特許 6321291 増加した抗腫瘍効果を有する白金（ＩＶ）錯体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6321291

(24)【登録日】2018年4月13日

(45)【発行日】2018年5月9日

(54)【発明の名称】増加した抗腫瘍効果を有する白金（ＩＶ）錯体

(51)【国際特許分類】

   C07F 15/00 20060101AFI20180423BHJP

   A61K 31/282 20060101ALI20180423BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180423BHJP

   A61K 47/14 20060101ALI20180423BHJP

   C07C 61/135 20060101ALN20180423BHJP

   C07C 211/38 20060101ALN20180423BHJP

【ＦＩ】

   C07F15/00 FCSP

   A61K31/282

   A61P35/00

   A61K47/14

   !C07C61/135

   !C07C211/38

【請求項の数】9

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2017-512996(P2017-512996)

(86)(22)【出願日】2014年9月3日

(65)【公表番号】特表2017-532305(P2017-532305A)

(43)【公表日】2017年11月2日

(86)【国際出願番号】EP2014068672

(87)【国際公開番号】WO2016034214

(87)【国際公開日】20160310

【審査請求日】2017年8月1日

(73)【特許権者】

【識別番号】517072985

【氏名又は名称】ブイユーエービー ファーマ エー．エス．

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(74)【代理人】

【識別番号】100169971

【弁理士】

【氏名又は名称】菊田 尚子

(74)【代理人】

【識別番号】100180932

【弁理士】

【氏名又は名称】和田 洋子

(72)【発明者】

【氏名】キシルカ，ウラジミール

(72)【発明者】

【氏名】メングラー，ジャン

(72)【発明者】

【氏名】ハヴロヴィック，カレル

(72)【発明者】

【氏名】カセル，ペトル

(72)【発明者】

【氏名】セルヴェニー，リボール

【審査官】 松澤 優子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１００４１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５１２４０１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｆ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

Ｃ０７Ｃ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式(III)

【化1】

で表されるリガンドの「シス-トランス-シス」立体配置を有する白金(IV)錯体。

【請求項2】

無極性の非プロトン性溶媒中で「シス-トランス-シス」PtCl₂(OH)₂(NH₃,1-アダマンチルアミン)を1-アダマンチルカルボニルクロリド及びアミンと反応させることにより、請求項1に記載の白金(IV)錯体を調製するための方法。

【請求項3】

無極性の非プロトン性溶媒が、1,4-ジオキサンである、請求項2に記載の方法。

【請求項4】

アミンが、ピリジン又はトリアルキルアミンである、請求項2又は3に記載の方法。

【請求項5】

ピリジン対1-アダマンチル-カルボニルクロリドの化学量論的な比が、ピリジン対1-アダマンチルカルボニルクロリド1〜2部対1部である、請求項2から4のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

式(III)

【化2】

で表されるリガンドの「シス-トランス-シス」立体配置を有する白金(IV)錯体を含有する、腫瘍性疾患の治療のための医薬組成物。

【請求項7】

請求項1に記載の白金(IV)錯体、及び少なくとも1種の親油性の薬学的に許容される添加剤を含有する、腫瘍性疾患の治療のための医薬組成物。

【請求項8】

請求項1に記載の白金(IV)錯体の含有量が、組成物の総重量に対して0.5〜50重量%である、請求項7に記載の医薬組成物。

【請求項9】

添加剤が、ステアロイルマクロゴール-32グリセリドである、請求項7又は8に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、実質的に増加した抗腫瘍効果を有する新規な白金(IV)錯体に関する。本発明は、前記錯体を調製するための方法及び前記錯体を含有する腫瘍性疾患の治療のための医薬組成物をさらに開示している。

【背景技術】

【0002】

白金(II)錯体、例えば、シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンは、腫瘍性疾患の治療において広範に及び長期に用いられる細胞分裂阻害薬(以下CTS)である。これらの利点は、非常に優良な臨床経験及び優れた抗腫瘍効果である。白金CTSの大きな利点は、これらが、特に、グアニン部位におけるがん細胞のDNAの直接的な架橋結合により、既存のがん細胞を死滅させることである。さらに、白金CTSは、ストレスキナーゼの活性化を誘導し、その結果、細胞表面におけるデスレセプターの発現を増加させ、可溶性デスリガンド(FASリガンド)の転写及び翻訳を増加させる。これにより、外部の受容体アポトーシス経路を活性化させる。優先的にグアニンに結合する白金CTSはまた、グアニンに富む高頻度配列TTAGGGを有するテロメアを阻害する。したがって、白金CTSの効果は、驚くべきことに多能性であり、これらは、細胞シグナル伝達経路の標的阻害剤を含めた、他のCTS剤とのがんの併用療法に特に適している。白金(II)CTSの欠点は、がん細胞及び健常な細胞の両方において細胞DNAに対する同じ作用から生じ、この作用によって重篤な副作用及び毒性がもたらされることである。これらの反応性が高く、また投与後の安定性が低いことにより、経口投与はやはり不可能である。その長期の使用後、シスプラチンに対して腫瘍が抵抗性を獲得することがやはり記載されている。

【0003】

標的阻害剤を含めた白金CTS並びに他のCTSは、生体異物であり、これらを身体に投与した後、免疫系及び酵素系により速やかに捕捉され、破壊され、排出される。投与量の少量の残留部分は、結果として標的がん組織に到達する。そのため、白金CTSの安定性の改善は、最も重要である。さらに、親油性の細胞膜は、白金CTSを含めた任意の薬物の細胞への貫通を基本的に制限し、この投与量の残留部分の一部だけが、細胞内環境に到達する。白金CTSのDNA-架橋結合作用機序は、細胞への侵入を要するため、白金CTSが親油性の細胞膜を通過する能力は、最も重要である。この投与量の残留部分の一部が細胞内環境に到達した後、これは、その治療作用と同時に、グルタチオンを含む酵素系により減少し破壊され、次いで、p-糖タンパク質による流出が増加することにより、分解された代謝産物は細胞から除去される。したがって、その投与後の白金CTSの治療効果及びその分解並びに身体からの排出は、時間的に可変性の動力学的な競合である。

【0004】

白金(IV)錯体は、白金(II)錯体と違い、安定性がより優れており、親油性(lipophility)が高く、毒性が低く、経口投与が見込まれる、比較的新しいクラスの白金抗がん薬である。白金(IV)錯体はまた、シスプラチンに対する腫瘍抵抗性を克服する。最も興味深い抗腫瘍効果は、中心のPt(IV)-イオンの周りのリガンドのシス、トランス、シス幾何学的立体配置を有する一般式(I)の白金(IV)錯体を有する。

【0005】

【化1】

【0006】

A₁及びA₂は、エカトリアルアミノリガンドであり、これらは、白金錯体中に残存する。B₁及びB₂は、アキシアルリガンドであり、これらは、細胞内環境において白金(II)種に還元されるべきである。C₁及びC₂は、エカトリアル脱離リガンドであり、これらは、反応性アクア-白金(II)種に加水分解され、次いで、特に、グアニン部位において細胞DNAと堅固な架橋錯体を創出し、これによって、細胞アポトーシスがもたらされる。

【0007】

実施形態のさらなる本文及び例において、書かれた順序で対で分類する場合、中心のPt(IV)-イオンの周りのリガンドの立体化学を特定するために、リガンドの「シス-トランス-シス」立体配置について略語「c-t-c」を用いる。「c-t-c」白金(IV)錯体の最適化された構造について、これらの抗腫瘍効果について及びそのような錯体を調製するための方法についての基本情報は、例えば、EP0 328 274(Johnson Matthey, Inc.)、EP0 423 707(Bristol-Myers Squibb Co.)及び米国特許第6,503,943号(Lachema, a.s.)において記載される。

【0008】

前述の最も有望な「c-t-c」白金(IV)錯体は、式(II)

【0009】

【化2】

[式中、R₁はメチルであり、A₂は、シクロヘキシルアミン(商品名「Satraplatin」による錯体、EP0 328 274を参照のこと)又は1-アダマンチルアミン(この錯体は、別名が「LA-12」である。米国特許第6,503,943号を参照のこと)]を有する。シクロヘキシルアミン又は1-アダマンチルアミンは、高親油性のアミノリガンドであり、これは、白金(IV)錯体の親油性を改善し、脂質細胞膜に貫通し、結果として、抗腫瘍効果の改善をもたらす。R₁基は、脂肪族鎖中で1から10個の炭素原子又は炭素循環において3から7個の炭素原子を好ましくは含有し(EP0 328 274、p.3、12行目をさらにまた参照のこと)、より好ましくは3個の炭素原子を含有する(同書、請求項3を参照のこと)という専門家の意見がある。Satraplatin及びLA-12は、白金錯体のこうしたタイプにおける最良の技術水準を示し、経口投与毎の可能性を提供し、シスプラチンのin vitro効果及びシスプラチン抵抗性をも克服する。しかしながら、これらは、臨床試験で10年を超えており、その結果はin vitroにおいて非常に優れた抗腫瘍の可能性が確認されない平均的なものである。

【0010】

アダマンタンは、トリシクロ(3.3.1.1^3,7)デカンであり、これは、ダイヤモンドのような固有の、高親油性の及び高対称性の構造を有する。アダマンチル誘導体は、従来技術、例えば、Chem.Rev.2013年、No.113、3516において、薬物を含めた、多くの化合物の特性を改善するために提案された。アダマンチル誘導体が、薬物の安定性及び親油性の改善のための優秀なツールを提供するとしても、これは、いまだ、白金(IV)錯体に完全に活用されていない。従来技術において1-アダマンチル基を有するほんのごくわずかの白金錯体が記載されており、さらに、これらの錯体は、たった1つの1-アダマンチル基を含有した。これは、LA-12と並んで、リガンドの「オールトランス」立体配置を有するそのPt(IV)類似体(J.Inorg.Biochem.2008年、No.102、1077)、さらに立体配置の「シス」(Gynecol.Oncol.2006年、No.102、32)及び「トランス」(J.Inorg.Biochem.2008年、No.102、1077)の形態の1-アダマンチルアミンを有するシスプラチンのPt(II)類似体であったが、これは、抗腫瘍効果が低かった。

【0011】

異なるアキシアルカルボキシレートリガンドB₁及びB₂を有する式(I)による「c-t-c」白金(IV)錯体は、大量の適切なカルボン酸無水物を、「c-t-c」Pt(C₁,C₂)(OH)₂(A₁,A₂)中間体(例えば、EP0 328 274、実施例1から5;J.Med.Chem.1997年、40、112)と反応させることにより、一般に調製される。反応は通常、室温で数日行われ、収率は、23〜87%の間であり、純度は、70〜95%の間である。Satraplatinの場合では、純度が98%を超え、収率を約68%にするために、さらなる精製が必要である(CN1557821を参照のこと)。反応時間を短縮するために、カルボン酸の無水物の代わりに、より反応性のカルボン酸の塩化物を使用することが可能であるが、収率は、わずか14%である(EP0 328 274、実施例8を参照のこと)。

【0012】

したがって、腫瘍性疾患の治療のために向上された抗腫瘍効果を有する新規な白金(IV)錯体がやはり引き続き必要とされる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】EP0 328 274

【特許文献2】EP0 423 707

【特許文献3】米国特許第6,503,943号

【特許文献4】CN1557821

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Chem.Rev.2013年、No.113、3516

【非特許文献2】J.Inorg.Biochem.2008年、No.102、1077

【非特許文献3】Gynecol.Oncol.2006年、No.102、32

【非特許文献4】J.Med.Chem.1997年、40、112

【発明の概要】

【0015】

本発明の第1の態様によれば、式(III)のリガンドの「シス-トランス-シス」立体配置を有する白金(IV)錯体が提供される。

【0016】

【化3】

【0017】

本発明者らは、驚くべきことに、式(II)の白金(IV)錯体中の1個を超える1-アダマンチル基の導入が、かさ高い中心のPt(IV)-イオンにより可能であること及び本発明の式(III)の白金(IV)錯体は、以下、TU-31又は「c-t-c」PtCl₂(1-アダマンチルカルボキシラト)₂(NH₃,1-アダマンチルアミン)とも称するが、抗腫瘍効果IC₅₀(IC₅₀=特定の生物学的又は生化学的機能を抑制する化合物の最大半抑制濃度)において一時的に最良の「c-t-c」Pt(IV)錯体Satraplatin及びLA-12を有意に超えることを見出した。理論に束縛されるものではないが、前記効果は、TU-31の親油性及び安定性の両方が実質的に高まり、その結果、3つのかさ高い、高親油性の及び対称性の1-アダマンチル基による中心のPt(IV)-イオンの空間保護(space protection)による脂質細胞膜への優れた貫通及び体内でのより良好な安定性がもたらされることにより説明することができる。本発明者らは、エカトリアルアミノリガンドA₂の構造及び親油性に関して、式(II)[R₁はメチルである]の白金(IV)錯体のIC₅₀の相互依存性(dependence)を試験し、本発明者らは、相互依存性は明らかでないが、最良の結果が、エカトリアルアミノリガンドA₂(すなわち、LA-12錯体)として1-アダマンチルアミンを有することを見出した。本発明者らはさらに、アキシアルカルボキシレートリガンド中のR₁基の構造及び親油性に関して、エカトリアルリガンドA₂としての1-アダマンチルアミンを有する式(II)の白金(IV)錯体のIC₅₀の相互依存性をさらに試験し、本発明者らは、従来技術によれば相互依存性は明らかでないが、R₁基として1-アダマンチル基を有する最良の結果による驚くべき例外であり、新規な及び驚くべき知識であることを見出した。本発明者らはさらに、1-アダマンチルカルボキシレートリガンド自体が、細胞毒性が低く、したがって、TU-31はまた、治療指数の改善をも示すことを見出した。生理的物質としての塩化物は、TU-31中の脱離リガンドとして好ましい。

【0018】

TU-31は、Satraplatin又はLA-12に対するin vitroにおける最良の結果IC₅₀を有するだけでなく、親油性及び安定性の実質的な増加による「in vivo」抗腫瘍効果の改善も示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明の第2の態様によれば、無極性の非プロトン性溶媒、好ましくは、1,4-ジオキサン中の「c-t-c」PtCl₂(OH)₂(NH₃,1-アダマンチルアミン)の、1-アダマンチルカルボニルクロリド及びアミンとの反応により、式(III)の白金(IV)錯体を調製するための方法が提供される。好ましくは、アミンは、ピリジン又はトリアルキルアミンである。最も好ましいのは、ピリジンである。

【0020】

ピリジンは、例えば、米国特許第4,604,463号、実施例2及び3、第16段、25行目に開示される反応中、HCl及び溶媒の両方の捕捉剤として従来技術においてうまく用いられているが、本発明者らは、溶媒としてピリジンを使用すると、この反応の転換を厳格に妨げるということ及び1-アダマンチル-カルボニルクロリドに対するピリジンの1〜2理論量を、「c-t-c」PtCl₂(OH)₂(NH₃,1-アダマンチルアミン)を式(III)の白金(IV)錯体にうまく転換するために用いることが好ましいということを驚くべきことに見出した。

【0021】

本発明の好ましい実施形態において、式(III)の白金(IV)錯体を調製するための方法は、ピリジン対1-アダマンチルカルボニルクロリド1〜2部対1部、好ましくは、2対1の比、好ましくは、1.5対1の比、最も好ましくは、1対1の比のピリジン対1-アダマンチルカルボニルクロリドの化学量論的な比又はモル比で、無極性の非プロトン性溶媒、好ましくは、1,4-ジオキサン中の「c-t-c」PtCl₂(OH)₂(NH₃,1-アダマンチルアミン)の1-アダマンチルカルボニルクロリド及びピリジンとの反応により提供される。

【0022】

CH₂Cl₂は、HCl捕捉剤としてプロピオニルクロリド及びトリエチルアミンを用いて他の白金(IV)錯体を調製するための溶媒として従来技術に用いられたが、収率は、わずか14%であった。EP0 328 274、実施例8、p.5、20行目を参照のこと。本発明者らは、CH₂Cl₂の代わりに無極性の非プロトン性溶媒として1,4-ジオキサンを用いて、式(III)の白金(IV)錯体の非常に優れた収率及び品質が得られたことを驚くべきことに見出した。

【0023】

好ましい実施形態において、本方法は、0.5〜6時間、好ましくは、1〜5時間、好ましくは、1〜4時間行われる。

【0024】

本方法は、19〜26℃、好ましくは20〜24℃、好ましくは20〜22℃の温度で、好ましくは室温で好ましくは行われる。

【0025】

好ましくは、生成物は、溶媒から沈殿させ、関連した不純物は、溶媒に残存する。

【0026】

好ましい実施形態において、生成物は、例えば、ろ過又は遠心により分離され、好ましくは、水及び溶媒により洗浄し、真空下で高温で好ましくは乾燥する。生成物の収率は、好ましくは80%を超え、純度は、98%を超え、好ましくは98.5%を超え、好ましくは98.6%である。

【0027】

本発明はまた、本発明の方法により、得ることができる、特に得られる式(III)の白金(IV)錯体に関する。

【0028】

本発明の第3の態様によれば、TU-31並びに結合剤、担体又は界面活性剤として少なくとも1種の親油性の薬学的に許容される添加剤を含有する腫瘍性疾患の治療のための医薬組成物が提供される。

【0029】

本発明の好ましい実施形態において、医薬組成物は、組成物の総重量に対してTU-31の含有量0.5〜50重量%、好ましくは1〜45重量%、好ましくは5〜40重量%、好ましくは10〜30重量%を有することを特徴とする。

【0030】

本発明者らは、TU-31が、その高親油性により、親油性が最も高い及び薬学的に許容される結合剤、担体又は界面活性剤と非常によく適合することが判明している。本発明者らは、TU-31が、親油性の薬学的に許容される結合剤、担体又は界面活性剤に高温で、好ましくは、好ましい界面活性剤としてのGelucire 50/13(ステアロイルマクロゴール-32グリセリドとも呼ばれる)において約60℃の温度で、均一に溶解できることが驚くべきことにさらに見出されている。この熱い融解溶液及び/又は懸濁液は、それが冷却した後、TU-31のGelucire 50/13中の固溶体及び/又は懸濁液になる。本組成物中の溶液及び/又は懸濁液の割合は、Gelucire 50/13中のTU-31の含有量に依存する。界面活性剤Gelucire 50/13はまた、経口投与後、消化管、特に胃中の親水性の胃液の活動的な作用に対してTU-31を保護する。本発明者らは、少なくとも1時間、37℃で0.1N-HCl中の界面活性剤Gelucire 50/13との組成物中のTU-31の安定性を確認した。さらに、界面活性剤Gelucire 50/13は全体的に又は少なくとも部分的に、消化管の外側の親水相中にTU-31を乳化し（emulgate）、経口投与後、消化管系からのTU-31のバイオアベイラビリティを高める。TU-31及びGelucire 50/13を含む、得られた固形医薬組成物は、一般に知られている手順により崩壊させることができ、次いで、硬ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースカプセル又は軟ゼラチンカプセル又はパールに密閉することができる。本発明はまた、好ましい実施形態において、液体医薬組成物、好ましくはGelucire 50/13中のTU-31の水性乳剤を提供する。

【0031】

したがって、本発明の好ましい実施形態において、医薬組成物は、本発明の式(III)の白金(IV)錯体及びステアロイルマクロゴール-32グリセリド(Gelucire 50/13)を含むものが提供される。

【0032】

不活性な固形賦形剤、例えば、微結晶性セルロース(microcrystallic cellulose)の添加はまた、組成物の所望の物理的特性を達成するために考慮することもできる。

【0033】

好ましい実施形態において、本発明による医薬組成物は、好ましくは、経口投与による、腫瘍性疾患、好ましくは悪性腫瘍の治療を目的とする。したがって、好ましい実施形態において、式(III)の本白金錯体及び/又は本組成物は、溶液、懸濁液、カプセル、錠剤、丸剤などの形態で、好ましくは、無菌の形態で製剤化することができる。

【0034】

本発明のさらなる態様によれば、式(III)の本白金(IV)錯体は、腫瘍性疾患を治療するための方法に用いるために提供される。

【0035】

本発明のさらなる態様では、腫瘍疾患の有効な治療を得るような、適当な投与量及び投与レジメンにおいて、本医薬組成物又は式(III)の白金(IV)錯体を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、それを必要とする対象において腫瘍性疾患を治療する方法が提供される。

【0036】

さらに好ましい実施形態は、従属請求項の主題である。

【実施例】

【0037】

本発明は、実施形態の以下の実施例により、さらに説明され例示されるが、これだけに限定されない。

【0038】

[実施例1]
式(II)及び(III)に従う白金(IV)錯体の合成
a)重要な中間体「c-t-c」PtCl₂(OH)₂(NH₃,アルキル-若しくはシクロアルキルアミン又はポリシクロアルキルアミン)の合成
米国特許第6,503,943号、実施例2a、第4段、45行目にさらに記載されている基本手順に従って、合成を行った。
b)「c-t-c」PtCl₂(アルキルカルボキシラト)₂(NH₃,アルキル-若しくはシクロアルキルアミン又はポリシクロアルキルアミン)、すなわち、式(II)に従う白金(IV)錯体の合成
EP0 328 274、実施例1から5、4頁に記載されている基本手順に従って合成を行った。
c)TU-31、すなわち、「c-t-c」PtCl₂(1-アダマンチルカルボキシラト)₂(NH₃,1-アダマンチルアミン)の合成。
合成を光の非存在下で行った。純度99%(2.1mmol)の「c-t-c」PtCl₂(OH)₂(NH₃,1-アダマンチルアミン)1.0g、純度>99%の1,4-ジオキサン20ml、純度>99%(12.9mmol)のピリジン1.05ml及び純度>95%(10.5mmol)の1-アダマンタンカルボニルクロリド2.2gを、室温で3時間撹拌した。得られた混合物を室温で8時間放置した。沈殿させたTU-31を、ろ過により分離し、水及び1,4-ジオキサンにより繰り返し洗浄し、次いで、これを真空下で45℃で乾燥した。TU-31の収率は、1.43g(理論に基づいた86%)であり、純度は、(HPLCにより)98.6%であった。

【0039】

[実施例2]
Gelucire 50/13を含むTU-31、すなわち、「c-t-c」PtCl₂(1-アダマンチルカルボキシラト)₂(NH₃,1-アダマンチルアミン)の医薬組成物の調製
TU-31 1.0g及びGelucire 50/13 4.0gを、65℃まで加熱して、黄色溶融液を創出した。この溶融液を、ポリプロピレン型に注ぎ、-18℃で1時間冷却した。次いで、固形組成物を、機械的に粒子にすり砕き、それぞれ、およそ5mgずつ秤量し、TU-31 20重量%を含有する。すり砕いた組成物を、ヒドロキシプロピルメチルセルロースカプセルに充てんし、その組成物の投与量1.0gは各カプセル当たり活性物質200mgを含有する。

【0040】

[実施例3]
調製された白金(IV)錯体のin vitro細胞毒性IC₅₀の決定
用いられた化合物の略語:
DMSO:ジメチルスルホキシド
PBS:リン酸緩衝食塩水
XTT:2,3-ビス-(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム-5-カルボキサニリド塩
PMS:N-メチル-ジベンゾピラジンメチルスルフェート
FBS:ウシ胎児血清
NEAA:非必須アミノ酸
L-glu:L-グルタミン
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地(SigmaAldrich社)
PMS:フェナジンメトスルフェート
被験化合物:
表中の本明細書による白金(IV)錯体
用いられた腫瘍細胞系:
MCF-7乳腺癌
CaCo-2結腸腺癌
HL60前骨髄球性白血病(promyelotic leukaemia)
A2780/シス 卵巣癌シスプラチン抵抗性
LNCaP前立腺がん
COR-L23肺癌
培養の条件:37℃、5%CO₂
増殖培地:DMEM、10%FBS、2mML-glut.、NEAA100×

【0041】

作業手順:
被験化合物を、ウェル中で細胞系に加える直前にDMSOに溶解し、試験される濃度範囲までPBSにより希釈した。PBSを陽性対照として用い、最終濃度20%のDMSOを陰性対照として用いた。化合物のすべての濃度を3連でアッセイした。決定をそれぞれ2回行い、実験者に対して盲検化した。試験を96-ウェルプレートで実施した。腫瘍細胞の投与量は、ウェル当たり約2.5×10⁴細胞であり、増殖培地の投与量は、ウェル当たり100μlであった。24時間後、増殖培地を吸引し、新鮮な増殖培地80μl及び異なる濃度の被験物質を含む溶液20μlを、ウェルに加えた。72時間後、培地を吸引し、XTT及びPMSを含有するOptimem試薬の溶液100μlをウェルに加えた。さらに4時間後、吸収度を450nmで測定した(参照は、630nmであった)。IC₅₀としての結果を、物質の濃度の対数に対してプロットした細胞の基準化された生存率のグラフから評価した。

【0042】

[実施例4]
エカトリアルアミノリガンドA₂の構造及び親油性における式(II)に従う白金(IV)錯体(R₁基はメチルである)のIC₅₀の相互依存性の試験
R₁基がメチルであり、A₂基が異なるアミノ-化合物である式(II)に従う白金(IV)錯体を、実施例1に従って調製した。腫瘍細胞系MCF-7(乳腺癌)及びCaCo-2(結腸腺癌)を用いた。IC₅₀を実施例3における手順に従って測定した。市販のシスプラチン及びオキサリプラチンを参照化合物として用いた。これらの結果を表1に示す。

【0043】

【表1】

【0044】

表1の結果から次の通りになる。
1. エカトリアルアミノリガンドA₂のタイプ及び親油性とIC₅₀との間で明らかな関係性が無い。
2. 最良の結果は、従来技術と一致する1-アダマンチルアミンエカトリアルリガンドを含む白金(IV)錯体を有する。
3. 1-アダマンチル骨格を3,5-ジメチル-1-アダマンチル骨格に変化させると、おそらく、1-アダマンチル基の対称性の低下により、抗腫瘍効果が低下する。ダイヤモンドのような1-アダマンタン骨格の高対称性は、白金(IV)錯体のこのタイプにおそらくは重要である。
4. 1-アダマンチル骨格を2-アダマンチル骨格に変化させると、おそらく、中心のPt(IV)-イオンの空間保護が低下することにより、抗腫瘍効果がやはり低下する。
5. 1-アダマンタン骨格と中心のPt(IV)-イオンとの間の距離が増大すると、おそらく中心のPt(IV)-イオンの空間保護が悪化することにより、抗腫瘍効果が低下する。

【0045】

[実施例5]
R₁基の構造及び親油性における式(II)に従う白金(IV)錯体(エカトリアルアミノリガンドA₂は、1-アダマンチルアミンである)のIC₅₀の相互依存性の試験

【0046】

A₂が1-アダマンチルアミンであり、R₁基が異なるアルキル又は1-アダマンチルである式(II)に従う白金(IV)錯体を、実施例1に従って調製した。腫瘍細胞系MCF-7(乳腺癌)及びCaCo-2(結腸腺癌)を用いた。IC₅₀を実施例3における手順に従って測定した。これらの結果を表2に示す。

【0047】

【表2】

【0048】

表2の結果から次の通りになる。
1. R₁基の脂肪族鎖中の炭素原子数間に明らかな関係性が無い。R₁としてメチル基を有するLA-12はよい結果であったが、R₁としてtert-ブチル基を有する白金錯体は、すべての被験脂肪族鎖の中で最良と思われ、従来技術と一致している(EP0328274、請求項1〜3を参照のこと)。
2. 1-アダマンチル基は、驚くべきことに、tert-ブチル基を含めたすべての被験R₁基を上回っている。

【0049】

[実施例6]
より広範な腫瘍細胞系パネルにおける、TU-31、すなわち、式(III)の白金(IV)錯体の、対象白金(II)錯体オキサリプラチン及び一時的に最良の白金(IV)錯体LA-12のIC₅₀との比較
被験腫瘍細胞系パネル:
MCF-7乳腺癌
CaCo-2結腸腺癌
HL60前骨髄球性白血病
A2780/シス 卵巣癌シスプラチン抵抗性
LNCaP前立腺がん
COR-L23肺癌

【0050】

【表3】

【0051】

表3の結果から次の通りになる。
1. TU-31、すなわち、本発明による白金(IV)錯体は、6種の被験がん細胞系のうち4種において最良の白金(II)錯体オキサリプラチン及び一時的に最良の白金(IV)錯体LA-12を上回る。
2. オキサリプラチンは、腫瘍細胞系LNCaPにおいて結果が良好であり、白金錯体の親油性が高まると共に、抗腫瘍効果は低下する。