特許 6321687 アマトキシン誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6321687

(24)【登録日】2018年4月13日

(45)【発行日】2018年5月9日

(54)【発明の名称】アマトキシン誘導体

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/64 20060101AFI20180423BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20180423BHJP

   C07K 1/00 20060101ALI20180423BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20180423BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20180423BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20180423BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180423BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180423BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20180423BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/64ZNA

   C07K19/00

   C07K1/00

   C12N15/00 H

   A61K38/12

   A61K47/68

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   A61P35/02

【請求項の数】18

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2015-560586(P2015-560586)

(86)(22)【出願日】2014年3月10日

(65)【公表番号】特表2016-516010(P2016-516010A)

(43)【公表日】2016年6月2日

(86)【国際出願番号】EP2014000614

(87)【国際公開番号】WO2014135282

(87)【国際公開日】20140912

【審査請求日】2017年3月8日

(73)【特許権者】

【識別番号】505348522

【氏名又は名称】ハイデルベルク ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(72)【発明者】

【氏名】クリストフ ミュラー

(72)【発明者】

【氏名】ヤン アンダール

(72)【発明者】

【氏名】ベルナー ジーモン

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン ルッツ

(72)【発明者】

【氏名】トールシュテン ヘヒラー

【審査官】 小田 浩代

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５４４２３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１１９７８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５２３３８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／１２１３２６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 Anderl, J. et al.，Chemical modification allows phallotoxins andamatoxins to be used as tools in cell biology，Beilstein J. Org. Chem.，２０１２年，Vol. 8，pp. 2072-2084

【文献】 Moldenhauer, G. et al.，Therapeutic potential of amanitin-conjugated anti-epithelial cell adhesion molecule monoclonal antibody against pancreatic carcinoma，J. Natl. Cancer Inst.，２０１２年，Vol. 104，pp. 622-634

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ ７／００−７／６６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＥＭＢＡＳＥ

／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉのアマトキシン（amatoxin）：

【化1】

（式中、
Ｒ^１は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝、Ｃ＝ＮＲ^６及びＣＲ^７Ｒ^８から選択され；
Ｒ^２は、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ_２、及びＳから選択され；
Ｒ^３は、ＮＨＲ^５及びＯＲ^５から選択され；
Ｒ^４は、Ｈ、ＯＲ^５、及びＯＣ_１−６−アルキルから選択され；
Ｒ^６は、Ｃ_１−６−アルキレン−Ｒ^５、シクロアルキレン−Ｒ^５、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ^５、アリーレン−Ｒ^５、及びヘテロアリーレン−Ｒ^５から選択され；
Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ_１−６−アルキレン−Ｒ^５、シクロアルキレン−Ｒ^５、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ^５、アリーレン−Ｒ^５、及びヘテロアリーレン−Ｒ^５から選択され；ここで、
（i）Ｒ^５はＨであるか；
（ii）Ｒ^５の一つは−Ｌ_ｎ−Ｘであり、ここでＬはリンカーであり、ｎは０及び１から選択され、Ｘは標的化部分と連結されてもよい化学部分であり、残りのＲ^５はＨであるか；或いは
（iii）Ｒ^５の一つは−Ｌ_ｎ−Ｘ^＊−Ｙであり、ここでＬはリンカーであり、ｎは０及び１から選択され、Ｙは標的化部分であり、Ｘ^＊は、ＸとＹの官能基との連結により生じる化学部分であり、残りのＲ^５はＨである）。

【請求項2】

前記Ｙの官能基がアミノ基である、請求項１（iii）に記載のアマトキシン。

【請求項3】

Ｘ^＊が尿素部分である、請求項２に記載のアマトキシン。

【請求項4】

−Ｌ_ｎ−Ｘ^＊−Ｙである残基Ｒ^５が、
（i）Ｒ^１に存在するか；
（ii）Ｒ^３に存在するか；
（iii）Ｒ^４に存在するか；或いは
（iv）Ｒ^５に存在する、
請求項１（iii）、２、及び３の何れか一項に記載のアマトキシン。

【請求項5】

アマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、又はこれらの塩若しくは類縁体から選択される、請求項１〜４の何れか一項に記載のアマトキシン。

【請求項6】

ｎが１であり、リンカーの長さが最大１２原子長、特に２〜１０原子長、より具体的には４〜９原子長、最も具体的には６〜８原子長である、請求項１（ii）、１（iii）、及び２〜５の何れか一項に記載のアマトキシン。

【請求項7】

前記リンカーＬが、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基であり、ここでヘテロ原子はＮ、Ｏ、及びＳから選択される１〜４のヘテロ原子でありであり、前記リンカーは任意により置換されていてもよい、請求項１（ii）、１（iii）、及び２〜６の何れか一項に記載のアマトキシン。

【請求項8】

前記リンカーＬが、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタン、及び尿素部分から選択される部分を含む、請求項１（ii）、１（iii）、及び２〜７の何れか一項に記載のアマトキシン。

【請求項9】

標的結合部分が、腫瘍細胞に存在するエピトープに特異的に結合し、特に標的結合部分が、ヒト上皮成長因子受容体２（human epidermal 生育 factor receptor 2：ＨＥＲ２）のエピトープに特異的に結合する、請求項１（iii）及び２〜８の何れか一項に記載のアマトキシン。

【請求項10】

前記標的結合部分が：
（i）抗体又はその抗原結合断片；
（ii）抗体様タンパク質；及び
（iii）核酸アプタマー
からなる群より選択される、請求項１（iii）及び２〜９の何れか一項に記載のアマトキシン。

【請求項11】

前記抗体又はその抗原結合断片が、二特異性抗体（diabody）、四特異性抗体（tetrabody）、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化（deimmunized）抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体から選択される、請求項１０に記載のアマトキシン。

【請求項12】

前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、及びジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）からなる群より選択される、請求項１０又は１１に記載のアマトキシン。

【請求項13】

薬剤として使用される、請求項１（iii）及び２〜１２の何れか一項に記載のアマトキシン。

【請求項14】

患者の癌の処置に使用され、特に前記癌が、乳癌、膵癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、悪性メラノーマ、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群より選択される、請求項１（iii）及び２〜１２の何れか一項に記載のアマトキシン。

【請求項15】

請求項１（iii）及び２〜１２の何れか一項に記載のアマトキシンを含むと共に、更に一又は二以上の医薬的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存剤を含む医薬組成物。

【請求項16】

Ｘがカルバミン酸誘導体−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｚであり、ここでＺは、標的結合部分の求核基により、特に標的結合部分の一級アミンにより、置換されてもよい脱離基である、請求項１（ii）に記載のアマトキシン。

【請求項17】

Ｚが、−^ｔブチルオキシ、−スクシニミジルオキシ、−１−Ｏ−スクシニミジルオキシ−３−スルフォネート（−スルフォ−ＮＨＳ）、−Ｏ−（４−ニトロフェニルオキシ）、−Ｏ−（３−ニトロフェニルオキシ）、−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニルオキシ）、−Ｏ−（２，４−ジクロロ−６−ニトロフェニルオキシ）、−ペンタフルオロフェニルオキシ、−ペンタクロロフェニルオキシ、−Ｏ−（２，４，５−トリクロロフェニルオキシ）、−Ｏ−（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）、−Ｏ−（エンド−１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド−１−イル）、−１−フタルイミドイルオキシ、−１−ベンゾトリアゾリルオキシ、−１−（７−アザ−ベンゾトリアゾリル）オキシ、）、及び−Ｎ−イミダゾリルから選択される、請求項１６に記載のアマトキシン。

【請求項18】

請求項１６又は１７のアマトキシンを合成するための方法であって、
式IIのアマトキシン

【化2】

（式中：
Ｒ^２は、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ_２、及びＳから選択され；
Ｒ^３は、ＮＨＲ^５及びＯＲ^５から選択され；
Ｒ^４は、Ｈ、ＯＲ^５、及びＯＣ_１−６−アルキルから選択され；
Ｒ^６は、Ｃ_１−６−アルキレン−Ｒ^５、シクロアルキレン−Ｒ^５、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ^５、アリーレン−Ｒ^５、及びヘテロアリーレン−Ｒ^５から選択され；
Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ_１−６−アルキレン−Ｒ^５、シクロアルキレン−Ｒ^５、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ^５、アリーレン−Ｒ^５、及びヘテロアリーレン−Ｒ^５から選択され；
ここで、Ｒ^５の一つは−Ｌ_ｎ−Ｘであり、Ｌはリンカーであり、ｎは０及び１から選択され、及びＸは標的化部分と連結されてもよい化学部分であり、残りのＲ^５はＨである）
を、（ｉ）Ｎ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（ＤＳＣ）、（ii）チオカルボキシル化試薬、特にチオホスゲン、１，１’−チオカルボキシルジイミダゾール又は１，１’−チオカルボキシルジ−２（１Ｈ）−ピリドン；（iii）イミノカルボキシル化試薬、特にイソシアニド二塩化物又はフェニルイソチオシアネート；或いは（iv）アルデヒド、ケトン又は非環式アセタールと反応させることを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は腫瘍治療に関する。一側面によれば、本発明は、アマトキシンと抗体等の標的結合部分とが特定の連結部により連結されてなる、癌並びに他の障害及び疾患の処置に有用なコンジュゲートに関する。更なる側面によれば、本発明は、斯かるコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

アマトキシンは８アミノ酸からなる環状ペプチドであり、例えばタマゴテングタケ（Amanita phalloides mushrooms）から単離し、或いは合成により得ることができる。アマトキシンは、哺乳類細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIを特異的に阻害しうると共に、これにより被毒細胞の転写及びタンパク質生合成を特異的に阻害しうる。細胞における転写の阻害により、生育及び増殖が停止する。アマニチンとＲＮＡポリメラーゼIIとの複合体は、共有結合ではないが極めて強固である（Ｋ_Ｄ＝３ｎＭ）。酵素からのアマニチンの脱離は極めて緩やかな過程であるため、被毒細胞が回復することは困難である。転写の阻害が長期間継続すると、細胞はプログラム細胞死（アポトーシス）を生じる。

【0003】

腫瘍治療の細胞毒性部分としてのアマトキシンの使用に関し、1981年に、Trp（アミノ酸４；図１参照）のインドール環にジアゾ化により連結したリンカーを用い、抗Thy1.2抗体をα−アマニチンに連結する試みがなされている（Davis ＆ Preston, Science, 1981, 213, 1385-1388）。Davis及びPrestonは連結位置を７’位と特定している。同様にMorris及びVentonも、７’位での置換によって細胞毒性活性を維持する誘導体が得られる旨を示している（Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res, 1983, 21, 419-430）。

【0004】

欧州特許出願第EP1859811A1号（2007年11月28日公開）は、β−アマニチンのアマトキシンのアミノ酸１γ位Ｃ原子が直接、即ちリンカー構造を介さずに、アルブミン又はモノクローナル抗体HEA125、OKT3、若しくはPA-1に連結されたコンジュゲートを記載する。更に、これらのコンジュゲートが乳癌細胞（MCF−7）、バーキットリンパ腫細胞（Raji）、及びT−リンパ腫細胞（Jurkat）の増殖に対して及ぼす阻害作用も示されている。リンカーの使用についても示唆しており、例えばアミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分等の要素を含むリンカーを挙げているが、斯かる構築物は実際には全く示されておらず、アマトキシンに対する連結部位等の詳細も供されていない。

【0005】

特許出願第WO2010/115629号及び同第WO2010/115630号（何れも2010年10月14日公開）は、アマトキシンに対して抗EpCAM抗体等の抗体、例えばヒト化huHEA125等を、（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγ位Ｃ原子、（ii）アマトキシンアミノ酸４の６’位Ｃ原子、又は（iii）アマトキシンアミノ酸３のδ位Ｃ原子を介して、何れの場合も直接又はリンカーを介して連結したコンジュゲートを記載する。リンカーとしては、例えばエステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合等の要素を含むものが挙げられている。更に、これらのコンジュゲートが乳癌細胞（細胞株MCF-7）、膵癌（細胞株Capan−1）、直腸癌（細胞株Colo205）、及び胆管癌（細胞株OZ）の増殖に対して及ぼす阻害作用も示されている。

【0006】

アマトキシン類の構造と活性との関係は、Wielandによって検討されている（T. Wieland, Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms, Springer series in molecular biology, Springer Verlag New York, 1986）。アミノ酸２（ヒドロキシプロリン）の水酸基及びアミノ酸３（ジヒドロキシイソロイシン）のγ−水酸基が活性によって重要だと推測されているのに対し、アミノ酸１（アスパラギン酸又はアスパラギン）、アミノ酸４（６−ヒドロキシトリプトファン）の官能基、並びにアミノ酸３のγ−水酸基は、化学修飾に対する耐性がより高いと考えられる。これは、後者の位置の方がリンカー連結部位として好ましいのに対して、前者の修飾は避けるべきである、との知見を示している。

【0007】

アマトキシン類は、抗体分子等の大型生体分子担体に連結すると、相対的に毒性が低くなること、また、生体分子担体を切断した後でないとその細胞毒性活性を発揮できないことが知られている。アマトキシンの毒性、特に肝臓細胞に対する毒性を考慮すると、標的化腫瘍治療用のアマトキシンコンジュゲートは血漿投与後も極めて安定であること、また、アマトキシンの放出が標的細胞への内在化の後に生じることが、とりわけ重要である。以上に鑑みると、コンジュゲートの安定性の僅かな改善であっても、治療用途のアマトキシンコンジュゲートの治療域及び安全性に対して、劇的な影響を与える可能性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、血漿中で安定な更なる標的結合部分アマトキシンコンジュゲートを供することにより、非標的細胞に対する有害な副作用を最小化することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、アマトキシンアミノ酸３のγ及びδ位Ｃ原子に結合する２つの酸素原子を介して環を形成することにより、斯かるアマトキシンと、その標的たる哺乳類細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼIIとの相互作用に干渉することなく、標的結合部分アマトキシンコンジュゲートの耐性を改善することができるという、予想外の知見に基づく。現在まで、アマトキシンアミノ酸３のγ位Ｃ原子に結合する水酸基の存在は、アマトキシン及びアマトキシンコンジュゲートの効力にとって不可欠であると考えられてきた。Wieland（T. Wieland, Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms, Springer Series in Molecular Biology, Springer Verlag New York, 1986; Wieland T, Rempel D, Gebert U, Buku A, Boehringer H. Ueber die Inhaltsstoffe des grunen Knollenblaetterpilzes. XXXII. Chromatographische Auftrennung der Gesamtgifte und Isolierung der neuen Nebentoxine Amanin und Phallisin sowie des ungiftigen amanullins. Liebigs Ann Chem. 1967; 704:226-236）は、γ−水酸基を有さないアマヌリン等の天然アマトキシンが、毒性が極めて低減されてなる旨を報告している。

【0010】

第一の側面によれば、本発明は式Ｉのアマトキシンに関する：

【化1】

（式中、
Ｒ^１は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝、Ｃ＝ＮＲ^６及びＣＲ^７Ｒ^８から選択され；
Ｒ^２は、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ_２、及びＳから選択され；
Ｒ^３は、ＮＨＲ^５及びＯＲ^５から選択され；
Ｒ^４は、Ｈ、ＯＲ^５、及びＯＣ_１−６−アルキルから選択され；
Ｒ^６は、Ｃ_１−６−アルキレン−Ｒ^５、シクロアルキレン−Ｒ^５、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ^５、アリーレン−Ｒ^５、及びヘテロアリーレン−Ｒ^５から選択され；
Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ_１−６−アルキレン−Ｒ^５、シクロアルキレン−Ｒ^５、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ^５、アリーレン−Ｒ^５、及びヘテロアリーレン−Ｒ^５から選択され；ここで、
（i）Ｒ^５はＨであるか；
（ii）Ｒ^５の一つは−Ｌ_ｎ−Ｘであり、ここでＬはリンカーであり、ｎは０及び１から選択され、Ｘは標的化部分と連結されてもよい化学部分であり、残りのＲ^５はＨであるか；或いは
（iii）Ｒ^５の一つは−Ｌ_ｎ−Ｘ^＊−Ｙであり、ここでＬはリンカーであり、ｎは０及び１から選択され、Ｙは標的化部分であり、Ｘ^＊は、ＸとＹの官能基との連結により生じる化学部分であり、残りのＲ^５はＨである）。

【0011】

別の側面によれば、本発明は、本発明のアマトキシンの薬剤としての用途に関する。

【0012】

別の側面によれば、本発明は、患者の癌の治療における本発明のアマトキシンの使用に関する。ここで特に癌は、乳癌、消化管 癌、例えば 結腸直腸癌、膵癌、胆管癌、肝細胞癌、骨肉腫、肺癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、卵巣癌、精巣癌、膀胱癌、胃癌、頭頸部癌、頸癌、腎臓癌、神経膠腫、皮膚癌、例えば悪性メラノーマ、甲状腺癌、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群より選択される。

【0013】

別の側面によれば、本発明は、本発明に係るアマトキシンを含むと共に、更に一又は二以上の医薬的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は、保存剤を含む、医薬組成物に関する。

【0014】

別の側面によれば、本発明は、本発明のアマトキシンを合成する方法であって、式IIのアマトキシン：

【化2】

（式中：
Ｒ^２は、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ_２、及びＳから選択され；
Ｒ^３は、ＮＨＲ^５及びＯＲ^５から選択され；
Ｒ^４は、Ｈ、ＯＲ^５、及びＯＣ_１−６−アルキルから選択され；
Ｒ^６は、Ｃ_１−６−アルキレン−Ｒ^５、シクロアルキレン−Ｒ^５、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ^５、アリーレン−Ｒ^５、及びヘテロアリーレン−Ｒ^５から選択され；
Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ_１−６−アルキレン−Ｒ^５、シクロアルキレン−Ｒ^５、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ^５、アリーレン−Ｒ^５、及びヘテロアリーレン−Ｒ^５から選択され；
ここで、Ｒ^５の一つは−Ｌ_ｎ−Ｘであり、Ｌはリンカーであり、ｎは０及び１から選択され、及びＸは標的化部分と連結されてもよい化学部分であり、残りのＲ^５はＨである）
を、（ｉ）Ｎ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（ＤＳＣ）、（ii）チオカルボキシル化試薬、特にチオホスゲン、１，１’−チオカルボキシルジイミダゾール又は１，１’−チオカルボキシルジ−２（１Ｈ）−ピリドン；（iii）イミノカルボキシル化試薬、特にイソシアニド二塩化物又はフェニルイソチオシアネート；或いは（iv）アルデヒド、ケトン又は非環式アセタールと反応させることを含む方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、複数の異なるアマトキシンの構造式を示す。太字の番号（１〜８）は、アマトキシンを形成する８つのアミノ酸の標準的な番号付けを指す。アミノ酸１、３及び４の各原子の標準的な表記も合わせて示す（それぞれギリシャ文字α〜γ、ギリシャ文字α〜δ、及び、番号１’〜７’）。

【0016】

【図2】図２は、複数の異なるアマトキシン−トラスツズマブ（商標名Herceptin^{（登録商標）}）コンジュゲートが、BrdUアッセイにおいて、７２時間のインキュベーション後、SK-OV-3（卵巣癌）細胞に対して及ぼす細胞毒性活性を示す。

【0017】

【図3】図３は、複数の異なるアマトキシン−トラスツズマブコンジュゲートが、BrdUアッセイにおいて、72時間のインキュベーション後、SK-OV-3（卵巣癌）細胞に対して及ぼす細胞毒性活性を示す。

【0018】

【図4】図４は、複数の異なるアマトキシン−トラスツズマブコンジュゲートが、BrdUアッセイにおいて、72時間のインキュベーション後、SKBR-3（乳癌）細胞に対して及ぼす細胞毒性活性を示す。

【0019】

【図5】図５は、複数の異なるアマトキシン−トラスツズマブコンジュゲートが、BrdUアッセイにおいて、72時間のインキュベーション後、JIMT-1（乳癌）細胞に対して及ぼす細胞毒性活性を示す。

【0020】

【図6】図６は、２種の異なるアマトキシン−トラスツズマブコンジュゲートの、JIMT−1乳癌異種移植モデルにおけるインビボ（in vivo）活性を示す。

【0021】

【図7】図７は、２種の異なるアマトキシン−トラスツズマブコンジュゲートの、雌NMRI nu/nuマウスにおけるインビボ（in vivo）耐性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、以下の発明の詳細な説明、及びそこに含まれる実施例を参照することにより、より理解が容易となるであろう。

【0023】

第１の態様では、本発明は式Ｉのアマトキシンに関する。

【化3】

式中、
Ｒ¹は、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝、Ｃ＝ＮＲ⁶及びＣＲ⁷Ｒ⁸から選択され；
Ｒ²は、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ₂、及びＳから選択され；
Ｒ³は、ＮＨＲ⁵及びＯＲ⁵から選択され；
Ｒ⁴は、Ｈ、ＯＲ⁵、及びＯＣ_1-6−アルキルから選択され；
Ｒ⁶は、Ｃ_1-6−アルキレン−Ｒ⁵、シクロアルキレン−Ｒ⁵、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ⁵、アリーレン−Ｒ⁵、及びヘテロアリーレン−Ｒ⁵から選択され；
Ｒ⁷及びＲ⁸はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ_1-6−アルキレン−Ｒ⁵、シクロアルキレン−Ｒ⁵、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ⁵、アリーレン−Ｒ⁵、及びヘテロアリーレン−Ｒ⁵から選択され；
ここで、
（ｉ）各Ｒ⁵はＨであるか；
（ｉｉ）Ｒ⁵の１つは−Ｌ_n−Ｘであり、ここでＬはリンカーであり、ｎは０及び１から選択され、Ｘは標的化部分と連結されてもよい化学部分であり、残りのＲ⁵はＨであるか；或いは
（ｉｉｉ）Ｒ⁵の１つは−Ｌ_n−Ｘ^*−Ｙであり、ここでＬはリンカーであり、ｎは０及び１から選択され、Ｙは標的化部分であり、Ｘ^*は、ＸとＹの官能基との連結により生じる化学部分であり、残りのＲ⁵はＨである。

【0024】

本明細書で使用される場合、「標的結合部分」という用語は、標的分子又は標的エピトープに特異的に結合できるいずれの分子又は分子の一部を指す。本願の文脈における好ましい標的結合構成部分は、（ｉ）抗体又はその抗原結合断片、（ｉｉ）抗体様タンパク質、及び（ｉｉｉ）核酸アプタマーである。典型的には、本発明での使用に適した「標的結合構成部分」は４０，０００Ｄａ（４０ｋＤａ）以上の分子量を有する。

【0025】

本明細書で使用される場合、第１の化合物（例えば抗体）が第２の化合物（例えば標的タンパク質等の抗原）に対して１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、好ましくは３０μＭ以下、好ましくは２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは９０ｎＭ以下、さらにより好ましくは８０ｎＭ以下、さらにより好ましくは７０ｎＭ以下、さらにより好ましくは６０ｎＭ以下、さらにより好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは４０ｎＭ以下、さらにより好ましくは３０ｎＭ以下、さらにより好ましくは２０ｎＭ以下、及びさらにより好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数Ｋ_Dを有する場合、第１の化合物は前記第２の化合物に「特異的に結合する」とみなされる。

【0026】

本願の文脈では、「標的分子」及び「標的エピトープ」という用語は、それぞれ標的結合部分によって特異的に結合される抗原及び抗原のエピトープをそれぞれ指す。好ましくは、標的分子は腫瘍関連抗原、特に非腫瘍細胞の表面と比べて増加した濃度及び／又は異なる立体高次構造で１つ以上の腫瘍細胞タイプ又は腫瘍関連細胞の表面に存在する抗原又はエピトープである。好ましくは、前記抗原又はエピトープは、１つ以上の腫瘍又は腫瘍間質細胞タイプの表面に存在するが、非腫瘍細胞の表面には存在しない。特定の実施形態では、標的結合部分はＨＥＲ−２／ｎｅｕ又は上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープに特異的に結合する。その他の実施形態では、前記抗原又はエピトープは自己免疫疾患に関与する細胞に優先的に発現される。特定のそのような実施形態では、標的結合部分はＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）のエピトープに特異的に結合する。その他の実施形態では、前記抗原又はエピトープは炎症性疾患に関与する細胞に優先的に発現する。

【0027】

本明細書で使用される場合、「抗体又はその抗原結合断片」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫的に活性のある部分、すなわち、免疫特異的に抗原と結合する抗原結合部位を含む分子を指す。また、例えば、標的分子、例えば、標的タンパク質Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ又はＥｐＣＡＭに特異的に結合するファージディスプレイを含む技術によって選択される免疫グロブリン様のタンパク質も含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれの種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスであることができる。本発明での使用に適した「抗体及びその抗原結合断片」としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロ複合体抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化（特にＣＤＲ移植）抗体、脱免疫化抗体、又はキメラ抗体、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作られる断片、ダイアボディ（diabodies）又はテトラボディ（tetrabodies）(Holliger P. et al.,1993）、ナノボディ（nanobodies）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体）、及び上記いずれのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。

【0028】

幾つかの実施形態では、抗原結合断片は本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）₂、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、並びにＶＬ又はＶＨ領域のいずれかを含む断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合抗体断片、例えば単鎖抗体は、可変領域のみを含んでもよく、又はヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の全て若しくは一部を組み合せて含んでいてもよい。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域とのいずれの組み合わせを含む抗原結合断片も本発明に含まれる。

【0029】

本発明に使用可能な抗体は、例えば、鳥類及び哺乳類を含むいずれの動物由来でありうる。好ましくは、抗体は、ヒト、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、若しくはウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ由来である。抗体はヒト又はネズミ由来であるのが特に好ましい。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」はヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体又は１つ以上のヒト免疫グロブリンが遺伝子導入され、内在性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。それらは、例えば、Kucherlapati及びJakobovitsによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載される。

【0030】

「抗体様タンパク質」という用語は、（例えばループ構造を突然変異生成により）改変されて標的分子に特異的に結合するタンパク質を指す。典型的には、そのような抗体様タンパク質は、両端でタンパク質スキャホールドに結合した少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重の構造的制約は、抗体様タンパク質の結合親和性を抗体の結合親和性に匹敵するレベルまで大幅に増加させる。典型的には、可変ペプチドループ長さは１０〜２０個のアミノ酸からなる。スキャホールドタンパク質は、良好な溶解特性を有するいずれのタンパク質でありうる。好ましくは、スキャホールドタンパク質は小さな球形タンパク質である。抗体様タンパク質としては、限定することなく、アフィボディ（affibodies）、アンチカリン、及び人工（designed）アンキリン反復タンパク質が挙げられる（総説については、Binz et al. 2005を参照）。抗体様タンパク質は、突然変異体の大規模ライブラリー由来であることができ、例えば大規模ファージディスプレイライブラリーから選択（panned）でき、通常の抗体と同様に単離できる。また、抗体様結合タンパク質は、球形タンパク質の表面露出残基のコンビナトリアル突然変異生成によって得ることができる。

【0031】

「核酸アプタマー」という用語は、インビトロ選択又はＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）を繰り返すことによって改変して標的分子に結合する核酸分子を指す（総説については、Brody and Gold, 2000を参照）。核酸アプタマーはＤＮＡ又はＲＮＡ分子でありうる。アプタマーは修飾形態、例えば、２’−フッ素置換ピリミジン等の修飾ヌクレオチドを含みうる。

【0032】

本明細書で使用される場合、「アプタマー複合体」は、標的結合部分が上記代替物（ｉｉｉ）の核酸アプタマーである標的結合部分毒素複合体を指す。

【0033】

本発明の文脈では、「リンカー」は、それぞれがリンカーの一端に結合した２つの構成要素、例えば、本発明の場合では標的結合部分とアマトキシンとの間等を接続する分子を指し、２つの構成要素の間の距離を増加させ、それらの構成要素間の立体障害を軽減する。リンカーがない場合、アマトキシンと標的結合部分との直接結合は、アマトキシンのＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する能力を減らしうる。特定の実施形態では、リンカーはその主鎖に、１〜３０個の原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の原子）の連続鎖を有し、すなわち、リンカーの長さは、アマトキシン部分と標的結合部分との間の原子又は結合の数によって測定される最短の結合として定義され、リンカー主鎖の一方はアマトキシンと反応し、もう一方は標的結合部分と反応する。本発明の文脈において、リンカーは、好ましくは、随意に置換された、Ｃ₁−₂₀−アルキレン、Ｃ₁−₂₀−ヘテロアルキレン、Ｃ₂−₂₀−アルケニレン、Ｃ₂−₂₀−ヘテロアルケニレン、Ｃ₂−₂₀−アルキニレン、Ｃ₂−₂₀−ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基である。リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素構成部分等の１つ以上の構造要素を含みうる。リンカーはまた、２つ以上のこれら構造要素の組み合わせを含んでもよい。これら構造要素の各々は、２箇所以上、例えば、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、又は６箇所存在してよい。幾つかの実施形態では、リンカーはジスルフィド結合を含んでいてもよい。単工程又は２つ以上の後続の工程で、リンカーをアマトキシン及び標的結合部分に結合させる必要があることが理解される。そのためには、リンカーとなるべきものは、好ましくは近位及び遠位の端に２つの基をもつことになり、（ｉ）連結される構成要素の１つに存在する基、好ましくはアマトキシン若しくは標的結合ペプチド上の活性化された基と共有結合を形成することができ、又は（ｉｉ）アマトキシン上の基と共有結合を形成するのに活性化される若しくは活性化できる。したがって、化学基がリンカーの遠位端及び近位端に存在し、それが、カップリング反応、例えばエステル結合、エーテル結合、ウレタン結合、ペプチド結合等の結果であることが好ましい。

【0034】

本発明の文脈では、「アマトキシン」という用語は、テングタケ（Amanita）属から単離され、Wieland T.及びFaulstich H.(Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 1978 Dec; 5(3):185-260)）に記載されるような８個のアミノ酸からなる環状ペプチドの全てを含み、さらにその全ての化学誘導体、さらにその全ての半合成類縁体、さらに天然化合物の主要構造（環状、８個のアミノ酸）に従って基本構成要素から構築されるその全ての合成類縁体、さらにヒドロキシル化アミノ酸の代わりに非ヒドロキシル化アミノ酸を含有する全ての合成又は半合成類縁体、さらにスルフィド、スルホンによって、又は硫黄以外の原子、例えばアマニチンのカルバ類縁体中の炭素原子によってチオエーテルスルホキシド部分が置換された全ての合成又は半合成類縁体を含み、いずれの場合にもいずれのそのような誘導体又は類縁体は、哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害することによって機能的に活性である。

【0035】

本明細書で使用される場合、化合物の「化学誘導体」（又は略して「誘導体」）は、その化合物と同様の化学構造を有するが、その化合物中には存在しない少なくとも１つの化学基を含有し、及び／又はその化合物中に存在する少なくとも１つの化学基を欠く化学種を指す。誘導体が比較される化合物は、「親」化合物として知られる。典型的には、「誘導体」は１つ以上の化学反応工程で親化合物から作られうる。

【0036】

本明細書で使用される場合、化合物の「類縁体」は、その化合物と構造的に関連するが同一ではなく、その化合物の少なくとも１つの活性を示す。類縁体が比較される化合物は、「親」化合物として知られる。上記で言及した活性としては、限定することなく、別の化合物との結合活性；阻害活性、例えば酵素阻害活性；毒性作用；活性化活性、例えば酵素活性化活性が挙げられる。類縁体はそのような活性を親化合物と同程度まで示す必要はない。本願の文脈内では、化合物が親化合物の活性の少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）の程度まで関連する活性を示す場合、その化合物は類縁体とみなされる。よって、本明細書で使用される場合、「アマトキシンの類縁体」とは、図１に示すようなα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、及びアマヌリン酸（amanullinic acid）のいずれか１つと構造的に関連し、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸の少なくとも１つと比較して哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩに対して少なくとも１％（より好ましくは少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）の阻害活性を示す化合物を意味する。本発明での使用に適した「アマトキシン類縁体」はさらに、哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩに対してα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、又はアマヌリン酸のいずれか１つより大きな阻害活性を示してもよい。阻害活性は、５０％の阻害が生じる濃度（ＩＣ₅₀値）を決定することによって測定されうる。哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する阻害活性は、細胞増殖への阻害活性を測定することによって間接的に決定できる。細胞増殖の阻害を測定するのに好適なアッセイは実施例に記載されている。

【0037】

「半合成類縁体」は、出発材料として天然のソース（例えば、植物材料、細菌培養物、真菌培養物、又は細胞培養物）由来の化合物を用いる化学合成によって得られる類縁体を指す。典型的には、本発明の「半合成類縁体」は、テングタケ（Amanitaceae）科のキノコから単離された化合物から出発して合成される。対照的に、「合成類縁体」は、小さな（典型的には石油化学的な）基本構成要素からのいわゆる全合成によって合成される類縁体を指す。通常この全合成は、生物学的なプロセスを用いることなく行なわれる。

【0038】

機能的には、アマトキシンは哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチド又はデプシペプチドとして定義される。好ましいアマトキシンは、上記で定義されるリンカー分子又は標的結合構成部分と反応できる官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール又はチオール捕捉基（thiol-capturing group））をもつものである。本発明の複合体に特に適したアマトキシンは、図１に示されるようなα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン、及びアマヌリン酸、ならびにその塩、化学誘導体、半合成類縁体、及び合成類縁体である。本発明での使用に特に好ましいアマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン、及びアマニンアミドである。

【0039】

本発明の特定の実施形態では、（ｉｉｉ）のアマトキシン、（ｉｉｉ）のアマトキシンのＹの官能基はアミノ基である。特定のそのような実施形態では、Ｘ^*は尿素部分である。

【0040】

本発明の特定の実施形態では、−Ｌ_n−Ｘ^*−Ｙである前記残基Ｒ⁵は、
（ｉ）Ｒ¹に存在するか；
（ｉｉ）Ｒ³に存在するか；
（ｉｉｉ）Ｒ⁴に存在するか；或いは
（ｉｖ）Ｒ⁵に存在する。

【0041】

本発明の特定の実施形態では、前記アマトキシンは、α−アマニチン、β−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、又はこれらの塩若しくは類縁体から選択される。

【0042】

特定の実施形態では、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のリンカーＬは、それぞれ独立に、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１〜２０個の原子、特に２〜１６個の原子、より具体的には５〜１４個の原子、さらにより具体的には６〜１２個の原子の直鎖である。特定の実施形態では、直鎖中の少なくとも６０％の原子はＣ原子である。特定の実施形態では、直鎖中の原子は単結合によって連結される。

【0043】

特定の実施形態では、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のリンカーの長さが最大１２原子長、特に２〜１０原子長、より具体的には４〜９原子長、最も具体的には６〜８原子長である。

【0044】

特定の実施形態では、リンカーＬは、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基であり、ヘテロ原子はＮ、Ｏ、及びＳから選択される１〜４のヘテロ原子であり、前記リンカーは任意により置換される。

【0045】

「アルキレン」という用語は、１〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖飽和炭化水素基、例えば、１〜１０個の炭素原子を有する基を指す。ある実施形態では、アルキレン基は低級アルキレン基でありうる。「低級アルキレン」という用語は、１〜６個の炭素原子、ある実施形態では、１〜５個又は１〜４個の炭素原子を有するアルキレン基を指す。アルキレン基としては、例えば、メチレン（−ＣＨ₂−）、エチレン（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−）、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチルエン、ｎ−ペンチルエン、及びｎ−ヘキシルエンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0046】

「アルケニレン」という用語は、２〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖基を指し、少なくとも１つの炭素−炭素結合は二重結合であり、一方で他の結合は単結合であってもよく、さらに二重結合であってもよい。本明細書で使用される場合、「アルキニレン」という用語は、２〜２０個の炭素原子を有する基を指し、少なくとも１つの炭素−炭素結合は三重結合であり、一方で他の結合は単結合、二重結合、さらに三重結合であってもよい。アルケニレン基としては、例えば、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、１−プロペニレン、２−プロペニレン、１−ブテニルエン、２−ブテニルエン、３−ブテニルエン等が挙げられる。アルキニレン基としては、例えば、エチニレン、１−プロピニレン、２−プロピニレン等が挙げられる。

【0047】

本明細書で使用される場合、「シクロアルキレン」は、いずれの安定な単環又は多環系の一部である二価の環を指すことを意図し、そのような環は３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を有さず、そのような環は完全飽和である。「シクロアルケニルエン」という用語は、いずれの安定な単環又は多環系の一部である二価の環を指すことを意図し、そのような環は３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を有さず、そのような環は少なくとも部分的に不飽和である（しかし、いずれのアリーレン環も除く）。シクロアルキレンとしては、例えば、シクロプロピルエン、シクロブチルエン、シクロペンチルエン、シクロヘキシルエン、及びシクロヘプチルエンが挙げられるが、これらに限定されない。シクロアルケニルエンとしては、例えば、シクロペンテニルエン、及びシクロヘキセニルエンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

本明細書で使用される場合、「ヘテロシクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルケニレン」という用語は、いずれの安定な単環又は多環系の一部である二価の環を指すことを意図し、そのような環は３〜約１２個の原子を有し、そのような環は炭素原子及び少なくとも１つのヘテロ原子からなり、特に、少なくとも１つのヘテロ原子は独立してＮ、Ｏ、及びＳからなる群から選択され、ヘテロシクロアルキレンは、完全に飽和であるそのような環を指し、ヘテロシクロアルケニレンは、少なくとも部分的に一部非飽和である環を指す（いずれのアリーレン又はヘテロアリーレン環を除く）。

【0049】

「アリーレン」という用語は、いずれの安定な単環又は多環系の一部である二価の環又は環系を意味することを意図し、そのような環又は環系は３〜２０個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を有さず、その環又は環系は、「４ｎ＋２」π電子則によって定義される芳香族部分、例えばフェニルエンである。

【0050】

本明細書で使用される場合、「ヘテロアリーレン」という用語は、いずれの安定な単環又は多環系の一部である二価の環又は環系を指し、そのような環又は環系は３〜２０個の炭素原子を有し、その環又は環系は、「４ｎ＋２」π電子則によって定義される芳香族部分からなり、炭素原子並びに１つ以上の窒素、硫黄、及び／又は酸素ヘテロ原子を含有する。

【0051】

本発明の文脈において、「置換された」という用語は、示される原子の通常の原子価、又は置換される基の適切な原子の原子価が超過されることなく、かつ置換が安定的な化合物をもたらすことを条件として、リンカーの骨格に存在する１つ以上の水素が、示される基から選択して置き換えられることを示すことを意図する。「随意に置換された」という用語は、本明細書で定義される１つ以上の置換基で、本明細書に定義されるようにリンカーが置換されない又は置換されることを意味することを意図する。置換基が、ケト（又はオキソ、すなわち＝Ｏ）基、チオ又はイミノ基等の場合、リンカー骨格原子上の２つの水素が置き換えられる。例示的な置換基としては、例えば、以下が挙げられる：アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、（チオ）エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、（チオ）アミド、スルフィドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、サルフェート、スルフォネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、パラフルオロアルキル（トリフルオロメチル等）を含むハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホノアミノ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、（随意に、例えばアルキル、アリール、若しくはヘテロアリールによって一置換若しくは二置換された）アミノ、イミノ、カルボキサミド、（随意に、例えばアルキル、アリール、若しくはヘテロアリールによって一置換若しくは二置換された）カルバモイル、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、（チオ）ウレイド、アリールチオ）ウレイド、アルキル（チオ）ウレイド、シクロアルキル（チオ）ウレイド、アリールオキシ、アルアルコキシ、又は−Ｏ（ＣＨ₂）_n−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂、−Ｏ（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ₂）_nＲ、−（ＣＨ₂）_nＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、若しくは−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）₂Ｒ、ｎは１〜４であり、Ｒは、独立して、水素、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−シクロアルキル、−シクロアルケニル、−（Ｃ−連結−ヘテロシクロアルキル）、−（Ｃ−連結−ヘテロシクロアルケニル）、−アリール、及び−ヘテロアリールから選択され、複数の置換が許容される。ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキル等の置換基又は−ＯＨ、−ＮＨＲ等の官能基は、適切な場合にはそれ自体が置換を受けることができることを当業者なら理解するであろう。置換される構成部分自体も適切な場合には置換されることができることを当業者なら理解するであろう。

【0052】

特定の実施形態では、リンカーＬは、次の構成部分：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）の１つから選択される部分を含む。

【0053】

本発明の特定の実施形態では、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のリンカーＬは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、及びヘテロアラルキレン基のリストから選択されるｍ基を含み、各基は随意に独立して置換されてもよく、そのリンカーは、以下の構成部分：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）の１つから独立して選択さるｎ部分さらに含み、ｍ＝ｎ＋１である。特定の実施形態では、ｍが２でありｎが１であるか、ｍが３でありｎが２である。特定の実施形態では、リンカーは、２又は３つの非置換アルキレン基、及び非置換アルキレン基に連結する、それぞれ１又は２つのジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタン、又は尿素構成部分を含む。

【0054】

特定の実施形態では、直鎖中のＣ原子は独立して随意に置換されたメチレン基（−ＣＨ₂−）の一部である。特定のそのような実施形態では、随意の置換基は、ハロゲン及びＣ₁−₆−アルキル、特にメチルから独立して選択される。

【0055】

特定の実施形態では、リンカーＬ、特に段落［００４３］に示されるリンカーＬは、次のリンカーの群から選択される：
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₂− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₃− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₄− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₅− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₆− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₇− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₈− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₉− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₁₀− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₁₁− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₁₂− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₁₆− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₂−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₂− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₃−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₂− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₂−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₃− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₃−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₃− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₄−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₄− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₂−ＣＭｅ₂−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₂− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₂−Ｓ−Ｓ−ＣＭｅ₂−（ＣＨ₂）₂− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−標的結合部分側；
アマトキシン側： −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−（ＣＨ₂）₆− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−（ＣＨ₂）₆− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−（ＣＨ₂）₆− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−（ＣＨ₂）₆− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−（ＣＨ₂）₆− 標的結合部分側；
アマトキシン側： −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−（ＣＨ₂）₆− 標的結合部分側；及び
アマトキシン側： −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−（ＣＨ₂）₆− 標的結合部分側

【0056】

特定の実施形態では、標的結合部分は腫瘍細胞上に存在するエピトープに特異的に結合し、特に、その標的結合部分はヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）のエピトープに特異的に結合する。

【0057】

特定の実施形態では、抗体はトラスツズマブ若しくはＨＥＡ１２５であるか、又はトラスツズマブ若しくはＨＥＡ１２５の抗原結合断片を含む抗体断片である。

【0058】

特定の実施形態では、１つより多いアマトキシン分子が１つの標的結合部分に連結する。複合体当たりのアマトキシンの数の増加は、毒性も増加させることになる。したがって、特定の実施形態では、標的結合部分のアマトキシンに対する割合は、１〜１５個のアマトキシン分子、具体的に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個に対して１つの標的結合部分である。ＩｇＧ等の抗体二量体の場合、割合を計算するために二量体は１つ標的結合部分とみなされる。

【0059】

特定の実施形態では、標的結合部分は：
（ｉ）抗体又はその抗原結合断片；
（ｉｉ）抗体様タンパク質；及び
（ｉｉｉ）核酸アプタマー
からなる群より選択される。

【0060】

特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、二特異性抗体、四特異性抗体、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体から選択される。

【0061】

特定の実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、及びジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される。

【0062】

別の態様では、本発明は薬剤として使用される本発明のアマトキシンに関する。

【0063】

別の態様では、本発明は、患者の癌の処置に使用され、特にその癌が、乳癌、膵癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、悪性メラノーマ、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群より選択される本発明のアマトキシンに関する。

【0064】

本明細書で使用される場合、「患者」とは、本明細書に記載される標的結合部分毒素複合体を用いる処置から恩恵を受けうるいずれの哺乳類又は鳥類を意味する。好ましくは、「患者」は、実験動物（例えば、マウス若しくはラット）、野性ではない動物（例えば、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、若しくはイヌを含む）、又はヒトを含む霊長類からなる群から選択される。「患者」はヒトであることが特に好ましい。

【0065】

本明細書で使用される場合、疾患又は障害を「処置する（treat）」、「処置すること（treating）」又は「処置（treatment）」とは、（ａ）障害の重症度を低減すること；（ｂ）処置される障害に特徴的な症状の発症を制限又は予防すること；（ｃ）処置される障害に特徴的な症状の悪化を阻止すること；（ｄ）障害を以前に有したことがある患者での障害の再発を制限又は予防すること；及び（ｅ）過去に障害の症状を呈した患者での症状の再発を制限又は予防することのうち１つ以上を達成することを意味する。

【0066】

本明細書で使用される場合、処置は、本発明にかかる複合体又は医薬組成物を患者に投与すること含んでいてもよく、「投与すること」は、生体内投与、及び静脈移植等の生体外組織への直接投与を含む。

【0067】

特定の実施形態では、本発明の複合体の治療上有効な量が使用される。

【0068】

「治療上有効な量」は、意図した目的を達成するのに十分な治療薬の量である。所定の治療薬の有効量は、薬剤の性質、投与の経路、治療薬を受ける動物の大きさ及び種、並びに投与の目的等の要因によって異なることになる。各々の個別の場合における有効量は、当該技術分野で確立された方法に従って当業者によって経験的に決定されうる。

【0069】

別の態様では、本発明は、本発明によるアマトキシンを含むと共に、更に１つ以上の医薬的に許容可能な希釈剤、担体、賦形剤、充填材、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤；及び／又は保存剤を含む医薬組成物に関する。

【0070】

「医薬的に許容可能な」とは、連邦若しくは州政府の規制当局に認可されているか、又は米国薬局方、若しくは動物、より具体的にヒトでの使用に一般に認められている他の薬局方で収載されていること意味する。

【0071】

特定の実施形態では、医薬組成物は全身的に投与される薬剤の形態で使用される。これは非経口剤を含み、とりわけ注射剤及び注入剤を含む。注射剤は、アンプルの形態又はいわゆるすぐに使える（ready-to-use）注射剤、例えばすぐに使える注射器若しくは使い捨ての注射器の形態のいずれか、及びそれに加えて数回の抜取りを行うための穿刺可能なフラスコ中に製剤化される。注射剤の投与は、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、又は皮内（ｉ．ｃ．）適用の形態であることができる。特に、結晶の懸濁液、溶液、例えばヒドロゾルのようなナノ粒子若しくはコロイド分散系としてそれぞれ好適な注射製剤を作ることが可能である。

【0072】

さらに、注射用製剤は濃縮物として作ることができ、その濃縮物は水性等張希釈剤を用いて溶解又は分散できる。また、注入剤は等張溶液、脂肪乳剤、リポソーム製剤、及びマイクロエマルションの形態で調製できる。注射剤と同様に、注入製剤もまた、希釈用濃縮物の形態で調製できる。また、注射用製剤は、例えばミニポンプにより、入院療法及び外来療法双方における、持続的な（permanent）注入剤の形態で適用することもできる。

【0073】

例えば、アルブミン、血漿、増量剤、表面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ調整物質（pH-influencing substances）、錯化物質、又は高分子物質を、特に本発明の標的結合部分毒素複合体のタンパク質又は高分子への吸着に影響を与える物質として非経口製剤に加えることができ、又は本発明の標的結合部分毒素複合体の注射器にような材料又は包装材料、例えばプラスチック若しくはガラスへの吸着を減らす目的でこれらを加えることができる。

【0074】

標的結合部分を含む本発明のアマトキシンは、非経口剤中のマイクロ担体又はナノ粒子、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ乳酸塩、ポリグリコール酸塩、ポリアミノ酸、又はポリエーテルウレタンをベースとする微分散粒子に結合できる。また、例えば、本発明の標的結合部分毒素複合体をそれぞれ微分散形態、分散形態、及び懸濁形態で導入する場合、例えば「複数単位原理（multiple unit principle）」に基づき、又は本発明の標的結合部分毒素複合体を製剤中に、例えば、後に埋め込まれる錠剤若しくは棒剤（rod）中に封入する場合、薬剤中の結晶の懸濁液として若しくは「単一単位原理（single unit principle）」に基づき、非経口製剤をデポー製剤として変更することもできる。単一単位製剤及び複数単位製剤でこれらの埋め込み剤又はデポー製剤は多くの場合、いわゆる生分解性高分子、例えば乳酸及びグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、又は多糖類等からなる。

【0075】

非経口剤として製剤化される本発明の医薬組成物の製造時に加えられる補助剤及び担体は、好ましくは滅菌水（aqua sterilisata（sterilized water））、ｐＨ値調整物質、例えば有機酸若しくは無機酸若しくは有機塩基若しくは無機塩基及びその塩等、ｐＨ値調整用の緩衝物質、等張化用の物質、例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース及びフルクトース等、それぞれ界面活性剤（tensides）及び界面活性剤（surfactants）、並びに乳化剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（例えばTween（登録商標））、若しくは例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（例えばCremophor（登録商標））等、脂肪油、例えば落花生油、大豆油若しくはヒマシ油等、脂肪酸の合成エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び中性油（例えばＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標））等、並びに高分子補助剤、例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドン等、有機溶媒の溶解度を増加させる添加剤、例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコール等、又は錯体形成物質、例えばクエン酸塩及び尿素等、保存料、例えば安息香酸ヒドロキシプロピルエステル及びメチルエステル、ベンジルアルコール等、酸化防止剤、例えば亜硫酸ナトリウム等、並びに安定化剤、例えばＥＤＴＡ等である。

【0076】

好ましい実施形態において懸濁剤として本発明の医薬組成物を製剤する場合、本発明の標的結合部分毒素複合体の硬化を防止する増粘剤、又は沈殿物の再懸濁を確実にする界面活性剤及び多価電解質、並びに／又は例えばＥＤＴＡといった錯体形成剤がを加えられる。また、活性成分のさまざまな高分子との錯体を得ることが可能である。そのようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、例としては、ポリエチレングリコール、ポリスチロール、カルボキシメチルセルロース、Pluronics（登録商標）、又はポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル（polyethylene glycol sorbit fatty acid ester）である。また、本発明の標的結合部分毒素複合体は、例えばサイクロデキストリンを用いた封入化合物の形で液体製剤に取り込まれることができる。特定の実施形態では、分散剤はさらなる補助剤として加えられることができる。凍結乾燥物の製造のために、スキャホールド剤（scaffolding agents）、例えばマンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ、又はさまざまなゼラチンを使用できる。

【0077】

本発明の特定の実施形態では、Ｘはカルバミン酸誘導体−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｚであり、Ｚは標的結合部分の求核基、特に標的結合部分の一級アミンにより、置換されてもよい脱離基である。

【0078】

特定の実施形態では、Ｚは、−^tブチルオキシ、−スクシニミジルオキシ、−１−Ｏ−スクシニミジルオキシ−３−スルフォネート（−スルフォ−ＮＨＳ）、−Ｏ−（４−ニトロフェニルオキシ）、−Ｏ−（３−ニトロフェニルオキシ）、−Ｏ−（２，４−ジニトロフェニルオキシ）、−Ｏ−（２，４−ジクロロ−６−ニトロフェニルオキシ）、−ペンタフルオロフェニルオキシ、−ペンタクロロフェニルオキシ、−Ｏ−（２，４，５−トリクロロフェニルオキシ）、−Ｏ−（３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）、−Ｏ−（エンド−１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド−１−イル）、−１−フタルイミドイルオキシ、−１−ベンゾトリアゾリルオキシ、−１−（７−アザ−ベンゾトリアゾリル）オキシ）、及び−Ｎ−イミダゾリルから選択される。

【0079】

別の態様では、本発明は、本発明のアマトキシンを合成するための方法に関し、その方法は式ＩＩのアマトキシン

【化4】

（式中
Ｒ²は、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ₂、及びＳから選択され；
Ｒ³は、ＮＨＲ⁵及びＯＲ⁵から選択され；
Ｒ⁴は、Ｈ、ＯＲ⁵、及びＯＣ_1-6−アルキルから選択され；
Ｒ⁶は、Ｃ_1-6−アルキレン−Ｒ⁵、シクロアルキレン−Ｒ⁵、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ⁵、アリーレン−Ｒ⁵、及びヘテロアリーレン−Ｒ⁵から選択され；
Ｒ⁷及びＲ⁸はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ_1-6−アルキレン−Ｒ⁵、シクロアルキレン−Ｒ⁵、ヘテロシクロアルキレン−Ｒ⁵、アリーレン−Ｒ⁵、及びヘテロアリーレン−Ｒ⁵から選択され；
そこにおいて、Ｒ⁵の１つは−Ｌ_n−Ｘであり、ここでＬはリンカーであり、ｎは０及び１から選択され、Ｘは標的化部分と連結されてもよい化学部分であり、残りのＲ⁵はＨである）
を、（ｉ）Ｎ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（ＤＳＣ）、（ｉｉ）チオカルボキシル化試薬、特にチオホスゲン、１，１’−チオカルボキシルジイミダゾール又は１，１′−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン；（ｉｉｉ）イミノカルボキシル化試薬、特にイソシアニド二塩化物又はフェニルイソチオシアネート；或いは（ｉｖ）アルデヒド、ケトン又は非環式アセタールと反応させることを含む。

【実施例】

【0080】

実施例１ アマトキシン複合分子の合成
１．１ ６´−Ｎ−Ｂｏｃ−（６−アミノヘキシル）−α−アマニチン ＨＤＰ３０．０１３２の合成

【化5】

アルゴン下室温にて、１８０ｍｇ（１９６μｍｏｌ）の真空乾燥したα−アマニチンを５０００μｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かした。Ｎ−Ｂｏｃ−アミノヘキシルブロミド（４３９ｍｇ、８当量）及び１Ｍ水酸化ナトリウム（２１５．５μｌ、１．１当量）を加えた。２時間後、１００μｌのＤＭＳＯ中の１Ｍ酢酸溶液を用いて反応、室温で混合物を酸性化してｐＨ＝５にした。揮発性物質を真空で蒸発させ、残留物を５００μｌのメタノールに溶かし、４０ｍｌの氷冷メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）に加えた。沈殿物を遠心分離し、４０ｍｌのＭＴＢＥに再懸濁することで洗浄した。沈殿物を４０００μｌのメタノールに溶かし、濾過し、５００μｌに小分けしてＣ１８カラムでの分取クロマトグラフィー（２５０×２１．２ｍｍ、Ｌｕｎａ ＲＰ−１８、１０μｍ、１００オングストローム）で精製した。溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：メタノール；勾配：０分 ５％Ｂ；５分 ５％Ｂ；２０分 １００％Ｂ；２５分 １００％Ｂ；２７分 ５％Ｂ；３５分 ５％Ｂ；流速３０ｍｌ／分。保持時間が１８．４〜１９．１分の画分を集め、溶媒を蒸発させて無色の固体として１２６ｍｇ（５７％）のＨＤＰ３０．０１３２を得た。

【0081】

ＭＳ（ＥＳＩ＋）１１１８．５［Ｍ＋Ｈ］⁺，１１４０．５［Ｍ＋Ｎａ］⁺

【0082】

保持時間が１２．８〜１３．４分の画分を蒸発させることによって、３５ｍｇ（１９％）のα−アマニチンを回収できた。

【0083】

１．２ ６´−（６−アミノヘキシル）−α−アマニチン ＨＤＰ３０．０１３４の合成

【化6】

６´−ＮＨ−ｂｏｃ−６−アミノヘキシル−α−アマニチン（ＨＤＰ３０．０１３２、８１．８２ｍｇ、７３．１７μｍｏｌ）を３００μｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶かした。反応混合物をアルゴン下で周囲温度にて撹拌した。２分後、酸を真空下で２０℃にて除去し、２回の３ｍｌの乾燥トルエンとの共蒸発によって微量のＴＦＡを除去した。残留物を３０００μｌの０．０５％ＴＦＡを含む９５：５の水／メタノールに溶かし、５００μｌに小分けしてＣ１８カラムでの分取クロマトグラフィー（２５０×２１．２ｍｍ、Ｌｕｎａ ＲＰ−１８、１０μｍ、１００オングストローム）で精製した。溶媒Ａ：水（０．０５％ＴＦＡ含有）、溶媒Ｂ：メタノール（０．０５％ＴＦＡ含有）；勾配：０分 ５％Ｂ；５分 ５％Ｂ；２０分 １００％Ｂ；２５分 １００％Ｂ；２７分 ５％Ｂ；３５分 ５％Ｂ；流速３０ｍｌ／分。保持時間が１３．４〜１３．９分の画分を集め、溶媒を蒸発させて無色の固体として７５．５２ｍｇ（８９％）ＨＤＰ３０．０１３４を得た。

【0084】

ＨＲ−ＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１０１８．４６７４９ Ｃ₄₅Ｈ₆₈Ｎ₁₁Ｏ₁₄Ｓについて１０１８．４６６７９［Ｍ＋Ｈ］⁺

【0085】

１．３ ６´−（６−（スクシンイミジルオキシ−カルボニル）−アミノヘキシル−α−アマニチン ＨＤＰ３０．０６４３の合成

【化7】

ＨＤＰ３０．０１３４（１６０．５２ｍｇ、１４１．７８μｍｏｌ）を１０００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、４０００μｌの乾燥ＤＭＦ中の３６３．１９ｍｇ（１０当量）のＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（ＤＳＣ）を一度に加えた後、３９．３μｌ（２当量）トリエチルアミンを加え、混合物を室温で撹拌した。３０分後、反応混合物を等量ずつ４０ｍｌの氷冷ＭＴＢＥが入った２つの遠心分離チューブに滴下して加えた。各々、結果として生じた沈殿物を遠心分離し、４０ｍｌのＭＴＢＥに再懸濁することで洗浄した。沈殿物を真空下で乾燥し、２４００μｌの０．０５％ＴＦＡ含有９５％メタノールに溶かして合わせた。４００μｌに小分けしてＣ１８カラムでの分取クロマトグラフィー（２５０×２１．２ｍｍ、Ｌｕｎａ ＲＰ−１８、１０μｍ、１００オングストローム）で精製した。溶媒Ａ：水（０．０５％ＴＦＡ含有）、溶媒Ｂ：メタノール（０．０５％ＴＦＡ含有）；勾配：０分 ５％Ｂ；５分 ５％Ｂ；２０分 １００％Ｂ；２５分 １００％Ｂ；２７分 ５％Ｂ；３５分 ５％Ｂ；流速３０ｍｌ／分。保持時間が１５．４〜１６．５分の画分を集め、溶媒を蒸発させ、残留物を８ｍｌのｔｅｒｔ‐ブタノールから凍結乾燥して、白色の粉末として１５１．４６ｍｇ（９２％）ＨＤＰ３０．０６４３を得た。

【0086】

ＭＳ（ＥＳＩ＋）１１５９．１［Ｍ＋Ｈ］⁺，１１８１．０［Ｍ＋Ｎａ］⁺

【0087】

１．４ 環状カルボネート誘導体 ＨＤＰ３０．１１６５の合成

【化8】

１０．２３ｍｇ（９．０４μｍｏｌ）のＨＤＰ３０．０１３４を５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、乾燥ＤＭＦ中の４５２μｌ（１０当量）のＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（ＤＳＣ）の０．２Ｍ溶液を一度に加えた。トリエチルアミン（２．５１μｌ、２当量）を加え、混合物を室温で９０分間撹拌した。その後続いて、揮発性物質を浴温４０℃にて真空下で除去した。残留物を５００μｌの０．０５％ＴＦＡ含有９５％メタノールに溶かし、Ｃ１８カラムでの分取クロマトグラフィー（２５０×２１．２ｍｍ、Ｌｕｎａ ＲＰ−１８、１０μｍ、１００オングストローム）で精製した。溶媒Ａ：水（０．０５％ＴＦＡ）、溶媒Ｂ：メタノール（０．０５％ＴＦＡ）；勾配：０分 ５％Ｂ；５分 ５％Ｂ；２０分 １００％Ｂ；２５分 １００％Ｂ；２７分 ５％Ｂ；３５分 ５％Ｂ；流速３０ｍｌ／分。保持時間が１５．４〜１６．５分の画分を集め、溶媒を蒸発させ、残留物を２ｍｌのｔｅｒｔ‐ブタノールから凍結乾燥して、白色の粉末として９．０６ｍｇ（８５％）ＨＤＰ３０．１０６５を得た。

【0088】

ＭＳ（ＥＳＩ＋）１１８５．１０［Ｍ＋Ｈ］⁺，１２０７．０７［Ｍ＋Ｎａ］⁺

【0089】

１．５ ６´−Ｎ−Ｂｏｃ−（６−アミノヘキシル）−Ｓ−デオキシ−α−アマニチン ＨＤＰ３０．０７４１の合成

【化9】

２ｍｌのエタノール中のＨＤＰ３０．０１３２（１８．６４ｍｇ、１６．６７μｍｏｌ）の溶液にモリブデンヘキサカルボニル（５１ｍｇ、１１．６当量）を加え、混合物を密閉したチューブで７５℃に２５時間熱した。その後続いて、揮発性物質を真空下で除去し、残留物を２ｍｌのメタノールに溶かした。不溶物質を遠心分離によって除去し、上澄みを５００μｌに濃縮し、Ｃ１８カラムでの分取クロマトグラフィー（２５０×２１．２ｍｍ、Ｌｕｎａ ＲＰ−１８、１０μｍ、１００オングストローム）で精製した。溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：メタノール；勾配：０分 ５％Ｂ；５分 ５％Ｂ；２０分 １００％Ｂ；２５分 １００％Ｂ；２７分 ５％Ｂ；３５分 ５％Ｂ；流速３０ｍｌ／分。保持時間が１７．９〜１８．６分の画分を集め、溶媒を蒸発させて、無色の固体として１０．９５ｍｇ（６０％）のＨＤＰ３０．０７４１を得た。

【0090】

ＭＳ（ＥＳＩ＋）１１０２．３［Ｍ＋Ｈ］⁺，１１２４．５［Ｍ＋Ｎａ］⁺

【0091】

１．６ ６´−（６−アミノヘキシル）−Ｓ−デオキシ−α−アマニチン ＨＤＰ３０．０７４３の合成

【化10】

ＨＤＰ３０．０７４１（１０．９５ｍｇ、９．９３μｍｏｌ）を５００μｌのＴＦＡに溶かし、室温で２分間インキュベーションした。次に、揮発性物質を真空下で蒸発させ、２回の１ｍｌの乾燥トルエンとの共蒸発によって微量のＴＦＡを除去した。１２．３８ｍｇの粗生成物をさらに精製することなく次の工程に使用した。

【0092】

ＭＳ（ＥＳＩ＋）１００２．４［Ｍ＋Ｈ］⁺，１０２４．３［Ｍ＋Ｎａ］⁺

【0093】

１．７ ６´−（６−（スクシンイミジルオキシ−カルボニル）−アミノヘキシル−Ｓ−デオキシ−α−アマニチン ＨＤＰ３０．１０３３の合成

【化11】

ＨＤＰ３０．０７４３（１２．３８ｍｇ、１０．５１μｍｏｌ）を５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、乾燥ＤＭＦ中の５２５（１０当量）のＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（ＤＳＣ）の０．２Ｎ溶液を一度に加えた後、２．９１μｌ（２当量）のトリエチルアミンを加え、混合物を室温で撹拌した。３０分後、反応混合物を等量ずつ１０ｍｌの氷冷ＭＴＢＥが入った遠心分離チューブに滴下して加えた。結果として生じた沈殿物を遠心分離し、１０ｍｌのＭＴＢＥに再懸濁することで洗浄した。沈殿物を真空下で乾燥し、５００μｌの０．０５％ＴＦＡ含有９５％メタノールに溶かし、Ｃ１８カラムでの分取クロマトグラフィー（２５０×２１．２ｍｍ、Ｌｕｎａ ＲＰ−１８、１０μｍ、１００オングストローム）で精製した。溶媒Ａ：水（０．０５％ＴＦＡ含有）、溶媒Ｂ：メタノール（０．０５％ＴＦＡ含有）；勾配：０分 ５％Ｂ；５分 ５％Ｂ；２０分 １００％Ｂ；２５分 １００％Ｂ；２７分 ５％Ｂ；３５分 ５％Ｂ；流速３０ｍｌ／分。保持時間が１６．０〜１７．２分の画分を集め、溶媒を蒸発させ、残留物を３ｍｌのｔｅｒｔ‐ブタノールから凍結乾燥して、白色の粉末として１０．９３ｍｇ（９１％）のＨＤＰ３０．１０３３を得た。

【0094】

ＭＳ（ＥＳＩ＋）１１４３．３［Ｍ＋Ｈ］⁺

【0095】

１．８ 環状カルボネート誘導体 ＨＤＰ３０．１０３６の合成

【化12】

粗製ＨＤＰ３０．０７４３（１２．３８ｍｇ、９．９３μｍｏｌ）を５００μｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、乾燥ＤＭＦ中の４９７μｌ（１０当量）のＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（ＤＳＣ）の０．２Ｍ溶液を一度に加えた。トリエチルアミン（２．７５μｌ、２当量）を加え、混合物を室温で９０分間撹拌した。その後続いて、揮発性物質を真空下浴温４０℃で除去した。残留物を５００μｌの０．０５％ＴＦＡ含有９５％メタノールに溶かし、Ｃ１８カラムでの分取クロマトグラフィー（２５０×２１．２ｍｍ、Ｌｕｎａ ＲＰ−１８、１０μｍ、１００オングストローム）で精製した。溶媒Ａ：水（０．０５％ＴＦＡ）、溶媒Ｂ：メタノール（０．０５％ＴＦＡ）；勾配：０分 ５％Ｂ；５分 ５％Ｂ；２０分 １００％Ｂ；２５分 １００％Ｂ；２７分 ５％Ｂ；３５分 ５％Ｂ；流速３０ｍｌ／分。保持時間が１５．９〜１７．２分の画分を集め、溶媒を蒸発させ、残留物を３ｍｌのｔｅｒｔ‐ブタノールから凍結乾燥して、白色の粉末として１０．０６ｍｇ（８７％）ＨＤＰ３０．１０３６を得た。

【0096】

ＭＳ（ＥＳＩ＋）１１９１．０８［Ｍ＋Ｎａ］⁺

【0097】

実施例２ アマトキシン抗体複合体の合成−トラスツズマブと既活性化（pre-activated）アマトキシン−ＮＨＳ−カルバミン酸塩との結合
１．１ トラスツズマブ−３０．０６４３
１．１５ｍｇ ｍｇの既活性化アマトキシン−リンカー誘導体ＨＤＰ３０．０６４３を２３０μｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、３．３３ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中の６ｍｇ／ｍｌ抗体溶液に加えた。結果として得られた溶液を４℃で一晩振とうし、Sephadex G-25ゲル濾過（ＰＤ−１０カラム；ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）によって分けた。前もってＰＤ−１０カラムを５ｍｌのＰＢＳ溶液、ｐＨ＝７．４で６回洗浄した。複合体画分をブラッドフォード溶液によって検出し、合わせて１つの溶液にした。次に、その溶液を、Slide-A-Lyzerカセット（サーモサイエンティフィック；０．５〜３ｍｌ；２０，０００ＭＷＣＯ）で１ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して４℃で一晩透析した。タンパク質濃度をRotiQuantアッセイ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社；ドイツ）によって求めた。Amicon Ultra Centrifugal Filters 50,000MWCO（ミリポア；４０００ｒｐｍで遠心分離）でＡＤＣ濃度を増加させ、最終的に３ｍｇ／ｍｌに調整した。トラスツズマブのアマニチンペイロード（payload）は、Ａ＝２８０ｎｍ及びＡ＝３１０ｎｍでのＵＶ吸収を決定することによって求めた。

【0098】

１．２ トラスツズマブ−３０．１０３３
２．００ｍｇの既活性化アマトキシン−リンカー誘導体ＨＤＰ３０．１０３３を４００μｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、２．６２ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中の１０ｍｇ／ｍｌ抗体溶液に加えた。結果として得られた溶液を４℃で一晩振とうし、Sephadex G-25ゲル濾過（ＰＤ−１０カラム；ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）によって分けた。前もってＰＤ−１０カラムを５ｍｌのＰＢＳ溶液、ｐＨ＝７．４で６回洗浄した。複合体画分をブラッドフォード溶液によって検出し、合わせて１つの溶液にした。次に、その溶液を、Slide-A-Lyzerカセット（サーモサイエンティフィック；０．５〜３ｍｌ；２０，０００ＭＷＣＯ）で１ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して４℃で一晩透析した。タンパク質濃度をRotiQuantアッセイ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社；ドイツ）によって求めた。Amicon Ultra Centrifugal Filters 50,000MWCO（ミリポア；４０００ｒｐｍで遠心分離）でＡＤＣ濃度を増加させ、最終的に３ｍｇ／ｍｌに調整した。トラスツズマブのアマニチンペイロードは、Ａ＝２８０ｎｍ及びＡ＝３１０ｎｍでのＵＶ吸収を決定することによって求めた。

【0099】

１．３ トラスツズマブ−３０．１０３６
２．００ｍｇの既活性化アマトキシン−リンカー誘導体ＨＤＰ３０．１０３６を４００μｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、２．５７ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中の１０ｍｇ／ｍｌ抗体溶液に加えた。結果として得られた溶液を４℃で一晩振とうし、Sephadex G-25ゲル濾過（ＰＤ−１０カラム；ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）によって分けた。前もってＰＤ−１０カラムを５ｍｌのＰＢＳ溶液、ｐＨ＝７．４で６回洗浄した。複合体画分をブラッドフォード溶液によって検出し、合わせて１つの溶液にした。次に、その溶液を、Slide-A-Lyzerカセット（サーモサイエンティフィック；０．５〜３ｍｌ；２０，０００ＭＷＣＯ）で１ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して４℃で一晩透析した。タンパク質濃度をRotiQuantアッセイ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社；ドイツ）によって求めた。Amicon Ultra Centrifugal Filters 50,000MWCO（ミリポア；４０００ｒｐｍで遠心分離）でＡＤＣ濃度を増加させ、最終的に３ｍｇ／ｍｌに調整した。トラスツズマブのアマニチンペイロードは、Ａ＝２８０ｎｍ及びＡ＝３１０ｎｍでのＵＶ吸収を決定することによって求めた。

【0100】

１．４ トラスツズマブ−３０．１１６５
0.90ｍｇの既活性化アマトキシン−リンカー誘導体ＨＤＰ30.1165を１８０μｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、２．００ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中の５ｍｇ／ｍｌ抗体溶液に加えた。結果として得られた溶液を４℃で一晩振とうし、Sephadex G-25ゲル濾過（ＰＤ−１０カラム；ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス）によって分けた。前もってＰＤ−１０カラムを５ｍｌのＰＢＳ溶液、ｐＨ＝７．４で６回洗浄した。複合体画分をブラッドフォード溶液によって検出し、合わせて１つの溶液にした。次に、その溶液を、Slide-A-Lyzerカセット（サーモサイエンティフィック；０．５〜３ｍｌ；２０，０００ＭＷＣＯ）で１ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して４℃で一晩透析した。タンパク質濃度をRotiQuantアッセイ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社；ドイツ）によって求めた。Amicon Ultra Centrifugal Filters 50,000MWCO（ミリポア；４０００ｒｐｍで遠心分離）でＡＤＣ濃度を増加させ、最終的に３ｍｇ／ｍｌに調整した。トラスツズマブのアマニチンペイロードは、Ａ＝２８０ｎｍ及びＡ＝３１０ｎｍでのＵＶ吸収を決定することによって求めた。

【表1】

【0101】

実施例３ インビトロでのＨＥＲ２陽性腫瘍細胞株に対するＨｅｒ−３０．０６４３［４．４］、Ｈｅｒ−３０．１０３３［３．９］、Ｈｅｒ−３０．１０３６［４．０］、及びＨｅｒ−３０．１１６５［５．０］の細胞毒性
ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞株ＳＫ−ＯＶ−３（卵巣がん）、ＳＫＢＲ−３（乳癌）、及びＪＩＭＴ−１（乳癌）、並びに化学発光ＢｒｄＵ取り込みアッセイ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて、トラスツズマブ−アマトキシン複合体の細胞毒性活性をインビトロで評価した。異なる濃度の複合体と３７℃、５％ＣＯ₂で７２時間インキュベーションした後、、固定して透過性にした細胞を抗−ＢｒｄＵ−ＨＲＰ抗体を用いてBMG Labtech Optimaマイクロプレートリーダーで測定することによって細胞生存度を決定した。用量反応曲線のＥＣ₅₀値を、グラフパッドプリズム４．０ソフトウェアで計算した。

【0102】

異なるＨｅｒ２陽性細胞株におけるトラスツズマブ−アマトキシン複合体のＥＣ₅₀値（図２〜５も参照されたい）：

【表2】

【0103】

実施例４ トラスツズマブ抵抗性ＪＩＭＴ−１異種移植片モデルにおけるＨｅｒ−３０．０６４３［４．４］及びＨｅｒ−３０．１０３６［４．０］の生体内有効性
６週齢の無傷（intact）の雌ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウスを購入（Ｊａｎｖｉｅｒ社）し、無作為に各群８頭ずつ３群に分けた。５×１０⁶個のＪＩＭＴ−１細胞を各マウスの側面に皮下注射した。腫瘍接種後１４日目に、トラスツズマブ−アマトキシン複合体Ｈｅｒ−３０．０６４３［４．４］及びＨｅｒ−３０．１０３６［４．０］をアマニチンにして３０μｇ／ｋｇ及び１５０μｇ／ｋｇの投与量で１回静注した。一方、陰性対照には媒体（ＰＢＳバッファー）を注射した。腫瘍体積を記録した（図６を参照）。両複合体はともに抗腫瘍活性を示し、３０μｇ及び１５０μｇ／ｋｇで完全な腫瘍の減少をもたらした。

【0104】

実施例５ マウスにおけるＨｅｒ−３０．０６４３［４．４］及びＨｅｒ−３０．１０３６［４．０］の忍容性
７週齢の無傷の雌ＮＭＲＩ ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウスを購入（Ｊａｎｖｉｅｒ社）し、無作為に１群当たり３頭の３群に分けた。ハーセプチン−アマトキシン複合体Ｈｅｒ−３０．０６４３［４．４］及びＨｅｒ−３０．１０３６［４．０］を投与量３００μｇ／ｋｇで１回静注した。一方、陰性対照には媒体（ＰＢＳバッファー）を注射した。マウスの体重を記録した（図７を参照）。Ｈｅｒ−３０．０６４３［４．４］で処置した動物は全て、適用後９日以内に死亡した。一方、Ｈｅｒ−３０．１０３６［４．０］で処置した動物は全て、１４日後、陰性対照群と同等の体重を示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】