特許 6334401 ラテックス凝集阻害免疫法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6334401

(24)【登録日】2018年5月11日

(45)【発行日】2018年5月30日

(54)【発明の名称】ラテックス凝集阻害免疫法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20180521BHJP

   G01N 33/545 20060101ALI20180521BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20180521BHJP

   C08L 101/00 20060101ALI20180521BHJP

   C08L 71/02 20060101ALI20180521BHJP

   C08L 79/02 20060101ALI20180521BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/543 581J

   G01N33/543 583

   G01N33/545 B

   G01N33/53 G

   C08L101/00

   C08L71/02

   C08L79/02

【請求項の数】4

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2014-528199(P2014-528199)

(86)(22)【出願日】2013年7月31日

(86)【国際出願番号】JP2013070775

(87)【国際公開番号】WO2014021387

(87)【国際公開日】20140206

【審査請求日】2016年6月13日

(31)【優先権主張番号】特願2012-170603(P2012-170603)

(32)【優先日】2012年7月31日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】390037327

【氏名又は名称】積水メディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】服部 恵子

(72)【発明者】

【氏名】北野 壮一

(72)【発明者】

【氏名】川本 道子

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−１２１２０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０３８９０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５０２９７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６２−０７１８６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１０−５０６１８４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ０８Ｌ ７１／０２

Ｃ０８Ｌ ７９／０２

Ｃ０８Ｌ １０１／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）で表されるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重体、式(II）で表されるポリオキシエチレンアルキルエーテル、式（III）で表されるポリオキシエチレン脂肪酸エステル、及び多価第四級アミン高分子化合物からなる群より選ばれる一種以上の化合物の存在下にラテックス凝集阻害測定法を行うことを特徴とする、ラテックス凝集阻害法における非特異的反応を回避する方法であって、
非特異的反応が、血液試料中に被検物質が存在しないときに、血清成分の存在により、本来生じるべき凝集が生じないという非特異反応である、前記方法。
ＨＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_a−（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）_b−（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_cＨ （Ｉ）
（式中、ａ，ｂ，ｃは任意の整数を表し、ａ＋ｃは４〜２００単位の平均重合度の酸化エ
チレンとなるよう決定され、かつｂは５〜１００単位の平均重合度の酸化プロピレンとな
るよう決定される）

Ｒ¹Ｏ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＨ （II）
（式中、Ｒ¹は炭素数８〜２０のアルキル基（当該アルキル基は、第１級、第２級のいず
れであってもよく、アルキル基中に二重結合を有していてもよい）を表し、ｎは７〜４０
の任意の整数を表す。）

Ｒ²ＣＯＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＲ³ （III）
（式中、Ｒ²は炭素数１６〜１８のアルキル基（当該アルキル基は、二重結合を有してい
てもよい）を表し、ｎは１７０〜１８０の任意の整数を表し、Ｒ³は水素原子を表すかま
たはＲ²ＣＯＯ基を表す。）

【請求項2】

多価第四級アミン高分子化合物が、ポリブレン（ＣＡＳ番号：28728-55-4）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

血液試料の測定に用いられるラテックス凝集阻害測定法用の試薬であって、式（Ｉ）で表されるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重体、式(II）で表されるポリオキシエチレンアルキルエーテル、式（III）で表されるポリオキシエチレン脂肪酸エステル、及び多価第四級アミン高分子化合物からなる群より選ばれる一種以上の化合物を以下（１）〜（４）のいずれか一つ以上に含有することを特徴とする試薬。
（１）濃度換算用標準物質
（２）抗被検物質抗体を含む溶液
（３）抗原が固定化されたラテックス粒子を含む溶液
（４）濃度換算用標準物質を溶解または希釈するための溶液
ＨＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_a−（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）_b−（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_cＨ （Ｉ）
（式中、ａ，ｂ，ｃは任意の整数を表し、ａ＋ｃは４〜２００単位の平均重合度の酸化エ
チレンとなるよう決定され、かつｂは５〜１００単位の平均重合度の酸化プロピレンとな
るよう決定される）

Ｒ¹Ｏ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＨ （II）
（式中、Ｒ¹は炭素数８〜２０のアルキル基（当該アルキル基は、第１級、第２級のいず
れであってもよく、アルキル基中に二重結合を有していてもよい）を表し、ｎは７〜４０
の任意の整数を表す。）

Ｒ²ＣＯＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＲ³ （III）
（式中、Ｒ²は炭素数１６〜１８のアルキル基（当該アルキル基は、二重結合を有してい
てもよい）を表し、ｎは１７０〜１８０の任意の整数を表し、Ｒ³は水素原子を表すかま
たはＲ²ＣＯＯ基を表す。）

【請求項4】

ヒト血液試料中のテイコプラニン測定に用いるものである請求項３に記載の試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液試料中の何らかの成分により生じる、ラテックス免疫凝集測定法における非特異的な反応の回避方法、及び当該回避方法に用いられる試薬に関する。

【背景技術】

【0002】

ラテックス免疫凝集測定法（以下、ＬＴＩＡということがある）は、抗原あるいは抗体を固定化したラテックス粒子を用いて、被検物質を測定する方法であり、臨床検査の分野で広く使用されている。ＬＴＩＡにより被検物質である抗原を測定する方法としては、被検物質に対する抗体を固定化したラテックス粒子と、被検物質である抗原とを反応させ、サンドイッチ型の免疫複合体を形成させ、免疫複合体形成に伴う当該ラテックス粒子の凝集の程度から被検物質（抗原）を測定する方法（以下、サンドイッチＬＴＩＡということがある）と、抗原を固定化したラテックス粒子と被検試料中の抗原（被検物質）とを競合させて、当該ラテックス粒子と抗体との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から被検物質（抗原）を測定する方法（以下、凝集阻害ＬＴＩＡということがある）に大別することができる。

【0003】

ＬＴＩＡにおいては、血清などの被検試料中に被検物質が存在していないにもかかわらず、被検試料中に含まれる何らかの成分により抗原あるいは抗体を固定化したラテックス粒子に生じるべきでない凝集が生じたり、あるいは生じるべき凝集が生じなかったりすることがしばしば発生する。これらは非特異的反応と呼ばれ、様々な測定誤差の原因となることが知られている。

【0004】

非特異的反応の回避方法として、反応系に様々な物質を添加する方法が知られている。
特許文献１には、サンドイッチＬＴＩＡにおける非特異性混濁（非特異的凝集と同義）を除去する方法として、無機ホウ素化合物を緩衝系と組み合わせて試料溶液に添加する方法が記載されている。しかしながら当該方法は、抗体を固定化したラテックス粒子を使用する測定する方法において生じるべきでない凝集が生じることを除去する方法であって、凝集阻害ＬＴＩＡにおいて、生じるべき凝集が生じないことに対応できる方法ではない。

【0005】

凝集阻害ＬＴＩＡで血液試料を測定する場合、血液試料中の何らかの成分の影響により、被検物質を含まない血液試料であるにもかかわらず、血液成分を全く含まない緩衝液を被検試料として測定した際に得られる凝集度よりも低い凝集度しか得られない場合がある。また、被検試料中の被検物質の濃度換算用の標準物質（以下、濃度換算用標準物質ということがある）を緩衝液で希釈した場合と血液成分を含む緩衝液で希釈した場合とで、凝集度（吸光度）が一致せずに乖離することがある。しかしながら上記のように、現在においても、凝集阻害ＬＴＩＡにおいて、生じるべき凝集が生じないという非特異的反応を回避できる方法は確立しておらず、新たな方法の開発が必要であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開昭６４−０４４８５５公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、凝集阻害ＬＴＩＡにおいて、生じるべき凝集が生じないという非特異的反応を回避できる方法の提供を課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、凝集阻害ＬＴＩＡにおける上記課題を解決するため、鋭意検討を行ったところ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体（以下、ＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重体ということがある）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥアルキルエーテルということがある）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（以下、ＰＯＥ脂肪酸エステルということがある）、多価第四級アミン高分子化合物からなる群より選ばれる一種以上の非特異的反応回避化合物を、濃度換算用標準物質を希釈するための緩衝液中に添加しておくと、当該緩衝液それ自体を被検試料として測定した場合に得られる凝集度と、被検物質を含まない血液試料を測定した場合の凝集度との差を縮小させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0009】

本発明は、以下の構成を有する。
＜１＞ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、多価第四級アミン高分子化合物からなる群より選ばれる一種以上の化合物の存在下にラテックス凝集阻害測定法を行うことを特徴とする、ラテックス凝集阻害法における非特異的反応を回避する方法。
＜２＞非特異的反応が、被検試料中に被検物質が存在しないときに、生じるべき凝集が生じないという非特異的反応である、＜１＞の方法。
＜３＞ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重体が、式（Ｉ）で表されるものである、＜１＞または＜２＞の方法。
ＨＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_a−（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）_b−（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_cＨ （Ｉ）
（式中、ａ，ｂ，ｃは任意の整数を表し、ａ＋ｃは４〜２００単位の平均重合度の酸化エチレンとなるよう決定され、かつｂは５〜１００単位の平均重合度の酸化プロピレンとなるよう決定される）
＜４＞ポリオキシエチレンアルキルエーテルが、式（II）で表されるものである、＜１＞または＜２＞の方法。
Ｒ¹Ｏ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＨ （II）
（式中、Ｒ¹は炭素数８〜２０のアルキル基（当該アルキル基は、第１級、第２級のいずれであってもよく、アルキル基中に二重結合を一つ以上有していてもよい）を表し、ｎは７〜４０の任意の整数を表す。）
＜５＞ポリオキシエチレン脂肪酸エステルが、式（III）で表されるものである、＜１＞または＜２＞の方法。
Ｒ²ＣＯＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＲ³ （III）
（式中、Ｒ²は炭素数１６〜１８のアルキル基（当該アルキル基は、二重結合を一つ以上有していてもよい）を表し、ｎは１７０〜１８０の任意の整数を表し、Ｒ³は水素原子を表すかまたはＲ²ＣＯＯ基を表す。）
＜６＞多価第四級アミン高分子化合物が、ポリブレン（ＣＡＳ番号：ＣＢ１３２７３１７）である、＜１＞または＜２＞の方法。
＜７＞ラテックス凝集阻害法用の試薬であって、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、多価第四級アミン高分子化合物からなる群より選ばれる一種以上の化合物を以下（１）〜（４）のいずれか一つ以上に含有することを特徴とする試薬。
（１）濃度換算用標準物質
（２）抗被検物質抗体を含む溶液
（３）抗原が固定化されたラテックス粒子を含む溶液
（４）濃度換算用標準物質を溶解または希釈するための溶液
＜８＞ヒト血液試料中のテイコプラニン測定に用いるものである、＜７＞の試薬。
＜９＞ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、多価第四級アミン高分子化合物からなる群より選ばれる一種以上の化合物を有効成分とするラテックス凝集阻害法用非特異的反応回避剤。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、凝集阻害ＬＴＩＡにおいて、生じるべき凝集が生じないという非特異的反応を回避できる方法が提供される。本発明により、凝集阻害ＬＴＩＡによる血液試料中の被検物質の正確な測定が可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】濃度換算用標準物質をヒト血清成分を全く含まない緩衝液で希釈した場合の検量線（×）、被検物質を添加したヒト血清をヒト血清成分を全く含まない緩衝液で希釈した場合の検量線（○）及び被検物質を添加したヒト血清を被検物質を添加していないヒト血清で希釈した場合の検量線（▲）である。

【図2】本発明の非特異的反応回避化合物を含む濃度換算用標準物質希釈液の組成を検討した結果の図である。

【図3】濃度換算用標準物質を本発明の濃度換算用標準物質希釈液で希釈した場合の検量線（×）、及び被検物質を添加したヒト血清を被検物質を添加していないヒト血清で希釈した場合の検量線（▲）である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

（非特異的反応回避化合物）
本発明の非特異的反応回避化合物としては、ＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重体、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、多価第四級アミン高分子化合物からなる群より選ばれる一種以上の化合物が挙げられる。

【0013】

本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体（ＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重体）は、下記式（Ｉ）に示す構造を有する。
［化１］
ＨＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_a−（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）_b−（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_cＨ （Ｉ）
（式中、ａ，ｂ，ｃは任意の整数を表し、ａ＋ｃは４〜２００単位の平均重合度の酸化エチレン（以下、ＥＯと表記することがある）となるよう決定され、かつｂは５〜１００単位の平均重合度の酸化プロピレン（以下、ＰＯと表記することがある）となるよう決定される）
本発明において使用するＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重体を含有する市販品の具体的な例としては、一般に「プルロニック（登録商標）」の名称で販売されている非イオン性界面活性剤のうち「Ｆ」で括られる製品、または「エパン（登録商標）」の名称で販売されている非イオン界面活性剤を挙げることができる。
なお、ＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重合体の成分としての表記は数種類存在し、各表記間で相互に同一性、類似性を確認できるが、同一名称の市販品であっても各表記間での数値が完全に一致しない場合がある。これらは重合性高分子に特有のものであり当業者は当然に理解しうる。

【0014】

より具体的な市販品の例を、確認できる成分としての表記（１），（２）とともに挙げる。
プルロニックＦ７７：
（１）ポリオキシエチレン含量７０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２３０６
（２）ＥＯ数−ＰＯ数：（５２ｘ２）−３５
プルロニックＦ８７：
（１）ポリオキシエチレン含量７０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２６４４
（２）ＥＯ数−ＰＯ数：（６２ｘ２）−３９
プルロニックＦ８８：
（１）ポリオキシエチレン含量８０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２６４４
（２）ＥＯ数−ＰＯ数：（９７ｘ２）−３９
プルロニックＦ６８：
（１）ポリオキシエチレン含量８０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ１９６７
（２）ＥＯ数−ＰＯ数：（７５ｘ２）−３０
エパン４８５
（１）ポリオキシエチレン含量８５％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ１２００
（２）ＥＯ数−ＰＯ数：（８０ｘ２）−２１
エパン６８０
（１）ポリオキシエチレン含量８０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ１７５０
（２）ＥＯ数−ＰＯ数：（８４ｘ２）−３０
エパン７８５
（１）ポリオキシエチレン含量８５％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２０００
（２）ＥＯ数−ＰＯ数：（１４０ｘ２）−３４
エパン７５０
（１）ポリオキシエチレン含量５０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２０００
（２）ＥＯ−ＰＯ数：（２３ｘ２）−３４
これらのうち、プルロニックＦ８８およびプルロニックＦ６８は、医薬部外品原料規格２００６にも収載されている。

【0015】

本発明のポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＰＯＥアルキルエーテル）は、下記式（II）に示す構造を有する。
［化２］
Ｒ¹Ｏ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＨ （II）
（式中、Ｒ¹は炭素数８〜２０のアルキル基（当該アルキル基は、第１級、第２級のいずれであってもよく、アルキル基中に二重結合を一つ以上有していてもよい）を表し、ｎは７〜４０の任意の整数を表す。）
本発明において使用するＰＯＥアルキルエーテルを含有する市販品の具体的な例としては、一般に「ＮＩＫＫＯＬ（登録商標）」の名称で販売されている非イオン性界面活性剤のうち「ＢＴ」、「ＢＣ」あるいは「ＢＯ」で括られる製品を挙げることができる。
より具体的な市販品の例を、確認できる成分としての表記（３）、（４）とともに挙げる。
ニッコールＢＣ４０ＴＸ：
（３）ポリオキシエチレンセチルエーテル
（４）Ｒ¹：炭素数１６、ｎ：４０
ニッコールＢＯ１０ＴＸ：
（３）ポリオキシエチレンオレイルエーエル
（４）Ｒ¹：炭素数１８、ｎ：１０
ニッコールＢＴ−７：
（３）ポリオキシエチレンアルキルエーテル
（４）Ｒ¹：炭素数１２〜１４（２級アルキル）、ｎ：７
ニッコールＢＴ−９：
（３）ポリオキシエチレンアルキルエーテル
（４）Ｒ¹：炭素数１２〜１４（２級アルキル）、ｎ：９

【0016】

本発明のポリオキシエチレン脂肪酸エステル（ＰＯＥ脂肪酸エステル）は、下記式（III）に示す構造を有する。
Ｒ²ＣＯＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_nＲ³ （III）
（式中、Ｒ²は炭素数１６〜１８のアルキル基（当該アルキル基は、二重結合を有していてもよい）を表し、ｎは１７０〜１８０の任意の整数を表し、Ｒ³は水素原子を表すかまたはＲ²ＣＯＯ基を表す。）
本発明において使用するＰＯＥ脂肪酸エステルを含有する市販品の具体的な例としては、一般に「ノイゲン（登録商標）」の名称で販売されている非イオン性界面活性剤のうち「ＤＳ」で括られる製品を挙げることができる。
より具体的な市販品の例を、確認できる成分としての表記（５）、（６）とともに挙げる。
ノイゲンＤＳ−６０１：
（５）ポリオキシエチレンジステアリン酸エステル
（６）Ｒ¹：炭素数１７、ｎ：１７５

【0017】

多価第四級アミン高分子化合物としては、ポリブレン（ＣＡＳ番号：ＣＢ１３２７３１７）が挙げられる。

【0018】

これらのうち、プルロニックＦ８８、ニッコールＢＴ―７、ニッコールＢＴ−９が好適である。

【0019】

本発明の非特異的反応回避化合物は、濃度換算用標準物質（いわゆるキャリブレータ）、抗被検物質抗体を含む溶液、抗原が固定化されたラテックス粒子を含む溶液、濃度換算用標準物質を溶解または希釈するための溶液など、凝集阻害ＬＴＩＡを行うための試薬の一以上に添加して使用することができる。なかでも濃度換算用標準物質に添加することが好ましい。

【0020】

非特異的反応回避化合物の好ましい濃度は、濃度換算用標準物質、抗被検物質抗体、抗原が固定化されたラテックス粒子の３成分が反応系中に共存した状態での濃度（反応系中での終濃度）として０．００３〜０．０７８％（ｖ/ｖ、以下同じ）、さらに好ましくは０．００６〜０．０３４％、特に好ましくは０．００７〜０．０２４％である。

【0021】

本発明の非特異的反応回避化合物は、本発明の効果に影響を与えないこと、製剤としての性能が担保できることを限度として、ＬＴＩＡで通常使用される緩衝液、タンパク質、塩類、防腐剤などと混合して使用することができる。

【0022】

（緩衝液）
緩衝液としては、例えば、中性ｐＨ付近、好ましくはｐＨ６．５〜７．８、より好ましくはｐＨ６．８〜７．５に緩衝作用を有する緩衝液（リン酸緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、及び複数の緩衝剤を組み合わせた広域緩衝液など）が好適である。これらの緩衝液中の緩衝剤の濃度としては、０．１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは１ｍＭ〜８００ｍＭ、特に好ましくは５ｍＭ〜５００ｍＭである。
なお、製剤としての性能担保の観点から、例えば、抗原が後述実施例のテイコプラニンである場合には、テイコプラニンの保存安定性に望ましくない影響をあたえるので、分子内にアミン構造を有する緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）の使用は好適ではない。本発明の非特異的反応回避化合物以外の成分は、被検物質それぞれの特性を考慮して、実験などにより選択することができる。

【0023】

（タンパク質）
タンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびカゼインなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらは、抗体や抗原が固定化されたラテックス粒子の保存安定性向上のため、あるいは、血液試料が反応系に持ち込むタンパク成分の濃度と近似させ反応環境をそろえるためなどの目的で使用されている。

【0024】

（塩類）
塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどが挙げられるがこれらに限定されない。

【0025】

（防腐剤）
防腐剤としては、オフロキサシンなどの抗菌剤や、アジ化ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0026】

（測定方法）
本発明の非特異的反応回避化合物を用いる凝集阻害ＬＴＩＡの測定方法としては、被検試料中の被検物質の濃度に応じて抗原が固定化されたラテックス粒子の凝集度が減少するラテックス競合法を使用することができ、生じた凝集の程度を光学的あるいは電気化学的に観察することにより被検物質を測定できる。光学的に観察する方法としては、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を光学機器で測定する方法が挙げられる。

【0027】

（被検試料・被検物質）
本発明の非特異的反応回避化合物を用いたラテックス凝集阻害測定法が測定対象とする被検試料は、血清、血漿などの血液試料である。被検試料中の被検物質（検出対象）としては、ペプチド抗原、ハプテンといった低分子抗原が挙げられ、例えば、テイコプラニン、アルベカシン、バンコマイシンのようなペプチド系抗生物質、オフロキサシンのような合成抗菌剤、卵白や豆類由来のアレルゲンなど、競合免疫測定法に好適な被検物質が挙げられる。これらのなかでもテイコプラニンが好適である。

【0028】

（抗体）
本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。本発明の抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能であり、一般的な動物（マウス、ヤギ、ヒツジなど）への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものやキメラ抗体を用いることも可能である。抗体の機能性断片としては抗原抗体反応活性を有する断片であるＦ（ａｂ'）₂、Ｆａｂ'などが挙げられる。これらの抗体の機能性断片は前記のようにして得られた抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。また、これらの抗体は、ラテックス粒子に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。

【0029】

（ラテックス粒子）
本発明に用いるラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックス粒子の平均粒径は、被検物質の被検試料中での濃度あるいは測定機器の検出感度などを考慮し、０．１μｍ〜０．４μｍのものが適宜選択される。

【0030】

（抗原を固定化したラテックス粒子）
本発明に用いる抗原を固定化したラテックス粒子における抗原の固定化方法は、固定化しようとする抗原の特性に応じて物理吸着（疎水結合）法、化学結合法のいずれかを適宜選択することができる。物理吸着（疎水結合）法においては、ポリハプテンを形成させて吸着させる方法、化学結合法においてはマレイミド基などの結合性の官能基を抗原に導入したり、抗原が糖を有する場合にはこれを利用してラテックス粒子表面の結合性の官能基に結合させ固定化することができる。

【0031】

（凝集阻害ＬＴＩＡ用試薬）
本発明の非特異的反応回避化合物を含有する凝集阻害ＬＴＩＡ用試薬は、通常使用される以下の形態のいずれか一以上で提供することができるが、これに限定されない。
（１）濃度換算用標準物質（キャリブレータなどの名称で呼ばれる場合がある）
（２）被検物質に対する抗体を含む溶液（抗体液、第一試液などの名称で呼ばれる場合がある）
（３）抗原が固定化されたラテックス粒子溶液（ラテックス試液、第二試液などの名称で呼ばれる場合がある）
（４）濃度換算用標準物質を溶解または希釈するための溶液（キャリブレータ希釈液などの名称で呼ばれる場合がある）
このうち、（１）濃度換算用標準物質に、本発明の非特異的反応回避化合物を含有させる場合には、本発明の非特異的反応回避化合物を含有させたのち、これを溶液のまま提供しても、あるいは凍結乾燥などの手段により固形化して提供してもよい。また、本発明の非特異的反応回避化合物を含有しない状態で提供し、使用時に本発明の非特異的反応回避化合物を含有する緩衝液等で復元あるいは希釈して使用できるように提供してもよい。前記本発明の非特異的反応回避化合物を含有する緩衝液等は、濃度換算用標準物質（キャリブレータ）希釈液、検体希釈液等の名称で提供される場合もあり、前記（４）の形態に相当する。
（２）被検物質に対する抗体を含む溶液あるいは（３）抗原が固定化されたラテックス粒子溶液に、本発明の非特異的反応回避化合物を含有させる場合には、本発明の非特異的反応回避化合物を含有させた溶液として提供することができる。
上記（１）〜（４）は、凝集阻害ＬＴＩＡを実施する際に、一連で使用されるものであれば、それぞれが独立して提供されても、キットなどのように一括提供されても構わない。

【実施例】

【0032】

＜比較例１＞ 濃度換算用標準物質を、ヒト血清成分を全く含まない緩衝液で希釈した場合の検量線と、被検物質を含まないヒト血清で希釈した場合の検量線の比較
１．試薬
（１）テイコプラニン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
（２）テイコプラニン非投与ヒトから得た血清（１００名のプール血清。以下、ベース血清という）
（３）濃度換算用標準物質希釈液（以下、標準物質希釈液という）：５％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．００２％ オフロキサシン
ＰＢＳ錠剤（ＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ ＰＢＳ ＴＡＢＬＥＴＳ（−）（ＤＳファーマバイオメディカル社製））１錠、ＢＳＡ（Ｐｒｏｂｕｍｉｎ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄｅ （ｋ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製））５ｇおよびオフロキサシン２ｍｇを水で１００ｍＬにメスアップし、標準物質希釈液を調製した。
なお、ＰＢＳ錠剤を１００ｍＬの溶液とした場合の組成は以下である。
８００ｍｇＮａＣｌ、２０ｍｇＫＣｌ、１１５ｍｇリン酸一水素ナトリウム（無水）、リン酸二水素カリウム（無水）
（４）抗テイコプラニン抗体液（２．８ｍｇ／ｍＬ抗テイコプラニンヒツジポリクローナル抗体及び０．５％ＢＳＡ含有。ｐＨ７．０。以下、抗体液という）
（５）テイコプラニン感作ラテックス試液（ｐＨ７．２．以下、ラテックス試液という）
２．方法
テイコプラニンを標準物質希釈液で０、５、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬになるように希釈し、キャリブレータとした。また、１１０μｇ／ｍＬとなるようテイコプラニンを添加したベース血清を、テイコプラニン非添加のベース血清または標準物質希釈液で１０段階（０、１１、２２、３３、４４、５５、６６、７７、８８、９９、１１０μｇ／ｍＬ）に希釈し、それぞれ模擬検体溶液１、模擬検体溶液２とした。２．４μＬのキャリブレータ、模擬検体溶液１あるいは模擬検体溶液２と、１８０μＬの抗テイコプラニン抗体液を混合し、３７℃、５分混和した。続いて、６０μＬのラテックス試液を混合し、３７℃、１分後（吸光度Ｉ）、１分２０秒後（吸光度II）、３分後（吸光度III）、３分２０秒後（吸光度IV）に、それぞれ７００ｎｍの吸光度を測定した。（吸光度IIと吸光度Ｉの平均値）と（吸光度IVと吸光度IIIの平均値）の差を求め、吸光度変化量（以下、ｄａｂｓという）とした。
３．結果
結果を図１に示す。テイコプラニン非添加のベース血清で希釈した模擬検体溶液１（▲）では、ベース血清それ自体（テイコプラニン濃度０μｇ／ｍＬ）のｄａｂｓが、テイコプラニン濃度０μｇ／ｍＬのキャリブレータ（標準物質希釈液それ自体）のｄａｂｓよりも低く、また１１〜１１０μｇ／ｍＬの濃度範囲でのキャリブレータ（×）および模擬検体溶液２（○）のｄａｂｓと比較して、いずれも低いｄａｂｓとなり、何らかの血清成分による非特異的反応が疑われた。

【0033】

＜実施例１＞ 非特異的反応回避化合物の探索検討
１．試薬
（１）テイコプラニン非投与ヒトから得た血清（ベース血清）
（２）抗テイコプラニン抗体液（抗体液）
（３）テイコプラニン感作ラテックス試液（ラテックス試液）
以上（１）〜（３）は比較例１と同様のものを使用した。
（４）１０％ＢＳＡ−２×ＰＢＳ（ｐＨ７．０）
ＰＢＳ錠剤１錠とＢＳＡ５ｇを水で５０ｍｌにメスアップし、１０％ＢＳＡ−２×ＰＢＳとした。
（５）探索した化合物
表１に示した。
（ａ）ブロッキングＮ１０１、Ｎ１０２（ともに日油社製）。合成ポリマーを主成分とする免疫学的測定用ブロッキング試薬である。
（ｂ）エパン７５０（ＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重合体。第一工業製薬社製）
（１）ポリオキシエチレン含量５０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ２０００
（２）ＥＯ数−ＰＯ数：（２３ｘ２）−３４
（ｃ）プルロニックＬ３４（ＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重合体。ＡＤＥＫＡ社製）
（１）ポリオキシエチレン含量４０％、ポリオキシプロピレンの分子量およそ８７０
（２）ＥＯ数−ＰＯ数：（７ｘ２）−１５
（ｄ）プルロニックＦ６８（ＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重合体。ＡＤＥＫＡ社製）
（ｅ）ノイゲンＤＳ６０１（ＰＯＥ脂肪酸エステル。第一工業製薬社製）
（ｆ）ニッコールＢＣ４０ＴＸ（ＰＯＥアルキルエーテル。日光ケミカルズ社製）
（ｇ）ニッコールＢＯ−１０ＴＸ（ＰＯＥアルキルエーテル。日光ケミカルズ社製）
（ｈ）ニッコールＢＴ−７（ＰＯＥアルキルエーテル。日光ケミカルズ社製）
（ｉ）ニッコールＢＴ−９（ＰＯＥアルキルエーテル。日光ケミカルズ社製）
（ｊ）ＰＥＧ６０００（Ｈ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨ 平均分子量：７３００〜９３００、和光純薬社製）
（ｋ）マンニトール（キシダ化学社製）
（ｌ）ポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
（ｍ）ヘパリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
２．方法
２．４μＬのベース血清あるいは１０％ＢＳＡ−２×ＰＢＳと、表１中に記載の終濃度の２倍濃度に調製した探索した化合物を容量比１：１で混合した溶液（試験溶液１）を、１８０μＬの抗体液と混合し、３７℃、５分混和した。続いて、６０μＬのラテックス試液を混合し、３７℃、１分後（吸光度Ｉ）、１分２０秒後（吸光度II）、３分後（吸光度III）、３分２０秒後（吸光度IV）にそれぞれ７００ｎｍの吸光度を測定した。（吸光度IIと吸光度Ｉの平均値）と（吸光度IVと吸光度IIIの平均値）の差を求め、ｄａｂｓとした。下記式（Ａ）で差がマイナスとなる場合を効果ありと判定した。
（ベース血清のｄａｂｓ）−（試験溶液１のｄａｂｓ）・・・式（Ａ）
なお、非特異的反応回避化合物の代わりに精製水を添加した物をコントロールとした。
３．結果
プルロニックＦ６８、ノイゲンＤＳ６０１、ニッコールＢＣ４０ＴＸ、ニッコールＢＯ−１０ＴＸ、ニッコールＢＴ−７、ニッコールＢＴ−９で効果ありと判定し、非特異的反応回避化合物とした。またベース血清との差から、エパン７５０とポリブレンも非特異的反応回避化合物候補とした。

【0034】

【表1】

注：表１に記載の終濃度中、「１／２」の記載は、市販品原液を１とした場合の希釈度（２倍希釈）を表している。

【0035】

＜実施例２＞ 非特異的反応回避化合物（候補）の有効濃度範囲の検討−１
実施例１の結果から絞込んだ非特異的反応回避化合物候補について、有効な濃度範囲を検討した。
１．試薬
（１）テイコプラニン非投与ヒトから得た血清（ベース血清）
（２）抗テイコプラニン抗体液（抗体液）
（３）テイコプラニン感作ラテックス試液（ラテックス試液）
以上（１）〜（３）は比較例１と同様のものを使用した。
（４）１０％ＢＳＡ−２×ＰＢＳ（ｐＨ７．０）
（５）非特異的反応回避化合物（候補）
表２に示した。
（ａ）エパン４８５（ＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重合体。第一工業製薬社製）
（ｂ）プルロニックＦ６８
（ｃ）プルロニックＦ８８
（ｄ）ノイゲンＤＳ６０１
（ｅ）ニッコールＢＴ−７
（ｆ）ニッコールＢＴ−９
（ｇ）ポリブレン
２．方法
２．４μＬのベース血清あるいは１０％ＢＳＡ−２×ＰＢＳと、表２中に記載の終濃度の２倍濃度に調製した添加化合物を１：１で混合した溶液（試験溶液２）を１８０μＬの抗体液と混合し、３７℃、５分混和した。続いて、６０μＬのラテックス試液を混合し、３７℃、１分後（吸光度Ｉ）、１分２０秒後（吸光度II）、３分後（吸光度III）、３分２０秒後（吸光度IV）にそれぞれ７００ｎｍの吸光度を測定した。（吸光度IIと吸光度Ｉの平均値）と（吸光度IVと吸光度IIIの平均値）の差を求め、ｄａｂｓとした。下記式（Ｂ）で比が９５％〜１０５％となる場合を効果ありと判定した。
（ベースの血清のｄａｂｓ）／（試験溶液２のｄａｂｓ）・・・式（Ｂ）
３．結果
プルロニックＦ６８、プルロニックＦ８８、ノイゲンＤＳ６０１、ニッコールＢＴ−７、ニッコールＢＴ−９、ポリブレンで効果ありと判定した。また、エパン４８５についても、終濃度を上げることで効果があることが推測された。以上より、これらを非特異的反応回避化合物と判断した。

【0036】

【表2】

注：空欄は試験を実施しなかった。

【0037】

＜実施例３＞ 非特異的反応回避化合物の濃度範囲の検討−２
１．試薬
（１）テイコプラニン非投与ヒトから得た血清（ベース血清）
（２）抗テイコプラニン抗体液（抗体液）
（３）テイコプラニン感作ラテックス試液（ラテックス試液）
以上（１）〜（３）は比較例１、２と同様のものを使用した。
（４）１０％ＢＳＡ−２×ＰＢＳ（ｐＨ７．０）
（５）非特異的反応回避化合物
（ａ）プルロニックＦ８８
（ｂ）ニッコールＢＴ−９
２．方法
２．４μＬのベース血清ならびに１０％ＢＳＡ−２×ＰＢＳと、表３中に記載の終濃度の２倍濃度に調製した添加化合物を１：１で混合した溶液（試験溶液３）を１８０μＬの抗体液と混合し、３７℃、５分混和した。続いて、６０μＬのラテックス試液を混合し、３７℃、１分後（吸光度Ｉ）、１分２０秒後（吸光度II）、３分後（吸光度III）、３分２０秒後（吸光度IV）にそれぞれ７００ｎｍの吸光度を測定した。（吸光度IIと吸光度Ｉの平均値）と（吸光度IVと吸光度IIIの平均値）の差を求め、ｄａｂｓとした。
下記式（Ｃ）で比が最も小さくなる濃度を単回帰分析から算出した。
（ベース血清のｄａｂｓ）／（試験溶液３のｄａｂｓ）・・・式（Ｃ）
３．結果
プルロニックＦ８８は、１．７５％で、ベース血清との差が最も小さくなった。ニッコールＢＴ−９では、２．５％でベース血清との差が最も小さくなった。

【0038】

【表3】

【0039】

＜参考例１＞ バッファー組成の検討
１．試薬
（１）テイコプラニン非投与ヒトから得た血清（ベース血清）
（２）抗テイコプラニン抗体液（抗体液）
（３）テイコプラニン感作ラテックス試液（ラテックス試液）
以上（１）〜（３）は比較例１、２と同様のものを使用した。
（４）非特異的反応回避化合物
プルロニックＦ８８
２．方法
以下の６通りの試験溶液４を調製した。
・ＢＳＡ０％、ＰＢ−
１．７５ｇの塩化ナトリウム、０．７ｇのプルロニックＦ８８、２ｍｇのオフロキサシンを秤量し１００ｍＬにメスアップした。
・ＢＳＡ５％、ＰＢ−
１．７５ｇの塩化ナトリウム、０．７ｇのプルロニックＦ８８、５ｇのＢＳＡ、２ｍｇのオフロキサシンを秤量し１００ｍＬにメスアップした。
・ＢＳＡ１０％、ＰＢ−
１．７５ｇの塩化ナトリウム、０．７ｇのプルロニックＦ８８、１０ｇのＢＳＡ、２ｍｇのオフロキサシンを秤量し１００ｍＬにメスアップした。
・ＢＳＡ０％、ＰＢ＋
ＰＢＳ錠剤１錠、０．７ｇのプルロニックＦ８８、２ｍｇのオフロキサシンを秤量し１００ｍＬにメスアップした。
・ＢＳＡ５％、ＰＢ＋
ＰＢＳ錠剤１錠、０．７ｇのプルロニックＦ８８、５ｇのＢＳＡ、２ｍｇのオフロキサシンを秤量し１００ｍＬにメスアップした。
・ＢＳＡ１０％、ＰＢ＋
ＰＢＳ錠剤１錠、０．７ｇのプルロニックＦ８８、１０ｇのＢＳＡ、２ｍｇのオフロキサシンを秤量し１００ｍＬにメスアップした。
２．４μＬのベース血清ならびに上記６種類の試験溶液４を１８０μＬの抗体液と混合し、３７℃、５分混和した。続いて、６０μＬのラテックス試液を混合し、３７℃１分後（吸光度Ｉ）、１分２０秒後（吸光度II）、３分後（吸光度III）、３分２０秒後（吸光度IV）にそれぞれ７００ｎｍの吸光度を測定した（吸光度Ｉ、吸光度II、吸光度III、吸光度IV）。（吸光度IIと吸光度Iの平均値）と（吸光度IVと吸光度IIIの平均値）の差を求め、ｄａｂｓとした。下記式（Ｄ）で比を計算し、バッファー組成の効果を確認した。
（ベース血清のｄａｂｓ）／（試験溶液４のｄａｂｓ）・・・式（Ｄ）
３．結果
結果を図２に示す。ＰＢＳは、本発明の非特異的反応回避化合物の効果を向上させることが確認された。一方、ＢＳＡは非特異的反応回避化合物の効果には影響を与えなかった。

【0040】

以上、比較例１、実施例１〜３、参考例１の結果より、ＰＯＥ−ＰＯＰブロック共重体、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、多価第四級アミン高分子化合物に、凝集阻害ＬＴＩＡにおける生じるべき凝集が生じないという非特異的反応を回避できることが確認された。
また、本発明の非特異的反応回避化合物は、濃度換算用標準物質（キャリブレータ）に添加することでその効果を発揮するという従来にない特徴を有していることが確認された。

【0041】

＜実施例４＞ 濃度換算用標準物質を、本発明の非特異的反応回避化合物を含む緩衝液で希釈した場合の検量線と、被検物質を含まないヒト血清で希釈した場合の検量線の比較
１．試薬
（１）テイコプラニン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）
（２）テイコプラニン非投与ヒトから得た血清（以下、ベース血清という）
（３）濃度換算用標準物質希釈液（以下、標準物質希釈液という）：５％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、０．００２％ オフロキサシン、０．７％プルロニックＦ８８
（４）抗テイコプラニン抗体液（抗体液）
（５）テイコプラニン感作ラテックス試液（ラテックス試液）
２．方法
テイコプラニンを標準物質希釈液で０、５、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬになるように希釈し、キャリブレータとした。また、１１０μｇ／ｍＬとなるようテイコプラニンを添加したベース血清を、テイコプラニン非添加のベース血清で１０段階（０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／ｍＬ）に希釈し、模擬検体溶液３とした。２．４μＬのキャリブレータ、模擬検体溶液３と、１８０μＬの抗テイコプラニン抗体液を混合し、３７℃、５分混和した。続いて、６０μＬのラテックス試液を混合し、３７℃、１分後（吸光度Ｉ）、１分２０秒後（吸光度II）、３分後（吸光度III）、３分２０秒後（吸光度IV）に、それぞれ７００ｎｍの吸光度を測定した。（吸光度IIと吸光度Ｉの平均値）と（吸光度IVと吸光度IIIの平均値）の差を求め、ｄａｂｓとした。
３．結果
結果を図３に示す。テイコプラニン非添加のベース血清で希釈した模擬検体溶液３（▲）とキャリブレータ(×)のｄａｂｓはテイコプラニン濃度０μｇ〜１１０μｇ／ｍＬの濃度範囲すべてで一致した。以上により、本発明の効果が確認された。

【産業上の利用可能性】

【0042】

本発明により、凝集阻害ＬＴＩＡにおいて、生じるべき凝集が生じないという非特異的反応を回避できる方法が提供される。本発明により、凝集阻害ＬＴＩＡによる血液試料中の被検物質の正確な測定が可能になる。

【図1】

【図2】

【図3】