特許 6335188 眼疾患の治療における使用のためのタンパク質ＳＬＵＲＰ−１

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6335188

(24)【登録日】2018年5月11日

(45)【発行日】2018年5月30日

(54)【発明の名称】眼疾患の治療における使用のためのタンパク質ＳＬＵＲＰ−１

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20180521BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20180521BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20180521BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20180521BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20180521BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20180521BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20180521BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20180521BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/47ZNA

   A61K38/00

   A61K9/08

   A61P27/02

   A61K47/36

   A61K47/34

   A61K47/42

   A61K47/24

【請求項の数】14

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2015-546050(P2015-546050)

(86)(22)【出願日】2013年12月9日

(65)【公表番号】特表2016-502558(P2016-502558A)

(43)【公表日】2016年1月28日

(86)【国際出願番号】EP2013075981

(87)【国際公開番号】WO2014087022

(87)【国際公開日】20140612

【審査請求日】2016年11月28日

(31)【優先権主張番号】12196007.4

(32)【優先日】2012年12月7日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】515150508

【氏名又は名称】ブライトプラス ホールディング リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コンベット ジャン−マルク

(72)【発明者】

【氏名】デローシェ カトリーヌ

(72)【発明者】

【氏名】アバディー クレール

(72)【発明者】

【氏名】モウズ セバスチャン

(72)【発明者】

【氏名】ペリーノ ジュリアン

【審査官】 松岡 徹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５２３６７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１３８３７９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１を含むタンパク質を含む、被験体の眼での瘢痕形成の誘導又は加速のための組成物。

【請求項2】

少なくとも１つの生体適合性ポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記生体適合性ポリマーが、ヒアルロン酸、糖ポリマー、レシチンゲル、ポリアラニン誘導体、プルロニック、ポリ（エチレン）グリコール、ポロキサマー、キトサン、キシログルカン、コラーゲン、フィブリン、ポリオルトエステル、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記生体適合性ポリマーがヒアルロン酸及び／又は糖ポリマーである、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記糖ポリマーがデキストランである、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記デキストランがカルボキシメチルデキストランサルフェートポリマーである、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記カルボキシメチルデキストランサルフェートポリマーが、

【化1】

である、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

少なくとも１つのナノ粒子担体を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記ナノ粒子担体が、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリシアノクリレート及びキトサンからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

局所処理又は結膜下注射により投与される、請求項２〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

配列番号１を含むタンパク質の量が１投与単位当たり５ｎｇ〜５０μｇである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

配列番号１を含むタンパク質の量が１投与単位当たり１０ｎｇ〜１０μｇである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物が結膜下注射により投与され、配列番号１を含むタンパク質の量が１投与単位当たり２０ｎｇ〜９０ｎｇである、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

配列番号１を含むタンパク質の量が１投与単位当たり４０ｎｇ〜６０ｎｇである、請求項１３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、被験体の眼での瘢痕形成の誘導若しくは加速及び／又は被験体の眼での感染の予防における使用のための配列番号１を含むタンパク質及び該タンパク質を含む組成物に関するものである。

【背景技術】

【0002】

眼、特に角膜及び結膜の病変は、医師の診察を受けた患者において最も多く診断される病態の一つであり、失明の主な原因の一つにもなっている。これらの病変の病因は様々であるが、主にアレルギー、感染（細菌性、ウイルス性及び真菌性）、ドライアイ症候群、外科手術及び他の外傷によるものである。これらの病変は有害なものであり、多大な痛みを伴う。これらの病変の症状には、乾燥、灼熱感及び砂埃の入ったような（sandy-gritty）眼の炎症がある。症状は他にも痒み、チクチク感（scratchy）、ヒリヒリ感（stingy）又は疲れ目としても記載されている。他の症状は、眼の痛み、赤み、引っ張られる感覚及び眼の奥の圧迫感である。眼表面に対する損傷によって不快感及び明るい光に対する感受性が高まる。

【0003】

視力の低下及び最も深刻な場合には失明に至ることもある状態の悪化及び潰瘍形成等の合併症を回避するために、眼表面の病変を極めて早急に処置し、治癒させる必要がある。ドライアイ症候群に起因する病変の治療のために、多くの潤滑溶液及び水和ヒドロゲルが存在する。しかし、これらの製品は症状を和らげるだけであり、病変の治癒プロセスを早めるものではない。

【0004】

より深刻な病変のために、いくつかのビタミンＡ溶液及びムチン分泌を高める組成物が存在し、それらにより治癒が促されることもあるが、効率には限界がある。

【0005】

他の組織における創傷治癒に関与することが見出されている化学化合物及び生体分子がいくつか存在するが、眼への特定用途選択は、依然極めて狭いものであり、現在利用可能である有効な分子はない。

【0006】

ヒトコンポーネントＢ（以下、ＳＬＵＲＰ−１と呼ばれる）は、アミノ酸配列比較により実証されたようにＬｙ−６／ｕＰＡＲスーパーファミリーの成員である。このスーパーファミリーには、Ｃ末端コンセンサス配列ＣＣＸＸＸＸＣＮと様々な数のＬｙ−６／ｕＰＡＲドメインリピートとが含まれている。配列全体に、タンパク質特異的なジスルフィド結合をもたらす複数（８個〜１０個）のシステイン残基^{［１〜３］}が含まれている。

【0007】

Ｌｙ−６／ｕＰＡＲスーパーファミリーを、ＧＰＩアンカーシグナル配列の存在に応じて２つのサブファミリーに分けることができる^［４］。

【0008】

ＳＬＵＲＰ−１は、Ｌｙ−６／ｕＰＡＲスーパーファミリーの第１のサブファミリーに属し、ＧＰＩアンカーシグナル配列は有していない。ＳＬＵＲＰ−２も同じサブファミリーの成員である^{［４，５］}。メレダ病（Mal de Meleda）（ＭｄＭ）の患者は、ＳＬＵＲＰ−１の変異に関連していることが多く、ＭｄＭ遺伝子は染色体８ｑ２４．３上のＬｙ−６遺伝子クラスターに位置している^{［６〜９］}。

【0009】

第２のサブファミリーは、ＧＰＩアンカーシグナルを有するタンパク質を含むものであり、第２のサブファミリーにはいくつかのタンパク質：レチノイン酸誘導性遺伝子Ｅ（ＲＩＧ−Ｅ）、Ｅ４８抗原（ヒトＬｙ−６Ｄ）、Ｌｙ６Ｈ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＣＤ５９又はプロテクチン、Ｌｙｎｘ１、及びｕＰＡＲ（ウロキナーゼ受容体）が含まれる^{［１０〜１５］}。

【0010】

ＳＬＵＲＰ−１は特許文献１に記載されている。簡潔には、そのタンパク質は初めに、吸着剤及び特定の精製プロセスによる処理後の透析尿濃縮物から発見及び精製された。ＳＬＵＲＰ−１は、分子量が８．９ｋＤ付近である成熟形態の８１アミノ酸（配列番号１）のタンパク質である（Ｎ末端シグナルペプチドを含む１０３アミノ酸−配列番号２）。その配列は多くのＬｙ６／ｕＰＡＲスーパーファミリー成員と同じようにヒト第８染色体の長腕に位置しており、このことから染色体の重複事象後の潜在的な共進化が確認されている^［４］。

【0011】

ＳＬＵＲＰ−１は３９位のチロシンにある硫酸基の存在に応じて２つの異なる形態で存在する：１型は硫酸化されているが、２型は硫酸化されていない。ＳＬＵＲＰ−１は複数の器官、並びに血液及び尿のような体液にて検出される。ＳＬＵＲＰ−１は主に、ケラチノサイト及び上皮細胞により産生され、そのため主に上皮組織に分布されている^{［１９〜２４］}。

【0012】

さらに系統発生解析により、ＳＬＵＲＰ−１とＬｙ−６／ｕＰＡＲスーパーファミリー成員との間だけでなく、ヘビ神経毒とも密接な関係性が実証された^［４］。ヘビ神経毒はアセチルコリン受容体に対して阻害作用を示し、これにより細胞と細胞外媒質とのイオン交換が阻害され、続いて細胞シグナル伝達が妨げられる^{［１６，１７］}。ヘビ神経毒とＳＬＵＲＰ−１との間の重要な配列相同性が、三次元構造の類似性により裏付けられている：ＳＬＵＲＰ−１はヘビ神経毒タンパク質の特別な特徴である「三本指」の外観を有すると考えられる^{［１８，１９］}。両タンパク質の類似性及びヘビ神経毒の阻害活性から、ＳＬＵＲＰ−１を、ニコチン様アセチルコリン受容体のようなイオンチャネルと結合し、相互作用させるのに使用することができることが指摘されてきた。

【0013】

非神経細胞にてｎＡＣｈＲを活性化することで、細胞周期調節、アポトーシス、細胞−細胞及び細胞−基質相互作用等のプロセスに関与するタンパク質の遺伝子発現を修飾することができた。主に研究されてきたホモマー受容体はα７サブユニットで構成されており、この特異的な受容体の活性化は異なる初期シグナルによって伝達されるが、共通するエンドポイントをもたらす。伝達シグナルは同時にイオン事象及びタンパク質キナーゼシグナル伝達を伴う。Chernyavskyらにより、この二重活性化（イオン事象及びタンパク質キナーゼシグナル伝達）が遺伝子発現と同時に細胞形態の変化（及び続くケラチノサイトの移動（locomotion））をもたらし得ることが結論付けられた^［２０］。同時の相補的なシグナル伝達は、イオンシグナル伝達又はタンパク質シグナル伝達のいずれかの阻害が部分的な阻害をもたらしたのに対し、両機構の阻害がそれらの作用の完全な阻害をもたらしたことにより明らかに実証された。

【0014】

ＳＬＵＲＰ−１とニコチン様受容体との間の相互作用は様々な刊行物にて確認されており、アセチルコリンの存在下において、アゴニスト活性（ヘビ神経毒とは対照的なものである）が、ＳＬＵＲＰ−１を使用したヒトケラチノサイトにて発見された^［２１］。この相互作用は、コリン作動性経路を通して細胞機能を調節し、上皮細胞接着、運動及び創傷治癒をもたらすと考えられるが^{［２２，２３］}、ＳＬＵＲＰ−１が治癒プロセスを遅らせ、ＳＬＵＲＰ−２が治癒プロセスを加速させるという結論に至ったチームによって矛盾する結果が得られている^［２６］。これらの結果は、ＳＬＵＲＰ−１とＳＬＵＲＰ−２とを組み合わせることで、ＳＬＵＲＰ−１阻害活性自体又はＳＬＵＲＰ−２加速活性自体に比べて皮膚治癒プロセスに対して正の相加効果が生じることを述べた同じグループによる第３の実験との比較については未だ行っていなかった。

【0015】

更なる研究により、ＳＬＵＲＰ−１又はＳＬＵＲＰ−２が一般に創傷治癒に有用であるかどうかを確かめる必要がある。

【0016】

さらに、効率が高く、反対の効果がなく、完全な角膜の透明性を回復して、眼疾患後の治癒を促す薬剤及び関連の組成物を開発する必要性が、眼科分野において強く感じられている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0017】

【特許文献1】国際公開第９４／１４９５９号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

本発明の目的は、被験体の眼での眼疾患の治療、特に瘢痕形成の誘導又は加速、炎症の低減、及び感染の予防における使用のための生体分子及び／又は組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0019】

上記目的は、請求項１に規定されるようなタンパク質に関するものである本発明により達成される。

【0020】

他に定義されていなければ、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有するものである。本明細書に記載されるものと同様な又は均等な多くの方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を下に記載している。他に言及されていなければ、本発明に使用される本明細書に記載の技法は当業者に既知の標準的な方法である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】全長の配列番号２のアミノ酸配列と、成熟ＳＬＵＲＰ−１タンパク質である配列番号１のアミノ酸配列との配列比較を示す図である（それぞれアミノ酸１〜１０３及びアミノ酸２３〜１０３）。

【図2】対照群及びＳＬＵＲＰ−１処理群におけるアルコールにより誘導される全体の脱上皮化後の指定の時点での角膜上皮の創傷のフルオレセイン染色画像を示す図である。対照群は、処理を行わなかった一群（対照）と、ビヒクル（ＰＢＳ）の結膜下注射による処理を行った一群（ＳＣＪビヒクル）とを含むものである。太字のパーセントは角膜創傷表面の群平均を示し、括弧内のパーセントは考慮した群を代表する角膜の値を示す。

【図3A】対照群及びＳＬＵＲＰ−１処理群における全体の脱上皮化後の角膜創傷治癒の経時変化を示すグラフである。算出した治癒速度は平均±ＳＥＭである。

【図3B】対照群及びＳＬＵＲＰ−１処理群（５０ｎｇのＳＬＵＲＰの結膜下投与及び点眼）における全体の脱上皮化後２日目での治癒速度のグラフを示す図である。

【図3C】対照群及びＳＬＵＲＰ−１処理群（５０ｎｇのＳＬＵＲＰの結膜下投与及び点眼）における全体の脱上皮化後３日目での治癒速度のグラフを示す図である。

【図4】ＰＢＳ処理群及びＳＬＵＲＰ−１処理群における較正されたアルコールにより誘導される脱上皮化後の指定の時点での角膜上皮の創傷のフルオレセイン染色画像を示す図である。太字のパーセントは角膜創傷表面の群平均を示し、括弧内のパーセントは考慮した群を代表する角膜の値を示す。

【図5A】対照群及びＳＬＵＲＰ−１処理群における脱上皮化後０日〜２日目での測定した創傷面積の経時変化を示すグラフである。

【図5B】対照群及びＳＬＵＲＰ−１処理群における較正された脱上皮化後Ｔ０ｈ〜Ｔ４７ｈでの算出した治癒速度のグラフである。

【図5C】較正された脱上皮化後Ｔ４７ｈでの創傷治癒の程度のグラフである。創傷治癒の程度は、各角膜、各群についてＴ４７ｈでのフルオレセインの創傷の面積／ベースラインでのフルオレセインの創傷の面積という比率により算出し、パーセントで表した。

【図6】ヒト角膜上皮細胞株ｈＴＣＥｐｉをＳＬＵＲＰ−１にて処理することにより行われた創傷治癒実験の写真を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明によれば、配列番号１を含むタンパク質は被験体の眼において瘢痕形成を誘導若しくは加速するのに及び／又は被験体の眼において感染を予防するのに使用される。

【0023】

好ましくは、眼疾患は、糖尿病角膜症、角膜炎、結膜炎、角結膜炎、ブドウ膜炎、角膜の外傷、角膜剥離、角膜熱傷、角膜慢性潰瘍、角膜ジストロフィ、持続性角膜上皮欠損（ＰＥＤ）、レーザー手術後の角膜上皮欠損、ＰＲＫ後の角膜上皮欠損、経角膜移植後の角膜上皮欠損からなる群から選択される。

【0024】

配列番号１はＳＬＵＲＰ−１の８１アミノ酸の成熟形態に相当する。

【0025】

代替的な実施形態では、本発明によれば、配列番号１を含むタンパク質を含む組成物は被験体の眼において瘢痕形成を誘導若しくは加速するのに及び／又は感染を予防するのに使用される。

【0026】

組成物は少なくとも１つの生体適合性ポリマーを含むのが好ましい。

【0027】

より好ましくは、生体適合性ポリマーは、ヒアルロン酸、糖ポリマー、レシチンゲル、ポリアラニン誘導体、プルロニック、ポリ（エチレン）グリコール、ポロキサマー、キトサン、キシログルカン、コラーゲン、フィブリン、ポリオルトエステル、及びそれらの混合物からなる群から選択される。

【0028】

更により好ましくは、生体適合性ポリマーはヒアルロン酸である。

【0029】

代替的には、生体適合性ポリマーは好ましくは糖ポリマー、更により好ましくはデキストラン（グルコースポリマー）である。

【0030】

好ましくは、デキストランは、カルボキシメチルデキストランサルフェートポリマー、より好ましくは再生剤（ReGeneraTing Agent）（ＲＧＴＡ（登録商標））、更により好ましくはＣａｃｉｃｏｌ ２０（登録商標）の名称で市販されているＯＴＲ４１２０（式Ｉ）である。

【化1】

【0031】

式Ｉはグルコースサブユニット系骨格を有するヘパラン硫酸の類似サブユニットを表す。

【0032】

組成物は固体、半固体、ゲル様又は液体とすることができ、さらに溶液、懸濁液、エマルション又は熱硬化性ゲルであってもよい。

【0033】

代替的な実施形態では、組成物は少なくとも１つのナノ粒子担体を含む。

【0034】

ナノ粒子担体は、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリシアノクリレート（polycyanocrylate）及びキトサンからなる群から選択されるのが好ましい。

【0035】

代替的な実施形態では、組成物は注射可能な粘性ポリマー組成物の形態である。特に組成物のポリマーはポリオルトエステルである。

【0036】

組成物は局所処理又は結膜下注射により投与されるのが好ましい。

【0037】

より好ましくは、配列番号１を含むタンパク質の量は、１投与単位当たり５ｎｇ〜５０μｇ、より好ましくは１投与単位当たり１０ｎｇ〜１０μｇである。

【0038】

好ましい実施形態では、組成物は結膜下注射により投与され、配列番号１を含むタンパク質の量が１投与単位当たり２０ｎｇ〜９０ｎｇである。

【実施例】

【0039】

実施例１：局所又は結膜下投与後の角膜創傷治癒
図２及び図３にて、ＳＬＵＲＰ−１の瘢痕形成／眼創傷治癒活性を、ラットにおける脱上皮化モデルにおいて２つの投与経路を用いて比較した第１の実験のデータを報告する。第１の投与経路は、特に使用が容易であることから、角膜の水分保持に使用される眼製品で一般的な経路、すなわち点眼とする（局所適用）。この経路は外科的な全体の脱上皮化後０日目及び３日目に１日に付き６回の投与頻度にて使用した。同じ外科的処理の後、第２の動物群を異なる投与経路、すなわち結膜下経路にて処理した。この投与は０日目及び３日目に１日１回だけ実施した。

【0040】

両投与経路とも共通する特徴、すなわちＳＬＵＲＰ−１適用量を有する：点眼を行う群は結膜下処理する群で使用される最高用量に相当する溶液で処理した。結膜下経路を介して投与されたプロダクトは、プロダクトが貯蔵される結膜タンクからゆっくりと放出され得ることから、創傷治療中により長時間に亘って利用可能であり、逆に局所投与処理では眼表面から急速に排出されることは容易に想定され得る。この仮定に従って、結膜下処理に用いる用量計画は局所処理に用いられる用量（５μｇ）から徐々に下げて５０ｎｇまでの範囲にした。

【0041】

図３Ａに示されるように、両投与経路とも創傷治癒プロセスを加速することが可能であった。

【0042】

全体の脱上皮化後２日目において、５０ｎｇのＳＬＵＲＰ−１の結膜下注射後の治癒速度はＰＢＳの結膜下注射と比較して有意に高かった（ｐ＜０．０５）（図３Ｂ）。

【0043】

結膜下投与経路に関する瘢痕形成効果が、量が極めて多い局所投与に用いられる用量と比較して最低用量（５０ｎｇ）にてより顕著なものであったことは予期せぬ発見であった。

【0044】

総投与量は同様の有効性の結果が得られる両投与経路計画において算出した（すなわち結膜下経路では１μｇ／ｍＬ及び局所経路では１００μｇ／ｍＬ）。局所処理では、１ｍＬの溶液当たり１００μｇの液滴５０μＬの投与を１日に付き６回、２つの別な日に行った。そのためこの処理群に使用される最終的な量は、６×２×５μｇ＝６０μｇとなった。結膜下処理では、１μｇ／ｍＬの溶液（５０μＬ容量）を２回注射することにより、この経路により与えられる全体量は２×０．０５μｇ＝０．１μｇとなった。同様の臨床的有効性をもたらす両投与量を比較すると、６００という結膜下での量と局所での量との比が観察される。

【0045】

これは眼創傷治癒及び他の規定の臨床病態を治療するのにこのプロダクトではあまり一般的ではないこの特異的な投与経路によりプロダクトの有効性が劇的に増大することを明らかに支持している。

【0046】

より具体的には、この実験は、７０％エタノールに浸した微小スポンジ及び１５番の外科用メスを用いて外科用顕微鏡下で行う全角膜上皮の機械的切除を伴うものであった。次いで角膜を０．９％ＮａＣｌで洗い流し、角膜の再上皮化に対する処理の効果を、脱上皮化後の５つの時点（それぞれＴ２４ｈ、Ｔ４８ｈ、Ｔ７２ｈ、Ｔ１４４ｈ及びＴ１６８ｈに対応するＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ６及びＤ７）で局所０．５％フルオレセインを用いて評価した。

【0047】

５匹６群の動物に以下の処理を行った：
群１：Ｄ０及びＤ３での５０μＬのビヒクルの結膜下注射
群２：Ｄ０及びＤ３での１μｇ／ｍＬ（５０μＬ）のＳＬＵＲＰ−１の結膜下注射（１投与当たり５０ｎｇ）
群３：Ｄ０及びＤ３での１０μｇ／ｍＬ（５０μＬ）のＳＬＵＲＰ−１の結膜下注射（１投与当たり５００ｎｇ）
群４：Ｄ０及びＤ３での１００μｇ／ｍＬ（５０μＬ）のＳＬＵＲＰ−１の結膜下注射（１投与当たり５μｇ）
群５：Ｄ０及びＤ３での１００μｇ／ｍＬ（５０μＬ）のＳＬＵＲＰ−１の６回の局所点眼（１投与当たり５μｇ）
群６：処理なし

【0048】

各時点（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ６及びＤ７）において正面の顔写真を、コバルトブルーの生物顕微鏡光を用いて撮影し、角膜の緑色蛍光標識を用いることで、残存する潰瘍の形状及び面積を求めた（図２）。治癒速度の経時変化を「対照」群（ビヒクル及び／又は何ら処理しない対照）とＳＬＵＲＰ−１処理群とを比較するために各群についてグラフに提示する（図３Ａ）。各角膜の創傷治癒の経過観察を、創傷面積（Ａ_ｔ）、すなわち総角膜面積に対するフルオレセイン染色面積の比のコンピュータを用いた測定により行った。各時点について、治癒速度、すなわち（Ａ_ｔ０−Ａ_ｔ）／Ａ_ｔ０を算出した。結果は平均±ＳＥＭで表す。ＡＮＯＶＡ検定の後に、ダネット多重比較検定又はノンパラメトリックマンホイットニー比較検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software、米国、サンディエゴ）を用いて行った。

【0049】

このモデルは角膜血管新生を引き起こし、治癒プロセスを遅らせる輪部の（limbic）機能不全を誘導した。強度の中心潰瘍を呈した角膜は本研究から除外した。

【0050】

図３Ｂに示されるように全体の脱上皮化後２日目では、５０ｎｇのＳＬＵＲＰ−１の結膜下注射後の治癒速度はＰＢＳの結膜下注射（ｐ＜０．０５ ダネット検定）及び対照（ｐ＜０．０１ ダネット検定）と比較して有意に高い。ＳＬＵＲＰ−１の点眼後の治癒速度も対照より有意に高いが（ｐ＜０．０５ ダネット検定）、ＰＢＳ注射後とは有意差はない。

【0051】

図３Ｃに示されるように全体の脱上皮化後３日目では、ＳＣＪ ５０ｎｇのＳＬＵＲＰ−１処理群及び点眼群の治癒速度は対照群より有意に高いが（ｐ＜０．０５ ダネット検定）、ＰＢＳでの治療速度とは有意差はない。

【0052】

この観察結果から、ＳＣＪ手法（又はＰＢＳ）自体が角膜治癒を促す応答を誘導することが示唆される。

【0053】

血管新生に関して、新生血管は再上皮化プロセスの開始直後の各群において視認可能であった。角膜血管新生の定性的な経過観察では、ＳＬＵＲＰ−１処理群と対照との間に何らの違いも実証されなかった。このことはＳＬＵＲＰ−１の治癒特性は血管新生促進作用には関連せず、角膜の透明性の回復を損なうものではないことを示す非常に重要な観察結果である。

【0054】

このことは、ＳＬＵＲＰ−１が結膜下投与及び点眼後に副作用のない、とりわけ輪部の（limbal）機能不全に関連する角膜血管新生のない、重要な角膜効果を示したことを意味しており、治癒効果は角膜の分化転換プロセスとは関係がないことが実証される。

【0055】

実施例２：較正された角膜脱上皮化モデルにおける局所投与又は結膜下投与後の角膜創傷治癒
治癒プロセスだけでなく、輪部の（limbic）機能不全についても示唆された、第１の角膜脱上皮化モデルにて得られた予試験結果に従って、アルコールにより誘導される脱上皮化の較正モデルを、ＳＬＵＲＰ−１の角膜治癒特性に着目するために第２の研究モデルとして選択した。この研究の目的は、対照と比較した試験タンパク質による再上皮化の増進を示す予試験結果を確認することと、このタンパク質により誘導される可能性のある用量応答を評価することとである。

【0056】

このモデルは、４ｍｍ径の輪状切開をもたらすトレフィンを用いて作り出した較正創傷を伴うものであった。このような微細な創傷の治癒は処置しなくても非常に早い（場合によってはおよそ２日間）。したがって投与は切開日に１度だけ行い、有効性は初めの４８時間中に１日２回の検査により評価した。

【0057】

注射容量は第１の実験から調整し、用量は投与容量を２倍にし、溶液の濃度を半分にすることで同等のものにした。この異なる投薬は、角膜表面上での長期的なＳＬＵＲＰ−１の存在をもたらす結膜下注射により生じるタンク中の保持時間を増大させることで、この標準モデルにて行われる特殊な投与を補うために選択された。

【0058】

この第２の実験モデルでは、ＳＬＵＲＰ−１の効果が確認された。すなわち、注射量の低い結膜下経路は、局所経路と比較して眼創傷治癒を加速するのに６倍〜６０倍有効であった。

【0059】

より具体的には、角膜上皮創傷はHattori et alにより記載されるようにして得た［２５］。要するに、全身麻酔及び局部麻酔の後、トレフィンを用いて、角膜上の中心に位置する４ｍｍ径の輪状切開を作製した。次いで、７０％エタノールに浸しておいた４ｍｍ径の輪状濾紙を切開領域に５秒間置いた。５ｍＬ生理食塩水にて穏やかに洗浄することで、剥離した角膜上皮を取り出した。

【0060】

処理はＤ０（角膜脱上皮化時）にて１回の結膜下注射又は６回の点眼により右目のみに行った。４匹〜６匹５群の動物に以下の処理を行った：
群１：Ｄ０での０．５μｇ／ｍＬ（１００μＬ）のＳＬＵＲＰ−１の結膜下注射（１投与当たり５０ｎｇ）
群２：Ｄ０での５μｇ／ｍＬ（１００μＬ）のＳＬＵＲＰ−１の結膜下注射（１投与当たり５００ｎｇ）
群３：Ｄ０での５０μｇ／ｍＬ（１００μＬ）のＳＬＵＲＰ−１の結膜下注射（１投与当たり５μｇ）
群４：Ｄ０での１００μｇ／ｍＬ（５０μＬ）のＳＬＵＲＰ−１の６回の点眼（１投与当たり５μｇ）
群５：Ｄ０でのビヒクルの結膜下注射（１００μＬ）

【0061】

右眼の角膜を、生物顕微鏡を用いて検査した。右眼の角膜にそれぞれ、０．５％のフルオレセイン（Novartis pharma S.A.S）１滴を与え、コバルトブルー光を用いて検査した。デジタル写真を、双眼鏡を通して撮影した。較正された角膜脱上皮化モデルにおける治癒経過観察中、角膜を、０日目、１日目午前（Ｔ２３ｈ）、１日目午後（Ｔ２８ｈ）、２日目午前（Ｔ４７ｈ）及び２日目午後（Ｔ５６ｈ）にて検査した（図４）。

【0062】

デジタル写真を、画像化ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）を用いて分析した。各眼及び各時点について、残存する潰瘍の面積を総角膜面積と比較した。治癒速度の経時変化を対照（ビヒクル及び／又は何ら処理しない対照）とＳＬＵＲＰ−１処理群とを比較するために各群についてグラフに提示する。結果は平均±ＳＥＭで表す。ＡＮＯＶＡ検定の後に、ダネット多重比較検定又はノンパラメトリックマンホイットニー比較検定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software、米国、サンディエゴ）を用いて行った。

【0063】

対照群及びＳＬＵＲＰ−１処理群における角膜創傷の閉鎖の経時変化を図５Ａに示す。Ｔ０ｈ〜Ｔ４７ｈで算出された治癒速度を比較すると、５００ｎｇ及び５μｇのＳＬＵＲＰ−１のＳＣＪ注射により、点眼群又はＰＢＳ結膜下投与群と比較して治癒速度が有意に増大した（図５Ｂ）。５０ｎｇのＳＣＪ注射群では有意な効果が観察されなかったことから、用量応答効果が存在していた。さらにＴ４７ｈにて、全体的に治癒した角膜の数は、対照群と比較して（６つのうち３つの角膜）、５００ｎｇ又は５μｇのＳＬＵＲＰ−１の結膜下注射で処理した群のいずれにおいても多く（図５Ｃ）、５００ｎｇ（５つのうち４つの角膜）と５μｇ（５つのうち５つの角膜）との間にも注目すべき違いがあった。

【0064】

実施例３：ヒト角膜上皮細胞株ｈＴＣＥｐｉでのＳＬＵＲＰ−１による創傷閉鎖アッセイ
細胞移動をモニタリングするのに使用される創傷閉鎖アッセイは、Platypus TechnologiesのＯｒｉｓ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ Ｃｏａｔｅｄである。細胞播種密度は倒立顕微鏡を用いて視覚的に求めた。１００マイクロリットルを最適細胞播種密度で試験ウェルにピペッティングし、加湿チャンバー（３７℃、５％ ＣＯ２）内にて１時間〜４時間インキュベートして、細胞を付着させた。サイトカラシンＤを陽性対照として使用した。

【0065】

実験はＳＬＵＲＰ−１量を増大させて3回繰返し行った。試験量は、０μｇ／ｍｌ（陰性対照）、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌとした。２４時間後、プレート上の創傷領域は異なる程度で治癒した。図６に見ることができるように、１０μｇ／ｍｌのＳＬＵＲＰ−１で処理した細胞が最適創傷治癒を示した。

【0066】

上記データの分析より、本発明が達成することができる利点が明らかである。

【0067】

特に、ＳＬＵＲＰ−１の特定濃度と特定の投与経路との間の効果的な関連性により、治癒速度の加速、及びより早い創傷領域の低減、特に感染からの眼表面の保護に関して最適な結果が得られる。

【0068】

さらに、ＳＬＵＲＰ−１の治癒特性は血管新生促進作用には関連せず、角膜の透明性の回復を損なうものではない。

【0069】

参考文献

【表1】

【0070】

【0071】

【0072】

【0073】

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]