特許 6333882 抗体−薬剤コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6333882

(24)【登録日】2018年5月11日

(45)【発行日】2018年5月30日

(54)【発明の名称】抗体−薬剤コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20180521BHJP

   A61K 31/427 20060101ALI20180521BHJP

   A61K 31/40 20060101ALI20180521BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20180521BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20180521BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20180521BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20180521BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20180521BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20180521BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20180521BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 LZNA

   A61K31/427

   A61K31/40

   A61P35/00

   A61P11/00

   A61P15/00

   A61K47/65

   A61K47/54

   !C12N15/00 A

   !C07K16/30

【請求項の数】24

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2016-84139(P2016-84139)

(22)【出願日】2016年4月20日

(62)【分割の表示】特願2014-501747(P2014-501747)の分割

【原出願日】2012年3月19日

(65)【公開番号】特開2016-172747(P2016-172747A)

(43)【公開日】2016年9月29日

【審査請求日】2016年4月27日

(31)【優先権主張番号】61/470,576

(32)【優先日】2011年4月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/593,549

(32)【優先日】2012年2月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/602,349

(32)【優先日】2012年2月23日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】309040701

【氏名又は名称】ワイス・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(72)【発明者】

【氏名】ハンス ピーター ガーバー

(72)【発明者】

【氏名】ジョン フランシス ディジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】キラン マノハー カンドキ

(72)【発明者】

【氏名】キンバリー アン マーケット

(72)【発明者】

【氏名】プヤ サプラ

(72)【発明者】

【氏名】リオウドミラ ゲナディ−ヴナ チスティアコヴァ

【審査官】 参鍋 祐子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５２９５７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３３０１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２３４６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Clin Cancer Res, 2005, vol.11, p.843-852

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ３１／４０

Ａ６１Ｋ ３１／４２７

Ａ６１Ｋ ４７／５４

Ａ６１Ｋ ４７／６５

Ａ６１Ｐ １１／００

Ａ６１Ｐ １５／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １６／３０

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

肺癌を治療するための医薬組成物であって、
式：
Ａｂ−（ＬＵ−Ｄ）ｐ
の抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物
（式中、
（ａ）Ａｂは、
（ｉ）配列番号５で示されるＶＨ ＣＤＲ１領域、
（ｉｉ）配列番号６で示されるＶＨ ＣＤＲ２領域、
（ｉｉｉ）配列番号７で示されるＶＨ ＣＤＲ３領域、
（ｉｖ）配列番号８で示されるＶＬ ＣＤＲ１領域、
（ｖ）配列番号９で示されるＶＬ ＣＤＲ２領域、および
（ｖｉ）配列番号１０で示されるＶＬ ＣＤＲ３領域
を有する、抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分であり、
（ｂ）ＬＵは、リンカー単位であり、
（ｃ）ｐは、１から８の整数であり、
（ｄ）Ｄは、モノメチルアウリスタチンD（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される薬剤単位である）。

【請求項2】

卵巣癌を治療するための医薬組成物であって、
式：
Ａｂ−（ＬＵ−Ｄ）ｐ
の抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物
（式中、
（ａ）Ａｂは、
（ｉ）配列番号５で示されるＶＨ ＣＤＲ１領域、
（ｉｉ）配列番号６で示されるＶＨ ＣＤＲ２領域、
（ｉｉｉ）配列番号７で示されるＶＨ ＣＤＲ３領域、
（ｉｖ）配列番号８で示されるＶＬ ＣＤＲ１領域、
（ｖ）配列番号９で示されるＶＬ ＣＤＲ２領域、および
（ｖｉ）配列番号１０で示されるＶＬ ＣＤＲ３領域
を有する、抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分であり、
（ｂ）ＬＵは、リンカー単位であり、
（ｃ）ｐは、１から８の整数であり、
（ｄ）Ｄは、モノメチルアウリスタチンD（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される薬剤単位である）。

【請求項3】

患者における5T4陽性腫瘍細胞の増殖を抑制するための医薬組成物であって、
式：
Ａｂ−（ＬＵ−Ｄ）ｐ
の抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物
（式中、
（ａ）Ａｂは、
（ｉ）配列番号５で示されるＶＨ ＣＤＲ１領域、
（ｉｉ）配列番号６で示されるＶＨ ＣＤＲ２領域、
（ｉｉｉ）配列番号７で示されるＶＨ ＣＤＲ３領域、
（ｉｖ）配列番号８で示されるＶＬ ＣＤＲ１領域、
（ｖ）配列番号９で示されるＶＬ ＣＤＲ２領域、および
（ｖｉ）配列番号１０で示されるＶＬ ＣＤＲ３領域
を有する、抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分であり、
（ｂ）ＬＵは、リンカー単位であり、
（ｃ）ｐは、１から８の整数であり、
（ｄ）Ｄは、モノメチルアウリスタチンD（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される薬剤単位である）。

【請求項4】

前記抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分が、配列番号3を有するVH領域および配列番号4を有するVL領域からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分が、配列番号１を有する重鎖および配列番号２を有する軽鎖からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記LUが切断可能なリンカーである、請求項１から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

切断可能なリンカーがマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル （mc−Val−Cit−PABA）である、請求項6に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記LUが切断不可能なリンカーである、請求項１から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

切断不可能なリンカーがマレイミドカプロイルである、請求項8に記載の医薬組成物。

【請求項10】

LUがマレイミドカプロイルまたはmc−Val−Cit−PABAであり、DがMMAEである、請求項１から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

LUがマレイミドカプロイルまたはmc−Val−Cit−PABAであり、DがMMAFである、請求項１から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

LUがmc−Val−Cit−PABAであり、DがMMADである、請求項１から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

肺癌を治療するための医薬を製造するための、
式：
Ａｂ−（ＬＵ−Ｄ）ｐ
の抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用
（式中、
（ａ）Ａｂは、
（ｉ）配列番号５で示されるＶＨ ＣＤＲ１領域、
（ｉｉ）配列番号６で示されるＶＨ ＣＤＲ２領域、
（ｉｉｉ）配列番号７で示されるＶＨ ＣＤＲ３領域、
（ｉｖ）配列番号８で示されるＶＬ ＣＤＲ１領域、
（ｖ）配列番号９で示されるＶＬ ＣＤＲ２領域、および
（ｖｉ）配列番号１０で示されるＶＬ ＣＤＲ３領域
を有する、抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分であり、
（ｂ）ＬＵは、リンカー単位であり、
（ｃ）ｐは、１から８の整数であり、
（ｄ）Ｄは、モノメチルアウリスタチンD（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される薬剤単位である）。

【請求項14】

卵巣癌を治療するための医薬を製造するための、
式：
Ａｂ−（ＬＵ−Ｄ）ｐ
の抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用
（式中、
（ａ）Ａｂは、
（ｉ）配列番号５で示されるＶＨ ＣＤＲ１領域、
（ｉｉ）配列番号６で示されるＶＨ ＣＤＲ２領域、
（ｉｉｉ）配列番号７で示されるＶＨ ＣＤＲ３領域、
（ｉｖ）配列番号８で示されるＶＬ ＣＤＲ１領域、
（ｖ）配列番号９で示されるＶＬ ＣＤＲ２領域、および
（ｖｉ）配列番号１０で示されるＶＬ ＣＤＲ３領域
を有する、抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分であり、
（ｂ）ＬＵは、リンカー単位であり、
（ｃ）ｐは、１から８の整数であり、
（ｄ）Ｄは、モノメチルアウリスタチンD（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される薬剤単位である）。

【請求項15】

患者における5T4陽性腫瘍細胞の増殖を抑制するための医薬を製造するための、
式：
Ａｂ−（ＬＵ−Ｄ）ｐ
の抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用
（式中、
（ａ）Ａｂは、
（ｉ）配列番号５で示されるＶＨ ＣＤＲ１領域、
（ｉｉ）配列番号６で示されるＶＨ ＣＤＲ２領域、
（ｉｉｉ）配列番号７で示されるＶＨ ＣＤＲ３領域、
（ｉｖ）配列番号８で示されるＶＬ ＣＤＲ１領域、
（ｖ）配列番号９で示されるＶＬ ＣＤＲ２領域、および
（ｖｉ）配列番号１０で示されるＶＬ ＣＤＲ３領域
を有する、抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分であり、
（ｂ）ＬＵは、リンカー単位であり、
（ｃ）ｐは、１から８の整数であり、
（ｄ）Ｄは、モノメチルアウリスタチンD（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）からなる群から選択される薬剤単位である）。

【請求項16】

前記抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分が、配列番号3を有するVH領域および配列番号4を有するVL領域からなる、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の、抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用。

【請求項17】

前記抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分が、配列番号１を有する重鎖および配列番号２を有する軽鎖からなる、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の、抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用。

【請求項18】

LUが切断可能なリンカーである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の、抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用。

【請求項19】

切断可能なリンカーがマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル （mc−Val−Cit−PABA）である、請求項１８に記載の抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用。

【請求項20】

LUが切断不可能なリンカーである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の、抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用。

【請求項21】

切断不可能なリンカーがマレイミドカプロイルである、請求項２０に記載の、抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用。

【請求項22】

LUがマレイミドカプロイルまたはmc−Val−Cit−PABAであり、DがMMAEである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の、抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用。

【請求項23】

LUがマレイミドカプロイルまたはmc−Val−Cit−PABAであり、DがMMAFである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の、抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用。

【請求項24】

LUがmc−Val−Cit−PABAであり、DがMMADである、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の、抗体−薬剤コンジュゲートまたはその薬学的に許容できる塩の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、がんの治療のための抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートに関する。

【背景技術】

【0002】

抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）は、モノクローナル抗体の結合特異性と化学療法剤の効力とを併せ持つ。腫瘍関連標的分子に対するモノクローナル抗体の開発に伴う技術、さらに効果的な細胞傷害性作用物質の使用、およびこれらの成分を共有結合するための化学的リンカーの設計は、近年、迅速に進歩している（Ｄｕｃｒｙ Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１：５〜１３、２０１０）。

【0003】

ＳＧＮ−７５（ＵＳ２００９／１４８９４２）およびトラスツズマブ−ＤＭ１（ＵＳ２００９／０２２６４６５）などの有望なＡＤＣが、現在、臨床試験されている。しかし、他の腫瘍関連抗原が標的として考慮されているため、多くの課題が残されている。各モノクローナル抗体が個別に特徴付けされ、適当なリンカーが設計され、そして腫瘍細胞への送達の際にその効力を保持する適切な細胞傷害性作用物質が同定されなくてはならない。がん標的に対する抗原密度、および正常組織が標的抗原を発現するかどうかが考慮されなくてはならない。他の考慮事項には、ＡＤＣ全体が標的の結合の際に取り込まれるかどうか、考えられる正常組織の曝露ならびに／または治療されるがんのタイプおよびステージを考慮した場合に、細胞増殖抑制性薬剤または細胞傷害性薬剤が好ましいかどうか、そして抗体を薬剤ペイロードに接続するリンカーが、切断可能な連結であるかまたは切断不可能な連結であるかが含まれる。さらに、薬剤部分への抗体のコンジュゲーション比率は、抗体の結合活性および／または薬剤の効力を弱めることなく、十分であるべきである。ＡＤＣが複雑な生物製剤であることは明らかであり、効果的なＡＤＣを開発するための課題はいまだ多く残っている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ヒト５Ｔ４腫瘍関連抗原は、本発明の標的抗原である。５Ｔ４抗原が、腫瘍開始細胞（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ−ｃｅｌｌ）とも呼ばれるある特定の高度に腫瘍形成性の細胞で高いレベルで発現することが、最近示されている（ＷＯ２０１０／１１１６５９）。腫瘍開始細胞は、標準的な治療法に対する耐性を示し、腫瘍の再発および転移の原因であると考えられており、したがって、ＡＤＣの開発のさらに別の障害をもたらしている。

【0005】

本発明の新規な抗５Ｔ４ ＡＤＣは、ＡＤＣ技術に伴う課題を克服し、５Ｔ４抗原を発現する腫瘍細胞に結合し十分な細胞傷害性薬剤を細胞に送達する高度に特異的で強力なＡＤＣを提供し、こうして、革新的で効果的ながん治療を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一実施形態において、本発明の抗体−薬剤コンジュゲートは、式：Ａｂ−（ＬＵ−Ｄ）ｐまたはその薬学的に許容できる塩を有する（式中、Ａｂは、配列番号５で示されるＶＨ ＣＤＲ１領域、配列番号６で示されるＶＨ ＣＤＲ２領域、および配列番号７で示されるＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を含む、抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分であり、ＬＵは、マレイミドカプロイルおよびマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡからなる群から選択されるリンカー単位であり、ｐは、約１から約８の整数であり、Ｄは、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、およびＭＭＡＤからなる群から選択される薬剤単位である）。

【0007】

本発明はさらに、前記抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分が、（ａ）配列番号５で示されるＶＨ ＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号６で示されるＶＨ ＣＤＲ２領域、および（ｃ）配列番号７で示されるＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域を含む、抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0008】

本発明はさらに、前記抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分が、（ａ）配列番号８で示されるＶＬ ＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号９で示されるＶＬ ＣＤＲ２領域、および（ｃ）配列番号１０で示されるＶＬ ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域を含む、抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0009】

本発明はさらに、前記抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分が、（ａ）配列番号５で示されるＶＨ ＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号６で示されるＶＨ ＣＤＲ２領域、および（ｃ）配列番号７で示されるＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域、ならびに（ａ）配列番号８で示されるＶＬ ＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号９で示されるＶＬ ＣＤＲ２領域、および（ｃ）配列番号１０で示されるＶＬ ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域をさらに含む、抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0010】

本発明はさらに、前記抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分が、配列番号３のＶＨ領域および配列番号４のＶＬ領域を含む、抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0011】

本発明はさらに、前記抗５Ｔ４抗体が、配列番号１を有する重鎖および配列番号２を有する軽鎖からなる、抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0012】

本発明はさらに、
（ａ）前記抗５Ｔ４抗体が、配列番号１を有する重鎖および配列番号２を有する軽鎖からなり、（ｂ）前記ＬＵがマレイミドカプロイルであり、（ｃ）前記薬剤がＭＭＡＦであり、（ｄ）ｐが約４の整数である、
抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0013】

本発明はさらに、
（ａ）前記抗５Ｔ４抗体が、配列番号１を有する重鎖および配列番号２を有する軽鎖からなり、（ｂ）前記ＬＵがマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡであり、（ｃ）前記薬剤がＭＭＡＥであり、（ｄ）ｐが約４の整数である、
抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0014】

本発明はさらに、
（ａ）前記抗５Ｔ４抗体が、配列番号１を有する重鎖および配列番号２を有する軽鎖からなり、（ｂ）前記ＬＵがマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡであり、（ｃ）前記薬剤がＭＭＡＤであり、（ｄ）ｐが約１から約８の整数である、
抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0015】

本発明はさらに、（ａ）前記抗５Ｔ４抗体が、配列番号１５を有する重鎖および配列番号２を有する軽鎖からなり、（ｂ）前記ＬＵがマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡであり、（ｃ）前記薬剤がＭＭＡＥであり、（ｄ）ｐが約１から約８の整数である、抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0016】

本発明は、前記抗体がヒト５Ｔ４抗原上のエピトープを認識し、前記エピトープが配列番号１１のアミノ酸配列のアミノ酸残基１７３〜２５８および２８２〜３６１を含む、抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0017】

本発明は、上記の抗体−薬剤コンジュゲートおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。

【0018】

本発明はさらに、それを必要とする患者において５Ｔ４陽性のがんを治療する方法であって、前記患者に上記の抗体−薬剤コンジュゲートを投与するステップを含む、方法を提供する。

【0019】

本発明はさらに、前記がんが、膀胱、乳房、頸部、結腸、子宮内膜、腎臓、肺、食道、卵巣、前立腺、膵臓、肝臓、皮膚、胃、および精巣の癌腫からなる群から選択される、５Ｔ４陽性のがんを治療する方法を提供する。

【0020】

さらに好ましくは、本発明は、前記がんが、結腸直腸癌、乳癌、膵癌、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、５Ｔ４陽性のがんを治療する方法を提供する。

【0021】

本発明はさらに、治療法における使用のための、上記の抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。

【0022】

本発明はさらに、医薬の製造のための、上記の抗体−薬剤コンジュゲートの使用を提供する。

【0023】

本発明はさらに、前記使用が、５Ｔ４陽性のがんの治療のためのものであり、前記がんが、膀胱、乳房、頸部、子宮内膜、腎臓、肺、食道、卵巣、前立腺、膵臓、皮膚、胃、および精巣の癌腫からなる群から選択される、上記の使用を提供する。

【0024】

さらに好ましくは、本発明はさらに、前記使用が、５Ｔ４陽性のがんの治療のためのものであり、前記がんが、結腸直腸癌、乳癌、膵癌、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、上記の使用を提供する。

【0025】

本発明はさらに、抗５Ｔ４抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、および前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0026】

本発明はさらに、上記のベクターを含む宿主細胞を培養するステップ、および細胞培養物から抗体を回収するステップを含む、抗５Ｔ４抗体を生産するための方法を提供する。

【0027】

本発明はさらに、（ａ）細胞培養物から回収された抗体を取得するステップ、（ｂ）前記抗体を、マレイミドカプロイルまたはマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔからなる群から選択されるリンカー単位を介して、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤ、またはＭＭＡＦからなる群から選択される薬剤単位に化学的に連結させるステップ、および（ｃ）抗体−薬剤コンジュゲートを精製するステップを含む、抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを生産するための方法を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明は、がんの治療のための抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートを提供する。本発明がさらに容易に理解されるように、ある特定の用語をまず定義する。

【0029】

本開示において用いられる全てのアミノ酸の略記は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（Ｂ）（Ｉ）に示されているように、米国特許商標庁によって認められているものである。

【0030】

５Ｔ４は、４２ｋＤａのグリコシル化されていない核を含む７２ｋＤａの高度にグリコシル化された膜貫通糖タンパク質である、５Ｔ４腫瘍胎児抗原を指す（ＵＳ５，８６９，０５３を参照されたい）。ヒト５Ｔ４は、膀胱、乳房、頸部、結腸、子宮内膜、腎臓、肺、食道、卵巣、前立腺、膵臓、肝臓、皮膚、胃、および精巣の癌腫を含む、多くのがんタイプにおいて発現する。がん幹細胞または腫瘍開始細胞とも呼ばれる、高度に腫瘍形成性の細胞は、高レベルの５Ｔ４発現を有することが示されている（ＷＯ２０１０／１１１６５９）。本発明の抗５Ｔ４抗体は、ヒト５Ｔ４抗原を特異的に結合する抗体を含む（ＵＳ２００７／０２３１３３３を参照されたい）。

【0031】

「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、用語「抗体」は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、そのあらゆる抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）または一本鎖、抗体を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された立体配置も包含し、これには、例えば、限定はしないが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインから構成されるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、およびＦｄ断片、抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから構成されるＦｖ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ抗体）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、ならびにビス−ｓｃＦｖが含まれる。

【0032】

抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などのあらゆるクラスの抗体を含み、また抗体は、何らかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。

【0033】

抗体の「可変領域」は、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野において知られているように、重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られている、抗体の抗原結合部位の形成に関与する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続されている、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。特にＣＤＲ領域の外側（すなわちフレームワーク領域内）のアミノ酸残基が置換された、目的の可変領域の変異体が所望であれば、目的の可変領域を、目的の可変領域と同一のカノニカルクラスのＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって、適当なアミノ酸置換、好ましくは保存的なアミノ酸置換を同定することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６（４）：９０１〜９１７、１９８７）。目的のＣＤＲに隣接させるためのＦＲを選択する場合、例えば抗体をヒト化または最適化する場合、同一のカノニカルクラスのＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列を含有する抗体のＦＲが好ましい。

【0034】

可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の集積、ＡｂＭ、接触の定義、ならびに／もしくは立体構造による定義、または当技術分野において周知のあらゆるＣＤＲ決定方法に従って同定される、可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって最初に定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．を参照されたい。ＣＤＲの位置はまた、Ｃｈｏｔｈｉａらによって最初に記載された構造的ループ構造として同定することができる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７〜８８３を参照されたい。ＣＤＲ同定のための他のアプローチには「ＡｂＭ定義」が含まれ、これは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））、または、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５において記載されている、観察される抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」を用いて誘導される。本明細書においてＣＤＲの「立体構造による定義」と呼ばれる別のアプローチにおいて、ＣＤＲの位置は、抗原結合へのエンタルピー寄与をもたらす残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照されたい。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のアプローチの１つに厳密に従わなくてもよいが、それでも、特定の残基または残基群またはさらにＣＤＲ全体が抗原の結合に有意に影響を与えないという予測または実験的所見に照らして短くまたは長くなり得るものの、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部とオーバーラップするであろう。本明細書において用いられる場合、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含む、当技術分野において知られているあらゆるアプローチによって定義されたＣＤＲを指し得る。本明細書において用いられる方法は、これらのアプローチのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用し得る。２つ以上のＣＤＲを含有するあらゆる所与の実施形態で、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造による定義のいずれかに従って定義され得る。

【0035】

用語「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、単一のコピーまたは例えばあらゆる真核生物、原核生物、もしくはファージのクローンを含むクローンに由来する抗体を指し、それを生産する方法を指すわけではない。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、均質なまたは実質的に均質な集団で存在する。

【0036】

「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２、または抗体の他の抗原結合部分配列）である、非ヒト（例えばマウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。

【0037】

用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すものである。

【0038】

本発明の抗体は、当技術分野において周知の技術、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはこのような技術の組み合わせ、または当技術分野において容易に知られる他の技術を用いて生産することができる（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４５：１６２８〜５０（１９９９）、およびＦｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７３（４）：９２４〜４０（２００７）を参照されたい）。

【0039】

以下の表１および２は、本発明の抗体のための好ましいＣＤＲを示す。

【0040】

【表1】

【0041】

【表2】

【0042】

本発明は、
ａ）ｉ）配列番号８および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、
ｉｉ）配列番号９および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、ならびに
ｉｉｉ）配列番号１０および１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
ｂ）ｉ）配列番号５および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、
ｉｉ）配列番号６および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、ならびに
ｉｉｉ）配列番号７および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と
を含む、抗体またはその抗原結合部分を含む。

【0043】

本発明の好ましい抗体またはその抗原結合部分は、
ａ）配列番号８のＬＣＤＲ１、配列番号９のＬＣＤＲ２、および配列番号１０のＬＣＤＲ３を含むＬＣＶＲ、ならびに
ｂ）配列番号５のＨＣＤＲ１、配列番号６のＨＣＤＲ２、および配列番号７のＨＣＤＲ３を含むＨＣＶＲ
を含む。

【0044】

本発明の好ましいモノクローナル抗体は、本明細書において、Ａ１（ヒト化抗５Ｔ４ ＩｇＧ１抗体）、Ａ１−ＩｇＧ４（ヒト化抗５Ｔ４ ＩｇＧ４抗体）、Ａ３（マウス／ヒトキメラ抗体）、およびＡ３ｈｕ（ヒト化抗５Ｔ４ ＩｇＧ１抗体）と呼ばれる。Ｍａｂ Ａ１、Ａ１−ＩｇＧ４、およびＡ３をコードするアミノ酸配列の配列番号を、以下の表３に示す。

【0045】

【表3】

【0046】

表現「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と、本明細書において区別せずに用いられる。

【0047】

抗５Ｔ４抗体−薬剤コンジュゲートは、リンカー単位分子（ＬＵ）を介して細胞傷害性薬剤部分（Ｄ）に連結している、本明細書において記載される抗５Ｔ４抗体またはその抗原結合部分を指す。

【0048】

リンカー単位（ＬＵ）：ＬＵは、薬剤への抗体の直接的または間接的な連結を説明する。ｍＡｂへのリンカーの付着は、様々な方法で、例えば、表面リジン、酸化糖質への還元的カップリング、および鎖間ジスルフィド連結の還元により遊離するシステイン残基を介して行われ得る。ヒドラゾン、ジスルフィド、およびペプチドに基づく連結を含む様々なＡＤＣ連結系が、当技術分野において知られている。

【0049】

薬剤（Ｄ）：薬剤は、生物学的なまたは検出可能な活性を有するあらゆる物質、例えば治療剤、検出可能な標識、結合剤など、およびインビボで活性作用物質に代謝されるプロドラッグである。薬剤およびペイロードという用語は、区別せずに用いられる。いくつかの実施形態において、薬剤は、オーリスタチンＥ（ドラスタチン−１０の誘導体としても当技術分野において知られている）などのオーリスタチン、またはその誘導体である。オーリスタチンは、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルであり得る。例えば、オーリスタチンＥは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応して、それぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢを生産し得る。他の典型的なオーリスタチンには、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、およびＭＭＡＥが含まれる。例示的なオーリスタチンの合成および構造は、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第７，０９８，３０８号、米国特許第７，２５６，２５７号、米国特許第７，４２３，１１６号、米国特許第７，４９８，２９８号、および米国特許第７，７４５，３９４号において記載されており、そのそれぞれは、その全体が全ての目的で参照によって本明細書に組み込まれる。

【0050】

オーリスタチンは、微小管の力学ならびに核および細胞の分裂に干渉し、抗がん活性を有することが示されている。本発明のオーリスタチンは、チューブリンを結合し、５Ｔ４を発現する細胞または細胞系に対して細胞傷害性のまたは細胞増殖抑制性の効果を及ぼし得る。オーリスタチンまたは得られた抗体−薬剤コンジュゲートが所望の細胞または細胞系に対して細胞増殖抑制性のまたは細胞傷害性の効果を及ぼすかどうかを決定するために用いることができる多くの異なるアッセイが、当技術分野において知られている。化合物がチューブリンを結合するかどうかを決定するための方法は、当技術分野において知られている。例えば、Ｍｕｌｌｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ２００６、７８、４３９０〜４３９７；Ｈａｍｅｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９５ ４７：９６５〜９７６；およびＨａｍｅｌら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９０ ２６５：２８、１７１４１〜１７１４９を参照されたい。

【0051】

薬剤またはペイロードの例は、ＤＭ１（メイタンシン、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−またはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン）、ｍｃ−ＭＭＡＤ（６−マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチン−ＤまたはＮ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−メトキシ−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（２−チアゾリル）エチル］アミノ］プロピル］−１−ピロリジニル］−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−（９ＣＩ）−Ｌ−バリンアミド）、ｍｃ−ＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＦまたはＮ−［６−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−５−メチル−４−（メチルアミノ）ヘプタノイル−（αＲ，βＲ，２Ｓ）−β−メトキシ−α−メチル−２−ピロリジンプロパノイル−Ｌ−フェニルアラニン）およびｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ（６−マレイミドカプロイル−ＶａｌｃＣｉｔ−（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）−モノメチルアウリスタチンＥまたはＮ−［［［４−［［Ｎ−［６−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］−Ｌ−バリル−Ｎ５−（アミノカルボニル）−Ｌ−オルニチル］アミノ］フェニル］メトキシ］カルボニル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニルエチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］−１−ピロリジニル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）からなる群から選択される。ＤＭ１は、チューブリン阻害剤であるメイタンシンの誘導体であり、一方、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＦは、オーリスタチン誘導体である。本発明の好ましいペイロードは、ｍｃ−ＭＭＡＦおよびｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥからなる群から選択される。

【0052】

用語「エピトープ」は、抗体の抗原結合領域の１つまたは複数で抗体によって認識および結合され得る、分子の部分を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面の配置から構成され、特異的な三次元構造特徴および特異的な電荷特徴を有することが多い。本明細書において用いられる用語「抗原性エピトープ」は、当技術分野において周知のあらゆる方法によって、例えば従来の免疫アッセイによって決定される、抗体が特異的に結合し得るポリペプチドの一部として定義される。「非線状エピトープ」または「立体構造的エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原性タンパク質内の不連続なポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。

【0053】

本明細書において用いられる用語「結合親和性（Ｋ_Ｄ）」は、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指すものである。Ｋ_Ｄは、会合速度または「オン速度（ｋ_ｏｎ）」に対する、「オフ速度（ｋ_ｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度の比率である。したがって、Ｋ_Ｄはｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。これは、Ｋ_Ｄが小さいほど結合の親和性が強いということになる。したがって、１μＭのＫ_Ｄは、１ｎＭのＫ_Ｄと比較して弱い結合親和性を示す。抗体のＫ_Ｄ値は、当技術分野において良く確立されている方法を用いて決定することができる。抗体のＫ_Ｄを決定するための１つの方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いることによるもの、典型的にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いるものである。

【0054】

本明細書において用いられる用語「特異的に結合する」は、抗体と５Ｔ４抗原との間の結合に言及するものであり、抗体は、２５℃でＳＰＲによって決定すると、約３０ｎＭ未満のＫ_Ｄで５Ｔ４抗原を結合する。

【0055】

本明細書において用いられる薬学的に許容できる塩は、薬学的に許容できる、分子または高分子の有機塩または無機塩を指す。

【0056】

用語「効力」は、生物学的活性の測定値であり、ＩＣ_５０、すなわち実施例３において記載されているように５Ｔ４陽性の細胞系の成長の５０％を阻害するために必要な抗体の効果的濃度として示すことができる。あるいは、効力は、実施例４において示されるようにインビボでの腫瘍異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルにおいて決定される抗腫瘍活性を指し得る。

【0057】

本明細書において用いられる用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むものである。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【0058】

本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、以下のものを含み得る：変異体のコード配列のみ；変異体のコード配列およびさらなるコード配列、例えば機能的ポリペプチドまたはシグナル配列もしくは分泌配列もしくは前駆タンパク質配列；抗体のコード配列および非コード配列、例えばイントロンまたは抗体のコード配列の５’および／もしくは３’非コード配列。用語「抗体をコードするポリヌクレオチド」は、変異体のさらなるコード配列を含むポリヌクレオチドだけではなく、さらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも包含する。特異的な宿主細胞／発現系に最適化されたポリヌクレオチド配列が所望のタンパク質のアミノ酸配列から容易に得られ得ることは、当技術分野において知られている（ＧＥＮＥＡＲＴ（登録商標）ＡＧ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙを参照されたい）。

【0059】

本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において知られている天然に関連するまたは異種のプロモーター領域を含む、抗体のコード配列に作動可能に連結している発現制御ポリヌクレオチド配列を典型的に含む。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし得るベクターにおける真核生物プロモーター系であるが、原核宿主の制御配列もまた用いることができる。ベクターが適当な宿主細胞系に組み込まれると、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現に、また必要に応じて抗体の収集および精製に適切な条件下で増殖させる。好ましい真核細胞系には、ＣＨＯ細胞系、様々なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換されたＢ細胞、またはヒト胚腎臓細胞系が含まれる。最も好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ細胞系である。

【0060】

本発明は、５Ｔ４抗原上の特異的エピトープに結合する抗体またはその抗原結合部分を包含する。同定されたエピトープは、アミノ酸残基１７３と２５２との間のヒト５Ｔ４抗原（配列番号１１）との第１の接触を含み、アミノ酸残基２７６と３５５との間の第２の接触を含む、非線状エピトープまたは立体構造的エピトープである（実施例７を参照されたい）。したがって、本明細書において記載されるＣＤＲならびに重鎖および軽鎖の可変領域は、５Ｔ４抗原の上記のエピトープに特異的なＣＤＲを採用して、タンパク質の結合親和性を維持する完全長抗体ならびに機能的断片および類似体を作製するために用いられる。

【0061】

本発明の抗体の結合親和性は、ＳＰＲを用いて決定される（実施例６）。これらの実験において、５Ｔ４抗原は、低密度でＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）チップ上に固定され、抗体が流される。チップ表面での塊の形成が測定される。この分析方法によって、結合に対する親和性（Ｋ_Ｄ）を得るためのオン速度およびオフ速度の両方をリアルタイムで決定することが可能になる。本発明のヒト化抗体は、約０．３０から約３０ｎＭの間、約０．３０から約２０ｎＭの間、約０．３０から約１０ｎＭの間、約０．５から約７ｎＭの間、約１．０から約５ｎＭの間、および約１．０から約３ｎＭの間のＫ_Ｄを有する。

【0062】

抗体への薬剤のコンジュゲーション
薬剤は、抗体上のコンジュゲーション点と反応性の基を有するか、またはそれを含むように修飾されている。例えば、薬剤は、アルキル化（例えば、抗体のイプシロン−アミノ基のリジン、またはＮ末端で）、酸化糖質の還元的アミノ化、ヒドロキシル基とカルボキシル基との間のトランスエステル化、アミノ基またはカルボキシル基でのアミド化、およびチオールへのコンジュゲーションによって付着させることができる。いくつかの実施形態において、抗体１分子当たりのコンジュゲートした薬剤部分の数ｐは、平均１から８、１から７、１から６、１から５、１から４、１から３、または１から２の範囲である。いくつかの実施形態において、ｐは、平均２から８、２から７、２から６、２から５、２から４、または２から３の範囲である。他の実施形態において、ｐは、平均１、２、３、４、５、６、７、または８である。いくつかの実施形態において、ｐは、平均約１から約８、約１から約７、約１から約６、約１から約５、約１から約４、約１から約３、または約１から約２の範囲である。いくつかの実施形態において、ｐは、約２から約８、約２から約７、約２から約６、約２から約５、約２から約４、または約２から約３の範囲である。コンジュゲーションに用いることができる化学の例については、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、第１５章（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を参照されたい（この文献の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。

【0063】

例えば、タンパク質の化学的活性化によって遊離チオール基が形成される場合、タンパク質はスルフヒドリル反応性の作用物質とコンジュゲートし得る。一態様において、作用物質は、遊離チオール基に実質的に特異的なものである。このような作用物質には、例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモ、クロロ）、ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロゲン化ベンジル（例えば、ヨウ化物、臭化物、または塩化物）、ビニルスルホン、およびピリジルチオが含まれる。

【0064】

リンカー
薬剤は、リンカーによって抗体に連結させることができる。適切なリンカーには、例えば、切断可能なリンカーおよび切断不可能なリンカーが含まれる。切断可能なリンカーは、典型的には、細胞内条件下で切断を受けやすい。適切な切断可能なリンカーには、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーが含まれる。例示的な実施形態において、リンカーは、ジペプチドリンカー、例えばバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）リンカー、フェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドカプロニック−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ）リンカーであり得る。別のリンカーは、スルホスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｍｃｃ）である。スルホ−ｓｍｃｃコンジュゲーションは、スルフヒドリル（チオール、−ＳＨ）と反応するがそのスルホ−ＮＨＳエステルは第一級アミン（リジンおよびタンパク質またはペプチドのＮ末端において見られる）に対して反応性である、マレイミド基を介して生じる。さらに別のリンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の適切なリンカーには、特異的なｐＨまたはｐＨ範囲で加水分解可能なリンカー、例えばヒドラゾンリンカーが含まれる。さらなる適切な切断可能なリンカーには、ジスルフィドリンカーが含まれる。リンカーは、薬剤が放出されるために抗体が細胞内で分解されなければならない程度まで、抗体に共有結合され得る（例えばｍｃリンカーなど）。

【0065】

リンカーは、抗体に連結するための基を含み得る。例えば、リンカーは、アミノ反応基、ヒドロキシル反応基、カルボキシル反応基、またはスルフヒドリル反応基（例えば、マレイミド、ハロアセトアミド（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロエステル（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロメチルケトン（例えば、ヨード、ブロモ、またはクロロ）、ハロゲン化ベンジル（例えば、ヨウ化物、臭化物、または塩化物）、ビニルスルホン、およびピリジルチオ）を含み得る。全体として、Ｗｏｎｇ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９１を参照されたい。

【0066】

免疫療法
免疫療法のために、抗体は、適切な薬剤、例えば細胞傷害性作用物質または細胞増殖抑制性作用物質、免疫抑制性作用物質、放射性同位体、毒素などにコンジュゲートさせることができる。コンジュゲートは、腫瘍もしくはがん細胞のアポトーシスをもたらす腫瘍細胞もしくはがん細胞の増殖の阻害に、または患者におけるがんの治療に用いることができる。コンジュゲートは、動物のがんの治療のための様々な状況でしかるべく用いることができる。コンジュゲートは、腫瘍細胞またはがん細胞に薬剤を送達するために用いることができる。理論に拘束されることはないが、いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、がん細胞関連抗原または腫瘍関連抗原に結合するかまたはそれを伴い、コンジュゲートおよび／または薬剤は、受容体介在性のエンドサイトーシスを介して腫瘍細胞またはがん細胞内に取り込まれ得る。抗原は、腫瘍細胞もしくはがん細胞に付着し得るか、または腫瘍細胞もしくはがん細胞に関連する細胞外マトリクスタンパク質であり得る。細胞内に入ると、コンジュゲート内の１つまたは複数の特異的なペプチド配列（例えばリンカー内）は、１つまたは複数の腫瘍細胞関連プロテアーゼまたはがん細胞関連プロテアーゼによって、加水分解によって切断され、薬剤を放出させる。放出された薬剤はそして、細胞内を自由に移動でき、細胞傷害性の活性または細胞増殖抑制性の活性または他の活性を誘発する。いくつかの実施形態において、薬剤は、腫瘍細胞またはがん細胞の外側で抗体から切断され、薬剤はその後、細胞に侵入するか、または細胞表面で作用する。

【0067】

がんの治療法
上述のように、限定はしないが腫瘍、転移、または制御されていない細胞の成長を特徴とする他の疾患もしくは障害を含む、がんは、タンパク質−薬剤コンジュゲートの投与によって治療または予防することができる。

【0068】

他の実施形態において、有効量のコンジュゲートおよび化学療法剤を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、がんを治療または予防するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、それを用いるがんの治療が不応性であることが分かっていないものである。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、それを用いるがんの治療が不応性であることが分かっているものである。コンジュゲートは、がんの治療のための外科手術などの治療も受けた患者に投与することができる。別の実施形態において、さらなる治療方法は、放射線照射療法である。

【0069】

がんの多剤療法
がんを治療するための方法は、有効量の抗体−薬剤コンジュゲートおよび抗がん剤である別の治療剤を、それを必要とする患者に投与するステップを含む。適切な抗がん剤には、限定はしないが、メトトレキサート、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、トポテカン、ナイトロジェンマスタード、サイトキサン、エトポシド、５−フルオロウラシル、ＢＣＮＵ、イリノテカン、カンプトテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、カリケアマイシン、およびドセタキセルが含まれる。

【0070】

本発明のＡＤＣは、選択された投与方式に適当となるように製剤された、投与のための医薬組成物、および薬学的に許容できる希釈剤または賦形剤、例えば緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定剤、担体などを含む形態であり得る。参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．、第１８版、１９９５は、医師に一般に知られているように、製剤技術の概要を提供している。

【0071】

これらの医薬組成物は、がんを治療するための一般に意図される目的を達成する、当技術分野において知られているあらゆる手段によって、投与することができる。好ましい投与経路は非経口であり、これは、本明細書において限定はしないが静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与方式を指すとして定義される。投与される量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、もしあれば併用する治療の種類、治療の頻度、ならびに所望の効果の性質に応じる。

【0072】

本発明の範囲内の組成物には、ＡＤＣががんの治療のための所望の医学的効果を達成するために有効な量で存在する、全ての組成物が含まれる。個体の要求は患者ごとに異なり得るが、全成分の有効量の最適な範囲の決定は、通常の技能を有する臨床医の能力の範囲内である。

【実施例】

【0073】

（実施例１）
抗５Ｔ４ ＡＤＣの調製
５Ｔ４−Ａ１抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）でｍＡｂを部分的に還元し、その後、還元されたＣｙｓ残基を所望のマレイミド末端リンカー−ペイロードと反応させることを介して調製する。具体的には、５Ｔ４−Ａ１ ｍＡｂを、２．８モル過剰の、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液）（ｐＨ７．０）および１ｍＭのジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）内のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の添加を介して、３７℃で２時間、部分的に還元する。所望のリンカー−ペイロードを次に、５．５（マレイミドカプロニック−モノメチルオーリスタチンＦ［ｍｃ−ＭＭＡＦ］）または８（マレイミドカプロニック−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチルオーリスタチンＥ［ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ］）のリンカー−ペイロード／ｍＡｂ−チオールのモル比で反応混合物に添加し、１５％ｖ／ｖのジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）の存在下で、２５℃でさらに１時間反応させる。１時間のインキュベーション期間の後、Ｎ−エチルマレイミド（ｍｃ−ＭＭＡＦについては４．５倍過剰、ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥについては２倍過剰）を、未反応のチオールにキャップをするために添加し、１５分間の反応を可能にし、その後、６倍過剰なＬ−Ｃｙｓを添加して、あらゆる未反応のリンカー−ペイロードをクエンチする。反応混合物を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）内で、４℃で一晩透析し、ＳＥＣ（ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０ＧＬカラム）を介して精製する。ＡＤＣを、純度のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、および液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ）を介してさらに特徴付けして、負荷量を計算し、濃度を、ＵＶ分光光度計を介して決定する。

【0074】

（実施例２）
結合の研究
５Ｔ４抗原を発現する細胞、および陰性対照であるＲａｊｉ細胞を、組織培養物で処理していない９６ウェルプレート上に５００，０００細胞／ウェルの密度で蒔き、氷上で維持する。Ａ１抗体およびＡ１−ＩｇＧ４抗体またはＡ１−ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣの希釈物を、ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）内の３％ウシ血清アルブミンＢＳＡ内に作製し、１０μｇ／ｍＬの最終濃度でプレートに添加する。プレートを次に、氷上で１時間インキュベートし、その後２回洗浄する。二次抗体、すなわちＰＥ（フィコエリスリン）にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃをウェルに添加する。４℃で３０分間インキュベートした後、平均蛍光強度を次に、フローサイトメーターを用いて測定する。

【0075】

表４のデータは、Ａ１抗体が５Ｔ４陽性細胞系の様々なパネルを結合することを示す。表５のデータは、いくつかの異なる細胞系に対する類似の結合がＡ１抗体およびＡ１−ＩｇＧ４抗体ならびにＡ１−ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣで観察されることを示す。

【0076】

【表4】

【0077】

【表5】

【0078】

（実施例３）
細胞傷害性アッセイ
５Ｔ４を発現する細胞系、および陰性対照であるＲａｊｉ細胞系を、増大濃度のＡＤＣと培養する。４日後、各培養物の生存能力を評価する。ＩＣ_５０値を、ロジスティック非線形回帰によって計算し、ｎｇ Ａｂ／ｍＬとして表す。Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＥ、Ａ３−ｍｃＭＭＡＦ、およびＡ３−ｍｃＭＭＡＥは、５Ｔ４を発現する細胞系の成長を阻害する（ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４、ＭＤＡＭＢ４６８、およびＭＤＡＭＢ３６１ＤＹＴ２）が、５Ｔ４陰性細胞（Ｒａｊｉ）に対しては不活性であることが示される、表６。

【0079】

【表6】

【0080】

さらに、５Ｔ４＋原発性肺腫瘍３７６２２ａ細胞を単離し、培養物内で成長させる。細胞を、増大濃度のＡＤＣと培養する。１０日後、各培養物の生存能力を、ＭＴＳ法を用いて評価する。ＩＣ_５０値を、ロジスティック非線形回帰によって計算し、ｎｇ Ａｂ／ｍＬとして表す。Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＥ、Ａ３−ｍｃＭＭＡＦ、およびＡ３−ｖｃＭＭＡＥは、原発性肺腫瘍細胞の成長を阻害する、表７。

【0081】

【表7】

【0082】

（実施例４）
皮下異種移植モデル
雌の無胸腺（ヌード）マウス（または別の免疫抑制マウス株）に、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４腫瘍細胞、ＭＤＡＭＢ３６１ＤＹＴ２腫瘍細胞、またはＨ１９７５腫瘍細胞をｓ．ｃ．注入する。およそ０．１から０．３ｇのステージ付けされた腫瘍を有するマウス（治療群当たりｎ＝６から１０匹のマウス）に、Ｑ４Ｄｘ４を、生理食塩水（媒体）、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＥ、Ａ１−ｍｃＭＭＡＤ、Ａ１−ｓｍｃｃＤＭ１、Ａ３−ｍｃＭＭＡＦ、Ａ３−ｖｃＭＭＡＥ、またはｍｃＭＭＡＦもしくはｖｃＭＭＡＥにコンジュゲートした非結合性の対照抗体と共に、１ｋｇ当たり３ｍｇのＡｂの用量で静脈内投与する。全ＡＤＣは、Ａｂ含有量に基づいて投与する。腫瘍を少なくとも１週に１回測定し、そのサイズ（ｍｍ^３±ＳＥＭ）を、ｍｍ^３＝０．５×（腫瘍の幅^２）×（腫瘍の長さ）として計算する。

【0083】

表８のデータは、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＥ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＤ、Ａ３−ｍｃＭＭＡＦ、およびＡ３−ｖｃＭＭＡＥが、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４異種移植片の成長を阻害するが、Ａ１−ｍｃＭＭＡＤおよびＡ１−ｓｍｃｃＤＭ１はこのモデルにおいて活性でなかったことを示す。

【0084】

表９のデータは、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＥ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＤ、Ａ１−ｓｍｃｃＤＭ１、Ａ３−ｍｃＭＭＡＦ、およびＡ３−ｖｃＭＭＡＥが、ＭＤＡＭＢ３６１ＤＹＴ２異種移植片の成長を阻害するが、Ａ１−ｍｃＭＭＡＤはこのモデルにおいて活性でなかったことを示す。

【0085】

表１０のデータは、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＥ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＤ、Ａ３−ｍｃＭＭＡＦ、およびＡ３−ｖｃＭＭＡＥが、Ｈ１９７５異種移植片の成長を阻害するが、Ａ１−ｍｃＭＭＡＤおよびＡ１−ｓｍｃｃＤＭ１はこのモデルにおいて活性でなかったことを示す。

【0086】

【表8】

【0087】

【表9】

【0088】

【表10】

【0089】

あるいは、３７６２２ａ原発性腫瘍細胞異種移植片が皮下に確立されたヌードマウスを、Ｑ４Ｄｘ４と、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ、Ａ１−ｍｃＭＭＡＤ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＤ、またはＡ３−ｍｃＭＭＡＦとで、１ｋｇ当たり３ｍｇのＡｂの用量でｉｖ処理し、腫瘍成長を９６日間の期間にわたりモニタリングする。表１１は、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ、Ａ１−ｖｃＭＭＡＤ、およびＡ３−ｍｃＭＭＡＦが、３７６２２ａ原発性腫瘍異種移植片の成長を、媒体対照で処理した動物と比較して阻害するが、Ａ１−ｍｃＭＭＡＤはこのモデルにおいて活性でなかったことを示す。

【0090】

【表11】

【0091】

予想外に、表８〜１１のデータは、同一の抗体および薬剤ペイロードを有するが異なるリンカーを有するＡＤＣが、４つの異種移植モデル全てにおいて、類似していない有効性プロフィール、すなわちＡ１−ｍｃＭＭＡＤ対Ａ１−ｖｃＭＭＡＤを有していたことを示す。さらに、データは、同一の抗体およびリンカーを有するが異なる薬剤ペイロードを有するＡＤＣもまた、４つの異種移植モデル全てにおいて、異なる有効性プロフィール、すなわちＡ１−ｍｃＭＭＡＦ対Ａ１−ｍｃＭＭＡＤを有していたことを示す。したがって、薬剤ＭＭＡＤは、ｖｃリンカーによってＡ１抗体に連結している場合は４つの異種移植モデル全てにおいて効果的であるが、ｍｃリンカーによって連結している場合は試験した異種移植モデルのいずれにおいても活性を有さない。逆に、薬剤ＭＭＡＦは、ｍｃリンカーでＡ１抗体に連結している場合は４つの異種移植モデル全てにおいて非常に効果的であるが、一方、化学的に関連する薬剤ＭＭＡＤは、同一のリンカーによって同一の抗体に連結している場合に４つの異種移植モデル全てにおいて活性を有さない。

【0092】

さらに別の予想外の所見は、ＡＤＣ Ａ１−ｓｍｃｃＤＭ１で見られる（表８〜１０）。このＡＤＣは、ＭＤＡＭＢ３６１ＤＹＴ２異種移植片に対して非常に効果的であったが、全ての異種移植片が５Ｔ４標的抗原の高い発現を有しているにもかかわらず、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４異種移植片およびＨ１９７５異種移植片に対して基本的に効果を有さなかった。このデータは、リンカー−ペイロードの有効性が、同一の高親和性抗体が利用される場合であっても、または同一のＡＤＣが用いられる場合であっても、予測され得ないことを説明する。

【0093】

（実施例５）
抗体依存性の細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣアッセイ：
健康なボランティアの血液を、ナトリウムヘパリンを有するＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ細胞調製管内に収集する。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を採取し、アッセイ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補ったＲＰＭＩ１６４０）内に２．５×１０^７細胞／ｍｌで再懸濁する。標的細胞（ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４またはＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ）を、９６ウェルアッセイプレート内に１×１０^４細胞／ウェルの密度で播種する。Ａ１抗体またはＡ１−ｍｃＭＭＡＦを添加し、次に、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞（５×１０^５）を、５０：１のエフェクター：標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ）となるように、ウェル内に分注する。アッセイプレートを、ＡＤＣＣ活性のために、３７℃で４時間インキュベートする。プレートを、等容積のＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによって採取する。停止溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、５０μｌ）を各ウェルに添加し、ラクテートデヒドロゲナーゼの放出を、蛍光強度を測定することによって定量した。陽性対照として、ウェル当たり２μｌの溶解緩衝液を添加して、対照ウェルにおける最大ＬＤＨ放出（１００％細胞傷害性）を生じさせる。細胞傷害性のパーセントを、以下の方程式を用いて計算する。

【0094】

【数1】

【0095】

「実験値」が実験条件の１つにおいて測定されたシグナルに対応する場合、「エフェクター自然値」は、ＰＢＭＣのみの存在下で測定されたシグナルに対応し、「標的自然値」は、標的細胞のみの存在下で測定されたシグナルに対応し、「標的最大値」は、デタージェントで溶解された標的細胞のみの存在下で測定されたシグナルに対応する。

【0096】

Ａ１−ＩｇＧ４ Ａｂと比較した、Ａ１−ＩｇＧ１ ＡｂおよびＡ１−ｍｃＭＭＡＦのＡＤＣＣ活性を、表１２に示す。Ａ１抗体およびＡ１−ｍｃＭＭＡＦの両方は、匹敵するＡＤＣＣ活性を示し、このことは、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦのＡＤＣＣ活性がその抗腫瘍活性に寄与し得ることを示している。

【0097】

【表12】

【0098】

（実施例６）
結合親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を利用して行って、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４でのヒトまたはカニクイザルの５Ｔ４へのＡ１−ＩｇＧ１およびＡ１−ＩｇＧ４の結合の親和性定数を決定する。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）技術は、表面層に固定されたヒト５Ｔ４タンパク質へのｈｕＡ１抗体変異体の結合の際の、表面層での屈折率の変化を利用するものである。結合は、表面からのレーザー光屈折のＳＰＲによって検出される。オン速度およびオフ速度でのシグナル動態の分析によって、非特異的相互作用と特異的相互作用との間の区別が可能になる。この分析に用いられる５Ｔ４タンパク質は、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメインに融合したヒトまたはカニクイザルの５Ｔ４細胞外ドメインから構成され、親和性定数を正確に測定するために、低密度（ヒトおよびカニクイザルでそれぞれ４５．１および４５．４ＲＵ）がＣＭ５チップ上に固定される。

【0099】

５Ｔ４細胞外ドメインへの特異的結合の測定は、５Ｔ４−Ｆｃ表面上の密度と同一の密度でＣＭ５チップ上に固定されたヒトＩｇＧ１−Ｆｃタンパク質のみを有する参照表面への結合を差し引くことによって得られる。次に、ｐＨ７．４のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液またはｐＨ６．０のＭＥＳ−ＥＰ緩衝液内の様々な濃度のＡ１抗体、Ａ１−ＩｇＧ４抗体、またはＡ３抗体を、表面全体に注入する。表面を、注入サイクルの間に、ｐＨ１．７のグリシン＋０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１０００−５４）で２回再生させる。

【0100】

結果は、Ａ１が、Ａ１−ＩｇＧ４と比較して、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で、低密度の５Ｔ４表面を用いて、ヒト５Ｔ４に対してわずかに高い親和性を有することを示す（それぞれ１．５倍および１．２倍、表１３）。さらに、Ａ１は、Ａ１−ＩｇＧ４と比較して、ｐＨ６．０およびｐＨ７．４の両方で、カニクイザル５Ｔ４に対してわずかに良好な結合を示し（それぞれ１．７倍および１．２倍）、Ａ１およびＡ１−ＩｇＧ４の両方は、カニクイザル５Ｔ４よりも３〜４倍良好にヒト５Ｔ４を結合した（表１３）。

【0101】

【表13】

【0102】

Ａ１抗体およびＡ３抗体を比較すると、Ａ１抗体がｐＨ６．０よりもｐＨ７．４で良好にヒトおよびカニクイザルの５Ｔ４を結合し、一方、Ａ３抗体がｐＨ７．４と比較してｐＨ６．０で増強した結合を示すことが明らかである、表１４。

【0103】

【表14】

【0104】

（実施例７）
５Ｔ４キメラを用いるエピトープマッピング
Ａ１抗体およびＡ３抗体のそれぞれが結合するエピトープを同定するために、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、（１）５Ｔ４細胞外ドメインＦｃ構築物、および（２）ＣＯＳ−１細胞において一時的に発現したヒト／マウス５Ｔ４キメラ構築物を用いて行う。細胞外ドメインは、アミノ末端領域、ロイシンに富んだ２つの反復、および介在する親水性領域を含む。マウスおよびラットの５Ｔ４細胞外ドメインは、その親水性領域内に６つのアミノ酸直接反復を含有する。

【0105】

ヒトＩｇＧ１の５Ｔ４細胞外ドメインおよびＦｃ定常領域を含有する融合タンパク質を、ヒト５Ｔ４（アミノ酸１〜３５５）、マウス５Ｔ４（アミノ酸１〜３６１）、ラット５Ｔ４（アミノ酸１〜３６１）、カニクイザル５Ｔ４（アミノ酸１〜３５５）、チンパンジー５Ｔ４（アミノ酸１〜３５５）、およびオグロマーモセット（アミノ酸１〜３５５）を用いて調製する。ヒト／マウス５Ｔ４キメラ構築物との結合結果を表１５にまとめ、これは、Ａ１抗体およびＡ３抗体による特異的結合、部分的結合、または結合の欠除を示す。

【0106】

表１５は、様々なヒト／マウスキメラに対する抗体の結合能力を示し、命名は、マウス５Ｔ４の内容によって指定されている。結合が観察されない場合、これは、抗体がマウス５Ｔ４を結合しないため、これらの抗体がヒト５Ｔ４を結合する場所を示す。例えば、Ａ３抗体は、最もＮ末端の結合エピトープを有し（８３〜１６３の間）、このことは、残基８３〜１６３がマウス５Ｔ４によって置き換えられている５Ｔ４キメラへの結合の欠除によって示され、したがってＡ３はもはや結合し得ない。これらの結果に基づいて、ヒト化されたＡ１抗体が、アミノ酸残基１７３と２５２との間のヒト５Ｔ４との第１の接触、およびアミノ酸残基２７６と３５５との間のヒト５Ｔ４との第２の接触を有することが決定される。Ａ３抗体は、アミノ酸残基８３から１６３の間のヒト５Ｔ４の第１のロイシンに富んだ反復領域を結合する。アミノ酸残基の番号は、配列番号１１のヒト５Ｔ４抗原のアミノ酸配列に対応する。

【0107】

【表15】

【0108】

（実施例８）
Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣとＡ１−ＩｇＧ４−ＣＭ ＡＤＣとの比較
Ａ１−ｍｃＭＭＡＦを、安全性および有効性の両方について、Ａ１−ＩｇＧ４−ＡｃＢｕｔカリケアマイシン（Ａ１−ＩＧＧ４−ＣＭ）と比較する。Ａ１−４−ＣＭは、リンカーＡｃＢｕｔ［−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸］でカリケアマイシンペイロードにコンジュゲートしたＡ１−ＩｇＧ４抗体で構成される。カリケアマイシンは、細菌ミクロモノスポラ・エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）に由来するエンジイン抗生物質のクラスの強力な抗腫瘍作用物質である。

【0109】

Ａ１ Ａｂ、Ａ１−ＩｇＧ４ Ａｂ、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣ、およびＡ１−ＩｇＧ４−ＣＭ ＡＤＣの細胞結合活性を、いくつかの５Ｔ４陽性細胞系を用いて比較する（実施例２、表５を参照されたい）。データは、類似の結合がＡ１抗体およびＡ１−ＩｇＧ４抗体ならびにＡ１−ｍｃＭＭＡＦ ＡＤＣで観察され、その全てが、全ての試験した５Ｔ４陽性細胞系について、Ａ１−ＩｇＧ４−ＣＭよりも高い平均蛍光強度を有することを示す。

【0110】

Ａ１−ｍｃＭＭＡＦおよびＡ１−ＩｇＧ４−ＣＭを、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４皮下異種移植モデルにおいて並行して試験する。両ＡＤＣは、腫瘍がおよそ２００ｍｍ^３のサイズに達する場合、ｉｖ投与される（Ｑ４ｄｘ２）。３ｍｇ／ｋｇの用量でのＡ１−ＩｇＧ４−ＣＭの抗腫瘍活性は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたＡ１−ｍｃＭＭＡＦの抗腫瘍活性に類似している（表１６）。これらの結果に基づいて、Ａ１−ＩｇＧ４−ＣＭの抗腫瘍活性は、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦよりもおよそ３．３倍強力である。

【0111】

【表16】

【0112】

Ａ１−ｍｃＭＭＡＦの効力よりもＡ１−ＩｇＧ４−ＣＭの効力が３．３倍増強したということはつまり、動物の毒性研究においてＡ１−ＩｇＧ４−ＣＭの安全域よりもＡ１−ｍｃＭＭＡＦの安全域が３．３倍増強したということであると期待され得る。しかし、カニクイザルにおけるＡ１−ＩｇＧ４−ＣＭの安全性プロフィールを見直すと、Ａ１−ＩｇＧ４−ＣＭがカニクイザルにおいてＡ１−ｍｃＭＭＡＦよりも少なくとも１００倍毒性であることが決定される。Ａ１−ＩｇＧ４−ＣＭを０．０３２、０．０９５、および０．３２ｍｇ Ａｂ／ｋｇ／サイクル（２、６、２０μｇのカリケアマイシン／ｋｇ／サイクル）で雄（ｎ＝３）および雌（ｎ＝３）のカニクイザルに投与すると、毒性は各用量レベルで観察される。２サイクル（２回の投与）の後、０．０９５処理群における６頭の動物のうち４頭が、安楽死させられるか、または死亡しているのが発見される。他方、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦで最大１０ｍｇ／ｋｇの投与量では（２４７μｇのｍｃ−ＭＭＡＦ／ｋｇ／サイクル）、２サイクル（２回の投与）の後、同じ４週間の期間にわたり、死亡は観察されない。要約すると、両方とも４週間の観察期間でカニクイザルに２回投与されると、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦの１０ｍｇ／ｋｇ投与量群は安全であるが、Ａ１−ＩｇＧ４−ＣＭの０．０９６ｍｇ／ｋｇ投与量群は毒性であると見なされる。

【0113】

予想外に、これらの結果は、各ＡＤＣの相対的抗腫瘍効力に基づいて期待される３．３倍の安全域ではなく、Ａ１−ＩｇＧ４−ＣＭの安全域に対するＡ１−ｍｃＭＭＡＦの安全域が１０５倍（１０／０．０９５＝１０５）であることを示す。このデータは、同一の抗原標的に対する抗体を利用するが異なる薬剤ペイロードにコンジュゲートしている抗体−薬剤コンジュゲートの、予測不可能な性質を明らかにしている。

【0114】

（実施例９）
Ａ１−ｍｃＭＭＡＦマウスのＰＫ／ＰＤモデリングおよび臨床的用量の予測
ＰＫ／ＰＤモデリングは、細胞系全体にわたって有効な濃度を決定するために、マウス異種移植片研究においてＡ１−ｍｃＭＭＡＦの腫瘍応答を定量するために用いられている。用いられる、トランジットコンパートメント腫瘍死滅ＰＫ／ＰＤモデルは、Ｓｉｍｅｏｎｉらによって以前に記載された（Ｓｉｍｅｏｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６４：１０９４、（２００４））。モデルは、腫瘍の線形の、指数関数的な、およびロジスティックな成長、ならびに薬剤による飽和的死滅を説明するように修正されている。ＰＫ／ＰＤモデルのパラメータには、
ｋ_{ｇ ｅｘ} 指数関数的な成長
ｋ_ｇ ロジスティックな成長
ｗ_０ 最初の腫瘍容積
ｔａｕ 形質導入率
ｋ_ｍａｘ 最大死滅率
ｋＣ_５０ 最大死滅率の半分での濃度
が含まれる。

【0115】

ＰＫ／ＰＤモデリングの結果を用いて、腫瘍増殖抑制濃度（ＴＳＣ、方程式１）を計算する。これは、腫瘍の成長が腫瘍の死亡速度に等しく腫瘍容積が変化しないままである場合の薬剤濃度である。ＴＳＣは、有効性に必要な最小濃度と定義され得る。ＴＳＣは、臨床における有効性に必要なＴＳＣを超える濃度での、臨床的用量の選択に関する指導を提供するために用いられる。

【0116】

Ａ１−ｍｃＭＭＡＦでは、マウスＰＫを個別の研究において決定した（３ｍｇ／ｋｇのＩＶ、雌無胸腺ｎｕ／ｎｕマウス）。マウス異種移植片の研究を、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦを１から３０ｍｇ／ｋｇの間の用量レベルで４日ごとに投与した３つの異なる５Ｔ４細胞系、すなわち細胞系ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４（１、３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇでの投与）、細胞系Ｈ１９７５（１、３、および１０ｍｇ／ｋｇでの投与）、および細胞系３７６２２Ａ（１および１０ｍｇ／ｋｇでの投与）を用いて完了した。ＰＫ／ＰＤモデリングを記載されているように行い、ＴＳＣを表１７において報告する。

【0117】

各異種移植片細胞系についてのマウスＰＫ／ＰＤパラメータをＡ１−ｍｃＭＭＡＦの予測されたヒトＰＫと組み合わせて、臨床における有効性に必要な用量をシミュレートした。この方法論を用いて、Ａ１−ｍｃＭＭＡＦは、約０．２２から約２．３ｍｇ／ｋｇ Ｑ３週間［３週間ごと］の予測最小有効臨床的用量を有する（表１７）。

【0118】

本発明の一実施形態において、用量範囲は、Ｑ３週間での投与で、約０．１８ｍｇ／ｋｇから約２．７ｍｇ／ｋｇ、約０．２２ｍｇ／ｋｇから約２．６ｍｇ／ｋｇ、約０．２７ｍｇ／ｋｇから約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．３２ｍｇ／ｋｇから約２．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３７ｍｇ／ｋｇから約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４２ｍｇ／ｋｇから約２．１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４７ｍｇ／ｋｇから約２．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５２ｍｇ／ｋｇから約２．００ｍｇ／ｋｇ、約０．５７ｍｇ／ｋｇから約１．９５ｍｇ／ｋｇ、約０．６２ｍｇ／ｋｇから約１．９０ｍｇ／ｋｇ、約０．６７ｍｇ／ｋｇから約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．７２ｍｇ／ｋｇから約１．８０ｍｇ／ｋｇ、約０．８２ｍｇ／ｋｇから約１．７０ｍｇ／ｋｇ、約０．９２ｍｇ／ｋｇから約１．６０ｍｇ／ｋｇ、約１．０２ｍｇ／ｋｇから約１．５０ｍｇ／ｋｇ、約１．１２ｍｇ／ｋｇから約１．４０ｍｇ／ｋｇ、または約１．２０ｍｇ／ｋｇから約１．３０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。好ましくは、用量範囲は、約０．２２ｍｇ／ｋｇから約２．３ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。

【0119】

【数2】

【0120】

【表17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]