特許 6326606 γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ（ＧＧＣＴ）の新規基質およびそれを用いたＧＧＣＴ活性測定法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6326606

(24)【登録日】2018年4月27日

(45)【発行日】2018年5月23日

(54)【発明の名称】γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ（ＧＧＣＴ）の新規基質およびそれを用いたＧＧＣＴ活性測定法

(51)【国際特許分類】

   C07C 271/54 20060101AFI20180514BHJP

   C07D 311/58 20060101ALI20180514BHJP

   C07D 265/38 20060101ALI20180514BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALI20180514BHJP

【ＦＩ】

   C07C271/54CSP

   C07D311/58

   C07D265/38

   C12Q1/48 A

【請求項の数】5

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2014-57967(P2014-57967)

(22)【出願日】2014年3月20日

(65)【公開番号】特開2014-218494(P2014-218494A)

(43)【公開日】2014年11月20日

【審査請求日】2017年2月24日

(31)【優先権主張番号】特願2013-81865(P2013-81865)

(32)【優先日】2013年4月10日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 １．ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１３００４８１／ｆｕｌｌ、平成２５年９月２４日掲載 ２．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，第１４巻，第１６号，第２１１０−２１１３頁，ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ社 平成２５年１１月発行 ３．第４回アジア−太平洋国際ペプチドシンポジウム 第５０回ペプチド討論会 ＡＰＩＰＳ２０１３講演要旨集、第１０１頁、日本ペプチド学会 平成２５年１０月１０日発行 ４．第４回アジア−太平洋国際ペプチドシンポジウム 第５０回ペプチド討論会 ＡＰＩＰＳ２０１３ ホテル阪急エキスポパーク（大阪府吹田市千里万博公園１−５） 平成２５年１１月６日開催

(73)【特許権者】

【識別番号】595125362

【氏名又は名称】株式会社ペプチド研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100138900

【弁理士】

【氏名又は名称】新田 昌宏

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】飯居 宏美

(72)【発明者】

【氏名】西内 祐二

(72)【発明者】

【氏名】吉貴 達寛

(72)【発明者】

【氏名】吉矢 拓

【審査官】 福山 則明

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−０４７８９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０３−０９１４９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０４９５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Molecular Pharmaceutics，２０１３年 ２月２６日，Vol. 10, No. 4，pp. 1409-1416，（第1-18頁）

【文献】 吉矢 拓 ほか，GGCT(C7orf24)蛍光基質の開発：酵素反応を引き金としたO-to-N分子内アシル転位型反応の応用，第18回日本病態プロテアーゼ学会学術集会プログラム抄録集，２０１３年 ８月１６日，第24頁

【文献】 Current Organic Synthesis，２０１１年，Vol. 8, No. 4，pp. 498-520，（第1-55頁）

【文献】 Progress in Molecular Biology and Translational Science，２０１３年，Vol. 113，pp. 1-34，Available online 13 December 2012

【文献】 Analytical Biochemistry，２００７年，Vol. 371，pp. 146-153

【文献】 BIOCHEMISTRY，１９６９年，Vol. 8, No. 3，pp. 1048-1055

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉ：

【化1】

Ｉ
［式中、
ＸはＣＯＯＨであり、
ＹはＮＨであり、
ＺはＯ、ＮＨ、Ｎ−Ｃ_１−６アルキル、Ｓ、またはＣＨ_２であり、
ｍは１、２、３、または４であり、
ｎは１であり、
ｃａｒｇｏは

【化2】

［式中、波線は分子の残部との結合点を示す。］
であり、ただしｃａｒｇｏが

【化3】

である場合、ＺはＮＨまたはＮ−Ｃ_１−６アルキルである］
の化合物またはその薬理的に許容しうる塩。

【請求項2】

下式：

【化4】

の化合物またはその薬理的に許容しうる塩。

【請求項3】

下式：

【化5】

の化合物またはその薬理的に許容しうる塩。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩を基質として用いることを特徴とする、ＧＧＣＴ活性を測定する方法。

【請求項5】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩を含む、ＧＧＣＴ活性を測定するための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ（以下、ＧＧＣＴ）の新規基質、およびそれを用いたＧＧＣＴ活性測定法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＧＧＣＴはグルタチオン（ＧＳＨ）の代謝に関わっており（非特許文献１）、γ−Ｇｌｕ−Ｘａａ−ＯＨを基質として、ピログルタミン酸とアミノ酸（Ｘａａ）とを産生する酵素である。現在では、ＧＧＣＴが通常は諸臓器で低発現なのに対して、尿路上皮癌などの各種癌組織において高発現であることが知られている。また、ＧＧＣＴをｓｉＲＮＡでノックダウンすると、癌細胞の細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が低下することも報告されている（非特許文献２）。このため、ＧＧＣＴ阻害剤の開発が試みられている。

【0003】

そのような阻害剤の開発において、ＧＧＣＴの存在および活性を直接的に観測することにより癌細胞の増殖の変化を直接的に観測することができれば、阻害剤のスクリーニングアッセイを非常に効率的に行うことができる。例えば、ＧＧＣＴ活性によって発色し、または蛍光を発する基質を用いることができれば、阻害剤のスクリーニングアッセイの効率化のみならず、癌イメージング研究などの分野にも応用することが期待できる。

【0004】

しかしながら、これまでにＧＧＣＴの発色／蛍光基質は開発されておらず、阻害剤のスクリーニングアッセイは間接的なものになっている。例えば、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａを基質とし、生成物であるＡｌａを用いた二段階の酵素反応を経てＮＡＤＨをＮＡＤとし、それによる吸光度の変化を観測する非効率な間接的方法が知られている。

【0005】

また、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓを基質として用い、系内に残存したγ−Ｇｌｕ−ＣｙｓをＮＤＡ（ナフタレン−２，３−ジカルボキシアルデヒド）にてトラップし、蛍光物質として分析する手法が報告されている（非特許文献３）。しかしながらこの手法も、以前から用いられているアッセイ手法同様に間接的なものであるため、正確性や再現性に難がある。また、アルデヒドと反応しうる夾雑物による蛍光の退色の問題がある。さらに、ＮＤＡを加えると酵素反応はストップしてしまうため、最後にＮＤＡを加える必要があり、操作は複雑になる。したがって、簡便かつ再現性良くＧＧＣＴ活性を測定しうるＧＧＣＴの発色／蛍光基質の開発が求められている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】P. G. Borad et al. J.Biol.Chem 2008 (283) 22031.

【非特許文献2】S. Kageyama et al. PROTEOMICS - Clinical Applications 2007 (1) 192.

【非特許文献3】P. G. Borad et al. Anal. Biochem. 2012 (420)177.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、上記のような先行技術における課題を解決すべくなされたものであり、ＧＧＣＴの新規発色／蛍光基質およびそれを用いたＧＧＣＴ活性測定法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下式Ｉで示す化合物またはその薬理的に許容しうる塩がＧＧＣＴによって切断されて発色団を放出し、該発色団の発色／蛍光を測定することによって直接的にＧＧＣＴ活性を測定できることを見出し、本発明を完成するに到った。

【0009】

即ち、本発明は、
［１］
式Ｉ：

【化1】

Ｉ
［式中、
ＸはＨ、またはＣＯＯＨであり、
ＹはＮＨであり、
ＺはＯ、ＮＨ、Ｎ−Ｃ_１−６アルキル、Ｓ、またはＣＨ_２であり、
ｍは１、２、３、または４であり、
ｎは０、１、または２であり、
ｃａｒｇｏは発色団である］
の化合物またはその薬理的に許容しうる塩；

【0010】

［２］
式Ｉにおいて、ｃａｒｇｏが

【化2】

［式中、波線は分子の残部との結合点を示す。］
の構造を有する、上記［１］に記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩；

【0011】

［３］
ｎが１である、上記［１］〜［２］のいずれか１つに記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩；

【0012】

［４］
ＸがＣＯＯＨである、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩；

【0013】

［５］
下式：

【化3】

の化合物またはその薬理的に許容しうる塩；

【0014】

［６］
下式：

【化4】

の化合物またはその薬理的に許容しうる塩；

【0015】

［７］
上記［１］〜［６］のいずれか１つに記載の化合物またはその薬理的に許容しうる塩を基質として用いることを特徴とする、ＧＧＣＴ活性測定法；および

【0016】

［８］
下式：

【化5】

の化合物またはその薬理的に許容しうる塩を基質として用いることを特徴とする、ＧＧＣＴ活性測定法；
に関する。

【発明の効果】

【0017】

本発明の化合物またはその薬理的に許容しうる塩をＧＧＣＴの基質として用いることにより、ＧＧＣＴの酵素活性によって該基質から発色団が放出され、該発色団の発色／蛍光を測定することによって直接的にＧＧＣＴ活性を測定することができるため、簡便かつ再現性のよいＧＧＣＴ活性の測定が可能となった。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、ＧＧＣＴによる本発明の化合物（ＬＩＳＡ−４）からの４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）の放出を示す。

【図2】図２は、ＬＩＳＡ−４とＭＵとの蛍光スペクトル比較（図２Ａ）およびその拡大図（図２Ｂ）を示す。

【図3】図３は、蛍光光度計を用いた、ＬＩＳＡ−４を基質とするＧＧＣＴ酵素反応のモニターを示す。

【図4】図４Ａは、ＧＧＣＴによる本発明の化合物（ＬＩＳＡ−１０１）からのレソルフィンの放出を示し、図４Ｂは、ＧＧＣＴによる本発明の化合物（ＬＩＳＡ−１０２）からのレソルフィンの放出を示す。ＬＩＳＡ−１０１については、ＧＧＣＴなしの場合のレソルフィン放出量も示している。

【図5】図５は、ＬＩＳＡ−１０１およびＬＩＳＡ−１０２とレソルフィンとの蛍光スペクトル比較（図５Ａ）およびその拡大図（図５Ｂ）を示す。

【図6】図６は、リコンビナントＧＧＣＴを用いた場合の、ＬＩＳＡ−１０１を基質とするＧＧＣＴ酵素反応の蛍光プレートリーダーによるモニターを示す。

【図7】図７は、細胞破砕物中のＧＧＣＴを用いた場合の、ＬＩＳＡ−１０１を基質とするＧＧＣＴ酵素反応の蛍光プレートリーダーによるモニターを示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

定義
本明細書で用いられている用語「アルキル」は、炭素数１〜６個（Ｃ_１−６アルキル）、好ましくは炭素数１〜３個（Ｃ_１−３アルキル）の飽和直鎖状または分岐鎖状炭化水素を指す。本発明で用いられる「アルキル」としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−メチルブチル、１，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｔｅｒｔ−ヘキシル、ネオヘキシル、３−メチルペンチル、１，２−ジメチルブチル、１−エチルブチル、および２−エチルブチル等を挙げることができる。

【0020】

本明細書で用いられている用語「ｃａｒｇｏ」は、ＧＧＣＴによる酵素反応、および場合によってはその後の自発的な化学反応によって切断・放出される発色団であれば特に限定されるものではない。ここで「発色団」とは、発色または蛍光を発する物質であれば特に限定されるものではない。本発明で用いられるｃａｒｇｏは、ＧＧＣＴ酵素反応によって切断される前には発色もしくは蛍光を有さないかまたは発色もしくは蛍光が非常に弱く、切断された後に強い発色または蛍光を発する物質が好ましく用いられる。本発明で用いられるｃａｒｇｏとしては、限定されるものではないが、４−メチルウンベリフェロン、ｐ−ニトロフェノール、レソルフィン、フルオレセイン、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ロドール、７−ヒドロキシクマリン、６−ヒドロキシクマリン、およびスコポレチン等のヒドロキシ基を有する発色または蛍光物質がヒドロキシ基を介して分子の残部に結合しているものを挙げることができる。好ましいｃａｒｇｏは、４−メチルウンベリフェロン、ｐ−ニトロフェノール、およびレソルフィンである。

【0021】

本明細書で用いられている用語「薬理的に許容しうる塩」は、ＧＧＣＴによる酵素反応系に影響を与えない生理的に許容しうる塩を意味し、限定されるものではないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、もしくはトリフルオロ酢酸塩などの酸付加塩、リチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、もしくはアルミニウム塩等の金属塩、またはアンモニウム塩、ジエタノールアミン塩、エチレンジアミン塩、トリエタノールアミン塩、もしくはトリエチルアミン塩などの塩基付加塩を指す。好ましい塩は、塩酸塩またはトリフルオロ酢酸塩である。

【0022】

本明細書中で使用する略号は、別段の定義がない限り、以下の意味を有する。また、アミノ酸は全てＬ−アミノ酸を意味する。
ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ
Ａｌａ ：アラニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ｓｅｒ ：セリン
Ｌｙｓ ：リシン
ＮＡＤＨ ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＮＡＤ ：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＭＵ ：４−メチルウンベリフェロン
Ｂｏｃ ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＮＳｕ ：スクシンイミド
ｔＢｕ ：ｔｅｒｔ−ブチル
ＭｇＳＯ_４：硫酸マグネシウム
Ａ_２ｐｒ ：２，３−ジアミノプロピオン酸
Ａ_２ｂｕ ：２，４−ジアミノ酪酸
Ｃｂｚ ：ベンジルオキシカルボニル
ｐＮＰ ：ｐ−ニトロフェノール
ＭｅＯＨ ：メタノール
ＨＣｌ ：塩酸
ＤＭＦ ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ：ジメチルスルホキシド
ＴＨＦ ：テトラヒドロフラン
Ｋ_２ＣＯ_３：炭酸カリウム
ＤＮｓ ：２，４−ジニトロベンゼンスルホニル
Ｅｔ ：エチル
ｉＰｒ ：イソプロピル
ＩＰＴＧ ：イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド
ＨＰＬＣ ：高速液体クロマトグラフィー

【0023】

以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を説明する目的で提供されているのであって、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0024】

実施例１
γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＭＵ）（ＬＩＳＡ−３）の合成

【化6】

【0025】

氷浴上、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＮＳｕ）−ＯｔＢｕ（６５７ｍｇ）、Ｈ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（３５０ｍｇ）およびトリエチルアミン（０．６８５ｍＬ）をジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解させ、室温に戻るに任せつつ、終夜攪拌した。その後、酢酸エチルにて溶液を希釈し、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、オイル状残渣としてＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕを５３３ｍｇ得た。残渣のうちの３００ｍｇと、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ、２４５ｍｇ）およびトリエチルアミン（０．１８ｍＬ）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し、室温にて５分間攪拌した。その後、４−メチルウンベリフェロン（１１４ｍｇ）を加え、さらに１時間室温にて攪拌した。その後、酢酸エチルにて溶液を希釈し、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、オイル状残渣としてＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｇｌｕ（ＭＵ）−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕを得た。得られた残渣をジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解し、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．０１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて粗精製した。Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｇｌｕ（ＭＵ）−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含むフラクションを凍結乾燥し、２３０ｍｇの白色粉末を得た。氷浴上にて、得られた白色粉末のうちの９０ｍｇをトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）に溶解させ、２時間攪拌した。その後、減圧濃縮し、残渣を逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ，粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて精製した。凍結乾燥後、表題化合物を５８ｍｇの白色粉末として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＦ_３ＣＯＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ７．９１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｓ，１Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｓ，１Ｈ），４．９３−４．８１（ｍ，１Ｈ），４．６０−４．４９（ｍ，１Ｈ），３．０７−２．９０（ｍ，４Ｈ），２．６９−２．４９（ｍ，６Ｈ），２．４３−２．３０（ｍ，１Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＦ_３ＣＯＯＤ，１００ＭＨｚ）：δ１７８．２９，１７７．９０，１７６．４４，１７４．７２，１６９．２４，１６０．８０，１５５．５０，１５５．４８，１２８．６３，１２１．６４，１２１．０７，１１４．８７，１１２．７９，５５．８４，５４．５８，３３．８４，３２．３１，２８．０７，２７．１５，１９．５８；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）：Ｃ_２０Ｈ_２２Ｎ_２ＮａＯ_９（Ｍ＋Ｎａ）^＋計算値：４５７．１２２３，実測値：４５７．１２２０．

【0026】

実施例２
γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（ＣＯ−ＭＵ）（ＬＩＳＡ−４）の合成

【化7】

【0027】

Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（８６３ｍｇ）、ＨＣｌ・Ｈ−Ｓｅｒ−ＯｔＢｕ（６０５ｍｇ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、４２１ｍｇ）を１０％水含有ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解させ、氷浴上、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、０．５７１ｍＬ）を滴下した。その後、室温に戻るに任せつつ、ジメチルホルムアミド溶液を終夜攪拌した。その後、酢酸エチルにて溶液を希釈し、飽和重曹水、１Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、オイル状残渣としてＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｓｅｒ−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（１．２１ｇ）を得た。Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｓｅｒ−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（１．２１ｇ）、およびカルボニルジイミダゾール（４４８ｍｇ）をジメチルホルムアミド（９ｍＬ）に溶解し、アルゴンガス雰囲気下、メタンスルホン酸（０．１７９ｍＬ）を加え、室温で１時間攪拌した。４−メチルウンベリフェロン（６２１ｍｇ）とメタンスルホン酸（０．２０２ｍＬ）を加えた後、溶液を６０℃で終夜攪拌した。その後、酢酸エチルにて溶液を希釈し、飽和重曹水、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、オイル状残渣としてＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｓｅｒ（ＣＯ−ＭＵ）−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕを得た。得られた残渣をジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解し、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．０１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて粗精製した。Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｓｅｒ（ＣＯ−ＭＵ）−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕを含むフラクションを凍結乾燥し、６０ｍｇの白色粉末を得た。氷浴上にて、得られた白色粉末のうちの５０ｍｇをトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）に溶解させ、２時間攪拌した。その後、減圧濃縮し、残渣を水に溶解し、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて精製した。凍結乾燥後、表題化合物を３０ｍｇの白色粉末として得た。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＦ_３ＣＯＯＤ，４００ＭＨｚ）：δ７．９３−７．８５（ｍ，１Ｈ），７．４０−７．２７（ｍ，２Ｈ），６．６２（ｓ，１Ｈ），５．１７−５．０７（ｍ，１Ｈ），４．９４−４．７６（ｍ，２Ｈ），４．５９−４．４８（ｍ，１Ｈ），３．０７−２．８７（ｍ，２Ｈ），２．７０−２．４７（ｍ，５Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＦ_３ＣＯＯＤ，１００ＭＨｚ）：δ１７７．７８，１７５．３８，１７４．７３，１６９．１０，１６０．５９，１５６．１８，１５５．６０，１５５．３９，１２８．７２，１２１．１７，１２０．９２，１１５．０３，１１２．２２，６９．８４，５５．８２，５４．４３，３３．７３，２７．１２，１９．５４；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）：Ｃ_１９Ｈ_２０Ｎ_２ＮａＯ_１０（Ｍ＋Ｎａ）^＋計算値：４５９．１０１６，実測値：４５９．１０１１．

【0028】

実施例３
γ−Ｇｌｕ−Ａ_２ｐｒ（ＣＯ−ｐＮＰ）（ＬＩＳＡ−７）の合成

【化8】

氷浴上、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＮＳｕ）−ＯｔＢｕ（８００ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）、Ｈ−Ａ_２ｐｒ（Ｃｂｚ）−ＯｔＢｕ（５００ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．２２ｍＬ，８．７８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に懸濁させ、室温に戻るに任せつつ、終夜攪拌した。不溶物を濾去した後、酢酸エチルにて母液を希釈し、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、オイル状残渣としてＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ａ_２ｐｒ（Ｃｂｚ）−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕを９５０ｍｇ（１．８１ｍｍｏｌ）得た。得られたＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ａ_２ｐｒ（Ｃｂｚ）−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（０．９１８ｇ，１．７５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（４０ｍＬ）に溶解し、パラジウム炭素（１０％パラジウム、１８０ｍｇ）を加えて、水素ガス雰囲気下、室温にて激しく１時間撹拌した。パラジウム触媒を濾去し、母液を減圧濃縮し、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ａ_２ｐｒ−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（６３３ｍｇ，１．６３ｍｍｏｌ）を得た。クロロギ酸４−ニトロフェニル（１５０ｍｇ，０．７４５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．３１２ｍＬ，２．２３ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ａ_２ｐｒ−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（２９０ｍｇ，０．７４５ｍｍｏｌ）とトリメチルシリルクロリド（０．１４２ｍＬ，１．１２ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（４０ｍＬ）に加え、室温にて１時間撹拌した。その後、酢酸にて酸性とし、減圧濃縮した。得られた、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ［Ａ_２ｐｒ（ＣＯ−ｐＮＰ）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕをトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）に溶解し、１時間室温にて撹拌した。溶媒を減圧濃縮し、ジエチルエーテルにて沈澱化させた後、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．０１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて精製した。目的物は凍結乾燥の後に、１１０ｍｇ（０．２１５ｍｍｏｌ）の粉末として得られた。純度：９９．４％（２２０ｎｍ）；
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＦ_３ＣＯＯＤ，４００ＭＨｚ）δ８．３６−８．２５（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．２５（ｍ，２Ｈ），５．０７−４．８３（ｍ，１Ｈ），４．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），４．１３−３．８２（ｍ，２Ｈ），２．９８−２．８０（ｍ，２Ｈ），２．６１−２．４０（ｍ，２Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）^＋計算値：３９９．１，実測値：３９９．０．

【0029】

実施例４
γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（ＣＯ−ＭＵ）（ＬＩＳＡ−１０）の合成

【化9】

１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ，０．５１６ｍＬ，２．８２ｍｍｏｌ）をＢｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（７７７ｍｇ，２．５６ｍｍｏｌ）、ＨＣｌ・Ｈ−Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−ＯｔＢｕ（１．００ｇ，２．６８ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ，３６２ｍｇ，２．６８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に０℃にて滴下し、室温に戻るに任せつつ、終夜撹拌した。その後、酢酸エチルにて反応溶液を希釈し、０．３Ｎ塩酸水、飽和重曹水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕを１．４７ｇ（２．３６ｍｍｏｌ）得た。得られたＢｏｃ−Ｇｌｕ（Ｌｙｓ（Ｃｂｚ）−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（１．１４ｇ，１．８３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３０ｍＬ）に溶解し、パラジウム炭素（１０％パラジウム、１７０ｍｇ）を加えて、水素ガス雰囲気下室温にて激しく２時間撹拌した。パラジウム触媒を濾去し、母液を減圧濃縮し、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｌｙｓ−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（８５８ｍｇ，１．７６ｍｍｏｌ）を得た。アルゴンガス雰囲気下、炭酸ビス（トリクロロメチル）（１２６ｍｇ，０．４２４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（１０ｍＬ）を、４−メチルウンベリフェロン（２２５ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４３５ｍＬ，２．４３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）に加え、室温で２０分撹拌した。その後、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｌｙｓ−ＯｔＢｕ）−ＯｔＢｕ（７４８ｍｇ，１．５３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を加えて１時間撹拌した。塩化メチレンにて反応溶液を希釈し、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮した。得られた、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ［Ｌｙｓ（ＣＯ−ＭＵ）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕをトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）に溶解し、２時間室温にて撹拌した。溶媒を減圧濃縮し、蒸留水（１５０ｍＬ）に溶解し、クロロホルム（ｘ３）で洗浄し、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて精製した。目的物は凍結乾燥の後に、１９０ｍｇ（０．３２１ｍｍｏｌ）の白色粉末として得られた。純度：９９．７％（２２０ｎｍ）；
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＦ_３ＣＯＯＤ，４００ＭＨｚ）δ７．８８（ｓ，１Ｈ），７．８６（ｓ，１Ｈ），７．３１（ｓ，１Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），４．７３−４．６０（ｍ，１Ｈ），４．５５−４．４４（ｍ，１Ｈ），３．６０−３．３０（ｍ，２Ｈ），３．００−２．８６（ｍ，２Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），２．５９−２．４１（ｍ，２Ｈ），２．１９−１．４８（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）^＋計算値：４７８．２，実測値：４７８．２．

【0030】

実施例５
γ−Ｇｌｕ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−Ｅｔ−Ｎ^γ−ＣＯ−レソルフィン）（ＬＩＳＡ−１０１）の合成

【化10】

Ｂｏｃ−Ａ_２ｂｕ−ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（９７０ｍｇ，３．１２ｍｍｏｌ）、２，４−ジニトロベンゼンスルホニルクロリド（１．２５ｇ，４．６８ｍｍｏｌ）およびＫ_２ＣＯ_３（２．１６ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ−Ｈ_２Ｏ（２：１，３０ｍＬ）に溶解させ、室温にて３時間撹拌した。その後、酢酸エチルにて反応溶液を希釈し、飽和重曹水、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、Ｂｏｃ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ＤＮｓ）−ＯｔＢｕを１．６５ｇ得た（ＤＮｓ：２，４−ジニトロベンゼンスルホニル）。得られたＢｏｃ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ＤＮｓ）−ＯｔＢｕ（１．５７ｇ）、ヨウ化エチル（３７４μＬ，４．６８ｍｍｏｌ）およびＫ_２ＣＯ_３（６４７ｍｇ，４．６８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中、室温にて終夜撹拌した。その後、酢酸エチルにて反応溶液を希釈し、飽和重曹水、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、Ｂｏｃ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ＤＮｓ−Ｎ^γ−Ｅｔ）−ＯｔＢｕを１．４９ｇ得た。得られたＢｏｃ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ＤＮｓ−Ｎ^γ−Ｅｔ）−ＯｔＢｕ（１．４９ｇ）をジオキサン（５ｍＬ）に溶解させ、５．７Ｎ塩酸−ジオキサン（７ｍＬ）を加えて、０℃にて１時間撹拌した。その後、酢酸エチルおよび飽和重曹水にて反応溶液を希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、Ｈ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ＤＮｓ−Ｎ^γ−Ｅｔ）−ＯｔＢｕを１．００ｇ得た。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４８７ｍｇ，２．５４ｍｍｏｌ）を、Ｈ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ＤＮｓ−Ｎ^γ−Ｅｔ）−ＯｔＢｕ（１．００ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（１．２６ｇ，２．４３ｍｍｏｌ）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ，３４４ｍｇ，２．５４ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド溶液（７ｍＬ）に加え、室温にて終夜撹拌した。その後、酢酸エチルにて反応溶液を希釈し、飽和重曹水、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて精製し、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ［Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ＤＮｓ−Ｎ^γ−Ｅｔ）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕ（３２０ｍｇ，０．４２６ｍｍｏｌ）を得た。純度：９８．６％（２２０ｎｍ）；
ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）^＋計算値：７５２．３，実測値：７５２．３．

【0031】

得られたＣｂｚ−Ｇｌｕ［Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ＤＮｓ−Ｎ^γ−Ｅｔ）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕ（３２０ｍｇ，０．４２６ｍｍｏｌ）を、チオグリコール酸（３ｍＬ）−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）混液に溶解し、終夜室温にて撹拌した。その後、酢酸エチルにて反応溶液を希釈し、飽和重曹水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮し、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて精製し、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ［Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−Ｅｔ）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕ（６５．０ｍｇ）を得た。純度：９７．２％（２２０ｎｍ）；
ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）^＋計算値：５２２．３，実測値：５２２．３．

【0032】

アルゴンガス雰囲気下、炭酸ビス（トリクロロメチル）（１２．０ｍｇ，４１．０μｍｏｌ）、レソルフィン（２６．１ｍｇ，１２２μｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２２．０μＬ，０．１２６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン−テトラヒドロフラン（１：２）（１．５ｍＬ）中、室温にて１０分撹拌し、Ｃｂｚ−Ｇｌｕ［Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−Ｅｔ）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕ（５３．０ｍｇ，１０２μｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６６．０μＬ，０．３７９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（３ｍＬ）を加えて１時間撹拌した。その後、酢酸エチルにて反応溶液を希釈し、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮した。得られたＣｂｚ−Ｇｌｕ［Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−Ｅｔ−Ｎ^γ−ＣＯ−レソルフィン）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕにトリイソプロピルシラン（０．２ｍＬ）を加えた後、トリフルオロ酢酸（３．８ｍＬ）に溶解し、室温にて終夜撹拌した。溶媒を減圧濃縮し、蒸留水（３０ｍＬ）に溶解し、クロロホルム（ｘ３）で洗浄し、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて精製した。目的物は凍結乾燥の後に、６．５ｍｇ（１０μｍｏｌ）のオレンジ色粉末として得られた。純度：９９．２％（２２０ｎｍ）；
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６（２％Ｄ_２Ｏおよび３％ＣＦ_３ＣＯＯＤ含有），４００ＭＨｚ）δ７．８４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄｄ，Ｊ＝１５，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄｔ，Ｊ＝８．８，８．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝１０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３０−４．２１（ｍ，１Ｈ），３．９８−３．８７（ｍ，１Ｈ），３．５９−３．１９（ｍ，４Ｈ），２．４２−２．２４（ｍ，２Ｈ），２．１７−１．８０（ｍ，４Ｈ），１．１６（ｄｔ，Ｊ＝３２，６．８，６．８Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）^＋計算値：５１５．２，実測値：５１５．２．

【0033】

実施例６
γ−Ｇｌｕ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ｉＰｒ−Ｎ^γ−ＣＯ−レソルフィン）（ＬＩＳＡ−１０２）の合成

【化11】

Ｂｏｃ−Ａ_２ｂｕ−ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（３５３ｍｇ，１．１４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）−アセトン（１０ｍＬ）に溶解し、パラジウム炭素（５％パラジウム、１２０ｍｇ）を加えて、水素ガス（８．５ａｔｍ）雰囲気下、室温にて終夜撹拌した。その後、パラジウム触媒を濾去し、母液を減圧濃縮し、Ｂｏｃ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ｉＰｒ）−ＯｔＢｕ（５９２ｍｇ）を得た。得られたＢｏｃ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ｉＰｒ）−ＯｔＢｕ（５９２ｍｇ）をＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、５．７Ｎ ＨＣｌ−ジオキサン（２ｍＬ）を加えて室温にて１時間撹拌した。その後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにて中和し、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（２ｍＬ）を加えて減圧濃縮し、Ｈ−Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ｉＰｒ）−ＯｔＢｕのＮ−メチル−２−ピロリドン溶液を得た。その溶液に、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＮＳｕ）−ＯｔＢｕ（６６１ｍｇ，１．６５ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６０μＬ，０．３５ｍｍｏｌ）を加え、終夜室温にて撹拌した。その後、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて精製し、凍結乾燥の後に、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ［Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ｉＰｒ）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕ（１９８ｍｇ，０．３２２ｍｍｏｌ）を白色粉末として得た。純度：９８．４％（２２０ｎｍ）；
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，４００ＭＨｚ）δ８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．２８−４．１８（ｍ，１Ｈ），３．８２−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．２９−３．２１（ｍ，１Ｈ），３．００−２．８０（ｍ，２Ｈ），２．２０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．０７−１．６４（ｍ，４Ｈ），１．４４−１．３１（ｍ，２７Ｈ），１．１９（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）^＋計算値：５０２．３，実測値：５０２．３．

【0034】

アルゴンガス雰囲気下、炭酸ビス（トリクロロメチル）（１９．０ｍｇ，６４．０μｍｏｌ）、レソルフィン（４１．０ｍｇ，１９４μｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３５．０μＬ，０．１９６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍＬ）中、室温にて１５分撹拌した。Ｂｏｃ−Ｇｌｕ［Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ｉＰｒ）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕ（１００ｍｇ，１６２μｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０５μＬ，０．５８８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）を加えて１時間撹拌した。その後、酢酸エチルにて反応溶液を希釈し、０．５Ｎ塩酸水および飽和食塩水にて洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥した後、減圧濃縮した。得られた、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ［Ａ_２ｂｕ（Ｎ^γ−ｉＰｒ−Ｎ^γ−ＣＯ−レソルフィン）−ＯｔＢｕ］−ＯｔＢｕをトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）に溶解し、蒸留水（０．１ｍＬ）を加えて室温にて２．５時間撹拌した。溶媒を減圧濃縮し、蒸留水（１０ｍＬ）に溶解し、クロロホルム（ｘ３）で洗浄し、逆相ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（３０ｘ２５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）、０．１％トリフルオロ酢酸含有水−アセトニトリル系］にて精製した。目的物は凍結乾燥の後に、６．８ｍｇ（１１μｍｏｌ）のオレンジ色粉末として得られた。純度：９９．３％（２２０ｎｍ）；
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６（３％Ｄ_２Ｏおよび３％ＣＦ_３ＣＯＯＤ含有），４００ＭＨｚ）δ７．８３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，１Ｈ），７．３７−７．２８（ｍ，１Ｈ），７．２１（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄｄ，Ｊ＝１０，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３１−４．０２（ｍ，２Ｈ），３．９７−３．８４（ｍ，１Ｈ），３．４６−３．１０（ｍ，２Ｈ），２．３８−２．２４（ｍ，２Ｈ），２．１４−１．８０（ｍ，４Ｈ），１．３０−１．０９（ｍ，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：（Ｍ＋Ｈ）^＋計算値：５２９．２，実測値：５２９．２．

【0035】

以下の実施例では、上記実施例１〜６で合成した本発明の化合物とＧＧＣＴとの反応をアッセイした。
実施例７〜１２で用いたＧＧＣＴ（リコンビナントＧＧＣＴ）は、以下のように調製した。
ＧＧＣＴ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿０２４０５１）のオープン・リーディング・フレームをｐＤＥＳＴ１７ベクター（Ｈｉｓ−ｔａｇベクター；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）に挿入したプラスミドを調製し、大腸菌（ＢＬ２１ ＤＥ３株）に形質転換した。コロニーをピックアップして２ｍＬのアンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有ＬＢ培地で数時間培養した後、１０ｍＬのアンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有ＬＢ培地に植え継ぎ、一晩培養した。培養液をよく懸濁して６００ｎｍの吸光度を測定し、０．１〜０．２になるようにアンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有ＬＢ培地で希釈し、５０ｍＬまでかさ上げした後、２〜３時間培養した。６００ｎｍの吸光度が０．４まで上昇した後、ＩＰＴＧ［ナカライテスク株式会社（京都、日本）、製品番号１９７４２−８１］を０．１ｍＭになるように添加し、さらに４〜６時間培養を続けた。培養液を遠心し、培養液上清を取り除き、大腸菌のペレットを得た後、Ｐｒｏｂｏｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて精製し、大腸菌由来のリコンビナントタンパク質を調製した。

【0036】

実施例７
ＬＩＳＡ−４を基質としたＧＧＣＴ酵素反応のＨＰＬＣによる追跡アッセイ
ＧＧＣＴの酵素反応による本発明の化合物の切断を追跡するために、ＧＧＣＴとＬＩＳＡ−４を反応させ、放出される４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）をＨＰＬＣによって追跡した。

【0037】

酵素反応は全て室温（２４℃）にて実施した。
以下の溶液１および溶液２を作製した。
溶液１：ｐＨ６．５トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ）にて作製したＬＩＳＡ−４の２ｍＭ溶液
溶液２：ｐＨ６．５トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ）にて作製したＧＧＣＴ溶液（７μＬ、０．９８ｍｇ／ｍＬ）を３．５倍希釈した溶液（計２４．５μＬ）
次に、溶液１（１３１μＬ）を、溶液２の全量に投入し、反応を開始した（初期濃度：１．６８ｍＭ）。各時点で、サンプリングした溶液（８μＬ）にトリフルオロ酢酸（５μＬ）を加え、反応を止めた。サンプルは、ＨＰＬＣ測定まで４℃にて保管した。

【0038】

各サンプルについて、ＨＰＬＣ（ＵＶ検出器）を用いてＬＩＳＡ−４とＭＵの量を解析し、ＭＵの量をプロットした。ＨＰＬＣ測定は、以下の条件で行った。
装置：ＬＣ−２０１０ＣＨＴ（株式会社島津製作所）
検出器：ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ（株式会社島津製作所）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（４．６ｘ１５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）（株式会社ワイエムシィ）
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ液−０．１％トリフルオロ酢酸含有水、Ｂ液−０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル
濃度勾配制御：Ｂ液１０％−９５％（２５分）
流速：１ｍＬ／分
注入量：７μＬ
結果は、図１に示す。

【0039】

図１から、ＬＩＳＡ−４はＧＧＣＴの基質となりうる化合物であり、ＧＧＣＴの酵素活性によって切断され、ＭＵを放出することが明らかになった。

【0040】

実施例８
ＬＩＳＡ−４とＭＵの蛍光スペクトル比較
ＧＧＣＴの酵素反応による本発明の化合物の切断を蛍光強度で追跡できるかどうかを確認するために、ＬＩＳＡ−４とＭＵの蛍光スペクトルをそれぞれ測定した。
ｐＨ６．５トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ）でそれぞれ０．０７ｍＭのＬＩＳＡ−４溶液およびＭＵ溶液を作製し、それぞれの溶液について蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトル測定は、以下の条件で行った。
装置：Ｆ−２５００（株式会社日立ハイテクノロジーズ）
励起波長：３７１ｎｍ
測定波長：３００−８００ｎｍ
結果は、図２に示す。

【0041】

図２から明らかなように、ＭＵは強い蛍光を発した（蛍光極大４５０ｎｍ）。一方、同条件において、ＬＩＳＡ−４は殆ど蛍光を発しなかった。特に４６１ｎｍにおける蛍光を比較すると、ＭＵはＬＩＳＡ−４と比べ約１２００倍の蛍光を発した。したがって、４６１ｎｍ付近における蛍光は、ＭＵに特徴的なシグナルであることが明らかになった。

【0042】

実施例９
ＬＩＳＡ−４を基質としたＧＧＣＴ酵素反応の蛍光光度計によるモニター
ＬＩＳＡ−４からのＭＵの放出を蛍光光度計にてモニターした。
ｐＨ６．５トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ）で以下の溶液を作製し、すぐに用いた。
基質：ＬＩＳＡ−４ ０．０７ｍＭ
酵素：ＧＧＣＴ ０．１９６ｍｇ／ｍＬ
基質溶液（１４０μＬ）を酵素溶液（１０μＬ）に添加し、４５分間室温にて蛍光を測定した。終濃度は、ＬＩＳＡ−４ ０．０６５ｍＭ、ＧＧＣＴ ０．０１３ｍｇ／ｍＬ（０．６２μＭ）とした。測定は以下の条件で行った。
装置：Ｆ−２５００（株式会社日立ハイテクノロジーズ）
励起波長：３７１ｎｍ
測定波長：４６６ｎｍ
結果は、図３に示す。

【0043】

図３から明らかなように、ＧＧＣＴを入れないＬＩＳＡ−４のみの条件では、殆ど蛍光の増加は見られなかった。したがって、ＧＧＣＴの酵素反応によるＬＩＳＡ−４からのＭＵの放出を実際に蛍光光度計にてモニターできることが明らかになった。

【0044】

実施例１０
ＬＩＳＡ−１０１またはＬＩＳＡ−１０２を基質としたＧＧＣＴ酵素反応のＨＰＬＣによる追跡アッセイ
ＧＧＣＴの酵素反応による本発明の化合物の切断を追跡するために、ＧＧＣＴとＬＩＳＡ−１０１またはＬＩＳＡ−１０２を反応させ、放出されるレソルフィンをＨＰＬＣによって追跡した。

【0045】

酵素反応は全て室温（２４℃）にて実施した。
以下の溶液１および溶液２を作製した。
溶液１：ｐＨ８．０トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ）にて作製したＬＩＳＡ−１０１またはＬＩＳＡ−１０２の０．３ｍＭ溶液
溶液２：ｐＨ８．０トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ）にて作製したＧＧＣＴ溶液（４μＬ、０．７０ｍｇ／ｍＬ）を３．５倍希釈した溶液（計１４μＬ）
次に、溶液１（４０μＬ）を、溶液２の全量に投入し、反応を開始した（ＬＩＳＡ−１０１またはＬＩＳＡ−１０２の初期濃度：０．２２ｍＭ）。各時点で、サンプリングした溶液（６μＬ）にトリフルオロ酢酸（６μＬ）を加え、反応を止めた。サンプルは、ＨＰＬＣ測定まで４℃にて保管した。

【0046】

各サンプルについて、ＨＰＬＣ（ＵＶ検出器）を用いてＬＩＳＡ−１０１またはＬＩＳＡ−１０２とレソルフィンの量を解析し、各量をプロットした。ＨＰＬＣ測定は、以下の条件で行った。
装置：ＬＣ−２０１０ＣＨＴ（株式会社島津製作所）
検出器：ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ（株式会社島津製作所）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（４．６ｘ１５０ｍｍ、粒径５μｍ、孔径１２ｎｍ）（株式会社ワイエムシィ）
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ液−０．１％トリフルオロ酢酸含有水、Ｂ液−０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル
濃度勾配制御：Ｂ液１０％−９０％（２５分）
流速：１ｍＬ／分
注入量：４μＬ
結果は、図４に示す。

【0047】

図４から、ＬＩＳＡ−１０１およびＬＩＳＡ−１０２はＧＧＣＴの基質となりうる化合物であり、ＧＧＣＴの酵素活性によって切断され、レソルフィンを放出することが明らかになった。
なお、ｐＨ６．５トリス塩酸緩衝液を用いた同様の実験系により、ＧＧＣＴによる酵素反応によってＬＩＳＡ−７およびＬＩＳＡ−１０からそれぞれｐ−ニトロフェノールおよび４−メチルウンベリフェロンが放出されることも確認できた。

【0048】

実施例１１
ＬＩＳＡ−１０１およびＬＩＳＡ−１０２とレソルフィンの蛍光スペクトル比較
ＧＧＣＴの酵素反応による本発明の化合物の切断を蛍光強度で追跡できるかどうかを確認するために、ＬＩＳＡ−１０１およびＬＩＳＡ−１０２とレソルフィンの蛍光スペクトルをそれぞれ測定した。
５％ＤＭＳＯを含むｐＨ８．０トリス塩酸緩衝液（１００ｍＭ）でそれぞれ１μＭのＬＩＳＡ−１０１およびＬＩＳＡ−１０２溶液、ならびにレソルフィン溶液を作製し、それぞれの溶液について蛍光スペクトルを測定した。蛍光スペクトル測定は、以下の条件で行った。
装置：Ｆ−２５００（株式会社日立ハイテクノロジーズ）
励起波長：５３０ｎｍ
測定波長：４００−８００ｎｍ
結果は、図５に示す。

【0049】

図５から明らかなように、レソルフィンは強い蛍光を発した（蛍光極大５８７ｎｍ）。一方、同条件において、ＬＩＳＡ−１０１およびＬＩＳＡ−１０２は殆ど蛍光を発しなかった。５８７ｎｍにおける蛍光を比較すると、レソルフィンはＬＩＳＡ−１０１と比べ約１１０倍、ＬＩＳＡ−１０２と比べ約５２０倍の蛍光を発した。したがって、５８７ｎｍ付近における蛍光は、レソルフィンに特徴的なシグナルであることが明らかになった。

【0050】

実施例１２
ＬＩＳＡ−１０１を基質としたＧＧＣＴ酵素反応の蛍光プレートリーダーによるモニター（リコンビナントＧＧＣＴ使用）
ＬＩＳＡ−１０１からのレソルフィンの放出を蛍光プレートリーダーにてモニターした。
以下の溶液を作製した。
Ａ液：５０μｇ／ｍＬ（１００ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０）のリコンビナントＧＧＣＴ
Ｂ液：４ｍＭのＬＩＳＡ−１０１（１００ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０）を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０で５０μＭに希釈したもの
Ａ液（２０μＬ、終濃度：５μｇ／ｍＬ）、Ｂ液（２０μＬ、終濃度：５μＭ）、および１００ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０（１６０μＬ）を、９６ウェルブラックプレートのウェル中で混合し、３７℃に設定したプレートリーダーにてインキュベートし、５分ごとに励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍで蛍光を測定した。測定は以下の装置を用いて行った。
使用機器：Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ウィヌースキ、バーモント州）
使用フィルター：励起５３０ｎｍ／２５ｎｍ、蛍光５９０ｎｍ／３５ｎｍ
結果は、図６に示す。

【0051】

図６から明らかなように、ＧＧＣＴを入れないＬＩＳＡ−１０１のみの条件では、殆ど蛍光の増加は見られなかった。したがって、ＧＧＣＴの酵素反応によるＬＩＳＡ−１０１からのレソルフィンの放出を実際に蛍光プレートリーダーにてモニターできることが明らかになった。

【0052】

実施例１３
ＬＩＳＡ−１０１を基質としたＧＧＣＴ酵素反応の蛍光プレートリーダーによるモニター（細胞破砕物中のＧＧＣＴ使用）
リコンビナントＧＧＣＴの代わりにＧＧＣＴ強制発現細胞の破砕物中のＧＧＣＴを用いて、ＬＩＳＡ−１０１からのレソルフィンの放出を蛍光プレートリーダーにてモニターした。
破砕物中のＧＧＣＴは、以下のようにして調製した。
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にレトロウィルスベクターを用いてＧＧＣＴを強制発現させたディッシュ上の細胞（５００，０００個）をリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄し、０．５％のプロテアーゼインヒビターカクテル［ナカライテスク株式会社（京都、日本）、商品コード２５９５５−１１］と０．１％のトリトンＸ−１００を含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μＬ中、スクレイパーで剥がした。その後、ソニケーションで細胞を破砕し、細胞破砕液（Ａ）とした。
ＬＩＳＡ−１０１を１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、５０μＭのＬＩＳＡ−１０１ストックソリューション（Ｂ）とした。
得られた細胞破砕液（Ａ）２０μＬ、ＬＩＳＡ−１０１ストックソリューション（Ｂ）２０μＬ、および１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１６０μＬを混合し、３７℃に設定したプレートリーダーにてインキュベートした。５分ごとに、励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍで蛍光を測定した。（終濃度ＬＩＳＡ−１０１：５μＭ、総溶液量：２００μＬ）。測定は実施例１２と同様の装置を用いて行った。
結果は、図７に示す。

【0053】

図７から明らかなように、細胞破砕物中のＧＧＣＴを用いた場合であっても、リコンビナントＧＧＣＴを用いた場合と同様に、ＬＩＳＡ−１０１からのレソルフィンの放出を蛍光プレートリーダーにてモニターできることが分かった。したがって、ＬＩＳＡ−１０１は、生細胞を用いた実験系にも適用可能な安定性を有していることが示唆された。

【産業上の利用可能性】

【0054】

本発明の化合物またはその薬理的に許容しうる塩をＧＧＣＴの基質として用いることにより、ＧＧＣＴの酵素活性によって該基質から発色団が放出され、該発色団の発色／蛍光を測定することによって直接的にＧＧＣＴ活性を測定することができるため、簡便かつ再現性のよいＧＧＣＴ活性の測定が可能となった。該基質は、ＧＧＣＴ阻害剤の開発、および癌イメージングなどの分野において有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】