特許 6306593 細胞透過性ペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6306593

(24)【登録日】2018年3月16日

(45)【発行日】2018年4月4日

(54)【発明の名称】細胞透過性ペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/05 20060101AFI20180326BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20180326BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20180326BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180326BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20180326BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20180326BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20180326BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20180326BHJP

   A61K 47/50 20170101ALI20180326BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180326BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180326BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20180326BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20180326BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/05ZNA

   C07K19/00

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N5/0784

   C07K7/08

   A61P35/00

   A61P31/00

   A61P37/02

   A61P37/06

   A61K47/42

   A61K47/50

   A61P43/00 121

   C12P21/02 C

   C12N5/0786

   C12N5/0781

【請求項の数】19

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2015-531671(P2015-531671)

(86)(22)【出願日】2013年9月12日

(65)【公表番号】特表2016-501829(P2016-501829A)

(43)【公表日】2016年1月21日

(86)【国際出願番号】IB2013058497

(87)【国際公開番号】WO2014041505

(87)【国際公開日】20140320

【審査請求日】2016年8月24日

(31)【優先権主張番号】12184311.4

(32)【優先日】2012年9月13日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/700,432

(32)【優先日】2012年9月13日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】503083421

【氏名又は名称】ユニベルシテ ドゥ ジュネーブ

(73)【特許権者】

【識別番号】515061651

【氏名又は名称】レ オピト ユニベルシテル ドゥ ジュネーブ

【氏名又は名称原語表記】ＬＥＳ ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥＳ ＤＥ ＧＥＮＥＶＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100094640

【弁理士】

【氏名又は名称】紺野 昭男

(74)【代理人】

【識別番号】100103447

【弁理士】

【氏名又は名称】井波 実

(74)【代理人】

【識別番号】100111730

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 武泰

(74)【代理人】

【識別番号】100180873

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 慶政

(72)【発明者】

【氏名】デロアジ、マディア

(72)【発明者】

【氏名】ウォーカー、 ポール

(72)【発明者】

【氏名】ディートリヒ、ピエール−イヴ

【審査官】 松岡 徹

(56)【参考文献】

【文献】 ROTHE, Romy et al.，Characterization of the Cell-penetrating Properties of the Epstein-Barr Virus ZEBRA trans-Activator，The Journal of Biological Chemistry，２０１０年 ６月２５日，Vol.285, No.26，pp.20224-20233

【文献】 WANG, Pu et al.，A Redox-Sensitive Cysteine in Zta Is required for Epstein-Barr Virus Lytic Cycle DNA Replication，Journal of Virology，２００５年１１月，Vol.79, No.21，pp.13298-13309

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ／ＤＤＢＪ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１または配列番号２を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチド。

【請求項2】

（１）配列番号１または配列番号２を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドと、
（２）カーゴ分子であって、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、（ｉｉ）多糖、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質、（ｖ）糖脂質、および（ｖｉ）核酸からなる群から選択され、ここで前記（ｉ）のカーゴ分子が病原体エピトープおよび／または腫瘍エピトープを含んでなるものである、カーゴ分子と
を含んでなる、複合体。

【請求項3】

前記細胞透過性ペプチドが、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩと関連して、細胞表面での前記カーゴ分子のエピトープの提示を促進する、請求項２に記載の複合体。

【請求項4】

（１）配列番号１または配列番号２を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチド、または
（２）病原体エピトープおよび／または腫瘍エピトープを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質カーゴ分子に共有結合している前記細胞透過性ペプチドを含んでなるアミノ酸複合体
をコードする、核酸。

【請求項5】

請求項４に記載の核酸を含んでなる、ベクター。

【請求項6】

請求項５に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。

【請求項7】

請求項１に記載の細胞透過性ペプチドを調製する方法であって、前記細胞透過性ペプチドをコードする核酸を含んでなるベクターを含む宿主細胞を培地中で培養すること、および前記ペプチドを培地からかまたは宿主細胞溶解後の宿主細胞溶解物から分離することを含んでなる、方法。

【請求項8】

請求項２に記載の複合体をロードした、単離された細胞。

【請求項9】

前記細胞が抗原提示細胞である、請求項８に記載の細胞。

【請求項10】

以下の少なくとも１つを含んでなる、組成物：
（ａ）配列番号１または配列番号２を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチド、
（ｂ）（１）配列番号１または配列番号２を含んでなるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドと、
（２）カーゴ分子であって、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、（ｉｉ）多糖、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質、（ｖ）糖脂質、および（ｖｉ）核酸からなる群から選択され、ここで前記（ｉ）のカーゴ分子が病原体エピトープおよび／または腫瘍エピトープから選択される、カーゴ分子と
を含んでなる複合体、
（ｃ）前記（ａ）の細胞透過性ペプチドまたは前記（ｂ）の複合体（ここで、前記（ｂ）（２）のカーゴ分子が、前記（ｂ）（１）の細胞透過性ペプチドに共有結合している病原体エピトープおよび／または腫瘍エピトープを含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質カーゴ分子である）をコードする核酸、
（ｄ）前記（ｃ）の核酸を含んでなるベクター、
（ｅ）前記（ｄ）のベクターを含んでなる宿主細胞、
（ｆ）前記（ｂ）の複合体をロードした細胞。

【請求項11】

（ａ）請求項１に記載の少なくとも１つの細胞透過性ペプチド、および
（ｂ）医薬的に許容されるキャリア
を少なくとも含んでなる、医薬組成物。

【請求項12】

（ａ）請求項２に記載の少なくとも１つの複合体、および
（ｂ）医薬的に許容されるキャリア
を少なくとも含んでなる、医薬組成物。

【請求項13】

前記組成物が、少なくとも２つの異なる複合体を含んでなる、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

癌、感染症、自己免疫疾患、および移植片拒絶を含む疾患または障害の治療に使用するための、請求項２に記載の複合体。

【請求項15】

癌、感染症、自己免疫疾患、および移植片拒絶を含む疾患または障害の治療に使用するための、請求項８に記載の細胞。

【請求項16】

インビトロで細胞内にカーゴ分子を送達するための方法であって、
ａ）請求項１に記載の細胞透過性ペプチドと細胞内に送達されるべきカーゴ分子との複合体を形成し、そして
ｂ）前記細胞を、工程ａ）で形成された複合体と接触させること
を含んでなる、方法。

【請求項17】

分離された細胞透過性ペプチドが、病原体エピトープおよび／または腫瘍エピトープを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパクに共有結合しているものである、請求項７に記載の方法。

【請求項18】

（ａ）請求項６に記載の少なくとも１つの宿主細胞、および
（ｂ）医薬的に許容されるキャリア
を少なくとも含んでなる、医薬組成物。

【請求項19】

（ａ）請求項２に記載の複合体を含んでなる少なくとも一つの宿主細胞、および
（ｂ）医薬的に許容されるキャリア
を少なくとも含んでなる、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物学的および医学的用途の細胞送達剤としての新たな細胞透過性ペプチドに関する。

【背景技術】

【0002】

真核細胞の細胞膜は生物活性分子の無秩序な流入から細胞を保護する、厳重に制御されたバリアである。細胞にとり内因性ではない低分子およびタンパク質または他の高分子をベースとする薬物が細胞膜を横断するためには、固有の輸送系を用いるか、または脂質二重層を介した直接拡散を行うことによる。しかしながら、多くの場合、いずれの侵入様式も、外因性分子にとって非効率である。

【0003】

この１０年の間に、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、タンパク質を含めた種々の治療薬をそれらの標的に送達するための有望なベクターとして浮上してきた。ＣＰＰは、輸送体または特異的受容体とは無関係に、生体膜を横断する効率的なタンパク質移行を促すペプチド配列である。ＣＰＰはまた、その生産においてコスト効率の高いという利点がある。ヒト免疫不全ウイルスのトランス活性化調節タンパク質（ＨＩＶ ＴＡＴ）の細胞移行特性が、２０年前に発見されて以来、ペネトラチン（アンテナペディアホメオドメイン）、ＶＰ２２（単純ヘルペスウイルス）および合成ポリアルギニン（ポリＲ）などのいくつかのＣＰＰが同定されている。種々のカーゴが、新規ワクチン設計のためにＣＰＰに連結されている。

【0004】

最近になり、エプスタイン・バーウイルスの塩基性ロイシンジッパー転写活性化因子であるＺＥＢＲＡが、生細胞の外膜を横断してリンパ球の核に蓄積することが示された。より詳細には、エプスタイン・バーウイルスＺＥＢＲＡトランス活性化因子の細胞透過能に必要なＺＥＢＲＡの最小領域が、ＺＥＢＲＡの残基１７０から残基２２０までであること、そして、この領域に含まれるＤＮＡ結合ドメインおよび二量体形成ドメインの両方が細胞透過性に必要であることが明らかにされている（Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５（２６）：２０２２４〜２０２３２）。

【0005】

細胞内へカーゴ分子を送達するビヒクルとしての用途を考慮すると、多くのＣＣＰには欠点がある。例えば、これらは細胞内において膜破壊による細胞質漏出または膜タンパク質の正常な機能の妨害などの重篤な副作用を引き起こし得るか、あるいは細胞毒性作用および／または免疫原性作用を引き起こし得る。また、いくつかのＣＰＰは、細胞質内で急速に分解されるか、またはエンドソーム内に捕捉されたままリソソーム内で分解される場合がある。さらに、いくつかのＣＰＰは、カーゴ分子を遊離できないか、あるいは対応しているかまたは遊離できるカーゴ分子の範囲が広くない。

【0006】

したがって、多種多様なカーゴ分子を細胞内に送達でき、カーゴ分子を高効率で取り込み、かつ毒性が低い改良ビヒクルが今もなお必要とされている。ワクチンとの関連においても、この送達ビヒクルが、カーゴ分子の内部移行のための単一経路に限定されず、抗原提示のためにサイトゾルおよびエンドソームの両方に送達され得るならば有利である。本発明は、例えば抗原提示細胞の細胞表面に抗原決定基を、効率的に送達および提示することが可能なＣＰＰを提供することによって、この問題を解決する。したがって、本発明によるＣＰＰは、例えば、ポリペプチドおよびタンパク質、多糖、脂質、またはそれらの組み合わせ、ならびに核酸、低分子薬物、およびイメージング剤などの種々のカーゴ分子の送達のためのビヒクルとして有用である。

【発明の概要】

【0007】

本発明の第１の態様によれば、
細胞透過性ペプチドであって、
ａ）当該ペプチドのアミノ酸配列の全長が１５〜３０アミノ酸の間にあり、かつ
ｂ）当該ペプチドが、ＺＥＢＲＡの残基１７０から残基２２０にわたる領域のフラグメントを含むアミノ酸配列を有し、ここで、場合により１、２、３、４、または５アミノ酸が、前記ペプチドの細胞透過能を失うことなく、置換、欠失および／または付加されていてもよいこと
を特徴とするもの、および
当該ペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つの保存的に置換されたアミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記ペプチドの変異体
が提供される。

【0008】

本発明の第２の態様は、前記細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含んでなる複合体に関する。

【0009】

本発明の第３の態様は、前記細胞透過性ペプチドまたは前記複合体をコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。

【0010】

本発明の第４の態様は、上記で定義されるような細胞透過性ペプチドまたは複合体を発現する宿主細胞、およびそのような細胞を産生する方法にある。

【0011】

本発明の第５の態様は、上記で定義されるような複合体をロードした細胞に関する。

【0012】

本発明の第６の態様は、（ｉ）本発明の細胞透過性ペプチド、（ｉｉ）本発明の複合体、（ｉｉｉ）本発明の核酸、（ｉｖ）本発明のベクター、（ｖ）本発明の宿主細胞、または（ｖｉ）本発明による複合体をロードした細胞を含んでなる組成物に関する。

【0013】

本発明の第７の態様は、医薬として使用するための、またはイメージング組成物もしくは診断用組成物として使用するための上記組成物に関する。

【0014】

本発明の第８の態様は、少なくとも以下の１つを含むパーツキットである：
（ａ）本発明による細胞透過性ペプチド
（ｂ）本発明による複合体
（ｃ）本発明による核酸
（ｄ）本発明によるベクター
（ｅ）本発明による宿主細胞
（ｆ）本発明による複合体をロードした細胞

【0015】

本発明の第９の態様は、インビトロで細胞内へカーゴ分子を送達する方法を提供し、この方法は、前記細胞を、本発明による細胞透過性ペプチドおよび前記カーゴ分子と接触させる工程を含んでなる。

【0016】

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ＣＰＰ１−ＯＶＡおよびＣＰＰ２−ＯＶＡ融合ポリペプチドを樹状細胞内にロードした後のＭＨＣクラスＩ拘束性提示の結果を示す。骨髄由来樹状細胞に、０．３μＭのそれぞれのＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドを４時間ロードし、ＬＰＳを用いて一晩成熟させた。ＴＣＲトランスジェニックマウスＯＴ１由来の脾細胞と共に５日間コインキュベーションした後、増殖しているＯＶＡ特異的Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈によって、ＯＶＡエピトープの正確なＭＨＣクラスＩ拘束性提示を評価した。Ｔ細胞単独（Ａ）または融合ポリペプチドでパルスしなかった成熟骨髄樹状細胞と共にコインキュベーションしたＴ細胞（Ｂ）のいずれかを用いた陰性コントロール；ペプチド（Ｃ）またはペプチドでパルスした成熟骨髄由来樹状細胞（Ｄ）のいずれかと共にインキュベーションしたＴ細胞を用いた陽性コントロール；ＣＰＰ１−ＯＶＡ（Ｅ）；ＣＰＰ２−ＯＶＡ（Ｆ）。

【図2】ＣＰＰ１またはＣＰＰ２およびオボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）ペプチドカーゴを含む融合ポリペプチドを用いたマウスのワクチン接種後のポリクローナル免疫応答を示す。マウスは、２０μｇの各ＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドおよび１００μｇの抗ＣＤ４０を用いて、１４日間隔で皮下に２回ワクチン接種を行い、５０μｇのポリＩＣを、この追加免疫の１０日後に筋肉内に注射し、これらのマウスを屠殺して、脾臓を多量体および抗ＣＤ８で染色した。ＰＢＳを用いた陰性コントロール（Ａ）；ＣＰＰ１−ＯＶＡ（Ｂ）；ＣＰＰ２−ＯＶＡ（Ｃ）。

【発明を実施するための形態】

【0018】

「細胞透過性ペプチド」（「ＣＰＰ」）という用語は、細胞膜を横断して種々のタイプのカーゴ分子を輸送することができ、したがって、多様な分子カーゴ（ナノサイズ粒子から低分子化学物質、巨大分子、およびＤＮＡの大きなフラグメントまで）の細胞取り込みを促進することができる短ペプチドを示すのに一般に用いられる。「カーゴ」分子は、共有結合を介する化学結合かまたは非共有相互作用のいずれかによって、細胞透過性ペプチドと結合している。細胞透過性ペプチドは、典型的には、リジンまたはアルギニンなどの正電荷アミノ酸を高い相対存在量で含むか、または極性／荷電アミノ酸と非極性（疎水性）アミノ酸の交互パターンを含む配列を有するかのいずれかのアミノ酸組成を有する。これらの２つのタイプの構造はそれぞれ、ポリカチオンまたは両親媒性と呼ばれる。細胞透過性ペプチドは、異なるサイズ、アミノ酸配列および電荷であっても、全てのＣＰＰは、細胞膜を移行することができ、多様な分子カーゴの細胞質または細胞小器官への送達を促進することができるという共通の特性を有する。現在のところ、ＣＰＰ移行の理論は、膜への直接浸透、エンドサイトーシスを介する侵入、および一過性構造の形成による移行の、３つの主要な侵入機構に分類されている。ＣＰＰ形質導入は、進行中の研究分野である。細胞透過性ペプチドは、癌を含む種々の疾患の治療における薬物送達剤およびウイルス阻害剤のような医薬において、ならびに細胞標識およびイメージングのための造影剤において、多くの用途が見出されている。

【0019】

「カーゴ分子」は、本明細書では、共有または非共有結合によって細胞透過性ペプチドに結合している分子を示し、前記細胞透過性ペプチドの存在によって、その細胞内部移行が促進されるかまたは可能になる。本発明において、「カーゴ分子」には、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、それらの組み合わせ（リポタンパク質および糖脂質など）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイＤＮＡ、プラスミド）、低分子薬物（例えば、シクロスポリンＡ、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキサート、５−アミノレブリン酸）、イメージング剤（例えば、フルオロフォア、量子ドット（ＱＤ）、放射性トレーサー、ガドリニウム（Ｇｄ３＋）低分子量キレートなどの金属キレート、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ））が含まれる。カーゴ分子がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である場合、１つ以上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を結合して含み得ると理解される。また、カーゴ分子が核酸である場合、前記核酸は、各々の核酸が１つのペプチドまたはポリペプチドをコードしている、１つ以上の核酸を含み得る。カーゴ分子はまた、リポタンパク質および糖脂質などの、タンパク質、脂質、および／または多糖の組み合わせであってもよい。

【0020】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」という用語およびこれらの用語の変形は、融合タンパク質を含めたペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーまたはタンパク質をいい、これらはそれぞれ少なくとも２つのアミノ酸を含んでなり、通常のペプチド結合によって互いに連結された、または、例えば等配電子体ペプチドの場合、修飾されたペプチド結合によって互いに連結されたものをいう。これらの用語には、本明細書では、非ペプチド構造要素を含むペプチドアナログと定義される「ペプチド模倣薬」も含まれ、これらのペプチドは、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣するか、またはその作用と拮抗することができる。ペプチド模倣薬は、酵素的に切断できるペプチド結合などの古典的ペプチド特性を有しない。ペプチドまたはポリペプチドは、遺伝コードにより定義される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸から構成されていてもよい。ペプチドまたはポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸から構成されていてもよい。ペプチドまたはポリペプチドは同様に、当業者に周知の、例えば翻訳後成熟過程などの天然過程によるか、または化学過程によって修飾されたアミノ酸から構成されていてもよい。これらの修飾は、文献に十分詳細に記載されている。これらの修飾は、ポリペプチド中のどこにでも、すなわち、ペプチド骨格中、アミノ酸鎖中、あるいはカルボキシ末端またはアミノ末端でさえも、出現し得る。ペプチドまたはポリペプチドは、ユビキチン化を受けて分岐状になっていても、あるいは分枝の有無にかかわらず環状であってもよい。このタイプの修飾は、当業者に周知の天然または合成の翻訳後過程の結果であってもよい。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的固定、脂質または脂質誘導体の共有結合的固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合的固定、共有結合的または非共有結合的架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ペグ化を含むグリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解過程、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化（ｓｅｎｅｌｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ）、アミノ酸付加、例えばアルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）もしくはユビキチン化が挙げられ得る。これらの修飾は、文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（１９９３）２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８３）Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６ ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，６６３：４８〜６２）に十分詳細に記載されている。

【0021】

細胞透過性ペプチドに連結されたカーゴ分子の「細胞内部移行」という用語は、一般に、細胞膜を横断するカーゴ分子の輸送を意味し、したがって細胞内へのカーゴ分子の侵入を意味する。個々の場合に応じて、カーゴ分子はその後、細胞質中に遊離され、細胞内小器官に向うか、またはさらに細胞表面に提示されてもよい。

【0022】

「ＺＥＢＲＡ」という用語（別名、Ｚｔａ、Ｚ、ＥＢ１、またはＢＺＬＦ１）は、一般に、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）転写活性化因子を意味する。細胞透過能を示すＺＥＢＲＡの最小領域は、ＺＥＢＲＡの残基１７０から残基２２０までであると特定されている。ＺＥＢＲＡのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＹＰ＿４０１６７３に開示され、配列番号２３に示す２４５アミノ酸を含む。

【0023】

「エピトープ」という用語（別名、「抗原決定基」）は、免疫システムによって、具体的には抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって認識される、抗原の部分である。本明細書にあって、「エピトープ」という用語は、主に、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に結合して抗原提示細胞の表面に提示される、Ｔ細胞エピトープを指すのに用いられる。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＴ細胞エピトープは、限定されないが、典型的には８〜１１アミノ酸長の間のペプチドであり、一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、限定されないが、一般に１２〜２５アミノ酸長の間のより長いペプチドを提示する。

【0024】

「ＣＤ４^＋エピトープ」または「ＣＤ４^＋拘束性エピトープ」という用語は、本明細書では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によって認識されるエピトープであって、ＭＨＣクラスＩＩ分子の溝に位置する抗原フラグメントからなるエピトープを指す。

【0025】

「ＣＤ８^＋エピトープ」または「ＣＤ８^＋拘束性エピトープ」という用語は、本明細書では、ＣＤ８^＋Ｔ細胞によって認識されるエピトープであって、ＭＨＣクラスＩ分子の溝に位置する抗原フラグメントからなるエピトープを指す。

【0026】

「ＭＨＣクラスＩと関連してのエピトープ提示」という用語は、細胞の表面でＭＨＣクラスＩ分子の溝に位置するＣＤ８^＋エピトープをいう。

【0027】

「ＭＨＣクラスＩＩと関連してのエピトープ提示」という用語は、細胞の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子の溝に位置するＣＤ４^＋エピトープをいう。

【0028】

「ＣＤＩとの関連でのエピトープ提示」という用語は、細胞の表面で分化抗原群１分子の溝に位置する脂質エピトープをいう。

【0029】

「ＭＨＣクラスＩ」は、主要組織適合遺伝子複合体分子の２つの主要なクラスの１つを指す。ＭＨＣクラスＩ（別名、「ＭＨＣＩ」）分子は、体のあらゆる有核細胞上で見いだされる。ＭＨＣクラスＩの機能は、細胞傷害性細胞（ＣＴＬ）にエピトープを表示することである。ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩ分子は、α−およびβ２−ミクログロブリン（ｂ２ｍ）の２つのペプチド鎖からなる。α鎖のみが多型性であり、ＨＬＡ遺伝子によってコードされるが、ｂ２ｍサブユニットは多型性ではなく、β２ミクログロブリン遺伝子によってコードされる。

【0030】

「ＭＨＣクラスＩＩ」は、主要組織適合遺伝子複合体分子の他方の主要なクラスを指す。ＭＨＣクラスＩＩ（別名、「ＭＨＣＩＩ」）分子は、マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞を含めた、少数の特殊な細胞型でのみ見いだされ、これらはすべて専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。

【0031】

「腫瘍エピトープ」とは、本明細書では、腫瘍関連抗原由来または腫瘍特異的抗原由来のエピトープを意味する。例えば、腫瘍エピトープにはグリオーマエピトープが含まれる。

【0032】

「病原体エピトープ」とは、本明細書では、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および多細胞寄生虫などの病原体に由来する抗原性タンパク質、抗原性多糖、抗原性脂質、抗原性リポタンパク質または抗原性糖脂質由来のエピトープを意味する。病原体に由来する抗原性タンパク質、多糖、脂質、リポタンパク質または糖脂質としては、本明細書では、例えばアメーバ症、炭疽、ブルーリ潰瘍（マイコバクテリウム・ウルセランス）、カリシウイルス関連下痢症、カンピロバクター下痢症、子宮頸癌（ヒトパピローマウイルス）、クラミジア・トラコマチス関連生殖器疾患、コレラ、クリミア・コンゴ出血熱、デング熱、ジフテリア、エボラ出血熱、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）下痢症、胃癌（ヘリコバクター・ピロリ）、淋病、Ａ群ストレプトコッカス関連疾患、Ｂ群ストレプトコッカス関連疾患、ヘモフィルスインフルエンザＢ菌による肺炎および侵襲性疾患、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎下痢症、単純ヘルペス２型外陰部潰瘍、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、鉤虫症、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、リーシュマニア症、レプトスピラ症、肝癌（Ｂ型肝炎）、肝癌（Ｃ型肝炎）、ライム病、マラリア、マールブルグ出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、上咽頭癌（エプスタイン・バーウイルス）、髄膜炎菌髄膜炎、パラインフルエンザ関連肺炎、百日咳、ペスト、灰白髄炎、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）肺炎、リフトバレー熱、ロタウイルス下痢症、風疹、住血吸虫症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、細菌性赤痢、天然痘、黄色ブドウ球菌関連疾患、胃癌（ヘリコバクター・ピロリ）、肺炎球菌および侵襲性疾患、破傷風、ダニ媒介脳炎、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、ウエストナイルウイルス関連疾患、黄熱を含めた、ワクチン接種の標的になり得る疾患の原因である病原体に由来する、それぞれタンパク質、多糖、脂質、リポタンパク質または糖脂質が挙げられる。

【0033】

「低分子干渉核酸」（ｓｉＮＡ）という用語は、それらの核酸のアンチセンス作用に基づいてｍＲＮＡ認識およびその下方制御を標的とするストラテジーに用いられる、短鎖核酸をいう。この用語には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよびデオキシリボザイムなどの触媒核酸、ならびに低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。

【0034】

「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子由来の標的ｍＲＮＡをノックダウンまたはサイレンシングすることができる一本鎖または二本鎖ＲＮＡ（約１９〜２３ヌクレオチド）である、低分子干渉ＲＮＡをいう。人工ｓｉＲＮＡは、オリゴヌクレオチドとして化学合成されてもよく、あるいは、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）としてプラスミドまたはウイルスベクター（アデノウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルス）中にクローニングされて、任意の細胞型で一過性または安定なトランスフェクションを生じてもよい（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，８：８１〜１０８；Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，３（１２）：８２７〜３４； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，１２（５），６３７〜６４５）。

【0035】

本明細書で使用する場合、「治療」および「治療する」並びにそれに類する語は、所望の薬理学的および生理学的効果を得ることを一般に意味する。その効果は、疾患、その症状または状態を予防するかまたは部分的に予防するという観点から、予防的なものであってもよく、および／または、疾患、状態、症状、またはその疾患に起因する有害作用の部分的な治癒または完全な治癒という観点から、治療的なものであってもよい。「治療」という用語は、本明細書で使用する場合、哺乳類（特にヒト）における疾患の任意の治療を含み、かつ、（ａ）疾患に罹患しやすいがまだ罹患していると診断されていない被験体において、疾患を発症しないように予防すること（例えば、予防的早期無症候性介入）；（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その進行を止めること；あるいは、疾患を軽減すること、すなわち、疾患および／またはその症状もしくは状態を退縮させること（例えば、損傷の改善または治療）を含む。詳細には、本発明による方法、使用、製剤および組成物は、癌または感染症の治療に有用であり、かつ／あるいは、初期癌患者における癌の進行期または転移期への移行を阻止し、それによって癌の進行度診断を改善するのに有用である。癌に適用される場合、疾患または障害の予防には、例えば個人の身内に癌の既往歴があることに起因して、その癌になる危険性があると同定された個人における、その癌の発生または進行の予防、ならびに、腫瘍促進病原体、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）およびヘリコバクター・ピロリなどによる感染の予防が含まれる。また癌の「予防／治療」という用語には、個人において既に診断された癌の安定化も含まれる。「安定化」とは、初期癌患者における癌の進行期または転移期への移行の阻止を意味する。

【0036】

「被験体」という用語は、本明細書で使用する場合、哺乳類をいう。例えば、本発明で意図する哺乳類には、ヒト、霊長類、家畜動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、実験用げっ歯類などが含まれる。

【0037】

「有効量」という用語は、本明細書で使用する場合、探求対象の組織、系、動物またはヒトにおいて生物学的応答もしくは医薬品応答を誘発する、少なくとも１つの細胞透過性ペプチド、前記細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体、前記複合体をロードした細胞、本発明によるそれらの組成物または医薬製剤の量をいう。一実施形態において、有効量は、治療を受ける疾患または状態の症状を緩和するための「治療有効量」である。別の実施形態において、有効量は、予防を受ける疾患または状態の症状を予防するための「予防有効量」である。この用語には、本明細書では、疾患の進行を減少させるために、特に、腫瘍増殖または感染を減少もしくは抑制し、それによって探求対象の応答（詳細には、このような応答は、カーゴ分子に含まれるエピトープに対する免疫応答であってもよい）を誘発するために十分な活性ポリペプチドの量（すなわち、「抑制有効量」）も含まれる。

【0038】

本発明による治療の「有効性」という用語は、本発明による使用または方法に応答して生じる、疾患の経過における変化に基づいて測定され得る。例えば、癌治療の有効性は、腫瘍体積の減少、および／または無増悪生存期間の増加、および／または原発癌切除後再発の危険性の減少によって測定され得る。より具体的には、免疫療法によって治療される癌に関して、有効性の評価は、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）および世界保健機関（ＷＨＯ）基準に沿った、新しい免疫関連応答判断基準（ｉｒＲＣ）により、免疫療法剤に対する抗腫瘍応答の臨床パターンの分布によってなされ得る（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２０１０，１０２（１８）：１３８８〜１３９７）。感染症予防の有効性は、ヒト個体群における疫学調査によって最終的に評価され、これは、血清中の中和抗体力価および病原体特異的な多機能Ｔ細胞応答の誘導とよく相関する。前臨床評価は、感染性病原体に曝露後の感染への耐性を含んでもよい。感染症の治療は、病原体特異的な抗体および／またはＴ細胞免疫応答と相関する、病原体増殖の抑制または病原体の排除（したがって、病原体の不検出）によって測定され得る。

【0039】

「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物活性が明白に有効になるような形態であり、かつ、前記製剤が投与される被験体にとって有毒である追加成分を含まない、調製物をいう。

【0040】

本発明による細胞透過性ペプチドおよび複合体
本発明の第一の態様は、
細胞透過性ペプチドであって、
ａ）前記ペプチドのアミノ酸配列の全長が、１５〜３０アミノ酸の間、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸の間にあり、かつ
ｂ）前記ペプチドが、ＺＥＢＲＡ（配列番号２３）の残基１７０から残基２２０にわたる、ＺＥＢＲＡの最小ドメインのフラグメントを含むアミノ酸配列を有し、場合により１、２、３、４、または５アミノ酸が、前記ペプチドの細胞透過能を失うことなく置換、欠失、および／または付加されていてもよいこと
を特徴とする細胞透過性ペプチド、および
前記ペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つの保存的に置換されたアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、前記ペプチドの変異体に関する。

【0041】

本発明による細胞透過性ペプチドまたは前記細胞透過性ペプチドを含む複合体の細胞透過能（すなわち内部移行）は、生細胞もしくは固定細胞のフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡観察、前記ペプチドまたは複合体で形質導入された細胞の免疫細胞化学、およびウエスタンブロットなどの、当業者に公知の標準方法によって確認され得る。

【0042】

有利な実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドの変異体またはフラグメントは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子との関連で、抗原提示細胞のような細胞の表面に、エピトープのようなタンパク質性カーゴ分子を提示する前記ペプチドの能力をさらに保持している。

【0043】

ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子との関連で、細胞の表面にエピトープのようなタンパク質性カーゴ分子を提示する、細胞透過性ペプチドまたは前記細胞透過性ペプチドを含む複合体の能力は、増殖を刺激する能力および／またはこれらのエピトープに特異性を有するＭＨＣ拘束性ＣＤ４^＋もしくはＣＤ８^＋Ｔ細胞の機能などの、当業者に公知の標準方法によって確認され得る。

【0044】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号１３ではない。

【0045】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号１４ではない。

【0046】

別の特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号２３のＺＥＢＲＡアミノ酸配列と比較して、１８９番に相当するＳｅｒ（Ｓ）の位置に置換されたＣｙｓ（Ｃ）を含む。

【0047】

一つの実施形態において、本発明は、
細胞透過性ペプチドであって、
ａ）前記ペプチドが、少なくとも１５アミノ酸長であり、かつ最大で３０アミノ酸長のアミノ酸配列を有し、かつ
ｂ）前記ペプチドが、
（ｉ）配列番号１、または
（ｉｉ）１、２、３、４、もしくは５アミノ酸が、前記ペプチドの細胞透過能を失うことなく置換、欠失、および／または付加されている以外は、配列番号１と同一であるアミノ酸配列
を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする、細胞透過性ペプチド、または
前記ペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つの保存的に置換されたアミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる、前記ペプチドの変異体に関する。

【0048】

本発明の一態様によれば、細胞透過性ペプチドは、参照される配列と比較して、少なくとも１つの保存的に置換されたアミノ酸を有するアミノ酸配列を含んでなる（所定のアミノ酸残基が、類似の生理化学特性を有する残基で置換されることを意味する）。

【0049】

一般に、参照アミノ酸配列中に存在する１つ以上のアミノ酸の置換は、保存的に行われるべきである。保存的置換の例としては、１つの脂肪族残基の別の残基での置換、例えばＩｌｅ、ＶａＩ、Ｌｅｕ、またはＡｌａの相互の置換、あるいは１つの極性残基の別の残基への置換、例えばＬｙｓおよびＡｒｇ間；ＧｌｕおよびＡｓｐ間；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間の置換が挙げられる。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する領域全体の置換が周知である（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５〜１３２）。１つ以上のＬ−アミノ酸の１つ以上のＤ−アミノ酸での置換は、本発明に関して保存的置換とみなされる。例示的なアミノ酸置換を、以下の表１に示す。

【表1】

【0050】

したがって、別の態様において、本発明による細胞透過性ペプチドは、以下であることを特徴とする：
ａ）前記ペプチドが、少なくとも１５アミノ酸長であり、かつ最大で３０アミノ酸長であるアミノ酸配列を有し、かつ
ｂ）前記ペプチドは、０、１、２、３、４、もしくは５アミノ酸が、前記ペプチドの細胞透過能を失うことなく置換、欠失、および／または付加されている配列番号６を含むアミノ酸配列を有し、配列中、
Ｘ_１は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、
Ｘ_２は、Ｒ、Ｋ、またはＨであり、
Ｘ_３は、Ｙ、Ｗ、またはＦであり、
Ｘ_４は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、
Ｘ_５は、ＮまたはＱであり、
Ｘ_６は、Ｒ、Ｋ、またはＨであり、
Ｘ_７は、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＡであり、
Ｘ_８は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＧであり、
Ｘ_９は、ＳまたはＴであり、
Ｘ_１０は、Ｒ、Ｋ、またはＨであり、
Ｘ_１１は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、
Ｘ_１３は、Ｒ、Ｋ、またはＨであり、
Ｘ_１４は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＧであり、
Ｘ_１５は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり、
Ｘ_１６は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｗ、またはＭであり、
Ｘ_１７は、Ｋ、Ｒ、またはＨであるものである。

【0051】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_１はＫである。

【0052】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_２はＲである。

【0053】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_３はＹである。

【0054】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_４はＫである。

【0055】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_５はＮである。

【0056】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_６はＲである。

【0057】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_７はＶである。

【0058】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_８はＡである。

【0059】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_９はＳである。

【0060】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_１０はＲである。

【0061】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_１１はＫである。

【0062】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_１３はＲである。

【0063】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_１４はＡである。

【0064】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_１５はＫである。

【0065】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_１６はＦである。

【0066】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、Ｘ_１７はＫである。

【0067】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号６を参照して上記で一般的に定義されるとおりであり、配列中、配列番号６と比較して１２位に相当する位置のアミノ酸は、Ｓｅｒ（Ｓ）である。

【0068】

より具体的な態様において、前記細胞透過性ペプチドは、配列番号７を含むアミノ酸配列を含み、配列中、
Ｘ_１は、ＫまたはＲであり、
Ｘ_２は、ＲまたはＫであり、
Ｘ_３は、Ｙ、Ｗ、またはＦであり、
Ｘ_４は、ＫまたはＲであり、
Ｘ_５は、ＮまたはＱであり、
Ｘ_６は、ＲまたはＫであり、
Ｘ_７は、Ｖ、Ｉ、ＭまたはＬであり、
Ｘ_８は、ＡまたはＧであり、
Ｘ_９は、ＳまたはＴであり、
Ｘ_１０は、ＲまたはＫであり、
Ｘ_１１は、ＫまたはＲであり、
Ｘ_１３は、ＲまたはＫであり、
Ｘ_１４は、ＡまたはＧであり、
Ｘ_１５は、ＫまたはＲであり、
Ｘ_１６は、Ｆ、Ｙ、またはＷであり、
Ｘ_１７は、ＫまたはＲであるものである。

【0069】

詳細には、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号１もしくは配列番号２を含むか、または配列番号１もしくは配列番号２からなる、アミノ酸配列を有する。

【0070】

別の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、配列番号１を含むか、または配列番号１からなる、アミノ酸配列を有する。

【0071】

別の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号８を含むか、またはアミノ酸配列の配列番号８からなる、細胞透過性ペプチドに関する。

【0072】

別の実施形態において、前記細胞透過性ペプチドは、アミノ酸配列の配列番号９を含むか、またはアミノ酸配列の配列番号９からなる。

【0073】

別の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列の配列番号１０を含むか、またはアミノ酸配列の配列番号１０からなる、細胞透過性ペプチドに関する。

【0074】

本発明の細胞透過性ペプチドの一次アミノ酸配列はさらに、本発明から逸脱することなく、例えばグリコシル化またはリン酸化などによって翻訳後修飾されてもよいことは、当業者に理解されるであろう。

【0075】

さらなる実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、上記のような細胞透過性ペプチドのアミノ酸配列に加えて、以下のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせを場合によりさらに含んでいてもよい：
（ｉ）核移行シグナル（ＮＬＳ）。このようなシグナルは、当業者に周知であり、Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１）：３９７〜３９９）に記載されている。
（ｉｉ）Ｋａｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（４）：ｅ３５１８７）に記載され、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｄｄ．ｏｓｄｄ．ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｔｕｍｏｒｈｏｐｅ／ｇｅｎｅｒａｌ．ｐｈｐ？に収載されているような腫瘍ホーミングペプチドを含めた、標的ペプチド。

【0076】

別の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドは、カーゴ分子に連結されて、前記カーゴ分子の細胞内部移行を促進する。

【0077】

したがって、本発明の別の態様は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、複合体に関する。

【0078】

カーゴ分子は、本発明による細胞透過性ペプチドのＣ末端部分またはＮ末端部分のいずれかに連結され得る。

【0079】

特定の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドに連結されているか、または本発明による複合体に含まれているカーゴ分子は、（ｉ）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、（ｉｉ）多糖、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質、（ｖ）糖脂質、（ｖｉ）核酸、（ｖｉｉ）低分子薬物または毒素、および（ｖｉｉｉ）イメージング剤またはコントラスト剤からなる群から選択され得る。

【0080】

カーゴ分子は、２つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、２つ以上の多糖、２つ以上の脂質、２つ以上のリポタンパク質、２つ以上の糖脂質、２つ以上の核酸、２つ以上の低分子薬物または毒素、２つ以上のイメージング剤または造影剤、またはそれらの組み合わせを含み得ると理解されている。

【0081】

さらなる実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドに連結されているか、または本発明による複合体に含まれているカーゴ分子は、病原体エピトープおよび／または腫瘍エピトープから選択される。

【0082】

一実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体に関し、前記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。

【0083】

本発明に有用なペプチド性、ポリペプチド性、またはタンパク質性カーゴ分子の例としては、エピトープ、抗体、抗体フラグメント、治療的タンパク質、転写因子、トランス活性化因子およびデコイペプチドが挙げられる。例えば、カーゴ分子は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、または病原体由来抗原タンパク質の抗原決定基に相当する、ＣＤ４^＋エピトープおよび／またはＣＤ８^＋エピトープを含み得る。本発明のポリペプチド中に含まれるＣＤ４^＋エピトープは、一般に、かつ好ましくは、約１２〜２５アミノ酸からなる。これらはまた、約８〜２５アミノ酸または約６〜１００アミノ酸からなっていてもよい。本発明のポリペプチド中に含まれるＣＤ８^＋エピトープは、一般に、かつ好ましくは、約８〜１１アミノ酸からなる。これらはまた、約８〜１５アミノ酸または約６〜１００アミノ酸からなっていてもよい。

【0084】

具体的な実施形態において、本発明による複合体は、エピトープ、抗体、抗体フラグメント、治療的タンパク質、転写因子、トランス活性化因子およびデコイペプチドから選択されるカーゴ分子を含む。

【0085】

より具体的な実施形態において、本発明による複合体は、１つ以上のエピトープ（本明細書で定義されるような腫瘍エピトープおよび／または病原体エピトープであってよい）を含むカーゴ分子を含む。

【0086】

具体的な実施形態において、本発明による複合体は、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、および／または病原体由来抗原タンパク質（ウイルス性、細菌性、真菌性、原生動物性および多細胞寄生虫性抗原タンパク質など）に由来するエピトープを含むカーゴ分子を含む。

【0087】

本発明の特定の例において、前記エピトープは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩと関連して、細胞表面に提示される。

【0088】

ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のカテゴリーに含まれるカーゴ分子の例としては、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５４（３）：１８７〜２０７）、Ｖｉｇｎｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．１３：１５）に記載されるような複数のグリオーマエピトープの組み合わせが挙げられる。

【0089】

本発明の別の態様において、前記グリオーマエピトープはすべて、同一の細胞透過性ペプチドに連結されて単一の本発明による複合体を形成するようなことはなく、個々に、または少なくとも２つのエピトープの群によってのいずれかで、別個の本発明による細胞透過性ペプチドに連結されて、少なくとも２つの別個の本発明による複合体を形成する。

【0090】

有利な実施形態において、本発明による複合体は、細胞透過性ペプチドおよびエピトープを含み、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩと関連して、抗原提示細胞の細胞表面に前記エピトープを輸送および提示することができるため、ワクチン接種および免疫療法に有用である。

【0091】

特定の態様において、本発明による複合体は、細胞透過性ペプチドとカーゴ分子を連結している、および／または、ペプチド性、ポリペプチド性もしくはタンパク質性カーゴ分子に含まれる連続的エピトープを連結している、および／または、連続的カーゴ分子を連結している、および／または、カーゴ分子のＣ末端部分に配置される、非免疫性の切断可能部分であるスペーサーもしくはリンカーを含む。

【0092】

前記スペーサーは、ペプチド性でも非ペプチド性でもよく、本発明による複合体の２つの成分間の連結は、共有結合でも非共有結合でもよい。

【0093】

ペプチド性スペーサーは、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸からなっていてもよい。ペプチド性スペーサーのアミノ酸配列は、カーゴ分子のＮ末端もしくはＣ末端隣接領域のアミノ酸配列、または前記カーゴ分子のエピトープのアミノ酸配列と同一であってもよい。あるいは、ペプチド性スペーサーは、前記天然隣接領域の保存的アミノ酸置換によって生じるアミノ酸配列のような非天然アミノ酸配列からなっていてもよく、または公知のプロテアーゼ切断部位の配列、例えばエンテロキナーゼ標的部位（アミノ酸配列ＤＤＤＫ、配列番号１５）、第Ｘａ因子標的部位（アミノ酸配列ＩＥＤＧＲ、配列番号１６）、トロンビン標的部位（アミノ酸配列ＬＶＰＲＧＳ、配列番号１７）、ＴＥＶプロテアーゼ標的部位（アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧ、配列番号１８）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ標的部位（アミノ酸配列ＬＥＶＬＦＱＧＰ、配列番号１９）、ポリカチオン性アミノ酸（例えば、ポリＫ）、フューリン標的部位（アミノ酸配列ＲＸ（Ｒ／Ｋ）Ｒ、配列番号２０）からなっていてもよい。特定の実施形態において、ペプチド性スペーサーは、Ｃｙｓ（Ｃ）残基を全く含まない。

【0094】

非ペプチド性スペーサーは、エステル、チオエステルまたはジスルフィドを含み得る。

【0095】

特定の態様において、本発明による複合体は、細胞透過性ペプチド配列と、ペプチド性、ポリペプチド性、もしくはタンパク質性カーゴとの間に配置される、スペーサーまたはリンカー、特にペプチド性スペーサーを含む。このペプチド性スペーサーは、一旦、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体が内部移行されると、細胞内機構によって切断され得る（従って、細胞透過性ペプチドを含まないカーゴを、細胞内、細胞小器官内、または細胞表面に遊離する）ように、当業者によって選択され得る。

【0096】

より詳細な態様において、細胞透過性ペプチドを、ペプチド性、ポリペプチド性、もしくはタンパク質性カーゴ分子と、またはペプチド性、ポリペプチド性、もしくはタンパク質性カーゴ分子に由来する隣接エピトープと連結している前記スペーサーは、前記カーゴ分子または隣接エピトープに隣接する領域の約１、２、３、４、もしくは５アミノ酸に相当する、約１、２、３、４、もしくは５アミノ酸からなっていてもよい。

【0097】

カーゴ分子が数個のエピトープを含む場合、本発明の複合体中に含まれる各エピトープは、互いに直接連結され得るか、または、少数のアミノ酸からなるペプチド性スペーサーのようなスペーサーもしくはリンカーを介して連結され得るということが、当業者には明らかであろう。あるいは、カーゴ分子が数個のエピトープを含む場合、本発明の複合体中に含まれるいくつかのエピトープは、互いに直接連結され、かつ、他のいくつかのエピトープは、少数のアミノ酸からなるペプチド性スペーサーのようなスペーサーもしくはリンカーを介して連結されるということも可能である。

【0098】

本発明の具体的な態様において、本発明のペプチド性、ポリペプチド性、もしくはタンパク質性カーゴ分子中に含まれる、２個の連続したエピトープは、前記エピトープの天然隣接領域からなるスペーサーによって、互いに連結される。一実施形態によれば、第１エピトープと第２エピトープの連結に用いられるスペーサーは、第１エピトープのＮ末端もしくはＣ末端隣接領域の約４個を超えるアミノ酸とそれに続く第２エピトープのＮ末端もしくはＣ末端隣接領域の約４個を超えるアミノ酸に相当する、約８個を超えるアミノ酸からなる。本発明の例において、第１エピトープ（「エピトープ１」）と第２エピトープ（「エピトープ２」）の連結に用いられるスペーサーは、エピトープ１の０個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の８個の隣接アミノ酸から、エピトープ１の８個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の０個の隣接アミノ酸までに及ぶ、任意の可能な組み合わせ（すなわち、エピトープ１の１個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の７個の隣接アミノ酸、エピトープ１の２個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の６個の隣接アミノ酸、エピトープ１の３個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の５個の隣接アミノ酸、エピトープ１の４個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の４個の隣接アミノ酸、エピトープ１の５個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の３個の隣接アミノ酸、エピトープ１の６個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の２個の隣接アミノ酸、エピトープ１の７個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の１個の隣接アミノ酸、エピトープ１の８個の隣接アミノ酸およびエピトープ２の０個の隣接アミノ酸など）に相当する、約８個のアミノ酸からなる。２個の連続エピトープを連結するスペーサーを構成する合計８個のアミノ酸は、絶対値ではなく、またそのスペーサーは、合計、例えば３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、９個のアミノ酸または１０個のアミノ酸から構成されてもよいことが理解されるであろう。同様に、スペーサーが８個より少ないかまたは多いアミノ酸を有する場合において、上記と同等の組み合わせも、この状況における本発明の例である。

【0099】

本発明の別の特定の例において、第１エピトープ（「エピトープ１」）と第２エピトープ（「エピトープ２」）の連結に用いられるスペーサーは、約４個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸からなる。より詳細には、前記スペーサーのアミノ酸配列は、エピトープ１またはエピトープ２のＮ末端もしくはＣ末端隣接領域の４個のアミノ酸に相当し得る。

【0100】

上記のようなスペーサーはまた、カーゴ分子中に含まれる最後のエピトープのＣ末端部分に配置されてもよい。

【0101】

ペプチド性スペーサーの例としては、例えばアミノ酸配列ＥＱＬＥ（配列番号１１）またはＴＥＷＴ（配列番号１２）、あるいはその任意の保存的置換体が挙げられる。

【0102】

別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体に関し、前記カーゴ分子は、多糖、脂質、リポタンパク質、および／または糖脂質、詳細には、多糖性、脂質性、リポタンパク質性、および／または糖脂質性エピトープであり、本明細書で定義されるような病原体エピトープであってもよい。

【0103】

特定の例において、本発明による複合体は、病原体由来の抗原（ウイルス性、細菌性、真菌性、原生動物性および多細胞寄生虫性抗原など）に由来する、多糖性、脂質性、リポタンパク質性、および／または糖脂質性エピトープを含むカーゴ分子を含む。

【0104】

本発明の特定の例において、前記エピトープは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩとの関連で、細胞表面に提示される。

【0105】

本発明の別の例において、前記脂質性エピトープは、ＣＤ１（分化抗原群１）との関連で、細胞表面に提示される。

【0106】

別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体を提供し、前記カーゴ分子は、低分子薬物または毒素である。

【0107】

本発明に有用な分子薬物または毒素のカテゴリーに含まれるカーゴ分子の例としては、シクロスポリンＡ、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキサート、５−アミノレブリン酸、ジフテリア毒素、スニチニブ、およびＤｅ ｗｉｔ Ａｍｅｒ（２０１０，Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ，１２（３）：３０４〜１６）に概説されるような分子が挙げられる。

【0108】

さらに別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体を提供し、前記カーゴ分子は、イメージング剤またはコントラスト剤である。

【0109】

本発明に有用なイメージング剤またはコントラスト剤のカテゴリーに含まれるカーゴ分子の例としては、フルオロフォア、量子ドット（ＱＤ）、ガドリニウム（Ｇｄ^３＋）低分子量キレートなどの金属キレートおよび超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、放射性トレーサーが挙げられる。

【0110】

別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体を提供し、前記カーゴ分子は核酸である。

【0111】

本発明に有用な核酸カーゴ分子の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイＤＮＡ、プラスミド、マイクロＲＮＡが挙げられる。

【0112】

別の実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む複合体を提供し、前記カーゴ分子は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする（詳細には、エピトープを含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする）核酸である。

【0113】

核酸のカテゴリーに含まれるカーゴ分子の例としては、本発明によるペプチド性、ポリペプチド性またはタンパク質性カーゴ分子をコードする核酸が挙げられる。詳細な例は、本発明によるペプチド性、ポリペプチド性またはタンパク質性カーゴ分子中に含まれるエピトープをコードする核酸である。別の例は、Ｒｅａｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ（２０１３，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１２（６）：５９７〜６１５）に記載されるような複数のグリオーマエピトープの組み合わせをコードする核酸である。

【0114】

別の有利な実施形態において、本発明による複合体は、細胞透過性ペプチド、およびエピトープをコードする核酸を含み、これにより、細胞内での前記核酸の輸送が可能になる。形質導入された核酸は次に、細胞内で前記エピトープを生成するために転写および翻訳され得、これらのエピトープは次いで、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩとの関連で、抗原提示細胞の細胞表面に提示される。したがって、そのような複合体は、ワクチン接種および免疫療法に有用である。

【0115】

本発明の一実施形態において、カーゴ分子は、本明細書に記載されるようなペプチド性スペーサーによるなどで、本発明による細胞透過性ペプチドと共有的または非共有的に結合され得る。

【0116】

本発明による細胞透過性ペプチドとカーゴ分子を連結する技術は、文献に十分詳細に記載され、カーゴ分子の性質によって左右され得る。例えば、カーゴ分子と細胞透過性ペプチドとの間の結合は、全段階的固相合成または液相もしくは固相フラグメントカップリングによる切断可能ジスルフィド結合、安定なアミド、チアゾリジン、オキシムおよびヒドラジン結合、ジスルフィド結合、安定なチオマレイミド結合、ペプチド結合（融合タンパク質のアミノ酸間のペプチド結合を含む）、または静電気的もしくは疎水性相互作用によって達成され得る。

【0117】

本発明によるペプチドおよびタンパク質複合体をコードするポリヌクレオチド
本発明の別の態様は、本発明による細胞透過性ペプチドをコードするか、または本発明によるペプチド性、ポリペプチド性、またはタンパク質性カーゴ分子を含んでなる複合体をコードする、ポリヌクレオチドに関する。

【0118】

一つの実施形態において、本発明は、本発明による細胞透過性ペプチドをコードするか、または、場合により本明細書に記載されるようなペプチド性スペーサーを用いて、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質カーゴ分子に共有結合している前記細胞透過性ペプチドを含んでなる複合体をコードする、核酸に関する。

【0119】

さらなる実施形態において、本発明は、本発明による細胞透過性ペプチドをコードするか、または、場合により本明細書に記載されるようなペプチド性スペーサーを用いて、少なくとも１つのエピトープを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質カーゴ分子に共有結合している前記細胞透過性ペプチドを含んでなる複合体をコードする、核酸に関する。

【0120】

またさらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１つのエピトープを含んでなる、本発明によるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質カーゴ分子をコードする、核酸に関する。

【0121】

本発明による細胞透過性ペプチドおよび複合体の生成ならびに精製
本発明の別の態様によれば、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクターが提供される。

【0122】

これらに限定されるものではないが、染色体、エピソーム、および派生ウイルスなどの多数の発現系が使用され得る。より詳細には、使用される組換えベクターは、細菌プラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パピローマウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、キツネポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスに由来するものであってもよい。

【0123】

これらの組換えベクターは同様に、コスミドまたはファージミド派生体であってもよい。ヌクレオチド配列は、当業者に周知の方法、例えばＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１に記載の方法によって、組換え発現ベクターに挿入され得る。

【0124】

組換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の調節を制御するヌクレオチド配列、ならびに本発明のポリヌクレオチドの発現および転写ならびに本発明のポリペプチドの翻訳を可能にするヌクレオチド配列を含んでもよく、これらの配列は、使用される宿主細胞に従い選択される。

【0125】

したがって、例えば、適切な分泌シグナルが組換えベクターに組み込まれてもよく、その結果、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、小胞体の内腔へ、細胞膜周辺腔へ、膜上に、または細胞外環境へと導かれる。適切な分泌シグナルの選択により、その後のタンパク質精製が促進され得る。

【0126】

さらなる実施形態において、本発明による組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。

【0127】

宿主細胞への組換えベクターの導入は、当業者に周知の方法、例えばＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２ｎｄ ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９５、およびＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（前出）に記載の方法、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入または感染によって行われ得る。

【0128】

宿主細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、酵母細胞およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの細胞のような真菌の細胞、昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、Ｃ１２７マウス細胞株、シリアンハムスター細胞のＢＨＫ細胞株、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞であってもよい。

【0129】

宿主細胞を用いて、例えば、本発明のポリペプチドを発現し得る。標準方法による精製の後、本発明のポリペプチドは、後述の方法に使用され得る。

【0130】

本発明のさらなる実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチド、またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質カーゴ分子に共有結合している前記細胞透過性ペプチドを含んでなる本発明による複合体を調製する方法を提供し、その方法は、培地中で上記のような宿主細胞を培養すること、および培地から前記細胞透過性ペプチドもしくは複合体を分離すること、または宿主細胞溶解後に宿主細胞溶解物から前記細胞透過性ペプチドもしくは複合体を分離することを含んでなる。

【0131】

別の実施形態において、本発明による細胞透過性ペプチドおよび複合体は、合成化学的方法、例えば固相ペプチド合成によって調製され得る。これらのペプチドの精製は、タンパク質／ペプチド精製の技術分野で公知の任意の技術を用いて行われ得る。例示的な技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびイムノアフィニティー法が挙げられる。

【0132】

本発明のさらなる実施形態は、本発明による細胞透過性ペプチドを調製する方法を提供し、その方法は、前記ペプチドを化学的に合成および精製することを含んでなる。

【0133】

本発明の別の実施形態は、本明細書で定義されるような、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質カーゴ分子に共有結合している細胞透過性ペプチドを含む、本発明による複合体を調製する方法を提供し、その方法は、前記細胞透過性ペプチドのアミノ酸配列および前記ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質カーゴ分子のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを、化学的に合成および精製することを含んでなる。

【0134】

別の実施形態において、本発明による方法は、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を別々に合成すること、ならびにその精製されたペプチドおよびカーゴ分子を混合するかまたは前記ペプチドおよびカーゴ分子を共有結合させることを含んでなる。

【0135】

本発明による複合体をロードした細胞
本発明の別の態様は、本発明による複合体をロードした細胞に関する。特定の実施形態において、その細胞は、治療されるべき患者に由来する。

【0136】

さらなる実施形態において、その細胞は、抗原提示細胞のような免疫系の細胞であるか、または神経幹細胞のような幹細胞である。

【0137】

一つの実施形態において、本発明による複合体をロードした抗原提示細胞が提供される。

【0138】

具体的な実施形態において、その抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞から選択される。樹状細胞、特に、治療されるべき患者に由来する樹状細胞（従来型および形質細胞様）が好ましい。

【0139】

抗原提示細胞、特に樹状細胞を患者から採取する方法は、当業者に公知である。それらの方法は、骨髄、臍帯血、または末梢血から、単球もしくは造血幹細胞を収集することを含む。それらの方法はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）の使用も含む。抗原提示細胞、特に樹状細胞またはその前駆体は、水簸および磁性ビーズベースの分離を含む方法によって濃縮され得、これはＣＤ１４^＋前駆細胞の濃縮を含み得る。

【0140】

本発明の複合体を細胞内に、特に上記の抗原提示細胞内にロードし、そのような細胞を患者に投与する前にさらに調製する方法は、当業者に公知である。樹状細胞の調製には、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４などのサイトカインを用いた樹状細胞の培養または分化が含まれ得る。樹状細胞株を使用してもよい。細胞内への、特に樹状細胞内への本発明の複合体のロードには、本発明の細胞透過性ペプチドの固有特性（すなわち、その内部移行能力）を利用した、本発明の複合体と培養細胞とのコインキュベーションが含まれ得る。このようにロードされた樹状細胞の効率的な成熟を誘導するためのさらなる培養には、サイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ２、ＩＦＮα、ならびにアジュバント、例えばポリＩＣ、ポリＩＣＬＣ（すなわち、カルボキシメチルセルロース、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸、およびポリ−Ｌ−リジン二本鎖ＲＮＡの合成複合体）、および他のＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）およびＮＬＲ（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体）アゴニストの添加が含まれ得る。

【0141】

さらなる態様は、カーゴ分子がイメージング剤である本発明による複合体をロードした、細胞療法に用いられる細胞、例えば幹細胞、樹状細胞、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞をイメージングすることに関する。

【0142】

上記のように本発明による複合体をロードした細胞、特に抗原提示細胞を調製する方法を提供することも、本発明の目的であり、この方法は、前記細胞を本発明の複合体で形質導入すること、前記細胞を培地中で培養すること、および前記細胞を培地から分離することを含んでなる。

【0143】

特定の実施形態において、その細胞は、カーゴ分子を含む複合体がロードされ、前記カーゴ分子は、（ｉ）ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または（ｉｉ）核酸から選択される。

【0144】

本発明の別の実施形態において、本発明によるエピトープを含む複合体をロードした細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩとの関連で、細胞表面に前記エピトープを提示する。

【0145】

本発明による組成物およびキット
本発明は、以下から選択される少なくとも１つの成分を含む組成物を提供する：
（ｉ）本発明の細胞透過性ペプチド、
（ｉｉ）本発明の複合体、
（ｉｉｉ）本発明の核酸、
（ｉｖ）本発明のベクター、
（ｖ）本発明の宿主細胞、および
（ｖｉ）本発明による複合体をロードした細胞。

【0146】

特定の実施形態において、本発明の組成物は、２つ以上の（ｉ）〜（ｖｉ）の成分を含む。

【0147】

本発明の例において、その組成物は、少なくとも２つの異なる（ｉ）のペプチド、少なくとも２つの異なる（ｉｉ）の複合体、少なくとも２つの異なる（ｉｉｉ）の核酸、少なくとも２つの異なる（ｉｖ）のベクター、少なくとも２つの異なる（ｖ）の宿主細胞、および／または少なくとも２つの異なる（ｖｉ）の細胞を含んでなる。

【0148】

別の例において、本発明の組成物は、本発明による少なくとも２つの異なる複合体および／または少なくとも２つの異なる核酸を含んでなる。

【0149】

詳細には、本発明による組成物は、２つ以上の本発明による複合体、例えば、各複合体が１つ以上のカーゴ分子を含み、かつ前記カーゴ分子が複合体間で異なるような、少なくとも２つの複合体を含み得る。

【0150】

一つの例において、本発明の組成物は、各複合体が１つ以上のエピトープを含み、かつ前記エピトープが複合体間で異なるような、少なくとも２つの複合体を含んでなる。

【0151】

別の例において、本発明の組成物は、各複合体が１つ以上のエピトープをコードする１つ以上の核酸を含み、かつ前記核酸が複合体間で異なるような、少なくとも２つの複合体を含んでなる。

【0152】

本発明は、医薬、特にワクチンとして使用するための、本明細書に記載されるような複合体または前記複合体をロードした細胞もまた提供する。

【0153】

特定の実施形態において、本発明は、癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶を含む疾患または障害の治療に使用するために、本明細書に記載されるような複合体または前記複合体をロードした細胞を提供する。

【0154】

別の実施形態において、本発明は、イメージング組成物または診断組成物として使用するために、本明細書に記載されるような複合体または前記複合体をロードした細胞を提供する。

【0155】

本発明はまた、本明細書に記載されるような、本発明による複合体または前記複合体をロードした細胞を含む、イメージング組成物または診断組成物も提供する。

【0156】

本発明は、医薬組成物、特にワクチン組成物、ならびに被験体を、好ましくは哺乳類被験体を、そして最も好ましくは、内科的障害、特に免疫療法によって治療され得る障害、例えば癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶などに罹患しやすいか、または罹患しているヒト患者を治療する方法を提供する。

【0157】

本発明による医薬組成物、特にワクチン組成物、または製剤は、本明細書に記載される任意の形態で本発明による細胞透過性ペプチドもしくは複合体を含み得る、医薬製剤として投与され得る。

【0158】

本発明による医薬組成物、特にワクチン組成物、または製剤はまた、本明細書に記載される任意の形態で本発明による複合体をロードした抗原提示細胞を含み得る、医薬製剤として投与されてもよい。

【0159】

本発明による組成物は、通常使用されるアジュバント、免疫調節物質、キャリア、希釈剤または賦形剤と共に、医薬組成物およびその単位用量の形態中に収められ得、そしてそのような形態で、固体、例えば錠剤もしくは充填カプセル剤、または液体、例えば溶液、懸濁液、乳濁液、エリキシル剤、もしくはそれらを充填したカプセル剤（すべて経口用）として使用され得るか、あるいは、注射もしくは持続点滴によって非経口（皮下および皮内を含む）用の滅菌注射用溶液の形態で使用され得る。注射用組成物は、典型的には、注射用滅菌生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水または当該分野で公知の他の注射用キャリアを基剤とする。このような医薬組成物およびその単位用量形態は、追加の活性化合物または成分の有無にかかわらず、成分を従来の比率で含み得、このような単位用量形態は、使用される目的の１日用量範囲に相応する任意の適切な有効量の活性成分を含み得る。

【0160】

適切なアジュバントおよび／または免疫調節物質の例としては、ＭＰＬ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ）、アルミニウム化合物を含むアルミニウムベースのミネラル（一般的にＡｌｕｍと呼ばれる）、ＡＳＯ１−４、ＭＦ５９、リン酸カルシウム、リポソーム、イスコム、ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリ−ＩＣ）（その安定化形態であるポリ−ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ）を含む）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、モンタニド、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧ）、フラジェリン、シャボンノキ（Ｓｏａｐ Ｂａｒｋ ｔｒｅｅ）サポニン（ＱＳ２１）、アミノアルキルグルコサミド（ａｍｉｎｏ ａｌｋｙｌ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｄｅ）化合物（例えば、ＲＣ５２９）、合成オリゴデオキシヌクレオチドを含む二成分抗菌ペプチド（例えば、ＩＣ３１）、イミキモド、レシキモド、免疫刺激配列（ＩＳＳ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、線維芽細胞刺激リポペプチド（ＦＳＬ１）、および抗ＣＤ４０抗体が挙げられる。

【0161】

本発明の組成物は、これらに限定されないが、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、およびエリキシル剤などの液体製剤であってよい。これらの組成物はまた、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて再構成される乾燥製品として製剤化されてもよい。このような液体調製物は、限定されないが、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存料などの添加物を含み得る。懸濁化剤としては、限定されないが、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および硬化食用脂が挙げられる。乳化剤としては、限定されないが、レシチン、ソルビタンモノオレエート、およびアラビアゴムが挙げられる。保存料としては、限定されないが、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルおよびソルビン酸が挙げられる。分散剤または湿潤剤としては、限定されないが、ポリ（エチレングリコール）、グリセロール、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）が挙げられる。

【0162】

本発明による組成物は、また、移植によるかまたは筋肉内注射によって投与され得る、デポー調製物として製剤化されてもよい。

【0163】

本発明による固体組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態であってよい。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセル剤は、これらに限定されないが、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤および湿潤剤などの従来の賦形剤を含み得る。結合剤としては、これらに限定されないが、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント、デンプンの粘液およびポリビニルピロリドンが挙げられる。充填剤としては、これらに限定されないが、ラクトース、糖、結晶セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールが挙げられる。潤滑剤としては、これらに限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカが挙げられる。崩壊剤としては、これらに限定されないが、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔａｒｃｈ ｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）が挙げられる。湿潤剤としては、これらに限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングされ得る。

【0164】

本発明の化合物はまた、徐放形態でまたは徐放薬物送達系から投与され得る。

【0165】

特定の実施形態によれば、本発明による組成物は、皮下用である。

【0166】

別の特定の態様によれば、本発明による組成物は、反復投与による送達に適している。

【0167】

さらなる材料および製剤加工技術などは、Ｐａｒｔ ５ ｏｆ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ“Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓに記載されており、これは引用することにより本明細書の開示の一部とされる。

【0168】

本発明の別の態様は、本発明による細胞透過性ペプチドもしくは複合体、または本発明による複合体をロードした細胞、特に抗原提示細胞と、医薬的に許容されるキャリアを混合する工程を含む、本発明による医薬組成物を調製する方法を提供することである。

【0169】

本発明による複合体、本発明による複合体をロードした細胞、特に抗原提示細胞、本発明による組成物、それらの製剤、または本発明による方法は、疾患または障害、特に免疫療法によって治療または予防され得るもの、例えば癌および感染症の予防および／または治療に有用である。

【0170】

別の態様において、本発明は、イメージング組成物または診断用組成物を提供する。さらに他の態様は、イメージング剤を送達する方法、および、被験体において、好ましくは哺乳類被験体において、そして最も好ましくは、内科的障害、特に癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶に罹患している疑いがあるヒト患者において、疾患または障害を診断する方法に関する。

【0171】

医薬組成物のための本明細書に記載される製剤および投与様式はまた、本発明によるイメージング組成物または診断組成物に適したものであってもよい。

【0172】

さらなる態様において、本発明はまた、以下の少なくとも１つを含むパーツキットにも関する：
（ａ）本発明による細胞透過性ペプチド
（ｂ）本発明による複合体
（ｃ）本発明による核酸
（ｄ）本発明によるベクター
（ｅ）本発明による宿主細胞
（ｆ）本発明による複合体をロードした細胞

【0173】

特定の実施形態において、本発明のパーツキットは、２つ以上の（ａ）〜（ｆ）の成分を含む。

【0174】

本発明の一つの例において、そのパーツキットは、少なくとも２つの異なる（ａ）のペプチド、少なくとも２つの異なる（ｂ）の複合体、少なくとも２つの異なる（ｃ）の核酸、少なくとも２つの異なる（ｄ）のベクター、少なくとも２つの異なる（ｅ）の宿主細胞、および／または少なくとも２つの異なる（ｆ）の細胞を含んでなる。

【0175】

別の例において、本発明のパーツキットは、本発明による少なくとも２つの異なる複合体および／または少なくとも２つの異なる核酸を含んでなる。

【0176】

詳細には、本発明のパーツキットは、２つ以上の本発明による複合体、例えば、各複合体が１つ以上のカーゴ分子を含み、かつ前記カーゴ分子が複合体間で異なるような、少なくとも２つの複合体を含み得る。

【0177】

一つの例において、本発明のパーツキットは、各複合体が１つ以上のエピトープを含み、かつ前記エピトープが複合体間で異なるような、少なくとも２つの複合体を含んでなる。

【0178】

別の例において、本発明のパーツキットは、各複合体が１つ以上のエピトープをコードする１つ以上の核酸を含み、かつ前記核酸が複合体間で異なるような、少なくとも２つの複合体を含んでなる。

【0179】

パーツキットの多様な成分は、１つ以上の容器にパッケージングされ得る。上記成分は、凍結乾燥形態もしくは乾燥形態で、または適切な緩衝液中に溶解されて提供され得る。このキットはまた、例えば保存料、増殖培地、および／または上記成分の貯蔵および／または再構成のための緩衝液、洗浄溶液などの追加の試薬も含み得る。別の実施形態において、本発明によるパーツキットはまた、使用説明書も含む。

【0180】

本発明の別の態様は、本発明による医薬組成物および前記医薬組成物の使用説明書を含む、癌または感染症を治療、予防または安定化するためのワクチン接種キットである。

【0181】

特定の実施形態において、本発明による組成物および／またはパーツキットは、イメージング技術用である。

【0182】

別の実施形態において、本発明による組成物および／またはパーツキットは、本願に沿って記載されるような疾患または障害の診断用である。

【0183】

本発明による使用および方法
本発明の一つの態様は、インビトロで細胞内へカーゴ分子を送達する方法を提供し、この方法は、前記細胞を、本発明による細胞透過性ペプチドおよび前記カーゴ分子と接触させる工程を含んでなる。

【0184】

特定の態様において、インビトロで細胞内へカーゴ分子を送達する本発明の方法は、以下の工程を含む：
ａ）本発明による細胞透過性ペプチドと細胞内に送達されるべきカーゴ分子との複合体を形成する工程、および
ｂ）前記細胞を、工程ａ）で形成された複合体と接触させる工程。

【0185】

本発明の別の態様は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩと関連して、細胞の表面にカーゴ分子由来のエピトープを送達および提示するインビトロ方法を提供し、この方法は、前記細胞を、本発明による細胞透過性ペプチドおよび前記カーゴ分子と接触させる工程を含んでなる。

【0186】

別の態様において、本発明は、癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶などの、免疫療法によって治療され得るような疾患または障害の予防、治療または安定化のための医薬を調製するために、以下のいずれか１つの使用を提供する：（ｉ）本発明の複合体、（ｉｉ）本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞。

【0187】

本発明の有利な実施形態において、細胞透過性ペプチドおよびエピトープを含み、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩと関連して抗原提示細胞の細胞表面に前記エピトープを輸送および提示することができる、ワクチン接種および免疫療法に使用するための本発明による複合体が提供される。

【0188】

別の態様によれば、本発明は、癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶などの、免疫療法によって治療され得るような疾患または障害を予防、治療または抑制する方法を提供し、前記方法は、以下のうちのいずれか１つを前記被験体に投与することを含む：（ｉ）本発明の複合体、（ｉｉ）本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の医薬製剤。

【0189】

別の実施形態によれば、被験体において、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞および／またはＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞に依存する１つまたは複数のエピトープに対する免疫応答を誘発または改善する方法が提供され、前記方法は、以下のうちのいずれか１つを前記被験体に投与することを含む：（ｉ）１つまたは複数のエピトープを含むカーゴ分子を含む本発明の複合体、（ｉｉ）前記複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の医薬製剤。

【0190】

ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋応答に依存する免疫応答は、本発明の化合物の投与前のレベルと比較して、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２のｍＲＮＡまたはタンパク質の１つ以上の発現量が増加するなどの炎症反応（炎症性サイトカイン反応）を評価することによって決定され得る。また、ＨＬＡ−ペプチド多量体染色、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、および遅延型過敏症試験によって測定される、本発明の化合物の投与後の抗原特異的Ｔ細胞の頻度または絶対数の増加によっても測定され得る。また、抗原特異的Ｔヘルパー細胞に依存する抗原特異的血清抗体の増加によっても、間接的に測定され得る。

【0191】

別の実施形態によれば、被験体において、複数のＭＨＣクラスＩ分子および／または複数のＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束される１つまたは複数のエピトープに対する免疫応答を誘発または改善する方法が提供され、前記方法は、以下のうちのいずれか１つを前記被験体に投与することを含む：（ｉ）１つまたは複数のエピトープを含むカーゴ分子を含む本発明の複合体、（ｉｉ）前記複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の医薬製剤。

【0192】

被験体において、複数のＭＨＣクラスＩ分子および／または複数のＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束される複数のエピトープに対する免疫応答を誘発または改善する方法は、抗原提示細胞上の別々のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子に結合している個々のペプチドによるＴ細胞のインビトロ刺激の後、本発明の化合物の投与前のレベルと比較して、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２のｍＲＮＡまたはタンパク質の１つ以上の発現量が増加するなどのサイトカイン反応を評価することによって決定され得る。異なるＭＨＣ分子への拘束はまた、異なるＭＨＣ分子を発現している抗原提示細胞を使用することによって、またはＭＨＣ阻止抗体を用いることによっても検証され得る。また、異なるＭＨＣ分子で構築された多量体を用いるＨＬＡ−ペプチド多量体染色によって測定される、本発明の化合物の投与後の抗原特異的Ｔ細胞の頻度または絶対数の増加によっても測定され得る。

【0193】

本発明による１つまたは複数のエピトープに対する免疫応答を誘発または改善する方法の好ましい態様において、その免疫応答は、例えば、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５４（３）：１８７〜２０７）およびＶｉｇｎｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．１３：１５）に記載されるようなグリオーマエピトープの組み合わせのように、腫瘍関連抗原もしくは腫瘍特異的抗原の１つまたは複数のエピトープに対するものである。

【0194】

別の好ましい態様において、その免疫応答は、病原体由来の抗原タンパク質の複数のエピトープに対するものである。

【0195】

本発明による方法の特定の態様において、前記方法は、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束される１つまたは複数のエピトープに対する免疫応答を、被験体において誘発または改善するためのものである。

【0196】

別の態様において、本発明は、イメージング技術用のイメージング組成物の調製のため、または、疾患もしくは障害の診断用の診断組成物の調製のためのそれぞれの目的で、以下のうちのいずれか１つの使用を提供する：（ｉ）本発明の複合体、（ｉｉ）本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞。本発明を用いて診断され得る疾患または障害としては、免疫療法によって治療され得るもの、例えば癌、感染症、自己免疫疾患および移植片拒絶が挙げられる。

【0197】

別の態様によれば、本発明はイメージング方法を提供し、前記方法は、以下のうちのいずれか１つを、インビトロ、エクスビボまたはインビボで用いることを含む：（ｉ）本発明の複合体、（ｉｉ）本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の医薬製剤。

【0198】

さらなる態様によれば、本発明は、被験体における疾患または障害を診断する方法を提供し、前記方法は、前記被験体に、またはエクスビボで前記被験体のサンプルに、以下のうちのいずれか１つを投与することを含む：（ｉ）本発明の複合体、（ｉｉ）本発明の複合体をロードした細胞、例えば抗原提示細胞、または（ｉｉｉ）（ｉ）〜（ｉｉ）の医薬製剤。

【0199】

特定の実施形態において、本発明の使用および方法は、本発明による複合体の投与を含む。

【0200】

別の特定の実施形態において、本発明の使用および方法は、本発明による２つ以上の複合体、細胞、または医薬製剤の投与を含む。

【0201】

本発明の使用および方法の例において、各複合体が１つ以上のカーゴ分子を含み、かつ前記カーゴ分子が複合体間で異なるような、少なくとも２つの複合体が使用されるかまたは投与される。

【0202】

本発明の使用および方法の別の例において、各複合体が１つ以上のエピトープを含み、かつ前記エピトープが複合体間で異なるような、少なくとも２つの複合体が使用されるかまたは投与される。

【0203】

本発明の使用および方法のなおさらなる例において、各複合体が１つ以上のエピトープをコードする１つ以上の核酸を含み、かつ前記核酸が複合体間で異なるような、少なくとも２つの複合体が使用されるかまたは投与される。

【0204】

本発明の使用および方法のための癌の例としては、脳癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、食道癌、肺癌、肝癌、腎癌、メラノーマ、消化管癌、肺癌、頭頸部扁平上皮癌、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、胃癌、子宮内膜癌、骨髄性白血病、肺扁平上皮癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、膀胱腫瘍、前骨髄球性白血病、非小細胞肺癌、肉腫が挙げられる。

【0205】

癌は、固形腫瘍、血液癌、またはリンパ性癌であってもよい。癌は、良性であっても転移性であってもよい。

【0206】

本発明の使用および方法のための感染症の例としては、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および多細胞寄生虫によって引き起こされる疾患が挙げられる。これらとしては、例えば、アメーバ症、炭疽、ブルーリ潰瘍（マイコバクテリウム・ウルセランス）、カリシウイルス関連下痢症、カンピロバクター下痢症、子宮頸癌（ヒトパピローマウイルス）、クラミジア・トラコマチス関連生殖器疾患、コレラ、クリミア・コンゴ出血熱、デング熱、ジフテリア、エボラ出血熱、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）下痢症、胃癌（ヘリコバクター・ピロリ）、淋病、Ａ群ストレプトコッカス関連疾患、Ｂ群ストレプトコッカス関連疾患、ヘモフィルスインフルエンザＢ菌による肺炎および侵襲性疾患、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎下痢症、単純ヘルペス２型外陰部潰瘍、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、鉤虫症、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、リーシュマニア症、レプトスピラ症、肝癌（Ｂ型肝炎）、肝癌（Ｃ型肝炎）、ライム病、マラリア、マールブルグ出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、上咽頭癌（エプスタイン・バーウイルス）、髄膜炎菌髄膜炎、パラインフルエンザ関連肺炎、百日咳、ペスト、灰白髄炎、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）肺炎、リフトバレー熱、ロタウイルス下痢症、風疹、住血吸虫症、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、細菌性赤痢、天然痘、黄色ブドウ球菌関連疾患、胃癌（ヘリコバクター・ピロリ）、肺炎球菌および侵襲性疾患、破傷風、ダニ媒介脳炎、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、ウエストナイルウイルス関連疾患、黄熱が挙げられる。

【0207】

本発明による使用および方法の別の実施形態において、本発明による細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、より詳細には治療されるべき被験体由来の樹状細胞である。

【0208】

典型的には、癌治療の場合、本発明によるポリペプチドの治療有効量は、注射１回あたり約０．１ｍｇ〜２ｍｇ、または注射１回あたり約マイクロモル〜１ミリモルである。

【0209】

典型的には、癌治療の場合、本発明によるポリペプチドをロードした抗原提示細胞の治療有効量は、注射１回あたり約２０万細胞〜２００万細胞である。

【0210】

単回投与または複数回投与として個体に投与される投薬量は、薬物動態学的特性、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康、サイズ）、症状の程度、併用治療、治療の頻度ならびに所望の効果などを含む、様々な要因によって変化する。

【0211】

投与様式
本発明による化合物、組成物、特にワクチン組成物、およびそれらの製剤は、経口、非経口、静脈内、直腸内、またはそれらの組み合わせを含む、任意の様式で投与され得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹膜内、皮下、皮内および筋肉内が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物はまた、局所、腫瘍内、鼻腔内、または筋内経路によっても投与され得る。本発明の組成物はまた、組成物の徐放および緩徐制御静脈内注入を可能にする移植片の形態でも投与され得る。

【0212】

好ましくは、本発明による化合物、組成物、特にワクチン組成物、およびそれらの製剤は、皮下に投与される。

【0213】

本発明の一つの実施形態において、本発明の複合体、抗原提示細胞および組成物の投与は、複数回連続注射を必要とする。したがって、一次免疫注射として１回、その後、追加免疫注射というように、少なくとも２回反復投与され得る。

【0214】

本発明の特定の実施形態において、ワクチン組成物は、反復または連続して投与され得る。ワクチン組成物は、少なくとも１、２、３、または４週間；２、３、４、５、６、８、１０、または１２ヶ月間；あるいは２、３、４、または５年間、反復または連続して投与され得る。

【0215】

別の実施形態において、本発明による複合体を構成する細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子は、別個の組成物中に含まれ、これらの組成物は、投与直前に混合されるか、またはそれらを必要とする被験体に同時に投与される。

【0216】

組み合わせ
さらなる実施形態によれば、本発明による方法および使用における医薬組成物の投与は、単独で実施されても、あるいは治療または抑制されるべき疾患または障害の治療および／または安定化に有用な補助剤と組み合わせて実施されてもよい。

【0217】

例えば、癌の治療、予防、または安定化の場合、本発明による方法および使用における医薬組成物の投与は、固形腫瘍に対するものであって転移定着の制御のために従来の化学療法に使用される物質、またはプログラム細胞死を引き起こすことによって作用する任意の他の分子、例えば、限定されないが、Ｆａｓリガンドおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導（ＴＲＡＩＬ）リガンドなどの腫瘍壊死ファミリーメンバーから選択される補助剤と組み合わせて実施され得る。さらなる実施形態によれば、本発明による方法および使用における医薬組成物の投与は、放射線療法と平行して実施され得る。

【0218】

本発明は、本発明の複合体、本発明の複合体をロードした細胞、または本発明によるその医薬組成物の投与を包含し、癌の治療および／または安定化および／または再発癌の予防に有用な他の治療計画または補助剤（例えば、複数の投薬計画）の前に、同時に、あるいは連続して、治療有効量で被験体に投与される。前記補助剤と同時に投与される前記複合体、細胞、または医薬組成物は、同一または別個の組成物中で、かつ、同一または別個の投与経路によって投与され得る。

【0219】

前記他の治療計画または補助剤は、放射線療法、化学療法、手術、標的療法（低分子、ペプチドおよびモノクローナル抗体を含む）、および抗血管新生療法からなる群から選択され得る。抗血管新生療法は、腫瘍関連脈管構造を直接的または間接的に標的とする薬剤の投与として本明細書で定義される。

【0220】

一つの実施形態によれば、本発明の複合体または本発明の細胞、特に本発明の抗原提示細胞を含む医薬製剤が、癌の治療および／または安定化および／または再発癌の予防に有用な少なくとも１つの補助剤、ならびに少なくとも１つの医薬的に許容されるキャリアと組み合わせて提供される。

【0221】

本発明の別の実施形態によれば、本発明による化合物およびその医薬製剤は、再発および／または転移に対する予防として、固形腫瘍を除去する手術の後に投与され得る。

【0222】

さらなる実施形態によれば、本発明による方法および使用におけるイメージング組成物または診断組成物の投与は、単独で実施されても、あるいは疑われる疾患または障害をイメージングおよび／または診断するのに有用な補助剤と組み合わせて実施されてもよい。

【0223】

患者
カーゴ分子の治療効果に応じて、本発明は、前記カーゴ分子の作用によって予防、治療、または軽減され得る任意の疾患または障害に罹患しやすいか、または罹患している任意の患者に適用され得る。カーゴ分子がエピトープを含む場合、前記カーゴ分子の治療効果は、前記エピトープに対する免疫応答、特に、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞および／またはＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞に依存し、かつ／あるいはＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束される応答を誘発することであってもよい。

【0224】

一つの実施形態において、本発明による患者は、癌に、例えば脳、結腸、頭部もしくは頸部の癌に、または子宮頸癌に罹患しやすいか、または罹患している患者である。

【0225】

特定の実施形態において、本発明による患者は、グリオーマなどの脳癌に罹患している患者である。

【0226】

特定の実施形態において、本発明による患者は、腫瘍の外科的除去を受けている。

【0227】

別の実施形態において、本発明による患者は、感染症に罹患しやすいか、または罹患している患者である。

【0228】

本明細書中に引用される参考文献は、その全体が、参考として援用される。本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、これらの実施形態は、本発明の個々の態様の１つの説明であることが意図されており、機能的に等価な方法および組成物が本発明の範囲内にある。実際に、本発明の種々の変更が、本明細書に示されかつ記載されるものに加えて、上述の記載および添付図面から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。

【0229】

本発明を記載してきたが、以下の実施例は、例として示すものであり、本発明はこれらに限定されない。

【実施例】

【0230】

以下の実施例は、細胞内へのペプチドおよびタンパク質の送達ならびにインビボでの免疫応答の誘導のための細胞透過性ペプチドとしてのＺＥＢＲＡのいくつかのフラグメントの有効性を支持するために行った。

【0231】

以下の略語は、それぞれ以下の意味を示す：
ａａ（アミノ酸）、ｈ（時間）、μｌ（マイクロリットル）、μＭ（マイクロモル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）、ｍｇ（ミリグラム）、ｍｉｎ（分）、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオセインサクシニミジルエステル）、ＤＣ（樹状細胞）。

【0232】

実施例１：本発明のＣＰＰ１またはＣＰＰ２およびオボアルブミンペプチドカーゴを含む融合ポリペプチドの調製
２つのＣＰＰ、ならびに構築物１および２に相当する２つの融合ポリペプチド（これらの融合ポリペプチドは、それぞれ、ＺＥＢＲＡ由来の２つのＣＰＰのうちの１つおよびオボアルブミン由来の免疫優性ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを含む）を化学的に合成した。

【0233】

これらのＣＰＰおよび融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＣＰＰ１：（全１７個のアミノ酸）
配列番号１：KRYKNRVASRKSRAKFK
ＣＰＰ２：（全３０個のアミノ酸）
配列番号２：KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
オボアルブミンＣＤ８エピトープ（全８個のアミノ酸）
配列番号３：SIINFEKL
複合体１：構築物１：オボアルブミンＣＤ８エピトープに融合されたＣＰＰ１を含む（全３３個のアミノ酸）
配列番号４：KRYKNRVASRKSRAKFKEQLESIINFEKLTEWT
複合体２：構築物２：オボアルブミンＣＤ８エピトープに融合されたＣＰＰ２を含む（全４６個のアミノ酸）
配列番号５：
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKEQLESIINFEKLTEWT

【0234】

実施例２：本発明によるＣＰＰ１−ＯＶＡまたはＣＰＰ２−ＯＶＡ融合ポリペプチドを樹状細胞内にロードした後の送達およびＭＨＣクラスＩ拘束性提示
抗原提示細胞によって取り込まれるＣＰＰ１およびＣＰＰ２の能力を、オボアルブミンエピトープのプロセシングおよび提示を用いて、最初にインビトロで試験した。構築物１および２の各々を、骨髄由来樹状細胞の培養物に添加し、これらの細胞を続いてリポ多糖（ＬＰＳ）で一晩成熟させた。次いで、ＭＨＣクラスＩ分子上でのオボアルブミンエピトープのプロセシングおよび提示を、樹状細胞とＯＴ１トランスジェニックマウスの脾臓由来のオボアルブミン特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞との共培養により、機能アッセイで検出した。ＯＴ１ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、蛍光色素ＣＦＳＥ（細胞分裂毎に希釈されるので、抗原特異的増殖の指標としての役割を果たす）で予め標識した。ＣＤ８^＋ＯＴ１Ｔ細胞と、構築物１および２の各々をロードした樹状細胞との５日間の共培養後、フローサイトメトリーによって増殖を評価した（図１）。

【0235】

構築物１および２に相当するポリペプチドは、ＯＴ１Ｔ細胞の増殖を同等に誘導することができた（ＣＦＳＥ希釈に基づき、９３〜９６％のＴ細胞が増殖した）。さらに、培養物中の細胞の生存率も類似していた（６９〜７５％）。最小Ｔ細胞エピトープに相当する合成ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を添加した陽性コントロール培養物に対して、この増殖は類似しており、生存率はより優れていた（図１Ｃ、１Ｄ）。また、ＯＴ１Ｔ細胞の単独培養または抗原を持たない樹状細胞との共培養の後に、生存ＯＴ１Ｔ細胞がほとんど検出されなかったので、増殖はオボアルブミン特異的でもあった（図１Ａ、１Ｂ）。

【0236】

実施例３：本発明のＣＰＰ１−ＯＶＡまたはＣＰＰ２−ＯＶＡ融合ポリペプチドを使用したマウスのワクチン接種
よりストリンジェントな条件で抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激する構築物１および２に相当するポリペプチドの能力を試験するために、これらをワクチン接種プロトコルにおいてインビボで試験した（図２）。インビボ応答を誘発するためには、このポリペプチドワクチンは、注射された動物に天然に存在する抗原提示細胞によって取り込まれなければならず、かつ、オボアルブミン特異的Ｔ細胞がエクスビボで検出されることになっている場合、ポリクローナルＴ細胞の刺激は高効率でなければならない。これらの実験についての読み取りは、オボアルブミン特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を検出するためにＭＨＣ−ペプチド多量体を使用した、脾細胞のフローサイトメトリーで行った。

【0237】

２回のみのワクチン接種にもかかわらず、オボアルブミン特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率の上昇が、２つのワクチン接種群について検出された（ＰＢＳでワクチン接種したマウス（陰性コントロール）の場合の０．１８％と比較して、０．３７〜１．１４％のＣＤ８^＋Ｔ細胞が多量体陽性であった）。構築物２に相当するペプチドは、１％を超えるオボアルブミン特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘発したので、インビボで特に有効であった。

【0238】

結論：全般的にこれらのデータは、細胞透過性ペプチドとしてのＣＰＰ１および２の機能性を確証するものである。これらのデータはまた、構築物１および２に相当するポリペプチド（それぞれが、これらの２つのＣＰＰの各々およびオボアルブミンＴ細胞エピトープを含む）が樹状細胞に取り込まれ得ること、かつ、カーゴ分子（すなわち、構築物中に含まれるＴ細胞エピトープ）がインビトロでおよびインビボワクチン接種との関連で、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に交差提示されることを確証するものでもある。

【0239】

実施例４：本発明の異なるＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドを使用したインビトロ形質導入実験
細胞内への形質導入を、ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＣＰＰ８、またはＣＰＰ１０を含む異なるＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドを用いてモニタリングした。オボアルブミン由来の免疫優性ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープと融合したこれらのＣＰＰの各々を化学合成し、フルオレセインで標識した。５×１０^５細胞を、０．９μＭの異なる融合ポリペプチドとともに、３７℃で２時間インキュベートした。試験した細胞は、ヒトリンパ球系細胞Ｋ５６２、マウスリンパ球系細胞ＥＬ４、ヒト星状細胞腫細胞Ｕ２５１およびマウス星状細胞腫細胞ＧＬ２６１であった。これらの細胞を酸緩衝液で洗浄して、膜に結合したペプチドをすべて除去し、生存率についてＬｉｖｅ−Ｄｅａｄ Ｙｅｌｌｏｗを用いて染色した。フローサイトメトリーによって分析を行った。蛍光の指標は、細胞の天然自己蛍光を超える蛍光のレベルを示す。これは、細胞単独とＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドをロードした細胞との間の、フローサイトメトリーによって測定される平均蛍光指標の比である。

【0240】

結果は表２に示される通りであった。

【表2】

【0241】

全般的に、ＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドの毒性作用は観察されなかった。さらに、これらの結果は、試験したすべてのＣＰＰが、ヒトまたはマウス起源の細胞を類似の効率で透過できることを実証している。

【0242】

実施例５：本発明の異なるＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドを使用したマウスのインビボワクチン接種
この実験は、実施例３に記載されるように行った。

【0243】

オボアルブミンＣＤ８^＋エピトープ（配列番号３）に、そのＣＤ８^＋エピトープのＮ末端およびＣ末端部分にそれぞれ配列番号１１および配列番号１２のスペーサーを介して隣接して、表２に示すＣＰＰの１つが融合されて含まれている、１０ｎｍｏｌの融合ポリペプチドを用いて、一群あたり４〜８匹のマウスを、１４日間隔で２回皮下にワクチン接種した。各ＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドを、ＰＢＳ中１００μｇの抗ＣＤ４０と共に注射した。５０μｇのポリ−ＩＣを、２回目のワクチン接種の７日後に筋肉内注射した。五量体染色後のフローサイトメトリー分析によって、血液中の免疫応答をモニタリングした。

【0244】

これらの結果は、配列番号２２のＣＰＰ１４を含む参照のＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドに対する増加倍数として、表３に示されるとおりであった。表２から分かるように、試験したすべてのＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチドは、ＣＰＰ１４を含む参照融合ポリペプチドよりも高い免疫原性を有していた（ただし、陰性コントロールを構成し、かつ、ＣＰＰ１４を含む参照融合ポリペプチドよりも低い免疫原性を有していた、配列番号２１のＣＰＰ７を含む別の参照融合ポリペプチドを除いて）。

【表3】

【0245】

ＣＰＰ７は、Ｚｅｂｒａの１７８〜１８５位にわたる、Ｚｅｂｒａの８アミノ酸長フラグメントである。

【0246】

ＣＰＰ１４は、Ｚｅｂｒａの１７８〜２１９位にわたる、Ｚｅｂｒａの４２アミノ酸長フラグメントである。

【0247】

結論：総合すれば、実施例４および５の結果は、本発明の様々なＣＰＰが、ヒトまたはマウス起源の細胞を透過できること、ならびにそのようなＣＰＰによって運ばれたカーゴ分子が、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に交差提示される（すなわち、輸送されたカーゴ分子に特異的な免疫応答を誘導する）ので、ワクチン接種および免疫療法に有用性があることを示している。

【0248】

配列表
ＣＰＰ１：（全１７個のアミノ酸）
配列番号１：KRYKNRVASRKSRAKFK
ＣＰＰ２：（全３０個のアミノ酸）
配列番号２：KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
オボアルブミンＣＤ８エピトープ（全８個のアミノ酸）
配列番号３：SIINFEKL
ＣＰＰ−ＯＶＡ融合ポリペプチド：
構築物１：オボアルブミンＣＤ８エピトープに融合されたＣＰＰ１を含む（全３３個のアミノ酸）
配列番号４：KRYKNRVASRKSRAKFKEQLESIINFEKLTEWT
構築物２：オボアルブミンＣＤ８エピトープに融合されたＣＰＰ２を含む（全４６個のアミノ酸）
配列番号５：
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKEQLESIINFEKLTEWT
人工配列
配列番号６：X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁SX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇
Ｘ_１は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり
Ｘ_２は、Ｒ、Ｋ、またはＨであり
Ｘ_３は、Ｙ、Ｗ、またはＦであり
Ｘ_４は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり
Ｘ_５は、ＮまたはＱであり
Ｘ_６は、Ｒ、Ｋ、またはＨであり
Ｘ_７は、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＡであり
Ｘ_８は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＧであり
Ｘ_９は、ＳまたはＴであり
Ｘ_１０は、Ｒ、Ｋ、またはＨであり
Ｘ_１１は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり
Ｘ_１３は、Ｒ、Ｋ、またはＨであり
Ｘ_１４は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＧであり
Ｘ_１５は、Ｋ、Ｒ、またはＨであり
Ｘ_１６は、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｙ、Ｗ、またはＭであり
Ｘ_１７は、Ｋ、Ｒ、またはＨである。
人工配列
配列番号７：X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁SX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇
Ｘ_１は、ＫまたはＲであり
Ｘ_２は、ＲまたはＫであり
Ｘ_３は、Ｙ、Ｗ、またはＦであり
Ｘ_４は、ＫまたはＲであり
Ｘ_５は、ＮまたはＱであり
Ｘ_６は、ＲまたはＫであり
Ｘ_７は、Ｖ、Ｉ、ＭまたはＬであり
Ｘ_８は、ＡまたはＧであり
Ｘ_９は、ＳまたはＴであり
Ｘ_１０は、ＲまたはＫであり
Ｘ_１１は、ＫまたはＲであり
Ｘ_１３は、ＲまたはＫであり
Ｘ_１４は、ＡまたはＧであり
Ｘ_１５は、ＫまたはＲであり
Ｘ_１６は、Ｆ、Ｙ、またはＷであり
Ｘ_１７は、ＫまたはＲである。
ＣＰＰ８：（全１５個のアミノ酸）
配列番号８：QHYREVAAAKSSEND
ＣＰＰ１０：（全１９個のアミノ酸）
配列番号９：REVAAAKSSENDRLRLLLK
ＣＰＰ１１：（全２５個のアミノ酸）
配列番号１０：QLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
スペーサー（人工配列）
配列番号１１：ＥＱＬＥ
配列番号１２：ＴＥＷＴ
人工配列（全２１個のアミノ酸）
配列番号１３：LEIKRYKNRVASRKCRAKFKQ
人工配列（全２１個のアミノ酸）
配列番号１４：SELEIKRYKNRVASRKCRAKF
エンテロキナーゼ標的部位
配列番号１５：DDDK
第Ｘａ因子標的部位
配列番号１６：IEDGR
トロンビン標的部位
配列番号１７：LVPRGS
プロテアーゼＴＥＶ標的部位
配列番号１８：ENLYFQG
ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ標的部位
配列番号１９：LEVLFQGP
フューリン標的部位
配列番号２０：RX₂X₃R
Ｘ_２は、任意のアミノ酸であり
Ｘ_３は、ＲまたはＫである。
ＣＰＰ７（全８個のアミノ酸）
配列番号２１：KRYKNRVA
ＣＰＰ１４（全４２個のアミノ酸）
配列番号２２：KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
ＺＥＢＲＡアミノ酸配列（エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来の天然配列） （ＹＰ＿４０１６７３）
配列番号２３：
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF

【図1-1】

【図1-2】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]