特許 6309669 ＣＶＤリスク評価のための生化学マーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6309669

(24)【登録日】2018年3月23日

(45)【発行日】2018年4月11日

(54)【発明の名称】ＣＶＤリスク評価のための生化学マーカー

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20180402BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180402BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180402BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180402BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180402BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180402BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20180402BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20180402BHJP

   C07K 14/775 20060101ALI20180402BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20180402BHJP

   C07K 17/00 20060101ALI20180402BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20180402BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 DZNA

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C07K14/47

   C07K14/78

   C07K14/775

   C07K16/18

   C07K17/00

   !C12P21/08

【請求項の数】12

【全頁数】55

(21)【出願番号】特願2017-81328(P2017-81328)

(22)【出願日】2017年4月17日

(62)【分割の表示】特願2014-165737(P2014-165737)の分割

【原出願日】2008年11月4日

(65)【公開番号】特開2017-181509(P2017-181509A)

(43)【公開日】2017年10月5日

【審査請求日】2017年5月15日

(31)【優先権主張番号】0721713.6

(32)【優先日】2007年11月5日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】0722748.1

(32)【優先日】2007年11月20日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】0802814.4

(32)【優先日】2008年2月15日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】503259129

【氏名又は名称】ノルディック・ビオサイエンス・エー／エス

【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＤＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ Ａ／Ｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】カルスダル，モルテン

(72)【発明者】

【氏名】クヴィスト，ペール

(72)【発明者】

【氏名】バラスクク，ナターシャ

【審査官】 赤坂 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００３−５０２６７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平９−５０９７３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−５５９１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−２６４３２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第９９／０６１４７７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 MOLLOY KJ et al.，CIRCULATION，２００４年，110，337-343

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ０７Ｋ １４／４７−１４／７８

Ｃ１２Ｎ １／１５− １／２１

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

プロテイナーゼによるＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片の定量のためのバイオアッセイの方法であって、前記ペプチド断片を含む試料を、前記ネオエピトープに対する特異的結合親和性を有する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記試料中の前記免疫学的結合パートナーのペプチド断片への結合レベルを定量するステップとを含み、
前記免疫学的結合パートナーが、ネオエピトープ配列を含む未切断のＩＩＩ型コラーゲンには特異的に結合せず、かつ、
前記免疫学的結合パートナーが、ＩＩＩ型コラーゲンの以下の部分配列：
Ｇ＊ＫＮＧＥＴＧＰＱＧＰＰＧＰＴＧＰＧＧＤＫＧＤＴＧＰＰＧＰＱＧ＊Ｌ
の＊で示される位置におけるＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片に対する特異的結合親和性を有する、方法。

【請求項2】

前記免疫学的結合パートナーが、ペプチドのＮ末端においてＩＩＩ型コラーゲンの以下の配列：
ＫＮＧＥＴＧ
に対する特異的結合親和性を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記免疫学的結合パートナーが、特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の断片である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記方法が、前記免疫学的結合パートナー及び競合物質が前記試料の存在下にてインキュベートされ、前記競合物質が試料中のペプチド断片と競合して前記免疫学的結合パートナーと結合する競合イムノアッセイとして行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記競合物質が合成ペプチドである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記試料が、尿、血清、血液又は血漿の試料である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記試料が患者由来試料であり、前記方法が、前記ペプチド断片の結合の定量レベルを、（ａ）比較できる健常患者および／または（ｂ）アテローム性動脈硬化病態の特徴を示す数値と比較するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

ＩＩＩ型コラーゲンのプロテイナーゼ切断によって形成される、Ｃ末端又はＮ末端ネオエピトープに対する免疫学的結合パートナーであって、ＩＩＩ型コラーゲンの以下の部分配列：
Ｇ＊ＫＮＧＥＴＧＰＱＧＰＰＧＰＴＧＰＧＧＤＫＧＤＴＧＰＰＧＰＱＧ＊Ｌ
の＊で示される位置におけるＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるネオエピトープを含むペプチド断片に対する特異的結合親和性を有する、免疫学的結合パートナー。

【請求項9】

前記免疫学的結合パートナーが、ペプチドのＮ末端におけるＩＩＩ型コラーゲンの以下の配列：
ＫＮＧＥＴＧ
に対する特異的結合親和性を有する、請求項８に記載の免疫学的結合パートナー。

【請求項10】

モノクローナル抗体又はその結合断片である、請求項８または９に記載の免疫学的結合パートナー。

【請求項11】

請求項１０に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。

【請求項12】

請求項８〜１０のいずれか一項に記載の免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーに結合する競合物質と、任意選択的に、１つ以上の洗浄試薬、緩衝液、停止試薬、酵素標識、標識酵素のための基質、較正基準、抗マウス抗体及びキットを用いてアッセイを行うための使用説明書とを含むイムノアッセイキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アテローム性動脈硬化の進展及びプラーク不安定性から生じる心血管事象の
リスクを示す生化学マーカーを含む、心血管疾患の診断目的及び疾患の進展の予後に有益
な生化学マーカーの検出のためのアッセイに関する。

【背景技術】

【0002】

世界的に、心血管疾患（ＣＶＤ）は罹病及び死亡の主因である。現在、診断と患者の異
なるリスク群への分類及び低リスク患者の診断を可能にする効果的且つ非侵襲的診断法は
ない。診断及び予後ツールは、主に、単純なマーカー、例えば、年齢、喫煙並びに種々の
脂質及びリポ蛋白質濃度の多変量解析から成る。

【0003】

ＣＶＤは複数の臨床症候群を包括し、それは主に狭心症、心筋梗塞（冠動脈血栓）及び
脳卒中である。通常、これらの症候群はすべて複雑なアテローム性動脈硬化の続発症であ
る。

【0004】

アテローム性動脈硬化は小児期に内膜肥厚から始まり、動脈内膜における脂肪線条に進
行し、これらの病変はそれぞれＩ型、ＩＩ型と特徴付けられる。脂肪線条はアテローム性
動脈硬化の進展における最も初期の肉眼で視認可能な病変であり、すべての人種及び社会
のすべてのヒトに生じる。非病原性状態では内皮細胞（ＥＣ）は白血球との付着性相互作
用に抵抗性である。しかし、アテローム発生時の炎症性サイトカイン及び動脈壁における
蓄積酸化リポ蛋白質の作用は、大動脈ＥＣの表面上における接着分子、例えば、細胞間接
着分子（ＩＣＡＭ）−１及び血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１の発現を引き起こす。こ
れは、白血球の捕捉及び内皮表面を貫通して血管壁の内膜部分への移動を許容する。プラ
ークの発達は、置換やアポトーシスを起こす平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増加を伴い、これは
マトリックス代謝回転の増加をもたらす。コラーゲン合成の障害は線維性被膜の脆弱性及
びより破裂しやすい動脈硬化性プラークをもたらし得るが、大部分の研究者らは、蛋白質
分解酵素、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）及び他のプロテアーゼの
作用が、プラークの破裂のリスクに重大に寄与すると考えている（Ｃｌａｒｋｓｏｎ ａ
ｎｄ Ｋａｐｌａｎ ５０９−２８）。

【0005】

プラークは２つの異なるタイプ、「不安定」及び「安定」プラークに分けられる。しか
し、詳細な組織学的分析及び分子的理解のために、より詳細な分類が用いられる場合が多
い。プラークの発達には３つの主要な段階、すなわち、初期、脂肪線条、及び、複雑性／
進行性プラークがある（Ｓｔａｒｙ Ｈ．Ｃ．）。

【0006】

動脈硬化性プラークは動脈内膜内で発達し、その組成及び構造により分類され得る。こ
の分類では病変を８つのタイプに分類する（Ｓｔａｒｙ Ｈ．Ｃ．）。
Ｉ．脂肪滴に満ち、脂肪滴によって拡大されたマクロファージ（マクロファージ泡沫細胞
）が内膜に増加する。
ＩＩ．マクロファージ泡沫細胞が内膜ＳＭＣ内で脂肪滴とともにプロテオグリカン層の深
部に蓄積する。泡沫細胞層は脂肪線条として視認可能である。ＩＩ型病変では、単球がヒ
トアテロームにおいて過剰発現する単球走化性蛋白質（主にＭＣＰ−１）によって内膜を
貫通する。病変の初期タイプ（Ｉ型及びＩＩ型）は幼児期に始まり得、必ずしもプラーク
の破裂には至らない。更に、アテローム性動脈硬化の発達はＩＩＩ型病変の形成後に終了
し得、プラークの形成は予測可能ではない（Ｓｔａｒｙ Ｈ．Ｃ．）。
ＩＩＩ．ＩＩＩ型病変は脂肪線条（ＩＩ型）とアテローム（ＩＶ型）との中間病変として
判定される。これらの病変は細胞外脂質のプールを含み、これにより、内膜の筋弾性層の
通常密接に隣接しているＳＭＣ間の空間を拡張する。物質のプールは通常ここに存在する
プロテオグリカン及びコラーゲン線維に取って代わり得るが、これはアテローム発生のこ
の段階においてほとんど影響なく生じる。
ＩＶ．アテロームはアテローム性動脈硬化の最初の臨床徴候である。脂質の蓄積細胞外プ
ールによる動脈内膜におけるＳＭＣの移動及び内膜構造の崩壊が、ＩＶ型病変の顕著な特
徴である。脂質コアの形成は、このＳＭＣ移動の最終結果である。脂質コアの形成は壁肥
厚の増大の説明となる。脂質コアは深部内膜の大きな明瞭な輪郭をした領域であり、この
動脈壁部分の通常の構造要素が高密度の泡沫細胞残遺物、遊離脂肪滴、コレステロール結
晶及びカルシウム粒子に置換されている。通常、この領域に存在するＳＭＣは、アテロー
ム性動脈硬化のこの段階において減少し、又は完全に消失する。残遺ＳＭＣは広範に分散
し、伸長細胞体及び、多くの場合、異常に厚い基底膜を生成している。この段階では脂質
コアを覆う層の発達が始まる。この層はコラーゲン／プロテオグリカンに富む細胞間マト
リックス、脂肪滴を有する又は有しないＳＭＣ、マクロファージ及び泡沫細胞から成る。
Ｖ．ＩＶ型病変に対する応答は、線維性「被膜」を形成する修復線維組織マトリックスの
形成である。通常、これらの病変は脂質コア及び不規則に積み重なり合った修復組織の層
から成る。血腫及び血栓形成のような事象がこれらのタイプの病変を更に複雑にし得る。
致死的ではない場合、これらの病変合併症は病変に組み込まれ、コラーゲン及びプロテオ
グリカンから成る修復マトリックス組織の薄層に覆われる。細胞外マトリックス蛋白質で
あるコラーゲン及びプロテオグリカンの含量は被膜の形成時に動脈硬化性プラークにおい
て増加する。
ＶＩ．内皮の異常、例えば、亀裂、びらん、潰瘍、血腫、血栓、出血は、組み合わされる
と、ＶＩ型病変と命名されるより複雑な病変型となり得る。
ＶＩＩ．病変は石灰化病変と称される場合が多く、病変の５０％超がミネラルから成る。
石灰化に加え、これらの病変は大量の修復線維結合組織を含む。ここに閉じ込められたＳ
ＭＣがアポトーシスを受けて分解すると、その石灰化小器官は石灰化の一部になる。
ＶＩＩＩ．線維性病変が石灰性病変に続く。線維性病変は完全にコラーゲンから成り脂質
を含み得ない（Ｓｔａｒｙ Ｈ．Ｃ．）。

【0007】

心血管事象はプラークの破裂の結果である場合が多く、炎症及びプロテアーゼの放出が
線維性被膜の肩領域を弱体化させ、プラークにおける脂肪質が壁在血栓を誘発する血液と
接触することを許容する（Ｃｌａｒｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ）。マトリックス生
成の減少と併せたプロテアーゼ活性の増大による線維性被膜の菲薄化がプラーク不安定性
の顕著な特徴であると考えられ、破裂のリスクを高める。プラークの不安定性及びその破
裂リスクは臨床的に興味深い分野である。不安定プラーク（ＶＰ）の定義は標準化されて
いないが、安定プラークと比べて３つの組織学的特徴の存在を明言する一般的な見解の一
致がある。
１）大きい脂質コア（総病変の４０パーセント超）
２）薄い線維性被膜（６５〜１５０マイクロメートル）
３）大量の急性炎症細胞
ＶＰを定義するための主な基準には、活発な炎症（単球、マクロファージ及びＴ細胞の存
在）、大きい脂質コアを有する薄い被膜、表在血小板凝集を伴う内皮の裸出、亀裂プラー
ク及び動脈の９０％超の狭窄が含まれる。他の細かい基準には、表在石灰化結節、プラー
ク内出血、内皮機能障害及び外側の再構成が含まれる（Ｓｈｉｎ，Ｅｄｅｌｂｅｒｇ，ａ
ｎｄ Ｈｏｎｇ）。

【0008】

プラーク合併症、不安定及び破裂は、医療処置及び／又は生活様式の変更によって抑制
され得る。しかし、場合により、より侵襲的な方法、即ち、血管形成術又はバイパス手術
が必要であり得る。

【0009】

現在、診断ツールは、依然として開発中である静止画像解析又はＣＶＤリスクに関連す
る収縮期・拡張期血圧レベルのような低技術法に基づく。当該分野では高リスクにある患
者をより良く同定し得る多変量解析の開発に多大な関心を向けてきた。そのようなモデル
の１つがＳＣＯＲＥモデル（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｒｉｓｋ Ｅｖ
ａｌｕａｔｉｏｎモデル）である。１９９４年に、そして２００３年に改訂されたのであ
るが、欧州アテローム性動脈硬化学会（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌ
ｅｒｏｓｉｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ）、欧州心臓病学会（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃ
ｉｅｔｙ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）及び欧州高血圧学会（Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａ
ｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）は、冠動脈心疾患の予防に関す
る一組の推奨を公表した。このガイドラインは、無症状の患者におけるＣＶＤリスクを評
価するために、即ち、無症状の高リスク患者の同定のために開発された複数の評価法に基
づく。ＳＣＯＲＥモデルは、性別、年齢、喫煙、収縮期血圧及び総コレステロール若しく
はコレステロール／ＨＤＬ比をリスク因子として一体化している（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ
ａｌ．）。

【0010】

より詳細な診断を行うためにはＳＣＯＲＥモデルは十分ではなく、撮像法が用いられる
。従って、撮像法は主に高リスク群の患者又は研究期間中に用いられる。

【0011】

＜撮像法＞
現在、冠動脈造影法（ＣＡＧ）は狭窄の程度を判定するための判断基準となる撮像法で
ある。ＣＡＧは二次元にて血管腔を撮像するが、血管腔のみに限定され、血管壁を撮像し
ないため、ＣＡＧは安定プラークを有する動脈と不安定プラークを有する動脈とを識別す
ることができない。ＣＡＧは患者が手術（血管形成術又はバイパス手術）を必要とするか
を判定するために用いられる場合が多い。血管の狭窄箇所が進行したプラークであるかを
判定するためには、他の手法、即ち、血管内冠動脈超音波（ＩＶＵＳ）又は血管顕微法が
必要である。

【0012】

ＩＶＵＳはプラーク及び血管壁の二次元断面画像を提供し、血管壁及び形態及び石灰化
の程度の特徴付けには良好であるが、病変における脂質を評価するには不向きな方法であ
ると考えられている。しかし、ＩＶＵＳは侵襲的であり、専門知識及び費用を必要とする
ため、その使用は広まっていない。血管顕微法はアテローム性動脈硬化を理解・同定する
のに有用なもう１つの方法である。血管顕微法はプラーク表面の直接的可視化であり、プ
ラークの色及び血栓を検出する能力を有する。しかし、血管顕微法は侵襲的で技術的に困
難であり、これまでプラークの拡張の程度を検出することができていない。現在多くの関
心を引いているもう１つの撮像法は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）である。ＭＲＩは非侵襲的
であり、脳卒中の高リスクにある頸動脈プラークを同定することができる。一方、小さい
プラークサイズ及び冠動脈の位置のため、ＭＲＩは冠動脈を撮像するのに最適な手法では
ない。他の撮像法、即ち、エラストグラフィ、サーモグラフィ及び光干渉断層撮影が開発
中である（Ｓｃｈａａｒ ｅｔ ａｌ．）。

【0013】

前述の撮像法はすべて開発中であり、単独ではいずれも不安定プラークを同定すること
ができないが、破裂前に分子事象及びプラーク代謝回転を理解するのに有用なツールであ
る。現在、早期においてＣＶＤを診断する唯一の機会は、問題となっている患者及びその
患者の近親者の確立された冠動脈心疾患、末梢動脈疾患及び脳血管アテローム性動脈硬化
症の一連のリスク因子を用いることである。

【0014】

＜現在の生化学マーカー＞
現在、アテローム性動脈硬化のリスク因子としていくつかの生化学マーカーが公知であ
る。最近、血清中の生化学マーカー濃度の測定に多くの関心が向けられている。脂質、例
えば、総コレステロール、低比重リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）及び高比重リポ
蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）並びに炎症マーカー、例えば、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲ
Ｐ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊
死因子アルファ（ＴＮＦα）、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）など。

【0015】

リポ蛋白質の中で少なくとも２つの注目すべき進展があった。ＬＤＬ粒子のサイズがア
テローム性動脈硬化の進行を予測するように思われる。小さいＬＤＬ粒子の濃度上昇が大
きい粒子の濃度上昇よりＣＶＤリスクに関連する（Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｆｏｒｔｍａｎｎ，
ａｎｄ Ｋｒａｕｓｓ）。

【0016】

ＨＤＬ−Ｃのレベルはトリグリセリドに強く関連し、高レベルのトリグリセリドはＣＨ
Ｄのより高いリスクと相関する。Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）によるコ
ホート研究は、高ＴＧ／低ＨＤＬ−ＣがＩＨＤ（虚血性心疾患）の最大のリスク因子であ
ることを見出した（Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）。

【0017】

脂質プロファイルはリスク因子の評価に重要であるが、プラーク代謝回転と関連する分
子事象の理解及び測定を可能としない。多くの生化学マーカーがＣＶＤのリスク因子とし
て示唆されているが、疾患の具体的な産物ではない。これらにはＣＲＰ及び骨ナトリウム
利尿ペプチド（ＢＮＰ）が含まれる（表１参照）。表１はＣＶＤの公知のマーカーの一部
を概述している。

【0018】

【表1】

【0019】

従って、心血管事象のマーカーとして一連の異なる生化学マーカーが示唆されている。
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ（２００６）は、表１に示される、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ研究に参
加した３２００人の患者における１０個の異なる生化学マーカーを測定した。その結論は
、１０個の生化学マーカーの測定が標準的なリスク因子に加えて診断に適度に寄与するの
みであるというものであった。１０個の生化学マーカーの中でＢ型ナトリウム利尿ペプチ
ドレベル、Ｃ反応性蛋白質レベル及び尿中アルブミン／クレアチニン比がマーカーと死亡
／心血管事象との最大の相関を示した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）。

【0020】

＜Ｃ反応性蛋白質＞
Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）は、異なる臨床状態、例えば、炎症、感染又は外傷に応答し
て肝臓によって産生される急性期血清蛋白質である（Ｇａｂａｙ ＆ Ｋｕｓｈｎｅｒ
１９９９）。ＣＲＰの産生は罹患又は損傷組織から放出されるＩＬ−６のようなサイトカ
インに誘発される。ＣＲＰの生理学的役割は未知であり、その炎症促進又は抗炎症作用に
関する議論は進行中である。

【0021】

ＣＲＰがヒトにおけるＣＶＤのリスク因子であるという証拠が蓄積している。Ｒｉｄｋ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２による研究では、急性心筋梗塞、脳卒中、冠血行再建又はＣ
ＶＤによる死亡の発生について８年間追跡した２８，０００人の健常女性から成る大集団
において、ＣＲＰはＬＤＬコレステロールより優れた将来の心血管事象の予測因子である
ことが示された。他の多くの研究もベースラインのＣＲＰレベルが心血管事象の独立した
リスク因子を構成することを報告している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９５，
Ｍｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｋｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｒｉｄ
ｋｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｒｉｄｋｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．２０００）。

【0022】

循環ＣＲＰはアテローム性動脈硬化プロセスにおいて生じる全般的な炎症を反映するだ
けであって、疾患の発病における能動的な構成成分ではないと推測されている。しかし、
また、一連の証拠はＣＲＰがアテローム発生に役割を有するという見解を支持している。
第一に、ＣＲＰを生じさせる慢性感染症もＣＶＤの増大リスクと関連する（Ｌｅｉｎｏｎ
ｅｎ ＆ Ｓａｉｋｋｕ ２００２）。第二に、本発明者らは異なるレベルのアテローム
性動脈硬化病変においてＣＲＰを同定した（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＆ Ｖａｎｃｅ １９８
７，Ｈａｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．１９９５）。最後に、ＣＲＰはｉｎ ｖｉｔｒｏに
てアテローム発生促進特性を有することが示されている：ＣＲＰは内皮細胞を活性化して
接着分子を生成し得る（Ｐａｓｃｅｒｉ ｅｔ ａｌ．２０００）。また、ＣＲＰは内皮
細胞におけるｅＮＯＳの生成を減少させ（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ ｅｔ ａｌ．２００２）
、マクロファージによるＬＤＬの取込みを増進し得る（Ｚｗａｋａ ｅｔ ａｌ．２００
１）。

【0023】

＜脳性ナトリウム利尿ペプチド＞
脳性（Ｂ型）ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、心室における心筋細胞の過度の伸
張に応答して心室によって分泌されるペプチドホルモンである。Ｔ−ｐｒｏＢＮＰ（不活
性Ｎ末端断片）は活性ホルモン（ＢＮＰ）とともにｐｒｏＢＮＰの切断と同時に血流に放
出される。ＢＮＰ及びＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは心血管事象の潜在的生化学マーカーとして示
唆されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）。

【0024】

＜ケモカイン＞
ケモカインもＣＶＤの潜在的マーカーである。ケモカインは炎症時に産生される低分子
量サイトカインである。ＣＶＤに関連する１つの主要なケモカインは単球走化性蛋白質−
１（ＭＣＰ−１）である。ＭＣＰ−１はアテローム性動脈硬化病変への単球の動員に初期
の重要な役割を果たすように思われる。アテローム性動脈硬化のサルモデルを用いた研究
では、ＭＣＰ−１の血漿濃度はプラークサイズ及びプラーク合併症と高度に関連していた
（Ｒｅｇｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．）。

【0025】

＜コレステロールを含む脂質＞
最近、血清中のコレステロール濃度の測定に多くの関心が向けられている（総コレステ
ロール並びに低比重リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）及び高比重リポ蛋白コレステ
ロール（ＨＤＬ−Ｃ）の濃度）。リポ蛋白マーカーの中で少なくとも２つの注目すべき進
展があった。第一に、ＬＤＬ粒子サイズからアテローム性動脈硬化の進行の程度が予測さ
れるように思われる。小ＬＤＬ粒子の濃度上昇は、大粒子の濃度上昇よりＣＶＤリスクに
関連する（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ）。第二に、ＬＤＬ粒子のオレイン酸コレステリ
ル含量はＣＶＤリスクの特に重要なマーカーになり得る。サルにおいて、オレイン酸コレ
ステリルを有するリポ蛋白粒子コアの高濃度化は、より重度の冠動脈アテローム性硬化と
強く且つ正に関連し（Ｒｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ）、ＬＤＬ及びＨＤＬコレステロール濃度
の寄与に相加的であった。実験動物におけるこれらの知見は、低比率のリノール酸コレス
テリル（逆に、高比率のオレイン酸コレステリル）を有する血漿リポ蛋白質が正常な対照
と比べてＣＨＤ（冠動脈心疾患）の合併症を有する患者に典型であることを示した従前の
ヒト研究（Ｌａｗｒｉｅ ｅｔ ａｌ）によって更に支持される。

【0026】

ＨＤＬ−Ｃのレベルはトリグリセリドと強く関連し、高レベルのトリグリセリドはＣＨ
Ｄのより高いリスクと相関する。Ｊｅｐｐｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ）によるコホート研究は
、高ＴＧ／低ＨＤＬ−ＣがＩＨＤ（虚血性心疾患）の最大のリスク因子であることを見出
した。

【0027】

これらの脂質プロファイルはリスク因子の評価に重要であるが、プラーク代謝回転と関
連する分子事象の理解及び測定を可能としない。多くの生化学マーカーがＣＶＤのリスク
因子として示唆されているが、これらは疾患の具体的な産物ではない。これらにはＣＲＰ
及びＡｐｏＥが含まれる。

【0028】

＜リポ蛋白質＞
ＣＶＤを予測するために最も一般的に用いられるバイオマーカーは、コレステロール濃
度である（総コレステロール及びコレステロール／ＨＤＬ比）。これらは他のリスク因子
、例えば、血圧及びＬＤＬレベルとともに用いられる。前述のＳＣＯＲＥモデルでは両方
の因子が用いられる。ＬＤＬは血中にコレステロールを輸送し、酸化ＬＤＬの蓄積はアテ
ローム性動脈硬化を促進し得るため、ＬＤＬレベルは重要である（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ
ａｌ）。加えて、ＣＨＤとトリグリセリド（ＴＧ）レベルとの有意な関連が見出され、Ｃ
ＨＤの増大リスクはＬＤＬ−Ｃ及びＨＤＬ−Ｃレベルから独立して増大ＴＧレベルと関連
したが、コレステロールレベルはＣＶＤの主要なリスク因子の１つであると見なされる（
Ｊｅｐｐｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ）。

【0029】

＜ＡＰＯ−Ｅ＞
アポリポ蛋白質Ｅはカイロミクロン、ＶＬＤＬ及びＨＤＬに見出される。アポリポ蛋白
質Ｅは主に肝臓で合成されるが、他の多くの臓器、例えば、脳、脾臓、腎臓でも合成され
る（Ｓｉｅｓｔ ｅｔ ａｌ．１９９５）。ＡｐｏＥは２つの受容体（ＬＤＬ受容体及び
ＡｐｏＥ特異的カイロミクロンレムナント受容体）のリガンドとして作用することによっ
てリポ蛋白代謝に重要な役割を果たす。ＡｐｏＥとこれらの受容体との相互作用はコレス
テロールの代謝調節の基盤を付与する。ａｐｏＥ遺伝子座における遺伝子多型は３つの対
立遺伝子（６つのａｐｏＥ表現型を決定するε２，ε３及びε４）が大部分の集団に見出
されることとなる。アイソフォームは１１２及び１５８位において１つのアミノ酸だけ互
いに異なる。ＡｐｏＥ２は両方の残基においてシステインを有し、Ｅ４は両方の位置にお
いてアルギニンを有する。ＡｐｏＥ３は１１２位においてシステインを、１５８位におい
てアルギニンを含む。対立遺伝子頻度は様々な集団において異なる。研究の中にはａｐｏ
Ｅ多型とアテローム性動脈硬化との関連の可能性を評価したものがある。１４の観察研究
のメタアナリシスではε４対立遺伝子が男女の間で冠動脈疾患と関連することを示した（
Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９６）。更に、ε４対立遺伝子は頸動脈アテローム性硬
化と関連している（Ｔｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｃａｔｔｉｎ ｅｔ ａｌ．１
９９７，Ｈａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．２００２）。

【0030】

ＡｐｏＥは２９９アミノ酸長であり、リポ蛋白質、脂溶性ビタミン及びコレステロール
をリンパ系へ、更には血液循環へ輸送する。ＡｐｏＥは主に肝臓で合成される。現在、保
存低比重リポ蛋白受容体遺伝子ファミリーに属するＡｐｏＥの哺乳動物受容体は７つある
。

【0031】

＜更なる生化学マーカー＞
微量アルブミン尿（Ｍｉｃｒｏａｌｂｕｍｉｎｕｒｅａ）（アルブミン／クレアチニン
レベル）も潜在的な独立したマーカーである。尿中アルブミン排泄率は腎臓の変化のマー
カーであり、クレアチニンの微量の上昇と比べてアテローム性動脈硬化を示し得る（Ｗａ
ｎｇ ｅｔ ａｌ．）。

【0032】

プロコラーゲンマーカーの中でＩＩＩ型コラーゲン代謝回転速度のマーカー（ＰＩＩＩ
ＮＰ）は高血圧の予後マーカーとして研究され、心筋梗塞と関連している。Ｓａｔｔａ
ｅｔ ａｌ．は腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）と血中プロコラーゲン（ＰＩＩＩＮＰ）の濃度と
の相関を検討した。彼らは、ＩＩＩ型コラーゲン代謝回転がＡＡＡ患者において増加し、
増進した合成、増進した分解又は両方の組合せによるものであり得ることを示した。同じ
実験において、Ｉ型プロコラーゲン（ＰＩＣＰ）のカルボキシ末端プロペプチドが測定さ
れ、動脈瘤嚢にＩ型コラーゲンの加速度的な合成はなかった。

【0033】

＜プラークの蛋白質プロファイル＞
ヒト動脈はより大きい若しくは弾性の動脈、中間若しくは筋性の動脈並びに小動脈に分
けられ得る。血管壁は内弾性板及び外弾性板によって分離された内膜、中膜及び外膜から
成る。内膜は結合組織、平滑筋細胞及び少数の分離マクロファージから成る。内膜の境界
は内皮の管腔表面と内弾性板との間の層と定義され得る。

【0034】

動脈内膜は更に２つの層に分けられ得る。プロテオグリカン層と称される内層は豊富な
プロテオグリカン、平滑筋細胞及びマクロファージから成る。下層、筋弾性層は豊富な平
滑筋細胞及び弾性線維から成る。通常の状態では内膜の２つの層は光学顕微鏡によってど
うにか視認可能であるが、内膜肥厚が生じると明確且つ著明である。中膜は動脈壁の筋部
分であり、平滑筋細胞、エラスチン、コラーゲン原線維から成る。

【0035】

外膜、外層は高度に微小血管であり、コラーゲン、弾性線維、平滑筋細胞及びリンパ管
を含む。

【0036】

ヒト動脈硬化性プラークは、線維状コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン及びＳ
ＭＣから成る線維性被膜に覆われた脂質に富むコアを特徴とする。プロテオグリカンヒア
ルロナンは、事象、例えば、脂質蓄積、血栓及び細胞増殖・移動を調節し、また、組織の
物質特性に作用することによって病変発達に作用する可能性を有する細胞外マトリックス
の主要な非線維状構成成分である（Ｗｉｇｈｔ １９９５）。浸潤ＡｐｏＥ及びＣＲＰも
存在し、本発明者らは、アテローム性動脈硬化症の異なる段階において冠動脈の動脈硬化
性プラークにおいて両方の局在を示した。？？参照

【0037】

＜ヒトにおけるＡｐｏＥ及びＣＲＰの分布＞
下記の表２はヒト体内のＡｐｏＥ及びＣＲＰの分布を示す。

【0038】

【表2】

【0039】

下記の表３は、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏにて示されるＡｐｏＥ及び
ＣＲＰと蛋白質との公知の相互作用を示す。

【0040】

【表3】

【0041】

＜ヒトにおけるコラーゲンの分布＞
コラーゲンはヒトの身体に広範に分布し、即ち、ヒトの身体における蛋白質の質量の約
３０％はコラーゲンから成る。表４に主要なコラーゲンタイプがその主要な組織分布とと
ともに一覧されている。

【0042】

【表4】

【0043】

Ｉ型コラーゲンは最も豊富なコラーゲンであり、大部分の結合組織に見出される。Ｉ型
コラーゲンは特に骨及び皮膚の構造に重要である。ヒトの身体におけるコラーゲンの主要
含量は骨及び皮膚に分布し、主要なコラーゲン成分はＩ及びＩＩＩ型コラーゲンである。
ＩＩＩ型コラーゲンは大動脈の主要構成成分であり、Ｉ型コラーゲンに富む組織にもより
少ない量にて見出される。加えて、ＩＶ型コラーゲンは基底膜及び血管・神経周囲に見出
される。Ｖ型コラーゲンの最も一般的な局在は、Ｉ及びＩＩＩ型コラーゲンと関連して特
徴的なコラーゲン原線維内である（Ｇａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ）。

【0044】

一部のコラーゲンは限定された組織分布を有し、例えば、ＩＩ型はほとんど軟骨に見出
される（Ｍａｙｎｅ Ｒ．）。

【0045】

コラーゲン原線維は２つ以上のコラーゲンタイプから成る場合が多い。例えば、Ｉ型コ
ラーゲン原線維は少量のＩＩＩ，Ｖ及びＸＩＩ型を含む場合が多く、一方、軟骨のＩＩ型
コラーゲン原線維はＩＸ及びＸＩ型も含む。

【0046】

＜動脈におけるコラーゲン＞
動脈には６つのタイプのコラーゲンが見出され（Ｉ，ＩＩＩ，ＩＶ，Ｖ，ＶＩ及びＶＩ
ＩＩ型）、Ｉ及びＩＩＩ型が最も豊富であり、コラーゲン含量の８０〜９０％である。Ｉ
及びＩＩＩ型は血管壁でも最も多い。Ｉ及びＩＩＩ型は動脈壁の３つのすべての層内に異
なる量にて共分布しているように思われ、Ｉ及びＩＩＩ型コラーゲンの合成は内膜に位置
している傾向にある（Ｍａｙｎｅ Ｒ）。

【0047】

＜プラークにおけるコラーゲン及び他の構造蛋白質の代謝回転＞
動脈硬化性プラークの発達の間、コラーゲンが線維性被膜に蓄積する（Ｓｔａｒｙ Ｈ
．Ｃ．）。Ｋａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ（１９９２）による研究では、Ｉ，ＩＩＩ及びＩ
Ｖ型コラーゲンがヒト大動脈組織における病変のすべての段階において肥厚内膜において
見出された。ＶＩ型コラーゲンが内膜細胞の領域における基底膜に分布し、進展した病変
では伸長ＳＭＣ周囲にも検出された。Ｉ及びＩＩＩ型の従前の研究はアテローム硬化性動
脈壁における同等の分布のエビデンスを提供している（Ｓｈｅｋｈｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ
）。ＭｃＣｕｌｌａｇｈ ｅｔ ａｌ（１９８０）によれば、ＩＩＩ型が正常なヒト大動
脈中膜において最も多いコラーゲンである（抽出可能なコラーゲンの約７０％）。Ｅｒｉ
ｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ（２００６）による最近の研究は、狭窄の程度に依存するヒト大動
脈弁における総コラーゲン含量の減少を見出した。狭窄の分子機構は、アテローム性動脈
硬化に類似すると考えられている。健常な大動脈弁では、コラーゲン含量は主にＩ及びＩ
ＩＩ型である。狭窄の間、コラーゲンの総含量は減少し、それはおそらくＩ型コラーゲン
の代謝回転の増大によって生じる。Ｉ型コラーゲンは総コラーゲンの約６０〜７０％を占
め、一方、ＩＩＩ型コラーゲンの割合は健常弁及び石灰化弁において３０〜４０％であっ
た。

【0048】

Ｖ型コラーゲンも、進展したアテローム性動脈硬化病変において増加し、大動脈中膜及
びプラークの内皮下領域において、細胞外マトリックス全体にわたって分布する（ＭｃＣ
ｕｌｌａｇｈ ｅｔ ａｌ）。

【0049】

動脈硬化性プラークに見出される主なコラーゲンタイプは、Ｉ及びＩＩＩ型であるとい
う見解の一致があるように思われ、それらが健常血管及びアテローム硬化性血管において
同等に分布しているかは更に研究される必要がある。

【0050】

Ｋａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ（１９９２）による研究では、より進展した病変のアテロ
ームの中心部にコラーゲンは検出されなかった。

【0051】

＜エラスチン＞
エラスチンは身体において最も安定な蛋白質の１つであり、その弾性及び弾力によって
生じる大部分の結合組織に見出される。エラスチンは動脈壁の蛋白質含量を独占し、主要
な細胞外マトリックス蛋白質である。

【0052】

エラスチンは弾性線維における主な構成成分であり、石灰化に関連する。血管石灰化は
血管壁内の２つの異なる部位（内膜及び中膜）において生じる。内膜石灰化は主に壊死性
コア内にてアテローム性動脈硬化に関連する。石灰化弾性線維はプラークが最も破裂しや
すいプラーク肩部を構成し、弾性線維の石灰化がプラーク安定性に作用し得ることを示唆
している（Ｂｏｂｒｙｓｈｅｖ Ｙ．Ｖ．）。アテローム性動脈硬化では、弾性線維の含
量は脂質沈着とともに減少し、これはエラスチン分解酵素に対する感受性の亢進を生じさ
せる。これにより、コラーゲンとは対照的に、エラスチンの含量は、病変が発達するにつ
れて減少する。

【0053】

＜ヒトにおけるエラスチンの分布＞
表５はヒトの身体におけるエラスチンの分布を示す。

【0054】

【表5】

【0055】

表６はｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏにて示されるエラスチンと蛋白質と
の公知の相互作用を示す。

【0056】

【表6】

【0057】

＜マトリックス構成成分としてのプロテオグリカン＞
プロテオグリカン（ＰＧ）は、主に血管壁の細胞間マトリックスに局在する多糖蛋白質
である（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ １９８１）。ＰＧは、結合領域を
通じてコア蛋白質に共有結合したＧＡＧと称される１つ以上の長い非分岐高ポリアニオン
糖側鎖の存在を特徴とする高分子である。ＧＡＧの反復単位は、アミノ糖（Ｎ−アセチル
−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａＩＮＡｃ））
及びヘキスロン酸（グルクロン酸（ｇｌｕｃｏｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＧｌｃＡ）又
はイズロン酸（ＩｄｏＡ））から成る。反復単位における糖の一方又は両方は１つ以上の
硫酸基を含む（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｅｅ ２００７）。ＧＡＧ鎖に加え、大部分のコ
ア蛋白質はＮ−及び／又はＯ−結合オリゴ糖を保有する。

【0058】

＜ＰＧの分類及び命名＞
ＰＧは高分子の極めて異質の群である。単一タイプのコア蛋白質は結合ＧＡＧ鎖の数及
びタイプの点で異なり得る。鎖長及び鎖に沿った硫酸化残基の構成も異なる。

【0059】

反復二糖類単位の構造によってＧＡＧの４つの主なクラスが識別される。コンドロイチ
ン硫酸（ＣＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパリン硫酸（ＨＳ）及びヘパリン、ヒア
ルロナン並びにケラチン硫酸（ＫＳ）。

【0060】

ヒアルロナンはＧＡＧの最も単純なものである。他のすべてと対照的に、ヒアルロナン
は硫酸化糖を含まない。その二糖類単位はすべて同一であり、その鎖長は膨大であり、ヒ
アルロナンはコア蛋白質に結合していない。

【0061】

ＫＳは硫酸化ポリラクトサミン鎖である。ＫＳ−Ｉは元々角膜において説明され、コア
蛋白質においてアスパラギン残基にＮ結合し、一方、ＫＳ−ＩＩ又は軟骨ＫＳはセリン又
はスレオニン残基にＯ結合している（Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ ２０００）。

【0062】

ＰＧはいくつかのパラメータによって分類され得る。
結合ＧＡＧ鎖（ＣＳ／ＤＳ−又はＨＳ含有ＰＧ）
細胞に関する組織分布（細胞外及び基底膜ＰＧ、細胞結合ＰＧ又は細胞内ＰＧ）
コア蛋白質相同性（ヒアレクタン（ｈｙａｌｅｃｔａｎ）、小さなロイシンに富むＰＧ
（ＳＬＲＰ）

【0063】

コンドロイチン／デルマタン硫酸ＰＧ（バーシカン、アグリカン、ニューロカン及びブ
レビカン）はヒアルロナン結合プロテオグリカンのファミリーに属する。この遺伝子ファ
ミリーは集合的にヒアレクタン（ｈｙａｌｅｃｔａｎ）と称される。各ファミリーメンバ
ーは特徴的な分布を有し、アグリカンは軟骨において顕著であり、ニューロカン及びブレ
ビカンは中枢神経系において顕著であり、バーシカンは血管壁を含む様々な軟組織に存在
する。バーシカンの遺伝子及び蛋白質構造はドメインテンプレートに従う。アミノ末端球
状末端（Ｇ１）はＧＡＧヒアルロナンに結合し、カルボキシ末端球状ドメイン（Ｇ３）は
、２つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン及び補体調節領域に隣接するＣ型レクチンから
成る蛋白質のセレクチンファミリーに類似する。バーシカンコア蛋白質の中央領域は、バ
ーシカンのＣＳ結合領域を指定する２つの大きなエクソンにコードされる。エクソン７に
コードされる領域はαＧＡＧと称され、一方、エクソン８にコードされる領域はβＧＡＧ
と称される。バーシカンの選択的スプライシングから４つのｍＲＮＡ転写物が生じ、コア
蛋白質の長さ及び結合ＧＡＧの数が異なるＶ０，Ｖ１，Ｖ２及びＶ３を生じさせる（Ｄｏ
ｕｒｓ−Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）。ヒトバーシカンにお
ける潜在的ＧＡＧ結合部位の数は、Ｖ０では１７〜２３、Ｖ１では１２〜１５、Ｖ２では
５〜８、Ｖ３では０である（Ｗｉｇｈｔ ６１７−２３）。

【0064】

デコリン及びバイグリカンは、３つのクラス（Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩ）及び異なるサブフ
ァミリーに分類される少なくとも９つのメンバーを含むＳＬＲＰファミリーのメンバーで
ある。それらはすべて、強い蛋白質−蛋白質相互作用を成すロイシンに富むリピートを含
む中央ドメインの強い存在を成すロイシンに富むリピートを含む中央ドメインの存在を特
徴とする。デコリン及びバイグリカンはクラスＩのメンバーであり、ファミリーの中で最
も高い相同性を示し（約５７％）、プロペプチドを有する唯一のＳＬＲＰである。プロペ
プチドは種にわたって高度に保存され、ＧＡＧ鎖の合成に関与する最初の酵素であるキシ
ロシルトランスフェラーゼの認識配列として機能し得る。

【0065】

バーシカン、デコリン及びバイグリカンは、哺乳動物動脈壁のマトリックスにおける主
要なＣＳ／ＤＳ ＰＧである（Ｗｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．１９８６）。バーシカンＶ０コ
ア蛋白質のサイズは３７０ｋＤａであり、３６ｋＤａのデコリン及び３８ｋＤａのバイグ
リカンよりほぼ１０倍大きい。側鎖は広範なサイズを示すが、概して各々平均約４０〜９
０ｋＤａである。

【0066】

ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、細胞結合及び細胞周囲ＰＧの５つの異
なるクラスに分類され、哺乳動物細胞表面、基底膜及びＥＣＭのＨＳの少なくとも９５％
を占める。細胞結合ＨＳＰＧは膜内在性シンデカン及び固着グリピカンを含む。細胞周囲
ＨＳＰＧは主にパールカン、アグリンを含む。これらのＰＧは、インテグリンを介した細
胞膜との密接な関連のために細胞周囲型と称される（Ｗｈｉｔｅｌｏｃｋ ａｎｄ Ｉｏ
ｚｚｏ）。

【0067】

パールカンは、ほぼすべての基底膜並びに間葉系臓器及び結合組織に発現するモジュラ
ーＨＳＰＧであり、脊椎及び無脊椎動物に見出される最大の単鎖ポリペプチドの１つであ
る。パールカンの５つのモジュール及びそのＨＳ側鎖は、例えば、線維芽細胞増殖因子２
、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及び他のマトリック
ス蛋白質との多数の分子相互作用に関与する。ヒトパールカンのコア蛋白質は約４７０ｋ
Ｄａであり、多くのＯ結合オリゴ糖及び４本のＨＳ側鎖とともに８００ｋＤａを超える分
子量に達し得る（Ｋｎｏｘ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｌｏｃｋ）。

【0068】

＜プロテオグリカンの分布＞
プロテオグリカン（ＰＧ）はヒトの身体のほぼあらゆる部位に分布する高分子である。
ＰＧの構造及びサイズは極めて異なる。すべてのＰＧの基本構造はコア蛋白質及び少なく
とも１つであるが、多くの場合、多くの炭水化物鎖、すなわちグリコサミノグリカン（Ｇ
ＡＧ）を含む。ＰＧは細胞内、細胞表面及び細胞外マトリックスに見出され得る。ＰＧの
構造多様性は多くの生物学的機能を示唆するものであり、表７を参照されたい。

【0069】

【表7】

【0070】

＜動脈におけるプロテオグリカン＞
少なくとも５つのタイプのＰＧが動脈壁の細胞外マトリックスに存在する。ヒアルロナ
ンと相互作用して大凝集体を形成するバーシカン；コラーゲン及びエラスチンのような原
線維マトリックス構成成分と相互作用する、小さいロイシンに富むデコリン及びバイグリ
カン；基底層の構成成分であるヘパラン硫酸−パールカン並びにケラチン硫酸−ルミカン
（Ｔａｌｕｓａｎ ｅｔ ａｌ．）。

【0071】

バーシカンはアテローム性動脈硬化病変に蓄積するいくつかのＥＣＭ分子の１つである
。多くの研究が、バーシカンが明らかにＬＤＬに結合することができることを示すが、概
して、バーシカンは壊死性コアの脂質に富む中央部には検出されない（Ｅｖａｎｋｏ ｅ
ｔ ａｌ．）。

【0072】

ルミカンはマクロファージに直接結合し、且つマクロファージの移動を増進することが
示されている。従って、ルミカンは血管内膜におけるマクロファージの挙動に影響を及ぼ
すとともに、進展したアテローム性動脈硬化病変の特徴を示す壊死性コアの形成を刺激し
得る（Ｆｕｎｄｅｒｂｕｒｇｈ ｅｔ ａｌ．１９９７）。

【0073】

バイグリカンは線維性被膜に見出される。バーシカン及びバイグリカンはＬＤＬに対す
る親和性を有し、不溶性複合体を形成し、これはＬＤＬの酸化を促進する。バイグリカン
はリポ蛋白質を動脈壁に捕捉することによってアテローム性動脈硬化の発病に寄与し得る
。動脈内膜のプロテオグリカン代謝の変化はアテローム性動脈硬化の初期病変を構成し、
プロテオグリカンの蓄積はアテローム性動脈硬化の進行に基本的な役割を果たす（Ｋｕｎ
ｚ Ｊ．）。

【0074】

パールカンは、質量分析ベースの分析及び免疫組織化学によって内膜の細胞外マトリッ
クスの中心成分の１つとしてヒト内膜過形成にて報告された。

【0075】

表８は、正常及びアテローム性動脈硬化血管におけるＰＧの免疫組織化学的染色でのい
くつかのＰＧの分布を示す（Ｅｖａｎｋｏ ｅｔ ａｌ）。

【0076】

【表8】

【0077】

＜マトリックス再構築におけるプロテオグリカンの関与＞
非ヒト霊長類におけるアテローム性動脈硬化の進行の研究は、特定のＰＧの蓄積が病変
の重症度及び細胞・増殖因子の分布により異なることを示し、アテローム性動脈硬化の進
行時に異なるＰＧが異なる役割を果たすことを示唆した。異なるレベルの特定のＰＧは、
線維性マトリックス構成成分、例えば、エラスチン及びコラーゲンの構造配置の変化への
寄与によって組織の物質特性に直接作用し得る。

【0078】

バーシカン及びヒアルロナンは、マトリックスにおける同様の局在を示し、アテローム
発生におけるその２つの間の凝集体形成を示唆する。早期病変におけるバーシカン及びヒ
アルロナンの著明な増加は、早期アテローム性動脈硬化病変、例えば、ＳＭＣ及び白血球
の増殖・移動に役割を果たすことを示唆し得る。更に、バーシカン及びヒアルロナンはヒ
ト再狭窄病変の主要なマトリックス構成成分であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて血管損傷後の
新たな内膜肥厚に寄与することが示されている。また、早期アテローム発生における大量
のバーシカンは、バーシカンのコンドロイチン硫酸鎖へのリポ蛋白質の結合により、細胞
外マトリックスに脂質の捕捉を増大させやすくし得る。この見解は、移植動脈疾患におけ
るバーシカンとアポ蛋白質（ａ）及びアポリポ蛋白質Ｅとの共局在によって支持される（
Ｅｖａｎｋｏ ｅｔ ａｌ）。プラークからのバーシカンの喪失はマトリックス不安定を
もたらし得る。

【0079】

このことは、血管損傷後に認められるバーシカン遺伝子のアップレギュレーションから
更に明らかである。この場合、バーシカンは、アテローム性動脈硬化のすべての段階、す
なわち、早期の発達プラークの内膜のみならず、進展した病変にわたり、脂質で満たされ
た壊死性コアの境界及びプラーク−血栓界面にても同定された（Ｗｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍ
ｅｒｒｉｌｅｅｓ ２００５）。これらの所見は脂質の蓄積、炎症及び血栓にバーシカン
が関与していると見なす。更に、バーシカンはＥＣＭのアセンブリ及び弾性線維原線維形
成の調節に重要な役割を果たし、これは血管疾患時のＥＣＭ再構築において基本的に重要
である（Ｗｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｌｅｅｓ ２００５）。

【0080】

動脈細胞生物学におけるバイグリカンの役割は不明瞭である。一部の免疫組織化学的研
究は、ヒト再狭窄病変においてコラーゲンＩ及びＩＩＩ染色とのバイグリカンの関連を示
している（Ｅｖａｎｋｏ ｅｔ ａｌ．）。

【0081】

マトリックス蛋白質としてのバイグリカンの重要性は、バイグリカン遺伝子のヌル変異
に対してホモ接合性のＢＡＬＢ／ｃＡマウスの作製によって更に述べられ、この場合、バ
イグリカン欠損雄マウスの５０％が大動脈破裂の結果として寿命の最初の３カ月以内に突
然死した。この所見は、大動脈壁の構造・機能的一体性にバイグリカンが不可欠であるこ
と、また、ヒトにおける大動脈解離・破裂の発病におけるバイグリカン遺伝子欠損の潜在
的役割を示唆する（Ｈｅｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．２００７）。

【0082】

他の研究は、バイグリカンが霊長類動脈においてエラスチンと関連する主要なＰＧであ
ることを示しており、これらの所見はヒト冠動脈疾患の所見に類似している（Ｅｖａｎｋ
ｏ ｅｔ ａｌ）。

【0083】

デコリンはコラーゲンに結合し、且つコラーゲン原線維形成を調節することが示されて
いる（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｖｏｇｅｌ）（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）。

【0084】

＜プロテアーゼのプロファイル＞
プロテアーゼはペプチド結合を加水分解し、アテロームにおけるコラーゲン、プロテオ
グリカン及びエラスチンのような細胞外マトリックス蛋白質の分解に関与する。表９を参
照されたい。動脈硬化性プラークには３つの主なタイプ（メタロプロテイナーゼ（即ち、
ＭＭＰ）、セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼ（即ち、カテプシン））が見
出される。カテプシン及びＭＭＰは、すべての細胞外マトリックス蛋白質の分解に関与す
る。プラーク安定性にはマトリックスが不可欠であるため、プロテアーゼによる線維性被
膜からのその除去はプラーク破裂を引き起こし得る（Ｓｔａｒｙ Ｈ．Ｃ）。

【0085】

表９に動脈硬化性プラークに見出される種々のプロテアーゼが一覧にされている。

【0086】

【表9】

【0087】

プラークにおけるＭＭＰ発現の主要源はマクロファージ及びＳＭＣ活性に関連する疑い
がある。プラークにおけるマクロファージは豊富なＭＭＰ−１，−８，−９及び−１３を
含み、ｉｎ ｓｉｔｕにてコラーゲン及びプロテオグリカン分解部位と共局在する（Ｋｕ
ｎｚ Ｊ．）。更に、自身のデータは動脈硬化性プラークにおけるＭＭＰ−８及びカテプ
シンＫの局在を示唆する。

【0088】

＜マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）＞
ＭＭＰは、ＥＣＭの大部分の構成成分を分解することができるエンドペプチダーゼの大
きな一群である。現在、２５超のＭＭＰが同定されている。メタロプロテアーゼは、金属
原子、典型的には亜鉛を含む活性部位を特徴とし、チモーゲンとして分泌される。特定の
組織阻害物質ＴＩＭＰがＭＭＰの活性を調節する。様々なＭＭＰが動脈硬化性プラークに
見出される。それらはほとんどの場合、ＳＭＣ及びマクロファージにおいてプラーク肩部
内にて線維性被膜に接するマクロファージにあり、線維性被膜内に同定されることは稀で
ある（Ｋｕｎｚ Ｊ．）。］

【0089】

ＭＭＰはその基質特異性によって異なる群に分類される。Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ及びＶ型コ
ラーゲンのような線維状コラーゲン、更にプロテオグリカンも分解するコラゲナーゼ；プ
ロテオグリカン、ＩＶ，Ｖ，ＶＩＩ型コラーゲン及びエラスチンを分解するゼラチナーゼ
；プロテオグリカン及びエラスチンに対して活性を示すストロメライシン（Ｒｏｕｉｓ
Ｍ）。これらの３つのサブグループは動脈硬化性プラークにおけるマトリックス再構築に
関して特に興味深い。

【0090】

＜ゼラチナーゼ＞
不溶性エラスチンは、ともにＭＭＰのゼラチナーゼファミリーに属するＭＭＰ−２及び
−９によって消化される。ＭＭＰ−９は、動脈硬化性プラークのサイズ及び組成に作用す
る重要な役割を有する。不安定なヒト動脈硬化性プラーク及びプラークの脆弱領域では、
ＭＭＰ−９のより高い発現及び濃度が認められている。更に、ＭＭＰ−９は、安定狭心症
患者と比べて不安定狭心症患者においてより多く、冠動脈プラークにおいて細胞内に見出
される（活発な合成を示す）。血中ＭＭＰ−９濃度は、冠状動脈アテローム性動脈硬化と
関連して上昇し、有害な心血管事象を予測する（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｖａｓａ
ｎ）。Ｋｕｚｕｙａ ｅｔ ａｌ（２００６）による最近の研究は、ＭＭＰ−２が線維性
被膜におけるＳＭＣの蓄積に関与し、これにより、プラーク不安定性を誘発することを示
す。

【0091】

＜ストロメライシン＞
ＭＭＰ−３はストロメライシンプロテアーゼに属し、エラスチン及びプロテオグリカン
を分解することができる。Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ（２００２）による研究は、ＭＭＰ
−３が女性における心筋梗塞の遺伝的リスクを予測する信頼できる手段であることが判明
し得ることを示す。

【0092】

＜コラゲナーゼ＞
ＭＭＰ−１，−８及び−１３はすべて動脈硬化性プラークにおいて同定され、プロテオ
グリカン及びＩ，ＩＩＩ型コラーゲンを分解する。

【0093】

ＭＭＰ−１，−８及び−１３はコラゲナーゼであり、コラーゲンを２つの断片に切断し
、その断片はＭＭＰ−２，−３又は−９によって更に分解される。

【0094】

ＭＭＰ−８は、ヒトアテロームには一般的に見出されないが動脈硬化性プラークにおい
て同定されている好中球によって発現される。ＭＭＰ−８は、Ｉ型コラーゲンを優先的に
選択し（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ）、ＭＭＰ−１及び１３より３倍大きいＩ型コラーゲ
ンの分解活性を有するため、線維性被膜の分解に部分的に関与し得る。このことはＴｕｒ
ｕ ｅｔ ａｌ（２００６）によって支持され、この研究では、血漿中のＭＭＰ−８含量
は安定プラークを有する患者より不安定プラークを有する患者で著しく多い。

【0095】

ＭＭＰ−１３はバイグリカンに対する高特異性を有し、ＳＬＲＰを切断することが報告
されている。特定の切断部位（．．．Ｇ_１７７／Ｖ_１７８）におけるＭＭＰ−１３による
バイグリカンの分解はＭｏｎｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）によって従前に示され
、骨関節炎における軟骨分解の早期検出に重要な役割を果たすことが提案されている。

【0096】

＜カテプシン＞
ヒトシステインカテプシンは、カテプシンＢ，Ｋ，Ｌ及びＳを含む１１のメンバーから
成り、主に細胞のエンドソーム／リソソームコンパートメント内に発現する。カテプシン
はプロテオグリカン、コラーゲン及びエラスチンの加水分解を触媒することができる。

【0097】

腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）において、正常大動脈と比べて高レベルのカテプシンＳ，Ｋ及
びＬが見出された。正常ヒト血管ＳＭＣは免疫染色により検出可能なカテプシンＫを含ま
ないが、動脈硬化性プラーク内の細胞は明らかに陽性である。カテプシンＫは、破裂しや
すい領域、例えば、線維性被膜、プラーク肩部及びプラーク破裂の実際の部位に局在する
（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ）。カテプシンＳは動脈硬化性プラークにおいてエラスチ
ン分解の増大領域と共局在することが見出され、アテローム性動脈硬化の減少がカテプシ
ンＳ及びＫ欠損マウスにおいて認められる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ）。

【0098】

カテプシンＬ及びＫは、いくつかのプロテオグリカン及びＩ，ＩＩ型コラーゲンを分解
し、カテプシンＫは共有結合的に架橋された三重らせん内にて分解し、一方、カテプシン
Ｌは非らせんテロペプチド領域においてのみ切断する。カテプシンＫは線維性被膜及びプ
ラーク肩部に局在する。正常動脈におけるカテプシンＫの発現は極めて低い。早期ヒトア
テローム性動脈硬化病変は内膜及び中膜ＳＭＣにおけるカテプシンＫの発現を示した。進
展した動脈硬化性プラークにおいて、カテプシンＫは主に線維性被膜のマクロファージ及
びＳＭＣに局在した（Ｌｕｔｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ）。カテプシンＫ蛋白質レベルは、正
常動脈と比べてアテローム性動脈硬化病変において上昇したが、一方、カテプシンＫのｍ
ＲＮＡレベルは、アテローム性動脈硬化血管及び正常動脈において同様であった。更に、
カテプシンＫのｍＲＮＡ及び蛋白質レベルは、早期アテローム性動脈硬化病変及び血栓を
含む病変と比べて、進展しているが安定したヒト動脈硬化性プラークにおいて最大である
ことが示された（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ）。

【0099】

カテプシンＳは、早期ヒトアテローム性動脈硬化病変及び脂肪線条において内膜及び中
膜ＳＭＣにほんのわずかに発現する。進展したヒト動脈硬化性プラークにおいて、カテプ
シンＳは線維性被膜のマクロファージ及びＳＭＣに局在した。血管自体及びプラーク微小
血管の管腔の内側を覆うＥＣも、カテプシンＳを発現した。更に、カテプシンＳのｍＲＮ
Ａ及び蛋白質レベルは、正常動脈と比べてヒトアテロームにおいて増大した（Ｌｕｔｇｅ
ｎｓ ｅｔ ａｌ）。カテプシンＳはプロテオグリカン、エラスチン及びコラーゲンを分
解することができる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ）。

【発明の概要】

【0100】

現在、ＣＶＤリスクの決定は、アテローム性動脈硬化進行の後期（線維性プラーク破裂
の有意なリスクがある時点）において行われている。早期及び後期におけるアテローム性
動脈硬化又はＣＶＤリスクに関する情報を提供する診断又は予後アッセイの必要性がある
。Ｋａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ（１９９２）の知見は、進展病変からのコラーゲンの除去
の酵素機構があることを示唆し、実際に動脈硬化におけるネオエピトープの主要な役割を
示唆している。

【0101】

本発明は、プロテイナーゼによる動脈硬化性プラークの蛋白質の切断によって形成され
るネオエピトープを含むペプチド断片の定量のためのバイオアッセイの方法を提供し、該
方法は、該ペプチド断片を含む試料を、該ネオエピトープに対する特異的結合親和性を有
する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、該試料中の該免疫学的結合パート
ナーのペプチド断片への結合レベルを定量するステップとを含む。

【0102】

該アッセイの結果は、特定の患者における動脈硬化性プラークの破裂のリスクの程度又
は患者の動脈硬化性プラークの不安定状態を示す指標を生成し得る。

【0103】

閾値を越える該指標の値を有する患者は、プラーク撮像法（上述の撮像法を含む）によ
る更なる検査又はアテローム性動脈硬化の処置のための薬剤の処方又はアテローム性動脈
硬化の外科的処置を推奨され得、そのようなフォローアップ検査又は処置は本発明の方法
の一部を成し得る。

【0104】

動脈硬化性プラークの蛋白質は、ルミカン、バーシカン、パールカン、デコリン、バイ
グリカン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＣＲＰ、ＡｐｏＥ及びエラスチンを含む。Ｉ型コラーゲ
ンは動脈硬化性プラークの蛋白質であるとは見なされない。動脈硬化性プラークに存在し
、身体のどの部位よりも高い程度に動脈硬化性プラークにおいてプロテアーゼに晒される
蛋白質が特に興味深い。

【0105】

該免疫学的結合パートナーは、Ｃ末端ネオエピトープ又はＮ末端ネオエピトープを含む
ペプチド断片に対する特異的結合親和性を有し得る。

【0106】

プロテオグリカンアッセイ
該ペプチド断片は、プロテオグリカンバーシカン（配列番号１）、ルミカン（配列番号
２）、パールカン（配列番号３）、バイグリカン（配列番号４）及びデコリン（配列番号
５）の断片でよく、それらはすべて正常及びアテローム性動脈硬化血管において同定され
る。プロテオグリカンは、エラスチン及びコラーゲンとともに、動脈硬化性プラーク及び
プラーク被膜を構成する主な蛋白質の一部である。プロテオグリカンの含量は、アテロー
ム性動脈硬化の進行時に異なり、その結果、プロテオグリカンの潜在的ネオエピトープは
病期及び疾患進行の良好なマーカーになる。特に、バーシカン及びルミカンは多くの他の
臓器には豊富ではないため、これにより、それらはより特異的な生化学マーカー候補にな
る。

【0107】

動脈硬化性プラークにおいて多くの異なるプロテアーゼが文献により報告されているよ
うに、複数の候補プロテアーゼがプラークにおけるプロテオグリカンの消化に関与し得る
。おそらく、これは最終的にプラーク破裂に至る広範の複雑なプロセスの結果である。し
かし、本発明者らの評価では、初期相は一定範囲のＭＭＰから成り得、一方、後期はマト
リックスのカテプシン分解により依存し得、病期に依存して異なるネオエピトーププロフ
ァイルとなる。本発明者らは、表４に一覧表示される酵素がルミカン、バーシカン、バイ
グリカン、パールカン及びデコリンを生じさせ、少なくとも以下の切断生成物を生じさせ
ると判定した。

【0108】

【表10A】

【表10B】

【0109】

従って、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、上記部分配列のいずれの
配列にもおける記号「^＊」を付された部位におけるプロテアーゼによるバーシカン、ルミ
カン、パールカン、デコリン又はバイグリカンの切断によって形成されるネオエピトープ
を含む。

【0110】

更に、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、バーシカン、ルミカン、デ
コリン、パールカン及びバイグリカンの以下の部分配列のいずれの配列にもおける部位に
おける１つ（又はそれ以上）のプロテアーゼによるプロテオグリカン（バーシカン、ルミ
カン、パールカン、デコリン及びバイグリカン）の切断によって形成されるネオエピトー
プを含み、或いは免疫学的結合パートナーは以下の配列の１つと特異的に反応する。

【0111】

【表11】

【0112】

好ましくは、該免疫学的結合パートナーは、切断されていない状態のバーシカン、ルミ
カン、デコリン、パールカン及びバイグリカンと反応しない。好ましくは、該免疫学的結
合パートナーは、生成断片のそれぞれのｃ末端及びＮ末端を過ぎて延長している場合、上
記一覧の該配列と反応しない。

【0113】

免疫学的結合パートナーは、バーシカン、ルミカン、デコリン、パールカン及びバイグ
リカンタイプの切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープと特異的に反応
する免疫学的結合パートナーでもよい。

【0114】

従って、好適な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端において表１１における
以下の配列のいずれかの又はペプチドのＣ末端において表１２における以下の配列と特異
的に反応し得る。

【0115】

【表12】

【0116】

【表13】

【0117】

同様にアッセイされ得るネオエピトープを決定する更なる切断部位は、プロテオグリカ
ン又は他の動脈硬化性プラーク蛋白質を本明細書で述べられる任意の酵素と反応させ、そ
うして生成されるペプチドを単離して配列決定することによって同定され得る。

【0118】

＜コラーゲンアッセイ＞
該ペプチド断片はＩＩＩ型コラーゲンの（配列番号１５３）、好ましくは、成熟ＩＩＩ
型コラーゲンの、即ち、ＩＩＩ型コラーゲンプロペプチドの断片ではない断片でもよい。
動脈硬化性プラークにおける主な蛋白質はＩ，ＩＩＩ型コラーゲン及びエラスチンであり
、一方、プロテオグリカンはプラークのマトリックスにわずかに寄与するのみである。動
脈硬化性プラークに見出される３つの主要な蛋白質中、Ｉ及びＩＩＩ型コラーゲンが優位
であり、一方、エラスチンは動脈における蛋白質プロファイルを占めるが、プラークにお
ける主要な蛋白質成分ではない。Ｉ型コラーゲンはヒトの身体全体にわたって豊富であり
、一方、ＩＩＩ型はより限定された組織位置を有し、これにより、本発明者らの見解では
生化学マーカーとしてより特異的な候補を構成する。

【0119】

動脈硬化性プラークにおける多くの異なるプロテアーゼが文献により報告されているよ
うに、複数の候補プロテアーゼがプラークにおけるコラーゲンの消化に寄与し得る。おそ
らく、これは、最終的にプラーク破裂に至る広範の複雑なプロセスの結果である。しかし
、本発明者らの評価では、初期相は一定範囲のＭＭＰから成り得、一方、後期はマトリッ
クスのカテプシンＫ分解により依存し得、疾患レベルに依存して異なるネオエピトーププ
ロファイルとなる。本発明者らは、以下の表に一覧表示される酵素が少なくとも以下の切
断部位においてＩＩＩ型コラーゲンを切断すると判定した。

【0120】

【表14A】

【表14B】

【表14C】

【表14D】

【表14E】

【0121】

従って、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、ＩＩＩ型コラーゲンの上
記部分配列のいずれの配列にもおける記号「^＊」を付された部位におけるプロテアーゼに
よるＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるネオエピトープを含む。

【0122】

更に、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、^＊間におけるＩＩＩ型コラ
ーゲンの上記部分配列のいずれの配列にもおける部位における１つ（又はそれ以上）のプ
ロテアーゼによるＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるネオエピトープを含み、
または免疫学的結合パートナーは上記表のエントリーにおける^＊間に伸長する配列と特異
的に反応する。

【0123】

好ましくは、該免疫学的結合パートナーは、切断されていない状態のＩＩＩ型コラーゲ
ンと反応しない。好ましくは、該免疫学的結合パートナーは、それぞれの切断部位を過ぎ
て延長している場合、上記一覧の該配列と反応しない。

【0124】

免疫学的結合パートナーは、ＩＩＩ型コラーゲンの切断によって形成されるＣ末端又は
Ｎ末端ネオエピトープと特異的に反応する免疫学的結合パートナーでよい。

【0125】

従って、好適な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端において以下の配列（各
配列の後に配列番号）又はペプチドのＣ末端において以下の配列と特異的に反応し得る。

【0126】

【表15】

【0127】

【表16】

【0128】

同様にアッセイされ得るネオエピトープを決定する更なる切断部位は、ＩＩＩ型コラー
ゲン又は他の動脈硬化性プラーク蛋白質を本明細書で述べられる任意の酵素と反応させ、
そうして生成されるペプチドを単離して配列決定することによって同定され得る。

【0129】

＜ＣＲＰ及びＡｐｏＥアッセイ＞
該ペプチド断片はＣＲＰ（配列番号６５８）又はＡｐｏＥ（配列番号６５９）の断片で
もよい。好ましくは、ＡｐｏＥでは、選択断片はＡｐｏＥのすべての同定アイソタイプ、
ε２，ε３及びε４において生じる。

【0130】

ＣＲＰ及びＡｐｏＥがヒトの身体全体にわたって豊富であるとしても、アテローム性動
脈硬化組織におけるその局在により、それらは局所プロテアーゼの作用に晒される。これ
により、これらの分子は生化学マーカーとして良好且つ特異的な候補である。

【0131】

動脈硬化性プラークにおける多くの異なるプロテアーゼが文献により報告されているよ
うに、複数の候補プロテアーゼがプラークにおけるＣＲＰ及びＡｐｏＥの消化に寄与し得
る。おそらく、これは、最終的にプラーク破裂に至る広範の複雑なプロセスの結果である
。しかし、初期相は一定範囲のＭＭＰから成り得、一方、後期はマトリックスのカテプシ
ンＫ分解により依存し得、疾患レベルに依存して異なるネオエピトーププロファイルとな
る。本発明者らは、純粋天然蛋白質の一定範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断を通じて、以下の
表に一覧表示される酵素が少なくとも以下の切断部位（^＊を付す）においてＣＲＰ及びＡ
ｐｏＥを切断すると判定した。

【0132】

【表17】

【0133】

従って、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、ＣＲＰ及びＡｐｏＥの以
下の部分配列のいずれの配列にもおける記号「^＊」が付された部位におけるプロテアーゼ
によるＣＲＰ及びＡｐｏＥの切断によって形成されるネオエピトープを含み、または免疫
学的結合パートナーは以下の配列の１つにおける^＊間に画定される配列と特異的に反応す
る。

【0134】

【表18】

【0135】

従って、好適な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端において以下の配列又は
ペプチドのＣ末端において以下の配列と特異的に反応し得る。

【0136】

【表19】

【0137】

【表20】

【0138】

同様にアッセイされ得るネオエピトープを決定する更なる切断部位は、ＣＲＰ及びＡｐ
ｏＥまたは他の動脈硬化性プラーク蛋白質を本明細書で述べられる任意の酵素と反応させ
、そうして生成されるペプチドを単離して配列決定することによって同定され得る。

【0139】

＜エラスチンアッセイ＞
該ペプチドはエラスチン（配列番号７３５）の断片でもよい。エラスチンはヒトの身体
全体にわたって豊富であるとしても、アテローム性動脈硬化組織におけるその局在はそれ
を局所プロテアーゼの作用に晒させ、そのためにこれらの分子は動脈硬化性プラーク代謝
回転の生化学マーカーとして良好且つ特異的な候補である。

【0140】

動脈硬化性プラークにおける多くの異なるプロテアーゼが文献により報告されているよ
うに、複数の候補プロテアーゼがプラークにおけるエラスチンの消化に寄与し得る。おそ
らく、これは、最終的にプラーク破裂に至る広範の複雑なプロセスの結果である。しかし
、初期相は一定範囲のＭＭＰから成り得、一方、後期はマトリックスのカテプシンＫ分解
により依存し得、疾患レベルに依存して異なるネオエピトーププロファイルとなる。本発
明者らは、純粋天然蛋白質の一定範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断を通じて、以下の表に一覧
表示される酵素が少なくとも以下の切断部位（^＊を付す）においてエラスチンを切断する
と判定した。

【0141】

【表21】

【0142】

従って、本発明の方法では、好ましくは、該ペプチド断片は、エラスチンの以下の部分
配列のいずれの配列にもおける記号「^＊」が付された部位におけるプロテアーゼによるエ
ラスチンの切断によって形成されるネオエピトープを含み、或いは免疫学的結合パートナ
ーは以下の配列の１つにおける^＊間に画定される配列と特異的に反応する。

【0143】

【表22】

【0144】

従って、好適な免疫学的結合パートナーは、ペプチドのＮ末端において以下の配列又は
ペプチドのＣ末端において以下の配列と特異的に反応し得る。

【0145】

【表23】

【0146】

【表24】

【0147】

同様にアッセイされ得るネオエピトープを決定する更なる切断部位は、エラスチン又は
他の動脈硬化性プラーク蛋白質を本明細書で述べられる任意の酵素と反応させ、そうして
生成されるペプチドを単離して配列決定することによって同定され得る。

【0148】

上述の２つ以上のペプチドのアッセイは別個に行われ、それらの結果は組み合わせられ
得、又は上述の２つ以上のペプチドはともに測定され得る。

【0149】

本発明によるアッセイの結果は、診断又は予後値の総合指数を形成するために１つ以上
の他の測定バイオマーカーと組み合わせられ得る。

【0150】

本明細書で用いられる「免疫学的結合パートナー」という用語は、ポリクローナル及び
モノクローナル抗体、更に抗体の特異的な結合断片、例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２
も含む。従って、該免疫学的結合パートナーはモノクローナル抗体又は特異的結合親和性
を有するモノクローナル抗体の断片でよい。

【0151】

本明細書で用いられる「蛋白質」という用語は、リポ蛋白質及びプロテオグリカン並び
に他の蛋白（または非蛋白）の天然複合体を含む。

【0152】

一般的に、本発明に従って不均一及び均一フォーマット、サンドイッチアッセイ、競合
アッセイ、酵素結合アッセイ、放射免疫アッセイなどを含むあらゆる既知のイムノアッセ
イフォーマットが用いられ得る。従って、任意に、該方法は、該免疫学的結合パートナー
及び競合物質が該試料の存在下にてインキュベートされ、競合物質が免疫学的結合パート
ナーと結合するために試料中のペプチド断片と競合する競合イムノアッセイとして行われ
る。

【0153】

該競合物質は、該ネオエピトープを示すためにネオエピトープが属する蛋白質の切断に
よって形成される合成ペプチド又は精製天然ペプチドでもよい。従って、ペプチドは、バ
ーシカン、ルミカン、パールカン、デコリン、バイグリカン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ａｐ
ｏＥ、ＣＲＰ又はエラスチンに由来し得る。

【0154】

１つの好適な方法は、任意のこれらの蛋白質の断片のネオエピトープ若しくは動脈硬化
性プラークに由来する他の蛋白質由来のペプチド断片上のネオエピトープに結合するモノ
クローナル抗体、又はその抗体結合断片を用いた競合イムノアッセイでよい。マイクロタ
イタープレートの固体表面上に被覆された、適切に選択された合成ペプチドは、モノクロ
ーナル抗体又は結合断片への結合について試料と競合し得る。或いは、モノクローナル抗
体又は結合断片によって認識されるネオエピトープを保有する１つ以上のこれらの蛋白質
由来の精製天然断片が、固体表面上に用いられ得る。更に別の代替例は、モノクローナル
抗体又は結合断片を固体表面上に固定化し、次に、試料を、シグナル分子、例えば、西洋
ワサビペルオキシダーゼ又はビオチンに適切に結合した合成ペプチドと共インキュベート
することである。試料は尿、血清、血液、血漿又は他の、例えば、動脈硬化性プラーク生
検の試料でもよい。

【0155】

一部の好ましい方法では、試料は患者由来の試料であり、方法は、該ペプチド断片の該
結合の定量レベルを、（ａ）比較できる健常患者及び／又は（ｂ）アテローム性動脈硬化
病態の特徴を示す数値と比較するステップと、任意に、高レベルの測定ペプチド（通常、
高レベルの結合によって示される）をより重症度の該病態と関連付けるステップとを更に
含む。

【0156】

本発明の一態様は、上述のネオエピトープを認識するモノクローナル抗体の開発に関す
る。これは、当該蛋白質分子のアミノ酸配列に由来する合成ペプチド（上記一覧表示され
た配列又はそこで終止する配列を含む）でマウスを免疫化し、選択マウス由来脾臓細胞を
骨髄腫細胞に融合し、関連合成ペプチド上のネオエピトープへの結合についてモノクロー
ナル抗体を試験することによって達成され得る。ネオエピトープに対する特異性は、合成
ペプチドとの反応性及び（Ｃ末端ネオエピトープに対する）Ｃ末端延長形態の免疫ペプチ
ド若しくは（Ｎ末端ネオエピトープに対する）Ｎ末端延長形態の免疫ペプチドとの反応性
の欠如を必要とすることによって確実にされ得る。天然蛋白質に対する結合能の欠如を確
定するために、ネオエピトープに対する抗体も評価され得る。或いは、ネオエピトープに
対する特異性は、抗体の反応性が末端アミノ酸の１つに共有結合したビオチン又は他の官
能基の存在が負に依存するよう求めることによって確実にされ得る。

【0157】

本発明は、上記に示される部分配列のいずれか１つの部分配列における末端部位におけ
るプロテアーゼによる該蛋白質の切断によって形成されるネオエピトープと特異的に免疫
反応する免疫学的結合パートナーを含み、例えば、モノクローナル抗体又はその結合断片
でもよい。

【0158】

本発明は、上記に示される部分配列のいずれか１つの部分配列における配列の末端部位
における動脈硬化性プラーク蛋白質の切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピ
トープに対するモノクローナル抗体を産生する細胞株を含む。

【0159】

本発明は、上記に示されるこれらの蛋白質の部分配列のいずれか１つの部分配列におけ
る該蛋白質の切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープを含むペプチドを
更に提供する。そのようなペプチドはイムノアッセイで用いるために、該ペプチドに対す
る免疫反応を生じさせるためにハプテンとして担体にコンジュゲートされ、又は固体表面
に固定化され、又は検出可能なマーカーにコンジュゲートされ得る。

【0160】

本発明は、上記に示される部分配列のいずれか１つの部分配列における該蛋白質の切断
によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをコードする単離核
酸分子を更に含む。

【0161】

本発明は、発現シグナルと、上記に示される部分配列のいずれか１つの部分配列におけ
る該蛋白質の切断によって形成されるＣ末端又はＮ末端ネオエピトープを含むペプチドの
発現をコードするコード配列とを含む核酸配列を含むベクターを更に含み、そのようなベ
クターで形質転換され、該ペプチドを発現する宿主細胞を更に含む。

【0162】

本発明の更に別の態様は、上述の方法を実施するために好都合に用いられ得るキットに
関する。そのようなキットは、（１）合成ペプチドで被覆されたマイクロタイタープレー
トと、（２）該合成ペプチドと反応する本発明のモノクローナル抗体若しくは抗体結合断
片と、（３）標識抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンとを含み得る。或いは、そのようなキッ
トは、（１）精製天然蛋白質断片で被覆されたマイクロタイタープレートと、（２）該蛋
白質のいずれか１つの断片上のネオエピトープを認識し、該精製断片と反応するモノクロ
ーナル抗体と、（３）標識抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンとを含み得る。或いは、そのよ
うなキットは、（１）ストレプトアビジンで被覆されたマイクロタイタープレートと、（
２）ビオチンに結合した合成ペプチドと、（３）該蛋白質断片上のネオエピトープを認識
し、該合成ペプチドと反応するモノクローナル抗体と、（４）標識抗マウスＩｇＧ免疫グ
ロブリンとを含み得る。更に別の代替例は、（１）ストレプトアビジンで被覆されたマイ
クロタイタープレートと、（２）ビオチンに結合した合成ペプチドと、（３）該蛋白質断
片上のネオエピトープを認識し（該合成ペプチドと反応し）、西洋ワサビペルオキシダー
ゼにコンジュゲートしたモノクローナル抗体とを含むキットでよい。

【0163】

従って、本発明は、本明細書で述べられる免疫学的結合パートナー並びに該免疫学的結
合パートナーに結合する競合物質、並びに、任意に、１つ以上の洗浄試薬、緩衝液、停止
試薬、酵素標識、標識酵素のための基質、較正基準、抗マウス抗体及び該イムノアッセイ
を行うための使用説明書を含むイムノアッセイキットを含む。

【0164】

本明細書で述べられるアッセイは患者におけるアテローム性動脈硬化症の診断に有用で
ある。加えて、検査は疾患の進行の評価及び治療に対する応答のモニタリングに有用であ
る。本発明の免疫学的結合パートナーは、本明細書で述べられる動脈硬化性プラーク蛋白
質の切断産物の存在又は位置を示すために免疫染色でも用いられ得る。

【0165】

本発明は、添付図面を参照して更に説明され、例示される。

【図面の簡単な説明】

【0166】

【図1】ＩＩＩ型病変を含む大動脈試料に対してモノクローナルマウス抗体を用いたバイグリカン染色（それぞれ２，４，４及び１０倍）を示す図である。

【図2】ＩＩＩ型病変を含む大動脈試料に対してモノクローナルマウス抗体を用いたカテプシンＫ染色（それぞれ２，４，１０及び１０倍）を示す図である。

【図3】Ｖ型病変を含む大動脈試料に対してモノクローナルマウス抗体を用いたバイグリカン染色（それぞれ２，４，１０及び１０倍）を示す図である。

【図4】Ｖ型病変を含む大動脈試料に対してモノクローナルマウス抗体を用いたカテプシンＫ染色（それぞれ２，４，１０及び１０倍）を示す図である。

【図5】プロテアーゼ：ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＢ及びカテプシンＬによって生じるバイグリカンの切断産物を示す図である。Ｍ＝着色マーカー（Ｒａｉｎｂｏｗ ｍａｒｋｅｒ）、−ｅｎｚ＝酵素消化なし、実施例２においてゲル上で泳動。

【図6】実施例４において得られた競合試験結果を示す図である。

【図7】実施例４において得られた競合試験結果を示す図である。

【図8】実施例４において得られた競合試験結果を示す図である。

【図9】実施例６において得られた競合試験結果を示す図である。

【図10】実施例７において得られた競合試験結果を示す図である。

【図11】実施例７において得られた競合試験結果を示す図である。

【実施例1】

【0167】

プロテオグリカン及びプロテアーゼの局在の分析のため、左冠動脈下行枝（ＬＡＤ）由
来のヒト動脈試料の免疫組織化学染色を行った。以下、カテプシンＫプロテアーゼ及びバ
イグリカンの共局在が示される。

【0168】

図１及び２に見られる免疫組織化学染色はバイグリカン及びカテプシンＫの共局在を明
らかにした。これは、バイグリカンがカテプシンＫの好ましい基質であることを示唆し得
る。動脈硬化性プラークが形成された大動脈試料に対して同じ免疫組織化学染色を行い、
この結果として正常な大動脈構造はマクロファージ泡沫細胞浸潤及び石灰化に置き換えら
れた。これらの免疫染色を図３及び４にまとめる。

【0169】

バイグリカン及びカテプシンＫの免疫組織化学染色は進行性アテローム性動脈硬化病変
に共局在することが示された。これらの結果はともにバイグリカンにおける特異的なカテ
プシンＫ切断部位の仮説を生じさせ、アテローム性動脈硬化病変におけるネオエピトープ
生成の増加をもたらす。この仮説を試験するため、本発明者らはバイグリカンを異なるプ
ロテアーゼで切断した。

【実施例2】

【0170】

分解断片の評価のためのバイグリカンの分解。ウシ関節軟骨由来のバイグリカン（Ｂ８
０４１−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をプロテアーゼ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ
８、カテプシンＫ、カテプシンＳ、カテプシンＢ及びカテプシンＬ）によって切断した。
上述のプロテアーゼの酵素切断によって生じたプロテオグリカンの断片を１０％のＮｕＰ
ａｇｅ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上に分離し、その後、「Ｓｉｌｖｅｒ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓ」−銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社カタログ番号ＬＣ６１００、ロット
番号３４１０９９）によって銀染色した。蛋白質分解で得られたバイグリカンの分離及び
銀染色の結果を図５に示す。

【実施例3】

【0171】

オボアルブミンにコンジュゲートしたＩＩＩ型コラーゲン由来ペプチドでマウスを免疫
化した。ビオチンにコンジュゲートしたスクリーニングペプチド配列との反応性について
血清をスクリーニングした。モノクローナル抗体分泌クローンを作製し、スクリーニング
配列を用いてスクリーニングした。ＩＩＩ型コラーゲン由来の隣接配列で連続する標的ペ
プチドの伸長バージョン（除外ペプチド）との反応性の欠如及びナンセンスペプチドとの
反応性の欠如についてクローンを調べた。

【0172】

標的配列、免疫原、スクリーニング配列及び除外配列は以下の通りであった。

【0173】

【表25】

【実施例4】

【0174】

＜ＩＩＩ型コラーゲンネオエピトープモノクローナル抗体のヒト尿との反応性＞
免疫ペプチドを競合物質として用いて競合アッセイ形式にて実施例３からの選択モノク
ローナル抗体クローンのヒト尿との反応性を判定した。典型的な手順では、９６ウェルス
トレプトアビジン被覆プレートを振盪しながら２０℃でＰＢＳ−ＢＴＥ中１０ｎｇ／ｍＬ
ビオチンペプチドで３０分間コートし、５倍洗浄緩衝液で洗浄した。２０μｌの希釈試料
（尿又はペプチド溶液）を加えた。下記に詳述する１００μＬの未精製抗体溶液（細胞培
養液由来の上清）を加えた。プレートを３００ｒｐｍで振盪しながら２０℃で１時間イン
キュベートし、次に、５倍洗浄緩衝液で洗浄した。１００μＬの二次抗体−ＰＯＤ（１：
５０００）を加え、３００ｒｐｍで振盪しながら２０℃で１時間インキュベートし、その
後、５倍洗浄緩衝液で洗浄した。１００μＬのＴＭＢを加え、３００ｒｐｍで振盪しなが
ら暗室で１５分間インキュベートし、その後、停止液１００μＬを加えた。ＥＬＩＳＡリ
ーダー上で６５０ｎｍを対照として４５０ｎｍにてプレートを読み取った。従って、抗体
に対するプレート上のペプチドと溶液中のペプチドとの間の競合が生じ、ペルオキシダー
ゼ発色反応によりプレート結合抗体を定量した。

【0175】

図６に４つの異なるクローンの結果が認められる。抗体が各々尿中の関連する配列を検
出することがわかる。

【0176】

免疫ペプチドとＭＭＰ９によってｉｎ ｖｉｔｒｏにて切断された天然ＩＩＩ型コラー
ゲンとの間の抗体結合の競合を試験するため、１つの選択クローンに対して更なる競合試
験を行った。切断コラーゲン、ペプチドＫＮＧＥＴＧ及びその配列の伸長バージョンの結
果を図７に示す。抗体が免疫ペプチド配列及び酵素切断コラーゲンに結合するが、伸長配
列には結合しないことがわかる。

【0177】

図８に同じクローンに関する更なる競合試験が認められ、この場合、競合物質はそれぞ
れ、ペプチドＫＮＧＥＴＧ、ヒト血清、ラット血清、ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）及び動脈硬
化性プラーク抽出物であった。抗体がペプチド、プラーク抽出物及びヒト血清と反応する
が、ラット血清又はＦＣＳとは反応しないことがわかる。

【実施例5】

【0178】

＜デコリン、バイグリカン及びバーシカン配列に対する抗血清の産生＞
抗血清を産生させ、実施例３のようにモノクローナル抗体を得たが、以下の免疫原、ス
クリーニング配列及び除外配列を用いた。

【0179】

【表26】

【実施例6】

【0180】

＜デコリンネオエピトープモノクローナル抗体のヒト尿との反応性＞
１つの抗デコリン未精製モノクローナル抗体（ＮＢ６２）を用いて概して実施例５のよ
うに競合ＥＬＩＳＡを行った。

【0181】

図９に結果を示す。これに対して抗体が産生され、選択されたペプチド配列及び尿に対
する反応が認められるが、無関連ペプチド配列に対する反応は認められない。

【実施例7】

【0182】

＜バーシカンネオエピトープモノクローナル抗体のヒト尿との反応性＞
配列に対する２つの抗バーシカン未精製モノクローナル抗体（ＮＢ６４）を用いて概し
て実施例５のように競合ＥＬＩＳＡを行った。

【0183】

それぞれのクローンの結果を図１０及び１１に示す。それぞれの場合、これに対して抗
体が産生され、選択されたペプチド配列及び尿に対する反応が認められるが、無関連ペプ
チド配列ＮＢ１８に対する反応は認められない。

【0184】

本明細書では、特に明示されない限り、条件の１つのみが満たされることを要求する演
算子「排他的ｏｒ」と対照的に、「又は」という語は言及条件の一方又は両方が満たされ
る場合に真値を返す演算子の意味で用いられる。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とい
う語は「〜から成る」を意味するというよりも「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という意
味で用いられる。上記に認められた従来の教示はすべて参照して本明細書に組み込まれる
。

【0185】

［参考文献リスト］

【表27A】

【表27B】

【表27C】

【表27D】

【表27E】

【表27F】

【表27G】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]