特許 6333814 マイコバクテリア抗原ワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6333814

(24)【登録日】2018年5月11日

(45)【発行日】2018年5月30日

(54)【発明の名称】マイコバクテリア抗原ワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/04 20060101AFI20180521BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20180521BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180521BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180521BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180521BHJP

   A61P 31/06 20060101ALI20180521BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20180521BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/04ZNA

   C12N7/01

   C12N15/00 A

   C12N1/21

   C12P21/02 C

   A61P31/06

   A61K35/76

【請求項の数】27

【全頁数】84

(21)【出願番号】特願2015-520979(P2015-520979)

(86)(22)【出願日】2013年7月10日

(65)【公表番号】特表2015-524794(P2015-524794A)

(43)【公表日】2015年8月27日

(86)【国際出願番号】EP2013064624

(87)【国際公開番号】WO2014009438

(87)【国際公開日】20140116

【審査請求日】2016年7月6日

(31)【優先権主張番号】12305825.7

(32)【優先日】2012年7月10日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】12306539.3

(32)【優先日】2012年12月7日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】13305737.2

(32)【優先日】2013年6月3日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】599082883

【氏名又は名称】トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム

【氏名又は名称原語表記】ＴＲＡＮＳＧＥＮＥ Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100117787

【弁理士】

【氏名又は名称】勝沼 宏仁

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100176083

【弁理士】

【氏名又は名称】松山 祐子

(72)【発明者】

【氏名】エマヌエル、トゥピン

(72)【発明者】

【氏名】ロマン、ミコル

(72)【発明者】

【氏名】シャルル、アントワーヌ、クーペ

(72)【発明者】

【氏名】ジェネビーブ、アンショプ

(72)【発明者】

【氏名】マリー、グワンビク

(72)【発明者】

【氏名】ナタリー、シルベストル

(72)【発明者】

【氏名】ジャン−バティスト、マルシャン

(72)【発明者】

【氏名】セシル、ベニー

【審査官】 深草 亜子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０７０７００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０５７９０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１４４９５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５４３８９０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／０４

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｐ ３１／０６

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ７／０１

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも５つの異なる抗原または前記少なくとも５つの抗原をコードする核酸分子を含んでなり、前記抗原がマイコバクテリア種から独立して得られる、免疫原性組み合せ物であって、
前記少なくとも５つのマイコバクテリア抗原が、ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８からなる群から選択され、
免疫原性組み合わせ物が、活動感染期からの少なくとも１つの抗原、再燃感染期からの少なくとも１つの抗原、および潜伏感染期からの少なくとも１つの抗原を含んでなるまたはコードする多相性であり、かつ
免疫原性組み合わせ物が、少なくともＲｐｆＢおよびＲｐｆＤを含んでなるまたは発現する、
免疫原性組み合わせ物。

【請求項2】

マイコバクテリア抗原が、結核菌（Ｍｔｂ）、ウシ結核菌、ウシ結核菌ＢＣＧ、Ｍ．アフリカナム、Ｍ．カネッティ、Ｍ．カプレ、およびネズミ型結核菌からなる群から選択される結核菌群のマイコバクテリア種から得られる、請求項１に記載の免疫原性組み合せ物。

【請求項3】

活動期の１または複数の抗原が、ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）、ならびにＰＰＥファミリータンパク質Ｒｖ３４７８からなる群から選択される、請求項１または２に記載の免疫原性組み合せ物。

【請求項4】

免疫原性組み合わせ物が、少なくともＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）およびＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）を含んでなるまたは発現する、請求項３に記載の免疫原性組み合せ物。

【請求項5】

潜伏期の１または複数の抗原が、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２６２６およびＲｖ３４０７からなる群から選択される、請求項１または２に記載の免疫原性組み合せ物。

【請求項6】

少なくとも５つのマイコバクテリア抗原が、配列番号１〜１０および１２〜２４のいずれかと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組み合せ物。

【請求項7】

免疫原性組み合せ物が付加的マイコバクテリア抗原を含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組み合せ物。

【請求項8】

免疫原性組み合せ物が、別個のポリペプチドの形態で、または１以上の融合ポリペプチドの形態で、または別個の１または複数の抗原および１または複数の融合物の両形態でマイコバクテリア抗原を含んでなるまたはコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組み合せ物。

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組み合せ物に含まれる前記少なくとも５つのマイコバクテリア抗原の全てをコードする、核酸分子または核酸分子のセット。

【請求項10】

配列番号４０〜５１のいずれかで示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を示す、請求項９に記載の核酸分子または核酸分子のセット。

【請求項11】

請求項９または１０に記載の１以上の核酸分子または核酸分子のセットを含んでなるベクター。

【請求項12】

ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択されるプラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。

【請求項13】

ベクターがＥ１欠陥アデノウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。

【請求項14】

ベクターが、鶏痘、カナリア痘およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択されるポックスウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。

【請求項15】

ワクシニアウイルスベクターが、コペンハーゲン株、ワイエス株、ＮＹＶＡＣ株および改変アンカラ（ＭＶＡ）株である、請求項１４に記載のベクター。

【請求項16】

ベクターが、ウシ結核菌ＢＣＧ、乳酸菌属、リステリア菌属、サルモネラ菌属およびシュードモナス属からなる群から選択される細菌細胞である、請求項１１に記載のベクター。

【請求項17】

ｉ．Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ１７３３ｃおよびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドと、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター；
ｉｉ．Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ１７３３ｃおよびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドと、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター；
ｉｉｉ．Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ１７３３ｃおよびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドと、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター；
ｉｖ．Ａｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６ ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤおよびＲｖ１７３３ｃを含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ２０２９ｃ、ＴＢ１０．４、ＥＳＡＴ−６およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター；
ｖ．Ａｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６ ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤおよびＲｖ１７３３ｃを含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ２０２９ｃ、ＴＢ１０．４、ＥＳＡＴ−６およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター；ならびに
ｖｉ．ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター
からなる群から選択される、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項18】

感染性ウイルス粒子の形態である、請求項１１〜１５および１７のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項19】

感染性ウイルス粒子を生産する方法であって、（ｉ）請求項１２〜１５、１７および１８のいずれか一項に記載のウイルスベクターを好適な細胞株に導入する工程、（ｉｉ）前記細胞株を前記感染性ウイルス粒子の生産を可能とするための好適な条件下で培養する工程、（ｉｉｉ）生産されたウイルス粒子を前記細胞株の培養物から回収する工程、および（ｉｖ）場合により、前記回収されたウイルス粒子を精製する工程を含んでなる、方法。

【請求項20】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組み合せ物、請求項９または１０に記載の核酸分子もしくは核酸分子のセット、または請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。

【請求項21】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組み合せ物により含まれるまたはコードされる少なくとも５つのマイコバクテリア抗原の全ての組換えによる生産方法であって、（ｉ）請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のベクターを好適な宿主細胞に導入してトランスフェクトまたは感染宿主細胞を作出する工程、（ｉｉ）ｉｎ−ｖｉｔｒｏで前記トランスフェクトまたは感染宿主細胞を宿主細胞の増殖に好適な条件下で培養する工程、（ｉｉｉ）前記細胞培養物を回収する工程、および（ｉｖ）場合により、１または複数のマイコバクテリア抗原または融合ポリペプチドを、回収された細胞および／または培養上清から精製する工程を含んでなる、方法。

【請求項22】

前記好適な宿主細胞が大腸菌宿主細胞である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組み合せ物、請求項９または１０に記載の核酸分子もしくは核酸分子のセット、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のベクター、もしくは請求項２０に記載の宿主細胞のうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せを含んでなる、
マイコバクテリア感染を予防または治療する目的で使用するための、
必要とする対象者においてマイコバクテリアによる感染を予防するまたは感染のリスクを遅延させる目的で使用するための、
マイコバクテリア種に感染した対象者において活動性疾患を治療する目的で使用するための、
マイコバクテリア種に潜伏感染した対象者において再活性化を予防または治療する目的で使用するための、
ＢＣＧブースターとして使用するための、
マイコバクテリア感染に対して有効な１以上の化学療法薬と併用して、必要とする対象者においてマイコバクテリアによる感染を予防するまたは感染のリスクを遅延させる目的で使用するための、または、
投与された対象者において、マイコバクテリア種に対する免疫応答を誘導または増強する目的で使用するための、
医薬組成物。

【請求項24】

薬学上許容されるビヒクルをさらに含んでなる、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

マイコバクテリア種が結核菌である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。

【請求項26】

マイコバクテリア感染に対して有効な１以上の化学療法薬が、１以上の抗生物質化学療法である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。

【請求項27】

誘導または増強された免疫応答が、マイコバクテリア抗原／エピトープに対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋媒介Ｔ細胞応答である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、マイコバクテリア種の少なくとも５つの抗原を含んでなる新規な免疫原性組合せおよびその融合物、ならびにそのような組合せ抗原および融合物をコードする核酸分子に関し、前記抗原は、マイコバクテリア種、特に、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)（Ｍｔｂ）などの結核菌群のマイコバクテリアに由来する。本発明はまた、前記マイコバクテリア抗原および融合ポリペプチドの組合せを含んでなるまたはコードするベクター、宿主細胞および組成物、ならびにそれらを発現および生産するための方法に関する。本発明はまた、特に、マイコバクテリア感染またはマイコバクテリア感染により引き起こされるもしくは関連する任意の疾患に対する防御的応答を提供することを目的として免疫応答を誘導または刺激するために、前記マイコバクテリア抗原の組合せ、融合ポリペプチド、ベクター、宿主細胞、組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、マイコバクテリア感染の診断において使用することができる本発明の使用におけるマイコバクテリア抗原および融合ポリペプチドに対する抗体、ならびに前記マイコバクテリア抗原の組合せ、融合ポリペプチド、ベクター、宿主細胞および組成物を含んでなる診断キットに関する。

【背景技術】

【0002】

世界の人口の推定３分の１（すなわち、２０億人超）が結核菌（Ｍｔｂ）に感染し、毎年、新症例が９００万人〜１０００万人、死者が２００万人ということを考えれば、結核（ＴＢ）は地球規模の世界的健康問題である。結核菌（Ｍｔｂ）は、ＴＢの病原体である桿菌であり、１９９８年に完全に配列が決定された４４１１５２９塩基対（ｂｐ）の環状ゲノムを有する(Cole et al., 1998, Nature 393: 537-44)。Ｍｔｂは、およそ４０００の遺伝子をコードするが、これらの遺伝子の大部分のＭｔｂ生活環および病因における機能および役割はまだ解明されていない。別の遺伝子セットが、異なる一連の感染期、すなわち、活動期、その後の潜伏状態、および条件がそろった際の、新たな活動期に至る再燃期に発現するという仮説が長い間あった。近年の証拠がこの古典的ドグマを揺るがし、当分野では、今や、ある種の「漏れ」が起こっている、すなわち、様々な閾値で段階非依存的に遺伝子の発現が起こり得ると認知されつつある。さらに、Ｍｔｂの潜伏性にも、細菌はほとんど休眠しているのか、複製しないのか、それとも複製を続け、場合によっては感染細胞から隣接する気道に逃れ、それにより反復性の免疫応答を誘導するのか、議論がある(Ehlers et al., 2009, Infection 37: 87-95)。

【0003】

一般に、人から人への感染は、肺ＴＢ（活動性疾患）罹患者により生じた飛沫液滴によって起こる。感染者のうち（暴露者の推定３０％）、５〜１０％だけが暴露２年以内に活動性ＴＢ疾患を発症する（一次ＴＢとして知られる）。しかしながら、感染者の大多数は潜伏感染（ＬＴＢＩ）を生じ、臨床徴候または疾病の症状なく何十年も持ちこたえる。ＬＴＢＩは、感染者が感染を制御可能であるが細菌を完全に根絶することはできない平衡の状態を表す。再活性化（遠隔感染後の活動性ＴＢ）は後の段階、特に、高齢者、またはＨＩＶ感染およびＴＮＦ阻害剤処置の場合のような免疫不全者で起こり得る。ＴＢ再活性化のリスクは生涯で１０％と見積もられ、免疫障害はリスクを１年当たり１０％まで上昇させる。

【0004】

細胞性免疫系の刺激がＴＢ疾患の制御に役割を果たしていることを示唆する数系統の証拠が存在する(Rook et al. 2007, J Infect Dis 196:191-8)。ＣＤ４ Ｔリンパ球の、病原体を制御し、疾患の進行を抑える（Ｍｔｂ感染者のおよそ９０％）中枢的役割は十分確認されている。例えば、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞数の低いＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者はＴＢ疾患へと進行しやすいが、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を高める抗ウイルス処置はＴＢ疾患への進行を引き下げる。しかしながら、ＣＤ４ Ｔ細胞は単独では機能せず、ＣＤ８ Ｔ細胞および他のＴ細胞サブセットによって補助される。この点で、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦａ）遮断薬ならびにインターフェロン−γ（ＩＦＮｇ）および他の受容体欠損などの遺伝子多型を用いた実験は、この疾患の制御における特定のサイトカインおよびサイトカインネットワークの重要性を実証し、ヒトにおけるＴＢ制御の細胞性免疫的性質を含意する(Cooper et al., 2009, Annu Rev Immunol 27: 393-422)。

【0005】

Ｍｔｂにより引き起こされる毎年１００万人の死は、ワクチン（カルメット・ゲラン桿菌(Bacille-Calmette-Guerin)（ＢＣＧ））と抗生物質の両方が存在し、かつ、広く使用されていることを考えれば、特に劇的なことである。しかしながら、ＢＣＧは新生児および幼児における疾患の予防においては効果的であると思われるとしても、成人を防御せず、および潜伏感染者ではＭｔｂの再活性化を防ぐことができない。他方、種々の抗生物質合剤による活動性ＴＢの処置が有効であると思われるが、種々の薬物を数ヶ月間、毎日投与することに対して、患者の強いコンプライアンスを要する。さらに、抗生物質は適切に服用された場合、野生型Ｍｔｂ株には極めて有効であるが、ほとんどはこの長期間でコストのかかる薬物療法処置のために、大変な割合の薬剤耐性Ｍｔｂ株（例えば、「多剤耐性(MultiDrug Resistant)」（ＭＤＲ）、「広範囲薬剤耐性(eXtensively Drug-Resistant)」（ＸＤＲ）および「完全薬剤耐性(Totally Drug Resistant)」（ＴＤＲ）株）が出現する。従って、有効なＴＢワクチンの開発はこの懸念点の優先事項であり、ここ１０年の間に、ＢＣＧとＢＣＧブースターの置き換えという２つの主要なアプローチが検討されてきた。１ダースを超えるワクチン候補が現在、臨床試験下にある（総説としては、Ottenhoff and Kaufmann, 2012, PLoS 8(5): e1002607参照）。さらに、もっと最近では、当分野ではまた、Ｍｔｂ感染の処置を助けるための新規なワクチン処方物、新規な単独処置として、またはそうでなれば標準療法を補助するため、特に、薬剤耐性株の処置のために使用される、いわゆる「治療用ワクチン」を使用することに想到した。

【0006】

ＢＣＧの代替候補は、ＢＣＧの有効性および安全性を改善することを目的とし、主として、遺伝子改変ＢＣＧまたはＢＣＧには存在しない新たな抗原セットを発現するように、またはＢＣＧが発現するがおそらくは不十分なレベルであるＭｔｂ抗原を過剰発現するように、またはさらには有毒遺伝子およびそれらのレギュレーターを削除するように操作されたＭｔｂ株などの弱毒生菌に基づく。様々な組換えＢＣＧ構築物で、ＢＣＧに取って代わるそれらの能力を試験するために臨床試験に入っている。現在第ＩＩ相臨床試験下にある最も進んでいるＶＰＭ１００２は、免疫不全動物においてＢＣＧより安全であること、およびＭｔｂ投与に対してマウスにおいてより優れた防御を提供することが示されているリステリア菌(Listeria monocytogenes)由来のチオール活性化、コレステロール結合リステリオリシン（ｈｌｙ）を発現するウレアーゼ欠損ｒＢＣＧである(Grode et al., 2005, J Clin Invest 115: 2472-9)。それぞれＡｇ８５Ｂを発現するｒＢＣＧ３０と、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５ＢおよびＲｖ３４０７をパーフリンゴリシンとともに発現するＡＥＲＡＳ４２２の、２つのさらなるｒＢＣＧが最近、臨床評価に入った。

【0007】

ＢＣＧブースターは、細胞性および／または体液性免疫応答を誘導することを目的とし、一般的に、一般に強力なＴｈ１活性化アジュバントと混合したタンパク質組成物として、あるいは、ウイルス発現ベクターを介して、ＴＢ抗原を提供するために設計された組換えワクチンに頼る（総説としては、Thaissa et al., 2010, Yale J. of Biol. and Medicine 83: 209-15; Andersen, 2007, Nature 5: 484およびKaufman, 2012, Trend in Immunology 241: 1-7参照）。４０００の潜在的ＴＢ抗原について、それらのうちのいくつかが前臨床モデルで免疫原性をもたらした。

【0008】

最も進んでいるタンパク質に基づく候補の１つが、ＥＳＡＴ−６と融合されたＡｇ８５Ｂからなるハイブリッド１（Ｈ１）タンパク質である(Langermans et al., 2005, Vaccine 23: 2740-50; Dietrich et al., 2007, J. Immunol. 178: 3721-30)。ヒトにおいてＩＣ３１アジュバントとともに投与した場合、強いＣＤ４＋ Ｔｈ１ ＩＦＮｇ媒介応答が見られた(Van Dissel et al., 2010, Vaccine 28: 3571-81)。もっと最近では、このワクチンは、ＢＣＧまたは潜伏Ｍｔｂ感染のいずれかによって予め誘導された免疫応答を増強することが見出された(Van Dissel, 2011, Vaccine 29: 2100-9)。ＴＢ１０．４と融合されたＡｇ８５Ｂからなる別の融合タンパク質Ｈｙｖａｃ ４（Ｈ４）(Aagaard et al., PLoS One 4: 1-8)は、並行開発プログラムにある。セリンプロテアーゼＲｖ０１２５の中央部に挿入されたＲｖ１１９６から作製されたＧＳＫのＭ７２融合タンパク質は、種々の合成アジュバントとともに投与した場合、安全性および免疫原性の点で有利な臨床特性を示した(Von Eschen et al., 2009, Hum Vaccine 5: 475-82)。Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３６２０およびＲｖ２６０８から作製されたＩＤ８３(Baldwin et al., 2009, Vaccine 27: 3063-71)ならびに３つのＩＤ８３抗原と融合されたＲｖ３６１９を含むＩＤ９３(Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med 2(53): 53ra74)などの、いわゆるＩＤ融合タンパク質（ＷＯ２００８／１２４６４７）も挙げられる。

【0009】

臨床試験で試験されているウイルスベクターＴＢワクチンには、Ａｇ８５Ａ抗原を発現する改変型ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）（ＭＶＡ８５Ａ／Ａｅｒａｓ−４８５；ＷＯ２００６／７２７８７）、およびＡｇ８５Ａ、Ａｇ８５ＢおよびＴＢ１０．４抗原を発現する複製欠陥アデノウイルス（Ａｄ）３５（Ｃｒｕｃｅｌｌ Ａｄ３５／Ａｅｒａｓ−４０２；ＷＯ２００６／０５３８７１）が含まれる。ＭＶＡ８５Ａは、ナイーブ個体ならびにＢＣＧプライム個体の両方で免疫原性であり、高いＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導することが証明されたが(Mc Shane et al., 2004, Nat Med 10: 1240-4; Scriba et al., 2010, Eur J Immunol 40: 279-90)、Ａｅｒａｓ−４０２は、ＣＤ８ Ｔ細胞応答およびＩＦＮｇ応答に有利であると思われた(Radosevic et al., 2007, Infect Immunol 75: 4105-15; Magalhaes et al., 2008, PLoS One 3, e3790; Abel et al., 2010 Am J Respir Crit Care Med 181: 1407-17)。

【0010】

もっと最近の研究では、今般、多相組成物に焦点が当てられている（例えば、ＷＯ２００８／１２４６４７およびＷＯ２０１１／１４４９５１参照）。これらのワクチン候補のいくつかは、前臨床および臨床試験において、Ｍｔｂに対してロバストな細胞媒介性免疫応答を誘導する能力を証明する結果をもたらした(Thaissa et al., 2010, Yale J. of Biol. and Medicine 83: 209-15; Delogu et al., 2009, J Infect Developing Countries 3: 5-15)。例えば、潜伏型Ｍｔｂ Ｒｖ２６６０を活性型Ａｇ８５ＢおよびＥＳＡＴ−６抗原と組み合わせたＨ５６融合タンパク質は、まだ臨床試験には至っていないが、潜在的に有望なＢＣＧブースター活性を示した(Aagaard et al, 2011, Nature Med 17: 189-94; Lin et al., 2012, J Clin Invest 122: 303-14)。しかしながら、これらの研究は、抗原用量（例えば、Aagaard et al., PLoS One 4: 1-8）および投与経路(Goonetilleke et al., 2003, J. Immunol. 171: 1602-9)など、Ｔ細胞応答および防御有効性に及ぼす種々の因子の影響を強調している。

【発明の概要】

【0011】

結核は、資源が限られた地域での規定の標準治療に対する患者のコンプライアンスの低さ、ＨＩＶの共感染によるＴＢ流行の増悪、成人の防御には有効でないＢＣＧ接種の性能の低さといった種々の理由で、管理されていると言うにはほど遠い。高まりつつあるＴＢの世界的脅威および内在するＭｔｂ感染と抗マイコバクテリア免疫応答の複雑さという点で、特に風土病地域において、結核を診断、予防および治療するための改良されたワクチン戦略の必要性が依然としてある。

【0012】

本発明は、感染の自然経過のあらゆる相に合わせられたＭｔｂ抗原の免疫原性組合せを提供することにより、この、およびその他の必要を満たす。

【0013】

この技術的問題は、特許請求の範囲に定義される実施形態の提供によって解決される。

【0014】

本発明のその他、およびさらなる態様、特徴および利点は、下記の本発明の現在のところ好ましい実施形態の説明から明らかになる。これらの実施形態は、開示の目的で示されるものである。

【0015】

発明の簡単な概要
本発明は、一般に、少なくとも５つの異なる抗原または前記少なくとも５つの抗原をコードする核酸分子を含んでなる免疫原性組合せに関し、前記抗原は、マイコバクテリア種、特に、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)（Ｍｔｂ）などの結核菌群のマイコバクテリア種から独立に得られる。Ｍｔｂ抗原パネルをそれらの免疫原性および防御特性に基づいて分類するためにデータマイニングスコアリングシステムが開発され、使用された。配列アラインメント、生化学的およびバイオインフォマティクス的予測研究の際に、１４のＭｔｂ抗原が選択され、抗原／ベクター組合せおよび融合ポリペプチドとして組み合わせられた。

【0016】

本発明の一態様において、本発明の抗原組合せは多相性であり、少なくとも５つのマイコバクテリア抗原がマイコバクテリア感染の自然経過２つまたは３つの相、すなわち、活動期、潜伏期および再燃期に由来する。マイコバクテリア抗原は、本明細書に記載のように、混合物の形態でまたは１以上の融合ポリペプチドとして使用／発現され得る。

【0017】

本発明はまた、特定のマイコバクテリア抗原の融合ポリペプチド、このような融合ポリペプチドをコード／発現する核酸分子およびベクター、および前記融合ポリペプチドを含んでなるまたはコードする組成物、ならびに前記融合物、ベクターおよび組成物を作製する方法に関する。本発明はまた、このようなマイコバクテリア抗原および融合ポリペプチドに対する抗体に関する。本発明はさらに、マイコバクテリア感染の診断、予防もしくは治療、またはマイコバクテリア感染に関連する病態の改善を目的としたこのような免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、組成物または抗体の使用に関する。

【0018】

本発明のさらなる態様は、必要とする対象者において、マイコバクテリア感染を治療、予防もしくは阻害する、またはマイコバクテリア感染に関連する病態を改善する方法であって、この免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは組成物を提供または投与することを含んでなる方法、を含む。

【0019】

本発明のなおさらなる態様は、必要とする対象者において免疫応答を惹起する方法であって、この対象者において免疫応答を誘導もしくは刺激する目的、またはマイコバクテリア感染を予防もしくは治療する目的で、この免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは組成物を提供または投与することを含んでなる方法、に関する。

【0020】

本発明のなおさらなる態様は、複数の容器、および対象者にこの免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは組成物を提供または投与するための説明書を含んでなるパーツキットを提供する。

【0021】

本発明のなおさらなる態様は、この免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは組成物を含んでなる、マイコバクテリア感染（例えば、結核）の診断用の抗体アッセイのための試薬のキットを提供する。

【0022】

本発明により提供される抗原組合せは、個々の抗原に比べて改良されかつ予期されない免疫原性特性（例えば、免疫原性応答のレベル、質および／または範囲）を提供する。

【0023】

本発明は、マイコバクテリア感染分野で予防または治療目的の、例えば、Ｍｔｂ感染の予防および／または一次ＴＢの予防および／または潜伏感染者における再活性化の予防のための、単独でのまたはＢＣＧブースターとしての免疫療法に関して特に有用である。本発明はまた、標準的な（例えば、抗生物質療法）治療または現在開発されている他の任意の新規な治療（例えば、直接的または間接的小阻害分子；抗体または免疫療法など）と併用することもできる。本発明はまた、獣医学分野においても、例えば、動物、特にウシおよびヤギの育種において、マイコバクテリア感染および／または活動性疾患のリスクを軽減するまたは無くすために有用である。

【発明の具体的説明】

【0024】

本発明は、一般に、マイコバクテリア種の少なくとも５つの抗原を含んでなる免疫原性組合せ、または前記少なくとも５つの抗原をコードする核酸分子に関する。

【0025】

定義
本明細書に出願全体を通じて使用される用語「１つ(a)」および「１つ(an)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、それらが「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１以上」または「複数」の参照化合物または工程を意味するという意味で使用される。

【0026】

用語「および／または」は、本明細書で使用される場合はどこであれ、「および」、「または」および「前記用語により接続された要素の総てまたは他の任意の組合せ」の意味を含む。

【0027】

用語「約」または「およそ」は、本明細書で使用する場合、示された値または範囲の１０％以内、好ましくは８％以内、およびより好ましくは５％以内を意味する。

【0028】

用語「アミノ酸」、「残基」および「アミノ酸残基」は同義語であり、天然アミノ酸ならびにアミノ酸類似体（例えば、非天然、合成および、ＤまたはＬ光学異性体を含む修飾アミノ酸）を包含する。

【0029】

用語「ポリペプチド」は、共有結合的ペプチド結合を介して結合された少なくとも９以上のアミノ酸を含んでなるアミノ酸残基のポリマーを意味する。ポリペプチドは、直鎖、分岐型または環状であり得、天然アミノ酸および／またはアミノ酸類似体を含んでなり得る。ポリペプチドは、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、切断、ジスルフィド結合による架橋および／もしくはリン酸化によって、またはタグ（ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｆｌａｇなど）もしくはさらにはターゲティングペプチド（シグナルペプチド、膜貫通ドメインなど）の付加的アミノ酸を含有することによって、化学的に修飾されてもよい。用語「ポリペプチド」は、タンパク質（通常、５０以上のアミノ酸残基を含んでなるポリペプチドに対して使用される）、オリゴペプチド、およびペプチド（通常、５０未満のアミノ酸残基を含んでなるポリペプチドに対して使用される）を包含すると理解される。従って、各ポリペプチドは、特定のアミノ酸によって特徴付けることができ、特定の核酸配列によりコードされ得る。

【0030】

製品、組成物および方法を定義するために使用する際に本明細書で使用する場合、用語「含んでなる(comprising)」（および含んでなる(comprising)の任意の形態、例えば、「含んでなる(comprise)」および「含んでなる(comprises)」）、「有する(having)」（および有する(having)の任意の形態、例えば、「有する(have)」および「有する(has)」）、「含む(including)」（および含む(including)の任意の形態、例えば、「含む(includes)」および「含む(include)」または「含有する(containing)」（および含有する(containing)の任意の形態、例えば、「含有する(contains)」および「含有する(contain)」）は、オープンエンドであり、付加的な、列挙されていない要素または方法工程を排除しない。従って、ポリペプチドは、あるアミノ酸配列がそのポリペプチドの最後のアミノ酸配列の部分であり得る場合には、そのアミノ酸配列を「含んでなる」。このようなポリペプチドは、最大数百の付加的アミノ酸残基（例えば、本明細書で述べられるようなタグおよびターゲティングペプチド）を有し得る。「から本質的になる」とは、何らかの本質的に重要な他の成分または工程を排除することを意味する。従って、列挙されている成分から本質的になる組成物は、微量の混入物および薬学上許容される担体は排除しない。ポリペプチドは、あるアミノ酸配列が最終的に少数の付加的アミノ酸残基だけを伴って存在する場合に、そのアミノ酸配列「から本質的になる」。「からなる」とは、他の成分または工程の微量と言えない要素を排除することを意味する。例えば、ポリペプチドは、そのポリペプチドが、列挙されているアミノ酸配列以外のいずれのアミノ酸も含まない場合に、そのアミノ酸配列「からなる」。

【0031】

用語「同一性」は、２つのポリペプチド配列または核酸配列の間のアミノ酸とアミノ酸またはヌクレオチドとヌクレオチドの一致を意味する。２つの配列間の同一性パーセンテージは、最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップの数と各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列が共通に持つ同一の位置の数の関数である。当技術分野においては、例えばAtlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9)のＮＣＢＩまたはＡＬＩＧＮで利用可能なＢｌａｓｔプログラムなど、アミノ酸配列間の同一性パーセンテージを決定するための様々なコンピュータプログラムおよび数学的アルゴリズムが利用可能である。ヌクレオチド配列間の同一性を決定するためのプログラムもまた、専用のデータベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム）で利用可能である。例として、「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を意味する。

【0032】

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結される」とは、連結されている要素が、それらの意図される目的と協調して機能するように配置されることを意味する。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが転写開始部から終結部まで転写を遂行して、許容性宿主細胞内の核酸分子中のコード配列の発現をもたらすならば、その核酸分子に作動可能に連結されている。

【0033】

本明細書で使用する場合、用語「マイコバクテリア」、「マイコバクテリア種」および「マイコバクテリアの」は、マイコバクテリウム科(Mycobacteriaceae)に属する放線菌属(Actinobacteria)のいずれのメンバーも意味して互換的に使用される。これらの用語は、実験室株ならびに臨床単離株も包含する。

【0034】

「マイコバクテリア感染」は、対象者のマイコバクテリア種への暴露と、その後の対象者または対象者組織への細菌の定着を意味する。この定着は、重大な疾患（例えば、マイコバクテリアに応じて結核、らい病、ブルーリ潰瘍(Bureli ulcer)など）を引き起こすことがあり、あるいは有害な徴候をもたらさない場合もある（無症候性または潜伏感染）。

【0035】

用語「組合せ」は、本明細書で使用する場合、様々な成分（例えば、マイコバクテリア抗原および／またはコード核酸分子）のあり得る任意の構成を意味する。このような構成としては、マイコバクテリア抗原の混合物（例えば、個々の抗原の混合物および／または抗原の融合物）または核酸分子の混合物（例えば、１以上のベクターにより運ばれる）ならびに１または複数のポリペプチドと１または複数の核酸分子の混合物が含まれる。本発明は、等モル濃度の各成分を含んでなる組合せ、ならびに大きく異なる濃度の組合せを包含する。各マイコバクテリア成分の最適濃度は当業者によって決定することができると認識される。

【0036】

用語「免疫原性」とは、免疫原性と認定された成分が導入された対象者において、測定可能なＴ細胞および／またはＢ細胞媒介免疫応答を誘導または刺激する能力を意味する。例えば、本発明の抗原性の組合せは、それが対象者において免疫応答を誘導または刺激することができるという意味で免疫原性であり、この免疫応答は、先天性および／または特異的（すなわち、前記免疫原性組合せに含まれる、または前記免疫原性組合せにより発現される少なくとも１つのマイコバクテリア抗原／エピトープに対して）、体液性および／または細胞性（例えば、抗体および／もしくはサイトカインの生産、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ、Ｔリンパ球、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞などの活性化）であり得、通常、投与された対象者において防御的応答をもたらす。当技術分野では、本明細書に記載のようにｉｎ ｖｉｖｏ（動物またはヒト）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、生体サンプル）のいずれかで成分の免疫原性を評価するために、極めて多様な直接的または間接的生物アッセイが利用できる。

【0037】

本明細書で使用する場合、用語「マイコバクテリア抗原」は、マイコバクテリア種内に存在するもしくはマイコバクテリア種から得られるポリペプチド、または抗体もしくはＴ細胞受容体が結合することができるその断片（例えば、エピトープ）を意味する。一般に、このような抗原は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に関して特異的抗体またはＴ細胞受容体による認識に関与する１以上のＢおよび／またはＴエピトープ、特に、ＣＴＬまたはＴ_Ｈエピトープまたはその両方を含有する。本発明に関して、この用語は、天然のマイコバクテリアポリペプチドならびに以下に記載されるその断片および改変型（すなわち、変異体）を包含する。

【0038】

「エピトープ」は、抗体、Ｔ細胞受容体またはＨＬＡ分子により認識される部位を形成する最小のペプチドモチーフ（通常、８〜２５アミノ酸残基のセット）に相当する。それらの残基は、連続的であっても（直鎖エピトープ）または連続的でなくてもよい（互いに直接隣接しない残基を含むコンフォメーショナルエピトープ）。

【0039】

用語「処置する(treating)」（および処置する(treating)の任意の形態、例えば、「処置(treatment)」、「処置する(treat)」）は、本明細書で使用する場合、予防（例えば、マイコバクテリアに感染するリスクのある対象者の予防）および／または治療（例えば、マイコバクテリアに感染していると診断された対象者）を包含する。処置は、最終的に従来の治療法、特に、活動性マイコバクテリア疾患（例えば、ＴＢ）の処置に現行使用されているものと併用して、対象者に有効薬剤（例えば、本明細書に記載の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクターおよび／または組成物）を外的または内的に投与することを必要とする。

【0040】

用語「対象者」は一般に、マイコバクテリア種に対する免疫応答の誘導または刺激から利益を得る脊椎動物、特に、家畜、農用動物、競技用動物、および霊長類からなる群から選択される哺乳動物を意味する。好ましくは、対象者は、マイコバクテリア、特に、Ｍｔｂに感染していると診断されたか、または感染するリスクのある、従って、マイコバクテリア感染（例えば、活動性または潜伏結核）により引き起こされるもしくは関連する疾患または病態を有する可能性のある、または有するリスクのあるヒトである。

【0041】

「防御的応答」は、その処置が、処置されない対象者における応答に比べて処置された対象者に利益、例えば、免疫応答の誘導もしくは刺激、マイコバクテリア感染からの防御、または活動性疾患に対する抵抗性の増強、または潜伏マイコバクテリア感染の再活性化に対する予防、またはさらには活動性疾患発症後の治癒をもたらすという、その通常の意味を持つ。

【0042】

本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、その自然環境から取り出された（すなわち、自然状態でその成分と会合している少なくとも１つの他の成分から分離された）成分（例えば、ポリペプチド、核酸分子、ベクターなど）を意味する。

【0043】

用語「から得られる」、「起源する(originating)」または「起源する(originate)」は、成分（例えば、ポリペプチド、核酸分子）の起源を特定するために使用され、例えば化学合成であり得るか組換え手段であり得るかなどの、その成分が作製される方法を限定することを意味しない。

【0044】

マイコバクテリア種
上記で定義したように、本発明の免疫原性組合せによって含まれてなる／コードされるマイコバクテリア抗原は、現時点で同定されているマイコバクテリウム(Mycobacterium)（Ｍ．）種の任意のメンバーから独立に得ることができる。当技術分野では、本発明に関して使用するための極めて多数のマイコバクテリアが記載されている。例示的マイコバクテリア種としては、限定されるものではないが、Ｍ．フレイ(M. phlei)、スメグマ菌(M. smegmatis)、Ｍ．アフリカナム(M. africanum)、Ｍ．カネッティ(M. canetti)、Ｍ．フォルツイタム(M. fortuitum)、Ｍ．マリナン(M. marinum)、Ｍ．ウルセランス(M. ulcerans)、結核菌(M. tuberculosis)（Ｍｔｂ）、パラ結核菌(M. paratuberculosis)、ウシ結核菌(M. bovis)、ネズミ型結核菌(M. microti)、Ｍ．セラツム(M. celatum)、鳥結核菌(M. avium)、らい菌(M. leprae)、Ｍ．レプラムリウム(M. lepraemurium)、Ｍ．イントラセルラーレ(M. intracellulare)、Ｍ．スクロフラセウム(M. scrofulaceum)、Ｍ．キセノピ(M. xenopi)、Ｍ．ゲナベンス(M. genavense)、Ｍ．カンサシイ(M. kansasii)、Ｍ．シミエ(M. simiae)、Ｍ．シュルガイ(M. szulgai)、Ｍ．ヘモフィルム(M. haemophilum)、Ｍ．アジアティカム(M. asiaticum)、Ｍ．マルモエンス(M. malmoense)、Ｍ．バッカエ(M. vaccae)、Ｍ．カプレ(M. caprae)、Ｍ．ピンニペディ(M. pinnipedii)およびＭ．シモイデイ(M. shimoidei)が挙げられる。

【0045】

好ましい実施形態では、本発明での使用におけるマイコバクテリア抗原は、結核疾患を引き起こすと従来から考えられている種、ならびに免疫不全者（例えば、ＨＩＶ感染患者）において結核および肺疾患を引き起こす環境性および日和見性のマイコバクテリア種を含む結核菌群のマイコバクテリア種から得られる。本明細書で使用するための結核菌群の例示的な種としては、限定されるものではないが、結核菌（Ｍｔｂ）、ウシ結核菌、ウシ結核菌ＢＣＧ、Ｍ．アフリカナム、Ｍ．カネッティ、Ｍ．カプレ、およびネズミ型結核菌が挙げられる。好ましい実施形態は、Ｈ３７ＲｖおよびＨ３７ＲａなどのＭｔｂ実験室株、およびＫＺＮ４２０７、Ｔ８５、ＣＤＣ１５５１（米国で単離）、Ｆ１１（南アフリカで単離）、Ｃ、Ｋ８５（オランダで単離）、ＣＰＨＬ−Ａなどの臨床単離株、ならびにＴＮ５９０４、Ｈａａｒｌｅｍ、ＫＺＮ１４３５、ＢｅｊｉｎｇおよびＫＺＮ６０５などのＭＤＲまたはＸＤＲ単離株を含むＭｔｂに関する。特に獣医学的使用のためのマイコバクテリア抗原供給源としての他の好ましい種は、ウシ結核菌、ウシ結核菌ＢＣＧおよびＭ．カプレである。しかしながら、Ｍ．種間に存在するアミノ酸およびヌクレオチドレベルでの高い相同性パーセンテージを考えれば、実際には交差反応性が予想される。例えば、Ｍｔｂおよびウシ結核菌のＲｖ１７３３抗原は１００％同一であるが、Ｍ．アフリカナムＲｖ１７３３は、Ｍｔｂと、２１０のアミノ酸のうち２０９が共通している。従って、Ｍｔｂ抗原の組合せは、Ｍｔｂ感染者（ヒト用途）と、ウシ結核菌およびＭ．カプレ（獣医学的用途）感染者の両方を処置するために有用である可能性がある。

【0046】

好適なマイコバクテリア抗原のアミノ酸配列およびコードヌクレオチド配列は、専門のデータバンクおよび文献において容易に入手できる。例えば、Ｍｔｂ配列は、Cole et al. (1998, Nature 393: 537)またはthe Wellcome Trust Sanger Institute, lnstitut Pasteurおよびその他（例えば、TB database (@tbdb.org)およびtuberculist (@tuberculist.epfl.ch)により管理されているものなどのウェブサイトに見出すことができる。しかしながら、本発明は、これらの例示的マイコバクテリア種に限定されない。実際に、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、異なる単離株および株間で異なる場合があり、この天然の遺伝的バリエーションも、下記のような非天然改変とともに本発明の範囲内に含まれる。

【0047】

免疫原性組合せ
本明細書で使用する場合、「少なくとも５つ」は、５〜５０（すなわち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５など）、望ましくは５〜３３、好ましくは７〜２０、およびより好ましくは８〜１８の範囲内に含まれる数であり、１０〜１５（例えば、１２、１３または１４）が特に好ましい。好ましくは、本発明の組合せは、およそ１０〜１５のＭｔｂ抗原または対応する核酸分子を含んでなる。

【0048】

本発明に関して、「少なくとも５つのマイコバクテリア抗原」は互いに異なる（例えば、その組合せが少なくとも５つの異なるマイコバクテリア抗原を含んでなる／コードする限り、同じマイコバクテリア抗原の複数コピーを使用することができる）。

【0049】

代わりにまたは加えて、少なくとも５つのマイコバクテリア抗原のそれぞれが天然マイコバクテリア抗原（例えば、全長抗原）またはその改変型（断片または変異体）であり得る。

【0050】

「天然」マイコバクテリア抗原は、自然界のマイコバクテリア源から発見、単離、取得することができる。このような供給源としては、マイコバクテリアに感染したまたは曝された対象者から採取された生体サンプル（例えば、血液、血漿、血清、唾液、痰、組織切片、生検試料など）、寄託機関（例えば、ＡＴＣＣまたはＴＢ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）、ライブラリーにおいて入手可能な、または文献に記載されている、培養細胞ならびに組換え材料（例えば、マイコバクテリア単離株、マイコバクテリアゲノム、ゲノム断片、ゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡ、ならびにこのような要素を含むことが当技術分野で知られている任意のプラスミドおよびベクター）が含まれる。

【0051】

改変マイコバクテリア抗原（例えば、変異体）は一般に、本明細書に具体的に開示されているポリペプチドまたは天然のものとは１以上の位置が異なる。１以上のアミノ酸残基の置換、挿入、付加および／または欠失、非天然構成ならびにこれらの可能性の任意の組合せを含む、いずれの改変も想定することができる。アミノ酸置換は、保存的であっても保存的でなくてもよい。いくつかの改変が企図される場合、それらは連続的残基に関するものでも、かつ／または非連続的残基に関するものでもよい。１または複数の改変は、部位特異的突然変異誘発（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ、レ・ジュリス、フランスのＳｃｕｌｐｔｏｒ（商標）ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発システムの使用）、ＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリングおよび合成技術（例えば、所望のポリペプチド変異体をコードする合成核酸分子を生じる）などの当業者に公知のいくつかの方法によって作出することができる。

【0052】

それらの起源（天然または改変）は何であれ、本発明の免疫原性組合せに含まれるまたはコードされるマイコバクテリア抗原のそれぞれがＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含む対応する天然抗原の１以上の免疫原性部分を保持することが好ましい。このような関連のある免疫原性部分を特定するための方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｔ細胞エピトープは、生物アッセイ（例えば、合成オーバーラッピングオリゴペプチドのライブラリーを使用するＩＦＮｇアッセイ）または利用可能な予測プログラムを実施することにより特定することができる。

【0053】

一実施形態では、本発明の免疫原性組合せは、活動期、再燃期および潜伏期からなる群から選択される少なくとも２つの異なる感染期（例えば、活動期と再燃期、活動期と潜伏期、または再燃期と潜伏期）からのマイコバクテリア抗原を含んでなるまたはコードする。好ましい組合せは、３つの感染期からのマイコバクテリア抗原、特にＭｔｂ抗原を含んでなるまたはコードする「多相性」であり、少なくとも１つの抗原が活動感染期に由来し、少なくとも１つの抗原が再燃感染期に由来し、少なくとも１つの抗原が潜伏感染期に由来する。

【0054】

「活動期の抗原」は一般に、マイコバクテリアがｉｎ ｖｉｖｏにおいて活発に増殖および複製している際に主として発現されるタンパク質のセットである。本発明において使用するための多数の活動期マイコバクテリア抗原が文献に記載されている（例えば、Bertholet et al., 2008, J. Immunol. 181: 7948-57; Bertholet and al., 2010, Sci Transl Med 2: 53ra74）。特に、適当な活動期の１または複数の抗原は、ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、ＣＦＰ−１０（Ｒｖ３８７４）、ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）、Ａｇ８５Ａ（Ｒｖ３８０４）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、ならびにＰＰＥファミリータンパク質Ｒｖ３４７８およびＲｖ２６０８およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。好ましい免疫原性組合せは、少なくともＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）およびＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）を含んでなるまたはコードする。

【0055】

「潜伏期の抗原」は、マイコバクテリアが長期間存続できる低代謝活性の可逆的状態であるマイコバクテリア感染の休眠（または潜伏）期の際に主として発現される。本発明において使用するための多数の潜伏期マイコバクテリア抗原が文献に記載されている。例示的Ｍｔｂ潜伏期抗原は、栄養素の枯渇の際にアップレギュレートされる低酸素抗原および飢餓抗原に対する細菌応答を媒介するＤｏｓＲレギュロンによりコードされているものである(Voskuil et al., 2003, J. Exp Med 198: 705-13; Leyten et al., 2006, Microbes Inf. 8: 2052-60; Roupie et al., 2007, Infection and Immunity 75: 941-9; Black et al., 2009, Clin Vaccine Immunol 16: 1203-12; Schuck et al., 2009, PLoS One 4: e5590; Vipond et al., 2006, Vaccine 24: 6340-50; Vipond et al., 2007, Tuberculosis 86: 218-24; Bertholet et al., 2008, J. Immunol. 181: 7948-57; Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med 2: 53ra74, Mollenkopf et al., 2004, Infect Immun 72: 6471-9);ＷＯ０３／０００７２１；ＷＯ０３／００４５２０；ＷＯ０３／０３５６８１；ＷＯ２００４／００６９５２およびＷＯ２００６／１０４３８９)。特に、適当な潜伏期の１または複数の抗原は、Ｒｖ００８１、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ０１９８、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１７３５、Ｒｖ１７３７、Ｒｖ１８０６、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２００５ｃ、Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ２６２７、Ｒｖ２６２８、Ｒｖ２６６０ｃ、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３８１２およびＲｖ３４７８およびそれらの任意の組合せからなる群から；より好ましくは、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ１７３３、Ｒｖ２０２９およびＲｖ２６２６から、またはＲｖ０５６９、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８から、またはＲｖ０１１１、Ｒｖ１７３３、Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８の両方からなる群から選択される。

【0056】

「再燃期の抗原」は、休眠状態と活発な増殖および複製（マイコバクテリア感染の活動状態）との間の遷移期に主として発現される、または遷移に関与する任意の抗原を意味する。本発明において使用するための再燃期抗原は文献に記載されている（例えば、Mukamolova et al., 2002, Mol Microbiol 46: 623-35; Yeremeev et al., 2003, Infection and Immunity 71: 4789-94; Mukamolova et al., 2006, Mol Microbiol 59: 84-98; Tufariello et al., 2006, Infect Immun 74: 2985-95; Biketov et al., 2007, MMC Infect Dis 7: 146; Kana et al., 2008, Mol Microbiol 67: 672-84; Kana et al., 2009, FEMS Immunol Med Microbiol 58: 39-50; Russel-Goldman et al., 2008, Infect Immun 76: 4269-81; Gupta et al., 2010, Microbiol 156: 2714-22およびCommandeur et al., 2011, Clin Vaccine Immunol. 18: 676-83）。特に、適当な再燃期の１または複数の抗原は、ＲｐｆＡ、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＣ、ＲｐｆＤおよびＲｐｆＥおよびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。好ましい免疫原性組成物は、少なくともＲｐｆＢおよびＲｐｆＤ（例えば、その免疫原性断片）を含んでなるまたはコードする。

【0057】

好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組合せは、ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、ＣＦＰ−１０（Ｒｖ３８７４）、ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）、Ａｇ８５Ａ（Ｒｖ３８０４）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、ＲｐｆＡ、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＣ、ＲｐｆＤ、ＲｐｆＥ、Ｒｖ００８１、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ０１９８、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１７３５、Ｒｖ１７３７、Ｒｖ１８０６、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２００５ｃ、Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ２６２７、Ｒｖ２６２８、Ｒｖ２６６０ｃ、Ｒｖ３４０７ Ｒｖ３４７８、およびＲｖ３８１２からなる群から；好ましくは、ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８からなる群から；およびより好ましくは、配列番号１〜１４で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドまたはその任意の変異体もしくは断片の群から選択される少なくとも５つのマイコバクテリア抗原を含んでなるまたはコードする。

【0058】

例として、配列番号１はＲｖ０１１１のアミノ酸配列を；配列番号２はＴＢ１０．４のアミノ酸配列を；配列番号３はＲｖ０５６９のアミノ酸配列を；配列番号４はＲｐｆＢのアミノ酸配列を；配列番号５はＲｖ１７３３のアミノ酸配列を；配列番号６はＲｖ１８０７のアミノ酸配列を；配列番号７はＲｖ１８１３のアミノ酸配列を；配列番号８はＡｇ８５Ｂのアミノ酸配列を；配列番号９はＲｖ２０２９のアミノ酸配列を；配列番号１０はＲｖ２６２６のアミノ酸配列を；配列番号１１はＲＶ２８３９ｃのアミノ酸配列を；配列番号１２はＲｖ３４０７のアミノ酸配列を；配列番号１３はＲｖ３４７８のアミノ酸配列を；配列番号１４はＥＳＡＴ−６のアミノ酸配列を表す。

【0059】

本発明に関して想定され得る各改変マイコバクテリア抗原は、天然対応物に対する１以上の改変、特に、得られるポリペプチドの合成、プロセシング、安定性および／もしくは溶解度に対する、ならびに／またはその免疫原性に対して有益な１以上の改変を含んでなる。好適な改変の代表例としては、限定されるものではないが、（ａ）１または複数の内部高疎水性領域の欠失、（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチドの欠失（必要であれば、異種のものとの置換）、および／または（ｃ）安定性、免疫原性および組換え発現に悪影響を及ぼし得る非折り畳み領域の欠失、および／または（ｄ）生物活性を消失させるための触媒ドメインの欠失または突然変異が挙げられる。

【0060】

特に、適当な免疫原性組成物は、配列番号１５〜２４で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの群から選択されるマイコバクテリア抗原を含んでなるまたはコードする。より具体的には、配列番号１５は、天然対応物に対して、疎水性のＮ末端部分（最初の残基〜約３９３番）の欠失により改変されたＲｖ０１１１抗原（Ｒｖ０１１１^＊）を表す。配列番号１６は、天然対応物に対して、シグナルペプチド（最初の残基〜およそ２９番の残基）の欠失、および触媒ドメインの欠失によって改変され、従って、ＲｆｐＢのおよそ３０番〜２８３番を保持するＲｐｆＢ抗原を表す。配列番号１７は、天然対応物に対して、Ｎ末端推定ＴＭドメイン（最初の残基〜約６１番）の欠失によって改変されたＲｖ１７３３抗原（Ｒｖ１７３３^＊）を表す。配列番号１８は、天然対応物に対して、非折り畳みＣ末端部分（最後のおよそ６０残基）の欠失によって改変されたＲｖ１８０７抗原（Ｒｖ１８０７^＊）を表す。配列番号１９は、天然対応物に対して、Ｎ末端シグナルペプチド（最初の残基〜約３４番）の欠失によって改変されたＲｖ１８１３抗原（Ｒｖ１８１３^＊）を表す。配列番号２０は、天然対応物に対して、Ｎ末端シグナルペプチド（最初の残基〜約３９番）の欠失によって改変されたＡｇ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ^＊）を表す。配列番号２１は、天然対応物に対して、Ｃ末端部分（最後のおよそ２５残基）の欠失によって改変され、かつ、Ｒｖ２０２９酵素活性を消失させるために２６５番を突然変異させた（例えば、Ｄ２６５Ｎ；Cabrera et al., 2010, Arch Biochem Biophys 502: 23-30）Ｒｖ２０２９抗原（Ｒｖ２０２９^＊）を表す。配列番号２２は、天然対応物に対して、関連する酵素活性を消失させることを目的とした３つの突然変異（例えば、Ｅ２９２Ｋ、Ｔ３１５ＡおよびＱ３４７Ａ）と最後の７残基の欠失を含み、触媒ドメイン（ＬＤ、すなわち、リゾチームドメインとも呼ばれる）ように改変されたＲｐｆＤ抗原を表す。配列番号２３は、天然対応物に対して、非折り畳みＣ末端部分（最後のおよそ３３残基）の欠失によって改変されたＲｖ３４０７抗原（Ｒｖ３４０７^＊）を表す。配列番号２４は、天然対応物に対して、非折り畳みＣ末端部分（最後のおよそ４０残基）の欠失によって改変されたＲｖ３４７８抗原（Ｒｖ３４７８^＊）を表す。

【0061】

好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組合せは、本明細書に示されるアミノ酸配列と、その全長ポリペプチドまたはその断片（例えば、５０以上の連続するアミノ酸残基、例えば、６０、７５、８０またはさらには９０のアミノ酸残基の断片）にわたって少なくとも８０％の同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性）を示す少なくとも５つのマイコバクテリア抗原、特に、配列番号１〜２４（開始Ｍｅｔを含むまたは含まない）のいずれかと少なくとも８０％相同または同一のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの群から選択される少なくとも５つのＭｔｂ抗原を含んでなるまたはコードする。

【0062】

より好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組合せは、少なくともＲｖ０１１１を含んでなり、または発現し、配列番号１５で示されるＲｖ０１１１^＊が特に好ましい。

【0063】

さらにより好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組合せは、少なくともＲｖ０１１１、Ｒｖ２６２６、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、ＴＢ１０．４およびＡｇ８５Ｂを含んでなり、または発現し、配列番号１５で示されるＲｖ０１１１^＊、配列番号１０で示されるＲｖ２６２６、配列番号１６で示されるＲｐｆＢ、配列番号２２で示されるＲｐｆＤ、配列番号２で示されるＴＢ１０．４および配列番号２０で示されるＡｇ８５Ｂが特に好ましい。

【0064】

前述のように、本発明の免疫原性組合せは、その構成要素であるマイコバクテリア抗原および／またはコード核酸分子の任意の構成を包含する。従って、本発明の免疫原性組合せは、別個のポリペプチド（例えば、組換えにより生産されたＭｔｂ抗原の混合物）の形態で、または１以上の融合ポリペプチド（少なくとも２つのマイコバクテリア抗原の共有結合的連結）の形態で、または１または複数の別個の抗原と１または複数の融合物の両方として、マイコバクテリア抗原を含んでなり得る、またはコードし得る。

【0065】

同様に、核酸分子の組合せは、別個の核酸分子もしくは共有結合的に連結された核酸分子（例えば、融合物コード核酸）のいずれか、または１以上のベクターにより運ばれ得る別個の核酸分子と融合された核酸分子の両方を包含する。マイコバクテリア抗原の数（５〜最大５０）の数を考えれば、好ましい組合せは、下記のような抗原融合物をコードする１以上のベクターを含んでなる。ベクターの組合せとしては、本明細書に記載の様々なマイコバクテリア抗原または融合物を発現させるために同じタイプのベクター（例えば、２つのＭＶＡ）または異なるタイプのベクター（例えば、プラスミドＤＮＡとＭＶＡ）を使用することができる。

【0066】

融合ポリペプチド
別の態様によれば、本発明はまた、本発明の免疫原性組合せにより含まれるまたはコードされる２以上のマイコバクテリア抗原を含んでなる単離された融合ポリペプチドならびにこのような融合ポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。

【0067】

用語「融合」または「融合ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、２以上のポリペプチドの単一のポリペプチド鎖における共有結合的連結を意味し、遺伝的手段、すなわち、前記ポリペプチドのそれぞれをコードする核酸分子を融合することによって行われる。「インフレームで融合される」とは、融合されたコード配列が発現すると、融合されたポリペプチドのそれぞれの間に翻訳ターミネーターを含まない単一のポリペプチドが生じることを意味する。融合は、直接的（すなわち、間に付加的アミノ酸残基を含まない）であっても、または間接的（例えば、融合ポリペプチド間のリンカーによる）であってもよく、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端または内部において起こってよい。リンカーの存在は、融合ポリペプチドの適正な折り畳みおよび／または機能を助長し得る。本発明は、使用するリンカー配列の形態、サイズまたは数によって限定されない。例として、典型的なリンカーは３〜３０アミノ酸長であり、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アラニンおよび／またはプロリンなどのアミノ酸残基の繰り返しから構成される。

【0068】

以上のように、本発明の融合ポリペプチドを形成するマイコバクテリア抗原は天然型、および／または上記のようなその改変型（変異体）および／または断片であってもよい。融合ポリペプチドの形態で使用するためのこのようなマイコバクテリア抗原の組合せは、別個の抗原の混合物（または発現ベクター）中で使用される同じ抗原組合せに比べて改良された免疫原性を提供し得る。

【0069】

好ましくは、本発明の融合ポリペプチドは、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６など）の本明細書に記載のマイコバクテリア抗原、好ましくは、配列番号１〜２４のいずれかと少なくとも８０％（例えば、９８または１００％）同一のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドの群から選択される少なくとも２つのポリペプチドを含んでなる。

【0070】

一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、同じ感染期のマイコバクテリア抗原を含んでなる。潜伏期Ｍｔｂ抗原の例示的融合物は、Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ１７３３およびＲｖ０１１１を含んでなり；活動期Ｍｔｂ抗原の例示的融合物は、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ６を含んでなり；再燃期Ｍｔｂ抗原の例示的融合物は、ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤ抗原を含んでなる。

【0071】

別の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、２つの異なる感染期からの、またはさらには活動期、再燃期および潜伏期からのマイコバクテリア抗原を含んでなる。このタイプの例示的融合物としては、限定されるものではないが、Ｒｖ２０２９、ＴＢ１０．４、ＥＳＡＴ−６およびＲｖ０１１を含んでなる潜伏期Ｍｔｂ抗原と活動期Ｍｔｂ抗原の融合物；ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６を含んでなる再燃期Ｍｔｂ抗原と活動期Ｍｔｂ抗原の融合物；ならびにＡｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６、ＲｐｆＢ、−ＲｐｆＤおよびＲｖ１７３３を含んでなる潜伏期Ｍｔｂ抗原と再燃期Ｍｔｂ抗原と活動期Ｍｔｂ抗原の融合物が挙げられる。

【0072】

好ましい実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、
・Ｍｔｂ抗原Ｒｖ０１１１（配列番号１５で示されるＲｖ０１１１が特に好ましい）を含んでなる融合ポリペプチド；
・Ｍｔｂ抗原Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ１７３３およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチド；
・Ｍｔｂ抗原Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチド；
・Ｍｔｂ抗原Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ６を含んでなる融合ポリペプチド；
・Ｍｔｂ抗原ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤを含んでなる融合ポリペプチド（例えば、ＬＤ欠損ＲｐｆＢ抗原と酵素活性を消失させる突然変異を有するＲｐｆＤのＬＤドメインとの間の融合物である、いわゆるＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂにより示される通り）；
・Ｍｔｂ抗原ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ（例えば、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ）、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ６を含んでなる融合ポリペプチド；
・Ｍｔｂ抗原Ａｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ（例えば、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ）およびＲｖ１７３３を含んでなる融合ポリペプチド；
・Ｍｔｂ抗原Ｒｖ２０２９、ＴＢ１０．４、ＥＳＡＴ６およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチド；および
・Ｍｔｂ抗原Ａｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６およびＲｖ１７３３を含んでなる融合ポリペプチド
からなる群から選択される。

【0073】

本発明に関して、例示的融合ポリペプチドにおいて特定されたマイコバクテリア抗原は、Ｎ末端からＣ末端へといずれの順序であってもよく、列挙された順序である必要はない。従って、Ｍｔｂ抗原Ａｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６およびＲｖ１７３３を含んでなる融合物は、列挙されているＡｇ８５Ｂ−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３融合物に対してさらにＡｇ８５Ｂ−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ２６２６；Ｒｖ１７３３−Ｒｖ２６２６−Ａｇ８５Ｂ；Ｒｖ１７３３−Ａｇ８５Ｂ−Ｒｖ２６２６；Ｒｖ２６２６−Ａｇ８５Ｂ−Ｒｖ１７３３；Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ａｇ８５ＢおよびＡｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−Ｒｖ２６２６−Ａｇ８５Ｂなどの融合物を包含する。

【0074】

マイコバクテリア抗原に関してさらに、本発明の免疫原性組合せおよび／または融合ポリペプチドは、場合により、マイコバクテリア種に由来し得る（例えば、１または複数の付加的マイコバクテリア抗原）または異種であり得る（すなわち、マイコバクテリアの異なる供給源由来の）他の成分を含んでなってもよい。このような１または複数の付加的成分は免疫原性であってもなくてもよい。代表的な付加的成分としては、限定されるものではないが、１または複数のタグペプチド、１または複数のターゲティングペプチド、１または複数のオリゴマー化ドメイン、１または複数のイムノアクチベーターペプチド／ポリペプチドおよびこのような１または複数の要素をコードする１または複数の核酸分子が挙げられる。

【0075】

一実施形態では、本発明の免疫原性組合せまたは融合ポリペプチド中に存在する、またはそれによりコードされる１または複数の任意のマイコバクテリア抗原は、シグナルペプチドおよび／または膜貫通ペプチドなどのターゲティングペプチドに作動可能に連結されてよい。このようなターゲティングペプチドは、当技術分野で周知である（例えば、ＷＯ９９／０３８８５参照）。簡単に述べれば、シグナルペプチド（ＳＳ）は、一般に、膜提示型または分泌型ポリペプチドのＮ末端に存在し、それらの小胞体（ＥＲ）への経路を開始させる。シグナルペプチドは、１５以上の本質的に疎水性のアミノ酸を含んでなり、これはその後、ＥＲに局在する特異的エンドペプチダーゼによって除去されて成熟ポリペプチドとなる。膜貫通ペプチド（ＴＭ）は、通常、本来は疎水性が極めて高く、細胞膜にポリペプチドを係留する働きをする。本発明に関して使用可能な膜貫通シグナルペプチドおよび／またはシグナルペプチドの選択肢は極めて広い。前記ペプチドは、膜係留型および／または分泌型ポリペプチド（例えば、細胞ポリペプチドまたはウイルスポリペプチド）、例えば、免疫グロブリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、インスリン、狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスエンベロープ糖タンパク質または麻疹ウイルスＦタンパク質のポリペプチドから得てもよいし、または合成してもよい。シグナルペプチドの好ましい挿入部位はＮ末端の転写開始コドンの下流であり、膜貫通ペプチドの好ましい挿入部位はＣ末端の、例えば、終止コドンのすぐ上流である。

【0076】

代わりにまたは加えて、本発明の免疫原性組合せまたは融合ポリペプチド中に存在する、またはそれによりコードされる１または複数の任意のマイコバクテリア抗原は、その単離および検出を容易にするため、またはこのような抗原または融合物を発現する宿主細胞の同定を容易にするために、タグペプチドと作動可能に連結されてもよい。限定されるものではないが、ＰＫタグ、ＦＬＡＧタグ（配列番号２５）、ＭＹＣタグ（配列番号２６）、ポリヒスチジンタグ（通常、５〜１０個のヒスチジン残基のストレッチ；例えば、配列番号２７）を含む、極めて多様なタグペプチドが本発明に関して使用可能である。タグペプチドは、付属の実施例に記載されているような抗タグ抗体を用いた免疫検出アッセイによって検出することができる。１または複数のタグペプチドは独立に、マイコバクテリア抗原または融合物のＮ末端に位置していてもよいし（タグ−ポリペプチド）、あるいはまたそのＣ末端に位置していてもよいし（ポリペプチド−タグ）、あるいはまた内部に位置していてもよいし、あるいはいくつかのタグを使用する場合にはこれらの位置のいずれに位置していてもよい。

【0077】

代わりにまたは加えて、本発明の免疫原性組合せまたは融合ポリペプチド中に存在する、またはそれによりコードされる１または複数の任意のマイコバクテリア抗原は、免疫原性特性を増強することができる１以上のイムノアクチベーターペプチド／ポリペプチドと作動可能に連結されてもよい。例えば、カルレティキュリン(Cheng et al., 2001, J. Clin. Invest. 108: 669)、Ｍｔｂ熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）(Chen et al., 2000, Cancer Res. 60: 1035)、ユビキチン(Rodriguez et al., 1997, J. Virol. 71: 8497)、およびＴヘルパーエピトープ、例えば、Ｐａｎ−Ｄｒペプチド(Sidney et al., 1994, Immunity 1: 751)、ｐｓｔＳ１ ＧＣＧエピトープ(Vordermeier et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2631)、破傷風トキソイドペプチドＰ２ＴＴ(Panina-Bordignon et al., 1989, Eur. J. Immunol. 19: 2237)、Ｐ３０ＴＴ(Demotz et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 425)、ヘマグルチニンエピトープ(Rothbard et al., 1989, Int. Immunol. 1: 479)およびＣ４ｂｐオリゴマー化ドメイン(Spencer et al., 2012, PLos One 7:e33555)が挙げられる。

【0078】

マイコバクテリア抗原に応じて、このような１または複数のペプチドの存在は、このようなペプチド無しで発現された組合せまたは融合物と比較した場合、得られる組合せまたは融合ポリペプチドの発現および／または免疫原性を増強させるために有益であり得る。発現の増強は、ウエスタンブロット法などの従来技術によって判定することができる。免疫原性の増強は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイなどの従来のアッセイを用いて判定することができる。

【0079】

好ましい実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、ターゲティングペプチドおよび／またはタグペプチドに作動可能に連結される。例えば、付属の実施例の節で例示される融合物番号２、３、４および５は、Ｎ末端の開始Ｍｅｔのすぐ後に位置するシグナルペプチドおよびＦｌａｇタグに、そして、Ｃ末端の終止コドンのすぐ前にあるｍｙｃタグ、膜貫通ペプチドおよびＨｉｓタグに作動可能に連結され、一方、融合物番号９、１０、１１および１２は、Ｎ末端の開始Ｍｅｔのすぐ後に位置するＦｌａｇタグに、そして、Ｃ末端の終止コドンのすぐ前にあるｍｙｃタグとその後のＨｉｓタグに作動可能に連結される。他方、融合物番号６、８、１３および１４は、Ｎ末端の開始Ｍｅｔのすぐ後に位置するシグナルペプチドおよびＦｌａｇタグに、そして、Ｃ末端の終止コドンのすぐ前にあるｍｙｃタグおよびＨｉｓタグに作動可能に連結される。

【0080】

好ましい融合ポリペプチドの例は、配列番号２８〜３９で示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、望ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは９８％の同一性、さらにより好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列、あるいはまた前記アミノ酸配列から本質的になる、あるいはまた前記アミノ酸配列からなるポリペプチドの群から選択される。より具体的には、配列番号２８および２９は、それぞれターゲティングペプチドを伴って、また伴わずに、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ６を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる（付属の実施例の融合物番号２および１０により示される通り）。配列番号３０および３１は、それぞれターゲティングペプチドを伴って、また伴わずにＲｐｆＢおよびＲｐｆＤを含んでなる、いわゆるＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ融合ポリペプチドを含んでなる（付属の実施例の融合物番号３および１２により示される通り）。配列番号３２および３３は、それぞれターゲティングペプチドを伴って、また伴わずに、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ６を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる（付属の実施例の融合物番号４および１１により示される通り）。配列番号３４および３５は、それぞれターゲティングペプチドを伴って、また伴わずに、Ｒｖ０５６９ Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる（付属の実施例の融合物番号５および９により示される通り）。配列番号３６は、シグナルペプチドとともにＡｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６、ＲＰＦＢ−ＤｈｙｂおよびＲｖ１７３３を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる（付属の実施例の融合物番号６により示される通り）。配列番号３７は、シグナルペプチドとともにＡｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６、およびＲｖ１７３３を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる（付属の実施例の融合物番号８により示される通り）。配列番号３８は、シグナルペプチドとともにＲｖ２０２９、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ１７３３およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる（付属の実施例の融合物番号１３により示される通り）。配列番号３９は、シグナルペプチドとともにＲｖ２０２９、ＴＢ１０．４、ＥＳＡＴ−６およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなる（付属の実施例の融合物番号１４により示される通り）。

【0081】

融合ポリペプチドのより好ましい例は、下記のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、望ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは９８％の同一性、さらにより好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはまた前記アミノ酸配列から本質的になる、あるいはまた前記アミノ酸配列からなるポリペプチドの群から選択される：
・配列番号２８のおよそ３２番〜およそ５０６番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号２または１０融合物により示されるようなＡｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６）；
・配列番号２９のおよそ１０番〜およそ４８４番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号２または１０により示されるような融合物Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６）；
・配列番号３０のおよそ３２番〜およそ３８０番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号３および１２により示されるような融合物ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ）；
・配列番号３１のおよそ１０番〜およそ３５８番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号３および１２により示されるような融合物ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ）；
・配列番号３２のおよそ３２番〜およそ８５５番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号４および１１により示されるような融合物ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６）；
・配列番号３３のおよそ１０番〜およそ８３３番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号４および１１により示されるような融合物ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６）；
・配列番号３４のおよそ３２番〜およそ１１１５番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号５および９により示されるような融合物Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）；
・配列番号３５のおよそ１０番〜およそ１０９３番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号５および９により示されるような融合物Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）；
・配列番号３６のおよそ３２番〜およそ９５６番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号６により示されるような融合物Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ−Ｒｖ１７３３^＊）；
・配列番号３７のおよそ３２番〜およそ６０７番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号８により示されるような融合物Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３^＊）；
・配列番号３８のおよそ３７番〜およそ９３２番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号１３により示されるような融合物Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３^＊−Ｒｖ０１１１^＊）；および
・配列番号３９のおよそ３７番〜およそ８３１番で示されるアミノ酸配列（融合物Ｒｖ２０２９^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６−Ｒｖ０１１１^＊）。

【0082】

当然のことながら、このようなアミノ酸配列は、開始Ｍｅｔを備えることができる。

【0083】

好ましい実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、細胞膜でのその提示を可能とするように、シグナルペプチドおよび／または膜貫通ペプチドなどの適当な１または複数のターゲティングペプチドをさらに含んでなる。さらにより好ましい融合ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、望ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは９８％の同一性、さらにより好ましくは１００％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはまた前記アミノ酸配列からなるポリペプチドの群から選択される：
・配列番号２８の１番（開始Ｍｅｔ）〜およそ２３番、およびおよそ３２番〜およそ５０６番、およびおよそ５１７番〜およそ５８３番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号２により示されるような融合物ＳＳ−Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６−ＴＭ）；
・配列番号３０の１番（開始Ｍｅｔ）〜およそ２３番、およびおよそ３２番〜およそ３８０番、およびおよそ３９１番〜およそ４５７番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号３により示されるような融合物ＳＳ−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ−ＴＭ）；
・配列番号３２の１番（開始Ｍｅｔ）〜およそ２３番、およびおよそ３２番〜およそ８５５番、およびおよそ８６６番〜およそ９３２番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号４により示されるような融合物ＳＳ−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６−ＴＭ）；
・配列番号３４の１番（開始Ｍｅｔ）〜およそ２３番、およびおよそ３２番〜およそ１１１５番、およびおよそ１１２６番〜およそ１１９２番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号５により示されるような融合物ＳＳ−Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７−ＴＭ）；
・配列番号３６の１番（開始Ｍｅｔ）〜およそ２３番、およびおよそ３２番〜およそ９５６番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号６により示されるような融合物ＳＳ−Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ−Ｒｖ１７３３^＊）；
・配列番号３７の１番（開始Ｍｅｔ）〜およそ２３番、およびおよそ３２番〜およそ６０７番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号８により示されるような融合物ＳＳ−Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３^＊）；
・配列番号３８の１番（開始Ｍｅｔ）〜およそ２８番、およびおよそ３７番〜およそ９３２番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号１３により示されるような融合物ＳＳ−Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３^＊−Ｒｖ０１１１^＊）；および
・配列番号３９の１番（開始Ｍｅｔ）〜およそ２８番、およびおよそ３７番〜およそ８３１番で示されるアミノ酸配列（付属の実施例の融合物番号１４により示されるような融合物ＳＳ−Ｒｖ２０２９^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６−Ｒｖ０１１１^＊）。

【0084】

一般に、本発明の免疫原性組合せおよび融合ポリペプチドに含まれるマイコバクテリア抗原およびこのような抗原をコードする核酸分子は、標準的な技術を用いて単離または作製することができる。それらは例えば細菌培養物から精製することもできるし、または当技術分野で利用可能な発現系のいずれかを用いて宿主細胞において組換えにより生産することもできるし、または本明細書に記載されているものなどの好適な１または複数の発現ベクターを投与した際に対象者に提供され得る。

【0085】

核酸分子および核酸組合せ
本発明はまた、本発明の免疫原性組合せおよび融合ポリペプチドに含まれる少なくとも５つのマイコバクテリア抗原をコードする単離された核酸分子、ならびにこのような核酸分子を含んでなる組成物を提供する。

【0086】

本発明の範囲内で、用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は互換的に使用され、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、単離されたＤＮＡ、プローブ、プライマーおよびそれらの任意の混合物）もしくはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）のいずれか、または混合ポリリボ−ポリデオキシリボヌクレオチドの任意の長さのポリマーを定義する。それらは、一本鎖または二本鎖、直鎖または環状、天然または合成核酸を包含する。

【0087】

上記に定義したように、本発明の核酸分子は天然核酸（例えば、マイコバクテリアのゲノムまたはゲノム断片から単離）であってもよいし、または人の手で１以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加および／または挿入を含むように改変されてもよい。本発明は、クローニング、発現、安定性を改善することを目的とした任意の改変（例えば、適当な制限部位の導入、変性および／または所与の宿主細胞において翻訳を最適化するためのヌクレオチド配列の最適化および／または核酸分子またはその転写産物を不安定化し得る潜在的な負の要素の抑制）を包含する。いくつかの改変が企図される場合、それらは連続的なヌクレオチド残基に関するものでも、かつ／または非連続的なヌクレオチド残基に関するものでもよい。本発明により企図される１または複数の改変は、コードされるマイコバクテリア抗原および融合ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させないサイレント改変、ならびにコードされるマイコバクテリアポリペプチドに翻訳される改変を包含する。これらの改変は、非改変物に比べて、コードされるマイコバクテリア抗原および融合ポリペプチドの免疫原性力を低下させないことが好ましい。

【0088】

一実施形態では、本発明の核酸分子は、本発明に関して使用されるまたは宿主細胞内の１または複数の核酸分子との配列相同性を低減するために、全長ヌクレオチド配列または１もしくは複数のその一部にわたって変性させることができる。高度のヌクレオチド配列同一性を示す核酸配列の部分を変性することが実際に望ましく、当業者ならば、生産過程での安定性の問題を回避するために核酸分子の相同部分を変性させるために、配列アラインメントによってこのような部分を同定することができる。

【0089】

代わりにまたは加えて、本発明の核酸分子は、特定の宿主細胞または対象者、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞、ＷＯ２０１０／１３０７５６およびＷＯ２０１２／００１０７５に記載のノバリケン(Cairina moschata)細胞株）、哺乳類、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)）または細菌（例えば、大腸菌(E. coli)、ＢＣＧまたはリステリア菌属(Listeria)）において高レベルの発現を提供するために最適化することができる。所与のアミノ酸をコードするために２以上のコドンが利用できる場合、生物のコドン使用頻度パターンは非ランダム性が高く、コドンの利用度は宿主が異なれば著しく異なり得るということが実際に観察されている。本発明で使用されるヌクレオチド配列はほとんどが細菌起源であるので、これらのヌクレオチド配列は高等真核細胞などの宿主細胞における効率的発現のためには不適当なコドン使用頻度パターンを持っているかもしれない。一般に、コドンの最適化は、対象とする宿主細胞において使用頻度の低いコドンに相当する１以上の「天然」（マイコバクテリア）コドンを、同じアミノ酸をコードする使用頻度のより高い１以上のコドンに置き換えることによって行われる。部分的な置換であっても発現の増強は達成できるので、使用頻度の低いコドンに相当する総ての天然コドンを置き換える必要はない。さらに、結果として得られる核酸分子への１または複数の制限部位の導入に適合させるために、最適化されたコドン使用頻度の厳守からいくらかの逸脱があってもよい。

【0090】

コドン使用頻度の最適化に関してさらに、宿主細胞または対象者における発現は、ヌクレオチド配列の付加的改変によってさらに改善することができる。例えば、本発明の核酸分子は、稀な非最適コドンのクラスター形成が集中した領域に存在しないようにするため、かつ／または発現レベルに負の影響を及ぼすと思われる「負の」配列要素を抑制もしくは改変するために改変することができる。このような負の配列要素としては、限定されるものではないが、極めて高い（＞８０％）または極めて低い（＜３０％）ＧＣ含量を有する領域；ＡＴリッチまたはＧＣリッチな配列ストレッチ；不安定な順方向または逆方向反復配列；ＲＮＡの二次構造；ならびに／または内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム進入部位、および／もしくはスプライシングドナー／アクセプター部位などの内部潜在調節要素が挙げられる。

【0091】

本発明は、配列番号１〜２４のいずれかで示されるポリペプチドの群から選択される任意のマイコバクテリア抗原をコードする核酸分子を包含する。

【0092】

配列番号２８〜３９で示されるアミノ酸配列のいずれかまたはその任意の変異体および断片（例えば、上記に挙げられた配列番号２８〜３９の１または複数の例示的部分をコードする断片）と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％）の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる融合ポリペプチドをコード核酸分子が特に注目される。

【0093】

本発明の特に好ましい実施形態は、配列番号４０〜５１のいずれかで示されるヌクレオチド配列またはその任意の変異体および断片（例えば、上記に挙げられた配列番号２８〜３９の例示的部分をコードする）と少なくとも８０％の同一性、有利には少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは１００％の同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる、あるいは前記ヌクレオチド配列から本質的になる、あるいはまた前記ヌクレオチド配列からなる核酸分子（すなわち、ストリンジェント条件下で列挙された核酸分子とハイブリダイズする核酸分子）に関する。

【0094】

本発明の核酸分子は、当技術分野で利用可能な配列データおよび本明細書で提供される配列情報を用いて作製することができる。例えば、本発明の核酸分子は、当技術分野で周知の慣例技術、例えば、ＰＣＲ単離、および／またはそれが含まれることが分かっている特定の種のマイコバクテリアゲノムもしくはそのゲノム断片、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーまたは任意の従来技術のベクターからの従来の分子生物学によるクローニングを用いて単離することができる。あるいは、本発明の核酸分子はまた、自動プロセスで化学合成によって作製することもできる（例えば、オーバーラッピング合成オリゴヌクレオチドからアセンブルされる）。

【0095】

本発明の別の実施形態は、本発明の核酸分子の断片、例えば、制限エンドヌクレアーゼ断片およびＰＣＲ生成断片に関する。このような断片は、関連の１または複数の免疫原性部分をコードするプローブ、プライマーまたは断片を使用することができる。

【0096】

ベクター
本発明はまた、本発明の１以上の核酸分子を含んでなるベクターならびにこのようなベクターを含んでなる組成物に関する。

【0097】

用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、宿主細胞または対象者内で本明細書記載の１または複数の核酸分子のいずれかの送達、増殖および／または発現を可能とするのに必要な要素を含有するビヒクル、好ましくは、核酸分子またはウイルス粒子を意味する。この用語は、維持用ベクター（クローニングベクター）または様々な宿主細胞または対象者内での発現用のベクター（発現ベクター）、染色体外ベクター（例えば、多重コピープラスミド）または組み込みベクター（例えば、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、宿主細胞が複製する際にその核酸分子のさらなるコピーを生産するように設計される）ならびにシャトルベクター（例えば、原核生物宿主および／または真核生物宿主の両方で機能する）および導入ベクター（例えば、ウイルスゲノムに核酸分子を導入するため）を包含する。本発明の目的において、これらのベクターは天然の遺伝子源のもの、合成物もしくは人工物、または天然の遺伝子要素と人工の遺伝子要素の何らかの組合せであってもよい。

【0098】

本発明に関して、用語「ベクター」は、広義には、プラスミドおよびウイルスベクターを含むと理解されなければならない。「プラスミドベクター」は、本明細書で使用する場合、複製可能なＤＮＡ構築物を意味する。通常、プラスミドベクターは、対応する選択薬剤の存在下でプラスミドベクターを有する宿主細胞の正または負の選択を可能とする選択マーカー遺伝子を含有する。様々な正および負の選択マーカー遺伝子は当技術分野で公知である。例として、抗生物質耐性遺伝子を、対応する抗生物質の存在下で宿主細胞の選択を可能とする正の選択マーカー遺伝子として使用することができる。

【0099】

用語「ウイルスベクター」は、本明細書で使用する場合、ウイルスゲノムの少なくとも１つの要素を含み、かつ、ウイルス粒子中へまたはウイルス粒子へと封入され得る核酸ベクターを意味する。用語「ウイルス」、「ビリオン」、「ウイルス粒子」および「ウイルスベクター粒子」は、核酸ベクターが、ウイルス粒子の生成を可能とする好適な条件に従って適当な細胞または細胞株に形質導入された場合に形成されるウイルス粒子を表して互換的に使用される。本発明に関して、用語「ウイルスベクター」は、広義には、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクター）ならびに生成されたそのウイルス粒子を含むと理解されなければならない。用語「感染性」は、宿主細胞または対象者に感染および侵入するウイルスベクターの能力を意味する。ウイルスベクターは、複製コンピテントもしくは複製選択的であり得（例えば、特定の宿主細胞で良好もしくは選択的に複製するように操作され）、または複製欠陥または複製障害となるように遺伝的に障害されてもよい。

【0100】

本発明に関して適当なベクターとしては、限定されるものではないが、細菌（例えば、大腸菌、ＢＣＧまたはリステリア菌）などの原核生物宿主細胞における発現のためのバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドベクター；酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリスにおける発現のためのベクター；昆虫細胞系（例えば、Ｓｆ９細胞）における発現のためのバキュロウイルスベクター；植物細胞系における発現のためのウイルスおよびプラスミドベクター（例えば、Ｔｉプラスミド、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）；ならびに高等真核細胞または対象者における発現のためのプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。一般に、このようなベクターは市販されているか（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａなど）、またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、Ｍｄ．）などの寄託機関から入手可能であるか、またはそれらの配列、構成および生産方法を記載し、当業者がそれらを適用することを可能とする多くの刊行物の実体が存在している。

【0101】

好適なプラスミドベクターの代表例としては、限定されるものではないが、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＧＷｉｚ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ）が挙げられる。

【0102】

好適なウイルスベクターの代表例は、様々な異なるウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、水疱性口内炎ウイルスなど）から作製される。上記のように、用語「ウイルスベクター」は、ベクターＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびに生成されたそれらのウイルス粒子、特に、感染性ウイルス粒子を包含する。

【0103】

一実施形態では、本発明において使用されるウイルスベクターは複製欠陥型または複製障害型であり、これはそれが正常細胞（例えば、正常ヒト細胞）では、またはそれが投与された対象者では、有意な程度まで複製できないことを意味する（複製機能の障害または欠陥は、従来の手段、例えば、非許容細胞におけるＤＮＡ合成および／またはウイルス力価の測定によって評価することができる）。このような複製欠陥または障害ベクターは、一般に、増殖のために、欠損している／障害されている機能を送り込むまたは補う許容細胞株を必要とする。

【0104】

本発明に関して有用なウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクターが含まれ、これはワクチン接種、免疫療法、遺伝子導入または組換え生産に関して十分に報告されている多くの利点を有する（総説としては、“Adenoviral vectors for gene therapy”, 2002, Ed D. Curiel and J. Douglas, Academic Pressを参照）。本発明のアデノウイルスベクターは、様々なヒトまたは動物源から得ることができる（例えば、イヌ、ヒツジ、サルアデノウイルスなど）。いずれの血清型も使用可能であり、ヒトアデノウイルスが特に好ましく、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６などのＣ亜属、ならびにＡｄ１１、Ａｄ３４およびＡｄ３５などのＢ亜属が特に好ましい。また、動物Ａｄの使用も有利であり得、ｃｈｉｍｐ Ａｄ３およびＡｄ６３などのチンパンジーＡｄが特に好ましい。引用したアデノウイルスはＡＴＣＣから入手可能であるか、またはそれらの配列、構成および生産方法を記載し、当業者がそれらを適用することを可能とする多くの刊行物の実体が存在している（例えば、米国特許第６，１３６，５９４号；米国特許第６，１３３，０２８号；ＷＯ００／５０５７３；ＷＯ００／７００７１；ＷＯ２００４／０８３４１８；ＷＯ２００４／０９７０１６およびＷＯ２００５／０７１０９３参照）。

【0105】

好ましい複製欠陥アデノウイルスベクターは、およそ４５９番〜３３２８番、またはおよそ４５９番〜３５１０番（受託番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅＢａｎｋに開示されているＡｄ５の配列を参照）にわたるＥ１欠失を有するＥ１欠陥型である。クローニング能は、アデノウイルスゲノムの１または複数のさらなる部分（非必須Ｅ３領域の全体または一部（例えば、およそ２７８６７番〜３０７４３番の欠失）またはＷＯ９４／２８１５２およびLusky et al., 1998, J. Virol 72: 2022に記載されいるような他の必須Ｅ２および／もしくはＥ４領域の全体または一部）を削除することによってさらに改善することができる。

【0106】

本発明の核酸分子は、独立に、アデノウイルスゲノムのどの位置に挿入してもよく、Ｅ１領域および／またはＥ３領域に変えての挿入が特に好ましい。本発明の核酸分子は、対象領域の本来の転写方向に対してセンス配向に配置してもアンチセンス配向に配置してもよい。

【0107】

本発明に関して特に適当なウイルスベクターの他の例としては、ポックスウイルスベクター、例えば、鶏痘ベクター（例えば、ＦＰ９）、カナリア痘ベクター（例えば、ＡＬＶＡＣ）およびワクシニアウイルスベクターが挙げられ、後者が好ましい。好適なワクシニアウイルスとしては、限定されるものではないが、コペンハーゲン株、ワイエス株、ＮＹＶＡＣ（米国特許第５，４９４，８０７号）および改変アンカラ（ＭＶＡ）株(Antoine et al., 1998, Virol. 244: 365;ＷＯ０２／４２４８０)が挙げられる。組換えポックスウイルスを構築および生産するための一般条件は当技術分野で周知である（例えば、ＷＯ２０１０／１３０７５３；ＷＯ０３／００８５３３；米国特許第６，９９８，２５２号；米国特許第５，９７２，５９７号および米国特許第６，４４０，４２２号参照）。本発明の核酸分子は好ましくは、ポックスウイルスゲノム内の非必須遺伝子座に挿入する。コペンハーゲンワクシニアベクターにおける挿入のためにはチミジンキナーゼ遺伝子が、また、ＭＶＡベクターにおける挿入のためには欠失ＩＩまたはＩＩＩが特に適当である（ＷＯ９７／０２３５５）。

【0108】

本発明に関して好適な他のウイルスベクターは、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae）から得ることができるモービリウイルスであり、麻疹ウイルスが特に好ましい。当技術分野では種々の弱毒株が利用可能であり(Brandler et al, 2008, CIMID, 31: 271; Singh et al., 1999, J. virol. 73(6): 4823)、例えば、限定されるものではないが、エドモンストンＡおよびＢ株(Griffin et al., 2001, Field's in Virology, 1401-1441)、シュワルツ株(Schwarz A, 1962, Am J Dis Child, 103: 216)、Ｓ−１９１またはＣ−４７株(Zhang et al., 2009, J Med Virol. 81 (8): 1477)がある。Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間、またはＨ遺伝子とＬ遺伝子の間への挿入が特に適当である。

【0109】

本発明において使用するための好適なベクターはまた、野生型または変異型（例えば、無毒）であり得る細菌細胞を含む。このような細菌細胞の周知の例としては、限定されるものではないが、無毒マイコバクテリア（例えば、ウシ結核菌ＢＣＧ）、乳酸菌属（例えば、乳酸連鎖球菌(Lactococcus lactis)、リステリア菌属（例えば、リステリア菌(Listeria monocytogenes)）ならびにサルモネラ菌属およびシュードモナス属などの他の微生物が挙げられる。好ましい実施形態は、ＢＣＧベクターのゲノム中に上記で定義したような１以上のマイコバクテリア抗原または融合ポリペプチドをコードする１または複数の核酸分子が、そのＢＣＧベクターがこのような１または複数の要素を発現することを可能とする様式で組み込まれている、ＢＣＧベクターに関する。

【0110】

本発明はまた、脂質またはポリマーと複合体化してリポソーム、リポプレックスまたはナノ粒子などの粒子構造を形成させたベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ）を包含する。

【0111】

本発明においては、本発明のベクターに含まれる核酸分子は、宿主細胞または対象者における発現に好適な形態であり、これは、本明細書に示される核酸分子のそれぞれが適当な調節配列に作動可能に連結されていることを意味する。本明細書で使用する場合、用語「調節要素」または「調節配列」は、所与の宿主細胞または対象者内で、１もしくは複数の核酸またはその誘導体（すなわち、ｍＲＮＡ）の複製、倍加、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または輸送を含め、１または複数の核酸分子の発現を可能とするか、発現に寄与するか、または発現を調節するいずれの要素も意味する。

【0112】

当業者ならば、調節配列の選択はベクター自体、宿主細胞または対象者、所望の発現レベルなどの因子によって決まり得ることを認識するであろう。プロモーターが特に重要である。本発明に関して、プロモーターは、多くのタイプの宿主細胞で核酸分子の発現を構成的に命令し得るか、またはある種の宿主細胞に特異的であり得るか（例えば、肺特異的調節配列）または特定の事象もしくは外因性因子に応答して（例えば、温度、栄養素の添加、ホルモンなどにより）、もしくはウイルス周期の相（例えば、後期または初期）に従って調節され得る。また、ベクター生産を最適化し、かつ、発現される１または複数のポリペプチドの潜在毒性を回避するために、特定の事象またはまたは外因性因子に応答して生産工程の際に抑制されるプロモーターを使用してもよい。

【0113】

哺乳類細胞における構成的発現に好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号）、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＴ７ポリメラーゼプロモーターが挙げられる。原核生物宿主では、ｔｒｐ、ｌａｃ、ファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖系酵素プロモーターなどのプロモーターが使用可能である。有用な酵母プロモーターとしては、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、または他の解糖系酵素（例えば、エノラーゼもしくはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、マルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域が挙げられる。ポックスウイルスベクターでの発現には、ワクシニアウイルスプロモーターが特に適合している。代表例としては、限定されるものではないが、ワクシニア７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、１１Ｋ７．５(Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15: 18)、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１およびＫ１Ｌプロモーター、ならびにChakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al., 1997, J. Virol Methods 66: 135-8;およびKumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8)に記載されているものなどの合成プロモーターならびに初期／後期キメラプロモーターが挙げられる。麻疹媒介発現に好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、麻疹転写単位の発現を指示するいずれのプロモーターも含まれる(Brandler and Tangy, 2008, CIMID 31: 271)。

【0114】

当業者ならば、本発明の１または複数の核酸分子の発現を制御する調節要素が、転写の適切な開始、調節および／または終結（例えば、ポリＡ転写終結配列）、ｍＲＮＡ輸送（例えば、核局在シグナル配列）、プロセシング（例えば、スプライシングシグナル）、および安定性（例えば、イントロンおよび非コード５’および３’配列）、宿主細胞または対象者での翻訳（例えば、開始Ｍｅｔ、三分節系リーダー配列、ＩＲＥＳリボソーム結合部位、シャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列など）、および精製工程（例えば、本明細書に記載されるタグ）のための付加的要素をさらに含んでなってもよいことを認識するであろう。

【0115】

一実施形態では、本発明の免疫原性組合せおよび／または融合ポリペプチドに存在するまたはコードされるマイコバクテリア抗原をコードする核酸分子は、単一のベクターにより運ばれる。

【0116】

別の実施形態では、本発明の免疫原性組合せおよび／または融合ポリペプチドに存在するまたはコードされるマイコバクテリア抗原をコードする核酸分子は、２以上のベクターにより運ばれる。各ベクターは、上記に挙げられたものからの１以上のマイコバクテリア抗原または１以上の融合ポリペプチドをコードする。これらの２以上のベクターは、対象者に実質的に同時にまたは逐次に投与することができる。

【0117】

本発明の特に好ましい実施形態は、
ｉ．Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ１７３３およびＲｖ０１１を含んでなる融合ポリペプチドと、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター（例示的ベクターは、融合物１３と４、および融合物１３と１１をそれぞれコードする）；
ｉｉ．Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ１７３３およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドと、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター（例示的 ベクターは、融合物１３と４と５、および融合物１３と１１と９をそれぞれコードする）；
ｉｉｉ．Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ１７３３およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドと、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター（例示的ベクターは、融合物１３と４と９、および融合物１３と１１と５をそれぞれコードする）；
ｉｖ．Ａｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤおよびＲｖ１７３３を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ２０２９、ＴＢ１０．４、ＥＳＡＴ−６およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター（例示的ベクターは、融合物６と１４をコードする）；
ｖ．Ａｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６ ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤおよびＲｖ１７３３を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ２０２９、ＴＢ１０．４、ＥＳＡＴ−６およびＲｖ０１１１を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター（例示的ベクターは、融合物６と１４と５、および融合物６と１４と９をそれぞれコードする））；
ｖｉ．ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６を含んでなる融合ポリペプチドと、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７を含んでなる融合ポリペプチドとをコードするベクター（例示的ベクターは、融合物９と１１、および融合物５と４をそれぞれコードする）
からなる群から選択される単一ベクター（またはウイルス粒子）に関する。

【0118】

より好ましくは、上記のベクターはＭＶＡベクターである。

【0119】

必要であれば、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチドまたはベクターは、マイコバクテリア感染またはマイコバクテリア感染により引き起こされるもしくは関連する任意の疾患もしくは病態に対する治療活性または防御活性を改善することを目的に、選択されたマイコバクテリア抗原の付加的コピー、またはウシ結核菌もしくはＭ．カプレなどの異なるマイコバクテリア種に由来する付加的抗原、および／または他種に由来する付加的ポリペプチド（すなわち、異種ポリペプチド）をさらに含んでなり得る。好適な付加的ポリペプチドとしては、限定されるものではないが、サイトカインなどの免疫調節剤および潜在的共感染生物（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶなど）に起源する他の任意の抗原が挙げられる。

【0120】

好ましい実施形態によれば、本発明のベクターは、感染性ウイルス粒子の形態である。一般に、このようなウイルス粒子は、（ｉ）本発明のウイルスベクターを好適な細胞株に導入する工程、（ｉｉ）前記細胞株を前記感染性ウイルス粒子の生産を可能とするために好適な条件下で培養する工程、（ｉｉｉ）生産されたウイルス粒子を前記細胞株の培養物から回収する工程、および（ｉｖ）場合により、前記の回収されたウイルス粒子を精製する工程を含んでなる方法によって生産される。

【0121】

ウイルスベクターが複製欠陥型または複製障害型である場合、粒子は通常、許容細胞株においてまたはヘルパーウイルスの使用を介して生産され、これにより、欠損している／障害されている機能をトランスで供給する。例えば、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターを補うために好適な細胞株としては、２９３細胞(Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72)ならびにＨＥＲ−９６およびＰＥＲ−Ｃ６細胞（例えば、Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17;ＷＯ９７／００３２６）またはこれらの細胞株の任意の誘導体が挙げられる。鳥類細胞は、限定されるものではないが、受精卵から得られるニワトリ胚から調製される一次ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびカモ細胞株（例えば、ＷＯ０３／０７６６０１、ＷＯ２００９／００４０１６、ＷＯ２０１０／１３０７５６およびＵＳ２０１１−００８８７２に記載）を含め、ポックスウイルスベクターを増殖させるために特に好適である。

【0122】

感染性ウイルス粒子は、培養上清から、および／または溶解後の細胞から回収することができる。感染性ウイルス粒子は、標準的な技術（クロマトグラフィー、超遠心分離技術など）に従ってさらに精製することができる。

【0123】

本発明はまた、特定の宿主細胞への優先的ターゲティングを可能とするように改変されたベクターまたはウイルス粒子を包含する。標的化ベクターの特徴は、それらの表面に、細胞特異的マーカー（例えば、マイコバクテリア感染細胞）、組織特異的マーカー（例えば、肺特異的マーカー）などの細胞成分および表面露出成分を認識してそれと結合することができるリガンドが存在することである。好適なリガンドの例としては、マイコバクテリア抗原性ドメインに対する抗体またはその断片が挙げられる。ターゲティングは、ウイルスの表面に存在するポリペプチド（例えば、アデノウイルス線維、ペントン、ｐＩＸまたはワクシニアｐ１４遺伝子産物）中にリガンドを遺伝的に挿入することによって行うことができる。

【0124】

宿主細胞および生産方法
別の態様において、本発明はまた、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子またはベクター（例えば、ウイルス粒子）を含んでなる宿主細胞、ならびにこのような宿主細胞を含んでなる組成物に関する。

【0125】

本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、広義には、限定されるものではないが、組織、器官、または単離された細胞における特定の機構に関すると理解されるべきである。このような細胞は、培養細胞株、初代細胞および増殖性細胞などの、独特なタイプの細胞または異なるタイプの細胞の群であり得る。本発明に関して、用語「宿主細胞」には、原核細胞、酵母などの下等真核細胞、および他の真核細胞、例えば、昆虫細胞、植物および哺乳類（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞、ならびに本発明のベクターを生産することができる細胞（例えば、２９３、ＨＥＲ９６、ＰＥＲＣ．６細胞、ＣＥＦ、カモ細胞株など）が含まれる。この用語はまた、本明細書に記載のベクターのレシピエントとなり得る、またはレシピエントとなった細胞、ならびにこのような細胞の後代も含む。

【0126】

本発明の特定の実施形態によれば、宿主細胞はさらにカプセル封入することができる。細胞のカプセル封入技術は当技術分野で公知である。

【0127】

本発明のなおさらなる態様は、本発明のベクター（もしくは感染性ウイルス粒子）および／または宿主細胞を使用する、本発明の免疫原性組合せまたは融合ポリペプチドに含まれるまたはコードされるマイコバクテリア抗原の組換え生産のための方法である。一般に、本方法は、（ｉ）ベクターを好適な宿主細胞に導入してトランスフェクトまたは感染宿主細胞を作出する工程、（ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記トランスフェクトまたは感染宿主細胞を、その宿主細胞の増殖に好適な条件下で培養する工程、（ｉｉｉ）細胞培養物を回収する工程、および（ｉｖ）場合により、回収細胞および／または培養上清から、１もしくは複数のマイコバクテリア抗原または融合ポリペプチドを精製する工程を含んでなる。

【0128】

当業者は、ポリペプチドを発現させるために当技術分野で利用可能な多くの発現系およびベクターを宿主細胞に導入するための方法についての知識があると思われる。このような方法としては、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、ＣａＰＯ_４媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション／リポソーム融合、遺伝子銃、形質導入、ウイルス感染ならびに様々な手段を介した宿主生物への直接投与が挙げられる。本方法はまた、ポリ陽イオンポリマー（例えば、キトサン、ポリメタクリレート、ＰＥＩなど）および陽イオン脂質（例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、トランスフェクタム、リポフェクチンなど）といった、宿主細胞における核酸の導入を助ける従来のトランスフェクション試薬と併用することもできる。

【0129】

宿主細胞は、従来の発酵バイオリアクター、フラスコ、およびペトリプレートで培養することができる。培養は、所与の宿主細胞に適当な温度、ｐＨおよび酸素含量で行うことができる。本明細書では、このような目的で当技術分野において利用可能な種々の原核生物および真核生物発現系を詳細に記載する試みはしない。

【0130】

好ましい実施形態では、本方法は、大腸菌宿主細胞、特に、そのゲノムに、ラクトースまたはラクトース類似体（例えば、ＩＰＴＧ：イソプロピルｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）によるＴ７ポリメラーゼの誘導発現を可能とするためのＤ１３プロファージを保有する大腸菌株を使用する。このような株は様々な製造者から入手可能である（例えば、Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋなど）。プラスミドの導入後、形質転換大腸菌細胞をおよそ１８℃〜およそ３９℃の間に含まれる温度（およそ３０℃またはおよそ３７℃が特に好ましい）にて、６〜４８時間の様々な時間（およそ８〜およそ２４時間が特に好ましい）、ベクター選択マーカー（例えば、抗生物質の存在）および宿主株（例えば、ＩＰＴＧなどのインデューサーの存在下）に適合された従来の培地で培養することができる。細胞培養物を回収し、溶解させることができる（例えば、洗剤による化学溶解、音波処理など）。細胞溶解液の遠心分離後、上清およびペレットの両方を、発現レベルならびに発現材料の溶解度（例えば、可溶性材料は細胞溶解液上清中に見られ、不溶性材料は封入体に捕捉され得る）を評価するためのさらなる分析（例えば、ＳＤＳ ＰＡＧＥ）のために回収することができる。

【0131】

回収された１または複数のマイコバクテリア抗原または融合ポリペプチドは、場合により、硫酸アンモニウム沈殿、酸抽出、ゲル電気泳動、濾過およびクロマトグラフィー法（例えば、逆相、サイズ排除、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、ヒドロキシアパタイト、高速液体クロマトグラフィーなど）を含む周知の精製方法により精製することができる。使用される条件および技術は、正味電荷、分子量、疎水性、親水性などの因子によって異なり、当業者には自明である。さらに、精製のレベルは、意図される使用によって異なる。例えば、タンパク質濃度はブラッドフォード(Bransdford)アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）によって評価することができ、内毒素レベルはポータブル・テスト・システム(Portable Test System)（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などの技術によって評価することができ、精製ポリペプチドの質量はＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）またはエレクトロスプレー法を用いて測定することができる。

【0132】

組成物
別の態様において、本発明は、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター（例えば、感染性ウイルス粒子）、もしくは宿主細胞（本明細書では「有効薬剤」とも呼ばれる）のうちの少なくとも１つ、またはそれらの任意の組合せ（例えば、異なるポリペプチドまたはベクター／ウイルス粒子の組合せ）を含んでなる組成物を提供する。好ましくは、本組成物は、治療上有効な量の有効薬剤に加えて、１以上の薬学上許容されるビヒクルを含んでなる医薬組成物である。

【0133】

本明細書で使用する場合、「薬学上許容されるビヒクル」は、対象者、特にヒトにおける投与に適合した担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、および吸収遅延剤などのいずれか、また総てを含むことを意図する。

【0134】

本明細書で使用する場合、「治療上有効な量」は、意図される使用に十分な用量である。予防的使用に関しては、この用語は、マイコバクテリア感染（例えば、Ｍｔｂ感染）の兆候および／または確立を予防または遅延させるのに十分な用量を意味する。「治療的」使用に関しては、本組成物は、マイコバクテリア種にすでに感染している対象者に、活動性疾患を治療する目的、または潜伏感染個体において再活性化を予防する目的で、最終的に本明細書に記載の１以上の従来の治療法と組み合わせて投与される。特に、本発明の組成物の治療上有効な量は、投与される対象者において免疫系の誘導または刺激を生じる（例えば、生得的および／または特異的応答の発現をもたらす）ために必要な量であり得る。

【0135】

処置される対象者は、新生児、幼児、若年成人または成人であり得る。対象者は、本明細書に記載の１または複数の有効薬剤で処置される前に、過去にカルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）で免疫されていてもよく、または過去にマイコバクテリア感染に関して治療されていてもよい。対象者は別の病原生物（例えば、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ）と共感染している場合またはしていない場合がある。

【0136】

特に、処置される対象者は、薬剤耐性（例えば、ＭＤＲ、ＸＤＲまたはＴＤＲ）株であり得る病原性マイコバクテリア種（例えば、Ｍｔｂ）に感染している。感染しているマイコバクテリアは、本発明で使用される有効薬剤により含まれるまたはコードされる抗原が起源する任意のマイコバクテリアと同じ株または単離株であってもよいし、または異なる株または単離株に由来してもよい。

【0137】

本発明の組成物は、ヒトまたは動物用途に適当とするために、生理学的ｐＨまたはやや塩基性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７〜およそｐＨ９）で適宜緩衝させる。好適なバッファーとしては、限定されるものではないが、リン酸バッファー（例えば、ＰＢＳ）、重炭酸バッファーおよび／またはトリスバッファーが挙げられる。

【0138】

本発明の組成物はヒトまたは動物用途に適当な希釈剤をさらに含んでなり得る。本発明の組成物は、好ましくは、等張性、低張またはやや高張であり、比較的低いイオン強度を有する。代表例としては、無菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、リンゲル液、グルコース、トレハロースまたはサッカロース溶液、ハンクス液、および他の水性生理学的平衡塩溶液（例えば、Remington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkinsの最新版を参照）。

【0139】

例えば、処方物のｐＨ、浸透圧、粘度、明澄度、色、無菌性、安定性、溶解速度の変更もしくは維持、ヒトもしくは動物生物体での放出もしくは吸収の変更もしくは維持、血液関門を通る輸送の促進、または特定の器官（例えば、肺）における浸透を含む、望ましい薬学的または薬力学的特性を提供するために、付加的な薬学上許容される賦形剤を使用してもよい。

【0140】

加えて、本発明の組成物は、ヒトにおける全身適用または粘膜適用に好適な１以上のアジュバントを含んでなってもよい。好ましくは、このアジュバントは、本発明の組成物に対する免疫性、特に、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、例えば、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９を介するＴ細胞媒介性免疫を刺激することができる。有用なアジュバントの代表例としては、限定されるものではないが、ミョウバン、フロイントの完全および不完全アジュバント（ＩＦＡ）などの鉱油エマルション、リポ多糖またはそれらの誘導体(Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)、ＱＳ２１（ＷＯ９８／５６４１５）などのサポニン、イミキモド（ＷＯ２００７／１４７５２９）などのイミダゾ−キノリン化合物、ＣｐＧなどのシトシンリン酸グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド、およびＩＣ−３１(Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822: 263)またはその任意の誘導体などの陽イオンペプチドが挙げられる。

【0141】

本発明の組成物に含まれる薬学上許容されるビヒクルはまた、製造および冷凍状態（例えば、−７０℃、−２０℃）、冷蔵状態（例えば、４℃）、周囲温度での長期保存（すなわち、少なくとも１か月、好ましくは少なくとも１年）の条件下でその安定性を保持することを可能としなければならない。このような「長期」処方物は当技術分野で公知である（例えば、ＷＯ９８／０２５２２；ＷＯ０３／０５３４６３）。（ａ）１Ｍサッカロース、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５４ｍｇ／ｌ Ｔｗｅｅｎ ８０、１０ｍＭトリスｐＨ８．５、（ｂ）１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、および１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ならびに（ｃ）するように適合された本発明の組成物に特に適合された生理食塩水が挙げられる。

【0142】

本発明の組成物は、例えば、固体、液体または凍結品などの種々の形態であり得る。固体（例えば、乾燥粉末または凍結乾燥品）組成物は、真空乾燥および凍結乾燥を含む工程によって得ることができる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、噴霧乾燥形態（例えば、ＷＯ２０１０／１３５４９５参照）または液滴形態（平均直径１００〜５０００μｍ）の液滴が特に好ましい）で気道（例えば、吸入、鼻腔内経路または肺内経路による）に送達するために処方される。

【0143】

本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、様々な投与様式に好適である。本発明に関しては、全身経路、局所経路または粘膜経路を含め、従来の投与経路のいずれもが適用可能である。

【0144】

全身投与としては、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、血管内、動脈内注射ならびにスタンプ式(scarification)が含まれる。注射は、従来のシリンジおよび針、または当技術分野で利用可能な他の任意の適当なデバイス（例えば、エレクトロポレーション）を用いて行うことができる。粘膜投与としては、限定されるものではないが、経口／食事性、鼻腔内、気管内、肺内、腟内または直腸内経路が挙げられる。気道における投与は、適当なディスペンサーを用いた、液滴、スプレー、または乾燥粉末組成物の霧化またはエアゾール化によって行うことができる。また、局所投与も、経皮的手段（例えば、パッチなど）を用いて行うことができる。本発明に関しては、鼻腔内、気管内および肺内投与だけでなく、筋肉内、皮内および皮下経路も特に好ましい。

【0145】

適当な用量は、様々なパラメーター、特に、組成物に含まれる１または複数の有効薬剤；投与様式；対象者の年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度；併用処置の種類；処置の頻度；および／または予防もしくは治療の必要性の関数として適合させることができる。処置に対して適当な用量を決定するために必要な計算のさらなる精密化は、通常、関連する状況に照らして、医師により行われる。

【0146】

一般的な指針としては、ウイルスベクターを含んでなる組成物の好適な用量は、使用するベクターおよび定量技術によって約１０^４〜約１０^１３ｖｐ（ウイルス粒子）、ｉｕ（感染単位）またはｐｆｕ（プラーク形成単位）と様々である。サンプル中に存在するｖｐ、ｉｕおよびｐｆｕの量を評価するために利用可能な技術は、当技術分野で慣例である。例えば、アデノウイルス粒子の数（ｖｐ）は、通常、Ａ２６０吸光度の測定またはＨＰＬＣにより決定され、ｉｕ力価は定量的ＤＢＰ免疫蛍光により決定され、ｐｆｕは許容細胞の感染後のプラークの計数によって決定される。ＦＤＡのガイドラインによれば、好ましくは、ｖｐ／ｉｕ比は１００未満である。好ましい用量は、約１０^５〜約１０^１２ｖｐ（例えば、約５×１０^８、約１０^９、約５×１０^９、約１０^１０、約５×１０^１０ｖｐまたは約１０^１１ｖｐ）のアデノウイルスベクターを含有する。ワクシニア（例えば、ＭＶＡ）に基づく組成物では、約５×１０^５〜約１０^９ｐｆｕの用量が好ましく、約５×１０^６、約１０^７、約５×１０^７、約１０^８または約５×１０^８ｐｆｕが特に好ましい。麻疹に基づく組成物では、約５×１０^４〜約１０^７ｐｆｕの用量が好ましく、約１０^５、５×１０^５、１０^６または５×１０^６ｐｆｕが特に好ましい。プラスミドベクターに基づく組成物は、１０μｇ〜２０ｍｇの間、有利には１００μｇ〜２ｍｇの間の用量で投与すればよい。タンパク質組成物は、その組成物に含まれるマイコバクテリア抗原のそれぞれについて１０μｇ〜２０ｍｇの間、特に好ましくは約０．１ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与すればよい。投与は、単回用量でまたは一定の時間間隔の後に反復用量で行うことができる。

【0147】

反復投与（２、３、４、５、６、７、８、９、１０回など）は互いに適当な時間だけ離すことができ、同じ投与経路または異なる投与経路によって、同じ部位にまたは異なる部位に行うことができる。さらに、各投与には同じ１または複数の有効薬剤を用いても異なるものを用いてもよい。例として、ＭＶＡに基づく組成物では、互いにおよそ１週間（例えば、３〜１０日）だけ離して２回または３回の皮下投与が特に好適であり、Ａｄ、麻疹およびプラスミドに基づく組成物では、１回または２回の筋肉内投与が特に好適である。第１シリーズのプライム投与の後（例えば、６ヵ月〜数年後）に、プライムされた抗マイコバクテリア免疫応答を想起させるために、１回以上の「リコール」投与を行うことができる。また、休止期の後に反復させる一連の投与周期（例えば、週単位の投与周期）によって進めることも可能である。

【0148】

特定の実施形態では、投与は、１以上のプライム組成物および１以上のブースター組成物の一連の投与を含んでなるプライムブースト法に従って行うことができる。一般に、プライム組成物とブースター組成物は、少なくともマイコバクテリア抗原、免疫原性ドメインまたはエピトープを共通に含んでなるまたはコードする、異なる有効薬剤である。プライム組成物とブースター組成物は、同じ投与経路または異なる経路投与によって同じ部位または異なる部位に投与することができる。例えば、ポリペプチドに基づく組成物は粘膜経路によって投与することができ、ベクターに基づく組成物は好ましくは、例えば、皮下または筋肉内経路によって注射される。例として、弱毒生菌（例えば、ＢＣＧ）で宿主応答をプライムし、本明細書に記載の「有効薬剤」（例えば、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター（例えば、感染性ウイルス粒子）、もしくは宿主細胞、またはそれらの任意の組合せ）のうちの少なくとも１つでブーストすることを企図することができる。

【0149】

予防的使用および治療的使用
本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、好ましくは、マイコバクテリア感染またはそれにより引き起こされるもしくは関連する任意の疾患および病態を予防または治療する目的で使用するためのものである。このような使用は、マイコバクテリア抗原／エピトープに対する防御免疫応答を誘導または刺激することを目的とする。

【0150】

一実施形態では、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、必要とする対象者、特に、活動性疾患を発症した感染個体と密接に接触した、従って、マイコバクテリア感染症を発症するリスクのある対象者において、マイコバクテリアによる感染を予防するまたは感染のリスク（例えば、ＴＢを有する個体から咳によって排出された飛沫中の桿菌の吸入による伝染）を遅延させることを目的とした方法で使用するためのものである。

【0151】

別の実施形態では、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、マイコバクテリア種、特に、Ｍｔｂに感染した対象者において活動性疾患を治療することを目的とした方法において使用するためのものであり、本方法は、感染しているマイコバクテリア種に対して免疫応答を誘導し、それにより、活動性疾患の発症を遅延させる、または発症のリスクを軽減するために、活動性疾患を発症した感染者に、治療上有効な量の、本明細書に記載の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物のうちの少なくとも１つを投与する工程を含んでなる。

【0152】

「活動性疾患」は、顕在化した重篤な病徴を有するマイコバクテリア感染を意味する。例えば、ヒト対象では、ＴＢは、一般臨床徴候（例えば、体重低下、虚弱、発熱、寝汗）、臨床徴候および／または症状（例えば、肺ＴＢの場合には、咳、喀血、胸部痛）によって、および／または肺外徴候の場合には、感染部位（例えば、リンパ節、骨型、髄膜炎、泌尿生殖器型）に従って特徴付けられる。

【0153】

さらに別の実施形態では、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、マイコバクテリア種、特に、結核菌に潜伏感染した対象者において再活性化を予防または治療することを目的とした方法において使用するためのものであり、本方法は、感染しているマイコバクテリア種に対して免疫応答を誘導し、それにより、再活性化を予防する、または遅延させるために、前記潜伏感染者に、治療上有効な量の、本明細書に記載の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物のうちの少なくとも１つを投与することを含んでなる。

【0154】

「潜伏感染者」とは、病原性マイコバクテリア種（例えば、Ｍｔｂ）にすでに感染しているが、顕在化病徴または臨床徴候を示さない個体と理解される。一般に、潜伏感染者は、その体内にマイコバクテリアを保有し、臨床的には病気ではないが、特に免疫抑制の場合（例えば、ＨＩＶなどの別の病原体との共感染またはＴＮＦａ阻害剤などの免疫抑制処置下）では、後に臨床疾患（再活性化）に進行するリスクを保持する。Ｍｔｂ潜伏感染者は、Ｍｔｂ感染の診断を可能とする任意の検査（例えば、ＰＰＤ反応性に関してはツベルクリン検査、マントー検査、および／またはＩＦＮｇ放出アッセイ）によって検査すれば陽性となると思われる。

【0155】

用語「再活性化」は、マイコバクテリア感染に関して陽性判定であるが、明らかな病徴を顕していなかった対象者における、後の、マイコバクテリア関連疾患の顕在化病徴の発現を意味する。例えば、再活性化は、過去に顕在化活動性病徴を有していた、もしくは有してない、または感染を潜伏状態に持ち込むために十分な処置が施された感染者において見られ得る。例えば、Ｍｔｂ感染者は、過去にＢＣＧで免疫を受けていた、または過去にＭｔｂ感染に関して処置（例えば、１以上の「第一選択」化学療法薬による）を受けていた者である。

【0156】

特定の実施形態では、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、接種対象者においてＢＣＧワクチン接種の有効性を増強するためのＢＣＧブースターとして使用するためのものである。

【0157】

化学療法との併用
本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、１以上の従来療法、例えば、マイコバクテリア感染（例えば、Ｍｔｂ感染）に対して有効な１以上の化学療法薬と併用することができる。

【0158】

化学療法は一般に、現行法を用いて治療する医師により決定される。このような化学療法薬の例としては、限定されるものではないが、抗生物質ならびに直接的および間接的小阻害分子、抗体および当技術分野で記載されるような免疫療法が挙げられる。一般に、薬剤耐性でないＭｔｂ感染を治療するために現行使用されている「第一選択」抗生物質化学療法としては、イソニアジド、リファマイシン（すなわち、リファンピン、リファペンチンおよびリファブチン）、エタンブトール、ストレプトマイシン、ピラジンアミドおよびフルオロキノロンが含まれる。１以上の「第一選択」療法に薬剤耐性を示したＭｔｂ感染を治療するために使用される「第二選択」化学療法としては、オフロキサシン、シプロフロキサシン、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンが含まれる。１以上の化学療法薬は一般に、適当な期間、例えば、１か月または数ヶ月（例えば、１、２、３、４、５、６、９または１２か月）またはそれより長期にわたって投与される。毎日、用量２００〜６００ｍｇ（例えば、３００または４００ｍｇ）の、６〜１２か月の範囲の期間にわたる投与が適当である。

【0159】

一実施形態では、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、マイコバクテリア（例えば、Ｍｔｂ）感染に対する化学療法を経時的に軽減する目的で使用するためのものである。通常、本明細書に記載の１または複数の有効薬剤の投与は、特に感染しているマイコバクテリアが薬剤耐性である場合に、化学療法の有効性（例えば、臨床徴候の持続期間および／または重篤度の軽減、痰陰性化率(sputum conversion rate)の改善など）の増強、化学療法の長さおよび／または使用する化学療法薬の数の軽減を可能とする。

【0160】

本発明においては、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、１以上の化学療法薬を投与する前、投与と同時、または投与した後に投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載の有効薬剤は、化学療法の投与を開始した少なくとも２週間後に投与される。

【0161】

好ましい実施形態では、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物は、投与される対象者において免疫応答を誘導または増強する目的で使用するためのものである。従って、本発明はまた、対象者において本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物を投与した際に、マイコバクテリア抗原に対する免疫応答を誘導または刺激するための方法を包含する。

【0162】

誘導または刺激された免疫応答は、特異的（すなわち、マイコバクテリアエピトープ／抗原に対する）および／または非特異的（生得的）、体液性および／または細胞性であり得る。本発明に関して、免疫応答は、好ましくは、マイコバクテリア抗原／エピトープに対するＣＤ４＋媒介型もしくはＣＤ８＋媒介型またはその両方のＴ細胞応答である。

【0163】

本明細書に記載の１または複数の有効薬剤の、免疫応答誘導能または刺激能は、当技術分野において標準的な様々な直接的または間接的アッセイを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで評価することができる。試験およびバリデーションも付属の実施例の節に例示されている。

【0164】

例えば、非特異的免疫の誘導は、ＮＫ／ＮＫＴ細胞（例えば、代表性および活性化のレベル）、ならびにＩＦＮ関連サイトカインおよび／またはケモカイン産生カスケード、ＴＬＲの活性化および生得免疫の他のマーカーの測定によって行うことができる（例えば、Riano et al., 2012, Tuberculosis 92: 148-59）。

【0165】

体液性応答を刺激する能力は、本明細書に記載の免疫原性組合せおよび融合ポリペプチドに含まれるまたはコードされる抗原のうちの少なくとも１つに特異的な抗体力価の上昇によって決定することができる。例示的技術としては、限定されるものではないが、抗体 結合、結合競合ならびにＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットが挙げられる。

【0166】

細胞性免疫の評価は、例えば、本明細書に記載の免疫原性組合せおよび融合ポリペプチドに含まれるまたはコードされるマイコバクテリア抗原のうちの少なくとも１つに特異的な、Ｔリンパ球などの免疫細胞の頻度の上昇によって評価することができる。また、放射性標識時の細胞増殖をモニタリングすることもできる（例えば、［^３Ｈ］チミジン組み込みアッセイによるＴ細胞増殖アッセイ）。免疫応答を検出するための別の高感度法がＥＬＩＳｐｏｔであり、この方法では、ＩＦＮｇ産生細胞の頻度が決定される。抗原特異的Ｔリンパ球の細胞傷害能もまた、増感した対象者においてまたは適当な動物モデルの免疫誘導によって評価することができる。また、慣例のバイオアッセイ（例えば、マルチパラメーターフローサイトメトリー（ＩＣＳ）、マルチプレックス技術またはＥＬＩＳＡを用いたサイトカインプロファイル分析など）を用い、活性化されたＴ細胞により産生された関連のＴｈ１および／またはＴｈ２サイトカインの放出を定量することによって行うこともできる。また、関連のサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在を判定するためにＰＣＲ技術を使用することもできる。当業者ならば、このような関連のサイトカインの量の有意な増加または減少を使用して本明細書に記載の１以上の有効薬剤の免疫原性活性を評価できることを認識するであろう。

【0167】

最後に、防御免疫応答は、適当な実験動物、例えば、マウス、ラットまたはモルモットにてｉｎ ｖｉｖｏで評価することができ（Ashwin et al., 2008, Am J Resp, 39: 503-8; Acosta et al., 2011, Malays J Med, 18: 5-12参照）、例えば、本明細書に記載の１以上の有効薬剤で事前に免疫した後のマイコバクテリア種（例えば、Ｍｔｂ）の病原性株でチャレンジ感染を受けた動物から単離された脾臓、肺または他の組織ホモジネートから得られたマイコバクテリアコロニー形成単位（ｃｆｕ）における、同じ病原性株のマイコバクテリアに感染させた、事前に免疫されてない実験動物の対照群のマイコバクテリアｃｆｕに比べた場合の減少を測定することによる。また、処置群と非処置群の間の比較は、動物生存率で評価することもできる（処置群の生存率の高さは防御免疫応答に相関する）。

【0168】

このような免疫学的読み取りは、本明細書に記載の有効薬剤により提供されるマイコバクテリア感染に対する防御免疫応答と良好な相関を示す。

【0169】

本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物により提供される防御的応答はまた、本明細書に記載の方法論に従ってヒト対象に投与した際に、ベースライン状態に対してまたは処置されない場合には予測される状態に対して評価することもできる。防御的応答は、医師または他の専門の医療スタッフにより一般に使用される関連の任意の臨床評価によって証明することができ、これらには例えば、
・ある集団、例えば、中国人集団またはある国の移住者集団内の疾患の罹患率および／または有病率および／または頻度の減少（例えば、本明細書に記載の有効薬剤を受容した群においてマイコバクテリア感染を有するまたはマイコバクテリア感染もしくはマイコバクテリア感染に関連する疾患を発症するリスクがあると診断された新規個体の割合が低いこと）；
・処置対象者群で痰陰性化率のパーセンテージが高いこと；
・処置対象者群で活動性疾患の治癒のパーセンテージが高いこと；
・感染者と密接に接触した後のマイコバクテリアの伝染の程度の減少（例えば、感染を受けるリスクもしくは活動性疾患を発症するリスクの軽減もしくは遅延、および／または潜伏感染者における再活性化リスクの軽減もしくは遅延）；
・病状の改善（例えば、標的組織もしくは生体サンプルにおける細菌ｃｆｕの低下；病徴、もしくはそれらの重篤度（例えば、標的器官における病巣の数および／もしくは重篤度）の低下、または安定（増悪しない）病状）；ならびに
・処置対象者の現行治療に対する応答の改善（従来の化学療法薬の必要性、数、期間および／または用量の低減）
が含まれる。

【0170】

本発明に関して、防御的応答は一過性（投与中止後２週間）であっても、または持続的（数ヶ月または数年）であってもよい。臨床状態の自然経過は対象者ごとに相当異なり得るので、有意な数の対象者に防御的応答が見られることが必要なのであって、処置を受けた各対象者に防御的応答が見られる必要はない（例えば、２つの群の間の統計的有意差は、ターキーパラメトリック検定、クラスカル・ウォリス検定、マンおよびホイットニーに従うＵ検定、スチューデントのｔ検定、ウィルコクソン検定などの当技術分野で公知の任意の統計検定によって判定することができる）。

【0171】

このような測定は本明細書に記載の１または複数の有効薬剤の投与前（ベースライン）、および処置中の種々の時点、および処置の中止後少なくとも数（例えば、１２）週間、行うことができる。

【0172】

一般的な指針としては、マイコバクテリア感染および関連の疾患は様々な手段によって検出することができる。例えば、Ｍｔｂ感染はまた、マントーツベルクリン皮膚検査（ＴＳＴ）、クォンティフェロン検査ならびにＨＢＨＡ（ヘパリン結合赤血球凝集素；Hougardy et al., 2007; PLos One 2(10): e926）に対する応答のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出またはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＳＡＴ６、ＣＦＰ１０およびＴＢ７．７による刺激後のＩＰ１０の検出(Ruhwald et al., 2008; Microbes Infect 9: 806-12)などの、現在臨床使用されているいくつかの方法によって方向付けることもできる。活動性疾患を発症している対象者は、現行法に従って診断することができる。例として、ＴＢ診断は、臨床検体において、顕微鏡、培養技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびそのざまざまな変形により病原細菌を検出することに基づく。ＤＮＡフィンガープリント法およびスポリゴタイピング(spoligotyping)法も実施可能である。マイコバクテリア培養は、結核菌群の単離株の同定および薬剤感受性試験の標準法であるＸ線技術および臨床所見もまた、活動性肺疾患および／または肺外疾患の発見を補助するために実施することができる。他方、補体結合検査、赤血球凝集検査、ラジオイムノアッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含め、循環抗体を検出するために様々な抗原を用いる多くの血清学的アッセイがＭｔｂ感染の診断のために開発されている。

【0173】

抗体
さらなる態様において、本発明は、本発明の免疫原性組合せまたは融合ポリペプチドに含まれるまたはコードされるマイコバクテリア抗原のうちの少なくとも１つと選択的に結合する抗体に関する。

【0174】

本明細書で使用する場合、「抗体」は、抗原結合断片または抗原結合ドメインを含んでなり、かつ、標的タンパク質と選択的に結合する任意のポリペプチドが、標的タンパク質とは結合するが無関連のタンパク質と有意には結合しない場合のそのポリペプチドを包含する。ある特定の場合において、標的タンパク質と結合する抗体は、ある程度の交差反応性があるとしてもなお選択性であると理解される。一般に、抗体と抗原の間の結合は、会合定数Ｋ_Ａが１０^−６Ｍよりも高い場合に特異的であると見なされる。抗体濃度、溶液のイオン強度、温度、結合を可能とする時間、遮断薬（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などの適当な結合条件は、慣例の技術を用いて当業者により最適化することができる。

【0175】

本発明の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多重特異性、ヒト、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組換え抗体、ならびに限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦｖおよびｓｃＦｖフラグメントを含む、このような抗体の、抗原結合を保持するフラグメントであり得る。

【0176】

本発明の抗体は、当技術分野で慣例の技術を用い、例えば、動物（例えば、ウサギ、ウマなど）に本明細書に記載のマイコバクテリア抗原、融合タンパク質および／またはそのペプチド断片のいずれかの有効量を投与した後に、ディスプレー（例えば、ファージ、酵母またはリボソームディスプレー）またはハイブリドーマ法によって作製することができる。モノクローナル抗体を作製するための一般法は当技術分野で周知である。

【0177】

本発明の抗体は、単離された形態、溶液中（例えば、動物抗血清）または宿主細胞（例えば、ハイブリドーマ）中で提供することができる。さらに、本発明の抗体は、放射性標識（_１３１Ｉまたは_９９Ｔｃなど）、酵素標識（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）および化学標識（例えば、ビオチンなど）を含む適当な標識（検出可能な標識または機能的標識）とコンジュゲートさせることができる。

【0178】

本発明の抗体は様々な潜在的用途を有し、それらは本発明の範囲内にある。例えば、このような抗体は、（ａ）本発明における使用でマイコバクテリア抗原を検出するためのアッセイの試薬として、（ｂ）生体サンプルにおいてマイコバクテリアの存在を検出するためのアッセイの試薬として、ならびに／または（ｃ）本発明の方法に従って組換えにより生産されたマイコバクテリア抗原および融合ポリペプチドを検出する、および／もしくはタンパク質の混合物および他の夾雑物から回収する（例えば、培養宿主細胞からのアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降による精製を可能とすることによる）ためのツールとして使用することができる。本発明の抗体はまた、例えば、マイコバクテリア暴露の後に対象者を処置するために治療目的で使用することもできる（例えば、受動免疫療法）。

【0179】

一実施形態では、本発明は、マイコバクテリアに感染したまたは感染の疑いのある対象者から採取した生体サンプル（例えば、血漿、血清、痰など）において、本発明の抗体を用いてマイコバクテリア抗原を検出および／または定量するための方法に関し、本方法は、前記生体サンプルと試薬としての本発明の抗体を、前記マイコバクテリア抗原と前記抗体試薬の間で複合体の形成を可能とする条件下で接触させる工程、ならびに前記複合体の形成を任意の適当な手段によって検出および／または定量する工程を含んでなる。標的マイコバクテリア抗原の存在の検出は、マイコバクテリア感染（例えば、Ｍｔｂ）の指標となる。

【0180】

別の実施形態では、本発明は、生体サンプル（例えば、マイコバクテリアに感染したまたは感染の疑いのある対象者から採取した血漿、血清など）において、マイコバクテリアに対する抗体を検出および／または定量するための方法に関し、本方法は、前記生体サンプルと、本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞のいずれかを含んでなる試薬とを、前記抗体と上記に挙げた試薬のいずれかにより含まれるまたはコードされるマイコバクテリア抗原／エピトープの間で複合体の形成を可能とする条件下で接触させる工程、ならびに前記複合体の形成を任意の適当な手段によって検出および／または定量する工程を含んでなる。特異的抗体の存在の検出は、マイコバクテリア感染（例えば、Ｍｔｂ）の指標となる。

【0181】

当業者ならば、本発明の方法において使用される試薬の量を容易に決定することができる。抗原／抗体複合体の検出および／または定量の手段は慣例であり、当業者に周知である。例として、ブロット、ＥＬＩＳＡ、いわゆる、サンドイッチ技術、競合技術、およびＰＣＲ技術、特に、いわゆる「リアルタイム」技術が挙げられる。上記に挙げた試薬の使用は、検出可能な物質とのカップリング（すなわち、物理的連結）によって容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、またはアビジン／ビオチン）、蛍光物質（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、またはフルオレセイン誘導体）、発光物質、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、またはエクオリン）、および放射性物質（例えば、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈ）が挙げられる。

【0182】

本発明はまた、マイコバクテリア（例えば、Ｍｔｂ）感染の診断用の、本発明の抗体を含んでなる抗原アッセイのため、および本発明の免疫原性組合せ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、組成物を含んでなる抗体アッセイのための試薬のキットに関する。

【0183】

上記に挙げた特許、刊行物およびデータベースエントリーの開示は総て、このような各個特許、刊行物またはエントリーが具体的かつ個々に、引用することにより本明細書の一部とされることが示されている場合と同じ程度で、引用することによりその全内容が具体的に本明細書の一部とされる。

【図面の簡単な説明】

【0184】

【図1】図１は、付属の実施例の節に記載のとおりに作製および使用されたＭｔｂ抗原の様々な融合ポリペプチドの概略図を示す。「ＳＳ」はシグナルペプチド、「ＴＭ」は膜貫通ドメイン、「Ｆ」はＦｌａｇタグ、「Ｍ」はＭｙｃタグおよび「Ｈ」はｈｉｓタグを意味する。Ａ^＊は、天然対応物に対してのＭｔｂ抗原の改変を示す。この図にはまた、融合ポリペプチドの番号および以下で用いる発現プラスミドベクターの参照（ｐＴＧＸＸＸＸＸ）も記載する。

【図2】図２は、特異的抗体による免疫検出後のウエスタンブロットによる、個々のＭｔｂ遺伝子の発現を示す。リポフェクタミン２０００を用い、２×１０^６のＨＥＫ２９３細胞を５μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション１８時間後に培養培地にプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を加えた。４８時間の培養後に採取した細胞の溶解液を１０％ゲルｃｒｉｔｅｒｉｏｎ上での電気泳動により分析し、Ｒｖ２０２９^＊（図２Ａ）、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ（図２Ｂ）を認識する１／１０００希釈したウサギ抗血清、およびＥＳＡＴ−６（図２Ｃ）およびＲｖ２６２６（図２Ｄ）を認識する市販の抗体を用いて免疫検出を行った。

【図3】図３は、抗Ｆｌａｇ免疫検出後の、潜伏期抗原（融合物番号９をコードするｐＴＧ１８２９５）、活動期抗原（融合物番号１０をコードするｐＴＧ１８２９６）、再燃期抗原（融合物番号１２をコードするｐＴＧ１８３０７）および再燃期および活動期両方の抗原（融合物番号１１をコードするｐＴＧ１８２９７）を包含するＭｔｂ融合物のウエスタンブロット解析を示す。＋／−は、ＭＧ１３２の有無を表す。

【図4】図４は、市販の抗ＴＢ１０．４抗体（ＡＢＩＮ３６１２９２）、抗Ｒｖ０５６９ウサギ抗血清および抗Ｒｖ２６２６マウスモノクローナル抗体２６Ａ１１による免疫検出後の、それぞれＴＢ１０．４（図４Ａ）、Ｒｖ０５６９（図４Ｂ）およびＲｖ２６２６（図４Ｃ）を含むＭｔｂ融合物のウエスタンブロット解析を示す。

【図5】図５は、融合物をコードするプラスミドｐＴＧ１８２６６（ＳＳ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６−ＴＭ；図５Ａ）、ｐＴＧ１８２９６（細胞質Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６；図５Ｂ）、個々のＡｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ６抗原をコードするｐＴＧ１８３１０、ｐＴＧ１８３１５およびｐＴＧ１８３０８プラスミドの混合物（図５Ｃ）およびｐＧＷｉｚ（図５Ｄ）で動物を免疫した後に誘導されたＩＦＮｇ産生細胞を示す。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて特定のペプチドプールで再刺激した後にＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。

【図6】図６は、融合物をコードするプラスミドｐＴＧ１８２６８（ＳＳ−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６−ＴＭ；図６Ａ）、ｐＴＧ１８２９７（細胞質ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６；図６Ｂ）、個々のＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ６抗原をコードするｐＴＧ１８３０７、ｐＴＧ１８３１０、ｐＴＧ１８３１５およびｐＴＧ１８３０８プラスミドの混合物（図６Ｃ）およびｐＧＷｉｚ（図６Ｄ）で動物を免疫した後に誘導されたＩＦＮｇ産生細胞を示す。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて特定のペプチドプールで再刺激した後にＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。

【図7】図７は、融合物をコードするプラスミドｐＴＧ１８２６７（ＳＳ−ＲＰＦＢ−ＴＭ；図７Ａ）、ｐＴＧ１８３０７（細胞質ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ；図７Ｂ）およびｐＧＷｉｚ（図７Ｃ）で動物を免疫した後に誘導されたＩＦＮｇ産生細胞を示す。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて、ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤ抗原をカバーする特定のペプチドプールで再刺激した後にＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。

【図8】図８は、融合物をコードするプラスミドｐＴＧ１８２６９（ＳＳ−Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７−ＴＭ；図８Ａ）、ｐＴＧ１８２９５（細胞質Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７；図８Ｂ）、個々のＲｖ０５６９、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８およびＲｖ１８０７抗原をコードするｐＴＧ１８３０１、ｐＴＧ１８３０３、ｐＴＧ１８３００、ｐＴＧ１８３０４およびｐＴＧ１８３０２プラスミドの混合物（図８Ｃ）およびｐＧＷｉｚ（図８Ｄ）で動物を免疫した後に誘導されたＩＦＮｇ産生細胞を示す。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて特定のペプチドプールで再刺激した後にＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。

【図9】図９は、精製されたＲｖ２６２６（図９Ａ）、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ融合物（図９Ｂ）およびＴＢ１０．４（図９Ｃ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

【図10】図１０は、融合物をコードするプラスミドｐＴＧ１８３２３（Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ０１１１；図１０ａ）またはｐＧＷｉｚ（図１０ｂ）で動物を免疫した後に生じた細胞性免疫応答を示す。ＩＦＮγ産生細胞は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて、特定のペプチドプールで再刺激した後にＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した。各バーは、１匹のマウスの応答を表す（マウス７匹／群）。

【図11】図１１は、（ａ）ＭＶＡＴＧ１８３６５（Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ０１１１ ＋ ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６ Ｗ／Ｏ ＳＳ／ＴＭ）または（ｂ）ＭＶＡＴＧ１８３６４（Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ０１１１ ＋ ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６）でマウスを免疫した後に誘導された細胞性免疫応答を示す。ＩＦＮγ産生細胞は、ＭＶＡ注射から１週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて、特定のペプチドプールで再刺激した後にＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した。各バーは、個々のマウスの応答を表す（マウス５匹／群）。

【図12】図１２は、ＴＢ疾患相または生化学的合理性に従って作出した総てのＭＶＡ候補を接種したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＦＮγ応答のレベルをまとめたものである。ＩＦＮγ産生細胞は、ＩＦＮγ産生細胞は、ＭＶＡ注射から１週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて、１４種類のＭｔｂ抗原の特定のペプチドプールで再刺激した後にＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した。検出された応答の強度が、カットオフ値に対する各再刺激の中央値（スポット／１０^６脾細胞）の増加倍率に従い、カラーコード（−、＋、＋＋、＋＋＋の範囲の凡例を参照）を用いて示されている。斜線のボックスは、その抗原が所与のＭＶＡワクチンに存在しないことを意味する。

【図13】図１３は、（ａ）ＭＶＡＴＧ１８３７６（Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ０１１１ ＋ ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６ ＋ Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）または（ｂ）エンプティＭＶＡＴＧＮ３３．１でトランスジェニックＨＬＡ−Ａ２マウスを免疫した後に誘導された細胞性免疫応答を示す。ＩＦＮγ産生細胞は、ＭＶＡ注射から１週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて、特定のペプチドプールで再刺激した後にＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した。各バーは、個々のマウスの応答を表す（マウス６匹／群）。

【図14】図１４は、（ａ）ＭＶＡＴＧ１８３７７（Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ０１１１ ＋ ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６ Ｗ／Ｏ ＳＳ／ＴＭ ＋ Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）または（ｂ）エンプティＭＶＡＴＧＮ３３．１でＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを免疫した後に誘導された細胞性免疫応答を示す。ＩＦＮγ産生細胞は、ＭＶＡ注射から１週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて、特定のペプチドプールで再刺激した後にＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した。各バーは、個々のマウスの応答を表す（マウス６匹／群）。

【図15】図１５は、示されたＭＶＡ候補を接種したトランスジェニックＨＬＡ−Ａ２、Ｃ５７ＢＬ／６およびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおけるＩＦＮγ応答のレベルをまとめたものである。ＩＦＮγ産生細胞は、ＭＶＡ注射から１週間後、ｅｘ ｖｉｖｏにて、１４種類のＭｔｂ抗原の特定のペプチドプールで再刺激した後にＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価した。検出された応答の強度が、カットオフ値に対する各再刺激の中央値（スポット／１０^６脾細胞）の増加倍率に従い、カラーコード（−、＋、＋＋、＋＋＋の範囲の凡例を参照）を用いて示されている。斜線のボックスは、その抗原が所与のＭＶＡワクチンに存在しないことを意味する。

【実施例】

【0185】

材料および方法
分析方法
感染の自然経過のあらゆる相で抗ＴＢ免疫を生じ得る免疫療法ワクチンにおいて有用であり得る第１選択のＭｔｂ遺伝子／抗原を同定する目的で、利用できる文献およびデータベースからＭｔｂ抗原の既存のデータを調べた。

【0186】

次に、選択された抗原を、異なるソースからのデータを書き換えて比較するために開発されたデータマイニングスコアリングシステムにかけた。各抗原の値を反映した総合的な最終「スコア」を生成した。このスコアは、その抗原の免疫原性ならびに動物モデルおよびヒトにおける感染性チャレンジに対するその防御能を考慮している（例えば、ヒトにおける防御データは、動物モデルにおいて免疫原性を誘導する場合よりも高いスコアとなる）。特定の抗原に対する総てのデータが収集されたところで、各カテゴリーに０〜５のグレードを、０を悪いと思われるグレード、５は最良として割り当てた。グレードの選択はまた、データの質（例えば、実験に用いた対象の妥当性、会社の厳密さ）だけではなく、データのロバスト性（例えば、実験が実施された回数、それらの知見を確かなものとする／裏付ける刊行物の数）にも基づいた。

【0187】

抗原の生化学的ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析
生化学的および生物学的データも、発現および融合物の設計を最適化するために重要なデータであり、潜在的発現問題の予想を可能とする。例えば、タンパク質の生物学的機能は、ベクターにより媒介される発現の際に遺伝的不安定性および／または安全性プロファイルをもたらす潜在的毒性に至り得る。さらに、タンパク質のアンフォールディングは、細胞分解速度が高いために安定性および発現レベルに影響を及ぼし得る。

【0188】

これらのタンパク質の構造および機能をより良く理解し特性評価をするために、総てのＭｔｂ抗原に対して大規模文献検索を行った。

【0189】

さらに、Ｍｔｂ抗原の特性評価のために生化学的およびバイオインフォマティクス的予測も行った。クラスＩおよびＩＩ ＨＬＡ分子の予測エピトープを調べるために、バイオインフォマティクス的予測ツール(Nielsen et al., 2007 PLos One 2: e796; Nielsen et al., 2008, PLoS Comput Biol 4: e1000107)を用いた。これらのエピトープ領域の同定は、選択されたＭｔｂ抗原の最適化に、または免疫に基づくアッセイの開発を助けるために有用であり得る。

【0190】

さらに、生化学的特性および／または生物学的機能を予測し、従って、Ｍｔｂ抗原の選択および設計を可能とするために（例えば、全長天然型が発現され得るか、または改変が要されると思われるか）、大規模ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ構造予測解析を行った。

【0191】

より具体的には、
・タンパク質データバンク（ＰＤＢ）構造ホモログの検索。使用プログラムはＢＬＡＳＴＰ（デフォルトパラメーターを使用）であり、選択データベースはＮＰＳ＠３Ｄ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ＰＤＢ提供）であった。この検索により、２５％より高い配列相同性を有する抗原またはタンパク質のＮＭＲまたは結晶構造を見つけることができる。３Ｄ構造はＣＮ３Ｄ ４．１．またはＰＤＢビューワーを用いて表示した。

【0192】

・ＵＮＩＰＲＯＴ−ＳＷＩＳＳＰＲＯＴおよびＴＢデータベースの検索。対象とするＭｔｂ抗原のタンパク質ホモログをＵＮＩＰＲＯＴ−ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースにて、クエリーとして一次構造を、およびＮＰＳ＠上でのＢＬＡＳＴを用いて検索した。使用プログラムはＢＬＡＳＴ（デフォルトパラメーターを使用）であり、選択データベースはＵＮＩＰＲＯＴ−ＳＷＩＳＳＰＲＯＴであり、ＵＮＩＰＲＯＴ−ＳＷＩＳＳＰＲＯＴエントリーからタンパク質機能、ドメイン、潜在的シグナルペプチド、翻訳後修飾に関する一般情報ならびに書誌参照にアクセスすることができる。選択されたＭｔｂ抗原についての一般情報（例えば、遺伝子機能、遺伝子間の遺伝的連関、遺伝子に関連する表現型および突然変異、免疫原性、ならびに書誌参照）を、ＴＢデータベースでクエリーとしてＲｖタンパク質名を用いて検索した。

【0193】

・シグナルペプチドの予測：これらの短いＮ末端配列は、多くの場合、膜貫通ドメインとして予測され、天然成熟タンパク質には存在しない。シグナルペプチドの存在は、ある特定の抗原に関してはＵＮＩＰＲＯＴ−ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースで、またはシグナルｖ３．０アルゴリズムの隠れマルコフモデルを用いて報告した。

【0194】

ホモログ検索でヒットしない場合には、さらなる検索を行った：
・３つの異なるプログラム（例えば、デンス・アラインメント・サーフェイス（dense Alignment surface）（ＤＡＳ）法、アルゴリズムＴＭＨＭＭおよびＴｏｐＰｒｅｄ０．０１）を用いた潜在的膜貫通ドメイン（ＴＭ）の予測。本発明者らの観察することろでは、このような疎水性ＴＭドメインがともに存在することにより、ＭＶＡなどのウイルスベクター内で発現させた際に対応する抗原の遺伝的安定性が損なわれる可能性がある。

【0195】

・ＰＲＯＳＩＴＥ ＳＣＡＮを用いたタンパク質のドメイン、ファミリーおよび機能的部位に関連する既知のタンパク質モチーフに関する検索。

【0196】

・いくつかの予測法（すなわち、ＳＯＰＭ、ＭＬＲＣ、ＨＮＮ、ＤＳＣ、ＰＨＤ、ＰＲＥＤＡＴＯＲ）を用いた二次構造の予測。二次構造は、これら６つの方法がそれを予測した場合に可能性が高いと見なした。二次構造は、これら６つの方法のうち３つがそれを予測した場合に、可能性ありと見なした。

【0197】

・疎水性クラスター解析（ＨＣＡ）。ＨＣＡ法は、タンパク質折り畳みの本質的特徴、すなわち、親水性／疎水性二分法およびタンパク質球状ドメインの疎水的密集性に基づく。タンパク質配列の疎水性クラスターを同定するためにＨＣＡプロットを用いた。これらのクラスターは、疎水性が埋め込まれたコア(hydrophobic buried core)を有する折り畳まれたタンパク質に特徴的である。抗原は、疎水性クラスターがそのタンパク質の少なくとも一部に存在していた場合に、おそらく折り畳まれた状態を有すると見なした。

【0198】

・非折り畳み領域の同定を可能とする天然変性領域の予測（ＭｅｔａＰｒＤＯＳ予測）。この解析は、折り畳まれていないタンパク質の領域を予測することによってＨＣＡプロットを補足する。閾値０．５を超える領域（変性傾向）は総て、タンパク質の非折り畳み部分と見なした。ほとんどの場合、タンパク質のＮ末端およびＣ末端部分は、それらの天然状態で折り畳まれていないことに留意されたい。このようなストレッチがそれらの末端に存在し、かつ、１０残基より小さい場合に、それらを融合のための潜在的リンカーとして維持した。

【0199】

・コイルドコイルの予測（ＣＯＩＬＳプログラムを使用）。抗原のオリゴマー化状態は抗原融合物の設計に影響を及ぼし得る。少なくとも１４残基枠の解析でタンパク質の一部に関して出力確率が１の値を示した場合に、コイルドコイルドメインを予測した。

【0200】

さらに、選択されたＭｔｂ抗原が異なるＭｔｂ株および単離株の間で保存されていることを確認するために配列アラインメントを行った。より正確には、各選択抗原（例示的Ｍｔｂ抗原はＨ３７Ｒｖ株に起源する）ならびに１１種の他のＭｔｂ株（臨床単離株）およびタンパク質データベース（ＢＬＡＳＴＰ検索）で同定されたウシ結核菌の、それらの等価物のアミノ酸配列間での多重配列アラインメントを、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２(@.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)を用いて行った。結果として、ＴＢ抗原は、解析した１２のマイコバクテリア株間で高い保存性を示し、同一性パーセンテージは、抗原およびマイコバクテリア株によって１００％〜９６％の範囲であった。主な例外がＲｖ３４７８で見られ、この場合には、Ｈ３７Ｒｖ配列とＣＤＣ１５５１配列間で８８％の同一性が見られたに過ぎなかった。

【0201】

最後に、最終的なＴＢ抗原選択を達成するためのもう１つの重要な基準は、様々な感染期からの抗原のバランスのとれた代表性を確保することであった。例えば、いくつかの潜伏期抗原は、ほとんどの活動期抗原よりも最終データマイニングスコアが低いにもかかわらず選択した。

【0202】

Ｍｔｂ抗原の融合物の構築
１２のＭｔｂ抗原融合物を図１に示すように作出した。５つの融合物は、生化学的合理性に基づいて設計し（融合物３、５、６、８および１４）、一方、融合物２、４および１３はＴＢ疾患の相に対して設計し、融合物２は活動期抗原を含有し、融合物４は活動期抗原と再燃期抗原を含有し、融合物１３は潜伏期抗原から構成される。様々な遺伝子融合物の検出を助け、かつ、各Ｍｔｂ抗原に対する特異的抗体の必要性を避けるために、各融合物にタグ配列を付加した（それぞれＮ末端にＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号２５）、Ｃ末端にｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号２６）タグとＨｉｓ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２７）タグを付加）。

【0203】

他方、ある特定の場合において免疫原性活性を最適化すると推測される細胞表面への係留を確保するために、シグナルペプチド（シグナル配列またはＳＳとも呼ばれる）および膜係留ペプチド（膜貫通またはＴＭペプチド／ドメインとも呼ばれる）をそれぞれＭｔｂ融合タンパク質のＮ末端およびＣ末端に付加した。しかしながら、Ｒｖ０１１１またはＲｖ１７３３で終わる融合物では、これらのタンパク質がすでに膜係留ペプチドを含んでいるために、ＴＭドメインの付加は必要でなかった。比較として、細胞の場（ＳＳおよびＴＭペプチドが存在する場合の膜提示とこのようなペプチドが存在しない場合の細胞質の場）が発現レベルおよび免疫原性活性に及ぼす影響を検討するために、シグナル配列（ＳＳ）およびＴＭドメインを含まない４つの融合物も作出した。例えば、ｐＴＧ１８２６９は、ｐＴＧ１８２６９によりコードされる融合物がそのＮ末端にＳＳを備え、そのＣ末端のＭｙｃタグとＨｉｓタグの間にＴＭタグを備えていること以外は、ｐＴＧ１８２９５と同じＭｔｂ抗原（Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）をコードし、一方、ｐＴＧ１８２９５によりコードされる融合物は、このようなＳＳおよびＴＭペプチドを欠いている。

【0204】

異なるＭｔｂ抗原および融合物をコードする合成遺伝子はＧｅｎｅａｒｔ（レーゲンスブルク、ドイツ）により合成された。これらの配列をヒトコドン使用頻度に関して最適化し、ＡＴＧ開始コドンの前にコザック配列（ＡＣＣ）を付加した。さらに、いくつかのモチーフを排除した：ポックスウイルスベクターでの発現に有害なＴＴＴＴＴＮＴ、ＧＧＧＧＧ、ＣＣＣＣＣ、およびいくつかの他のベクターでの発現に有害であり得るＡＡＡＧＧＧ、ＡＡＡＡＧＧ、ＧＧＧＡＡＡ、ＧＧＧＧＡＡ（および相補配列ＴＴＣＣＣＣ、ＴＴＴＣＣＣ、ＣＣＴＴＴＴ、ＣＣＣＣＴＴ）。

【0205】

これらの融合物を、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨで消化したｐＧＷｉｚプラスミド（Ｇｅｌａｎｔｉｓ）にクローニングした。このプラスミドは、改変型のＣＭＶプロモーター、その後にＣＭＶ前初期遺伝子由来のイントロンＡ、および高効率人工転写ターミネーターが含有する。

【0206】

ｐＴＧ１８２６６（融合物番号２）の構築
融合物番号２のアミノ酸配列は、配列番号２８で示される。アミノ酸１〜２３は、狂犬病ウイルスＥＲＡ株の糖タンパク質前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｍ３８４５２に記載）のＮ末端に存在するシグナルペプチドに相当し、アミノ酸２４〜３１はＦｌａｇタグに相当し、アミノ酸３２〜３１７はＡｇ８５Ｂ^＊に相当し、アミノ酸３１８〜４１２はＴＢ１０．４に相当し、アミノ酸４１３〜５０６はＥＳＡＴ６に相当し、アミノ酸５０７〜５１６はｃ−ｍｙｃタグ、Ｓｅｒリンカーに相当し、アミノ酸５１８〜５８３は、ＥＲＡ株の狂犬病糖タンパク質に由来する膜係留ペプチドに相当し、アミノ酸５８４〜５８９はＨｉｓタグに相当する。配列番号４０で示される融合物番号２をコードするヌクレオチド配列は合成法により作出し、その合成遺伝子を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１で処理したｐＧＷｉｚにクローニングし、ｐＴＧ１８２６６を得た。

【0207】

ｐＴＧ１８２６７（融合物番号３）の構築
融合物番号３のアミノ酸配列は、配列番号３０で示される。アミノ酸１〜２３は、狂犬病ウイルスＰＧ株の糖タンパク質前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ａｙ００９０９７およびＷＯ２００８／１３８６４９の配列番号２に記載）のＮ末端に存在するシグナルペプチドに相当し、アミノ酸２４〜３１はＦｌａｇタグに相当し、アミノ酸３２〜３８０はＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊に相当し、アミノ酸３８１〜３９０はｃ−ｍｙｃタグ、Ｓｅｒリンカーに相当し、アミノ酸３９２〜４５７は、ＰＧ株（ＷＯ２００８／１３８６４９の配列番号３）の狂犬病糖タンパク質に由来する膜係留ペプチドに相当し、アミノ酸４５８〜４６３はＨｉｓタグに相当する。配列番号４２で示される融合物番号３をコードするヌクレオチド配列は合成法により作出し、その合成遺伝子を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１で処理したｐＧＷｉｚにクローニングし、ｐＴＧ１８２６７を得た。

【0208】

ｐＴＧ１８２６８（融合物番号４）の構築
融合物番号４のアミノ酸配列は、配列番号３２で示される。アミノ酸１〜２３は、狂犬病ウイルスＰＧ株の糖タンパク質前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ａｙ００９０９７に記載）のＮ末端に存在するシグナルペプチドに相当し、アミノ酸２４〜３１はＦｌａｇタグに相当し、アミノ酸３２〜３８０はＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊に相当し、アミノ酸３８１〜６６６はＡｇ８５Ｂ^＊に相当し、アミノ酸６６７〜７６１はＴＢ１０．４に相当し、アミノ酸７６２〜８５５はＥＳＡＴ６に相当し、アミノ酸８５６〜８６５はｃ−ｍｙｃタグ、Ｓｅｒリンカーに相当し、アミノ酸８６７〜９３２は、ＰＧ株の狂犬病糖タンパク質に由来する膜係留ペプチドに相当し、アミノ酸９３３〜９３８はＨｉｓタグに相当する。配列番号４４で示される融合物番号４をコードするヌクレオチド配列は合成法により作出し、その合成遺伝子を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１で処理したｐＧＷｉｚにクローニングし、ｐＴＧ１８２６８を得た。

【0209】

ｐＴＧ１８２６９（融合物番号５）の構築
融合物番号５のアミノ酸配列は、配列番号３４で示される。アミノ酸１〜２３は、狂犬病ウイルスＥＲＡ株の糖タンパク質前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｍ３８４５２に記載）のＮ末端に存在するシグナルペプチドに相当し、アミノ酸２４〜３１はＦｌａｇタグに相当し、アミノ酸３２〜１１８はＲｖ０５６９に相当し、アミノ酸１１９〜２２７はＲｖ１８１３^＊に相当し、アミノ酸２２８〜３２５はＲｖ３４０７に相当し、アミノ酸３２６〜７１７はＲｖ３４７８に相当し、アミノ酸７１８〜１１１５はＲｖ１８０７に相当し、アミノ酸１１１６〜１１２５はｃ−ｍｙｃタグ、Ｓｅｒリンカーに相当し、アミノ酸１１２７〜１１９２は、ＰＧ株の狂犬病糖タンパク質（ＷＯ２００８／１３８６４９の配列番号３）に由来する膜係留ペプチドに相当し、アミノ酸８４３〜８４８はＨｉｓタグに相当する。配列番号４６で示される融合物番号５をコードするヌクレオチド配列を合成法により作出し、その合成遺伝子を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１で処理したｐＧＷｉｚにクローニングし、ｐＴＧ１８２６９を得た。

【0210】

ｐＴＧ１８２７０（融合物番号６）の構築
融合物番号６のアミノ酸配列は、配列番号３６で示される。アミノ酸１〜２３は、狂犬病ウイルスＥＲＡ株の糖タンパク質前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｍ３８４５２に記載）のＮ末端に存在するシグナルペプチドに相当し、アミノ酸２４〜３１はＦｌａｇタグに相当し、アミノ酸３２〜３１７はＡｇ８５Ｂ^＊に相当し、アミノ酸３１８〜４５９はＲｖ２６２６に相当し、アミノ酸４６０〜８０８はＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊に相当し、アミノ酸８０９〜９５６はＲｖ１７３３^＊に相当し、アミノ酸９５７〜９６６はｃ−ｍｙｃタグ、Ｓｅｒリンカーに相当し、アミノ酸９６８〜９７３はＨｉｓタグに相当する。配列番号４８で示される融合物番号６をコードするヌクレオチド配列を合成法により作出し、その合成遺伝子を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１で処理したｐＧＷｉｚにクローニングし、ｐＴＧ１８２７０を得た。

【0211】

ｐＴＧ１８２７２（融合物番号８）の構築
融合物番号８のアミノ酸配列は、配列番号３７で示される。アミノ酸１〜２３は、狂犬病ウイルスＥＲＡ株の糖タンパク質前駆体（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｍ３８４５２に記載）のＮ末端に存在するシグナルペプチドに相当し、アミノ酸２４〜３１はＦｌａｇタグに相当し、アミノ酸３２〜３１７はＡｇ８５Ｂ^＊に相当し、アミノ酸３１８〜４５９はＲｖ２６２６に相当し、アミノ酸４６０〜６０７はＲｖ１７３３^＊に相当し、アミノ酸６０８〜６１７はｃ−ｍｙｃタグ、Ｓｅｒリンカーに相当し、アミノ酸６１９〜６２４はＨｉｓタグに相当する。配列番号４９で示される融合物番号８をコードするヌクレオチド配列を 合成法により作出し、その合成遺伝子を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１で処理したｐＧＷｉｚにクローニングし、ｐＴＧ１８２７２を得た。

【0212】

ｐＴＧ１８３２３（融合物番号１３）の構築
融合物番号１３のアミノ酸配列は、配列番号３８で示される。アミノ酸１〜２８は、麻疹ウイルス（Ｈａｌｌｅ株、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ０５５９７−１に記載）のＮ末端のＦタンパク質に存在するシグナルペプチドに相当し、アミノ酸２９〜３６はＦｌａｇタグに相当し、アミノ酸３７〜３４９はＲｖ２０２９^＊に相当し、アミノ酸３５０〜４９１はＲｖ２６２６に相当し、アミノ酸４９２〜６３９はＲｖ１７３３^＊に相当し、アミノ酸６４０〜９３２はＲｖ０１１１^＊に相当し、アミノ酸９３３〜９４２はｃ−ｍｙｃタグ、Ｓｅｒリンカーに相当し、アミノ酸９４４〜９４９はＨｉｓタグに相当する。配列番号５０で示される融合物番号１３をコードするヌクレオチド配列を合成法により作出し、その合成遺伝子を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１で処理したｐＧＷｉｚにクローニングし、ｐＴＧ１８３２３を得た。

【0213】

ｐＴＧ１８３２４（融合物番号１４）の構築
融合物番号１４のアミノ酸配列は、配列番号３９で示される。アミノ酸１〜２８は、麻疹ウイルス（Ｈａｌｌｅ株、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ０５５９７−１に記載）のＦタンパク質のＮ末端に存在するシグナルペプチドに相当し、アミノ酸２９〜３６はＦｌａｇタグに相当し、アミノ酸３７〜３４９はＲｖ２０２９^＊に相当し、アミノ酸３５０〜４４４はＴＢ１０．４に相当し、アミノ酸４４５〜５３８はＥＳＡＴ６に相当し、アミノ酸５３９〜８３１はＲｖ０１１１^＊に相当し、アミノ酸８３２〜８４１はｃ−ｍｙｃタグ、Ｓｅｒリンカーに相当し、アミノ酸８４３〜８４８はＨｉｓタグに相当する。配列番号５１で示される融合物番号１４をコードするヌクレオチド配列を合成法により作出し、その合成遺伝子を、制限酵素ＮｏｔＩおよびＢａｍＨ１で処理したｐＧＷｉｚにクローニングし、ｐＴＧ１８３２４を得た。

【0214】

融合物９〜１２の構築
適当なプライマー対、すなわち、シグナルペプチド配列の削除用にはＯＴＧ２０１８８（ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧ；配列番号５２）とＯＴＧ２０１８９（ＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧ；配列番号５３）、また、ＴＭ配列の削除用にはＯＴＧ２０１９０（ＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧ−ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＧ；配列番号５４）とＯＴＧ２０１９１（ＣＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴ−ＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧ；配列番号５５）のを用い、定方向突然変異誘発（Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって、プラスミドｐＴＧ１８２６７、ｐＴＧ１８２６９、ｐＴＧ１８２６６およびｐＴＧ１８２６８からターゲティング配列を削除した。得られたプラスミドはそれぞれ、配列番号４３、４７、４１および４５のヌクレオチド配列によりコードされている配列番号３１、３５、２９および３３のアミノ酸配列に相当するｐＴＧ１８３０７（融合物番号１２＝細胞質融合物番号３）、ｐＴＧ１８２９５（融合物番号９＝細胞質融合物番号５）、ｐＴＧ１８２９６（融合物番号１０＝細胞質融合物番号２）およびｐＴＧ１８２９７（融合物番号１１＝細胞質融合物番号４）であった。

【0215】

個々のＭｔｂ遺伝子発現プラスミドの構築
ＮｈｅＩ制限部位で隔てられたＦｌａｇ配列およびｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ配列を、ｐＧＷｉｚプラスミドのＣＭＶプロモーターの下流に導入した。ＣＭＶプロモーターの末端、Ｆｌａｇ配列およびｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ配列を含む合成ＤＮＡ断片はＧｅｎｅａｒｔにより合成され、プラスミドＦＬＡＧ＿ＴＡＧ＿１に挿入した。このプラスミドをＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、得られた断片を同じ酵素で処理したｐＧＷｉｚに挿入し、ｐＴＧ１８２８２を得た。次に、個々のＲｖ３４０７、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３^＊、Ｒｖ３４７８およびＲｖ２６２６遺伝子を、ｐＴＧ１８３２３を鋳型として用いたＲｖ２６２６以外は、ｐＴＧ１８２６９からＰＣＲにより増幅した。

【0216】

各ＴＢ遺伝子の単離に用いた増幅プライマー対を表１に示す。

【0217】

【表1】

【0218】

得られたアンプリコンを「Ｉｎ ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ」ＰＣＲクローニング法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＮｈｅＩで線状化したｐＴＧ１８２８２にクローニングした。これによりタグ配列とＭｔｂ遺伝子の融合が可能となる。作製されたプラスミドをそれぞれｐＴＧ１８３００（Ｒｖ３４０７）、ｐＴＧ１８３０１（Ｒｖ０５６９）、ｐＴＧ１８３０２（Ｒｖ１８０７）、ｐＴＧ１８３０３（Ｒｖ１８１３^＊）、ｐＴＧ１８３０４（Ｒｖ３４７８）およびｐＴＧ１８３０５（Ｒｖ２６２６）と呼称した。

【0219】

５’側でＦｌａｇと融合し、３’側でｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ配列と融合したＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３^＊、Ａｇ８５Ｂ^＊、ＴＢ１０−４、Ｒｖ０１１１^＊およびＲｖ２０２９^＊の発現カセットを含有する６つのプラスミドはＧｅｎｅａｒｔにより合成され、ｐＧＷｉｚに挿入した。それらをそれぞれｐＴＧ１８３０８（ＥＳＡＴ６）、ｐＴＧ１８３０９（Ｒｖ１７３３^＊）、ｐＴＧ１８３１０（Ａｇ８５Ｂ^＊）、ｐＴＧ１８３１５（ＴＢ１０．４）、ｐＴＧ１８３２９（Ｒｖ０１１１^＊）、ｐＴＧ１８３１７（Ｒｖ２０２９^＊）と呼称した。Ｒｖ１７３３^＊およびＲｖ０１１１^＊タンパク質はＴＭドメインを含むので、発現の問題を回避するために、狂犬病ウイルスＥＲＡ株の糖タンパク質前駆体のＮ末端に存在するシグナルペプチドをＦｌａｇ配列の上流に融合させた。

【0220】

個々のＭｔｂ遺伝子をコードする場合でも融合Ｍｔｂ遺伝子をコードする場合でも、免疫に用いるプラスミドは内毒素不含条件で作製した。

【0221】

組換えＭＶＡの構築
タグ配列の削除
タグ配列は、ＭＶＡベクターにそれらが存在しないように、Ｍｔｂ抗原融合物から除去した。Ｍｔｂ融合物カセット内に位置するタグ配列（すなわち、シグナルペプチドとＭｔｂ融合物の最初のアミノ酸の間に存在するＦｌａｇ、およびＭｔｂ融合物の最後のアミノ酸と膜係留ペプチドの間に存在するｃｍｙｃタグ）は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および下記表２で示される適当なプライマー対を用いた定方向突然変異誘発により削除した。Ｍｔｂ融合物カセット外に位置するタグ配列（細胞質融合物およびＨｉｓタグの場合）は、融合物の両末端への開始Ｍｅｔおよびターミネーターコドンの付加を可能とするプライマー用いたＰＣＲにより削除した。

【0222】

【表2】

【0223】

ＭＶＡＴＧ１８３５５（融合物番号１３）の構築
融合物番号１３（配列番号３８の１〜２８および３７〜９３２の部分により示されるＳＦ−Ｒｖ２０２９^＊−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３^＊−Ｒｖ０１１１^＊）をコードするヌクレオチド配列を、ｐ７．５Ｋプロモーター（配列番号８０；ＣＣＡＣＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＣＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＣＧＧＴＡＡＧＧＡＡＧＴＡＧＡＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＡＣＡＧＴ）の制御下に置いた。これを、適当なプライマー対ＯＴＧ２０４０５（配列番号８１）とＯＴＧ２０４０６（配列番号８２）を用い、ＶＶ（ワクシニアウイルス）コペンハーゲン株ＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、一方、融合物番号１３配列は、ＯＴＧ２０４０７（配列番号８３）とＯＴＧ２０４０８（配列番号８４）を用い、プラスミドｐＴＧ１８３４２からＰＣＲにより増幅した。次に、ｐ７．５Ｋおよび融合物番号１３をコードする配列を、プライマーＯＴＧ２０４０５（配列番号８１）およびＯＴＧ２０４０８（配列番号８４）を用いるダブルＰＣＲにより再構成した。得られた断片をワクシニア導入プラスミドｐＴＧ１７９６０のＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入し、ｐＴＧ１８３５５を得た。

【0224】

ＭＶＡ導入プラスミドｐＴＧ１７９６０は、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩにおける相同組換えによって、導入対象のヌクレオチド配列の挿入を可能とするように設計される。これはプラスミドｐＴＧ１Ｅ（Braun et al., 2000, Gene Ther. 7:1447に記載）に起源し、これにＭＶＡ欠失ＩＩＩを挟むようにフランキング配列（ＢＲＧ３およびＢＲＤ３）をクローニングした(Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847)。この導入プラスミドはまた、オワンクラゲ(Aequorea victoria)増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ遺伝子、ｐＥＧＰ−Ｃ１から単離、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と大腸菌(Escherichia coli) キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子）との間の融合物を、初期後期ワクシニアウイルス合成プロモーターｐ１１Ｋ７．５（R. Wittek、ローザンヌ大学によって厚意により提供）の制御下に含む。キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが合成されると、ＧＰＴ^＋組換ＭＶＡはミコフェノール酸、キサンチン、およびヒポキサンチンを含有する選択培地中で増殖可能となり(Falkner et al, 1988, J. Virol. 62, 1849-54)、ｅＧＦＰは組換えＭＶＡプラークの可視化を可能とする。この選択マーカーｅＧＦＰ−ＧＰＴを２つの相同配列の間に同じ配向で配置する。クローン選択の後、この選択マーカーは、ｅＧＦＰ−ＧＰＴ⁻組換えＭＶＡの増殖を可能とする選択なして数回継代培養することによって容易に除去することができる。

【0225】

ＭＶＡＴＧ１８３５５の作出は、ＭＶＡを感染させ、ヌクレオフェクションによりｐＴＧ１８３５５をトランスフェクトした（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ技術に従う）初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）における相同組換えにより行った。ウイルスの選択は、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する選択培地の存在下で増殖させた後にプラーク精製により行った。前述のように、その後、選択マーカーは、非選択培地での継代培養により除去した。親ＭＶＡの混入がないことをＰＣＲにより確認した。

【0226】

ＭＶＡＴＧ１８３６４（融合物番号１３＋融合物番号４）の構築
融合物番号４（配列番号３２の１〜２３、続いて３２〜８５５および８６６〜９３２の部分により示されるＳＲ−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊−Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６−ＴＭＲ）をコードするヌクレオチド配列を、野生型ＭＶＡのゲノムＤＮＡから、プライマー対ＯＴＧ２０４４５（配列番号８６）とＯＴＧ２０４４６（配列番号８７）を用いたＰＣＲによりクローニングしたｐＨ５Ｒプロモーター（配列番号８５、ＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧ）の制御下に置いた。増幅産物をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化した。融合物番号４をコードする配列をｐＴＧ１８３３９から、ＯＴＧ２０４４７（配列番号８８）およびＯＴＧ２０３８０（配列番号８９）プライマーを用い、ＰＣＲにより増幅した。増幅産物をＰａｃＩおよびＸｈｏＩで消化した。両断片をともに、制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで処理したｐＴＧ１８３５５にクローニングし、ｐＴＧ１８３６４を得た。

【0227】

ＭＶＡＴＧ１８３６４ウイルスの作出は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えにより行った。

【0228】

ＭＶＡＴＧ１８３６５（融合物番号１３＋融合物番号１１）の構築
融合物番号１１（１番がＭｅｔイニシエーターで始まる配列番号３３の１０番〜８３３番の部分により示されるＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊−Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６）をコードするヌクレオチド配列を、ｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に置いた。プロモーターはｐＴＧ１８３６４から、ＯＴＧ２０４４５（配列番号８６）およびＯＴＧ２０４４６（配列番号８７）プライマーを用いたＰＣＲにより得、増幅断片をＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化した。融合物番号１１をコードする配列を、ｐＴＧ１８２９７から、プライマー対ＯＴＧ２０４４８（配列番号９０）とＯＴＧ２０３８２（配列番号９１）を用いたＰＣＲによりクローニングし、増幅産物をＰａｃＩおよびＸｈｏＩで消化した。両断片をともに、制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで処理したｐＴＧ１８３５５にクローニングし、ｐＴＧ１８３６５を得た。

【0229】

ＭＶＡＴＧ１８３６５ウイルスの作出は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えにより行った。

【0230】

ＭＶＡＴＧ１８３７６（融合物番号１３＋融合物番号４＋融合物番号５）の構築
融合物番号５（配列番号３４の１番〜２３番、続いて３２番〜１１１５番および１１２６番〜１１９２番の部分により示されるＳＲ−Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７−ＴＭＲ）をコードするヌクレオチド配列を、Ｂ２Ｒプロモーター（配列番号９２、ＴＡＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＴ−ＴＴＧＴＣＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＴＣＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＣＣＧＡＡＡＴＣ）の制御下に置いた。このプロモーターをＶＶウエスタンリザーブ株ＤＮＡから、プライマー対ＯＴＧ２０４６９（配列番号９３）とＯＴＧ２０４７０（配列番号９４）を用いたＰＣＲにより増幅し、増幅断片をＸｈｏＩおよびＮｈｅＩで消化した。融合物番号５をコードする配列をｐＴＧ１８３４０から、プライマー対ＯＴＧ２０４７２（配列番号９５）とＯＴＧ２０４７３（配列番号９６）を用いて増幅した後、制限酵素ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで処理した。消化した両断片をともに、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで線状化したｐＴＧ１８３６４にクローニングし、ｐＴＧ１８３７６を作出した。

【0231】

ＭＶＡＴＧ１８３７６ウイルスの作出は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えにより行った。

【0232】

ＭＶＡＴＧ１８３７７（融合物番号１３＋融合物番号１１＋融合物番号５）の構築
Ｂ２ＲプロモーターをｐＴＧ１８３７６から、上記のプライマー対ＯＴＧ２０４６９とＯＴＧ２０４７０を用いて増幅し、ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩで消化した。融合物番号５（ＳＲ−Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７−ＴＭＲ）をコードするヌクレオチド配列を上記のように増幅し、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで線状化したｐＴＧ１８３６４のＢ２Ｒプロモーターの制御下にクローニングし、ｐＴＧ１８３７７を作出した。

【0233】

ＭＶＡＴＧ１８３７７ウイルスの作出は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えにより行った。

【0234】

ＭＶＡＴＧ１８３７８（融合物番号１３＋融合物番号４＋融合物番号９）の構築
融合物番号９（１番がＭｅｔイニシエーターで始まる配列番号３５の１０番〜１０９３番の部分により示される通りＲｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）をコードするヌクレオチド配列を、ｐＴＧ１８２９５から、プライマー対ＯＴＧ２０４８３（配列番号９７）とＯＴＧ２０４７４（配列番号９８）を用いたＰＣＲにより増幅した。増幅産物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩで処理したＢ２Ｒプロモーター（上記のようにｐＴＧ１８３７６から増幅）とともに、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで線状化したｐＴＧ１８３６４にクローニングし、ｐＴＧ１８３７８を得た。

【0235】

ＭＶＡＴＧ１８３７８ウイルスの作出は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えにより行った。

【0236】

ＭＶＡＴＧ１８３７９（融合物番号１３＋融合物番号１１＋融合物番号９）の構築
融合物番号９（Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）をコードするヌクレオチド配列およびＢ２Ｒプロモーターをとも上記のように増幅し、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで線状化したｐＴＧ１８３６５にともにクローニングし、ｐＴＧ１８３７８を得た。

【0237】

ＭＶＡＴＧ１８３７９ウイルスの作出は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えにより行った。

【0238】

ＭＶＡＴＧ１８４０４（融合物番号１４＋融合物番号６）の構築
融合物番号１４（配列番号３９の１番〜２８番および３７番〜８３１番の部分により示されるＳＦ−Ｒｖ２０２９^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ０１１１^＊）をコードするヌクレオチド配列を、ｐＴＧ１８３４３から、プライマー対ＯＴＧ２０４０７（配列番号８３）とＯＴＧ２０５２５（配列番号９９）を用いたＰＣＲにより増幅した。ｐ７．５Ｋプロモーターは、ｐＴＧ１８３５５から、ＯＴＧ２０５２４（配列番号１００）およびＯＴＧ２０４０６（配列番号８２）プライマーを用いたＰＣＲにより得た。次に、融合物番号１４をコードする配列を、ＯＴＧ２０５２４（配列番号１００）およびＯＴＧ２０５２５（配列番号９９）を用いたダブルＰＣＲにより、ｐ７．５Ｋプロモーターの制御下にクローニングした。得られた断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで処理し、ワクシニア導入プラスミドｐＴＧ１７９６０のＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位に挿入し、ｐＴＧ１８３９５を得た。

【0239】

融合物番号６（配列番号３６の１番〜２３番および３２番〜９５６番の部分により示されるＳＳ−Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊−Ｒｖ１７３３^＊）をコードするヌクレオチド配列を、ｐＴＧ１８３４１から、プライマー対ＯＴＧ２０５２７（配列番号１０１）とＯＴＧ２０３７６（配列番号１０２）を用いたＰＣＲにより増幅し、増幅産物をＰａｃＩおよびＸｈｏＩで消化した。ｐＨ５Ｒプロモーターを上記のようにｐＴＧ１８３５５から増幅し、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩで消化した。消化した両断片をともに、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで線状化したｐＴＧ１８３９５にクローニングし、プラスミドｐＴＧ１８４０４を得た。

【0240】

ＭＶＡＴＧ１８４０４ウイルスの作出は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えにより行った。

【0241】

ＭＶＡＴＧ１８４１７（融合物番号１４＋融合物番号６＋融合物番号５）の構築
Ｂ２Ｒプロモーターの制御下に置かれた融合物番号５（ＳＲ−Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７−ＴＭＲ）をコードするヌクレオチド配列を、ｐＴＧ１８３７６のＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ消化により得た。得られた断片を、同じ制限酵素で処理したｐＴＧ１８４０４に挿入し、ｐＴＧ１８４１７を得た。

【0242】

ＭＶＡＴＧ１８４１７ウイルスの作出は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えにより行った。

【0243】

ＭＶＡＴＧ１８４１８（融合物番号１４＋融合物番号６＋融合物番号９）の構築
Ｂ２Ｒプロモーターの制御下に置かれた融合物番号９（Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）をコードするヌクレオチド配列を、ｐＴＧ１８３７９のＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ消化により得た。得られた断片を、同じ制限酵素で処理したｐＴＧ１８４０４に挿入し、ｐＴＧ１８４１８を得た。

【0244】

ＭＶＡＴＧ１８４１８ウイルスの作出は、ＣＥＦにおいて、上記のように相同組換えにより行った。

【0245】

生産およびタンパク質精製
４つの大腸菌株を個々のＭｔｂ抗原の発現に関して試験した。これらの株は総て、それらのゲノム内に、ラクトースまたはラクトース類似体（すなわち、ＩＰＴＧ）によるＴ７ポリメラーゼの発現誘導を可能とするＤＥ３プロファージを保持する。これらの４株は、タンパク質発現の標準株としてのＢｌ２１（ＤＥ３）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、有毒タンパク質発現用のＣ４１（ＤＥ３）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、大腸菌とは異なるコドン使用頻度を有するタンパク質の発現用のＢｌ２１（ＤＥ３）Ｒｏｓｅｔｔａ（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、および膜貫通ペプチド（例えば、Ｒｖ１７３３）を有するタンパク質の発現用のＣ４３（ＤＥ３）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）であった。さらに、抗原生産を最適化するために、３つの異なる温度と生産時間を試験した。

【0246】

最適条件を決定するための発現アッセイ
各大腸菌株を、生産対象のＭｔｂ抗原をコードするプラスミドで形質転換させた。新たに形質転換させたプレートから５つのコロニーが単離され、これをアンピシリンの存在下、５０ｍｌのＬＢ（ルリア培地）培地に播種し、振盪下、３７℃一晩増殖させた。自動誘導培地(autoinducible medium)（グルコース／ラクトースおよび抗生物質を含有するＡＩ培地；Studier, 2005, Protein Expr Purif. 41: 207-34）のフラスコに前培養試料を播種した後、１８℃、３０℃および３７℃のいずれかでそれぞれ２４、８時間および８時間培養した。インキュベーション終了時に、６００ｎｍでの吸光度を測定し、細胞を遠心分離により採取した。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁させ、試験する各培養条件についてＯＤ６００ｎｍを５０前後に調整した後、細胞を音波処理により溶解させた。次に、細胞溶解液を４℃にて１０，０００ｇで１０分間遠心分離し、その後、上清の試料（一般に１０μＬ）およびペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、最適条件を評価した。

【0247】

Ｍｔｂ抗原の生産および精製
Ｈｉｓタグ含有Ｍｔｂ抗原の精製は、事前に決定した最適条件を適用して２Ｌフラスコで増殖させた５００ｍＬ培養物から行った。細胞を遠心分離により採取し、２５０ｍＬの培養物に相当するペレットを使用まで−２０℃で保持した。採取した細菌を、抗原の溶解度に応じてＰＢＳまたはグアニジンに再懸濁させ、細胞溶解のための音波処理を施し、提供者の推奨に従い、非変性条件または変性条件のいずれかで、Ｎｉセファロース６ファーストフローレジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；参照番号１７−５３１８）でのＩＭＡＣアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。漸増濃度のイミダゾール（５０ｍＭ、１００ｍＭおよび２５０ｍＭ）を適用することにより、タンパク質を溶出させた。純粋なタンパク質を含有する画分をプールし、抗原の溶解度に応じてＰＢＳまたは尿素に対して透析した。

【0248】

タンパク質の特性評価
溶出画分に存在する精製されたＭｔｂ抗原の量と質を評価するために様々な試験を行うことができる。

【0249】

内毒素レベル Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのポータブル・テスト・システム（ＰＴＳ）を用いて測定した。検出範囲０．００５〜０．５ＥＵ／ｍＬのカートリッジを製造者の推奨に従って使用した。

【0250】

タンパク質濃度は、製造者の推奨に従い、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏｒｏａｄ）によって測定した。サンプルバッファーに希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標品として用いた。

【0251】

溶出画分および透析溶液の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での電気泳動により評価することができる。

【0252】

精製タンパク質の質量は、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）またはエレクトロスプレー法を用いて測定した。タンパク質が完全であるかどうかを決定するために、測定質量と計算質量を比較した。溶液中またはゲルのバンド中いずれかのタンパク質の同一性は、トリプシン消化後に生じたペプチドの質量測定によって確認した。ペプチドの質量は、ＭＡＬＤＩおよび／またはタンデム質量分析と連結した液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により測定した。タンパク質の同一性を確認するために、ペプチドの測定質量と計算質量を比較した。

【0253】

Ｍｔｂ抗原に対する抗体の生産
種々のＭｔｂ抗原に対する抗体は、ウサギを２つの異なる抗原特異的ペプチドの混合物（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ； Ｓｅｒａｉｎｇ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で免疫した後に生産された。このような１５または１６アミノ酸残基のペプチドは、エピトープＢ予測プログラムを実行した後に選択された。Ｒｖ１７３３^＊、Ｒｖ２０２９^＊、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ０１１１、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊、Ｒｖ１８１３^＊およびＲｖ３４０７抗原に対する抗血清は、ウサギを０日目の２つの特異的ペプチドおよび７、１０および１８日目の３回のブースターで免疫した後に生成した。最初のペプチド注射の前と２１日目に血液サンプルを採取した。最終的なウサギの採血は２９日目に行った。Ｒｖ３４７８では、ウサギに対して０、２２、４９および７７日目に２つの特異的１６マーペプチドを注射した。最初のペプチド注射の前と３１および５９日目に血液サンプルを採取した。最終的なウサギの採血は８７日目に行った。

【0254】

最終的な血清を、特異的ペプチドを用いたＥＬＩＳＡおよび個々のＭｔｂ遺伝子発現プラスミドを用いたウエスタンブロット分析により評価した。

【0255】

Ｍｔｂ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ＤＮＡ媒介発現産物に対するウエスタンブロット
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃１１６６８−０１９）を用い、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（１０μＭ）の存在下（トランスフェクション１８時間後に増殖培地に添加）、２×１０^６個のＨＥＫ２９３細胞をＭｔｂ抗原融合物または個々の遺伝子をコードする種々のプラスミド５μｇでトランスフェクトした。ｐＧＷＩＺプラスミドを陰性対照として用いた。４８時間後、培地を廃棄し、細胞を、β−メルカプトエタノール（５％ｖ：ｖ）を添加した４５０μＬ／ディッシュのトリス−グリシン−ＳＤＳ ２×バッファー（ｒｅｆ：ＬＣ２６７６；Ｎｏｖｅｘ）で溶解させた。次に、溶解液を音波処理し、９５℃で５分間煮沸した。３０μＬの細胞溶解液を、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｐｒｅｃａｓｔゲルシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用い、プレキャスト１０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル上で電気泳動に付した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、７４１２６０）に転写した。免疫検出は１／５００希釈のモノクローナル抗Ｆｌａｇ Ｍ２ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体（Ｓｉｇｍａ；＃Ａ８５９２）または１／５０００希釈のモノクローナル抗Ｈｉｓペルオキシダーゼ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｒ９３１〜２５）を用いて行った。免疫複合体は、ＩｍｍｕｎＳｔａｒ ＷｅｓｔｅｒｎＣキット（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ１７０．５０７０）を用いて可視化した。

【0256】

上記のようにウサギの免疫後に得られた血清（１／１０００希釈）を、Ｒｖ１７３３^＊、Ｒｖ２０２９^＊、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ０１１１^＊、Ｒｐｆ−Ｂ−Ｄ、Ｒｖ１８１３^＊、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８のウエスタンブロット検出にも用いた。ＥＳＡＴ６、Ａｇ８５Ｂ^＊、ＴＢ１０．４およびＲｖ２６２６の検出には市販の抗体を用い、それぞれ、ＥＳＡＴ６にはマウスモノクローナル抗体ＨＹＢ０７６−０８（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ；＃ｓｃ−５７７３０、１／５００希釈）、Ａｇ８５Ｂ^＊にはウサギポリクローナル抗血清ＮＲ−１３８００（ＢＥＩ、１／５０００希釈）、Ｒｖ２６２６にはマウスモノクローナル抗体２６Ａ１１（Ｌｉｆｅｓｐａｎ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；＃ＬＳ−Ｃ９１０５２ １／１０００希釈）およびＴＢ１０．４にはポリクローナルウサギ抗体ＡＢＩＮ３６１２９２（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ、１／１０００希釈）を用いた。

【0257】

ＭＶＡ媒介発現産物に対するウエスタンブロット
１０^６個のＡ５４９細胞に、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（１０μＭ）（感染３０分後に培養培地に添加）の存在下、種々のＭＶＡ産生Ｍｔｂ抗原融合物をＭＯＩ １で感染させた。ＭＶＡＴＧＮ３３．１エンプティベクターを陰性対照として用いた。２４時間後、培地を廃棄し、細胞を、β−メルカプトエタノール（５％ｖ：ｖ）を添加した３００μＬ／ディッシュのトリス−グリシン−ＳＤＳ ２×バッファー（ｒｅｆ：ＬＣ２６７６；Ｎｏｖｅｘ）で溶解させた。次に、溶解液を音波処理し、９５℃で５分間加熱した。２０μＬの細胞溶解液を、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｐｒｅｃａｓｔゲルシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用い、プレキャスト４〜１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル上で電気泳動に付した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）トランスファーシステム（＃１７０−４１５５、Ｂｉｏｒａｄ））に転写した。免疫検出は、上記のようにＤＮＡプラスミドの発現産物との関連でＭｔｂ特異的抗体を用いて行った。免疫複合体は、ＩｍｍｕｎＳｔａｒ ＷｅｓｔｅｒｎＣキット（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ １７０．５０７０）を用いて可視化した。

【0258】

マウスモデルにおける免疫原性評価
ＤＮＡ免疫プロトコール
マウスは、融合物をコードするプラスミドまたは前記融合物に含まれる個々のＭｔｂ抗原をコードするプラスミドの混合物のいずれかで、２週または３週間隔で３回免疫した。１００μＬの無菌ＰＢＳ中、１００μｇのＤＮＡを前脛骨筋に筋肉内経路で注射した。細胞性免疫応答を、最後のＤＮＡ注射から２週間後にＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイにより評価した。

【0259】

ＭＶＡ免疫プロトコール
ＭＶＡ ＴＢ候補の免疫原性を、ＢＡＬＢ／ｃ、トランスジェニックＨＬＡ−Ａ２、Ｃ５７ＢＬ／６およびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスで評価した。各ＭＶＡベクターを尾の基部に、１００μＬのトリス−ＨＣｌ緩衝およびスクロース含有バッファー中１×１０^７ｐｆｕの用量で１回、皮下投与した。細胞性免疫応答を、ＭＶＡ注射から７日後にＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイにより評価した。

【0260】

ペプチドライブラリー
ペプチドライブラリーを用い、免疫マウス由来の脾細胞をｅｘ−ｖｉｖｏで再刺激した。より正確には、上記融合物に含まれる１４総てのＭｔｂ抗原をカバーする６７９のペプチド（１１アミノ酸のオーバーラッピングある１５マー）を合成した（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）。ペプチドプールは、ＤＭＳＯ中、終濃度１μモル／Ｌで調製した。各Ｍｔｂ抗原の全長をカバーするためには１〜４プールが必要であった。

【0261】

Ｒｖ１７３３は、１８および１７ペプチドの２プールによりカバーされた。プール１：１８ペプチドはＲｖ１７３３残基６２〜１４４をカバーし；プール２：１７ペプチドはＲｖ１７３３残基１３４〜２１０をカバーする。

【0262】

Ｒｖ２０２９は、１９ペプチドの４プールによりカバーされた。プール１：１９ペプチドはＲｖ２０２９残基１〜８７をカバーし；プール２：１９ペプチドはＲｖ２０２９残基７７〜１６３をカバーし；プール３：１９ペプチドはＲｖ２０２９残基１５３〜２３９をカバーし；プール４：１９ペプチドはＲｖ２０２９残基２２９〜３１４をカバーする。

【0263】

Ｒｖ０５６９は、Ｒｖ０５６９残基１〜８８をカバーする２０ペプチドの１プールによりカバーされた。

【0264】

Ｒｖ１８０７は、最初の３プールが２５ペプチド、および４つ目のプールが２２ペプチドの、４プールによりカバーされた。プール１：２５ペプチドはＲｖ１８０７残基１〜１１１をカバーし；プール２：２５ペプチドはＲｖ１８０７残基１０１〜２１１をカバーし；プール３：２５ペプチドはＲｖ１８０７残基２０１〜３１１をカバーし；プール４：２２ペプチドはＲｖ１８０７残基３０１〜３９９をカバーする。

【0265】

Ｒｖ０１１１は、最初の３プールが２０ペプチド、および４つ目のプールが１９ペプチドの、４プールによりカバーされた。プール１：２０ペプチドはＲｖ０１１１残基３６１〜４５１をカバーし；プール２：２０ペプチドはＲｖ０１１１残基４４１〜５３１をカバーし；プール３：２０ペプチドはＲｖ０１１１残基５２１〜６１１をカバーし；プール４：１９ペプチドはＲｖ０１１１残基６０１〜６８５をカバーする。

【0266】

ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂは、最初の３プールが２２ペプチド、および４つ目のプールが１９ペプチドの、４プールによりカバーされた。プール１：２２ペプチドはＲｐｆＢ残基３０〜１２７をカバーし；プール２：２２ペプチドはＲｐｆＢ残基１１７〜２１５をカバーし；プール３：２２ペプチドはＲｐｆＢ残基２０５〜２８４およびＲｐｆＤ残基５３〜７１をカバーし；プール４：１９ペプチドはＲｐｆＤ残基６１〜１４６をカバーする。

【0267】

Ｒｖ１８１３は、Ｒｖ１８１３残基３４〜１４３をカバーする２５ペプチドの１プールによりカバーされた。

【0268】

Ｒｖ３４０７は、Ｒｖ３４０７残基１〜９９をカバーする２２ペプチドの１プールによりカバーされた。

【0269】

Ｒｖ３４７８は、２４ペプチドの４プールによりカバーされた。プール１：２４ペプチドはＲｖ３４７８残基１〜１０７をカバーし；プール２：２４ペプチドはＲｖ３４７８残基９７〜２０３をカバーし；プール３：２４ペプチドはＲｖ３４７８残基１９３〜２９９をカバーし；プール４：２４ペプチドはＲｖ３４７８残基２８９〜３９３をカバーする。

【0270】

Ｒｖ２６２６は、１７ペプチドおよび１６ペプチドの２プールによりカバーされた。プール１：１７ペプチドはＲｖ２６２６残基１〜７９をカバーし；プール２：１６ペプチドはＲｖ２６２６残基６９〜１４３をカバーする。

【0271】

Ａｇ８５Ｂは、２３ペプチドの３プールによりカバーされた。プール１：２３ペプチドはＡｇ８５Ｂ残基３９〜１４１をカバーし；プール２：２３ペプチドはＡｇ８５Ｂ残基１３１〜２３３をカバーし；プール３：２３ペプチドはＡｇ８５Ｂ残基２２３〜３２５をカバーする。

【0272】

ＥＳＡＴ−６は、ＥＳＡＴ−６残基１〜９５をカバーする２１ペプチドの１プールによりカバーされた。

【0273】

ＴＢ１０．４は、ＴＢ１０．４残基１〜９５をカバーする２１ペプチドの１プールによりカバーされた。

【0274】

ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
免疫マウス由来の脾細胞を採取し、赤血球を溶解させた（Ｓｉｇｍａ、Ｒ７７５７）。２×１０^５細胞／ウェルを、抗マウスＩＦＮγモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；１０μｇ／ｍＬ、５５１２１６）をコーティングしたマルチスクリーンプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＨＡ Ｓ４５１０）において、１０％ＦＣＳ（ＪＲＨ、１２００３−１００Ｍ）、８０Ｕ／ｍＬペニシリン／８０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰＡＮ、Ｐ０６−０７−１００）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０）、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ、１５６３０）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、３１３５０）および５０μＭβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、３１３５０）を添加したαＭＥＭ培養培地（Ｇｉｂｃｏ、２２５７１）中、１０単位／ｍＬの組換えネズミＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２１２−１２）の存在下、陰性対照としては単独で、または
・終濃度１μモル／Ｌの上記ペプチドプール、
・陽性対照としては、５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ５２７５）
・無関連ペプチド
とともに３反復で４０時間培養した。

【0275】

ＩＦＮγ産生Ｔ細胞は、従前に記載されている通り(Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76: 12735-46)、ＥＬＩＳｐｏｔ（サイトカイン特異的酵素結合免疫スポット）アッセイにより定量した。結果は、３反復ウェルに関して得られた平均値として示す。見られた応答の陽性の実験閾値（すなわち、カットオフ）を、培地単独で見られたスポットの平均値＋２標準偏差に相当する閾値を計算することにより求め、１０^６細胞について報告した。ＣＴＬ ＥＬＩＳｐｏｔリーダーに関連したテクニカルカットオフ（それを超えるとそのリーダーのＣＶ（変動係数）が一貫して２０％未満となる値）も５０スポット／１０^６細胞と定義された。ＥＬＩＳｐｏｔ応答の統計分析は、クラスカル・ウォリス検定と、有意差が見られた場合にはその後にマン・ホイットニー検定を用いることによって行った。０．０５以上のＰ値が有意と見なされる。

【0276】

マウスにおける結核菌感染に対するＭｔｂ抗原含有ワクチンの治療効力の評価
エアロコントールユニットを搭載する内蔵型ヘンダーソン装置(contained Henderson apparatus）(Hartings et al., 2004, J Pharmacol Toxicol Methods 49: 39-55)を用いて０週目に、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）にエアゾールチャレンジを行った。結核菌チャレンジ株Ｈ３７Ｒｖ（ＮＣＴＣ７４１６）をケモスタットにて培養し(James et al., 2000, J Appl Microbiol 88: 669-77)、平均直径２μｍの微粒子をＣｏｌｌｉｓｏｎネブライザーで生成し、動物の鼻に直接送達した。Ｃｏｌｌｉｓｏｎネブライザー内の懸濁液は、各マウス群におよそ１００ＣＦＵ／肺の推定吸入用量を送達するように調整した。

【0277】

マウスを、感染後１０週目および１４週目にＭＶＡＴＧ１８３６４、ＭＶＡＴＧ１８３７６またはＭＶＡＴＧ１８３７７の、尾の基部の一か所への皮下投与（１０^７ｐｆｕ／１００μＬ／マウス）で免疫した。一マウス群には、陰性対照としてＭＶＡＴＧＮ３３．１（１０^７ｐｆｕ／１００μＬ／マウス）を注射した。

【0278】

マウスを６週目から１５週目の１０週間、週に１回、イソニアジド（ＩＮＨ、２５ｍｇ／ｋｇ体重）およびリファペンチン（ＲＩＦ、１０ｍｇ／ｋｇ体重）の強制経口投与により処置した（Aagaard et al., 2011, Nat Med, 17: 189-194から採用したプロトコール）。５匹のマウスを６週目の薬剤処置前に屠殺にした。

【0279】

処置期の終了時のクリアランスを測定するために抗生物質処置の終了時（感染１５週間後）に各群のマウス５匹を屠殺し、他は２１週目に屠殺した。器官（例えば、脾臓）を無菌的に摘出し、剖検当日に凍結し、細菌量分析向けの処理を行った。器官ホモジネートのサンプルの連続希釈系を７Ｈ１１ Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ＯＡＤＣ選択寒天に播種し、マイコバクテリア生菌の計数（ＣＦＵ）のために最大３週間インキュベートした。細菌量データは、Ｌｏｇ１０総コロニー形成単位（ＣＦＵ）として表した。

【0280】

ＭＶＡ候補の治療効力を比較し、マン・ホイットニー検定を用いてランク付けした。０．０５より優れたｐ値を有意と見なした。

【0281】

結果
実施例１：免疫原性組合せのために好適なＭｔｂ抗原の選択：
Ｍｔｂゲノムはおよそ４０００の遺伝子を発現するが、これらの遺伝子産物の大多数の、Ｍｔｂ生活環における機能および役割はまだ同定されていない。Ｍｔｂゲノムから、感染の自然経過のあらゆる相で抗ＴＢ免疫を生起することができる免疫療法ワクチンを提供するために最も適当な遺伝子／抗原セットを特定することを目的に、材料および方法に記載の通り、Ｍｔｂ抗原に関する既存のデータを利用可能な文献およびデータベースから調べた。

【0282】

これらの文献分析によって、３つの感染期の総てに属す３３のＭｔｂ抗原、すなわち、活動期の７抗原、５つの再燃期（Ｒｐｆ）抗原および１９の潜伏期抗原ならびに２つのＰＥ／ＰＰＥ抗原、のセットを「予備選択」することができる。
・活動期の抗原：ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、ＣＦＰ−１０（Ｒｖ３８７４）、ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）、Ａｇ８５Ａ（Ｒｖ３８０４）、Ａｇ８５Ｂ、（Ｒｖ１８８６）・および２つの「ＥＳＡＴ−６様抗原」（Ｒｖ３６２０およびＲｖ３６１９）。
・毒性と関連すると思われる２つのＰＥ／ＰＰＥ抗原（Ｒｖ２６０８およびＲｖ３４７８）。
・再燃期の抗原：５つの既存のＲｐｆ群遺伝子（ＲｐｆＡ（Ｒｖ０８６７ｃ）、ＲｐｆＢ（Ｒｖ１００９）、ＲｐｆＣ（Ｒｖ１８８４ｃ）、ＲｐｆＤ（Ｒｖ２３８９）、ＲｐｆＥ（Ｒｖ２４５０ｃ））が予備選択された。Ｒｐｆ群は、その発現が休眠細胞の再燃のために必要とされる、分泌型または膜結合型の壁分解酵素である。
・１９の潜伏期抗原は、記載されている既存の１５０を超える潜伏期遺伝子から予備選択された。より正確には、１２がＤｏｓＲレギュロンに属し、４５の遺伝子のセットは、その発現が潜伏期に増強され、５つはＭｔｂがｉｎ ｖｉｖｏで直面する潜伏条件を模倣すると思われる培養条件の際に発現が変調される遺伝子の中から選択された。３つの潜伏期抗原はまた、最近記載された前臨床期および初期臨床期に基づいて選択された(Bertholet et al., 2008, J. Immunol. 181: 7948-57; Bertholet et al., 2010, Sci Transl Med 2: 53ra74, Mollenkopf et al., 2004, Infect Immun 72: 6471-9)。要するに、予備選択された１９の潜伏期抗原は、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ１７３５、Ｒｖ１７３７、Ｒｖ２６２８、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ２６２７ｃ、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ３８１２、Ｒｖ１８０６、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ０１９８、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ００８１、Ｒｖ２００５ｃ、Ｒｖ２６６０、Ｒｖ３４０７およびＲｖ１８１３であった。

【0283】

次に、３３の予備選択Ｍｔｂ抗原のランク付けを行うために二次選択を行った。Ｍｔｂ抗原の二次選択は、免疫能および防御能（最高スコアの保持）ならびに生化学的予測を反映するデータマイニングベースの選択プロセスに基づいた（材料および方法参照）。

【0284】

下記の抗原が選択された。
・潜伏期抗原： Ｒｖ１７３３、Ｒｖ２０２９、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ１８０７およびＲｖ３４０７。Ｒｖ２６２６およびＲｖ１８１３も、それらの極めて良好なデータマイニングスコアおよび生化学的予測スコアのために選択された。
・活動期抗原： ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）およびＲｖ３４７８。予備選択された活動期Ｒｖ３６１９抗原は良好なデータマイニングスコアを有したが、ＥＳＡＴ−６様タンパク質は、ＥＳＡＴ−６自体よりも良好なスコアを示しながら、選択リストに保持されなかったことに留意しなければならない。別の例として、活動期Ｒｖ２６０８およびＲｖ３４７８抗原は同じデータマイニングスコアを有していたが、ヒトコホート研究におけるより高い奏功者パーセンテージを誘導するその能力に基づいてＲｖ３４７８が選択された。
・再燃期抗原： ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤ。５つの再燃期遺伝子産物のうち、３つのＲｐｆ（ＲｐｆＢ、ＤおよびＥ）が、ランニングデータマイニングスコアリングプロセスの後に極めて類似したスコアで目立ったが、主に２つの理由でＲｐｆＢおよびＤのみが選択された。第一に、５つのＲｐｆのうち４つの間で細胞応答および体液性応答に関して交差反応性が報告されている(Yeremeev et al., 2003, Infect Immun 71: 4789-94)、ただし、本発明者らの見解ではＲｐｆＢはその選択が妥当であると思われた。第二に、配列分析の後に、ＲｐｆＢとＤの間のリゾチームドメイン（ＬＤ）の配列相同性がＲｐｆＢとＥの間の相同性よりも低いことに基づいてＲｐｆＥの代わりにＲｐｆＤが選択された。従って、５つのＲｐｆに対する免疫応答を生じるためには、ＲｐｆＢとＤを保持することで十分であると思われる。

【0285】

実施例２：融合物の設計
材料および方法に記載されているように選択されたＭｔｂ抗原の生化学的特性および／または生物学的機能を予測するために、大規模ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ構造予測および文献分析を行った。

【0286】

選択された１４の抗原候補を、違うタイプの分析を必要とする３群に分類した。
・種々のウイルスベクターでのそれらの発現に関して利用できるデータがある抗原、すなわち、ＭＶＡ(Kolilab et al. 2010, Clin Vaccine Immunol 17: 793-801)、ワクシニアウイルス(Malin et al. 2000, Microbes Infect 2: 1677-85)およびアデノウイルス(Mu et al., 2009, Mol Ther 17: 1093-100; Dietrich et al. 2005, J Immunol 174: 6332-9;およびHavenga et al. 2006; J Gen Virol 87: 2135-43)におけるＡｇ８５Ｂ ＥＳＡＴ−６およびＴＢ１０−４。これらの場合、文献の分析が、ベクター構築において挿入すべき配列を設計するための主要な情報源となった。
・ウイルスベクター化に関して報告されているデータは無いが、既知の構造を有するタンパク質との同一または相同な抗原。これらの場合、構造データが、ベクター構築において挿入すべきＭｔｂ配列を設計するための主要な情報源となった（Ｒｖ２６２６、Ｒｖ２０２９、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤおよびＲｖ０５６９）。
・ウイルスベクター化に関して報告されているデータが無く、既知の構造を有するタンパク質との相同性も無い抗原。これらの場合、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ生化学的解析および予測を用いて、抗原の特性評価を行い、ベクター構築において挿入すべきＭｔｂ配列を設計した（Ｒｖ０１１１、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３４７８、Ｒｖ１８０７およびＲｖ１８１３）。

【0287】

Ａｇ８５Ｂ抗原の設計
Ａｇ８５Ｂは、ＫｏｌｉｌａｂのＭＶＡベクターでは保存されているが、Ｍａｌｉｎのワクシニアウイルスおよびアデノウイルス構築物では保存されていない、４０残基長のペプチドシグナルを示す。Ａｇ８５ＢシグナルペプチドはＴＭドメインと予測され、本発明者らは本発明のベクター構築においてこのＡｇ８５Ｂペプチドシグナルを保持しなほうがよいと考えた。本明細書に記載のベクター構築において使用すべきＡｇ８５Ｂ^＊の推奨される一次構造は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列に相当する。

【0288】

ＥＳＡＴ−６抗原の設計
ＥＳＡＴ−６は、ＣＦＰ−１０とヘテロ二量体複合体を形成し、このヘテロ二量体相互作用は両タンパク質の折り畳みを誘導する予想される。ＣＦＰ１０と複合体を形成した際、ＥＳＡＴ−６だけがモルテン・グロビュール様状態およびヘリックス−ターン−ヘリックスをとる。従って、そのパートナーと結合したＥＳＡＴ−６は、単独で発現されるＥＳＡＴ−６よりも安定となり得る。しかしながら、本明細書に記載のベクター構築において使用すべきＥＳＡＴ−６の推奨される一次構造は、最終的にその開始Ｍｅｔを欠く（例えば、融合物の内部の位置にある場合）全長タンパク質（配列番号１４で示されるアミノ酸配列）に相当する。

【0289】

ＴＢ１０−４（Ｒｖ０２８８）の設計
ＴＢ１０−４は、ＥＳＡＴ−６と同じタンパク質ファミリーに属す。ＴＢ１０−４のＮＭＲ構造は、それがＲｖ０２８７とヘテロ二量体複合体（その構造を安定化させると思われる）を形成することを示した。ポックスウイルスによるＴＢ１０−４発現を報告している刊行物は無いが、アデノウイルスベクターにおいて、Ａｇ８５ＡまたはＡｇ８５ＢのいずれかのＣ末端部分と融合した形で全長ＴＢ１０−４の発現が報告されている。これに基づけば、本明細書に記載のベクター構築において使用すべきＴＢ１０．４の推奨される一次構造は、最終的にその開始Ｍｅｔを欠く全長タンパク質（配列番号２で示されるアミノ酸配列）に相当する。

【0290】

Ｒｖ２６２６の設計
Ｒｖ２６２６の結晶化(Sharpe et al., 2008, J Mol Biol 383: 822-36)は、サブユニット内およびサブユニット間ジスルフィド結合を有するホモ二量体として発現されることを示した。Ｒｖ２６２６に関して予測されるシグナルペプチドは無い。Ｒｖ２６２６は極めてよく定義された折り畳みを有するので、本明細書に記載のベクター構築において使用すべきＲｖ２６２６の推奨される一次構造は、最終的にその開始Ｍｅｔを欠く全長タンパク質（配列番号１０で示されるアミノ酸配列）に相当する。

【0291】

Ｒｖ０５６９の設計
Ｒｖ０５６９構造は知られていないが、このタンパク質はＲｖ２３０２と、（８８残基のうち）７６のアミノ酸オーバーラップ領域において６２％の同一性（８１％の類似性）を示す。この後者の構造はＮＭＲにより解明されており(Buchko et al., 2006, Bacteriol 188: 5993-6001)、逆平行β−シートコアとＣ末端α−ヘリックスを有する、溶液中で極めて良好に折り畳まれた構造を示した。このタンパク質に関してコイルドコイル予測は無い。Ｒｖ０５６９タンパク質に関して既知の機能は無い。潜在的に極めてよく定義された折り畳みのために、本明細書に記載のベクター構築において使用すべきＭｔｂ Ｒｖ０５６９の推奨される一次構造は、最終的にその開始Ｍｅｔを欠く全長タンパク質（配列番号３で示されるアミノ酸配列）に相当する。

【0292】

Ｒｖ２０２９の設計
Ｒｖ２０２９構造は未知であるが、このタンパク質は、大腸菌のホスホフルクトキナーゼ−２（ｐｆｋ２）と、（３３９のうち）３１０ａａのオーバーラップ領域で３５％の同一性を示す。さらに、ＰＲＯＳＣＡＮ検索によれば、完全に保存された糖鎖キナーゼシグネチャーが同定された。従って、Ｒｖ２０２９は、おそらくＭｔｂにおいてホスホフルクトキナーゼ活性を有する。ホスホフルクトキナーゼは、解糖の際にフルクトース−６−リン酸のリン酸化を触媒する。大腸菌ｐｆｋ２構造は、ＡＴＰが結合している場合は四量体であり、培地中にＡＴＰが存在していない場合には二量体である（酵素活性のアロステリックな調節）。この大腸菌酵素では、Ｃ末端の最後の４つの残基の欠失が、ＡＴＰ誘導性の四量体形成を完全に阻害する。従って、Ｒｖ２０２９のオリゴマー化のヘテロ性（二量体型と四量体型の混在）を回避するためには、このＣ末端部分の欠失（すなわち、最後の２５残基の欠失）が推奨される。さらに、Ｒｖ２０２９の酵素活性を消失させるためには、突然変異Ｄ２６５Ｎ（Ｍｅｔイニシエーターから始めれば２６５番またはＭｅｔ無しでは２６４番）が、大腸菌ｐｆｋ−２におけるこの酵素活性がほぼ完全に消失させるので推奨される(Cabrera et al., 2010, Arch Biochem Biophys 502: 23-30)。これに基づけば、本明細書に記載のベクター構築において使用すべきＲｖ２０２９抗原（Ｒｖ２０２９^＊）の推奨される一次構造は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列に相当する。

【0293】

ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤの設計
再燃促進因子(Resuscitation Promoting Factor)（Ｒｐｆ）は、細菌の再活性化（休眠から増殖への遷移）の際に産生される分泌型タンパク質である。結核菌は５つの異なるＲｐｆ（Ａ〜Ｅ）を有し、その総てが、保存されている触媒ドメイン（リゾチーム様ドメイン）を含む。このドメインの他に、これらの５つのタンパク質間で有意な類似性は無い。ＲｐｆＢ構造は、この分子の約半分（残基１９４〜３６２）に関して得られており、シグナルペプチドが予測されている（残基１〜２９；Ruggiero et al. 2009, J Mol Biol 385: 153-62）。全長タンパク質（そのシグナルペプチドを欠く）は、大腸菌で発現される場合には単量体として挙動する。

【0294】

ＲｐｆＢに関して、構造が得られてないタンパク質の部分（３０〜１９３）を解析するために、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測および解析を行った。シグナルペプチド以外には、膜貫通ドメインは予測されなかった。ＨＣＡプロット、二次構造予測および天然変性領域予測は、３０〜１９３領域のよく定義されている折り畳みと一致する。ＰＲＯＳＣＡＮを用いたコイルドコイル予測および既知のモチーフに関する検索では、有意な結果が得られなかった。

【0295】

触媒ドメインの活性は、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）再燃アッセイ（突然変異Ｅ２９２Ｋ；Mukamolova et al. 2006, Mol Microbiol 59: 84-98）において、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)Ｒｐｆの再燃活性に不可欠な保存された残基に依存することが示された。さらに、２つの残基Ｔ３１５およびＱ３４７がリゾチームの基質結合に関与しており、ＲｐｆＢでは保存されている(Cohen-Gonsaud, et al. 2005, Nat Struct Mol Biol 12, 270-3）。

【0296】

さらに、その触媒ドメインを有するＲｐｆＢ分子をＲｐｆ群の中でも最も発散度の高い触媒ドメイン（すなわち、ＲｐｆＤ触媒ドメイン）で置換したものに相当するＲＰＦＢ−Ｄハイブリッドを設計することが選択された。従って、ウイルスベクターで発現させるべきＲＰＦＢ−Ｄハイブリッドは、３つの突然変異（Ｅ２９２Ｋ、Ｔ３１５ＡおよびＱ３４７Ａ）によって中和された触媒活性を有し、シグナルペプチドを欠くハイブリッドタンパク質である。融合物において使用されるこのＲＰＦＢ−Ｄハイブリッドタンパク質の推奨される一次構造は、ＲｐｆＢの配列番号３１残基１０〜残基２８３で示されるアミノ酸配列とＲｐｆＤの残基５１〜残基１４７が融合し、最終的に開始Ｍｅｔを欠くものに相当する。

【0297】

Ｒｖ１８０７の設計
Ｒｖ１８０７構造は公開されていないが、ＰＤＢデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索は、あるＭｔｂ ＰＰＥタンパク質（Ｒｖ２４３０）の最初の１５０残基とのみマッチを示した。ＰＥ／ＰＰＥは、Ｎ末端部分にＰＥ（プロリン、グルタミン酸）モチーフまたはＰＰＥ（プロリン、プロリン、グルタミン酸）モチーフを共通に持つ大きなＭｔｂタンパク質ファミリーである（１００前後のＰＥおよび６０ＰＰＥメンバー）。ＰＥタンパク質はＰＰＥとのヘテロ二量体として発現され、それらの機能はまだ知られていない。ＵＮＩＰＲＯＴ−ＳＷＩＳＳＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ検索ではいくつかのマッチを示したが、それらは総て付加的Ｍｔｂ ＰＰＥであり、さらなる情報を得ることはできなかった。

【0298】

大腸菌では、可溶性ＰＰＥ（Ｒｖ２４３０）またはＰＥ（Ｒｖ２４３１）の発現はヘテロ二量体として発現される場合にのみ可能であるように見える(Strong et al. 2006, Proc Natl Acad Sci 103: 8060-5)。これらの著者らは、大腸菌において単独で発現されるＲｖ１８０７が封入体を形成することを報告している。ＰＲＯＳＣＡＮ検索は、既知のモチーフとの有意なマッチを示さなかった。このタンパク質に関しては、シグナルペプチドも膜貫通ドメインも報告は無く、予測もされていない。ＨＣＡプロットならびに二次構造予測は、最後の６０〜７０残基の領域以外は、タンパク質全体のよく定義された折り畳みと一致していた。さらに、最後の６０残基は、天然変性領域予測を用い、折り畳まれていないと予測されるが、Ｒｖ１８０７に対するコイルドコイル予測では有意な結果は得られなかった。

【0299】

ＥＳＡＴ６およびＴＢ１０−４については、Ｒｖ１８０７とそのパートナー（すなわち、Ｒｖ１８０６）の共発現は、タンパク質の安定性と従って潜在的にその免疫原性にも、おそらく有利な影響を与える。誤った折り畳みのタンパク質（単量体型）の発現は、組換えベクターの安定性を損なうおそれがある（タンパク質毒性）。さらに、Ｒｖ１８０７の非折り畳みＣ末端部分も免疫原性および／または組換えウイルスの安定性のいずれにも不利な影響を持つおそれがある。融合物において使用されるＲｖ１８０７の推奨される一次構造は、全長タンパク質（配列番号６）に相当する。全長抗原で問題がある場合には、最後の６０残基が削除されたＣ末端切断抗原（配列番号１８に示される通り）を使用することができる。

【0300】

Ｒｖ３４７８の設計
Ｒｖ３４７８は、もう１つのＰＰＥタンパク質である。そのＰＰＥドメインは、Ｒｖ１８０７のＰＰＥドメインと５７％同一である（２つの全長タンパク質間で４１％の同一性）。ＵＮＩＰＲＯＴ−ＳＷＩＳＳＰＲＯＴに対するＢＬＡＳＴ検索ではいくらかのマッチを示したが、これらは総て他のＭｔｂ ＰＰＥであった。ＨＣＡプロットは、タンパク質配列全域に疎水性のパッチの存在を示した。言い換えれば、ＨＣＡプロットは、Ｒｖ３４７８において非折り畳み親水性領域を示さなかった。しかしながら、Ｒｖ１８０７では、Ｒｖ３４７８の最後の４０〜５０残基は折り畳まれていないと予測される（二次構造および天然変性予測の両方に基づく）。このタンパク質に関しては、シグナルペプチドも膜貫通ドメインも報告は無く、予測もされていない。Ｒｖ３４７８に対するコイルドコイル予測では有意な結果は得られなかった。Ｒｖ１８０７については、推奨される一次構造は全長タンパク質（配列番号１３）または、問題があれば、最後の４０残基が削除されたＣ末端切断抗原（配列番号２４に示される通り）である。

【0301】

Ｒｖ０１１１の設計
Ｒｖ０１１１は、おそらくアシルトランスフェラーゼ活性を有する膜タンパク質であると予測される。残基５８〜４２７にわたるＤＡＳ、ＴＭＨＭＭおよびＴｏｐＰｒｅｄにより、１０の膜貫通ドメインが予測される。シグナルペプチドは予測されなかった。二次構造は一次構造全域で予測され、４４９〜４６９に、予測天然変性領域に相当するギャップを持つ。Ｒｖ０１１１に対するコイルドコイル予測では、有意な結果は得られなかった。

【0302】

Ｐｒｏｓｃａｎ分析では、８０％以上の類似性を有する４つのヒット、すなわち、アルド／ケトレダクターゼ酵素部位、アシルトランスフェラーゼリポイル結合部位、糖輸送タンパク質シグネチャーおよび真核生物リポカリンタンパク質が得られた。最初の３つのシグネチャーはこのタンパク質の最初の３００残基内にあるので、潜在的生物活性を回避するために、タンパク質の少なくともこの部分を除去することが推奨される。これにより、タンパク質の膜貫通ドメインの大部分も取り除くことができる。従って、ウイルスベクターにおいて使用すべきＲｖ０１１１の推奨される一次構造は、このタンパク質のＣ末端部分（例えば、配列番号１５に示されるような天然抗原の残基３９３〜６８５）であり、分泌型構築物の場合には原形質膜係留のためにＴＭを１つだけ備える。発現に問題があれば、ＴＭドメインを欠いたさらなる末端切断抗原（配列番号１５の残基３７で始まる天然Ｒｖ０１１１の残基４２９〜６８５）を使用することができる。

【0303】

Ｒｖ１８１３の設計
Ｒｖ１８１３構造は公開されておらず、ＰＤＢに対するＢＬＡＳＴ検索でもマッチは得られなかった。Ｒｖ１８１３は小タンパク質（１４３残基）であり、シグナルペプチド（１〜３２）を含み、膜貫通ドメインを欠くと予測される。このタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔ−Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースの他のタンパク質と有意な相同性を示さない。ＨＣＡプロット、二次構造予測および天然変性領域予測は総て、タンパク質全体のよく定義された折り畳みと一致する。コイルドコイル予測では、有意な結果は得られなかった。ＴＢベースでは機能は報告されておらず、ＰＲＯＳＣＡＮ検索では、既知のモチーフとの有意なマッチは得られなかった。従って、ウイルスベクターにおいて使用すべきＲｖ１８１３の推奨される一次構造は、そのシグナルペプチド（残基１〜３４）を欠く全長タンパク質であり場合のアミノ酸配列は配列番号１９で示される。

【0304】

Ｒｖ３４０７の設計
Ｒｖ３４０７構造は公開されておらず、ＰＤＢに対するＢＬＡＳＴ検索でもマッチは得られなかった。Ｒｖ３４０７は小タンパク質（９９残基）であり、Ｕｎｉｐｒｏｔ−Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースの他のタンパク質と有意な相同性は無い。このタンパク質に関しては、シグナルペプチドも膜貫通ドメインも報告は無く、予測もされていない。ＨＣＡプロットおよび二次構造予測は、タンパク質全体のよく定義された折り畳みと一致した。しかしながら、天然変性領域予測は、定義された構造において最後の３３残基は折り畳まれていない可能性があることを示した。ＨＣＡおよび二次構造予測とは一致しないこの最後の結果は、パートナータンパク質と結合した際に折り畳まれるＭＯＲＥ（「分子認識エレメント(Molecular Recognition Element)」）のシグネチャーであり得る。Ｒｖ３４０７の場合、Ｃ末端αヘリックスは、Ｒｖ３４０７がそのパートナーと結合した場合にのみ存在し得る。コイルドコイル予測では、有意な結果は得られなかった。このタンパク質に関してＴＢベースでは機能は報告されておらず、ＰＲＯＳＣＡＮ検索では、既知のモチーフとの有意なマッチは得られなかった。Ｒｖ３４０７の推奨される一次構造は、全長タンパク質（配列番号１２）である。安定性に問題があれば、最後の３３残基が削除されたＣ末端端切断抗原（配列番号２３に示される通り）を使用することができる。

【0305】

Ｒｖ１７３３の設計
Ｒｖ１７３３は、ＵＮＩＰＲＯＴ−ＳＷＩＳＳＰＲＯＴおよびＴＢベースによれば、２つの膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であると予測される（これはＤＡＳ、ＴＭＨＭＭおよびＴｏｐＰｒｅｄを用いた場合にも予測される）。最初のＴＭドメインはシグナルペプチドと予測された。このタンパク質では、これらの膜貫通ドメインの他に、二次構造はほとんど予測されない。ＨＣＡプロットは、２つの膜貫通ヘリックス間に疎水性パッチがほとんど存在しないことを示す。最後に、これら２つの膜貫通ヘリックス間に天然変性領域（約２０残基長）が予測された。これらの結果を総て併せると、膜貫通ドメインの近傍におそらくルーズな折り畳みがあることが示される。そのシグナルペプチドを欠くＲｖ１７３３に対するＰＲＯＳＣＡＮ検索では、既知のモチーフとの有意なマッチは得られなかった。Ｒｖ１７３３に対するコイルドコイル予測では、有意な結果は得られなかった。従って、ウイルスベクターにおいて使用すべきＲｖ１７３３の推奨される一次構造は、配列番号１７示されるように、そのシグナルペプチド（最初の６２の残基）を欠く全長タンパク質である。あるいは、全長Ｒｖ１７３３（配列番号５）も使用可能である。

【0306】

実施例３：Ｍｔｂ遺伝子融合物の構築
１２の異なる融合タンパク質を図１および表３に示されるように作出した。より具体的には、生化学的合理性に基づき、それぞれ下記のような５つの融合物を設計した：
・融合物番号３（ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊）；
・融合物番号５（Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）；
・融合物番号６（Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊−Ｒｖ１７３３^＊）；
・融合物番号８（Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−
Ｒｖ１７３３^＊）；および
・融合物番号１４（Ｒｖ２０２９^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ０１１１^＊）。

【0307】

前記融合物を設計するために下記の生化学的合理性に従った。
・２つの二量体タンパク質（すなわち、Ｒｖ２６２６およびＲｖ２９２９^＊）は、ステリッククラッシュを回避するために同じ融合物において融合させるべきでない。
・２つの膜タンパク質（すなわち、Ｒｖ１７３３^＊およびＲｖ０１１１^＊）は、潜在的毒性問題を回避するために同じ融合物において使用されるべきでない。
・ＴＭを有するタンパク質（Ｒｖ１７３３^＊およびＲｖ０１１１^＊）は、分泌型構築物のためには原形質膜係留を可能とするように融合物の末端に挿入されるべきである。
・可能であれば、融合タンパク質は、その融合物の残りの部分に「シャペロン」効果をもたせるためには、十分な折り畳みを持つタンパク質（すなわち、Ａｇ８５Ｂ^＊、Ｒｖ２０２９^＊、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ０５６９、ＲＰＦＢ−Ｄハイブリッド^＊）で始めるべきである。
・３つの融合物を作製すること、そのうち２つは抗原の最小セット（すなわち、Ａｇ８５Ｂ^＊、Ｒｖ２０２９^＊、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ０１１１^＊、Ｒｖ１７３３^＊、ＴＢ１０−４、ＥＳＡＴ−６、ＲＰＦＢ−Ｄハイブリッド^＊）を有し、最後の融合物は抗原の残りの部分（任意選択）（すなわち、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８１３^＊、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ３４７８）を有する。

【0308】

他方、融合物はまた、ＴＢ疾患の相に対しても設計された。融合物番号２は、活動期抗原（Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６）を含み、融合物番号４は活動期抗原および再燃期抗原（ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊−Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６）を含む。融合物番号１３は、潜伏期抗原（Ｒｖ２０２９^＊−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３^＊−Ｒｖ０１１１^＊）から構成される。

【0309】

材料および方法に記載されているように、一連のペプチド、すなわち、コードされる遺伝子産物の検出を容易にすることを目的としたＮ末端ＦｌａｇタグおよびＣ末端ｃ−ｍｙｃおよびＨｉｓタグペプチド、ならびに免疫原性活性を増強するためのＮ末端シグナルおよびＣ末端膜係留ペプチド（Ｒｖ０１１１^＊またはＲｖ１７３３^＊で終わる融合物には、これらのタンパク質がすでにこのようなドメインを含んでいるので、ＴＭドメインの付加は必要でないことに留意）がそれぞれＭｔｂ抗原融合物に付加された。

【0310】

比較として、コードされるＭｔｂ抗原の細胞質発現を評価するために、ＳＳおよびＴＭペプチドを欠いた融合物も構築した。融合物番号３（ｐＴＧ１８２６７）、番号５（ｐＴＧ１８２６９）、番号２（ｐＴＧ１８２６６）および番号４（ｐＴＧ１８２６８）をＳＳペプチドおよびＴＭペプチドから削除し、融合物番号１２（ｐＴＧ１８３０７）、番号９（ｐＴＧ１８２９５）、番号１０（ｐＴＧ１８２９６）および番号１１（ｐＴＧ１８２９７）を得た。Ｎ末端ＦｌａｇタグおよびＣ末端ｃ−ｍｙｃおよびＨｉｓタグはこれらの構築物において保持した。

【0311】

【表3】

【0312】

比較のため、上記融合物において使用した個々のＭｔｂ遺伝子をコードするプラスミドはＰＣＲにより増幅し、または遺伝子配列がＧｅｎｅａｒｔにより合成された。より正確には、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３^＊およびＲｖ３４７８を増幅するためにはｐＴＧ１８２６９を鋳型として用い、Ｒｖ２６２６を増幅するためにはｐＴＧ１８３２３を鋳型として用いた。ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３^＊、Ａｇ８５Ｂ^＊、ＴＢ１０−４、Ｒｖ０１１１^＊およびＲｖ２０２９^＊は合成遺伝子として作製した。

【0313】

個々の遺伝子は融合物と同じコンテキストに置く、すなわち、ｐＧＷｉｚのＣＭＶプロモーターの下流に挿入し、５’側はＦｌａｇと、３’側はｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ配列と融合した。Ｒｖ１７３３^＊およびＲｖ０１１１^＊タンパク質はＴＭドメインを含むので、狂犬病ウイルスＥＲＡ株の糖タンパク質前駆体のＮ末端に存在するシグナルペプチドをＦｌａｇ配列の上流に融合させた。作出したプラスミドをそれぞれｐＴＧ１８３００（Ｒｖ３４０７）、ｐＴＧ１８３０１（Ｒｖ０５６９）、ｐＴＧ１８３０２（Ｒｖ１８０７）、ｐＴＧ１８３０３（Ｒｖ１８１３^＊）、ｐＴＧ１８３０４（Ｒｖ３４７８）、ｐＴＧ１８３０５（Ｒｖ２６２６）、ｐＴＧ１８３０８（ＥＳＡＴ６）、ｐＴＧ１８３０９（Ｒｖ１７３３^＊）、ｐＴＧ１８３１０（Ａｇ８５Ｂ^＊）、ｐＴＧ１８３１５（ＴＢ１０．４）、ｐＴＧ１８３２９（Ｒｖ０１１１^＊）、ｐＴＧ１８３１７（Ｒｖ２０２９^＊）と呼称した。

【0314】

種々の融合タンパク質を、対応する発現プラスミドを導入した後に、真核生物発現系で評価した。発現はウエスタンブロットにより評価し、免疫原性活性は、マウスのＤＮＡ免疫の後にＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイにより評価した。可能であれば、細胞質型（ＳＳおよびＴＭを欠く場合）および膜係留型発現の免疫原性、ならびに融合物により提供された免疫原性と個々のＭｔｂ抗原を発現するプラスミドの混合物を用いた場合に得られた免疫原性を比較した。

【0315】

実施例４：Ｍｔｂ抗原および融合物の発現分析
個々の発現であれ融合物としての発現であれ、Ｍｔｂ遺伝子の発現は、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞溶解液からウエスタンブロットにより解析した。

【0316】

４．１ 個々のＭｔｂ抗原をコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞溶解液のウエスタンブロット解析
個々のＭｔｂ抗原の免疫検出は、発現カセット（例えば、抗Ｆｌａｇ Ｍ２ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体、モノクローナル抗ｃ−ｍｙｃペルオキシダーゼ抗体およびモノクローナル抗Ｈｉｓペルオキシダーゼ抗体）に含まれるタグペプチドに対する抗体、またはＭｔｂ抗原に特異的な抗体を用いて行った。具体的には、Ｒｖ１７３３^＊、Ｒｖ２０２９^＊、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ０１１１^＊、Ｒｐｆ−Ｂ−Ｄ、Ｒｖ１８１３^＊、Ｒｖ３４０７、およびＲｖ３４７８の検出のためにはウサギの免疫後に得られた血清（材料および方法参照）を用い、ＥＳＡＴ６、Ａｇ８５Ｂ^＊、ＴＢ１０．４およびＲｖ２６２６の検出のためには市販の抗体を用いた。

【0317】

結果を表４にまとめる。より具体的には、用いた免疫検出系（抗Ｆｌａｇ、抗Ｈｉｓ抗体、特異的ウサギ血清および市販の抗体）によらず、総ての個々のタンパク質について、予測されたサイズに相当するバンドが検出された。いくつかのタンパク質では、用いた免疫検出系によっては、付加的な産物も検出された。さらに、Ｒｖ３４０７以外は高レベルの発現が検出され、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ６は比較的低かった。代表的なＭｔｂ抗原のパネルに関する発現検出の例を図２に示す、すなわち、Ｒｖ２０２９^＊（図２Ａ）、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ（図２Ｂ）、ＥＳＡＴ６（図２Ｃ）およびＲｖ２６２６（図２Ｄ）。

【0318】

【表4】

【0319】

４．２ Ｍｔｂ抗原融合物をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞溶解液のウエスタンブロット解析
ＨＥＫ２９３細胞を、種々のＭｔｂ遺伝子融合物を発現するプラスミドでトランスフェクトし、発現産物を上記と同じ条件でウエスタンブロットにより解析した。トランスフェクションは、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下、また不在下でも行った。この場合にもまた、免疫検出は抗Ｆｌａｇ Ｍ２ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体、モノクローナル抗ｃ−ｍｙｃペルオキシダーゼ抗体およびモノクローナル抗Ｈｉｓペルオキシダーゼ抗体ならびに抗Ｍｔｂ特異的抗体を用いて行った。

【0320】

タグを有する融合物の予測サイズを以下に示す。
融合物番号２（ｐＴＧ１８２６６）：６３．６ｋＤａ
融合物番号３（ｐＴＧ１８２６７）：４９．０ｋＤａ
融合物番号４（ｐＴＧ１８２６８）：９９．７ｋＤａ
融合物番号５（ｐＴＧ１８２６９）：１２２．０ｋＤａ
融合物番号６（ｐＴＧ１８２７０）：１０３．５ｋＤａ
融合物番号８（ｐＴＧ１８２７２）：６７．３ｋＤａ
融合物番号９（ｐＴＧ１８２９５）：１１２．９ｋＤａ
融合物番号１０（ｐＴＧ１８２９６）：５３．８ｋＤａ
融合物番号１１（ｐＴＧ１８２９７）：９０．０ｋＤａ
融合物番号１２（ｐＴＧ１８３０７）：３９．３ｋＤａ
融合物番号１３（ｐＴＧ１８３２３）：１０１．５ｋＤａ
融合物番号１４（ｐＴＧ１８３２４）：９０．６ｋＤＡ

【0321】

Ｍｔｂ抗原融合物は総て、抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体および抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いて検出した。Ｍｔｂ融合産物はまた、ｐＴＧ１８２６６、ｐＴＧ１８２６７、ｐＴＧ１８２６８およびｐＴＧ１８２６９を除き、抗ｃ ｍｙｃモノクローナル抗体でも検出した。細胞質対応物（ｐＴＧ１８２９６、ｐＴＧ１８３０７、ｐＴＧ１８２９７およびｐＴＧ１８２９５）はこの抗ｍｙｃ抗体で十分検出されたことから、これらの融合物では隣接するＴＭドメインのためにｃ−ｍｙｃエピトープに接近できない可能性がある。図３は、抗Ｆｌａｇ免疫検出後の、潜伏期抗原（融合物番号９をコードするｐＴＧ１８２９５）、活動期抗原（融合物番号１０をコードするｐＴＧ１８２９６）、再燃期抗原（融合物番号１２をコードするｐＴＧ１８３０７）および再燃期および活動期の両抗原（融合物番号１１をコードするｐＴＧ１８２９７）を包含するＭｔｂ融合物のウエスタンブロット解析を示す。抗Ｈｉｓ抗体による免疫検出も同じ発現パターンを示した。

【0322】

図４は、対応する特異的血清を用いた免疫検出後のＴＢ１０．４（図４Ａ）、Ｒｖ０５６９（図４Ｂ）およびＲｖ２６２６（図４Ｃ）を含むＭｔｂ融合物、それぞれＴＢ１０．４を含有する融合物番号２（ｐＴＧ１８２６６）、番号１０（ｐＴＧ１８２９６）、番号４（ｐＴＧ１８２６８）、番号１１（ｐＴＧ１８２９７）、番号１４（ｐＴＧ１８３２４）；Ｒｖ０５６９を含有する融合物番号５（ｐＴＧ１８２６９）および番号９（ｐＴＧ１８２９５）、ならびにＲｖ２６２６を含有する融合物番号１３（ｐＴＧ１８３２３）、番号６（ｐＴＧ１８２７０）および番号８（ｐＴＧ１８２７２）のウエスタンブロット解析を示す。ｐＧＷｉｚは陰性対照として、ＴＢ１０．４をコードするｐＴＧ１８３１５は陽性対照として示す。

【0323】

免疫検出系によらず、総ての融合物について予測されたサイズに相当するバンドが強く示され、いくつかの場合では、付加的融合産物も見られた。特に、ｐＴＧ１８２７０、ｐＴＧ１８２７２およびｐＴＧ１８３２３では二量体が検出された。これらの３つの融合物は、還元条件に耐性のある二量体を形成する能力を持つＲｖ２６２６を含んでいる。抗Ｆｌａｇ抗体および抗Ｈｉｓ抗体による免疫検出は、ｐＴＧ１８３２３およびｐＴＧ１８２６９に関して、一部、付加的な、マイナーなタンパク質分解産物が強く示された。さらに、ｐＴＧ１８２６６、ｐＴＧ１８２６８、ｐＴＧ１８２６９、ｐＴＧ１８２７０、ｐＴＧ１８２７２、ｐＴＧ１８３２３およびｐＴＧ１８３２４では、抗Ｆｌａｇ抗体および抗Ｈｉｓ抗体で、予測されたサイズよりも大きい付加的産物も検出された。これらのバンドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＮ−グリコシダーゼＦ処理により実証されたように（すなわち、細胞抽出物のＮ−グリコシダーゼ処理の後に予測されたサイズに発現産物が見られた）、Ｎ−グリコシル化産物に相当する。融合物番号４（ｐＴＧ１８２６７、ＲｐｆＢ−Ｄ^＊）を除き、シグナルペプチドを含有する総ての融合物は、Ｎ−グリコシル化産物をもたらす。Ｎ−グリコシル化産物は、抗原特異的抗体でも検出され、Ｒｖ２６２６を含有する融合物ｐＴＧ１８２７０、ｐＴＧ１８２７２およびｐＴＧ１８３２３では二量体もまた検出された。一部の融合物で特異的血清を用いた場合にも、融合物および血清にもよるが、タンパク質分解産物の証拠が得られた（データは示されていない）。例えば、ｐＴＧ１８２６９では約４０ｋＤａ、ｐＴＧ１８２９５では約３６ｋＤａと３８ｋＤａの付加的バンドがＲｖ３４０７特異的血清を用いて検出されたが、Ｒｖ０５６９特異的血清を用いた場合には見られなかった。

【0324】

総ての融合物について同等の高レベルの発現が見られ、ＭＧ１３２の存在下で高い量の産物が検出された。膜係留融合物（ｐＴＧ１８２６９、ｐＴＧ１８２６８）の発現レベルは、細胞質融合物（ｐＴＧ１８２９６）よりも良好に発現されたｐＴＧ１８２６６を除き、それらの細胞質対応物（ｐＴＧ１８２９５、ｐＴＧ１８２９７）を用いた場合に検出された発現レベルに匹敵していた。融合物番号５（ｐＴＧ１８２６９）はＲｖ１８０７特異的抗体を用いた場合には極めて弱い検出であったが、細胞質融合物（ｐＴＧ１８２９５）の場合にはそうではなかった。Ｒｖ１８０７特異的エピトープは、隣接するＴＭ配列のために、この融合物内では接近できない可能性がある。

【0325】

実施例５：ＤＮＡ免疫評価
種々のＭｔｂ抗原融合物の免疫原性活性を、ＤＮＡ免疫後の種々のマウスモデルで評価した。

【0326】

５．１． 活動期のＭｔｂ抗原に基づく融合物により誘導される免疫原性の評価
細胞膜係留型（ＳＳ／ＴＭ：ｐＴＧ１８２６６）または細胞質型（ｐＴＧ１８２９６）のいずれかで融合物「Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６」を発現するプラスミドを用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内経路から３週間隔で３回の免疫を行った。比較のため、融合物に含まれる個々のＭｔｂ抗原をコードするプラスミドの混合物（ｐＴＧ１８３１０（Ａｇ８５Ｂ）＋ｐＴＧ１８３１５（ＴＢ１０．４）＋ｐＴＧ１８３０８（ＥＳＡＴ６））および陰性対照としてのエンプティｐＧＷｉｚでもマウスを免疫した。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、材料および方法に記載の種々のペプチドプールによるｅｘ ｖｉｖｏ再刺激の後に、ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。

【0327】

図５に示されるように、ｐＴＧ１８２６６（係留型のＡｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ融合物を発現する）で免疫した総てのマウスで、Ａｇ８５ＢおよびＴＢ１０．４抗原に対して強い細胞応答が誘導され、一方、８匹の動物のうち６匹でＥＳＡＴ−６に対するＩＦＮγ産生細胞が生成された（図５ａ）。ｐＴＧ１８２９６（細胞質型のＡｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ融合物を発現する）で免疫したマウスでも、Ａｇ８５ＢおよびＴＢ１０．４抗原に対するＩＦＮγ産生細胞の活性化が検出されたが、係留型融合物により誘導されたものに比べて低いレベルであり、一方、ＥＳＡＴ−６に対しては極めて弱い応答が検出されたに過ぎなかった（図５ｂ）。非常に興味深いことに、図５ａ／５ｂおよび図５ｃを比較すると、個々のプラスミドから独立に発現される場合（ｐＴＧ１８３１０、ｐＴＧ１８３１５およびｐＴＧ１８３０８の混合物）ではなく、Ａｇ８５Ｂ、ＴＢ１０．４およびＥＳＡＴ−６が融合タンパク質（ｐＴＧ１８２６６およびｐＴＧ１８２９６）として発現される場合に、３つの抗原総てに対して最も強い応答が検出された。予想されたように、エンプティプラスミドによる免疫は特異的免疫応答を誘導しなかった（図５ｄ）。

【0328】

よって、少なくとも活動期のＭｔｂ抗原では、これらの結果によれば、得られるＭｔｂ抗原融合物の免疫原性活性を最適化するためには、細胞表面で発現される抗原融合物（ＳＳおよびＴＭペプチドを有する）設計することの利益が強調される。

【0329】

５．２． 活動期および再燃期のＭｔｂ抗原に基づく融合物により誘導される免疫原性の評価
細胞膜係留型（ＳＳ／ＴＭ：ｐＴＧ１８２６８）または細胞質型（ｐＴＧ１８２９７）のいずれかで融合物「ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６」を発現するプラスミドを用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内経路から３週間隔で３回の免疫を行った。比較のため、融合物に含まれる個々のＴＢ抗原をコードするプラスミドの混合物（ｐＴＧ１８３０７（ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ）＋ｐＴＧ１８３１０（Ａｇ８５Ｂ）＋ｐＴＧ１８３１５（ＴＢ１０．４）＋ｐＴＧ１８３０８（ＥＳＡＴ６））および陰性対照としてのエンプティｐＧＷｉｚでもマウスを免疫した。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、材料および方法に記載の種々のペプチドプールによるｅｘ ｖｉｖｏ再刺激の後に、ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。

【0330】

図６に示されるように、ｐＴＧ１８２６８プラスミド（係留型のＲｐｆＢ−ＤＨｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６融合物を発現する）による免疫は、対応するペプチドプールによるｅｘ ｖｉｖｏ再刺激後に高レベルのＩＦＮγ産生細胞が検出されることを特徴とする、ＲｐｆＢ−ＤＨｙｂ、Ａｇ８５ＢおよびＴＢ１０．４抗原に特異的な強い応答をもたらしたが、ＥＳＡＴ−６に対するＩＦＮγ産生細胞は少数の動物で低いレベルで誘導されたに過ぎなかった（図６ａ）。ｐＴＧ１８２９７（細胞質型のＲｐｆＢ−ＤＨｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６融合物を発現する）で免疫されたマウスでも、ＲｐｆＢ−ＤＨｙｂ、Ａｇ８５ＢおよびＴＢ１０．４抗原に対するＩＦＮγ産生細胞の活性化が検出されたが、係留型融合物により誘導されたものに比べて低いレベルであり、一方、ＥＳＡＴ−６に対しては極めて弱い応答が検出されたに過ぎなかった（図６ｂ）。ＥＳＡＴ−６を除き、図６ｃに示されるように、個々のプラスミドから独立に発現される場合（ｐＴＧ１８３０７＋ｐＴＧ１８３１０＋ｐＴＧ１８３１５＋ｐＴＧ１８３０８の混合物）ではなく、融合タンパク質（ｐＴＧ１８２６８およびｐＴＧ１８２９７ 図６ａおよび６ｂ）として発現される場合に、ＲｐｆＢ−ＤＨｙｂ、Ａｇ８５ＢおよびＴＢ１０．４に対して最も強い抗Ｍｔｂ応答が得られた。予想されたように、エンプティプラスミドによる免疫は特異的免疫応答を生じなかった（図６ｄ）。

【0331】

５．３． 再燃期のＭｔｂ抗原に基づく融合物による誘導される免疫原性の評価
細胞膜係留型（ＳＳ／ＴＭ：ｐＴＧ１８２６７）または細胞質型（ｐＴＧ１８３０７）のいずれかで融合物「ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ」を発現するプラスミドを用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内経路から３週間隔で３回の免疫を行った。エンプティｐＧＷｉｚを陰性対照として用いた。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、材料および方法に記載の４つのペプチドプールによるｅｘ ｖｉｖｏ再刺激の後に、ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。

【0332】

図７に示されるように、ｐＴＧ１８２６７（ＳＳ／ＴＭペプチドを有する係留型のＲｐｆＢ−ＤＨｙｂ融合物を発現する）を接種したマウスにおいて高レベルのＩＦＮγ産生細胞が見られ、このことは、これらのマウスが強い特異的細胞応答を惹起したことを示す（図７ａ）。ｐＴＧ１８３０７（細胞質型のＲｐｆＢ−ＤＨｙｂ融合物を発現する）による免疫もＩＦＮγ産生細胞の活性化をもたらしたが、やや程度が低かった（図７ｂ）。さらに、この応答は、ｐＴＧ１８２６７で処置した動物群内の方が、ｐＴＧ１８３０７で処置した群内よりも均質であると思われた。予想されたように、エンプティプラスミドによる免疫は特異的免疫応答を生じなかった（図７ｃ）。

【0333】

５．４． 潜伏期のＭｔｂ抗原に基づく融合物により誘導される免疫原性の評価
細胞膜係留型（ｐＴＧ１８２６９）または細胞質型（ｐＴＧ１８２９５）のいずれかで融合物「Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７」を発現するプラスミドを用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内経路から３週間隔で３回の免疫を行った。比較のため、融合物に含まれる個々のＭｔｂ抗原をコードするプラスミドの混合物（ｐＴＧ１８３００（Ｒｖ３４０７）＋ｐＴＧ１８３０１（Ｒｖ０５６９）＋ｐＴＧ１８３０２（Ｒｖ１８０７）＋ｐＴＧ１８３０３（Ｒｖ１８１３）＋ｐＴＧ１８３０４（Ｒｖ３４７８））および陰性対照としてのエンプティｐＧＷｉｚでもマウスを免疫した。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、材料および方法に記載の種々のペプチドプールによるｅｘ ｖｉｖｏ再刺激の後に、ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。

【0334】

図８に示されるように、ｐＴＧ１８２６９プラスミド（係留型のＲｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７融合物を発現する）による免疫は、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８抗原に特異的な強い応答をもたらし、Ｒｖ１８０７に対しては程度は低かった（図８ａ）。ｐＴＧ１８２９５（細胞質型のＲｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７融合物を発現する）で免疫したマウスでは、これら３つの抗原に対して同等レベルのＩＦＮγ産生細胞が得られた（図８ｂ）。プラスミド混合物を注射したマウスでも応答は同桁内であった（図８ｃ）。他方、どの場合でも、Ｒｖ１８１３およびＲｖ０５６９に対して有意な応答は検出できなかった（図８ａ、ｂおよびｃ）。予想されたように、エンプティプラスミドによる免疫は特異的免疫応答を生じなかった（図８ｄ）。

【0335】

異なるＭＨＣハプロタイプをカバーするため、抗Ｍｔｂ抗原応答の検討に他の系統のマウスも使用した：ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｈ−２^ｄ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＨ−２^ｂ、ＣＢＡ／ＪおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスはＨ−２^ｋである。

【0336】

潜伏期「Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ０１１１」からの抗原を発現するｐＴＧ１８３２３または陰性対照としてのエンプティｐＧＷｉｚを用い、マウスに筋肉内経路から２週間隔で３回の免疫を行った。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、材料および方法の節に記載の種々のペプチドプールによるｅｘ ｖｉｖｏ再刺激の後に、ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。図１０に示されるように、ｐＴＧ１８３２３プラスミドによるＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの免疫は、Ｒｖ２０２９抗原（ペプチド番号１の陽性プール）、Ｒｖ２６２６抗原（陽性プール番号２）およびＲｖ１７３３抗原（陽性プール番号２）に特異的な強い免疫応答を生じた（図１０ａ）。ｐＧＷｉｚでの免疫およびＲｖ０１１１ペプチドプールでのｅｘ ｖｉｖｏ再刺激の後に非特異的バックグラウンド応答が検出された（図１０ｂ）ことから、ｐＴＧ１８３２３接種後の抗Ｒｖ０１１１特異的応答の検出が複雑化する。

【0337】

Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６およびＲｖ１７３３抗原に特異的な免疫応答も、ｐＴＧ１８３２３で免疫されたＨ−２^ｋ ＣＢＡ／Ｊマウスで見られたものと同等のレベルで検出された。対照的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、Ｒｖ２６２６ペプチドで再刺激した後にのみＩＦＮγ産生細胞が特異的に検出され、一方、Ｃ５７ＢＬ／６マウスではシグナルは検出されなかった。

【0338】

全体的に見れば、これらの結果は、供試したＭｔｂ抗原融合物配列がマウスの異なるハプロタイプにおいてロバストな細胞性免疫応答を誘導できることを強調する。

【0339】

５．５． 生化学的規則に基づく融合物により誘導される免疫原性の評価
Ｍｔｂ抗原の生化学的特性に従って設計された融合物番号６、８または１４をコードするプラスミド、すなわち、ｐＴＧ１８２７０（Ａｇ８５Ｂ−Ｒｖ２６２６−ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ−Ｒｖ１７３３）、ｐＴＧ１８２７２（Ａｇ８５Ｂ−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３）およびｐＴＧ１８３２４（Ｒｖ２０２９−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ−６−Ｒｖ０１１１）を用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内経路から２週間隔で３回の免疫を行った。比較のため、陰性対照としてのエンプティｐＧＷｉｚでもマウスを免疫した。細胞性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後、材料および方法の節に記載の種々のペプチドプールによるｅｘ ｖｉｖｏ再刺激の後に、ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮγアッセイによって評価した。

【0340】

ｐＴＧ１８２７０で免疫したＢＡＬＢ／ｃとＣ５７ＢＬ／６マウスの両方でＡｇ８５Ｂ抗原およびＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ抗原に特異的な強い細胞応答が誘導され、一方、ＢＡＬＢ／ｃマウスのみでＲｖ２６２６に特異的な高レベルのＩＦＮγ産生細胞が検出された。ｐＴＧ１８２７２による免疫は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてはＡｇ８５Ｂに特異的な、また、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてはＡｇ８５Ｂ抗原およびＲｖ２６２６抗原に特異的なＩＦＮγ産生細胞の活性化をもたらしたが、ｐＴＧ１８２７０により誘導される応答に比べてレベルは低かった。ｐＴＧ１８３２４で免疫したマウスでは、ＴＢ１０．４抗原およびＥＳＡＴ−６抗原に特異的な高レベルのＩＦＮγ産生細胞が検出され、一方、Ｒｖ２０２９およびＲｖ０１１１に特異的なＩＦＮγ産生細胞も誘導されたが、レベルは低かった。予想されたように、エンプティプラスミドによる免疫は特異的免疫応答を誘導しなかった。

【0341】

全体的に見れば、融合物の安定性および生産を高めるために生化学的に基づく合理性に従って設計された供試融合物は、種々の感染期からのＭｔｂ抗原に特異的な良好な免疫原性応答を示す。

【0342】

５．６． Ｍｔｂ抗原融合物により誘導される抗Ｒｖ１７３３体液性応答の評価
融合物「Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３^＊」（ｐＴＧ１８２７０）および融合物「Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊−Ｒｖ１７３３^＊（ｐＴＧ１８２７２）を発現するプラスミドを用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内経路から３週間隔で３回の免疫を行った。比較のため、融合物に含まれる個々のＭｔｂ抗原をコードするプラスミドの混合物（ｐＴＧ１８３１０（Ａｇ８５Ｂ^＊）＋ｐＴＧ１８３０５（Ｒｖ２６２６）＋ｐＴＧ１８３０９（Ｒｖ１７３３^＊））および陰性対照としてのエンプティｐＧＷＩＺでもマウスを免疫した。体液性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後に評価した。免疫マウスの血清をプールし、ウエスタンブロットにより解析した。より具体的には、１００ｎｇ／レーンの組換えタンパク質Ｒｖ１７３３（大腸菌で生産、実施例８参照）をアクリルアミドゲルにロードし、１／２００希釈の血清で免疫検出を行った。結果として、ｐＴＧ１８２７０、ｐＴＧ１８２７２および個々のＭｔｂ抗原をコードするプラスミドの混合物で免疫したマウスの血清を用いて、Ｒｖ１７３３タンパク質に対する特異的検出が見られた。

【0343】

５．７． Ｍｔｂ抗原融合物により誘導される抗Ｒｖ１８１３体液性応答の評価
細胞膜係留型（ＳＳ／ＴＭ：ｐＴＧ１８２６９）または細胞質型（ｐＴＧ１８２９５）のいずれかで融合物「Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７」を発現するプラスミドを用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内経路から３週間隔で３回の免疫を行った。比較のため、融合物に含まれる個々のＭｔｂ抗原をコードするプラスミドの混合物（ｐＴＧ１８３００（Ｒｖ３４０７）＋ｐＴＧ１８３０１（Ｒｖ０５６９）＋ｐＴＧ１８３０２（Ｒｖ１８０７）＋ｐＴＧ１８３０３（Ｒｖ１８１３）＋ｐＴＧ１８３０４（Ｒｖ３４７８））および陰性対照としてのエンプティｐＧＷｉｚでもマウスを免疫した。体液性免疫応答は、最後のＤＮＡ注射から２週間後に評価した。免疫マウスの血清をプールし、１００ｎｇ／レーンの組換えタンパク質Ｒｖ１８１３（大腸菌で生産、実施例８参照）をアクリルアミドゲルにロードし、ウエスタンブロットにより解析した。免疫検出は１／２００希釈の血清を用いて行った。結果として、Ｒｖ１８１３タンパク質は、ｐＴＧ１８２６９（細胞膜係留型の融合物をコードする）で免疫したマウスの血清を用いて特異的に検出された。

【0344】

実施例６： Ｍｔｂ抗原を発現する組換えＭＶＡの作出遺伝子
１または最大３のＭｔｂ融合物の発現のために合計１０種のＭＶＡワクチン候補を作出し、種々のＭｔｂ抗原の発現を、感染したＡ５４９細胞から得られた細胞溶解液から、ウエスタンブロットにより解析した。

【0345】

６．１ ＴＢ疾患の相による組換えＭＶＡの作出
ＴＢ疾患の種々の相に代表的なＭｔｂ融合物の発現用の１、２または３つのカセットを含むように７種の組換えＭＶＡ候補を作出した。融合物番号４および融合物番号１１は両方とも、細胞膜で係留型（Ｎ末端シグナルおよびＣ末端膜係留ペプチドを備えた融合物番号４）として発現されるかまたは細胞質で発現される（融合物番号４の細胞質型に相当する融合物番号１１）活性期抗原および再燃期抗原（ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊−Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６）を含む。融合物番号１３は潜伏期抗原（Ｒｖ２０２９^＊−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３^＊−Ｒｖ０１１１^＊）を含む。融合物番号５および融合物番号９は両方とも、異なる細胞の場で、すなわち、細胞膜に係留されて（融合物番号５はＮ末端シグナルおよびＣ末端膜係留ペプチドを含む）または細胞質で（融合物番号９）発現される付加的潜伏期抗原（Ｒｖ０５６−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７）を含む。

【0346】

総て併せると、７つのＭＶＡ候補は次の通りである：
・ＭＶＡＴＧ１８３５５は、融合物番号１３をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に含む。
・ＭＶＡＴＧ１８３６４は、融合物番号１３をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、および融合物番号４をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に含む。
・ＭＶＡＴＧ１８３６５は、融合物番号１３をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、および融合物番号１１をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に含む。
・ＭＶＡＴＧ１８３７６は、融合物番号１３をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、融合物番号４をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に、および融合物番号５をＢ２Ｒプロモーターの制御下に含む。
・ＭＶＡＴＧ１８３７７は、融合物番号１３をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、融合物番号１１をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に、および融合物番号５をＢ２Ｒプロモーターの制御下に含む。
・ＭＶＡＴＧ１８３７８は、融合物番号１３をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、融合物番号４をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に、および融合物番号９をＢ２Ｒプロモーターの制御下に含む。
・ＭＶＡＴＧ１８３７９は、融合物番号１３をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、融合物番号１１をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に、および融合物番号９をＢ２Ｒプロモーターの制御下に含む。

【0347】

６．２ 生化学的合理性における組換えＭＶＡの作出
生化学的合理性に対して設計されたＭｔｂ融合物の発現用の２つまたは３つのカセットを含むように３つの組換えＭＶＡ候補を作出した。融合物番号６は、下記の抗原：Ａｇ８５Ｂ^＊−Ｒｖ２６２６−ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊−Ｒｖ１７３３^＊を含み、一方、融合物番号１４は、Ｒｖ２０２９^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ０１１１^＊を含む。両融合物ともＮ末端シグナルペプチドが付加されたが、これらの融合物がＲｖ０１１１またはＲｖ１７３３で終わり、すでに膜係留ペプチドを含んでいるためにＴＭドメインは付加されなかった。

【0348】

・ＭＶＡＴＧ１８４０４は、融合物番号１４をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、および融合物番号６をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に含む。
・ＭＶＡＴＧ１８４１７は、融合物番号１４をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、融合物番号６をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に、および融合物番号５をＢ２Ｒプロモーターの制御下に含む。
・ＭＶＡＴＧ１８４１８は、融合物番号１４をｐ７．５Ｋプロモーターの制御下に、融合物番号６をｐＨ５Ｒプロモーターの制御下に、および融合物番号９をＢ２Ｒプロモーターの制御下に含む。

【0349】

６．３ ＭＶＡにより発現されたＭｔｂ抗原および融合物のウエスタンブロット解析
Ａ５４９細胞に上記の種々のＭＶＡ候補を感染させ（ＭＯＩ１）、発現産物を、材料および方法に記載の条件下でウエスタンブロットにより解析した。免疫検出は、本明細書に記載の種々のＭｔｂ抗原に特異的な抗体を用いて行った。具体的には、Ｒｖ１７３３^＊、Ｒｖ２０２９^＊、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ０１１１^＊、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊、Ｒｖ１８１３^＊、Ｒｖ３４０７、およびＲｖ３４７８の検出にはウサギの免疫後に得られた血清（材料および方法参照）を用い、ＥＳＡＴ６、Ａｇ８５Ｂ^＊、ＴＢ１０．４およびＲｖ２６２６の検出には市販の抗体を用いた。

【0350】

結果として、供試された組換えＭＶＡによらず、総ての融合物で予測されたサイズに相当するバンドが強く示された。より具体的には、ＭＶＡＴＧ１８３５５、ＭＶＡＴＧ１８３６４、ＭＶＡＴＧ１８３６５、ＭＶＡＴＧ１８３７６、ＭＶＡＴＧ１８３７７、ＭＶＡＴＧ１８３７８およびＭＶＡＴＧ１８３７９を感染させた細胞に起源する細胞溶解液において抗Ｒｖ２６２６および抗Ｒｖ０１１１免疫検出後に、およそ９８．４ｋＤａ（融合物番号１３の予測サイズ）のバンドが検出された。融合物番号４を含有するＭＶＡＴＧ１８３６４、ＭＶＡＴＧ１８３７６およびＭＶＡＴＧ１８３７８、ならびに融合物番号１１を含有するＭＶＡＴＧ１８３６５、ＭＶＡＴＧ１８３７７およびＭＶＡＴＧ１８３７９をそれぞれ感染させた細胞に起源する細胞溶解液において抗ＥＳＡＴ６免疫検出後に、およそ９６．７ｋＤａ（融合物番号４の予測サイズ）のバンドとおよそ８７ｋＤａ（融合物番号１１の予測サイズ）のバンドが検出された。さらに、融合物番号５を含有するＭＶＡＴＧ１８３７６およびＭＶＡＴＧ１８３７７、ならびに融合物番号９を含有するＭＶＡＴＧ１８３７８およびＭＶＡＴＧ１８３７９をそれぞれ感染させた細胞に起源する細胞溶解液において抗Ｒｖ３４０７免疫検出後に、およそ１１９．７ｋＤａ（融合物番号５の予測サイズ）のバンドとおよそ１０９．９ｋＤａ（融合物番号９の予測サイズ）のバンドが検出された。最後に、それぞれ抗Ｒｖ２６２６および抗Ｒｖ０１１１免疫検出後に、ＭＶＡＴＧ１８４０４を感染させた細胞に起源する細胞溶解液において、およそ１００．４ｋＤａ（融合物番号６の予測サイズ）のバンドとおよそ８７．５ｋＤａ（融合物番号１４の予測サイズ）のバンドが検出された。

【0351】

さらに、いくつかの場合では、付加的融合物産物も見られた。特に、融合物番号１３および融合物番号６では、おそらくは還元条件に耐性のある二量体を形成するＲｖ２６２６の能力の結果として二量体が検出された。融合物番号１３に関しては、全長融合物番号１３（予測サイズ９８．４ｋＤａ）の発現が実際に検出されたが、低レベルであった。抗Ｒｖ２６２６（７０ｋＤａ前後）および抗Ｒｖ０１１１（３０ｋＤａ前後）を用いた場合には主要なタンパク質分解産物が見られ、融合物番号１３のタンパク質分解切断が示唆される。

【0352】

同じ抗原（ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ^＊−Ａｇ８５Ｂ^＊−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６）を含むが、膜係留型（融合物番号４）または細胞質型（融合物番号１１）のいずれかである融合物番号４と番号１１は、同等レベルの発現が検出された。融合物番号４では予測サイズよりも大きなバンド（９６．７ｋＤａではなく１１５ｋＤａ）が見られ、おそらくＮ−グリコシル化産物に相当する。両融合物で、少量のタンパク質分解産物も検出された。

【0353】

融合物番号５および番号９（両方ともＲｖ０５６９−Ｒｖ１８１３^＊−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７抗原の融合物に相当するが、膜係留型（融合物番号５）または細胞質型（融合物番号９）で発現される）を発現するＭＶＡの細胞溶解液において、抗Ｒｖ３４０７を用いた場合に同等レベルの発現が明らかになった。融合物番号５を発現する細胞溶解液には予測サイズよりも大きなバンド（９８．４ｋＤａではなく１２０ｋＤａ）が存在し、おそらくＮ−グリコシル化産物に相当する。他方、融合物番号５は抗Ｒｖ１８０７抗体では極めて弱く検出されたが、細胞質型の場合にはそうではない。Ｒｖ１８０７特異的エピトープは隣接するＴＭＲ配列のために膜係留型融合物においては接近できない可能性があると推測される。

【0354】

実施例７： Ｍｔｂ抗原を発現するＭＶＡ候補ワクチンの免疫原性の評価
７．１ ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭｔｂ抗原を発現するＭＶＡ候補ワクチンの免疫原性の評価
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、両方とも「Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ０１１１」（融合物番号１３に相当）ならびに「ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６」（融合物番号４または番号１１に相当）を発現するＭＶＡＴＧ１８３６５およびＭＶＡＴＧ１８３６４で免疫した。融合物番号１３では、ＳＳドメインがＮ末端に存在し、Ｒｖ１７３３およびＲｖ０１１１は、融合物の発現を細胞表面に向けるはずであるＴＭドメインを伴って発現される。ＭＶＡＴＧ１８３６４により発現される融合物番号４はＳＳドメインとＴＭドメインの両方を含むが、融合物番号１１（ＭＶＡＴＧ１８３６５）は含まず、理論的には細胞質(bcytoplasmic)発現を保持しているはずである。特異的細胞性免疫応答は、注射から１週間後、本明細書に記載のペプチドプールで再刺激した後にＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより評価した。マウスはまた、陰性対照としてのエンプティＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧＮ３３．１）でも免疫した。

【0355】

それぞれ図１１ａおよびｂに示されるように、ＭＶＡＴＧ１８３６５およびＭＶＡＴＧ１８３６４の両ベクターは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＭＶＡＴＧＮ３３．１ベクターと比べた場合に、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ０１１１、ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ、Ａｇ８５ＢおよびＴＢ１０．４に特異的なＩＦＮγ陽性応答を誘導した。これらの応答は、同等の応答を示すＲｖ２６２６を除き、ＭＶＡＴＧ１８３６５（細胞質の融合物）に比べてＭＶＡＴＧ１８３６４（係留型融合物）を用いた場合に一貫して強かった。Ｒｖ２０２９、Ｒｖ１７３３およびＥＳＡＴ６に特異的なより弱い散発的応答が検出された。

【0356】

さらに、「実施例６」の節に記載の総ての組換えＭＶＡ候補ワクチンをＢＡＬＢ／ｃマウスに注射し、総てのＭｔｂ抗原に特異的な細胞性免疫応答を、材料および方法の節に記載のＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて各ＭＶＡ候補により誘導された応答の範囲と強度の概要を図１２に示す。ＴＢ疾患の相または生化学的合理性に従って設計されたＭｔｂ抗原融合物を含む総てのＭＶＡワクチンが、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて１４のうち１２の抗原に特異的なＩＦＮγ応答を誘導できた。２つの潜伏期抗原Ｒｖ１７３３およびＲｖ０５６９に特異的な陽性細胞応答は検出されなかった。

【0357】

７．２ トランスジェニックＨＬＡ−Ａ２マウスにおけるＭｔｂ抗原を発現するＭＶＡ候補ワクチンの免疫原性の評価
本発明者らがＤＮＡに基づく研究で観察したところでは、マウスハプロタイプが選択されたＭｔｂ抗原の免疫原性に影響を及ぼす（第５節参照）。ＭＶＡ候補により誘導されるＲｖ１７３３およびＲｖ０５６９抗原の免疫原性をさらに分析するために、ヒトＭＨＣクラスＩ分子、ＨＬＡ−Ａ２を発現するトランスジェニックマウスに、両抗原を発現する組換えＭＶＡを注射した。細胞性免疫応答は、注射から１週間後、本明細書に記載のペプチドプールによる再刺激の後にＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより評価した。マウスはまた、陰性対照としてのエンプティＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧＮ３３．１）でも免疫した。具体的には、ＨＬＡ−Ａ２マウスを、「Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ０１１１」（融合物番号１３に相当）、「ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６」（融合物番号４に相当）ならびに「Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７」（融合物番号５または番号９に相当）を発現するＭＶＡＴＧ１８３７６ワクチンまたはＭＶＡＴＧ１８３７８ワクチンで免疫した。ＭＶＡＴＧ１８３７６により発現された融合物番号５では、ＳＳドメインおよびＴＭドメインがそれぞれＮ末端部分およびＣ末端部分で発現された。図１３は、ＭＶＡＴＧ１８３７６ワクチンで免疫したＨＬＡ−Ａ２マウスにおいて誘導されたＩＦＮγ応答を示す。１４のうち７つの抗原に特異的な免疫応答が検出された（図１３ａ）。脾細胞がＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ抗原およびＡｇ８５Ｂ抗原に特異的なペプチドで再刺激された場合に高レベルのＩＦＮγ産生細胞が検出された（それぞれ１３９７スポット／１０^６細胞および１１６０スポット／１０^６細胞）。対照的に、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７およびＥＳＡＴ６に特異的な低レベルの細胞応答がＭＶＡＴＧ１８３７６ワクチンによって誘導された。さらに、細胞をＲｖ０５６９特異的ペプチドで再刺激した場合に、ＭＶＡＴＧＮ３３．１エンプティワクチンで検出されたシグナル（３６スポット／１０^６細胞、図１３ｂ）に比べて、低い（１×カットオフ＜中央値＜２×カットオフ、１８６スポット／１０^６細胞、図１３ａ）が有意なレベルのＩＦＮγ産生細胞が検出された。ＭＶＡＴＧ１８３７８候補を接種したＨＬＡ−Ａ２マウスでも同等の結果が導かれ、Ｒｖ０１１１抗原およびＴＢ１０．４抗原に特異的な付加的な弱い応答を誘導した。ＭＶＡＴＧ１８３７６およびＭＶＡＴＧ１８３７８の両ワクチンにより誘導されたＩＦＮγ応答を図１５にまとめる。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスでは、注射されたＭＶＡ候補によらず、Ｒｖ１７３３、Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６およびＲｖ３４７８に特異的な、検出可能な応答は見られなかった。

【0358】

７．３ Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＭｔｂ抗原を発現するＭＶＡ候補ワクチンの免疫原性の評価
Ｒｖ０５６９抗原およびＲｖ１７３３抗原の免疫原性を証明するために、Ｈ−２^ｂハプロタイプＣ５７ＢＬ／６マウスを、「Ｒｖ２０２９−Ｒｖ２６２６−Ｒｖ１７３３−Ｒｖ０１１１」（融合物番号１３に相当）、「ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ−Ａｇ８５Ｂ−ＴＢ１０．４−ＥＳＡＴ６」（融合物番号１１に相当）ならびに「Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７」（融合物番号５または番号９に相当）を発現するＭＶＡＴＧ１８３７７ワクチンまたはＭＶＡＴＧ１８３７９ワクチンで免疫した。細胞性免疫応答は、注射から１週間後、本明細書に記載のペプチドプールによる再刺激の後に、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより評価した。マウスはまた、陰性対照としてのエンプティＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧＮ３３．１）でも免疫した。細胞ＩＦＮγ応答を図１５にまとめる。両ＭＶＡワクチンともＲｖ１８０７、ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ、Ｒｖ３４７８、Ａｇ８５ＢおよびＥＳＡＴ６抗原に特異的な強い免疫応答を惹起することができた（９２〜８６１スポット／１０^６細胞の範囲）が、ＴＢ１０．４抗原およびＲｖ０５６９抗原に特異的な陽性ＩＦＮγ応答は、ＭＶＡＴＧ１８３７９候補で免疫したマウスでのみ検出された（それぞれ７８および５８スポット／１０^６細胞）。免疫Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、Ｒｖ１７３３、Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ１８１３およびＲｖ３４０７に特異的な陽性応答は検出されなかった。

【0359】

７．４ Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおけるＭｔｂ抗原を発現するＭＶＡ候補ワクチンの免疫原性の評価
プラスミドを接種したＨ−２^ｋハプロタイプＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいてＲｖ１７３３に特異的な免疫原性が証明されたので（第５．４節参照）、Ｒｖ１７３３タンパク質を含有する融合物を発現するＭＶＡＴＧ１８３７６、ＭＶＡＴＧ１８３７８、ＭＶＡＴＧ１８３７７およびＭＶＡＴＧ１８３７９をこのマウス系統に注射した。細胞性免疫応答は、注射から１週間後、本明細書に記載のペプチドプールによる再刺激の後に、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより評価した。マウスはまた、陰性対照としてのエンプティＭＶＡＴＧＮ３３．１ベクターでも免疫した。図１４に示されるように、ＭＶＡＴＧ１８３７７ワクチンは、ＭＶＡＴＧＮ３３．１に比べてＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいてＩＦＮγ応答を誘導した。Ｒｖ２０２９およびＲｖ２６２６ペプチドで脾細胞を再刺激した際に、高レベルのＩＦＮγ産生細胞が検出された（それぞれ６６０および３５３スポット／１０^６細胞）。ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８抗原に特異的な、７８〜２５０スポット／１０^６細胞の範囲の低い細胞性免疫応答もまた、免疫Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいて誘導された。ＤＮＡ接種Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいて示されたように、このマウス系統では、エンプティＭＶＡＴＧＮ３３．１ワクチンを注射したマウスから生じるシグナル（９スポット／１０^６細胞、図１４ｂ）に比べて、Ｒｖ１７３３特異的ＩＦＮγ応答（１８３スポット／１０^６細胞）が惹起された。ＭＶＡＴＧＮ３３．１による免疫およびＲｖ０１１１、Ａｇ８５ＢおよびＲｖ１８０７ペプチドプールによるｅｘ ｖｉｖｏ再刺激の後に非特異的バックグラウンド応答が検出されたが（図１４ｂ）、これはＭＶＡＴＧ１８３７７接種後のこれらの抗原に特異的な応答の検出を困難にする。

【0360】

Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいて、ＭＶＡＴＧ１８３７７に加え、ＭＶＡＴＧ１８３７６、ＭＶＡＴＧ１８３７８およびＭＶＡＴＧ１８３７９により誘導された免疫応答を図１５に示す。４つの供試ＭＶＡ候補のうち、ＭＶＡＴＧ１８３７７が最も免疫原性が高かった（１４のうち７つの抗原）。ＭＶＡＴＧ１８３７６およびＭＶＡＴＧ１８３７８は、１４抗原のうち２つのみ（Ｒｖ２０２９およびＲｖ２６２６）に特異的な細胞性免疫応答を誘導し、一方、ＭＶＡＴＧ１８３７９は、両抗原だけでなくＲｖ１７３３に対しても応答を惹起することができた。ＭＶＡＴＧ１８３７７およびＭＶＡＴＧ１８３７９は、融合物「Ｒｖ０５６９−Ｒｖ１８１３−Ｒｖ３４０７−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８０７」を除き、同じ融合タンパク質を発現する。ＭＶＡＴＧ１８３７７では、ＳＳドメインおよびＴＭドメインは融合物番号５のそれぞれＮ末端部分およびＣ末端部分で発現され、ＭＶＡＴＧ１８３７９には両ドメインとも存在しない。この融合物に存在する５つの抗原のうち３つはＭＶＡＴＧ１８３７７においては免疫原性であったが、ＭＶＡＴＧ１８３７９で免疫原性であったものは無かった。これらの結果は、融合タンパク質を細胞膜へ向けることがそれらの免疫原性を高めることを示す。

【0361】

全体的に見れば、ＭＶＡベクターならびにＤＮＡプラスミドのよる免疫が、本出願に記載される融合物に含まれる総てのＭｔｂ抗原をターゲティングする強力かつ特異的な細胞応答の誘導をもたらす。供試した２つの抗原に特異的な体液性免疫応答はＤＮＡ免疫マウスにおいても検出された。ＤＮＡプラスミドの場合、ＭＶＡにより発現されるＭｔｂ融合物の膜係留が特異的免疫応答の誘導レベルをある程度高める。

【0362】

実施例８： Ｍｔｂ抗原の生産および精製
８．１ 選択されたＭｔｂ抗原のバイオマス生産のための最適条件
４つの大腸菌株を個々のＭｔｂ抗原の発現ならびに種々の培養条件（例えば、温度）に関して試験した。

【0363】

これらのアッセイは、選択された１４の抗原の総てが少なくとも１つの細菌株、１つの定義温度で発現可能であったが、Ｍｔｂ抗原ごとに有意差が見られたことを強く示す。実際に、種々の大腸菌株で、どの培養条件でも容易に生産できるＭｔｂ抗原もあれば（例えば、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ２０２９、Ｒｖ２６２６、ＲｐｆＢ−Ｄ融合物）、極めて特異的な宿主細胞および条件を必要とする抗原もある（例えば、Ｒｖ１７３３、Ｒｖ１８１３、ＴＢ１０−４）。他方、検出可能であるが低いレベルで発現されたＲｖ３４０７、Ａｇ８５ＢおよびＲｖ１８１３を除き、ほとんどのＭｔｂ抗原に関して種々の大腸菌株で高い発現レベルを得ることができた。さらに、特定のＭｔｂ抗原は可溶性材料として生産されるが（例えば、細胞溶解液上清から直接回収することができるＲｖ２６２６、Ｒｖ３４０７およびＡｇ８５Ｂ）、他のものは不溶性材料中にある（例えば、細胞溶解後にペレットから回収されるＲＰＦＢ−Ｄ、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ１７３３、Ｒｖ２０２９、Ｒｖ３４７８、Ｒｖ１８０７、ＥＳＡＴ６およびＴＢ１０．４）。興味深いことに、Ｒｖ０５６９は、１８℃で培養された形質転換Ｂｌ２１細胞から生産された場合には可溶性であり、Ｂｌ２１細胞が３７℃で培養される場合には、可溶性材料と不溶性材料の両方（溶解後の上清およびペレット中）にある。

【0364】

８．２ Ｍｔｂ抗原の精製
材料および方法に記載されるように、Ｍｔｂ抗原はニッケルカラム、その後最終的にはゲル濾過カラムでのＩＭＡＣクロマトグラフィーにより精製した。

【0365】

Ｒｖ２６２６（３７℃にてＣ４１（ＤＥ３）細胞で生産された可溶性材料から精製）、ＲＰＦＢ−Ｄ融合物（３７℃にてＢｌ２１（ＤＥ３）で生産された封入体を可溶化したものから精製された変性ＲｐｆＢ−Ｄ）およびＴＢ１０．４（３７℃にてＣ４１（ＤＥ３）細胞で生産された可溶性材料および不溶性材料から精製）に関して、代表的な精製アッセイを示す。溶出画分を、それぞれ図９ａ、ｂおよびｃに示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてアッセイした。

【0366】

図９Ａに示されるように、Ｒｖ２６２６精製プールは目に見える夾雑物を示さなかった。主要バンドが予想されたＲｖ２６２６分子量の位置に見られるとともに、マイナーバンド（いわゆる、バンドＢ）も見られ、これはＭＳによりＲｖ２６２６と同定された。Ｒｖ２６２６は、変性および還元に部分的に耐性のある二量体を形成することが知られている。従って、マイナーなバンドＢは二量体型のＲｖ２６２６に相当すると思われる。

【0367】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した際（レーン１〜８は中間体精製画分を表し、レーン９〜１１は５、１０および１５μＬの精製プールを表す）、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ精製プールは目に見える夾雑物を示さなかった（図９Ｂ参照）。

【0368】

ＴＢ１０−４は、変性条件とその後の最終工程では非変性条件で精製した。図９Ｃに示されるように、精製プールのゲル分析は、目に見える夾雑物を示さなかった（レーン２〜６は中間体精製画分を表し、レーン７〜９は１、３および６μＬの精製プールを表す）。

【0369】

これら３つの場合で、精製プールにおいて内毒素レベルを測定したところ、最大レベルが１０ＥＵ／ｍｇタンパク質であることが示された。

【0370】

従って、これら３つのタンパク質は、許容される量、純度および内毒素レベルで精製された。

【0371】

要約すると、本発明は、Ｍｔｂ抗原の最適な組合せを提供する。大規模な文献的、データマイニングスコアリング的、および生化学的ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析の後に１４のＭｔｂ抗原が選択され、これらを個々にまたは融合物の形態でプラスミドベクターにクローニングした。ウエスタンブロット法により証明されるように、総ての融合物が高レベルで発現され、Ｎ末端もしくはＣ末端に存在するタグに対する、または融合物に存在する各Ｍｔｂ抗原に対する一連の抗体による免疫検出の後に、適正な予測されたサイズで検出された。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける免疫アッセイは、Ｔ細胞応答を誘導するための、選択されたＭｔｂ抗原組合せおよび融合物の免疫原性能を裏付ける。

【0372】

さらに、選択されたＭｔｂ抗原（融合物中のＲｐｆＢおよびＲｐｆＤ）を、組換え手段により細菌で個々に生産した。大腸菌での発現条件を、細菌株および培養条件（例えば、増殖温度）などの基準を検討することによって最適化した。総てのタンパク質が首尾良く発現され、リットル規模で生産された。

【0373】

実施例９： マウスにおける結核菌感染に対するＭｔｂ抗原含有ワクチンの治療効力の評価
３つのＭｔｂ発現ＭＶＡ候補、ＭＶＡＴＧ１８３６４、ＭＶＡＴＧ１８３７６およびＭＶＡＴＧ１８３７７の治療効力を、Ｍｔｂ株Ｈ３７Ｒｖを事前に感染させたマウスにおいて、抗生物質併用投与の治療状況で検討した。陰性対照として、ＭＶＡＴＧＮ３３．１も１つの群に注射した。抗生物質処置の終了時（感染後１５週目）および６週後（感染後２１週目）に処置マウスから採取した脾臓において細菌量を評価した。マウス群、薬物投与計画および免疫スケジュールを表５に記載する。

【0374】

【表5】

【0375】

Ｍｔｂ感染後６週目、化学療法およびＭＶＡ免疫の開始前には、総てのマウス群の脾臓でマイコバクテリアが現れていた（総ｃｆｕ２．６４ ｌｏｇ_１０）。予想されたように、マイコバクテリア量は、化学療法の処置中に低下した。化学療法単独で処置した群２では、Ｍｔｂレベルは徐々に低下し、１５週目には総ｃｆｕが１．１８ ｌｏｇ_１０に、２１週目には総ｃｆｕが０．７０ ｌｏｇ_１０に達した。興味深いことに、１５週目では、マイコバクテリア量は、抗生物質単独（群２）および対照エンプティＭＶＡと抗生物質の組合せ（群６）で処置したマウスよりも、抗生物質とＭｔｂ抗原発現ＭＶＡで併用処置したマウスの方が低く（群３〜５では１５週目の総ＣＦＵは０．７０ ｌｏｇ_１０）、Ｍｔｂ発現ＭＶＡがより強力な抗菌効果に寄与したことを示唆する。処置の終了から６週間後（２１週目）では、マイコバクテリアは増殖しておらず、ＭＶＡ接種マウスにおける細菌量は抗生物質両方単独処置マウスで見られたものと同等のレベルに抑えられていた（総ｃｆｕが０．７０〜０．８５ ｌｏｇ_１０の範囲）。対照として、薬物療法と組み合わせたエンプティＭＶＡＴＧＮ３３．１ベクターは、１５週目および２１週目において抗生物質投与計画単独よりも良好な抗マイコバクテリア効果を誘導しなかった。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]