特許 6321857 糖カルボン酸の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6321857

(24)【登録日】2018年4月13日

(45)【発行日】2018年5月9日

(54)【発明の名称】糖カルボン酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/02 20060101AFI20180423BHJP

   C12P 19/12 20060101ALI20180423BHJP

   C12P 19/04 20060101ALI20180423BHJP

   C12N 9/08 20060101ALN20180423BHJP

   C12N 9/24 20060101ALN20180423BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/02

   C12P19/12

   C12P19/04 Z

   !C12N9/08

   !C12N9/24

【請求項の数】7

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2017-97923(P2017-97923)

(22)【出願日】2017年5月17日

【審査請求日】2017年5月29日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】591014097

【氏名又は名称】サンエイ糖化株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100131705

【弁理士】

【氏名又は名称】新山 雄一

(72)【発明者】

【氏名】深見 健

【審査官】 小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０１６０４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／０５６８１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−２２３７７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−２４３９６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００１−２７５６６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−２９１１９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−０８４０７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biotechnol. Bioeng.，２０１０年，Vol. 68, No. 2，p. 231-237

【文献】 Eur. J. Biochem.，２００１年，Vol. 268，p. 1136-1142

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １９／００ − １９／６４

Ｃ１２Ｎ ９／０８ − ９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の澱粉分解物又は転移反応物の還元末端側のアルデヒド基が酸化された糖カルボン酸の製造方法であって、
糖質酸化時に過酸化水素を副生する糖質酸化酵素剤を、カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）に対する糖化活性（Ｂ）の含有比率（Ｂ／Ａ）が０．００００２以上０．００５以下であるカタラーゼ製剤の存在下、前記澱粉分解物或いは転移反応物を含む原料基質に作用させる工程を含み、
前記カタラーゼ製剤は、その糖化活性が前記原料基質中の還元糖量に対して０．９ｕ／ｇ以下である量で存在する方法。

【請求項2】

還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の澱粉分解物又は転移反応物の還元末端側のアルデヒド基が酸化された糖カルボン酸の製造方法であって、
糖質酸化時に過酸化水素を副生する糖質酸化酵素剤を、カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）に対する糖化活性（Ｂ）の含有比率（Ｂ／Ａ）が０．００５以下でありかつ糖化活性（Ｂ）が０．１ｕ／ｍｌ以上であるカタラーゼ製剤の存在下、前記澱粉分解物或いは転移反応物を含む原料基質に作用させる工程を含み、
前記カタラーゼ製剤は、その糖化活性が前記原料基質中の還元糖量に対して０．９ｕ／ｇ以下である量で存在する方法。

【請求項3】

前記糖カルボン酸は、マルトビオン酸を除く請求項１又は２記載の方法。

【請求項4】

前記糖質酸化酵素剤の添加量は、前記原料基質中の還元糖量に対して１ｕ／ｇ以上３０ｕ／ｇ以下である請求項１から３いずれか記載の方法。

【請求項5】

カタラーゼ製剤は、そのカタラーゼ活性が前記原料基質中の還元糖量に対して４０ｕ／ｇ以上１０００ｕ／ｇ以下である量で存在する請求項１から４いずれか記載の方法。

【請求項6】

前記カタラーゼ製剤は、その糖化活性が前記原料基質中の還元糖量に対して０．００００８ｕ／ｇ以上である量で存在する請求項１から５いずれか記載の方法。

【請求項7】

前記作用工程における前記澱粉分解物或いは転移反応物の濃度が１０％（ｗ／ｗ）以上である請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の澱粉分解物又は転移反応物の還元末端側のアルデヒド基が酸化された糖カルボン酸、その塩類及びそのラクトンを製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

グルコースの還元末端を酸化することで得られるアルドン酸の一つであるグルコン酸は、単糖でありながらビフィズス菌増殖選択性を持つ機能性等を有しているだけでなく、カルシウムなどの無機カチオンと安定な塩を形成する特徴を持つことから、ミネラル補強剤として利用されている。しかしながら溶液安定性が悪く、高濃度下で保存すると析出してしまう欠点があった。

【0003】

これら欠点を補う素材として、グルコン酸の非還元末端側にグルコースが結合したマルトビオン酸などの糖カルボン酸が挙げられる。糖カルボン酸であるマルトビオン酸においても無機カチオンと安定な塩を形成するが、溶解性が良好であり、高濃度条件で保存しても析出しない特徴を有している。このように二糖類以上の糖質の還元末端を酸化することで、多くの機能性物質が得られることが期待される。

【0004】

特許文献１及び２には、重合度２のマルトース、ラクトースやセロビオースなどを酸化する手法として、アシネトバクター属、ブルクホルデリア属、グルコノバクター属やアセトバクター属などの微生物を用いた方法が開示されている。また、重合度４以上の澱粉分解物を酸化する酵素的な手法として、Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ属に属する微生物由来の糖質酸化酵素製剤や、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物由来の糖質酸化酵素製剤を用いる手法が知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２００１−２４５６５７号公報

【特許文献2】特開２００７−０２８９１７号公報

【特許文献3】特許第４４１７５５０号公報

【特許文献4】特許第３３１０００８号公報

【特許文献5】国際公開ＷＯ２０１４／０４２２３７号パンフレット

【特許文献6】特許第３９１０２１３号公報

【特許文献7】特表２０００−５０２９０４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

特許文献３〜５の糖質酸化酵素は、糖質を酸化する反応で副生成分として過酸化水素を生成する。過酸化水素は、殺菌や漂白剤として使用されるなど、タンパク質を変性させる力があり、糖質酸化時に副生する過酸化水素が、糖質酸化酵素を変性失活させてしまう。このため、糖質酸化酵素を用いて工業的に安定且つ効率的に重合度２以上の澱粉分解物および転移反応物を酸化するためには、過酸化水素の速やかな分解が必要となる。

【0007】

特許文献６や７のグルコースオキシダーゼ製剤においても、グルコースをグルコン酸へ酸化する過程で過酸化水素が発生する。副生する過酸化水素を速やかに分解する生産技術としてカタラーゼ製剤を使用することが記載されている。

【0008】

重合度２以上の澱粉分解物や転移反応物を酸化する場合においても、糖質酸化酵素と一緒に、カタラーゼ製剤を添加すると、糖質酸化時に副生する過酸化水素を速やかに分解することが出来る。しかしながら、原因は不明ではあるが、重合度２以上の酸化物を高収率で安定して生産することができない。

【0009】

本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、酸化反応で副生する過酸化水素を速やかに分解するカタラーゼ製剤を用い、かつ、高収率で、重合度２以上の澱粉分解酸化物或いは転移反応酸化物で糖カルボン酸を工業的に生産する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、原料となる重合度２以上の澱粉分解物や転移反応物が、カタラーゼ製剤中に含まれる夾雑酵素であるα−グルコシダーゼやグルコアミラーゼ等の澱粉分解酵素により加水分解されることが、重合度２以上の糖酸化物の生産を不安定化あせる原因であることを発見した。酵素法によるグルコン酸製造では、原料であるグルコースは単糖であるためカタラーゼ製剤中の夾雑酵素による加水分解を考慮する必要がないこととは対照的である。この発見に基づき、夾雑酵素である澱粉分解酵素を所要以下となるように調製したカラターゼ製剤を用いることで、重合度２以上の澱粉分解物或いはその転移反応物の酸化物を安定的に得る方法を見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。

【0011】

（１） 還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の澱粉分解物又は転移反応物の還元末端側のアルデヒド基が酸化された糖カルボン酸の製造方法であって、
糖質酸化時に過酸化水素を副生する糖質酸化酵素剤を、カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）に対する糖化活性（Ｂ）の含有比率（Ｂ／Ａ）が０．００００２以上０．００５以下であるカタラーゼ製剤の存在下、前記澱粉分解物或いは転移反応物を含む原料基質に作用させる工程を含み、
前記カタラーゼ製剤は、その糖化活性が前記原料基質中の還元糖量（ｗｔ％）に対して０．９ｕ／ｇ以下である量で存在する方法。

【0012】

（２） 還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の澱粉分解物又は転移反応物の還元末端側のアルデヒド基が酸化された糖カルボン酸の製造方法であって、
糖質酸化時に過酸化水素を副生する糖質酸化酵素剤を、カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）に対する糖化活性（Ｂ）の含有比率（Ｂ／Ａ）が０．００５以下でありかつ糖化活性（Ｂ）が０．１ｕ／ｍｌ以上であるカタラーゼ製剤の存在下、前記澱粉分解物或いは転移反応物を含む原料基質に作用させる工程を含み、
前記カタラーゼ製剤は、その糖化活性が前記原料基質中の還元糖量（ｗｔ％）に対して０．９ｕ／ｇ以下である量で存在する方法。

【0013】

（３） 前記糖質酸化酵素剤の添加量は、前記原料基質中の還元糖量（ｗｔ％）に対して１ｕ／ｇ以上３０ｕ／ｇ以下である（１）又は（２）記載の方法。

【0014】

（４） カタラーゼ製剤は、そのカタラーゼ活性が前記原料基質中の還元糖量（ｗｔ％）に対して４０ｕ／ｇ以上１０００ｕ／ｇ以下である量で存在する（１）から（３）いずれか記載の方法。

【0015】

（５） 前記カタラーゼ製剤は、その糖化活性が前記原料基質中の還元糖量（ｗｔ％）に対して０．００００８ｕ／ｇ以上である量で存在する（１）から（４）いずれか記載の方法。

【0016】

（６） 前記作用工程における前記澱粉分解物或いは転移反応物の濃度が１０％（ｗ／ｗ）以上である（１）から（５）のいずれかに記載の製造方法。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、食品、医薬や工業分野等において、ミネラル成分を可溶させる素材等として有用である糖カルボン酸を収率よく製造することができる。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略する場合があるが、発明の要旨を限定するものではない。

【0019】

本発明の一実施形態は、糖質酸化時に過酸化水素を副生する糖質酸化酵素剤を、カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）に対する糖化活性（Ｂ）の含有比率（Ｂ／Ａ）が０．００００２以上０．００５以下であるカタラーゼ製剤の存在下、前記澱粉分解物或いは転移反応物を含む原料基質に作用させる工程を含み、
前記カタラーゼ製剤は、その糖化活性が前記原料基質中の還元糖量（ｗｔ％）に対して０．９ｕ／ｇ以下である量で存在する方法である。

【0020】

本発明の別の実施形態は、還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の澱粉分解物又は転移反応物の還元末端側のアルデヒド基が酸化された糖カルボン酸の製造方法であって、
糖質酸化時に過酸化水素を副生する糖質酸化酵素剤を、カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）に対する糖化活性（Ｂ）の含有比率（Ｂ／Ａ）が０．００５以下でありかつ糖化活性（Ｂ）が０．１ｕ／ｍｌ以上であるカタラーゼ製剤の存在下、前記澱粉分解物或いは転移反応物を含む原料基質に作用させる工程を含み、
前記カタラーゼ製剤は、その糖化活性が前記原料基質中の還元糖量（ｗｔ％）に対して０．９ｕ／ｇ以下である量で存在する方法である。

【0021】

例えば、還元末端にグルコース残基を有する澱粉分解物である、重合度２のマルトースを原料として場合、糖質酸化時に過酸化水素を副生する糖質酸化酵素剤を作用させることにより、マルトビオン酸と過酸化水素が生成するが、副生する過酸化水素が、酸化酵素を変性失活させてしまう。このため、高収率でマルトビオン酸を製造するためには、過酸化水素を速やかに分解するカタラーゼ製剤を添加する必要がある。

【0022】

（カタラーゼ製剤）
本発明で言うカタラーゼ製剤とは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属や、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属などの微生物由来のカタラーゼ製剤などが挙げられ、具体的には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｒ又はＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ由来のカタラーゼ製剤が挙げられる。また、副活性としてカタラーゼ活性を有する市販のグルコースオキシダーゼ製剤を選択して用いることも含まれる。

【0023】

本発明のカタラーゼ製剤中には、グルコアミラーゼやα‐グルコシダーゼなどの糖化活性を持つ夾雑酵素が多く混在していると、糖カルボン酸の原料となる還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の澱粉分解物又は転移反応物や、これら原料を酸化した糖カルボン酸が分解されてしまい、安定的な品質の糖カルボン酸の製造が不可能となる。

【0024】

このため本発明では、マルトビオン酸等の糖カルボン酸を高収率で安定生産するために、カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）に対する糖化活性の含有比率（Ｂ／Ａ）が０．００５以下であるカタラーゼ製剤を用いる。好ましくは、Ｂ／Ａは、０．００４５以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１５以下、０．００１以下、０．０００５以下、０．０００４以下である。

【0025】

本発明で用いるカタラーゼ製剤は、工業的に糖カルボン酸を製造する観点で、試薬のように高度に精製されたカタラーゼ酵素のみからなるものではなく、むしろ許容範囲内での夾雑酵素を含む。具体的に、Ｂ／Ａは０．００００２以上であることが好ましく、具体的には０．０００１以上、０．０００２以上、０．０００３以上、０．０００４以上であってよい。カタラーゼ製剤がこの程度の比率で糖化活性を有していても、糖化反応に比べて糖質酸化の主反応が速やかに進むため、収率低下につながりにくい。

【0026】

本発明においては、試験例４の比較例５に示したようにカタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）に対する糖化活性（Ｂ）の含有比率（Ｂ／Ａ）が０．００５以下であっても、原料糖質に対してカタラーゼ製剤を多めに添加すると、カタラーゼ製剤中の夾雑酵素が原料基質を加水分解し、マルトビオン酸等の糖カルボン酸が想定している組成のものが得られない場合がある。このためカタラーゼ製剤中の糖化活性が、原料基質中の還元糖量（固形分当たりｗｔ％）に対して０．９ｕ／ｇ以下（好ましくは、０．８ｕ／ｇ以下、０．７ｕ／ｇ以下、０．６５ｕ／ｇ以下）となるようにカタラーゼ製剤を作用させる必要がある。

【0027】

カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）は、５０００ｕ／ｍｌ以上であることが好ましく、具体的には１００００ｕ／ｍｌ以上、１５０００ｕ／ｍｌ以上、２００００ｕ／ｍｌ以上、２２５００ｕ／ｍｌ以上であってよい。高いカタラーゼ活性を有すると、糖化活性がある程度高くても、収率に与える影響を小さくとどめやすい。

【0028】

カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）は、５０００００ｕ／ｍｌ以下であることが好ましく、具体的には、２５０００００ｕ／ｍｌ以下、１５００００ｕ／ｍｌ以下、１０００００ｕ／ｍｌ以下、７５０００ｕ／ｍｌ以下であってよい。本発明で用いられるカタラーゼ製剤は糖化活性が低いので、過大なカタラーゼ活性を有しなくても、収率に与える影響を小さくとどめやすい。

【0029】

カタラーゼ製剤中の糖化活性（Ｂ）は、２５０ｕ／ｍｌ以下であることが好ましく、具体的には、１００ｕ／ｍｌ以下、５０ｕ／ｍｌ以下、３０ｕ／ｍｌ以下、２５ｕ／ｍｌ以下であってよい。

【0030】

他方、カタラーゼ製剤中の糖化活性（Ｂ）は、許容範囲内で有してよく、０．１ｕ／ｍｌ以上であることが好ましく、具体的には０．５ｕ／ｍｌ以上、１．０ｕ／ｍｌ以上、１．５ｕ／ｍｌ以上、２．０ｕ／ｍｌ以上であってよい。この程度の糖化活性が存在しても、糖化反応に比べて糖質酸化の主反応が速やかに進むため、収率低下につながりにくい。

【0031】

カタラーゼ製剤中の糖化活性は、許容範囲内で有してよく、具体的には原料基質中の還元糖量（固形分当たりｗｔ％）に対して、０．００００８ｕ／ｇ以上、好ましくは０．０００５ｕ／ｇ以上、０．００１ｕ／ｇ以上、０．００１５ｕ／ｇ以上であってよい。この程度の糖化活性が存在しても、糖化反応に比べて糖質酸化の主反応が速やかに進むため、収率低下につながりにくい。

【0032】

また、マルトビオン酸等の糖カルボン酸製造にあたり、前記カタラーゼ製剤は、原料基質中の還元糖量（固形分当たり）に対して４０ｕ／ｇ以上１０００ｕ／ｇ以下で存在するのが好ましく、より好ましくは、６０ｕ／ｇ以上５００ｕ／ｇ以下で存在する。本発明では、カタラーゼ製剤中の糖化活性が低く抑えられているため、過酸化水素による糖質酸化酵素の分解を抑制するのに十分な量のカタラーゼ製剤を使っても収率低下を招きにくい。また、糖化活性による原料となる重合度２以上の澱粉分解物や転移反応物の分解が抑制され、ある程度の時間をかけて糖質酸化反応を行っても収率低下を招きにくいので、過剰なカタラーゼ活性を必要としない。

【0033】

本発明のカタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性は、次のようにして測定する。
酵素反応後の残存過酸化水素をチオ硫酸ナトリウムで滴定する方法に従う（小崎道雄監修「酵素利用ハンドブック」、地人書館昭和６０年版、ｐ４０４〜４１０）。すなわち、市販の３０重量％過酸化水素を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で８００倍に希釈した基質溶液５ｍｌを容器にとり、３０℃の恒温水槽に１５分入れ恒温とする。これに３０℃に保温した検体酵素液１ｍｌを加え、正確に５分後に０．５Ｎ硫酸２ｍｌを加えよく振り混ぜ酵素作用を止める。これに１０重量％ヨウ化カリウム溶液１ｍｌと１％モリブデン酸アンモニウム１滴及び指示薬として０．５％デンプン試薬５滴を加え、この溶液を撹拌しながら、０．００５Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液（定量用）で滴定し、ブランクは試料の代わりに水１ｍｌを添加し、ブランクの値から検体の値を差し引いてカタラーゼ作用によって分解された過酸化水素の量を算出し、標準曲線から検体酵素液のカタラーゼ活性を求める。なお、１Ｕは１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を分解する活性を示している。
カタラーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）＝Ａ×ｎ
ｎ：希釈倍率
Ａ：標準曲線のグラフよりｙ＝（Ｔ₀−Ｔ_S）×２４.１８／Ｔ₀×２．５×ｆのｘ軸の値Ａを求める
ｆ：０．００５Ｎチオ硫酸ナトリウムのファクター
Ｔ₀：ブランクの滴定値（ｍｌ）
Ｔ_S：サンプルの滴定値（ｍｌ）
２４.１８／Ｔ₀：初発基質濃度による活性測定変化に対する補正値
２．５：０．００５Ｎチオ硫酸ナトリウム溶液１ｍｌは過酸化水素２．５μｍｏｌに相当

【0034】

本発明で定義する糖化活性とは、グルコアミラーゼ活性とα−グルコシダーゼ活性により澱粉分解物が加水分解されグルコースを遊離する力であり、本発明の糖化活性は、基質の４−ニトロフェニルβ−マルトシド（Ｇ２−β−ＰＮＰ）より、１分間に１μｍｏｌのＰＮＰを遊離する活性を１Ｕと定義することができる。

【0035】

カタラーゼ製剤中の糖化活性は、カタラーゼ製剤を４−ニトロフェニルβ−マルトシドと反応させて４−ニトロフェニルβ−グルコシドを生成させ、それをβ-グルコシダーゼによって分解して４−ニトロフェノールを生成させ、４−ニトロフェノールを定量することにより測定される。具体的には、キッコーマン社製の糖化力測定キット或いは糖化力分別定量キットなどを利用して、カタラーゼ製剤中の糖化活性を測定する。

【0036】

（キッコーマン社製の糖化力測定キットを使用した糖化力活性の測定）
キッコーマン社製の糖化力測定キットを使用する場合、４−ニトロフェニルβ−マルトシドを含有する基質溶液０．５ｍｌにβ−グルコシダーゼを含有する酵素溶液０．５ｍｌを混ぜ、３７℃で５分間予備加温を行った後、測定試料０．１ｍｌを加え、混合して３７℃で１０分間反応させる。反応停止は、炭酸ナトリウムを含有する酵素停止液２ｍｌを加え混合する。反応終了後の液を波長400nmで定量することにより糖化力を測定し、以下の計算式より活性を算出する。
糖化力活性 （Ｕ／ｍｌ）＝（Ｅｓ−Ｅｂ）× ０．１７１×ｎ
Ｅｓ：測定試料の吸光度
Ｅｂ：ブランクの吸光度
ｎ：酵素液の希釈倍率

【0037】

（糖質酸化酵素製剤）
本発明で言う糖質酸化酵素製剤とは、還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の糖質を酸化し、副生成分として過酸化水素を発生するものをいう。Ｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ属に属する微生物由来の糖質酸化酵素製剤や、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属する微生物由来の糖質酸化酵素製剤などが挙げられ、具体的には、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに由来する糖質酸化酵素などが挙げられる。

【0038】

マルトビオン酸等の糖カルボン酸製造にあたり糖質酸化酵素は、原料基質中の還元糖量（ｗｔ％）に対して１ｕ／ｇ以上３０ｕ／ｇ以下が好ましく、より好ましくは、２ｕ／ｇ以上２０ｕ／ｇ以下で作用させる。本発明では、カタラーゼ製剤による過酸化水素の分解が十分になされるので、副生される過酸化水素の増加にかかわらず、糖質酸化反応を十分な速度で行うことができる。また、糖化活性による原料となる重合度２以上の澱粉分解物や転移反応物の分解が抑制され、ある程度の時間をかけて糖質酸化反応を行っても収率低下を招きにくいので、過剰な量の糖質酸化酵素を必要としない。

【0039】

本発明の糖質酸化酵素の酵素活性は、次のようにして測定する。
０．１５％（ｗ／ｖ）フェノール及び０．１５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００を含む０．１Ｍリン酸一カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌ、１０％マルトース一水和物溶液０．５ｍｌ、２５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ溶液０．５ｍｌ、及び０．４％（ｗ／ｖ）４−アミノアンチピリン溶液０．１ｍｌを混合し、３７℃で１０分保温後、酵素溶液０．１ｍｌを添加し、反応を開始した。酵素反応進行と共に、波長５００ｎｍにおける吸光度の増加を測定することにより糖質酸化活性を測定した。なお、ブンランクには０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用し、１分間に１μｍｏｌのマルトース一水和物を酸化するのに必要な酵素量を１単位とし、以下の計算式より活性を算出する。
マルトース酸化活性 （Ｕ／ｍｌ）
＝｛（Ａ５−Ａ２）−（Ａｂ５−Ａｂ２）｝× ２．２１８ ×ｎ
Ａ２， Ａ５ ： 反応開始後、２分後および５ 分後の吸光度 (検体)
Ａｂ２， Ａｂ５ ： 反応開始後、２ 分後および5 分後の吸光度 (ブランク)
ｎ：酵素液の希釈倍率

【0040】

（原料糖質）
本発明において原料に用いる糖質は、還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の澱粉分解物或いは転移反応物であり、マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトヘキサオース、パノース、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、水飴、粉飴、デキストリン、分岐デキストリン、イソマルトデキストリン等が挙げられる。

【0041】

糖カルボン酸生産時の原料糖質の濃度は、精製工程での濃縮等を考慮すると１０〜５０（ｗｔ）％が好ましく、２０〜４０（ｗｔ）％がより好ましい。なお、本明細書において、「（ｗｔ）％」は、対象成分の含有量（質量）を意味し、ここでは、液体中における糖質の含有量を意味する。

【0042】

（反応温度と反応ｐＨ）
糖質酸化酵素とカタラーゼの反応工程での反応温度は、例えば２０〜６０℃程度の条件下で行うのが好ましく、より好ましくは、２５〜４０℃の範囲である。

【0043】

反応ｐＨは４〜１０程度の条件下で行うのが好ましく、より好ましくはｐＨ５〜８の範囲である。また、糖カルボン酸が生成する過程で、反応ｐＨが低下するため、反応液に中和剤を添加調整する必要がある。中和剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、酸化カルシウムなどが挙げられる。

【0044】

また、本発明の酸化反応では、酸素が必要となるため、空気や酸素を通気撹拌することで、反応溶液中の溶存酸素量を維持することが好ましい。

【0045】

（糖カルボン酸）
本発明方法を使用して調製される糖カルボン酸は、重合度２以上、好ましくは重合度４以上の澱粉分解物又は転移反応物の還元末端側のアルデヒド基が酸化されたものであれば、特に限定されない。澱粉分解物又は転移反応物の重合度は、例えば、２〜１００、好ましくは４〜１００等であってもよい。より具体的には、糖カルボン酸は、より具体的には、マルトデキストリン酸化物、粉飴酸化物、水飴酸化物、マルトヘキサオン酸、マルトテトラオン酸、マルトトリオン酸、マルトビオン酸、イソマルトデキストリン酸化物、パノース酸化物、イソマルトトリオン酸、イソマルトビオン酸、ニゲロビオン酸、コージビオン酸などが挙げられる。これらのうち、糖カルボン酸は、遊離の酸であってもよく、ラクトンであってもよく、その塩類であってもよい。

【0046】

糖カルボン酸の塩としては、特に限定されないが、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩等が挙げられる。

【0047】

糖カルボン酸への酸化反応は、還元糖量の減少から確認することができ、例えばネルソン・ソモギ法による比色定量法を用いることが出来る。

【0048】

また、ＨＰＬＣにより原料糖質や糖カルボン酸を分析することで確認することも可能である。例えば、マルトースを原料に酸化反応を行った後、ＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法（パルスドアンペロメトリー検出器、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム）により、溶出：３５℃、１．０ｍｌ／ｍｉｎ、水酸化ナトリウム濃度：１００ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−０ｍＭ、２分−０ｍＭ、２０分−２０ｍＭの条件で測定すれば、マルトース、マルトビオン酸を定量することが可能である。

【0049】

本発明方法を使用して調製した糖カルボン酸は、飲食物や化粧品、医薬品、化成品等へ使用することが可能である。

【実施例】

【0050】

（試験例１） カタラーゼ製剤Ａによるマルトビオン酸生産への影響
バッフル付きの三角フラスコへ、マルトース（和光純薬製）９ｇを蒸留水へ溶解させ３０ｇ（３０ｗｔ％）とした後、炭酸カルシウム（和光純薬製）１．５ｇと、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来糖質酸化酵素製剤（糖質酸化活性３００ｕ／ｍｌ）１２０μｌ（３６ｕ、４ｕ／ｇ基質）と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のカタラーゼ製剤Ａ（カタラーゼ活性７５０６０ｕ／ｍｌ、糖化活性２４．８ｕ／ｍｌ、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．０００３３）０〜４５００Ｕ（０〜５００ｕ／ｇ基質）を加え、３０℃、２００ｒｐｍで振盪反応を行いマルトビオン酸の生産効率への影響を評価した。

【0051】

反応組成中のマルトビオン酸量は、ＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法（パルスドアンペロメトリー検出器、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム）により、溶出：３５℃、１．０ｍｌ／ｍｉｎ、水酸化ナトリウム濃度：１００ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−０ｍＭ、２分−０ｍＭ、２０分−２０ｍＭの条件で分析した。

【0052】

【表1】

【0053】

評価の結果、比較例１のカタラーゼ無添加では、マルトビオン酸への変換率は２５％に留まった。これに対し、所定のカタラーゼ製剤を適量で用いた実施例１〜６では、マルトビオン酸へ９０％以上変換することができた。

【0054】

（試験例２） カタラーゼ製剤Ａによるデキストリン酸化物生産への影響
バッフル付きの三角フラスコへ、デキストリン（商品名ＮＳＤ７００，サンエイ糖化社製）９ｇを蒸留水へ溶解させ３０ｇ（３０ｗｔ％）とした後、炭酸カルシウム（和光純薬製）０．７５ｇ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来糖質酸化酵素製剤（糖質酸化活性３００ｕ／ｍｌ）６０μｌ（１８ｕ、２ｕ／ｇ基質）と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のカタラーゼ製剤Ａ（カタラーゼ活性７５０６０ｕ／ｍｌ、糖化活性２４．８ｕ／ｍｌ、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．０００３３）０〜９０００Ｕ（０〜３００ｕ／ｇ基質）を加え、３０℃、２００ｒｐｍで振盪反応を行いデキストリンの酸化効率への影響を評価した。酸化率は、反応液の還元糖量をネルソン・ソモギ法で定量し、次式により変換率を算出した。
（反応開始前還元糖量−反応液還元糖量）／反応開始前還元糖量×１００＝酸化率（％）

【0055】

【表2】

【0056】

評価の結果、比較例２のカタラーゼ無添加では、副生した過酸化水素量により糖質酸化酵素が変性失活されたため３４％の酸化率に留まった。所定のカタラーゼ製剤を適量で用いた実施例７〜１１では、９０％以上を酸化することができた。

【0057】

（試験例３） カタラーゼ製剤Ｂによるデキストリン酸化物生産への影響
バッフル付きの三角フラスコへ、デキストリン（商品名ＮＳＤ７００，サンエイ糖化社製）９ｇを蒸留水へ溶解させ３０ｇ（３０ｗｔ％）とした後、炭酸カルシウム（和光純薬製）０．７５ｇ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来糖質酸化酵素製剤（糖質酸化活性３００ｕ／ｍｌ）６０μｌ（１８ｕ、２ｕ／ｇ基質）と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のカタラーゼ製剤Ｂ（カタラーゼ活性２７４００ｕ／ｍｌ、糖化活性２４４ｕ／ｍｌ、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００８９）を表３の記載量を加え、３０℃、２００ｒｐｍで振盪反応を行いデキストリンの酸化効率への影響を評価した。酸化率は、反応液の還元糖量をネルソン・ソモギ法で定量し、次式により変換率を算出した。
（反応開始前還元糖量−反応液還元糖量）／反応開始前還元糖量×１００＝酸化率（％）

【0058】

また、反応生成物の糖組成は、ＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法（パルスドアンペロメトリー検出器、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム）により、溶出：３５℃、１．０ｍｌ／ｍｉｎ、水酸化ナトリウム濃度：１００ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−０ｍＭ、５分−０ｍＭ、５５分−４０ｍＭの条件で分析した。

【0059】

【表3】

【0060】

評価の結果、糖化活性が原料基質の還元糖あたり０．９ｕ／ｇ以下でも、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００５以上となる比較例３は、酸化率８割以下であり、且つ組成中の加水分解により生成したグルコースが酸化されたグルコン酸量が９％程度となっており、原料のデキストリンが加水分解による影響を受けていることが分かる。

【0061】

また、糖化活性が原料基質の還元糖あたり０．９ｕ／ｇ以上で、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００５以上となる比較例４は、酸化率は７割以下であり、且つ組成中の加水分解により生成したグルコースが酸化されたグルコン酸量が１６％程度と、原料のデキストリンが加水分解による影響を受けていることが分かる。

【0062】

（試験例４） カタラーゼ製剤Ｃによるデキストリン酸化物生産への影響
バッフル付きの三角フラスコへ、デキストリン（商品名ＮＳＤ７００，サンエイ糖化社製）９ｇを蒸留水へ溶解させ３０ｇ（３０ｗｔ％）とした後、炭酸カルシウム（和光純薬製）０．７５ｇ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来糖質酸化酵素製剤（糖質酸化活性３００ｕ／ｍｌ）と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のカタラーゼ製剤Ｃ（カタラーゼ活性５２０００ｕ／ｍｌ、糖化活性６４ｕ／ｍｌ、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００１２）を表４の記載量を加え、３０℃、２００ｒｐｍで振盪反応を行いデキストリンの酸化効率への影響を評価した。酸化率は、反応液の還元糖量をネルソン・ソモギ法で定量し、次式により変換率を算出した。
（反応開始前還元糖量−反応液還元糖量）／反応開始前還元糖量×１００＝酸化率（％）

【0063】

また、反応生成物の糖組成は、ＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法（パルスドアンペロメトリー検出器、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム）により、溶出：３５℃、１．０ｍｌ／ｍｉｎ、水酸化ナトリウム濃度：１００ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−０ｍＭ、５分−０ｍＭ、５５分−４０ｍＭの条件で分析した。

【0064】

【表4】

【0065】

評価の結果、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００５以下でも、糖化活性が原料基質の還元糖あたり０．９ｕ／ｇ以上となる比較例５は、酸化率は７割以下であり、且つ組成中の加水分解により生成したグルコースが酸化されたグルコン酸量が１９％程度となっており、原料のデキストリンが加水分解による影響を受けていることが分かる。一方、糖化活性が原料基質の還元糖あたり０．９ｕ／ｇ以下である実施例１２では、酸化率は９割以上であり組成中のグルコン酸量も７％以下と、大きく低分子化することなく、酸化反応が進んだ。

【0066】

（試験例５） カタラーゼ製剤Ｃによるマルトビオン酸生産への影響
バッフル付きの三角フラスコへ、３０（ｗｔ）％ハイマルトース溶液３０ｇ、炭酸カルシウム（和光純薬製）０．７５ｇ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来糖質酸化酵素製剤（糖質酸化活性３００ｕ／ｍｌ）と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のカタラーゼ製剤Ｃ（カタラーゼ活性５２０００ｕ／ｍｌ、糖化活性６４ｕ／ｍｌ、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００１２）を表５の記載量を加え、３０℃、２００ｒｐｍで振盪反応を行いマルトビオン酸の生産効率への影響を評価した。

【0067】

反応組成中のマルトビオン酸量は、ＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法（パルスドアンペロメトリー検出器、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム）により、溶出：３５℃、１．０ｍｌ／ｍｉｎ、水酸化ナトリウム濃度：１００ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−０ｍＭ、２分−０ｍＭ、２０分−２０ｍＭの条件で分析した。

【0068】

【表5】

【0069】

評価の結果、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００５以下でも、糖化活性が原料基質の還元糖あたり０．９ｕ／ｇ以上となる比較例６は、原料のマルトースが加水分解されたことで、マルトビオン酸への変換量は８割以下であったの対して、糖化活性が原料基質の還元糖あたり０．９ｕ／ｇ以下で実施例１３では、殆ど夾雑酵素による加水分解の影響を受けることなく、９８％以上がマルトビオン酸へ変換された。

【0070】

（試験例６） カタラーゼ製剤Ｄによるデキストリン酸化物生産への影響
バッフル付きの三角フラスコへ、デキストリン（商品名ＮＳＤ７００，サンエイ糖化社製）９ｇを蒸留水へ溶解させ３０ｇ（３０ｗｔ％）とした後、炭酸カルシウム（和光純薬製）０．７５ｇ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来糖質酸化酵素製剤（糖質酸化活性３００ｕ／ｍｌ）６０μｌ（１８ｕ、２ｕ／ｇ基質）と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のカタラーゼ製剤Ｄ（カタラーゼ活性５４４００ｕ／ｍｌ、糖化活性２４２ｕ／ｍｌ、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００４４）を表６の記載量を加え、３０℃、２００ｒｐｍで振盪反応を行いデキストリンの酸化効率への影響を評価した。酸化率は、反応液の還元糖量をネルソン・ソモギ法で定量し、次式により変換率を算出した。
（反応開始前還元糖量−反応液還元糖量）／反応開始前還元糖量×１００＝酸化率（％）

【0071】

また、反応生成物の糖組成は、ＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法（パルスドアンペロメトリー検出器、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム）により、溶出：３５℃、１．０ｍｌ／ｍｉｎ、水酸化ナトリウム濃度：１００ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−０ｍＭ、５分−０ｍＭ、４０分−４０ｍＭの条件で分析した。

【0072】

【表6】

【0073】

評価の結果、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００５以下でも、糖化活性が原料基質の還元糖あたり０．９ｕ／ｇ以上となる、比較例７は、酸化率は７割以下であり、且つ組成中の加水分解により生成したグルコースが酸化されたグルコン酸量が２６％となっており、原料のデキストリンが加水分解による影響を受けていることが分かる。一方、糖化活性が原料基質の還元糖あたり０．９ｕ／ｇ以下である実施例１４では、酸化率は９割以上であり組成中のグルコン酸量も８％以下と、大きく低分子化することなく、酸化反応が進んだ。

【0074】

（試験例７）
（実施例１５）
マルトース ７０．３ｗｔ％に加えて、グルコース １．２ｗｔ％、マルトトリオース１５．０ｗｔ％及びマルトテトラオース（重合度４）以上のマルトオリゴ糖１３．５ｗｔ％を含むハイマルトース水飴（Ｂｘ．７５％、サンエイ糖化製）８８０ｇに蒸留水１３２０ｇを加え、３０％ｗｔとなるように溶解させた後、炭酸カルシウム（和光純薬製）８６ｇ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来糖質酸化酵素製剤（糖質酸化活性３００ｕ／ｍｌ）４．４ｍｌ（１３２０ｕ、２ｕ／ｇ基質）と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来のカタラーゼ製剤Ａ（カタラーゼ活性７５０６０ｕ／ｍｌ、糖化活性２４．８ｕ／ｍｌ、糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．０００３３）０．６６ｍ（ｌ４９５００Ｕ、７０ｕ／ｇ基質）を加え、３５℃、５００ｒｐｍ、空気通気２Ｌ／分で通気攪拌をおこなった。反応開始から１２時間後に、糖質酸化酵素剤１．１ｍｌ（３３０ｕ、０．５ｕ／ｇ基質）とカタラーゼ製剤０．２２ｍｌ（１６５００ｕ、２５ｕ／ｇ基質）を追加添加し酸化反応を行った。

【0075】

酸化反応の推移は、反応液の還元糖量をネルソン・ソモギ法で定量し、次式により変換率を算出した。
（反応開始前還元糖量−反応液還元糖量）／反応開始前還元糖量×１００＝酸化率（％）

【0076】

また、反応生成物の糖組成は、ＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法（パルスドアンペロメトリー検出器、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム）により、溶出：３５℃、１．０ｍｌ／ｍｉｎ、水酸化ナトリウム濃度：１００ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−０ｍＭ、２分−０ｍＭ、２０分−２０ｍＭの条件で分析した。

【0077】

【表7】

【0078】

糖化活性／カタラーゼ活性比＝０．００５以下（０．０００３３）且つ糖化活性が原料基質の還元糖あたり０．９ｕ／ｇ以下（０．０６６）の実施例１５について、表７に酸化反応開始時から４５時間までの経過時における酸化率を示す。表７に示すとおり、反応４５時間後には１００％酸化され、この時の生成物は、カルシウム４．１ｗｔ％を含む、マルトビオン酸 ６７．４ｗｔ％に加えて、グルコン酸 １．２ｗｔ％、マルトトリオン酸１４．４ｗｔ％及びマルトテトラオン酸（重合度４）以上のマルトオリゴ糖酸１２．９ｗｔ％で構成されており、糖化活性による加水分解等の影響がないことが確認された。

【要約】

【課題】酸化反応で副生する過酸化水素を速やかに分解するカタラーゼ製剤を用い、かつ、高収率で、重合度２以上の澱粉分解酸化物或いは転移反応酸化物で糖カルボン酸を工業的に生産する方法を提供すること。
【解決手段】還元末端にグルコース残基を有する重合度２以上の澱粉分解物又は転移反応物の還元末端側のアルデヒド基が酸化された糖カルボン酸の製造方法は、糖質酸化時に過酸化水素を副生する糖質酸化酵素剤を、カタラーゼ製剤中のカタラーゼ活性（Ａ）に対する糖化活性（Ｂ）の含有比率（Ｂ／Ａ）が０．００００２以上０．００５以下であるカタラーゼ製剤の存在下、前記澱粉分解物或いは転移反応物を含む原料基質に作用させる工程を含む。カタラーゼ製剤は、その糖化活性が前記原料基質中の還元糖量（ｗｔ％）に対して０．９ｕ／ｇ以下である量で存在する。
【選択図】なし