特許 6335918 制限酵素を用いない標的富化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6335918

(24)【登録日】2018年5月11日

(45)【発行日】2018年5月30日

(54)【発明の名称】制限酵素を用いない標的富化

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180521BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20180521BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12Q1/68 A

【請求項の数】20

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2015-546460(P2015-546460)

(86)(22)【出願日】2013年10月3日

(65)【公表番号】特表2016-500259(P2016-500259A)

(43)【公表日】2016年1月12日

(86)【国際出願番号】US2013063290

(87)【国際公開番号】WO2014088694

(87)【国際公開日】20140612

【審査請求日】2016年10月3日

(31)【優先権主張番号】61/734,251

(32)【優先日】2012年12月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】399117121

【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク

【氏名又は名称原語表記】ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100114591

【弁理士】

【氏名又は名称】河村 英文

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100170379

【弁理士】

【氏名又は名称】徳本 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100179154

【弁理士】

【氏名又は名称】児玉 真衣

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(74)【代理人】

【識別番号】100184424

【弁理士】

【氏名又は名称】増屋 徹

(72)【発明者】

【氏名】ハッペ，スコット

(72)【発明者】

【氏名】ルプルスト，エミリー・マリン

(72)【発明者】

【氏名】バルボーザ，ジュリア

(72)【発明者】

【氏名】オン，ジョゼフ・ホアン・ハイ

【審査官】 市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０１５６４１２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０００３６５７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００７−０２０４７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０１９９９１６（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）無作為に剪断されたゲノムＤＮＡを、ハロプローブにハイブリダイズするステップであって、第１の環状複合体を作製するステップであって、前記ハロプローブが、
（ｉ）前記無作為に剪断されたゲノムＤＮＡの断片中の種々の領域にハイブリダイズするフランキング配列及び中央配列を含む第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記中央配列に相補的な１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドと
を含む、ステップと、
（ｂ）前記第１の環状複合体中の前記ゲノム断片のオーバーハング末端を酵素的に消化するステップであって、前記１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端が、消化されたゲノム断片の３’末端及び５’末端にライゲーション可能に隣接した第２の環状複合体を得る、ステップと、
（ｃ）（ｂ）の前記消化されたゲノム断片の末端を、前記１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドの末端にライゲートするステップであって、環状ＤＮＡ分子を作製する、ステップと、
を含む方法。

【請求項2】

（ｄ）前記１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドによって与えられる部位に結合する１つ又は複数のプライマを使用して、前記環状ＤＮＡ分子から前記消化されたゲノム断片を増幅するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ｅ）（ｄ）の増幅生成物をシークエンシングするステップであって、前記消化されたゲノム断片の少なくとも一部のヌクレオチド配列を得る、ステップ、
を更に含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１のオリゴヌクレオチドが捕捉部分を含み、前記方法がステップ（ａ）とステップ（ｂ）との間に、該捕捉部分を使用して前記第１の環状複合体を単離するステップを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記シークエンシングするステップが、前記１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチド中のシークエンシングプライマ部位にハイブリダイズするプライマを使用して行われる、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記酵素的に消化するステップが、ポリメラーゼの存在下で一本鎖特異的両方向性エキソヌクレアーゼを使用して前記第１の環状複合体を消化することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記一本鎖特異的両方向性エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＶＩＩである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記酵素的に消化するステップが、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ／Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼカクテル、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ／エキソヌクレアーゼＶＩＩカクテルによる処理、マングビーンヌクレアーゼによる処理、別の３’エンドヌクレアーゼと組み合わせたフラップエンドヌクレアーゼによる処理を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記無作為に剪断されたゲノムＤＮＡが化学的な、物理的な又はトランスポゼースにより触媒される断片化方法を用いてゲノムＤＮＡから作製される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記物理的な断片化方法が超音波処理、ネブライゼーション又は剪断を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドが、前記第１のオリゴヌクレオチドの中央配列に相補的な単一オリゴヌクレオチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドが、各々が前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第１の領域と、１つ又は複数の増幅プライマの結合部位をもたらす第２の領域とを含む２つのオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

（ａ）無作為に剪断されたゲノムＤＮＡを、該無作為に剪断されたゲノムＤＮＡの断片にハイブリダイズする領域を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするステップであって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を作製する、ステップと、
（ｂ）前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖中のゲノム断片のオーバーハング末端を酵素的に消化するステップであって、規定の末端を有する消化されたゲノム断片を含む二重鎖を得る、ステップと、
（ｃ）（ｂ）の前記二重鎖のＲＮＡオリゴヌクレオチドを消化するステップであって、前記消化されたゲノム断片を放出する、ステップと、
（ｄ）（ｃ）の前記消化されたゲノム断片を、
（ｉ）前記消化されたゲノム断片の末端にハイブリダイズするフランキング配列及び中央配列を含む第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの中央配列に相補的な１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドと、
を含むハロプローブとハイブリダイズするステップであって、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端が、前記消化されたゲノム断片の３’末端及び５’末端にライゲーション可能に隣接した第２の複合体を得る、ステップと、
（ｅ）前記消化されたゲノム断片の末端を前記第２のオリゴヌクレオチドにライゲートするステップであって、環状ＤＮＡ分子を作製する、ステップと、
を含む方法。

【請求項14】

前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドが捕捉部分を含み、前記方法が該捕捉部分を使用して（ｂ）の前記酵素的に消化された第１の複合体を単離するステップを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記消化するステップ（ｃ）を、ＮａＯＨ又はＲＮａｓｅＨ処理を使用して行う、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

（ｆ）前記第１のオリゴヌクレオチドの中央配列中の部位に結合する１つ又は複数のプライマを使用して、前記環状ＤＮＡ分子から前記消化されたゲノム断片を増幅するステップを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

（ｇ）（ｆ）の増幅生成物をシークエンシングするステップを更に含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記シークエンシングするステップを、前記１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドによって与えられるシークエンシングプライマ部位にハイブリダイズするプライマを使用して行う、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記酵素的に消化するステップが、エキソヌクレアーゼＶＩＩを使用して前記第１の複合体を消化することを含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記第１のオリゴヌクレオチドが捕捉部分を含み、前記方法がライゲートするステップ（ｅ）の前に（ｄ）の前記第２の複合体を単離するステップを含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

分子生物学の幾つかの分析法（例えばシークエンシングライブラリ作成）では、富化したＤＮＡ断片を操作する方法を得るために、アダプタ配列がその断片の末端に位置する必要がある。例えば、１つ又は複数のアダプタをＤＮＡの富化した断片にライゲートして、アダプタライゲート断片を作製することができ、付加されたアダプタ中に存在するプライマ結合部位を使用してアダプタライゲート断片を増幅及び／又はシークエンシングすることができる。

【発明の概要】

【0002】

無作為に剪断されたゲノムＤＮＡ中に存在する標的断片を富化する様々な方法が本明細書で提供される。幾つかの実施の形態では、該方法は、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡをハロプローブにハイブリダイズすることであって、第１の環状複合体を作製することと、次いでゲノム断片のオーバーハング末端を酵素的に消化することとを含むことができる。他の実施の形態は、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡを、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡの断片にハイブリダイズする領域を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることであって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を作製することを含むことができる。次いで、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のゲノム断片のオーバーハング末端を酵素的に消化することができる。規定の末端を有する得られる消化されたゲノム断片を、ハロプローブの１つ又は複数のオリゴヌクレオチドにライゲートすることができる。次いで、消化されたゲノム断片を増幅及びシークエンシングすることができる。

【0003】

当業者は添付の図面が例示のみを目的とすることを理解するであろう。図面は本教示の範囲を限定することを何ら意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0004】

【図1】ハロプローブの２つの実施形態の概略図である。

【図2】本方法の一実施形態の概略図である。

【図3】本方法の別の実施形態の概略図である。

【図4】生成物ＤＮＡ分子をシークエンシングすることができる一方法の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0005】

定義
例示的な実施形態をより詳細に記載する前に、本明細書に用いられる用語の意味及び範囲を説明及び規定する以下の定義を示す。

【0006】

数値範囲は範囲を規定する数値を含むものである。他に指定のない限り、核酸は左から右に５’から３’方向、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向でそれぞれ記載される。

【0007】

他に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991)は、当業者に本明細書で使用される多くの用語の一般的な意味を提示する。さらに、ある特定の用語を明確にする、また参照を容易にするために下記に規定する。

【0008】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上明白に他の指示がない限り、数量を限定していない単数形"a", "an", and "the"は複数の指示対象を含むことに留意すべきである。例えば、「プライマ（a primer）」という用語は１つ又は複数のプライマ、すなわち単一のプライマ及び複数のプライマを指す。請求項は任意の要素を除外するように作成され得ることに更に留意されたい。そのため、この記述は請求項の要素の列挙に関連した「単に（solely）」、「のみ（only）」等の排他的な専門用語の使用、又は「消極的な」限定の使用の先行詞としての役割を果たすことを意図する。

【0009】

「サンプル」という用語は本明細書で使用される場合、必ずではないが、典型的には液体形態の対象の１つ又は複数の分析物を含有する物質又は物質の混合物に関する。一実施形態では、この用語はその最も広い意味で使用される場合、ＤＮＡ又はＲＮＡを含有する任意の植物、動物又はウイルス物質、例えば個体又はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養成分から単離された組織又は体液（血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、涙液、唾液及び組織切片を含むが、これらに限定されない）、及び環境からのサンプルを指す。「サンプル」という用語は「生体サンプル」も指す。本明細書で使用される場合、「生体サンプル」という用語は生物全体又はその組織、細胞若しくは構成成分の一部（例えば血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血（amniotic cord blood）、尿、膣液及び精液を含むが、これらに限定されない体液）を指す。「生体サンプル」は、生物全体、若しくは例えば血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側片、気道、腸管及び尿生殖路、涙液、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官を含むが、これらに限定されないその組織、細胞若しくは構成成分の一部から調製されたホモジネート、溶解物若しくは抽出物、又はその画分若しくは一部分を指す。殆どの場合、サンプルは動物から取り出されているが、「生体サンプル」という用語はｉｎ ｖｉｖｏで、すなわち動物から取り出さずに分析される細胞又は組織を指す場合もある。典型的には、「生体サンプル」は動物に由来する細胞を含有するが、この用語は癌関連ポリヌクレオチド又はポリペプチドレベルを測定するために使用することができる非細胞生体物質、例えば血液、唾液又は尿の非細胞画分を指す場合もある。「生体サンプル」は、タンパク質又は核酸分子等の細胞成分を含有する、生物を増殖させた栄養ブロス又はゲル等の培地を更に指す。

【0010】

「核酸サンプル」という用語は本明細書で使用される場合、核酸を含有するサンプルを表す。本明細書で使用される核酸サンプルは、配列を含有する複数の異なる分子を含有するという点で複合物（complex）であってもよい。哺乳動物（例えばマウス又はヒト）に由来するゲノムＤＮＡは種々の複合サンプルである。複合サンプルは１０^４個、１０^５個、１０^６個又は１０^７個を超える異なる核酸分子を含む。ＤＮＡ標的はゲノムＤＮＡ又は人工ＤＮＡ構築物等の任意の供給源に由来するものとすることができる。核酸を含有する任意のサンプル、例えば組織培養細胞又は組織のサンプルから作製されたゲノムＤＮＡを本明細書で用いることができる。

【0011】

「混合物」という用語は、本明細書で使用される場合、散在し、任意の特定の順序でない要素の組合せを指す。混合物は不均一であり、その種々の構成要素に空間的に分離可能でない。要素の混合物の例としては、同じ水溶液に溶解した多数の異なる要素、及びランダムな位置で（すなわち、特定の順序でない）固体支持体に付着した多数の異なる要素が挙げられる。混合物はアドレス可能でない。例示すると、当該技術分野で一般に知られるような空間的に分離した表面に結合したポリヌクレオチドのアレイは、表面に結合したポリヌクレオチド種が空間的に区別され、アレイがアドレス可能であるため、表面に結合したポリヌクレオチドの混合物ではない。

【0012】

「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリン塩基及びピリミジン塩基だけでなく、修飾された他の複素環塩基も含有する部分を含むことを意図する。かかる修飾としては、メチル化プリン又はピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン、アルキル化リボース又は他の複素環が挙げられる。加えて、「ヌクレオチド」という用語は、ハプテン又は蛍光標識を含有し、従来のリボース糖及びデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も含有することができる部分を含む。修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドには糖部分の修飾、例えばヒドロキシル基の１つ又は複数がハロゲン原子又は脂肪族基に置き換えられ、エーテル、アミン等として官能基化された修飾も含まれる。

【0013】

「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書でヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される任意の長さ、例えば約２塩基超、約１０塩基超、約１００塩基超、約５００塩基超、１０００塩基超、最大約１００００又はそれ以上の塩基のポリマを記載するために本明細書で区別なく使用され、酵素的又は合成的に生成することができ（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号及びそれに引用される参考文献に記載されるＰＮＡ）、２つの天然核酸と類似して配列特異的に天然核酸とハイブリダイズすることができ、例えばワトソン−クリック塩基対合相互作用に関与する場合がある。天然ヌクレオチドとしては、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシル（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｔ及びＵ）が挙げられる。ＤＮＡ及びＲＮＡはそれぞれデオキシリボース糖骨格及びリボース糖骨格を有するが、ＰＮＡの骨格はペプチド結合によって連結した反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位から構成される。ＰＮＡでは、様々なプリン塩基及びピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合によって骨格に連結する。インアクセシブル（inaccessible）ＲＮＡとしばしば称されるロックド核酸（ＬＮＡ）は修飾ＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素と４’炭素とを結び付ける特別な架橋で修飾される。この架橋はＡ型二重鎖に見られることが多い３’−エンド（Ｎｏｒｔｈ型）配座のリボースを「ロックする」。ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのＤＮＡ残基又はＲＮＡ残基と所望される場合にいつでも混合することができる。「非構造核酸」又は「ＵＮＡ」という用語は、安定性の低下を伴って互いに結合する非天然ヌクレオチドを含有する核酸である。例えば、非構造核酸はＧ’残基及びＣ’残基を含有することができ、これらの残基は安定性の低下を伴って互いに塩基対合するが、それぞれ天然のＣ残基及びＧ残基と塩基対合する能力を保持するＧ及びＣの非天然形態、すなわち類似体に相当する。非構造核酸は、ＵＮＡの開示のために米国特許出願公開第２００５０２３３３４０号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。

【0014】

「標的ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で使用される場合、研究中の関心あるポリヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは研究中の関心ある１つ又は複数の配列を含有する。

【0015】

「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、約２ヌクレオチド長〜２００ヌクレオチド長、最大５００ヌクレオチド長のヌクレオチドの一本鎖多量体を表す。オリゴヌクレオチドは合成されていても又は酵素的に作製してもよく、幾つかの実施形態では３０ヌクレオチド長〜１５０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマ（すなわち、オリゴリボヌクレオチドとすることができる）又はデオキシリボヌクレオチドモノマを含有することができる。オリゴヌクレオチドは例えば１０ヌクレオチド長〜２０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長、５１ヌクレオチド長〜６０ヌクレオチド長、６１ヌクレオチド長〜７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長〜８０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長〜１５０ヌクレオチド長又は１５０ヌクレオチド長〜２００ヌクレオチド長とすることができる。

【0016】

「プライマ」という用語は、本明細書で使用される場合、精製された制限消化物のように天然に発生するか又は合成的に生成されるかに関わらず、核酸鎖に相補的なプライマ伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼ等の誘導剤の存在下、好適な温度及びｐＨに置かれた場合に合成開始点として働くことが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマは一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、誘導剤の存在下で所望の伸長生成物の合成を始動するのに十分な長さである必要がある。プライマの正確な長さは温度、プライマの供給源及び方法の使用を含む多くの要因に左右される。例えば、診断用途については、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマは典型的には１５個〜２５個又はそれ以上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有していてもよい。本明細書のプライマは、特定の標的ＤＮＡ配列の種々の鎖に実質的に相補的となるように選択される。これは、プライマがそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなくてはならないことを意味している。したがって、プライマ配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片がプライマの５’末端に付着し、プライマ配列の残りの部分が鎖に相補的であってもよい。代替的には、プライマ配列が鎖の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的であり、それにより伸長生成物の合成の鋳型が形成されるという条件で、非相補的塩基又はより長い配列がプライマに組み入れられていてもよい。

【0017】

「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」という用語は、標準ハイブリダイゼーション条件下で核酸鎖が第２の相補的核酸鎖とアニールしてホモ二重鎖又はヘテロ二重鎖の安定な二重鎖を形成し、同じ標準ハイブリダイゼーション条件下で非関連核酸分子とは安定な二重鎖を形成しないプロセスを指す。二重鎖の形成は、ハイブリダイゼーション反応における２つの相補的核酸鎖のアニーリングによって達成される。ハイブリダイゼーション反応は、ハイブリダイゼーション反応が行われるハイブリダイゼーション条件（ハイブリダイゼーションストリンジェンシとしばしば称される）の調整によって、２つの核酸鎖が実質的又は完全に相補的な特異的配列にある特定数のヌクレオチドを含有する場合を除き、２つの核酸鎖間のハイブリダイゼーションにより安定な二重鎖、例えば標準ストリンジェンシ条件下で二本鎖（double-strandedness）の領域を保持する二重鎖が形成されないように、高度に特異的にすることができる。「標準ハイブリダイゼーション又は標準ストリンジェンシ条件」は、任意の所与のハイブリダイゼーション反応によって容易に決定される。例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York、又はSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸鎖が塩基対合によって相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。

【0018】

核酸は、中〜高ストリンジェンシのハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で２つの配列が互いに特異的にハイブリダイズする場合に、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であるとみなされる。中及び高ストリンジェンシのハイブリダイゼーション条件は既知である（例えば、Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons 1995、及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, 2001 Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい）。高ストリンジェンシ条件の一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｕｇ／ｍＬ変性キャリアＤＮＡ中、約４２Ｃでのハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ、室温で２回、０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ、４２℃で更に２回の洗浄が挙げられる。

【0019】

「二重鎖」又は「二重鎖の（duplexed）」という用語は、本明細書で使用される場合、互いに塩基対合、すなわちハイブリダイズした２つの相補的なポリヌクレオチドを記載するものである。

【0020】

「増幅する」という用語は本明細書で使用される場合、鋳型核酸の一方又は両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子の増幅は、典型的には鋳型核酸を変性させることと、プライマの融解温度未満の温度でプライマを鋳型核酸にアニーリングすることと、プライマから酵素的に伸長することであって、増幅生成物を生成することととを含む。変性、アニーリング及び伸長のステップは各々の一回行うことができる。しかしながら、概して変性、アニーリング及び伸長のステップは増幅生成物の量が多くの場合、指数関数的に増大するように複数回行われるが、指数関数的増幅は本発明の方法には必要とされない。増幅には、典型的にはデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素及び適切な緩衝剤及び／又はポリメラーゼ酵素の最適活性のための補助因子の存在が必要である。「増幅生成物」という用語は、本明細書で規定される増幅プロセスにより作製される核酸配列を指す。

【0021】

「決定する」、「測定する」、「評価する」、「判定する」、「アッセイする」及び「分析する」という用語は、任意の形態の測定を指すために本明細書で区別せずに使用され、要素が存在するか否かを決定することを含む。これらの用語には定量的決定及び／又は定性的決定の両方が含まれる。判定は相対的なものでも又は絶対的なものであってもよい。「の存在を判定すること」には、存在するものの量を決定すること及びそれが存在するか否かを決定することが含まれる。

【0022】

「使用する」という用語はその従来の意味を有し、したがって目的を達成するために方法又は組成物を用いること、例えば使い始めることを意味する。例えばプログラムを使用してファイルを作成する場合、プログラムを実行して、通常はプログラムの出力であるファイルを作成する。別の例では、コンピュータファイルを使用する場合、通常は目的を達成するためにコンピュータファイルにアクセスして読み取り、ファイルに保存されている情報を用いる。同様に、一意識別子、例えばバーコードを使用する場合、一意識別子を通常は、例えば一意識別子と関連するオブジェクト又はファイルを特定するために読み取る。

【0023】

本明細書で使用される場合、「Ｔ_ｍ」という用語は、二重鎖の半数がハイブリダイズしたままであり、二重鎖の半数が一本鎖へと解離するオリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度を指す。オリゴヌクレオチド二重鎖のＴ_ｍは、以下の式Ｔ_ｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ率）−（６０／Ｎ）（ここで、Ｎは鎖長であり、［Ｎａ^＋］は１Ｍ未満である）を用いて実験的に決定又は予測することができる。Sambrook and Russell (2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y., ch. 10)を参照されたい。オリゴヌクレオチド二重鎖のＴ_ｍを予測する式は他にもあるが、１つの式で所与の条件又は条件のセットに概ね適切である。

【0024】

「溶液中に遊離した」という用語は本明細書で使用される場合、別の分子に結合又は連結していないポリヌクレオチド等の分子を記載するものである。

【0025】

ゲノムに関する「分割する」という用語は、ゲノムの一部分をゲノムの残りの部分から分離して、ゲノムの残りの部分から単離された生成物を作製することを指す。「分割する」という用語は富化することを包含する。

【0026】

「ゲノム領域」という用語は本明細書で使用される場合、ゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類又は昆虫又は植物のゲノム等の動物又は植物のゲノムの領域を指す。ある特定の場合では、本明細書で記載の方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、例えば参照ゲノム領域、すなわち既知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば配列が例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベース又は他のデータベースに寄託された染色体領域を用いて設計することができる。かかるオリゴヌクレオチドは試験ゲノムを含有するサンプルを使用するアッセイに用いることができ、試験ゲノムはオリゴヌクレオチドの結合部位を含有する。

【0027】

「ゲノム配列」という用語は本明細書で使用される場合、ゲノム中に生じる配列を指す。

【0028】

「ゲノム断片」という用語は本明細書で使用される場合、ゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類又は昆虫又は植物のゲノム等の動物又は植物のゲノムの領域を指す。ゲノム断片は染色体全体又は染色体の断片とすることができる。ゲノム断片はアダプタにライゲートしても（この場合、断片の一方又は両方の末端にライゲートしたアダプタを有する）、又はアダプタにライゲートしなくてもよい。

【0029】

ある特定の場合では、本明細書に記載される方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、例えば参照ゲノム領域、すなわち既知のヌクレオチド配列のゲノム領域、例えば配列がＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベース又は他のデータベースに寄託された染色体領域を用いて設計することができる。かかるオリゴヌクレオチドは、試験ゲノムを含有するサンプルを使用するアッセイに用いることができ、試験ゲノムがオリゴヌクレオチドの結合部位を含有する。

【0030】

「親和性タグ」という用語は本明細書で使用される場合、親和性タグが付着した分子を、親和性タグを含有しない他の分子から分離するために使用することができる部分を指す。「親和性タグ」は特異的な結合対、すなわち一方の分子が化学的手段又は物理的手段によって他方の分子に特異的に結合した２つの分子の成員である。本明細書で「捕捉剤」として言及される特異的な結合対の相補的な成員を、（例えばクロマトグラフィ支持体、ビーズ又は平面）に固定化して、親和性タグに特異的に結合した親和性クロマトグラフィ支持体を作製することができる。言い換えると、「親和性タグ」を「捕捉剤」に結合することができ、親和性タグが捕捉剤に特異的に結合することにより、親和性タグが付着した分子を、親和性タグを含有しない他の分子から分離することが容易になる。

【0031】

本明細書で使用される場合、「ビオチン部分」という用語はビオチン、又はデスチオビオチン、オキシビオチン、２’−イミノビオチン、ジアミノビオチン、ビオチンスルホキシド、ビオシチン等のビオチン類似体を含む親和性物質を指す。ビオチン部分はストレプトアビジンに少なくとも１０^−８Ｍの親和性で結合する。ビオチン親和性物質はリンカ、例えば−ＬＣ−ビオチン、−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、−ＳＬＣ−ビオチン又は−ＰＥＧ_ｎ−ビオチン（ｎは３〜１２である）も含むことができる。

【0032】

「末端ヌクレオチド」という用語は本明細書で使用される場合、核酸分子の５’末端又は３’末端のヌクレオチドを指す。核酸分子は二本鎖（すなわち二重鎖）形態又は一本鎖形態とすることができる。

【0033】

「ライゲートする」という用語は本明細書で使用される場合、第１のＤＮＡ分子の５’末端の末端ヌクレオチドと第２のＤＮＡ分子の３’末端の末端ヌクレオチドとの酵素的に触媒された接合を指す。

【0034】

「複数」は少なくとも２つの成員を含有する。ある特定の場合では、複数は少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１００個、少なくとも１００００個、少なくとも１０００００個、少なくとも１０^６個、少なくとも１０^７個、少なくとも１０^８個若しくは少なくとも１０^９個又はそれ以上の成員を有することができる。

【0035】

２つの核酸が「相補的」である場合、それらは高ストリンジェンシ条件下で互いにハイブリダイズする。「完全に相補的な」という用語は、核酸の１つの各々の塩基が他の核酸の相補的なヌクレオチドと塩基対合する二重鎖を記載するために使用される。多くの場合、相補的な２つの配列は少なくとも１０個、例えば少なくとも１２個又は１５個の相補的なヌクレオチドを有する。

【0036】

「消化する」という用語は、核酸をエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ、例えば制限酵素等の酸素によって切断するプロセスを示すことを意図する。核酸を消化するには、酵素と核酸とを、制限酵素が作用するのに好適な条件下で接触させる。市販の制限酵素の活性に好適な条件は既知であり、購入時にこれらの酵素とともに提供される。

【0037】

「オリゴヌクレオチド結合部位」は、標的ポリヌクレオチド中のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする部位を指す。オリゴヌクレオチドがプライマの結合部位を「提示する」場合、プライマはそのオリゴヌクレオチド又はその相補体にハイブリダイズすることができる。

【0038】

「分離する」という用語は本明細書で使用される場合、（例えばサイズ又は親和性等による）２つの要素の物理的な分離及び他の部分を保全した１つの要素の分解を指す。

【0039】

「標的配列」という用語は未修飾ゲノム、及び修飾された（例えば断片化された及び／又はアダプタがライゲートした）又はコピーされたゲノム中の配列を指す。標的ゲノム配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドはゲノム配列と塩基対合する。標的配列を含有するゲノム断片は、例えば０．５ｋｂ長〜５００ｋｂを超える長さ又はそれ以上、例えば５ｋｂ〜１００ｋｂの範囲とすることができる。

【0040】

「参照染色体領域（reference chromosomal region）」という用語は本明細書で使用される場合、例えば既知のヌクレオチド配列の染色体領域、例えば配列がＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベース又は他のデータベースに寄託された染色体領域を指す。

【0041】

「鎖」という用語は本明細書で使用される場合、共有結合、例えばホスホジエステル結合によって互いに共有結合したヌクレオチドから構成される核酸を指す。

【0042】

細胞において、ＤＮＡは通常は二本鎖形態で存在し、そのため本明細書で「トップ」鎖及び「ボトム」鎖と称される核酸の２つの相補鎖を有する。ある特定の場合では、染色体領域の相補鎖は「プラス」鎖及び「マイナス」鎖、「第１」鎖及び「第２」鎖、「コード」鎖及び「非コード」鎖、「ワトソン」鎖及び「クリック」鎖又は「センス」鎖及び「アンチセンス」鎖と称することができる。トップ鎖又はボトム鎖としての鎖の割当ては任意であり、任意の特定の方向、機能又は構造を意味するものではない。幾つかの例示的な哺乳動物染色体領域（例えば、ＢＡＣ、アセンブリ、染色体等）の第１鎖のヌクレオチド配列は既知であり、例えばＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋデータベースに見ることができる。

【0043】

「トップ鎖」という用語は本明細書で使用される場合、核酸の両方の鎖ではなく核酸のいずれかの鎖を指す。オリゴヌクレオチド又はプライマが「トップ鎖のみ」に結合又はアニールする場合、これは一方の鎖のみに結合し、もう一方の鎖には結合しない。「ボトム鎖」という用語は本明細書で使用される場合、「トップ鎖」に相補的な鎖を指す。オリゴヌクレオチドが「一方の鎖のみ」に結合又はアニールする場合、これは一方の鎖、例えば第１又は第２の鎖のみに結合し、もう一方の鎖には結合しない。

【0044】

「共有結合する」という用語は２つの別個の分子、例えば二本鎖核酸のトップ鎖及びボトム鎖の間の共有結合の生成を指す。ライゲートは共有結合の一種である。

【0045】

「変性する」という用語は本明細書で使用される場合、二重鎖を好適な変性条件に置くことによる核酸二重鎖の塩基対の少なくとも一部の分離を指す。変性条件は当該技術分野で既知である。一実施形態では、核酸二重鎖を変性させるために二重鎖を二重鎖のＴｍを超える温度に曝露することにより、二重鎖の一方の鎖をもう一方の鎖から放出することができる。ある特定の実施形態では、核酸を好適な時間（例えば少なくとも３０秒間、最大３０分間）にわたって少なくとも９０℃の温度に曝露することにより変性させることができる。ある特定の実施形態では、完全変性条件を用いて二重鎖の塩基対を完全に分離することができる。他の実施形態では、部分的変性条件（例えば完全変性条件よりも低い温度）を用いて、二重鎖のある特定の部分の塩基対を分離することができる（例えば、Ａ−Ｔ塩基対について富化した領域を分離し、Ｇ−Ｃ塩基対について富化した領域を対合したままにすることができる）。核酸は（例えば尿素又はＮａＯＨを使用して）化学的に変性させることもできる。

【0046】

本明細書で使用される場合、「標識」という用語は検出可能な（好ましくは定量可能な）効果をもたらすために使用することができ、核酸又はタンパク質に付着させることができる任意の原子又は分子を指す。標識としては、^３２Ｐ等の染料及び放射標識；ビオチン等の結合部分；ジゴキシゲニン等のハプテン；発光性、リン光性又は蛍光性部分；及び単独の、又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって発光スペクトルを抑制若しくはシフトすることができる部分と組み合わせた蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。標識は蛍光、放射活性、比色分析、重量測定、Ｘ線回折又は吸収、磁気、酵素活性等によって検出可能なシグナルをもたらすことができる。標識は荷電部分（正電荷又は負電荷）であってもよく、又は代替的には中性電荷であってもよい。標識は、標識を含む配列が検出可能である限りにおいて核酸又はタンパク質配列を含むか又はそれからなっていてもよい。「標識ｄＮＴＰ」という用語は、標識の付着によって修飾されたｄＮＴＰを指す。「標識ｄｄＮＴＰ」という用語は、標識の付着によって修飾されたｄｄＮＴＰを指す。

【0047】

「標識オリゴヌクレオチド」という用語は本明細書で使用される場合、親和性タグ（例えばビオチン部分）を有するオリゴヌクレオチド、分離又は検出を可能にする原子又は基（例えば、異なる密度をもたらすブロモ−デオキシウリジン又はコロイド金粒子）によって修飾されたオリゴヌクレオチド、光学的に検出可能な標識（例えば、蛍光又は別のタイプの発光標識）で修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。天然ヌクレオチドのみを含有するオリゴヌクレオチドは標識オリゴヌクレオチドではない。

【0048】

「アダプタ」という用語は二本鎖アダプタ、一本鎖アダプタ並びに部分的に二本鎖及び部分的に一本鎖のアダプタを指す。アダプタはＤＮＡ若しくはＲＮＡであっても、又はＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含有していてもよい。

【0049】

「表面に連結した」という用語は固体基質の表面に固定化された分子を指し、基質は様々な構成、例えばシート、ビーズ又は他の構造を有することができる。

【0050】

「遺伝子型決定」という用語は本明細書で使用される場合、任意のタイプの核酸配列の分析を指し、シークエンシング、多型（ＳＮＰ）分析及び再配列を特定する分析を含む。

【0051】

「シークエンシング」という用語は本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの同一性（例えば少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個若しくは少なくとも２００個又はそれ以上の連続ヌクレオチドの同一性）が得られる方法を指す。

【0052】

「次世代シークエンシング」という用語は、いわゆるIllumina、Life Technologies及びRoche等により現在用いられている合成による並列化シークエンシング又はライゲーションプラットホームによるシークエンシングを指す。次世代シークエンシング方法としては、ナノ細孔シークエンシング法又はLife Technologiesによって商品化されているＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術等の電子検出ベースの方法も挙げることができる。

【0053】

「酵素処理」という用語は、酵素（例えばポリメラーゼ又は制限酵素等）によって触媒される共有結合修飾を指す。プライマ伸長（ＰＣＲ、ローリングサークル増幅を含む）、転写（例えばＴ７又はＴ３ポリメラーゼ等を用いる）及び消化（例えば制限酵素を用いる）は全て酵素処理の一種である。

【0054】

「伸長する」という用語は本明細書で使用される場合、ポリメラーゼを使用したヌクレオチドの付加によるプライマの伸長を指す。核酸にアニールしたプライマを伸長する場合、核酸は伸長反応の鋳型として作用する。

【0055】

「バーコード配列」又は「分子バーコード」という用語は本明細書で使用される場合、ａ）反応中にポリヌクレオチドの供給源を同定及び／又は追跡するため、及び／又はｂ）初期分子がシークエンシングされる回数を計数するため（例えば、サンプル中の実質的に全ての分子を異なる配列でタグ付けた後、サンプルを増幅する場合）に使用されるヌクレオチドの独自の配列を指す。バーコード配列はオリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端又は中央に存在することができる。バーコード配列のサイズ及び組成は広く変化する場合がある。以下の参照文献は特定の実施形態に適切なバーコード配列セットの選択の指針を与えるものである：Brennerの米国特許第５，６３５，４００号、Brenner et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 1665-1670 (2000)、Shoemaker et al, Nature Genetics, 14: 450-456 (1996)、Morris et alの欧州特許出願公開第０７９９８９７号、Wallaceの米国特許第５，９８１，１７９号等。特定の実施形態では、バーコード配列は４ヌクレオチド長〜３６ヌクレオチド長、又は６ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長、又は８ヌクレオチド長〜２０ヌクレオチド長の範囲とすることができる。

【0056】

本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ試薬」という用語は、鋳型上でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うのに必要とされる全ての試薬を指す。当該技術分野で既知であるように、ＰＣＲ試薬には基本的に第１のプライマ、第２のプライマ、熱安定性ポリメラーゼ及びヌクレオチドが含まれる。使用されるポリメラーゼに応じて、イオン（例えばＭｇ^２＋）が存在していてもよい。ＰＣＲ試薬は標的配列を増幅することができる鋳型を任意に含有することができる。

【0057】

本明細書で使用される場合、「フラップ切断反応」という用語は、フラップエンドヌクレアーゼによって重複依存的に基質が切断され、フラップを放出する反応を指す。フラップアッセイの原理は既知であり、例えばLyamichev et al. (Nat. Biotechnol. 1999 17:292-296)、Ryan et al (Mol. Diagn. 1999 4:135-44)及びAllawi et al (J Clin Microbiol. 2006 44: 3443-3447)に記載されている。

【0058】

「フラップエンドヌクレアーゼ」又は略して「ＦＥＮ」という用語は、本明細書で使用される場合、鎖の一方に核酸の別の鎖によって、すなわち一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの間の接合部に重複ヌクレオチドが存在するように変位した一本鎖５’オーバーハング又はフラップを含有する二重鎖を有するＤＮＡ構造に対して構造特異的エンドヌクレアーゼとして働く核酸分解酵素類を指す。ＦＥＮは一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの間の接合部のホスホジエステル結合の加水分解切断を触媒し、オーバーハング又はフラップを放出する。フラップエンドヌクレアーゼは、Ceska and Savers (Trends Biochem. Sci. 1998 23:331-336)及びLiu et al (Annu. Rev. Biochem. 2004 73: 589-615)によって概説されている。ＦＥＮは個別酵素、マルチサブユニット酵素であっても、又は別の酵素若しくはタンパク質複合体、例えばＤＮＡポリメラーゼの活性として存在していてもよい。フラップエンドヌクレアーゼは熱安定性とすることができる。

【0059】

用語の他の定義は本明細書全体に見ることができる。

【0060】

例示的な実施形態の説明
本開示は、侵襲的切断によってアダプタをゲノム配列に付加する方法、及び該方法を行うためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、該方法を用いて、各々がそれにライゲートしたアダプタ配列を含有する無作為に生成されたゲノム断片のライブラリを作製することができる。これらの実施形態は、全ゲノムシークエンシングにおいて特定の用途を有する。他の実施形態では、該方法を用いて、各々がそれにライゲートしたアダプタ配列を含有する標的ゲノム断片のライブラリを作製することができる。これらの実施形態は、例えば標的化再シークエンシング用途及びＳＮＰのマッピングにおいて特定の用途を有する。

【0061】

様々な実施形態を記載する前に、本開示の教示が記載される特定の実施形態に限定されず、そのため当然ながら変更することができることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態の説明のみを目的とし、本教示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定を意図するものではないことも理解されたい。

【0062】

本明細書で使用される節の見出しは構成のみを目的とし、記載の主題を限定すると何ら解釈されるものではない。本教示を様々な実施形態に併せて記載するが、本教示がかかる実施形態に限定されることは意図されない。それどころか、本教示は当業者に認識されるように様々な代替手段、変更及び均等物を包含する。

【0063】

他に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本教示の実施又は試験に際して使用してもよいが、幾つかの例示的な方法及び材料をこれより記載する。

【0064】

いかなる出版物の引用も出願日前のその開示のためであり、本発明の請求項が先行発明のためにかかる出版物に先行する権限を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。さらに、提示の刊行日は実際の刊行日とは異なる可能性があり、別に確認する必要がある。

【0065】

本開示を読む際に当業者に明らかなように、本明細書に記載及び説明される個々の実施形態は各々、本教示の範囲又は趣旨を逸脱することなく他の幾つかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離するか、又はそれと組み合わせることができる個別の構成要素及び特徴を有する。列挙されるいずれの方法も、列挙される事象の順序又は論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。

【0066】

本明細書で言及される特許及び出版物に開示される全ての配列を含む全ての特許及び出版物は、引用することにより明示的に本明細書の一部をなすものとする。

【0067】

参照目的で、ハロプローブの２つの実施形態２及び実施形態１６を図１に示す。図１に示されるように、ハロプローブの両方の実施形態２及び実施形態１６は、（ｉ）断片標的ＤＮＡ中の種々の領域にハイブリダイズするフランキング配列８及びフランキング配列１０、並びに中央配列１２を含む第１のオリゴヌクレオチド４と、（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの中央配列に相補的な１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドとを含む。実施形態２（パネルＡに示される）では、１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドは単一オリゴヌクレオチド１４とすることができる。実施形態１６（パネルＢに示される）では、１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドは、各々が第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする領域と、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしないテールとを含有する２つのオリゴヌクレオチド１４ａ及び１４ｂとすることができる。ある特定の実施形態では、１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドは、増幅及び／又はシークエンシングプライマ結合部位、更に分子バーコード配列をもたらすことができる。これらの配列はハロプローブ１６を使用する場合、オリゴヌクレオチド１４ａ及び１４ｂのテール中に存在することができる。図１に示されるハロプローブのいずれかを下記の方法に使用することができる。方法を説明する際の便宜のためにのみ、図面には図１のパネルＡに示されるハロプローブの第１の実施形態を使用する方法を示す。

【0068】

図２を参照すると、上記方法の一実施形態は、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡ２０をハロプローブ２２にハイブリダイズして、第１の環状複合体２４を作製することを含む。上で述べたように、ハロプローブは、（ｉ）無作為に剪断されたゲノムＤＮＡの断片中の種々の領域にハイブリダイズするフランキング配列（flanking sequences）及び中央配列を含む第１のオリゴヌクレオチドと、（ｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドの中央配列に相補的な１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドとを含む。示されるように、第１の環状複合体２４は、オーバーハング末端２６及び２８を有する無作為に剪断されたゲノムＤＮＡ２３の断片を含む。示されるように、ハロプローブの第１のオリゴヌクレオチドは、上記方法中に複合体の１つを単離するために使用することができる任意の捕捉部分２１、例えばビオチン部分を含有することができる。これらの実施形態では、上記方法は消化前に捕捉部分を使用して第１の環状複合体を単離することを任意に含むことができる。上記方法の次のステップは、第１の環状複合体中のゲノム断片のオーバーハング末端を酵素的に消化することであって、１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端が、消化されたゲノム断片３２の３’末端及び５’末端にライゲーション可能に隣接した第２の環状複合体３０を得ることを含む。酵素的消化は様々な異なる方法で行うことができる。例えば酵素的消化は、過剰に消化された任意の末端を埋めるために、任意選択的に、ポリメラーゼの存在下で一本鎖特異的両方向性（bi-directional）エキソヌクレアーゼであるエキソヌクレアーゼＶＩＩを使用して第１の環状複合体を消化することを含むことができる。他の実施形態では、酵素的消化は例えばＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含むカクテル、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼＶＩＩを含むカクテルによる処理、マングビーンヌクレアーゼによる処理、又は３’エキソヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶ）と組み合わせたフラップエンドヌクレアーゼによる処理、又は５’及び３’エキソヌクレアーゼによる連続処理を含むことができる。図２に示されるように、この方法の実施形態は、消化されたゲノム断片３２のライゲート可能な末端を１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドの末端にライゲートすること（すなわち、消化されたゲノム断片の３’末端と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端との間にあるライゲート可能な接合部３４をライゲートすること、及び消化されたゲノム断片の５’末端と第２のオリゴヌクレオチドの３’末端との間のライゲート可能な接合部３６をライゲートすること）であって、環状ＤＮＡ分子４０を作製することを含む。ある特定の実施形態では（図２に示されるように）、環状ＤＮＡ分子４０は、消化されたゲノム断片３２の末端が第２の単一オリゴヌクレオチドの両方の末端にライゲートした共有結合環状とすることができる。他の実施形態では、環状ＤＮＡ分子４０は、ハロプローブの第２の実施形態（図１のパネルＢに示される）を使用する場合、非共有結合環状とすることができる。これらの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドを断片化されたゲノム断片の５’末端及び３’末端の両方にハイブリダイズし、断片の末端を結び付けて環状ＤＮＡ分子を得る。これらの実施形態では、消化されたゲノム断片３２の５’末端を、一方の第２のオリゴヌクレオチドの３’末端にライゲートし、消化されたゲノム断片３２の３’末端を他方の第２のオリゴヌクレオチドの５’末端にライゲートする。

【0069】

図２に示される方法によって作製される生成物と同様の環状生成物を得る代替方法を図３に示す。図３に示される実施形態では、上記方法にＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用するが、任意の消化可能なオリゴヌクレオチドを使用することができる。図３を参照すると、この方法の実施形態は、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡ５０を、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡの断片にハイブリダイズする領域を含むＲＮＡオリゴヌクレオチド５２にハイブリダイズすることであって、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖５６を作製することを含む。ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖５６はゲノム断片５８及びＲＮＡオリゴヌクレオチド５２を含み、ゲノム断片はオーバーハング配列を含有する。ある特定の実施形態では、ＲＮＡオリゴヌクレオチド５２は任意の捕捉部分、例えばビオチン部分５４を含むことができる。これらの実施形態では、上記方法は、下記の消化ステップの前に捕捉部分を使用して酵素的に消化された第１の複合体５６を単離することを含むことができる。二重鎖を作製した後、上記方法は、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖中のゲノム断片のオーバーハング末端を酵素的に消化することであって、規定の末端として消化されたゲノム断片６０を含む二重鎖５９を得ることを含む。酵素的消化には上記と同様の方法を用いる。例えば酵素的消化は、過剰に消化された任意の末端を埋めるために、任意選択的に、ポリメラーゼの存在下で一本鎖特異的両方向性エキソヌクレアーゼであるエキソヌクレアーゼＶＩＩを使用して第１の環状複合体を消化することを含むことができる。他の実施形態では、酵素的消化は例えばＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含むカクテル、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼＶＩＩを含むカクテルによる処理、マングビーンヌクレアーゼによる処理、又は３’エキソヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶ）と組み合わせたフラップエンドヌクレアーゼによる処理、又は５’及び３’エキソヌクレアーゼによる連続処理を含むことができる。この実施形態に使用されるオリゴヌクレオチドは１０ヌクレオチド長〜２００ヌクレオチド長、例えば１０ヌクレオチド長〜２０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長〜４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長〜５０ヌクレオチド長、５１ヌクレオチド長〜６０ヌクレオチド長、６１ヌクレオチド長〜７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長〜８０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長〜１５０ヌクレオチド長又は１５０ヌクレオチド長〜２００ヌクレオチド長の範囲とすることができる。

【0070】

二重鎖５９を作製した後、上記方法は二重鎖のＲＮＡオリゴヌクレオチドを消化することであって、消化されたゲノム断片６２を放出することを含むことができる。次に、上記方法は消化されたゲノム断片６２をハロプローブ６４にハイブリダイズすることを含むことができる。その例は図１に示す。示されるように、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端が、消化されたゲノム断片の３’末端及び５’末端にライゲーション可能に隣接した第２の複合体７０を得るために、ハロプローブは、消化されたゲノム断片の末端にハイブリダイズするフランキング配列及び中央配列を含む第１のオリゴヌクレオチド６６と、第１のオリゴヌクレオチドの中央配列に相補的な１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチド６８とを含むことができる。この方法の実施形態は、消化されたゲノム断片７０のライゲート可能な末端を１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドの末端にライゲートすることであって、環状ＤＮＡ分子７２を作製することを含む。ある特定の場合では（図３に示されるように）、環状ＤＮＡ分子７２は、消化されたゲノム断片６０の末端が第２の単一オリゴヌクレオチドの両方の末端にライゲートした共有結合環状とすることができる。ある特定の場合では、環状ＤＮＡ分子７２は、ハロプローブの第２の実施形態（図１のパネルＢに示される）を使用する場合、非共有結合環状とすることができる。これらの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドを断片化されたゲノム断片の５’末端及び３’末端の両方にハイブリダイズし、断片の末端を結び付けて環状ＤＮＡ分子を得る。この実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドで環の末端を結び付ける。この実施形態では、消化されたゲノム断片６０の５’末端を一方の第２のオリゴヌクレオチドの３’末端にライゲートし、消化されたゲノム断片６０の３’末端を他方の第２のオリゴヌクレオチドの５’末端にライゲートする。この実施形態では、二重鎖５９のＲＮＡオリゴヌクレオチドの消化はＮａＯＨ又はＲＮａｓｅＨ処理を使用して行うことができるが、任意の好適な消化方法を使用してもよい。

【0071】

上記の実施形態のいずれにおいても、無作為に剪断されたゲノムＤＮＡを化学的な、物理的な又はトランスポゼースにより触媒される断片化方法を用いてゲノムＤＮＡから作製することができる。例えば、Adey et al (Genome Biology 2010, 11:R119)を参照されたい。例えば、物理的な断片化方法はゲノムＤＮＡの超音波処理、ネブライゼーション又は剪断とすることができる。ある特定の実施形態では、上記方法を行う前に、ゲノムＤＮＡを１００ｂｐ〜１０ｋｂ、例えば２００ｂｐ〜１ｋｂの範囲の平均サイズまで断片化することができる。

【0072】

図４に、上記の実施形態のいずれかの消化されたゲノム断片を増幅及びシークエンシングすることができる方法を概略的に示す。図４に示されるように、生成物ＤＮＡ分子８０（消化されたゲノム断片８２及び１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドを含み、示されるように環状であるか、又は使用するハロプローブのタイプに応じて線状とすることができる）を、１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドによって与えられる部位に結合するインバースＰＣＲプライマ８６及び８８を使用して増幅することができる。示される実施形態では、プライマ８６及び８８は第２の単一オリゴヌクレオチドによって与えられる部位に結合する。他の実施形態では、プライマ８６及び８８の結合部位は、図１のパネルＢに示される２つの第２のオリゴヌクレオチドのテールによって与えられると考えられる。増幅生成物９０をシークエンシングして、消化されたゲノム断片の少なくとも一部のヌクレオチド配列を得ることができる。ある特定の場合では、シークエンシングは、上記１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドのシークエンシングプライマ部位にハイブリダイズするプライマを使用して行うことができる。

【0073】

明らかなように、ある特定の実施形態では、１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドによって付加する配列は、次世代シークエンシングプラットホーム、例えばIlluminaの可逆的ターミネータ法、Rocheのパイロシークエンス法（４５４）、Life Technologiesのライゲーションによるシークエンシング（ＳＯＬｉＤプラットホーム）又はLife TechnologiesのＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットホームにおける使用に適合する配列を含有することができる。かかる方法の例は以下の参照文献に記載されている：Margulies et al (Nature 2005 437: 376-80)、Ronaghi et al (Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9)、Shendure (Science 2005 309: 1728)、Imelfort et al (Brief Bioinform. 2009 10:609-18)、Fox et al (Methods Mol Biol. 2009;553:79-108)、Appleby et al (Methods Mol Biol. 2009;513:19-39)及びMorozova (Genomics. 2008 92:255-64)（各々のステップの全ての出発生成物、試薬及び最終生成物を含む方法及び方法の特定のステップの概要のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。配列は１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチド中（それらのテール中又は第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする配列中）に存在することができる。ある特定の場合では、１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドは、一方がインバースＰＣＲによる環状ＤＮＡの増幅のため、もう一方が得られる生成物のシークエンシングのためである２つのプライマ結合部位のセットを含有することができる。１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドは、配列が由来するサンプルを同定するため又はシークエンシングされた異なる出発分子の数を計数するために使用することができる、増幅及びシークエンシングプライマ結合部位の下流に位置する分子バーコードを含有していてもよい。他の実施形態では、アンプリコンはナノ細孔シークエンシング（例えば、Soni et al Clin Chem 53: 1996-2001 2007に記載される又はOxford Nanopore Technologiesによって記載される）を用いてシークエンシングすることができる。ナノ細孔シークエンシングは、ナノ細孔を通過する際のＤＮＡの単一分子を直接シークエンシングする単一分子シークエンシング技術である。ナノ細孔は直径１ナノメートル程度の小さな穴である。導電性流体へのナノ細孔の浸漬及び電位（電圧）の印加により、ナノ細孔を通したイオン伝導のために僅かな電流が生じる。流れる電流の量はナノ細孔のサイズ及び形状に影響を受ける。ＤＮＡ分子がナノ細孔を通過すると、ＤＮＡ分子上の各々のヌクレオチドがナノ細孔を異なる程度で塞ぎ、ナノ細孔を通る電流の大きさが異なる程度で変化する。このため、ＤＮＡ分子がナノ細孔を通過する際のこの電流の変化は、ＤＮＡ配列の読み取り値である。ナノ細孔シークエンシング技術は米国特許第５，７９５，７８２号、同第６，０１５，７１４号、同第６，６２７，０６７号、同第７，２３８，４８５号及び同第７，２５８，８３８号、並びに米国特許出願公開第２００６００３１７１号及び同第２００９００２９４７７号に開示されている。

【0074】

主題のハロプローブの様々な領域の長さは所望の用途、１つ又は複数の第２のオリゴヌクレオチドによって担持される積荷（freight）の量（すなわちプライマ結合部位、バーコード等の数）に応じて大幅に変化する場合がある。ある特定の実施形態では、ハロプローブの二本鎖領域は２０塩基対長〜１００塩基対長（例えば３０ｂｐ〜６０ｂｐ）であり、隣接領域の配列（ゲノム中の標的断片に特異的にハイブリダイズすることができる）は１０塩基長〜１００塩基長（例えば１２塩基長〜５０塩基長）とすることができる。容易に理解されるように、ハロプローブの二本鎖領域のヌクレオチド配列は、研究中のゲノムにハイブリダイズしないように設計するものとする。

【0075】

上記の方法は、ゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＢＡＣクローン等を含むが、これらに限定されない実質的に任意の核酸供給源に由来するＤＮＡを操作及び分析するために用いることができる。さらに、植物、動物（例えば爬虫類、哺乳動物、昆虫、蠕虫、魚類等）、組織サンプル、細菌、真菌（例えば酵母）、ファージ、ウイルス、死体組織、考古学的／古代サンプル等を含むが、これらに限定されない任意の生物、有機物質又は核酸含有物質を本発明に従って処理される核酸の供給源として使用することができる。ある特定の実施形態では、上記方法に使用される初期ＤＮＡは哺乳動物に由来していてもよく、ある特定の実施形態では哺乳動物はヒトである。

【0076】

ある特定の実施形態では、分析される初期ＤＮＡは単一供給源（例えば単一の生物、ウイルス、組織、細胞、被験体等）に由来するものとすることができるが、他の実施形態では、核酸サンプルは複数の供給源から抽出される核酸のプール（例えば複数の生物、組織、細胞、被験体等の核酸のプール）であり、ここで「複数」とは２つ以上を意味する。したがって、ある特定の実施形態では、核酸サンプルは２個以上の供給源、３個以上の供給源、５個以上の供給源、１０個以上の供給源、５０個以上の供給源、１００個以上の供給源、５００個以上の供給源、１０００個以上の供給源、５０００個以上の供給源、約１００００個以上の供給源を含むそれ以下の供給源に由来する核酸を含有することができる。分子バーコードは、異なる供給源に由来する配列を、それらを分析した後に区別することを可能にする。加えて、反応は複数の異なる標的遺伝子座（例えば１０個〜１０００個）が単一反応で標的化されるような多重反応とすることができる。

【0077】

キット
上記のような主題の方法を行うためのキットも本開示によって提供される。主題のキットは少なくとも記載のハロプローブ、及び上記方法を行うのに好適な反応試薬（例えば緩衝剤等）を含有する。キットの様々な構成要素は別個の容器に存在していてもよく、又はある特定の適合する構成要素が必要に応じて単一容器に予め合わせられていてもよい。

【0078】

上述の構成要素に加えて、主題のキットは、主題の方法を実施するための、すなわちサンプル分析を説明するためのキットの構成要素の使用説明書を更に含むことができる。主題の方法を実施するための説明書は概して、好適な記録媒体に記録されている。例えば、説明書は紙又はプラスチック等の基体に印刷されている。そのため、説明書は添付文書として、キット又はその構成要素の容器のラベル（すなわち、パッケージ又はサブパッケージに付随する）等でキットに含まれる場合がある。他の実施形態では、説明書は好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット等に存在する電子記憶データファイルとして含まれる。更に他の実施形態では、実際の説明書はキットに含まれず、遠隔供給源から、例えばインターネット経由で説明書を得るための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができる及び／又は説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、この説明書を得るための手段も好適な基体に記録される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】