特許 6306513 抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6306513

(24)【登録日】2018年3月16日

(45)【発行日】2018年4月4日

(54)【発明の名称】抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20180326BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180326BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20180326BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/08

【請求項の数】6

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2014-548811(P2014-548811)

(86)(22)【出願日】2012年12月19日

(65)【公表番号】特表2015-500879(P2015-500879A)

(43)【公表日】2015年1月8日

(86)【国際出願番号】US2012070486

(87)【国際公開番号】WO2013096380

(87)【国際公開日】20130627

【審査請求日】2015年11月12日

(31)【優先権主張番号】61/577,817

(32)【優先日】2011年12月20日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】アルデルファー，クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】ジャネッキー，ダリウス

(72)【発明者】

【氏名】リウ，シュエソン

(72)【発明者】

【氏名】マードック，メリッサ

(72)【発明者】

【氏名】ウ，シェン−ジウン

(72)【発明者】

【氏名】メルケン，マーク

(72)【発明者】

【氏名】バンダーミーレン，マーク

(72)【発明者】

【氏名】マリア，トーマス

【審査官】 高山 敏充

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／１４４７１１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００５９０９３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３７のＶＨの抗原結合部位と配列番号３８のＶＬの抗原結合部位とを含む、ＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体。

【請求項2】

配列番号３７のＶＨの抗原結合部位をコードするポリヌクレオチドと、配列番号３８のＶＬの抗原結合部位をコードするポリヌクレオチドとを含む、単離ポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項4】

請求項３に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項5】

請求項４に記載の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞によって産生される抗体を回収することを含む、ＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を製造する方法。

【請求項6】

請求項１に記載の抗体と薬学的に許容できる担体とを含む、ｔａｕ凝集体を低減するための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１１年１２月２０日出願の米国仮出願第６１／５７７，８１７号の利益を主張し、その内容全体を参照することにより本明細書に援用する。

【0002】

本発明は、抗ＰＨＵ−ｔａｕ抗体、並びにその製造方法及び使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

アルツハイマー病（ＡＤ）は、徐々に激しい精神機能低下を導き、最終的には死に至らしめる、記憶、認知、論理的思考、判断力、及び情動安定性の進行性喪失を臨床的特徴とする、退行性脳障害である。ＡＤは、高齢者の進行性精神機能不全（認知症）の非常に一般的な原因であり、米国では４番目に多い死亡の医学的原因を表すと考えられている。ＡＤは、世界中の民族で観察され、現在及び未来の主たる公衆衛生の問題を提示する。

【0004】

ＡＤ個体の脳は、老人性（又はアミロイド）斑、アミロイド血管症（血管におけるアミロイド沈着）及び神経原線維変化と呼ばれる特徴的な病変を呈する。これら病変の大多数、特にアミロイド斑及び対らせん状細線維の神経原線維変化は、一般にＡＤ患者の記憶及び認知機能に重要なヒトの脳の幾つかの領域で見られる。

【0005】

ＡＤ及び幾つかの他の神経変性疾患における神経原線維変性の主なタンパク質成分は、高リン酸化形態の微小管結合タンパク質ｔａｕである。ｔａｕ凝集体を予防又はクリアランスする治療法の開発は、長年にわたって関心の対象であるが、抗凝集化合物及びキナーゼ阻害剤を含む候補薬物は、臨床試験が始まったばかりである（Ｂｒｕｎｄｅｎ等．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ８：７８３〜９３，２００９）。

【0006】

最近、ｔａｕについての能動及び受動免疫が治療可能性を有している可能性があるという前臨床的エビデンスが、トランスジェニックｔａｕマウスモデルにおいて得られた（Ｃｈａｉ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６：３４４５７〜６７，２０１１，ＢｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔＣｈａｉ等、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ １１８：６５８〜６７，２０１１，ＢｏｕｔａｊａｎｇｏｕｔＣｈａｉ等、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３０：１６５５９〜６６，２０１０，ＡｓｕｎｉＣｈａｉ等、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２７：９１１５〜２９，２００７）。最近、タウオパシーの伝達及び拡散仮説が報告されたが、これは、ヒト脳におけるタウオパシー進行のＢｒａａｋ段階と前臨床的ｔａｕモデルにおけるｔａｕ凝集体を注射した後のタウオパシー拡散に基づいている（ＦｒｏｓｔＣｈａｉ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４：１２８４５〜５２，２００９，ＣｌａｖａｇｕｅｒａＣｈａｉ等、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：９０９〜１３，２００９）。したがって、ＡＤ及び他の神経変性疾患を治療するためにｔａｕ凝集体及びタウオパシー進行を防ぐ治療法が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の１つの態様は、配列番号３５又は３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位と配列番号３６又は３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。

【0008】

本発明の別の態様は、特定の重鎖及び軽鎖の相補性決定領域を含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。

【0009】

本発明の別の態様は、配列番号３５のＶＨの抗原結合部位と配列番号３６のＶＬの抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。

【0010】

本発明の別の態様は、配列番号３７のＶＨの抗原結合部位と配列番号３８のＶＬの抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。

【0011】

本発明の別の態様は、配列番号３５のＶＨの抗原結合部位と配列番号３６のＶＬの抗原結合部位とを含むか、又は配列番号３７のＶＨの抗原結合部位及び配列番号３８のＶＬの抗原結合部位を含むモノクローナル抗体とＰＨＦ−ｔａｕとの結合について競合する単離抗体又は断片である。

【0012】

本発明の別の態様は、本発明の抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドである。

【0013】

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。

【0014】

本発明の別の態様は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。

【0015】

本発明の別の態様は、本発明の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞によって産生される抗体を回収することを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を製造する方法である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＡＴ８の競合を示す。

【図2】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＰＴ１の競合を示す。

【図3】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＰＴ３の競合を示す。

【図4】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＡＴ１００の競合を示す。

【図5】様々な抗ｔａｕ抗体による標識ＨＴ７の競合を示す。

【図6】図に示す通り生理食塩水、マウスＩｇＧ１、ＰＴ３、又はＡＴ８で処理した５月齢のメスのＰ３０１Ｌトランスジェニック動物、又は未処理非トランスジェニック動物（Ｂ６）由来の脳幹ホモジネート（画分Ｐ１）におけるリン酸化ｔａｕの分析である。捕捉抗体としてＡＴ８（左のパネル）又はＡＴ１００（右のパネル）、次いでビオチン化−ＨＴ７及びアビジン−ＨＲＰを用いてＥＬＩＳＡを行った。非トランスジェニック動物（Ｂ６）由来の平均サンプルと同じＥＬＩＳＡシグナルを提供するＡＤ脳ホモジネートの相対量（ｎｇ／ｍＬ）としてＥＬＩＳＡシグナルをプロットする。平均＋／−Ｓ．Ｄ．と共にデータを個々にプロットし、ＰＴ３処理動物とＩｇＧ１処理動物との間の差についてのｐ値を示す。（Ｂ）は、ＡＴ１００を用いた、ＩｇＧ１処理動物又はＰＴ３処理動物由来の脳幹ホモジネート画分Ｐ１のウエスタンブロットである。ＩｇＧ１（ＩｇＧ１〜ＩｇＧ１０）で処理した１０匹の動物、及びＰＴ３（ＰＴ３−１、ＰＴ３−２、ＰＴ３−７〜ＰＴ３−１０）で処理した７匹の動物のホモジネートから得られたシグナルを示す。アクチンをローディングコントロールとして用いた。

【図7】図に示す通りＰＴ３又はアイソタイプ対照（ＩｇＧ）で処理した５月齢のメスのＰ３０１Ｌトランスジェニックマウスに由来するサルコシル可溶性（ｐＴ４可溶性）皮質ホモジネート中の合計ｔａｕレベル、不溶性（ｐＴ４不溶性）皮質ホモジネート中の合計ｔａｕレベル、及び不溶性（ＡＴ８不溶性）皮質ホモジネート中のリン酸化ｔａｕレベルである。レベルは、平均＋／−ＳＤと共に個々にプロットされたＥＬＩＳＡのシグナルの尺度として示す。サンプル１ｍ ｉｎｊは、ｔａｕ凝集体を注射したＰ３０１Ｌマウス脳に由来するポジティブコントロールサンプルである。

【発明を実施するための形態】

【0017】

用語「抗体」は、本明細書において広義に用いられ、ポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト適合化、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、並びに抗体断片を含む、免疫グロブリン又は抗体分子を含む。

【0018】

一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体の構造は、周知である。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列をもとに、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの大きなクラスに分類することができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のアイソタイプに更に分類される。あらゆる脊椎動物種の抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）の２つの明確に異なるタイプのうちの１つに分類することができる。

【0019】

用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を意味する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂及びＦｖ断片、ＣＤＲ，抗原結合部位、重鎖又は軽鎖可変領域、二重特異性抗体、単鎖抗体分子、及び少なくとも２つのインタクトな抗体又はその断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

【0020】

免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、「抗原結合部位」が割り込んだ「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、以下の様々な表現を使用して定義されている。（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいている（Ｗｕ及びＫａｂａｔ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜５０，１９７０）。一般的に、抗原結合部位は、各可変領域（重鎖可変領域（ＶＨ）におけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）に３つのＣＤＲを有する（Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋによって定義されている通り構造が超可変的である抗体可変ドメインの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１〜１７，１９８７）。一般的に、抗原結合部位は、各ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの超可変領域を有する。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋは、構造的に保持されているＨＶを「カノニカル構造」と呼んでいる。ＣＤＲ及びＨＶの付番体系及び注釈は、最近、Ａｂｈｉｎ及びＭａｒｔｉｎにより改訂された（Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ及びＭａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３８３２〜９，２００８）。（ｉｉｉ）免疫グロブリン由来のＶドメインとＴ細胞受容体との比較に基づいた、抗原結合部位を形成する領域の別の定義が、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３）により提案されている。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、これら領域の標準的な付番及び定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの記述間の対応については、Ｌｅｆｒａｎｃ等の上記に記載されている。（ｉｖ）抗原結合部位は特異性決定残基の使用（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜４３，２００４）に基づいて概説することもできる。特異性決定残基（ＳＤＲ）は、抗原との接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基を指す。

【0021】

「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位の配列であると定義されるもの以外の、抗体の可変領域内の残りの配列である。抗原結合部位の正確な定義は、上述したような様々な表現により決定され得るため、正確なフレームワーク配列は、抗原結合部位の定義に依存する。

【0022】

本明細書で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体断片）を意味する。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、通常、単一の抗原決定基に対する。

【0023】

用語「エピトープ」は、本明細書で使用するとき、抗体が特異的に結合する抗原の部分を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸、リン酸化アミノ酸、又は多糖類側鎖等の部分の化学的に活性な（例えば、極性、非極性又は疎水性の）表面分類からなり、特定の３次元構造特性及び特定の帯電特性を有しうる。エピトープは事実上直鎖状であってもよく、又はアミノ酸の直線状の配列ではなく、抗原の連続していないアミノ酸間の空間的な関係によって形成される不連続エピトープ（例えば、立体構造エピトープ）であってもよい。立体構造エピトープには、抗原の直線状配列の異なる部分のアミノ酸同士が３次元空間で近接するような抗原の折り畳みによって生じるエピトープが含まれる。

【0024】

ｔａｕは、多数の周知のアイソフォームを有する豊富な中枢及び末梢神経系タンパク質である。ヒトのＣＮＳでは、オルタナティブスプライシングによって３５２〜４４１のサイズの６種の主なｔａｕアイソフォームが存在する（Ｈａｎｇｅｒ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １５：１１２〜９，２００９）。これらアイソフォームは、０〜２個のＮ末端挿入及び３又は４個のタンデムに配置された微小管結合反復配列が制御されて含まれることにより互いに異なっており、０Ｎ３Ｒ（配列番号１）、１Ｎ３Ｒ（配列番号２）、２Ｎ３Ｒ（配列番号３）、０Ｎ４Ｒ（配列番号４）、１Ｎ４Ｒ（配列番号５）、及び２Ｎ４Ｒ（配列番号６）と呼ばれる。用語「コントロールｔａｕ」とは、本明細書で使用されるとき、リン酸化及び他の翻訳後修飾を受けていない配列番号６のｔａｕアイソフォームを指す。

【0025】

ｔａｕは、微小管に結合し、ｔａｕのリン酸化によって調節され得るプロセスである、細胞を通じたカーゴの輸送を制御する。ＡＤ及び関連する疾患においては、ｔａｕの異常リン酸化が広く生じ、これは、ｔａｕの対らせん状細線維（ＰＨＦ）と呼ばれる原線維への凝集の前に生じるか又は前記凝集を誘発すると考えられる。ＰＨＦの主な成分は、高リン酸化ｔａｕである。用語「対らせん状細線維−ｔａｕ」又は「ＰＨＦ−ｔａｕ」は、本明細書で使用されるとき、対らせん状細線維における周知のｔａｕ凝集体を指す。ＰＨＦ構造における２つの主な領域であるファジーコート及びコアフィラメントは、電子顕微鏡で明らかであり、ファジーコートは、タンパク質分解に対して感受性であり、かつフィラメントの外側に位置し、フィラメントのプロテアーゼ耐性コアは、ＰＨＦの骨格を形成する（Ｗｉｓｃｈｉｋ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８５：４８８４〜８，１９８８）。

【0026】

本明細書で使用するとき、「ＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体」は、ウエスタンブロットで評価したときにＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を指す。典型的に、ＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体は、５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）ＴＢＳ−Ｔ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１時間ブロッキングした後、約５００ｎｇのＰＨＦ−ｔａｕをクマシー染色した後に評価することができる。ＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体は、コントロールｔａｕ及びＰＨＦ−ｔａｕの両方がＰＨＦ−ｔａｕエピトープに対する選択性を有しないｔａｕ抗体（例えば、抗体ＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））によって等しく検出される抗原ローディング条件下で試験したときにウエスタンブロットによって測定すると、場合によっては、コントロールｔａｕ（配列番号６）に結合しない。（Ｍｅｒｃｋｅｎ等、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５８：５４８〜５３，１９９２）。このような例示的な抗原ローディング条件は、５００ｎｇのＰＨＦ−ｔａｕ及び２００ｎｇのコントロールｔａｕである。

【0027】

本明細書では、従来周知のアミノ酸の１文字表記及び３文字表記を用いる。

【0028】

物質の組成
本発明は、抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体及びこのような抗体の使用に関する。このような抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体は、ＰＨＦ−ｔａｕのリン酸化エピトープに結合する特性を有していてもよく、ＰＨＦ−ｔａｕの非リン酸化エピトープに結合する特性を有していてもよい。抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体は、治療法として、或いは生物学的サンプル、例えば、組織又は細胞においてＰＨＦ−ｔａｕを検出するための研究又は診断試薬として有用であり得る。

【0029】

本発明の１つの実施形態は、配列番号３５若しくは３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位、又は配列番号３６若しくは３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位を含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。表１は、例示的な重鎖及び軽鎖可変領域に加えてＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａに従って定義した本発明の例示的な抗体の抗原結合部位残基を示す。

【0030】

別の実施形態では、本発明の抗体のＶＨの抗原結合部位は、それぞれ配列番号７、８、及び９又は１３、１４、及び１５の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２ （ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）を含む、或いは本発明の抗体のＶＬの抗原結合部位は、それぞれ配列番号１０、１１、及び１２又は１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１ （ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３（ＬＣＤＲ３）を含む。

【0031】

本発明の別の実施形態は、配列番号３５又は３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位、及び配列番号３６又は３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位を含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。

【0032】

別の実施形態では、本発明の抗体のＶＨの抗原結合部位は、それぞれ配列番号７、８、及び９又は１３、１４、及び１５の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）を含む、或いは本発明の抗体のＶＬの抗原結合部位は、それぞれ配列番号１０、１１、及び１２又は１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１ （ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３（ＬＣＤＲ３）を含む。

【0033】

【表1】

【0034】

実施例で説明する実施形態は、１つは重鎖に由来し、１つは軽鎖に由来する１対の可変領域を有しているが、当業者であれば代替的な実施形態は、重鎖又は軽鎖の可変領域を単独で有してもよいということを認識するであろう。１つの可変領域を用いて、例えばＰＨＦ−ｔａｕに結合することが可能な２ドメイン特異的抗原結合断片を形成することが可能な可変ドメインについてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、国際特許公開第９２／０１０４７号に開示される階層的二重コンビナトリアルアプローチを用いたファージディスプレイスクリーニング法によって実現することが可能である。このアプローチでは、Ｈ鎖又はＬ鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて他方の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全なライブラリを感染させ、得られた二本鎖特異的抗原結合ドメインを上述のようなファージディスプレイ法に従って選択する。

【0035】

本発明の別の態様は、配列番号３５の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位と配列番号３６の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。

【0036】

本発明の別の態様は、配列番号３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位と配列番号３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。

【0037】

本発明の別の実施形態は、それぞれ配列番号７、８、及び９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号１０、１１、及び１２の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３（ＬＣＤＲ３）とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。

【0038】

本発明の別の実施形態は、それぞれ配列番号１３、１４、及び１５の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１（ＨＣＤＲ１）、２（ＨＣＤＲ２）及び３（ＨＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、２（ＬＣＤＲ２）及び３ （ＬＣＤＲ３）とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体である。

【0039】

前述の実施形態のいずれかでは、ＰＨＦ−ｔａｕに結合する単離抗体をヒト化してもよい。

【0040】

本発明の抗体は、多様な方法により、例えば、ハイブリドーマ法等の様々な技術によって作製することができる（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜７，１９７５）。アクセプター抗体（通常、別の哺乳動物種、例えば、ヒト）に由来する軽鎖及び重鎖定常領域と関連してドナー抗体（通常、マウス）に由来する軽鎖及び重鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている方法によって調製することができる。非ヒトドナー免疫グロブリン（通常、マウス）に由来するＣＤＲと１以上のヒト免疫グロブリンに由来する分子の残りの免疫グロブリン由来部分とを有するＣＤＲグラフトｍＡｂは、米国特許第５，２２５，５３９号に開示されているような当業者に公知の技術によって調製することができる。任意の非ヒト配列も有さない完全なヒトｍＡｂは、（Ｌｏｎｂｅｒｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜９，１９９４，Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８４５〜５１，１９９６，Ｍｅｎｄｅｚ等、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １５：１４６〜５６，１９９７）に参照される技術によってヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製することができる。また、ヒトｍＡｂは、ファージディスプレイライブラリから調製及び最適化することもできる（Ｋｎａｐｐｉｋ等、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７〜８６，２０００，Ｋｒｅｂｓ等、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４：６７〜８４，２００１，Ｓｈｉ等、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５〜９６，２０１０）。

【0041】

抗体のヒト化は、周知の方法を用いて行うことができ、例えば、特異性決定残基リサーフェシング（ＳＤＲＲ）（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ等、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９〜９８，１９９１）、超ヒト化（国際公開第０４／００６９５５号）、及びヒト繊維含量最適化（米国特許第７，６５７，３８０号）である。グラフト化／ヒト化に有用なヒトフレームワーク配列は、当業者であれば関連するデータベースから選択することができる。選択されたフレームワークは、Ｑｕｅｅｎ等（Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８６：１００２９〜３３，１９８９）又は米国特許出願公開第２０１１／００９２３７２号に開示されている技術等の技術によって結合親和性を保存又は増強するために更に修飾してもよい。

【0042】

免疫用抗原又は単離抗体として用いるためのＰＨＦ−ｔａｕのファージディスプレイライブラリからの調製は、任意の好適な技術を用いて行うことができる。例示的な方法では、ＰＨＦ−ｔａｕは、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７：５８２７〜３１，１９９０）に記載のような周知のプロトコールを用いてＡＤ患者の脳から単離される。ＰＨＦ−ｔａｕは、アルツハイマー患者の死後皮質から単離してもよい。単離ＰＨＦ−ｔａｕは、その純度及びＰＨＦ−ｔａｕと反応することが知られている抗体による過剰リン酸化状態を特徴とする。典型的なＰＨＦ−ｔａｕ調製では、ウエスタンブロットにおける約６０、６４、６８、及び７２ｋＤａで移動する過剰リン酸化バンド（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ａｎｄ Ｇｏｅｄｅｒｔ Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２１：４２８〜３３，１９９８）は、過剰リン酸化ＰＨＦ−ｔａｕに特異的に結合するが、脱リン酸化ＰＨＦ−ｔａｕには結合しないＡＴ８抗体によって検出される。

【0043】

本発明の抗体は、配列番号６のコントロールｔａｕには結合しないという特徴を有し得る。このような抗体は、上記方法を用い、ウエスタンブロットにおいてコントロールｔａｕに結合しないかことについて抗体を試験し、次いで、上記の通りクマシー染色することにより作製してもよい。コントロールｔａｕは、組換え的に発現させ、標準的な方法を用いて精製してもよい。ＰＨＦ−ｔａｕに結合するが、コントロールｔａｕには結合しない例示的な抗体は、抗体ＰＴ１及びＰＴ３である。本発明の抗体は、コントロール及びＡＤ脳切片において、例えば、免疫組織化学を用いて、その特異性について更に評価してもよい。

【0044】

本発明の抗体は、解離定数（Ｋ_D）が約１０^-7、１０^-8、１０^-9、１０^-10、１０^-11、又は１０^-12Ｍ以下であるＰＨＦ−ｔａｕに対する親和性を有し得る。ＰＨＦ−ｔａｕに対する所与の分子の親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。このような方法は、当業者に既知のＢｉａｃｏｒｅ、ＰｒｏｔｅＯｎ又はＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡ又は競合的結合アッセイを利用してもよい。

【0045】

本発明の別の態様は、配列番号３５の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位及び配列番号３６の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位、又は配列番号３７の重鎖可変領域（ＶＨ）の抗原結合部位及び配列番号３８の軽鎖可変領域（ＶＬ）の抗原結合部位を含むモノクローナル抗体とＰＨＦ−ｔａｕ結合について競合する単離抗体又は断片である。

【0046】

ＰＨＦ−ｔａｕに対する結合間の競合は公知の方法によってインビトロでアッセイすることができる。例えば、未標識抗体の存在下におけるＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ−タグ（商標）ＮＨＳ−エステル標識抗体のＰＨＦ−ｔａｕに対する結合は、イムノアッセイ、次いで、電気化学発光検出を用いて評価することができる。

【0047】

競合的結合に加えて、幾つかの周知の方法を用いて、本発明の抗体の結合エピトープを決定することができる。例えば、両方の個別の構成成分の構造が知られている場合、インシリコでタンパク質−タンパク質のドッキングを行って、適合する相互作用部位を特定することができる。抗原抗体複合体において水素−重水素（Ｈ／Ｄ）交換を行うことによって抗体が結合しうる抗原の領域をマッピングすることができる。抗原のセグメント及び点突然変異誘発を用いることにより、抗体の結合に重要なアミノ酸の位置を特定することができる。抗体−抗原複合体の共結晶構造を使用して、エピトープ及びパラトープに寄与する残基を特定することができる。

【0048】

本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＭアイソタイプのモノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は、二重特異的又は多重特異的であってもよい。例示的な二重特異性抗体は、ＰＨＦ−ｔａｕの２つの異なるエピトープに結合することができるか、又はＰＨＦ−ｔａｕ及びアミロイドベータ（Ａβ）に結合することができる。別の例示的な二重特異性抗体は、ＰＨＦ−ｔａｕと、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様成長因子−１受容体、及びリポタンパク質受容体等の内因性血液脳関門トランスサイトーシス受容体とに結合することができる。例示的な抗体は、ＩｇＧ１タイプである。

【0049】

本発明の抗体の免疫エフェクター特性は、当業者には周知の技術により、Ｆｃ修飾によって強化又はサイレンシングさせることも可能である。例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等のＦｃエフェクター機能は、これら活性に関与するＦｃの残基を修飾することによって提供及び／又は制御することができる。また、薬物動態特性は、抗体の半減期を延長するＦｃドメインの残基を突然変異させることによって強化することができる（Ｓｔｒｏｈｌ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：６８５〜９１，２００９）。

【0050】

更に、本発明の抗体は、グリコシル化、異性化、又は脱グリコシル化等の反応によって、或いはポリエチレングリコール部分の付加（ペグ化）及び脂質化等の自然界では生じない共有結合修飾等の反応によって翻訳後修飾してもよい。このような修飾は、インビボ又はインビトロで行われてもよい。例えば、本発明の抗体はポリエチレングリコールと複合体化（ＰＥＧ化）することによって薬物動態特性を向上させることができる。複合体化は、当業者に既知の方法によって行うことができる。治療用抗体とＰＥＧとの複合体化は、機能に干渉することなく薬効を強化することが示されている（Ｋｎｉｇｈｔ等、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９〜１８，２００４，Ｌｅｏｎｇ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６〜１９，２００１，Ｙａｎｇ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １６：７６１〜７０，２００３）。

【0051】

本発明の別の実施形態は、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチド、又はその補体、又はその断片である。例示的な単離ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号７、８、及び９又は１３、１４、及び１５に示す免疫グロブリン重鎖ＣＤＲであるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むポリペプチド、或いはそれぞれ配列番号１０、１１、及び１２又は１６、１７、及び１８に示す免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲであるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに本発明の抗体可変領域をコードする配列番号３１〜３４に示す配列を有するポリヌクレオチドである。遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの選好性を考慮すると、本発明の抗体をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明の単離核酸は、周知の組換え又は合成技術を用いて作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法を用いて容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマを作製する場合、かかる細胞は、かかるＤＮＡ源として機能し得る。或いは、例えばファージ又はリボソームディスプレイライブラリ等のコード配列及び翻訳産物が連結しているディスプレイ技術を用いると、結合剤及び核酸の選択が簡略化される。ファージ選択後、ファージに由来する領域をコードする抗体を単離し、ヒト抗体又は任意の他の所望の抗原結合断片を含む抗体全体を作製するために用い、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主内で発現させることができる。

【0052】

本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むベクターである。かかるベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってもよい。

【0053】

本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞である。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってもよい。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものが挙げられる。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣＮｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株等のハイブリドーマ又は骨髄腫細胞株等の不死化細胞株が挙げられる。ヒト骨髄腫細胞株の一例としては、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）が挙げられる。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６１、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）のようなチャイニーズハムスターに由来する卵巣（ＣＨＯ）細胞又はＤＧ４４が挙げられる。

【0054】

本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞によって産生された抗体を回収することを含む、ＰＨＦ−ｔａｕと結合する抗体の製造方法である。抗体を製造して精製する方法は、当該技術分野で周知である。

【0055】

治療方法
本発明の抗体の抗原結合部位を含むＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ断片、又は抗体を含む本発明の抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体又はその断片を用いて、ＡＤ又は任意の他のタウオパシーに罹患している患者等、脳内にｔａｕの病理学的凝集体を含む神経変性疾患を有する患者における症状を治療、低減、又は予防することができる。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本発明の抗体は、病理学的ｔａｕ凝集体を低減し、ひいては脳におけるＰＨＦ−ｔａｕの量を低減することによって有益な効果を発揮し得る。本発明の抗体を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。かかる動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜等の哺乳動物が挙げられる。例えば、本発明の抗体は、ＡＤの治療のための薬剤の調製においても有用であり、前記薬剤は、本明細書に定められる投薬量で投与するために調製される。

【0056】

本発明の別の実施形態は、ｔａｕの凝集体を低減するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明の単離抗体を患者に投与することを含む、それを必要としている患者におけるｔａｕの凝集体低減する方法である。

【0057】

本発明の別の実施形態は、神経変性疾患の症状を治療又は低減するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明の単離抗体を患者に投与することを含む、患者におけるｔａｕの凝集体を伴う神経変性疾患の症状を治療又は低減する方法である。

【0058】

上記実施形態のいずれかでは、ｔａｕの凝集体を伴う神経変性疾患は、タウオパシーである。

【0059】

上記実施形態のいずれかでは、単離抗体は、配列番号３５のＶＨの抗原結合部位と配列番号３６のＶＬの抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を含む。

【0060】

上記実施形態のいずれかでは、単離抗体は、配列番号３７のＶＨの抗原結合部位と配列番号３８のＶＬの抗原結合部位とを含むＰＨＦ−ｔａｕに結合する抗体を含む。

【0061】

本明細書で使用するとき、「タウオパシー」は、脳内のｔａｕの病理学的凝集体を伴う任意の神経変性疾患を包含する。家族性及び特発性ＡＤに加えて、他の例示的なタウオパシーは、１７番染色体に連鎖しているパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性、ピック病、進行性皮質下グリオーシス、神経原線維型痴呆症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、嗜銀性グレイン認知症、筋萎縮性側索硬化症パーキンソン認知症症候群、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、亜急性硬化性全脳炎、筋緊張性ジストロフィ、神経原線維変化を伴う非グアナミン運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソニズム、及び慢性外傷性脳症、例えば、ボクサー痴呆（ボクシング病）である（Ｍｏｒｒｉｓ等、Ｎｅｕｒｏｎ ７０：４１０〜２６，２０１１）。

【0062】

タウオパシーに関連する行動的表現型としては、認知障害、初期人格変化及び脱抑制、感情鈍麻、無為症、無言症、失行症、反復症、常同運動／挙動、口愛過度、無秩序、連続タスクを予定又は計画する能力の欠如、利己的行動／無神経、反社会的特徴、共感の欠如、一貫性の欠如、錯誤的誤りは頻繁にあるが比較的理解力は保たれている失文症的な話し方、理解障害、及び換語欠陥、緩徐進行性歩行不安定性、後方突進、すくみ、頻繁な転倒、非レボドパ反応性軸剛性、核上性注視麻痺、方形波痙攣、緩徐な垂直断続性運動、仮性球麻痺、四肢失行症、筋緊張異常、皮質性感覚消失、及び振戦が挙げられる。

【0063】

治療の影響を受けやすい患者としては、現在症状を示している患者に加えて、ＡＤ又は他のタウオパシーのリスクを有する無症候性個体が挙げられる。治療の影響を受けやすい患者としては、ＡＤの家族歴又はゲノムにおける遺伝的リスク因子の存在等、ＡＤの公知の遺伝的リスクを有する個体が挙げられる。例示的なリスク因子は、特に、位置７１７、並びに位置６７０及び６７１におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の突然変異（それぞれ、Ｈａｒｄｙ及びＳｗｅｄｉｓｈ突然変異）である。他のリスク因子は、プレセニリン遺伝子、ＰＳ１及びＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４における突然変異、高コレステロール血症又は粥状硬化症の家族歴である。現在ＡＤに罹患している個体は、上記リスク因子の存在によって特徴的な認知症から認識することができる。更に、ＡＤを有する個体を同定するために利用可能な多数の診断試験が存在する。これらとしては、脳脊髄液のｔａｕレベル及びＡβ４２レベルの測定が挙げられる。ｔａｕレベルの上昇及びＡβ４２レベルの低下は、ＡＤの存在を表す。また、ＡＤに罹患している個体は、アルツハイマー病関連障害協会の基準によって診断することもできる。

【0064】

投与／医薬組成物
本発明の抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体は、ＡＤ又は他のタウオパシー等、ｔａｕの病理学的凝集を伴う神経変性疾患を治療又は予防するための治療剤及び予防剤の両方に好適である。無症候性患者では、治療は何歳から開始してもよい（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０歳）。しかし、通常、患者が約４０、５０、６０、又は７０歳に達するまで治療を始める必要はない。治療は、典型的に、ある期間にわたる複数回投与を含む。治療は、経時的に治療剤に対する抗体、又は活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞を評価することによってモニタリングしてもよい。反応が低下した場合、追加投与が指示される。

【0065】

予防用途では、医薬組成物又は薬剤は、疾患の生化学的、組織学的、及び／又は挙動的症状、その合併症、並びに疾患の発現中に提示される中間病理学的表現型を含む、疾患のリスクをなくす又は低減する、重篤度を低下させる、又は疾患の発症を遅らせるのに十分な量で、ＡＤに罹患しやすいか又は他の点でＡＤのリスクを有する患者に投与される。治療用途では、組成物又は薬剤は、疾患の症状（生化学的、組織学的、及び／又は挙動的）のいずれかを低減、阻止、又は遅延させるのに十分な量で、かかる疾患が疑われるか又は既に罹患している患者に投与される。治療薬の投与により、特徴的なアルツハイマー病状を未だ発現していない患者における軽度の認知障害を低減又はなくすことができる。治療又は予防的処置を達成するのに適切な量は、治療的に又は予防的に有効な用量として定義される。予防的及び治療的レジメンにおいて、組成物又は薬剤は、通常、十分な免疫反応が得られるまで何回か投与される。

【0066】

本発明の抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体又はその断片は、関連する神経変性疾患の治療に有効な他の剤と併用投与してもよい。ＡＤの場合、本発明の抗体は、アミロイドベータ（Ａβ）の沈着を低減又は予防する剤と併用投与してもよい。ＰＨＦ−ｔａｕ及びＡβ病理は相乗的である可能性がある。したがって、同時にＰＨＦ−ｔａｕとＡβ及びＡβ関連病理のクリアランスを標的とする併用療法は、それぞれを個々に標的とするよりも有効である場合がある。

【0067】

パーキンソン病及び関連する神経変性疾患の場合、α−シヌクレインタンパク質の凝集形態をクリアランスするための免疫修飾も新たに開発された治療法である。ｔａｕ及びα−シヌクレインタンパク質のクリアランスを標的とする併用療法は、同時に、いずれかのタンパク質を個々に標的とするよりも有効であり得る。

【0068】

本発明の方法では、タウオパシーの治療又は症状の改善における抗体の「治療的に有効な量」は、標準的な研究技術によって決定することができる。例えば、抗体の用量は、当該技術分野において周知の関連する動物モデルに剤を投与することによって決定することができる。

【0069】

更に、場合により、インビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの要因の考慮に基づいて（例えば、臨床試験によって）決定することができる。こうした要因には、治療又は予防しようとする疾患、関与する症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には周知の他の要因が含まれる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。

【0070】

本発明の抗体を治療的に使用するための投与方法は、薬剤を受容者に送達する任意の好適な経路であってもよい。これら抗体の医薬組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、又は頭蓋内等非経口投与に有用であるか、脳又は脊髄の脳脊髄液に投与してもよい。

【0071】

本発明の抗体は、薬学的に許容できる担体内の活性成分として、有効な量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」という用語は、抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又は溶媒を指す。こうした医薬用賦形剤は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油等の液体であってもよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌液であり、一般的に、粒子状物質を含まない。これらは、従来の公知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤等の生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容できる助剤を含有してもよい。かかる医薬製剤中の本発明の抗体の濃度は、約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％か、最大で１５又は２０重量％までと広く変動してもよく、選択される特定の投与方法に従って、主として必要とされる用量、流体の体積、粘度等に基づいて選択される。

【0072】

治療は、単回投与スケジュール、又は複数回投与スケジュールで行ってもよく、複数回投与計画では、一次処置過程が１〜１０回の別個の投与と、応答を維持し及び又は強化するのに必要な後続の時間間隔で他の投与とを行い、例えば第２の投与が１〜４ヶ月後、また必要であれば、次の投与を数ヶ月後に行う。好適な治療スケジュールの例としては、（ｉ）０、１ヶ月及び６ヶ月、（ｉｉ）０、７日、及び１ヶ月、（ｉｉｉ）０及び１ヶ月、（ｉｖ）０及び６ヶ月、又は疾患症状を低減する、又は疾患の重篤度を低下させると予測される所望の反応を誘発するのに十分な他のスケジュールが挙げられる。

【0073】

このように、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体を含むように調製してもよい。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、又は５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体を含むように調製してもよい。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに、より詳細に記載されている。

【0074】

本発明の抗体は、保存のために凍結乾燥させ、使用前に好適な担体中で再構成させることができる。この技術は、抗体及び他のタンパク質調製物に有効であることが示されており、当該技術分野において公知の凍結乾燥及び再構成技術を用いることができる。

【0075】

診断方法及びキット
本発明の抗体は、被験体におけるＡＤ又は他のタウオパシーを診断する方法で使用することができる。この方法は、本発明の抗体又はその断片等の診断試薬を用いてＰＨＦ−ｔａｕの存在を被験体において検出することを含む。

【0076】

ＰＨＦ−ｔａｕは、生物学的サンプルと診断抗体試薬とを接触させ、被験体由来のサンプルにおける診断抗体試薬のＰＨＦ−ｔａｕに対する結合を検出することによって、被験体由来の生物学的サンプル（例えば、血液、尿、脳脊髄液）において検出することができる。検出を実施するためのアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロット、又はインビボイメージング等の周知の方法が挙げられる。例示的な診断抗体は、本発明の抗体ＰＴ１及びＰＴ３であり、また、ＩｇＧ１、κ型である。

【0077】

診断抗体又は類似の試薬は、上に例示した通り剤を受容者に送達する任意の好適な経路によって患者の身体又は脳に直接静脈内注射することによって投与してもよい。抗体の用量は、治療方法と同じ範囲内でなければならない。典型的に、抗体は標識されるが、同じ方法において、ＰＨＦ−ｔａｕに対して親和性を有する一次抗体は未標識であり、二次標識剤は、一次抗体に結合させるために用いられる。標識の選択は、検出手段に依存する。例えば、蛍光標識は、光学検出に好適である。常磁性標識の使用は、外科的介入のないトモグラフィー検出に好適である。また、放射標識は、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴを用いて検出され得る。

【0078】

診断は、被験体由来のサンプル又は被験体における標識ＰＨＦ−ｔａｕ、ｔａｕ凝集体、及び／又は神経原線維変化の数、大きさ、及び／又は強度を対応するベースライン値と比較することによって行われる。ベースライン値は、非罹患個体の集団における平均レベルを表し得る。また、ベースライン値は、同じ被験体において決定された以前の値を表す。

【0079】

また、上記診断方法は、治療前、治療中、又は治療後の被験体におけるＰＨＦ−ｔａｕの存在を検出することによって治療に対する被験体の応答をモニタリングするために用いることもできる。ベースラインに対する値の減少は、治療に対する陽性応答を示す。また、値は、病理学的ｔａｕが脳からクリアランスされたとき生物学的流体において一時的に増加する場合がある。

【0080】

本発明は、更に、上記診断及びモニタリング方法を実施するためのキットに関する。典型的に、このようなキットは、本発明の抗体等の診断試薬と任意追加的に検出可能な標識とを含有する。診断抗体自体は、直接検出可能であるか又は二次反応（例えば、ストレプトアビジンとの反応）を介して検出可能である検出可能な標識（例えば、蛍光標識、ビオチン等）を含有してもよい。或いは、検出可能な標識を含有する第２の試薬を利用してもよく、この場合、第２の試薬は、一次抗体に対する結合特異性を有する。生物学的サンプルにおけるＰＨＦ−ｔａｕを測定するのに好適な診断キットでは、キットの抗体は、マイクロタイターディッシュのウェル等の固相に予め結合して供給され得る。

【0081】

本出願全体を通して引用された全ての参照文献（文献、発行済み特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の内容は、参照することにより本明細書に全文が明示的に援用される。

【実施例】

【0082】

（実施例１）
対らせん状細線維−ｔａｕ（ＰＨＦ−ｔａｕ）の精製
Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７：５８２７〜３１，１９９０）変法によってＰＨＦ−ｔａｕを部分的に精製した。簡潔に述べると、組織学的に確認されたアルツハイマー患者から得られた皮質の死後組織を部分的に精製した。典型的に、１０００ｒｐｍのガラス／テフロンポッター組織ホモジナイザー（ＩＫＡ Ｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ；Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて前頭皮質５ｍｇを１０体積の冷バッファＢｕｆｆｅｒ Ｈ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、及び１０％スクロース／ｐＨ ７．４）中でホモジナイズした。ホモジナイズされた材料をＳｏｒｖａｌｌローターＳＳ３４内で２０分間２６４．８Ｎ（２７０００ｇ）で遠心分離した。ペレットを廃棄し、上清を１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン及び１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールの最終濃度に調整し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ ６０Ｔｉローター内で２０℃にて３５分間１０５９．１Ｎ（１０８０００ｇ）で遠心分離した。ペレットを慎重にＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに懸濁させた。上記の通り上清を２回目の遠心分離にかけ、最後のペレットを溶解させ、分注し、−８０℃で冷凍した。ＰＨＦ−ｔａｕ調製物の量を、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、抗ｔａｕ抗体ＡＴ８及びＨＴ７（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いたウエスタンブロットとで評価した。ＡＴ８は、Ｓ２０２／Ｔ２０５においてリン酸化されたＰＨＦ−ｔａｕを検出するが、非リン酸化ＰＨＦ−ｔａｕ及び野性型ｔａｕには結合しない。ＨＴ７は、（配列番号６の）Ｔａｕアミノ酸１５９〜１６３における非リン酸化エピトープに結合し、ｔａｕ及びＰＨＦ−ｔａｕを認識する。優れた品質のＰＨＦ−ｔａｕ調製物は、ＡＴ８等の過剰リン酸化ＰＨＦ−ｔａｕと反応する抗体で検出された、ウエスタンブロット上の約６０、６４、６６、及び７２ｋＤａの分子量を有する４本のバンドからなる。同等の量及び純度を有する２つの別々のＰＨＦ−ｔａｕ調製物を同じ脳サンプルから作製した。調製物１を免疫に用いた。

【0083】

（実施例２）
ＰＨＦ−ｔａｕに対するモノクローナル抗体の作製
正常Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて標準的なハイブリドーマ技術を用いて抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体を作製した（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜７，１９７５）。得られたハイブリドーマを９６ウェルプレートに播種し、１０日後に、下記の通り２５ｎｇ／ウェルでコーティングされたＰＨＦ−ｔａｕにおいて直接ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性細胞を、大腸菌ＢＬ２１細胞で発現させ、熱処理及び硫酸アンモニウム沈殿で精製したコントロールｔａｕ（配列番号６）でコーティングされた１０ｎｇ／ウェルにおける交差反応性について試験し、直ちにサブクローニングし、陽性クローンを液体窒素で冷凍した。１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｅｕｒｏｐｅ）、ハイブリドーマフュージョンクローニングサプリメント（２％）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）２％ ＨＴ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ−グルタミン及びペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、並びにストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地で全てのハイブリドーマを増殖させた。

【0084】

抗体可変領域を、選択したハイブリドーマ細胞からマウスＩｇＧ１／ＩｇＧ２／κバックグラウンドにクローニングし、発現させ、常法を用いて精製した。

【0085】

抗体選択のための直接ＥＬＩＳＡ
５０μＬ／ウェルのコーティングバッファ（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのＮａＮ３、ｐＨ ８．５）において、２５ｎｇ／ウェルのＰＨＦ−ｔａｕを、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）平底高結合９６ウェルマイクロタイタープレートにて４℃で一晩コーティングした。次の日、室温で６０分間７５μＬ／ウェルのＰＢＳ中０．１％カゼインでプレートをブロッキングした。次に、５０μＬのハイブリドーマ上清を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、３７℃で１時間、５０μＬ／ウェルのセイヨウワサビペルオキシダーゼと複合体化しているヒツジ抗マウスＩｇＧで検出した（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。両試薬を０．１％カゼイン／ＰＢＳで希釈した。プレートを洗浄し、０．４２ｍＭ ３，５，３’，５’−テトラメチル−ベンジジン、０．００３％（ｖ／ｖ）Ｈ₂Ｏ₂の１００ｍＭクエン酸及び１００ｍＭリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ ４．３）溶液５０μＬを基質として添加した。室温でプレートシェーカー上に最大１５分間反応を進行させ、その後、５０μＬ／ウェルの２ Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄で顕色を停止させ、４５０ｎｍにてマイクロタイタープレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でプレートを読み取った。

【0086】

モノクローナル抗体の特異性
ハイブリドーマのスクリーニングから得られた選択抗体を、組換え的に発現させたコントロールｔａｕ（配列番号６）との交差反応性について試験した。５００ｎｇのＰＨＦ−ｔａｕ及び２００ｎｇのコントロールｔａｕを、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ４〜１２％ゲルにロードし、製造業者の指示に従ってｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用によってニトロセルロースメンブレン上にブロットした。脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）（５％ ｗ／ｖ；Ｂｉｏｒａｄ）を含有するトリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ；１Ｍ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ ８．５）で１時間メンブレンをブロッキングした。ＴＢＳ−Ｔ含有ＮＦＤＭ（５％ ｗ／ｖ）で希釈した一次対照抗体（１μｇ／ｍＬ）ＨＴ７、ＡＴ８、ＡＴ１００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、及びＢＴ２と共に４℃で一晩インキュベートした。ハイブリドーマのスクリーニングから選択されたＰＴ１、ＰＴ２、ＰＴ３、ＰＴ４、及びＰＴ５モノクローナル抗体を、１０％ ＦＣＳを含有する培養上清に添加した。Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ（登録商標）増強化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介してＨＲＰＯ（ＴＢＳ−Ｔ中１：２００００、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と複合体化しているヒツジ抗マウスＩｇを用いて一次抗体を検出した。Ｌｕｍｉ−ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）によってシグナルを捕捉した。ウエスタンブロットにおいて、ＰＴ１及びＰＴ３は、ＰＨＦ−ｔａｕと反応したが、コントロールｔａｕとは反応しなかった。ＰＴ２は、両タンパク質と反応した。ＨＴ７及びＡＴ８の結合プロファイルは、上記の通りである。ＡＴ１００は、リン酸化Ｓｅｒ２１２／Ｔｈｒ２１４に結合し、ＰＨＦ−ｔａｕに結合するが、野性型ｔａｕには結合しない。ＢＴ２は、Ｓ１９９／Ｓ２０２を含む非リン酸化エピトープを認識し、したがって、野性型ｔａｕは認識するが、ＰＨＦ−ｔａｕは認識しなかった。

【0087】

競合的エピトープ結合
モノクローナル抗体ＰＴ１、ＰＴ２、ＰＴ３、ＰＴ４、ＰＴ５、ＡＴ８（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、ＡＴ１００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、及びＨＴ７（ＭＮ１０００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、ＰＨＦ−ｔａｕ又はリン酸化ｔａｕペプチドに対する競合結合について評価した。製造業者の指示に従って、ＭＳＤ（登録商標）ＳＵＬＦ０−ＴＡＧ ＮＨＳエステル（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて抗体を標識した。

【0088】

標識ＰＴ１、ＰＴ３、ＡＴ１００、及びＨＴ７との競合の場合、５μＬ（５０μｇ／ｍＬ）／ウェルの富化されているＰＨＦ−ｔａｕタンパク質（上記の通り精製）を室温（ＲＴ）で２時間ＭＳＤ ＨｉｇｈＢｉｎｄプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にコーティングした。ＡＴ８との競合の場合、コントロールｔａｕにおけるＳ２０２／Ｔ２０５に相当する残基がリン酸化されているコントロールｔａｕ（配列番号６）の残基１９４〜２１１に相当する合成ビオチン化及びＰＥＧ化ペプチドＲＳＧＹＳＳＰＧ（ｐＳ）ＰＧ（ｐＴ）ＰＧＳＲＳＲ−ＯＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ，ＬＬＣ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，ＭＡ）（配列番号３９）（０．１ｍｇ／ウェル）２５μＬをストレプトアビジン帯電プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）にコーティングした。コーティング後、室温で２時間５％ ＭＳＤブロッカーＡバッファ１５０μＬでウェルをブロッキングし、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ ７．４）で３回洗浄した。標識された個々の抗ｔａｕ抗体（１０ｎＭ又は５０ｎＭ）と様々な未標識競合抗体（１ｎＭ〜２μＭ）の希釈系列との混合物２５μＬを各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪させながらＲＴで２時間インキュベートし、上記の通り３回洗浄した。１５０μＬ／ウェルの希釈ＭＳＤ ＲｅａｄバッファＴを添加し、ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）でプレートを読み取った。

【0089】

抗Ｔａｕ ｍＡｂ ＨＴ７、ＡＴ１００、及びＡＴ８の非重複エピトープは、上記の通りである。公開されているデータに基づいて、Ｔａｕタンパク質又はペプチドに対する結合において、これら抗体は互いに競合するとは予測されなかった。

【0090】

実施した競合アッセイに基づいて、結合について互いに競合した抗体は存在せず、これは、これらが全て異なるエピトープに結合することを示す。各実験において、自己阻害のみが観察された。図１〜５は、それぞれ、標識されたＡＴ８、ＰＴ１、ＰＴ３、ＡＴ１００、及びＨＴ７との競合アッセイの結果を示す。

【0091】

（実施例３）
抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体は、インビボにおいてＰＨＦ−ｔａｕの蓄積を減少させる。
５月齢のメスのＰ３０１Ｌマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，ｃａｔ＃００２５０８）を５ヶ月間マウスＩｇＧ１、生理食塩水、ＰＴ３（５００μｇ／マウス）又はＡＴ８（ハイブリドーマＥＣＡＣＣから発現、寄託番号９１１００８６）で週１回処理した。マウスに麻酔をかけ、冷ＰＢＳで灌流し、氷上で脳を解剖した。各マウスについて、１つの脳半球を１０体積のＨ−バッファ中でホモジナイズし、次いで、４℃で２０分間２０５．９Ｎ（２１，０００ｇ）で遠心分離した。得られた上清を、６０分間２０５．９Ｎ（１００，０００ｇ）で更に遠心分離した。遠心分離後、ペレット（画分Ｐ１）を回収し、Ｃｈａｉ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６：３４４５７〜６７，２０１１に記載の通りウエスタン及びＥＬＩＳＡ分析用にリシスバッファに再懸濁させた。皮質サンプルの場合、画分Ｐ１を更に１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンで処理し、超遠心して、ペレット中のＰＨＦ−ｔａｕを更に富化させた。オスのＰ３０１Ｌマウスは、トランスジーンの発現が少ないことが見出され、分析には含まれていなかった。

【0092】

本質的にＣｈａｉ等、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８６：３４４５７〜６７，２０１１に記載の通り、リン酸化ｔａｕを、捕捉抗体として抗体ＡＴ８及びＡＴ１００を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡで脳幹ホモジネート（画分Ｐ１）にて測定し、次いで、ビオチン化ＨＴ７及びアビジン−ＨＲＰによって検出し（図６Ａ及び６Ｂ）、ウエスタンブロットではＡＴ１００を用いて検出した（図６Ｃ）。簡潔に述べると、Ｐ１ペレットをリシスバッファ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で再懸濁させた。Ｐ１ペレットサンプルをＡＴ８又はＡＴ１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で予めコーティングされているウェル及びビオチン標識されているＨＴ−７抗体においてインキュベートした。次いで、サンプルをバッファで５回洗浄し、次いで、１時間アビジン−ＨＲＰと共にインキュベートした。この後、サンプルを、３０分間１段階ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベートし、次いで、２Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄と共にインキュベートした。最後に、反応を４５０ｎｍで読み取り、脳内のＡＴ８−又はＡＴ１００−反応性ｔａｕの量をヒトＡＤ脳ホモジネートから得られた標準曲線を用いて決定し、ＡＤ脳ホモジネートの相対量（ｎｇ／ｍＬ）としてプロットし、非トランスジェニック動物（Ｂ６）由来の平均サンプルと同じＥＬＩＳＡシグナルを得た。

【0093】

リン酸化を検出するためにＡＴ１００（ｐ＝０．０５７）又はＡＴ８（ｐ＝０．０４７５）を用いるＥＬＩＳＡアッセイにおいて、アイソタイプコントロールを投与した動物と比べて、ＰＴ３で処理したＰ３０１Ｌトランスジェニックマウスではリン酸化ｔａｕにおける統計的に有意な減少又は有意性に向かう傾向が見られた（ＥＬＩＳＡシグナル：生理食塩水（１１３５±２２８．８）；ＩｇＧ１群（１３４４±２４５．６）；ＰＴ３群（６６０．５±１３４．５）；ＡＴ８群（１２７１±２７４））。

【0094】

ＥＬＩＳＡで得られたデータを確認するために、ＡＴ１００抗体を用いてＰＨＦ−ｔａｕを検出することによって、ＩｇＧ１−又はＰＴ３−処理動物由来の脳幹ホモジネート（画分Ｐ１）をウエスタンブロットで分析した。ローディングコントロールとして抗アクチン抗体を用いてフィルタをブロットした（図６Ｂ）。ウエスタンブロットは、ＩｇＧ１で処理した動物と比べて、ＡＴ１００抗体で検出したＰＨＦ−ｔａｕ量の減少を示した。

【0095】

皮質分析では、サルコシル可溶性（可溶性ｔａｕを表す）及び不溶性（ＰＨＦ−ｔａｕを表す）皮質画分を、捕捉用にｐａｎ−ｔａｕ抗体（ＰＴ４）又はホスホ−ｔａｕ抗体（ＡＴ８）を用い、次いで、ビオチン−ｐａｎ−ｔａｕ抗体（ｈＴａｕ１０）、次いで、ＨＲＰ−アビジンを用いてサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。ＰＴ３で処理した動物は、アイソタイプコントロールＩｇＧ１で処理した動物に比べて合計ｔａｕレベルが類似していた。より低いＰＨＦ−ｔａｕレベルに向かう傾向は、Ｎ−ラウロイルサルコシン不溶性画分におけるアイソタイプコントロールと比べたときＰＴ３で処理した動物において明らかであった（ＰＴ４を用いたＥＬＩＳＡ捕捉：ＩｇＧ群：８５１０２６±２６１１９８及びＰＴ３群：５８５６３９±１２０４９８；ＥＬＩＳＡ、ＡＴ８で捕捉：ＩｇＧ群：１１２５８８６±２８６２４０（Ｎ＝１０）、及びｐＴ３群：７４６５８２±１２４９７０（Ｎ＝７））。

【0096】

（実施例４）
抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体の特性評価
親和性の決定
モノクローナル抗体ＰＴ１及びＰＴ３と組換えヒト可溶性ｔａｕ又はＰＨＦ−ｔａｕとの相互作用をＰｒｏｔｅＯｎによって試験した。ランニング又はシステムバッファとして３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を用いて２５℃で全ての相互作用を試験した。２つの異なる実験フォーマットを用いた。１つは、組換え的に発現させたコントロールｔａｕとの相互作用ののものであり、他方は、ＰＨＦ−ｔａｕとの相互作用のためのものであった。これら実験では、ＨＴ７（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号ＭＮ１０００）、マウス抗ｔａｕ抗体をポジティブコントロールとして用いた。

【0097】

組換え的に発現させたコントロールｔａｕとの相互作用を試験するために、アミノカップリング化学（約５０００応答単位（ＲＵ））用に各製造業者の指示に従ってＧＬＣ（ＰｒｏｔｅＯｎ）センサチップの表面に抗ヒト又は抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ断片特異的抗体（Ａｂ）をカップリングさせることによってバイオセンサ表面を調製した。カップリングバッファは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）であった。抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体をランニングバッファで希釈し、注入して、６０〜１３０ＲＵのキャプチャーを得た。抗ＰＨＦ−ｔａｕ ｍＡｂの捕捉後、溶液（０．１〜７５ｎＭ、５倍希釈）中に組換え的に発現させたコントロールｔａｕ（Ｔａｕ−４４１、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ０５７６−５０μｇ）を注入した。２分間会合をモニタリングした（４０μｇ／分で８０μＬを注入）。１０分間解離をモニタリングした。０．８５％ Ｈ₃ＰＯ₄、又は０．８５％ Ｈ₃ＰＯ₄、次いで５０ｍＭ ＮａＯＨを用いてセンサ表面を再生した。１：１結合モデルを用いてデータをフィッティングした。１：１結合モデルを用いてデータをフィッティングした。

【0098】

【表2】

^* ＰＨＦ−ｔａｕについて、これは、ＫＤが二価結合モデルを用いて実施したフィッティングに由来するｋｆｆ１／ｋｏｎ−１の比として得られる場合、みかけの固有親和性である。
^** 有意な結合無し
^***５実験中４実験で結合無し

【0099】

ＰＨＦ−ｔａｕとの相互作用を試験するために、捕捉試薬としてＨＴ７を用いて捕捉−カップリングＰＨＦ−ｔａｕによってバイオセンサ表面を調製した。流体に入る不溶性材料の量を制限するために、ＰｒｏｔｅＯｎでは上記ＰＨＦ−ｔａｕの更なる調製が必要であった。５℃で１０分間４９Ｎ（５０００ｇ）で２回遠心分離することによって上記ＰＨＦ−ｔａｕを更に調製し、ここで、２回目の遠心分離から得られた上清を、次いで、ランニングバッファで１／２０又は１／４０希釈した。チップを調製するために、アミノカップリング化学（約３０００応答単位（ＲＵ））用の各製造業者の指示に従ってＧＬＣ（ＰｒｏｔｅＯｎ）センサチップの表面にＨＴ７を共有結合で固定した。カップリングバッファは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ ４．５）であった。ＨＴ７固定後、ＰＨＦ−ｔａを注入し、ＨＴ７によって捕捉（約３００ＲＵ）した。捕捉後、アミノカップリング化学用の各製造業者の指示に従ってチップの活性化によってＰＨＦ−ｔａｕをセンサチップに共有結合で固定した。最後に、エタノールアミンを注入することによって、残りの反応部位をブロックした。ＰＨＦ−ｔａｕ修飾表面及び参照表面（抗原を含有しない）の調製及び安定化後、抗ＰＨＦ−ｔａｕ抗体をランニングバッファで希釈し、溶液中に注入した（０．１〜７５ｎＭ、５倍希釈）。３分間会合をモニタリングした（４０μｇ／分で１２０μＬを注入）。１０又は１５分間解離をモニタリングした。１０ｍＭ Ｇｌｙ（ｐＨ ２）を用いてセンサ表面を再生した。二価結合モデルを用いてデータをフィッティングし、ここでは、みかけの固有親和性をｋｏｆｆ−１／ｋｏｎ−１比で報告した。

【0100】

ＰｒｏｔｅＯｎ実験に基づいて、３２２ｐＭの親和性でＰＴ１はＰＨＦ−ｔａｕに結合し、試験した条件下ではコントロールＴａｕに対する結合を示さなかった（表２）。ＰＴ３は１８±２ｐＭの親和性でＰＨＦ−ｔａｕに結合し、試験した条件下では５回の実験のうちの４回でコントロールＴａｕに対する結合を示さなかった。５回のＰｒｏｔｅＯｎ実験のうちの１回で、測定は、用いたコントロールＴａｕの最高濃度に基づいて＞７５ｎＭの親和性を推定するために用いることができた弱い結合を示した。

【0101】

以上、本発明の全容を述べたが、付属の特許請求の範囲の趣旨又は範囲を逸脱することなく本発明に多くの変更及び改変をなし得ることは、当業者にとって明白であろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]