抽出分中の糖（特に単糖類及び二糖類）の合計質量は、初期混合物中の糖（特に単糖類及び二糖類）の合計質量に基づき、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．９％減じられる。好ましくは、抽出分（アミノ酸が富化された流れ）には、糖（特に単糖類及び二糖類）が無いか、実質的に無い。

【0079】

一の実施態様に従い、抽出分中の塩の合計質量は、初期混合物中の塩の合計質量に基づき、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．９％減じられる。好ましくは、抽出分（アミノ酸が富化された流れ）には、塩が無いか、実質的に無い。

【0080】

一の実施態様において、何らかの高度に保持される不純物は、水性の、塩の、又は極性の溶出液による追加の溶出によって脱着され得る。

【0081】

一の実施態様において接触工程と溶出工程との中間のリンス工程が無い。溶出液の注入は、従って、初期混合物の注入に直接、続く。

【0082】

一の実施態様に従い、クロマトグラフィー分離由来の抽出分中に回収されたアミノ酸には、例えば以下の追加の処理が行われる：
−炭による脱色。
−脱ミネラル。
−逆浸透型膜又はナノ濾過膜による濃縮。
−蒸発又は多重効用蒸発、それはエネルギー消費の最適化を可能とする。
−結晶化。
−上記操作の組合わせ。その順番は初期混合物の性質及び方法の目的に依存して適宜調整される。

【0083】

好ましい実施態様に従い、溶出液（好ましくはＮＨ_３溶液）がアミノ酸から分離され、及び、クロマトグラフィー分離工程の開始点にリサイクルするために、上記後処理工程の間に回収される。

【0084】

本発明に従う方法は、非連続法（「バッチ法」）、半連続法又は連続法であってよい。好ましくは、半連続法又は連続法である。

【0085】

本発明に従うクロマトグラフィー分離は、固定床を備えるクロマトグラフィーユニット内で、又は好ましくは非固定床を備えるクロマトグラフィーユニット内で適用され得る。

【0086】

固定床を備えるクロマトグラフィーシステムにおいて、分離されるべき化合物の混合物は、一般的に円筒形状の容器（又はカラム）中に浸透する。カラムは、多孔性材料床（固定相）を備え、それは流体が浸透可能である。混合物中の各化合物の浸透速度は、化合物の物理的特性に依存する。固定相上で最も保持される化合物は、固定相上により弱く保持される化合物に比べて、ゆっくり浸透する。この原理が所望の分離を実施することを可能とする。

【0087】

そのような処理は、直列又は並列のいくつかのカラム上で実施することが可能であるが、一般には固定床を備えるクロマトグラフィー分離は、単一カラムに適用される。

【0088】

そのような固定床を備えるクロマトグラフィーシステムの例は、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）又はＣＹＣＬＯＪＥＴ（登録商標）システム（固定床内でリサイクルするシステム）である。

【0089】

ＣＹＣＬＯＪＥＴ（登録商標）システムは、米国特許第６，０６３，２８４号明細書に記載されており、明示的にそれを引用する。これは、単一カラムを備える非連続的クロマトグラフィー分離システムであり、（ｉ）最も保持される種及び（ｉｉ）より弱く保持される種がカラムの出口で別々に回収され、クロマトグラムの非分離部が主ポンプによりリサイクルされる；そして、分離されるべき混合物が、実質的にクロマトグラムのリサイクル部分の中央部に位置する注入ループにより周期的に注入される。いくつかのクロマトグラフィーサイクルの後、プロセスが周期的に定常状態に達し、状態では注入する製品の量がカラムの出口で別々に回収される分離された製品の量と同じである。

【0090】

二つのカラムを用いたＣＹＣＬＯＪＥＴ（登録商標）システムの他の態様が米国特許第５，６３０，９４３号明細書に記載されており、明示的にそれを引用する。

【0091】

非固定床を用いるシステムは、マルチカラムシステムであり、システムでは固定相床、及び流れの中の注入または回収点（ポイント）の相対的位置が時間と共に動く。

【0092】

非固定床を備えるクロマトグラフィーシステムの例は、ＳＭＢ（疑似移動床）、ｉＳＭＢ（改良された疑似移動床）、ＳＳＭＢ（連続的疑似移動床）、ＡＭＢ（真性移動床）、ＶＡＲＩＣＯＬ（登録商標）、ＭＯＤＩＣＯＮ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＦＥＥＤ（登録商標）、ＭＣＳＧＰ又はＧＳＳＲ（マルチカラムグラジエントクロマトグラフィー）システムである。

【0093】

ＳＭＢシステムは、吸着剤を含む複数の個別のカラムを備え、それらが直列に接続されている。溶出液が、第一の方向に沿ってカラムを亘って流れる。原料フロー及び溶出液フローの注入点及び分離された化合物を回収する点が周期的及び同時に一組のバルブによってシフトされる。全体的な効果は、固体吸着剤の移動床を含み、固体吸着剤が溶出液フローに対して向流方向に動く、単一カラムの動作を模することである。このように、ＳＭＢシステムは、溶出液が通過するところの、固体吸着剤の固定床を含む複数のカラムからなるが、その動作は向流での連続的移動床を模するようなものである。

【0094】

ＳＭＢシステムの最も伝統的な形態は、４つのゾーンを備えるＳＭＢシステムである。他の可能な形態は、（Ｋｗａｎｇｎａｍ Ｌｅｅ、「２セクション疑似移動床プロセス」、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３５巻（４）、第５１９−５３４頁、２０００年に記載されているような）３つのゾーンを備えるＳＭＢシステム及び２つのゾーンを備えるＳＭＢシステムである（文献を明示的に引用する）。

【0095】

ｉＳＭＢ及びＳＳＭＢシステムには、製品の導入又は取り出しが無い、閉鎖ループで動作する少なくとも一の工程がある。

【0096】

ｉＳＭＢシステムは、欧州特許公開第０ ３４２ ６２９号公報、及び米国特許第５，０６４，５３９号明細書に記載されており、それらを明示的に引用する。

【0097】

ＳＳＭＢシステムは、導入及び回収のフローを周期的に適用されるサブシーケンスに分ける。

【0098】

ＳＭＢシステムの他の態様は以下のとおりである：時間で変化するＳＭＢシステム、及び、ＰＯＷＥＲＦＥＥＤ（登録商標）、これらは米国特許第５，１０２，５５３号明細書及びＺｈａｎｇら、「疑似移動床のパワーフィード操作：スイッチング間隔の間に流速を変化させる」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、第１００６巻、第８７−９９頁、２００３年に記載され、それらを明示的に引用する；ＭＯＤＩＣＯＮ（登録商標）システム、これは米国特許第７，４７９，２２８号明細書に記載され、それを明示的に引用する；及び内部再循環を行うＳＭＢシステム、これは米国特許第８，２８２，８３１号に記載され、それを明示的に引用する。

【0099】

ＡＭＢシステムは、ＳＭＢシステムと類似の動作をする。しかし、一組のバルブによって原料フローと溶出フローの注入点、並びに回収点を変化させる代わりに、一組の吸着ユニット（カラム）が、原料及び回収点に対して、物理的に移動される。動作は、連続式向流移動床を模することを可能とする。

【0100】

ＶＡＲＩＣＯＬ（登録商標）クロマトグラフィーシステムは、米国特許第６，１３６，１９８号明細書、米国特許第６，３７５，８３９号明細書、米国特許第６，４１３，４１９号明細書、及び米国特許第６，７１２，９７３号明細書に記載されており、それらを明示的に引用する。ＶＡＲＩＣＯＬ（登録商標）システムは、吸着剤を含む複数の個別のカラムを含み、それらが直列に結合されている。溶出液がカラム中を第一の方向に通過させられる。ＳＭＢシステムと異なり、システムにおいて、分離されるべき混合物及び溶出液の注入点及び分離された化合物の回収点が、一組のバルブによって、周期的に、非同期的に移動される。全体的な効果は、時間経過と共に種々の長さの分離ゾーンが生成することであり、これによって、ゾーンにおいて最も有用な固定相を動的に割り当てて、より少ないクロマトグラフィー分離ユニットによって同等の分離力と向上された生産性を可能とする。ＳＭＢシステムと異なり、ＶＡＲＩＣＯＬ（登録商標）システムは、溶出フローに対して向流方向に動く、固体吸着剤移動床を含む単一カラムの動作を模するのではなく、従って、ＶＡＲＩＣＯＬ（登録商標）の動作原理は、同等のＡＭＢシステムには適用できない。

【0101】

疑似移動床の好ましい例が、６つのセル又はカラムでの連続疑似移動床型（ＳＳＭＢ）のクロマトグラフィーシステムの形態である図１を参照して示される。このシステムは、４つの段階の循環操作に従い操作されてよい。
−第１段階（図１Ａ）：溶出液を注入せずに、一のセルの間隙体積を次のセルへと移動するための、直列に位置された全てのセル上の閉ループ内の連続循環が維持されるループ段階。
−第２段階（図１Ｂ）：原料／原料の注入。原料（Ｆ）が第４セルの頂部に注入される。同時に、実質的に同一体積の回収液（Ｒ）が第５セルの出口で回収される。ここでは第４及び第５セルは第３ゾーンを形成する。第２及び第３セルが抽出分及び原料注入の間の分離ゾーンを形成する。ここでは、これらが第２ゾーンを形成する。
−第３段階（図１Ｂ）：抽出分の溶出。溶出液（ＥＬ）が抽出分（ＥＸ）を溶出するために第１セル上に注入され、それは第１セルの底部で、実質的に同一体積で回収される。ここでは、第１セルが第１ゾーンを形成する。
−第２及び第３段階は、システムの生産性を増すために好ましくは同時に行われる。
−第４段階：ラフィネートの溶出：溶出液（ＥＬ）が第１セルの頂部に注入され、及び、実質的に同一体積のラフィネート（Ｒ）が第５セルの出口で回収される。第６セルは、ここで抽出分の終端とラフィネートの先端との分離を確実にする可能性を付与するためのバッファーセルである。これは第４ゾーンを形成する。このゾーンは、純度及び／又は所望の収率の度合いが比較的限定されているときには、除いてもよい。

【0102】

この好ましい実施態様において、これらの段階は、１〜４のこの順で操作される。これらのシーケンスで、完全なシーケンスが形成される。

【0103】

各シーケンス（第１〜第４段階）が、システムの左から右へ、セル番号を増やすことで、セルの入口と出口をずらしながら６回繰り返される：原料が、第１シーケンスで第１セルの頂部に、次いで、第２シーケンスでは第２セルの頂部に注入される、等々。

【0104】

６つの連続シーケンスの完了後、最初に第１セルの入口であった原料の注入点が、再び第１セルの入口に戻ったときに、完全な製造サイクルが達成される。

【0105】

以上において、セルがカラムに対応するときの場合に関してＳＳＭＢシステムの記載が為された。これは限定的なものではなく、発明はセル、又はさらに区画が、カラムの一部分であるシステムにも適用される。

【0106】

さらに、第１、２、３、４ゾーンに存在するカラムの数は、所望の分離の品質に依存して変えてもよい。従って、同じ型のシステムを１つのセル、２つのセル、３つのセル、４つのセル及び１２のセル、又はそれより多くのセルで構築することが可能である。

【0107】

方法は、閉ループ又は国際公開２００７／０１２７５０号に記載のＤＣＣシステムのようなオープンループでの、非連続マルチカラム装置にも適用され得る。

【0108】

一の実施態様に従い、マルチカラム装置（とりわけＳＭＢ型等）は、一又はいくつかのクリーニングゾーンを含み、強く吸着している化合物（不純物）を周期的に脱着し、次いで再生し及び分離の溶出液と吸着剤を再バランスさせるために、分離ループのカラムの切り離しを可能とする。

【実施例】

【0109】

以下の実施例は、本発明を、それらに限定することなく説明する。
［実施例１−トリプトファンの保持の検討］
この例では、ｐＨ＝２．６に調整され、セラミック膜上で精密濾過及びダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）予備処理後のトリプトファン発酵液が処理される。

【0110】

製品はカラム当たり３０ｍＬ（この例では、３０ｍＬが１ベッド体積（ＢＶ）である）のＡｐｐｌｅｘｉｏｎ（登録商標）ＸＡ２０１４−２２樹脂で処理される。樹脂は８％ＤＶＢのポリスチレン−ＤＶＢポリマー型の強カチオン性樹脂であり、単分散の粒径２２０μｍ及びイオン交換容量１．８当量／Ｌ_樹脂を有する。樹脂は４％ＮａＯＨ水溶液で予めＮａ型に転換される。

【0111】

クロマトグラフィー工程用の初期混合物は、１７．５ｇ／Ｌのトリプトファン、３．７ｇ／Ｌの糖、及び溶液中の塩による１８．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。

【0112】

この混合物が樹脂上に過剰量注入される。注入段階の間、樹脂上での異なる種の異なる挙動が観察される：
−塩不純物は、樹脂上に保持されない：それらのイオン電荷と樹脂の電荷との間のイオン排除現象がそれらのマトリックス中への浸透を阻止するものと考えられる。溶出段階の間、カラム出口で初期混合物と同じ導電率が測定される。
−糖、それは中性種であり、樹脂マトリックス中に浸透し得、そして少し減速されるが、保持されない：それらは注入段階の間、塩と一緒に溶出される。
−注入されたトリプトファンは、ｐＨ＝２．６で大半が両性イオン型であり、そのため、その芳香環と樹脂のそれとの相互作用により遅延現象を起こす。

【0113】

このようにして保持されたトリプトファンの溶出分が２ＢＶ／ｈで、４ｇ／Ｌ濃度のＮａＯＨにより得られる。

【0114】

図２は、システム中の、ラフィネートの溶出の開始から抽出分のリンスの終わりまで、分離工程の全行程が起こるポイントにおける、濃度の時間による変化を示す。段階Ａは初期混合物の注入段階であり、段階ＢはＮａＯＨ水溶液による溶出段階である。
このシステムは、下記性能での動作を可能とする：
−８時間製造サイクルでの、樹脂１Ｌ当たり２０５．６ｇのトリプトファンの処理；
−トリプトファン抽出分の回収の間、９９．５％の脱ミネラル化に相当する１００μＳ／ｃｍ未満の導電率。

【0115】

［実施例２−トリプトファンのマルチカラム分離］
この例では、本発明が４０ｇ／Ｌのトリプトファンを含むｐＨ＝４の発酵液に対し、連続及びマルチカラムシステム上でのクロマトグラフィーモードにおいて適用される。主な不純物は基質の残渣、ミネラル、並びに細胞代謝の固体状残渣である。

【0116】

該液のｐＨはここではＨ_２ＳＯ_４を添加して２．７に調整される。このｐＫａより大きいｐＨで、トリプトファンのほとんどが両性イオン型である。

【0117】

次いで、セラミック膜によりタンジェンシャル精密濾過で浄化される。固体懸濁物質は膜に維持され、保持分と呼ばれる画分に濃縮される。トリプトファン並びに可溶性不純物のほとんどのものは、膜を通過して浸透分と呼ばれる画分へと運ばれる。

【0118】

濃縮の最後に、保持分画分中に水を添加することによって、希釈し及び保持分を再濃縮することが可能である：この操作はダイアフィルトレーションと呼ばれ、保持分画分中の残渣量を減らすことでトリプトファンの全体収率の上昇を可能とする。

【0119】

このようにして処理された精密濾過浸透分は、液中に当初存在したトリプトファンの９８％を１５ｇ／Ｌの濃度で含む。そのなかに存在する不純物は２５ｇ／Ｌのミネラル塩：その導電率は１５．９ｍＳ／ｃｍである。３ｇ／Ｌの糖レベルも測定される。

【0120】

この浸透分は上記ＳＳＭＢシステムに投入するための製品として使用される。

【0121】

上記ＳＳＭＢ原理に従い、この特定の例で使用されるシステムは、以下のように分布されたカラムとして適用された９つの分離セルからなる。
−ゾーン１：３つのカラム＝トリプトファン溶出ゾーン；
−ゾーン２：２つのカラム＝分離ゾーン；
−ゾーン３：３つのカラム＝トリプトファンの減速ゾーン；
−ゾーン４：１つのカラム＝ループゾーン

【0122】

各カラムは、４７５ｍＬのＡｐｐｌｅｘｉｏｎ（登録商標）ＸＡ２０１４−２２樹脂を含む。床体積（ベッド体積）の大きさは従って：１ＢＶ＝４７５ｍＬである。

【0123】

樹脂は、最初に３ＮのＮＨ_３を注ぐことによってＮＨ_４^＋型にされる。

【0124】

システムは４．５ＢＶ／ｈで操作される。

【0125】

原料製品をゾーン３の頂部に注入する。各製造期間において、７．５ＢＶの原料製品を注入する。３つのカラム上において、トリプトファンが樹脂による遅延現象によって減速され、それによってゾーンの出口で「ラフィネート」と言われる画分として溶出及び回収される不純物から分離される。不純物の主なもの（塩及び糖）がこのラフィネート内へと溶出される：その導電率は１７．６ｍＳ／ｃｍである。

【0126】

システムは、０．１％の初期トリプトファンがラフィネート画分中へと溶出するように調整される。

【0127】

ゾーン１の頂部において、２ｇ／Ｌ（溶出液）に薄められたアンモニアが注入され、それはトリプトファンの脱着を可能とする。各製造期間において、５ＢＶの溶出液が注入される。トリプトファンは「抽出」画分と呼ばれるこの溶出の間に回収される。抽出分の導電率は、２００μＳ／ｃｍ未満である：これは原料製品に対して９８．８％の脱ミネラル化であり、残留糖の８９％の減少、及び色の７５％の減少も観測される。

【0128】

非常に少量のアンモニア溶出液が使用される：溶出液／原料製品比は、０．６７（体積／体積）である。また、この操作の間濃縮現象も観察される：トリプトファンが（原料製品中の１５ｇ／Ｌに対して）２０ ｇ／Ｌで溶出される。初期トリプトファンの９９％超がこの工程の間抽出分中に回収される。ＳＳＭＢサイクルの各シーケンスにおいて、使用されたＮＨ_３の量は、１．４７モル／Ｌ樹脂のトリプトファンの注入量に対して、樹脂１Ｌ当たり０．５９モルである（トリプトファン１モル当たり０．４モルのＮＨ_３である）：これは、保持機構がイオン交換ではないことを示す。

【0129】

連続操作、及びループ工程の間に、９つのカラムにおいて観測されたプロフィールを図３に示す。

【0130】

トリプトファン濃度、Ｂｒｉｘ（乾燥分濃度を示す）、及び導電率（塩不純物の濃度を示す）のプロフィールがそこに示される。トリプトファンの溶出ゾーン（ゾーン１，カラム２、３及び４）とラフィネートの回収のためのゾーン（ゾーン３、カラム７、８及び９）の分離が、このように観察される。

【0131】

［実施例３−フェニルアラニンの保持の検討］
この例は、ｐＨ＝２に調整し、次いでセラミック膜上でマイクロ濾過することによって予備処理したフェニルアラニンの発酵液に適用される。

【0132】

製品が１カラム当たりの体積３０ｍＬ＝１ＢＶの、Ａｐｐｌｅｘｉｏｎ（登録商標）ＸＡ２０１４−２２樹脂で処理される。樹脂は、３％ＮＨ_３により予めＮＨ_４^＋型に転換され、リンスされ、次いで２ｇ／ＬのＮＨ_３を通過させてバランスされる。

【0133】

クロマトグラフィー原料製品は、３２．７６ｇ／Ｌのフェニルアラニンを含み、及び媒体の塩濃度により３６．８ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。

【0134】

原料製品の過剰量が４ＢＶ／ｈで樹脂上に注入される：フェニルアラニンの塩及び糖に対する保持、次いで、アミノ酸のリークが観察される。アミノ酸の出口での濃度が入口での濃度と同じになったら、原料製品の注入が中止される。

【0135】

フェニルアラニンの溶出が４ＢＶ／ｈで、２ｇ／Ｌ濃度のＮＨ_３で達成される。

【0136】

図４は、システム中の、分離工程における、ラフィネートの溶出の開始から抽出分のリンスの終了迄の全ての分離工程の発生が見られるポイントにおける濃度の時間変化を示す。段階Ａは初期混合物の注入段階であり、段階ＢはＮＨ_３溶液による溶出段階である。

【0137】

このシステムは下記性能での動作を可能とする。
−６．７５時間の製造周期で、樹脂１Ｌ当たり１６９ｇのフェニルアラニンの処理。
−フェニルアラニン抽出分の回収の間、９８．５％の脱ミネラル化に相当する約６００μＳ／ｃｍの導電率。

【0138】

［実施例４−ヒスチジンの保持の検討］
この実施例は、１７．４８ｍＳ／ｃｍの導電率を有し、３．９ｇ／Ｌの糖を含む、１２．９８ｇ／Ｌのヒスチジン溶液から出発する。溶液のｐＨは、Ｈ_２ＳＯ_４を添加して、予め２．７に調整される。

【0139】

製品は１カラム当たり１７ｍＬの体積（＝１ＢＶ）の、Ａｐｐｌｅｘｉｏｎ（登録商標）ＸＡ２０１４−２２樹脂で処理される。樹脂は予め３％ＮＨ_３によりＮＨ_４^＋型に転換され、リンスされ、次いで２ｇ／ＬのＮＨ_３を通過させてバランスされる。

【0140】

原料製品の過剰量が２ＢＶ／ｈでカラム上に注入される：ヒスチジンの保持現象が、次いでアミノ酸のリークが観察される。アミノ酸の出口での濃度が入口での濃度と等しくなったら、原料製品の注入が中止される。

【0141】

ヒスチジンの溶出が２ＢＶ／ｈで、２ｇ／Ｌ濃度のＮＨ_３により達成される。

【0142】

図５は、システム中の、ラフィネートの溶出の開始から抽出分のリンスの終了迄の全ての分離工程の発生が見られるポイントにおける濃度の時間変化を示す。段階Ａは初期混合物の注入段階であり、段階ＢはＮＨ_３溶液による溶出段階である。

【0143】

このシステムは下記性能での動作を可能とする。
−３０時間の製造周期で、樹脂１Ｌ当たり１２０ｇのヒスチジンの処理。
−ヒスチジン抽出分の回収の間、９８．８％の脱ミネラル化に相当する約２２０μＳ／ｃｍの導電率。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】