特許 6336979 α−コノトキシンペプチド、その医薬組成物及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6336979

(24)【登録日】2018年5月11日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】α−コノトキシンペプチド、その医薬組成物及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20180528BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180528BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20180528BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180528BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180528BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180528BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 25/30 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 25/34 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 25/32 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 25/36 20060101ALI20180528BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20180528BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20180528BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/08ZNA

   C12N15/00 A

   C07K19/00

   C12N1/15

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N1/19

   A61P25/30

   A61P25/34

   A61P25/32

   A61P25/36

   G01N33/15 Z

   G01N33/50 Z

【請求項の数】17

【全頁数】61

(21)【出願番号】特願2015-525711(P2015-525711)

(86)(22)【出願日】2013年6月18日

(65)【公表番号】特表2015-532637(P2015-532637A)

(43)【公表日】2015年11月12日

(86)【国際出願番号】CN2013077363

(87)【国際公開番号】WO2014023129

(87)【国際公開日】20140213

【審査請求日】2016年1月26日

(31)【優先権主張番号】201210277619.8

(32)【優先日】2012年8月7日

(33)【優先権主張国】CN

(31)【優先権主張番号】201210325531.9

(32)【優先日】2012年9月6日

(33)【優先権主張国】CN

(31)【優先権主張番号】201210347966.3

(32)【優先日】2012年9月19日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】514318323

【氏名又は名称】ハイナン ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100164563

【弁理士】

【氏名又は名称】佐々木 貴英

(72)【発明者】

【氏名】ルオ スゥラン

(72)【発明者】

【氏名】ジャンスン ドンティン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ヨーン

(72)【発明者】

【氏名】ジュウ シャオプオン

(72)【発明者】

【氏名】ホゥ ユエンイエン

(72)【発明者】

【氏名】ビーン ホゥイ

(72)【発明者】

【氏名】ジェイ．マイケル マッキントッシュ

【審査官】 佐藤 巌

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０１３８１４０３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３３３５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５３４９９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０２１５４３００（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０００１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２６２２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１２３７５８４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０１７４５０９７（ＣＮ，Ａ）

【文献】 BROWN, M.，Drug Dis. Today，２００２年，Vol.7，pp.885-886

【文献】 YUAN, D-D. et al.，Toxicon，２００７年，Vol.49，pp.1135-1149

【文献】 DOWELL, C. et al.，J. Neurosci.，２００３年，Vol.23, No.24，pp.8445-8452

【文献】 YANG, K-C. et al.，Acta Pharmacol. Sin.，２００９年，Vol.30, No.6，pp.740-751

【文献】 AZAM, L. and MCINTOSH, J.M.，Acta Pharmacol. Sin.，２００９年，Vol.30, No.6，pp.771-783

【文献】 JERLHAG, E. et al.，Eur. Neuropsychopharmacol.，２００８年，Vol.18，pp.508-518

【文献】 BRUNZELL, D.H. et al.，Neuropsycopharmacol.，２０１０年，Vol.35，pp.665-673

【文献】 EXLEY, R. et al.，Neuropsycopharmacol.，２００８年，Vol.33，pp.2158-2166

【文献】 QUIK, M. et al.，J. Neurosci.，２００１年，Vol.21, No.15，pp.5494-5500

【文献】 KURYATOV, A. et al.，Neuropharmacol.，２０００年，Vol.39，pp.2570-2590

【文献】 MCINTOSH, J.M. et al.，Mol. Pharmacol.，２００４年，Vol.65, No.4，pp.944-952

【文献】 HONE, A.J. et al.，Mol. Pharmacol.，２０１２年１１月，Vol.82, No.5，pp.972-982

【文献】 BAI-SONG, L. et al.，Peptides，１９９９年，Vol.20，pp.1139-1144

【文献】 TALLEY, T.T. et al.，J. Biol. Chem.，２００６年，Vol.281, No.34，pp.24678-24686

【文献】 FRANCO, A. et al.，Biochem. Pharmacol.，２０１１年１１月１６日，Vol.83，pp.419-426

【文献】 KLIMIS,H. et al.，Pain，２０１１年，Vol.152，pp.259-266

【文献】 JERLHAG, E. et al.，Alcohol Alcohol.，２００６年，Vol.41，pp.486-493

【文献】 LUO, S. et al.，J. Biol. Chem.，２０１３年 １月１１日，Vol.288，pp.894-902

【文献】 McINTOSH,J.M. et al.，J. Biol. Chem.，２００５年，Vol.280，pp.30107-30112

【文献】 LARSSON, A. et al.，Alcohol，２００４年，Vol.34，pp.239-250

【文献】 NICKE, A. et al.，Eur. J. Biochem.，２００４年，Vol.271，pp.2305-2319

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。

【請求項2】

前記ポリペプチドのＮ末端から数えて１番目のシステインと３番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして前記ポリペプチドのＮ末端から数えて２番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成するか；
あるいは
前記ポリペプチドのＮ末端から数えて、１番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして前記ポリペプチドのＮ末端から数えて２番目のシステインと３番目のシステインがジスルフィド結合を形成するか；
あるいは
前記ポリペプチドのＮ末端から数えて、１番目のシステインと２番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして前記ポリペプチドのＮ末端から数えて３番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成する、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記ポリペプチドのカルボキシル末端はアミド化されている、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

請求項１又は２に記載のポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。

【請求項5】

配列番号１６で示されるヌクレオチド配列からなる、請求項４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

請求項４又は５に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクト。

【請求項7】

請求項６に記載の核酸コンストラクトを含む発現ベクター。

【請求項8】

請求項７に記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。

【請求項9】

請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。

【請求項10】

請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、又は請求項９に記載の融合タンパク質を含む、依存症の治療、及び／又は予防のための医薬組成物。

【請求項11】

医薬的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

インビトロにおいて、アセチルコリン受容体を遮断するための方法であって、有効量の請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載の融合タンパク質を使用する工程を含み、ここで前記アセチルコリン受容体がα６／α３β２β３アセチルコリン受容体である、前記方法。

【請求項13】

アセチルコリン受容体の遮断における請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載の融合タンパク質のインビトロでの使用であって、ここで、前記アセチルコリン受容体がα６／α３β２β３アセチルコリン受容体である、前記使用。

【請求項14】

アセチルコリン受容体を遮断するための医薬の製造における、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載の融合タンパク質の使用であって、ここで、前記アセチルコリン受容体がα６／α３β２β３アセチルコリン受容体である、前記使用。

【請求項15】

依存症の治療、及び／又は予防のための医薬の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載の融合タンパク質の使用。

【請求項16】

前記依存症は、ニコチン、アヘン、ヘロイン、メチルアンフェタミン（アイス）、モルフィン、マリファナ又はコカインによって誘導される、請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

禁煙、又は依存症治療のための薬剤の製造における請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載の融合タンパク質の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、生物化学及び分子生物学の分野に属し、新規α−コノトキシン (conotoxin) ペプチド、その医薬組成物、それらの調製方法及び使用に関する。本発明はさらに、コノトキシンペプチドのプロペプチド、コノトキシンペプチドの核酸コンストラクト、発現ベクター及び形質転換細胞に関し、並びにコノトキシンペプチドの融合タンパク質に関する。本発明はさらに、アセチルコリン受容体を遮断する方法、及び医薬の製造におけるコノトキシンペプチドの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

背景技術
コノトキシン（ＣＴｘ、コノペプチド）は、熱帯の海に生息する肉食性の軟体動物の１種であるイモガイ（Conus）により分泌され、これは、種々のイオンチャネルを制御する特殊な機能を有し、診療において重要な価値を示す。コノトキシンは通常、ジスルフィド結合に富む１０〜４６のアミノ酸を含有し、強い生物活性を有し、動物細胞膜上の受容体及びイオンチャネルに特異的に作用することができ、具体的には電位依存性イオンチャネル又はリガンド依存性イオンチャネルに対して比較的高い選択性を有する（数個のＧタンパク質関連受容体などを含む）。コノトキシンは、前駆体タンパク質である小胞体標的化配列及びシステインパターンにより、異なる遺伝子ファミリーに分類することができる。これまでのところ、すべての既知のコノトキシンは、１９のスーパーファミリー、すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｓ、Ｍ、Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３、Ｊ、Ｌ、Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｐ、Ｔ、Ｖ、Ｙ、Ｋに分類することができる（Sulan Luo, Sean Christensen, Dongting Zhangsun, Yong Wu, Yuanyan Hu, Xiaopeng Zhu, Sandeep Chhabra, Raymond S. PLoS ONE, (2013) 8(1): e54648 (1-10); Kaas Q, Yu R, Jin AH, Dutertre S and Craik DJ.Nucleic Acids Research (2012) [Ahead of print]; Ye M, Khoo KK, Xu S, Zhou M, Boonyalai N, Perugini MA, Shao X, Chi C, Galea CA, Wang C & Norton RS. A helical conotoxin from Conus imperialis has a novel cysteine framework and defines a new superfamily. Journal of Biological Chemistry (2012) 287, 14973-14983）。コノトキシンは、その受容体標的に従って薬理学的ファミリーであるα、ω、μ、δなどに分類することができる。受容体の標的型に従って、コノトキシンの各スーパーファミリーはさらに、α、αＡ、κＡ（Ａ−スーパーファミリー）、ω、δ、κ、μＯ（Ｏ−スーパーファミリー）、μ、ψ、κＭ（Ｍ−スーパーファミリー）、など（サブタイプ）に分類することができる。

【0003】

一方、α−コノトキシンは、ニコチンアセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）サブタイプ特異的遮断剤であり、当該分野において最も高い選択性を有することが知られているものである。従って、α−コノトキシンとその作用標的ｎＡＣｈＲは、多くの疾患の機序の研究において、及び薬剤の研究と開発において、非常に重要な価値がある。α−コノトキシンは、最も初期から知られているコノトキシンの１つであり、比較的小さい分子量を有し、通常１２〜１９のアミノ酸残基からなり、ジスルフィド結合に富んでいる。多様な活性と複雑な構造変化を有する多種類のα−コノトキシンがある。α−コノトキシンは、その高度保存的シグナルペプチド配列、薬理活性、及びシステインパターンに従って分類することができる。α−コノトキシンのシステインパターンはＣＣ−Ｃ−Ｃであり、ここで、天然のペプチドのジスルフィドの結合モードはＣ１−Ｃ３及びＣ２−Ｃ４であり、これは球状異性体と呼ばれ、ジスルフィド結合の間に２つのループが形成される。４つのシステインを含むα−コノトキシン線形ペプチドは通常、Ｃ１−Ｃ３及びＣ２−Ｃ４（球状異性体）の天然ペプチドのジスルフィド結合モード以外に、酸化とフォールディング後に３つの異性体を生成し、他の２つの異性体は別々にリボン異性体とビーズ異性体である。リボン異性体はＣ１−Ｃ４及びＣ２−Ｃ３としてのジスルフィドの結合モードを有し、ビーズ異性体はＣ１−Ｃ２及びＣ３−Ｃ４としてのジスルフィドの結合モードを有する。球状異性体は完全な生物活性を有し、リボン異性体は、時に異なる活性機序により生物活性を示し、一方ビーズ異性体は通常、低下した活性を有する。ジスルフィド結合間に２つのループが形成され、α−コノトキシンは、２番目と３番目のシステインの間、及び３番目と４番目のシステインの間のアミノ酸の数に従って、α３／５、α４／７、α４／６、α４／４、及びα４／３などの多くのサブファミリーに分類することができ、各ループの特徴と残基組成の差が、異なるコノトキシンが異なる受容体サブタイプに作用するという基礎を形成する（Ulens C, Hogg RC, Celie PH, et al. Structural determinants of selective alpha-conotoxin binding to a nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP[J]. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: 3615-20; McIntosh, J. M.; Santos, A.Olivera, B. M., Conus peptides targeted to specific nicotinic acetylcholine receptor subtypes. Annual review of biochemistry 1999,68, 59-88; Terlau, H.; Olivera, B. M., Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides. Physiological reviews 2004,84 (1), 41-68. Gehrmann J, Alewood PF, Craik DJ. Structure determination of the three disulfide bond isomers of alpha-conotoxin GI: a model for the role of disulfide bonds in structural stability1998, 278(2):401-15; Grishin AA, Wang CI, Muttenthaler M, Alewood PF, Lewis RJ, Adams DJ. Alpha-conotoxin AuIB isomers exhibit distinct inhibitory mechanisms and differential sensitivity to stoichiometry of alpha3beta4 nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 2010, 285 (29): 22254-63）。

【0004】

ニコチンアセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）は、動物界に高い頻度で見られる膜タンパク質であり、そして重要な生理学的作用及び臨床研究的な重要性を有し、これらは、ヒトにより見いだされた最初の受容体であり、２群（筋肉型アセチルコリン受容体と神経型アセチルコリン受容体）に分類することができる。ｎＡＣｈＲは、細胞膜上のアロステリック膜タンパク質であり、学習、記憶、依存症、応答、及び鎮痛と運動制御を含む中枢及び末梢神経系の多くの生理学的機能を仲介する。ｎＡＣｈＲは、多くの神経伝達物質、例えばドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン、γ−アミノブチル酸の放出を活性化する。ｎＡＣｈＲは、重要な疾患の大きな群の診断及び治療の薬剤をスクリーニングするための重要な標的であることが確認されており、これらの疾患は、疼痛、タバコ、アルコール及び薬物への依存症（addiction）、精神薄弱、認知症、統合失調症、中枢神経系の障害、てんかん、パーキンソン病、精神疾患、神経筋遮断、重症筋無力症、うつ病、高血圧、不整脈、喘息、筋弛緩、脳卒中、乳癌及び肺癌を含む。これまで、これらの疾患の対処療法のための医薬は存在していない。一般的な非選択的ｎＡＣｈＲアゴニスト、例えばニコチンは、上記の神経疾患の症状を緩和することができるが、これらは、心臓及び胃腸管、及び依存症への強い副作用及び依存性を有する。それ故、上記の疾患の治療のための鍵は、ｎＡＣｈＲの様々なサブタイプに関する高い選択性を有するリガンド医薬を開発することである（Livett BG, Sandall DW, Keays D, Down J, Gayler KR, Satkunanathan N, Khalil Z. Therapeutic applications of conotoxins that target the neuronal nicotinic acetylcholine receptor. Toxicon. 2006,48(7):810-829; Taly A., Corringer PJ, Guedin D, Lestage P, Changeux JP. Nicotinic receptors: allosteric transitions and therapeutic targets in the nervous system. Nat Rev Drug Discov. 2009, 8(9): 733-50; Layla A, McIntosh JM. Alpha-conotoxins as pharmacologica probes of nicotinic acetylcholine receptors [J]. Acta Pharmacol Sin 2009 Jun; 30 (6): 771-783.)。

【0005】

しかしながら、かかる医薬を開発するための前提条件は、様々なサブタイプの優れた組成物及び生理学的機能を研究及び同定するためのツール医薬として用いることができるか、又は関連する疾患のための治療薬として直接的に用いることができる、ｎＡＣｈＲの様々なサブタイプと特異的に結合することができる選択的な化合物を得ることである。加えて、乳癌及び小細胞肺癌の腫瘍細胞膜上のアセチルコリン受容体の活性化は、腫瘍細胞の増殖を促進することができ、従ってこれらの受容体の活性化を医薬で遮断することは、これらの壊滅的な癌の早期診断又は治療を行うのに効果的に使用することができる。

【0006】

ｎＡＣｈＲは、異なるα及びβサブユニットと組み立てられて多くのサブタイプを形成し、各サブタイプは異なる薬理学的特徴を有し、そのうち、筋肉アセチルコリン受容体は５つのサブユニット（２つのα１サブユニット、１つのβサブユニット、１つのδサブユニット及び１つのγもしくはεサブユニットを含む）からなり、これがγ又はεサブユニットであってもなくても、これが胎児性であるか又は成人性アセチルコリン受容体であるかに依存する。哺乳動物の神経ｎＡＣｈＲのサブタイプは、筋肉ｎＡＣｈＲよりはるかに多く、少なくとも８つのαサブユニット、３つのβサブユニットを有し、これらは別々に、α２−α７、α９、α１０（ニワトリのα８）、及びβ２−β４である。ここで、α２、α３及びα４は別々にβ２又はβ４に結合して機能性受容体、例えばα２β２、α３β２、α２β４を形成することができ、α９とα１０は結合して機能性受容体α９α１０ ｎＡＣｈＲを形成する。加えて、α７とα９は相同的マルチマーを形成することができる。種々のサブタイプに対して高い選択性を有するリガンド化合物は存在しないため、種々のｎＡＣｈＲサブタイプの優れた構造と機能を研究し例示することは大きな挑戦である。

【0007】

薬物依存症は、医学的課題であり社会問題である。喫煙依存症は煙草のニコチンにより引き起こされ、そのインビボの受容体は、ニコチンアセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）である（Azam L, McIntosh JM. Alpha-conotoxins as pharmacological probes of nicotinic acetylecholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 2009; 30(6): 771-783.）。ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンのｎＡＣｈＲの発現は、神経心理学的疾患、例えばニコチン、モルフィン、コカインの依存症、パーキンソン病、認知症、統合失調症、うつ病の治療の薬剤作用標的である（Larsson, A.; Jerlhag, E.; Svensson, L.; Soderpalm, B.; Engel, J. A., is an alpha-conotoxin MII-sensitive mechanism involved in the neurochemical, stimulatory, and rewarding effects of ethanol? Alcohol 2004, 34 (2-3), 239-50. Jerlhag, E.; Egecioglu, E.; Dickson, S. L.; Svensson, L.; Engel, J. A., Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors are involved in mediating the ghrelin-induced locomotor stimulation and dopamine overflow in nucleus accumbens. European neuropsychopharmacology, 2008, 18 (7), 508-18）。α３β２及びα６β２* ｎＡＣｈＲを遮断することができるα−コノトキシン−ＭＩＩは、線条体シナプトソームからのドーパミン放出を部分的にかつ差別的にブロックすることができ、そしてシナプス前ｎＡＣｈＲは、ドーパミンニューロンからのＤＡ放出を制御することができる少なくとも２のサブタイプ、すなわち、ＭＩＩ感受性型とＭＩＩ非感受性型を含有する（Kaiser SA, Soliakov L, Harvey SC, Luetje CW, Wonnacott S. Differential inhibition by α-conotoxin-MII of the nicotinic stimulation of [3H]-dopamine release from rat striatal synaptosomes and slices. J Neurochem 1998; 70: 1069-76）。いくつかの新しい報告は、α３β４又はα６β２を含有するｎＡＣｈＲを遮断することが、喫煙依存症とモルフィン依存症の発症を効果的に防止することができ、喫煙と薬物に対する欲求を有意に抑制することができることを示す（Brunzell DH, Boschen KE, Hendrick ES, Beardsley PM, McIntosh JM. Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors in the nucleus accumbens shell regulate progressive ratio responding maintained by nicotine. Neuropsychopharmacology, 2010; 35(3):665-673.）。

【0008】

加えて、ＤＡニューロンは、α６サブユニットを含有するｎＡＣｈＲの非常に高い発現量を有し、α６^* ｎＡＣｈＲに特異的な薬理学的分子プローブが欠如しているため、依存症におけるα６ ｎＡＣｈＲの重要な作用機序はいまだに不明である。哺乳動物の脳の線条体上のα６β２^*−ｎＡＣｈＲサブタイプは、喫煙依存症と薬物依存症の治療のための薬物作用標的と見なされる（Exley, R.; Clements, M. A.; Hartung, H.; McIntosh, J. M.; Cragg, S. J., Alpha6-containing nicotinic acetylcholine receptors dominate the nicotine control of dopamine neurotransmission in nucleus accumbens. Neuropsychopharmacology 2008, 33 (9), 2158-66）。α６サブタイプは脳に広くは分布されず、中脳ドーパミン作動性ニューロン領域に濃縮されており、この領域は、幸福感、報われ感、及びムードコントロールに密接に関連しており、これは、α６^* ｎＡＣｈＲが薬物依存症とムードコントロールにおいて重要な役割を果たしていることを意味する（Yang, K. C.,Z. Jin, et al. (2009). Mysterious alpha6-containing nAChRs: function, pharmacology, and pathophysiology. Acta Pharmacol Sin 30(6): 740-751. Klink, R.; de Kerchove d'Exaerde, A.; Zoli, M.; Changeux, J. P., Molecular and physiological diversity of nicotinic acetylcholine receptors in the midbrain dopaminergic nuclei. The Journal of neuroscience, 2001, 21 (5), 1452-63. Azam, L.; Winzer-Serhan, U. H.; Chen, Y.; Leslie, F. M., Expression of neuronal nicotinic acetylcholine receptor subunit mRNAs within midbrain dopamine neurons. The Journal of comparative neurology 2002,444 (3), 260-74. Champtiaux, N.; Gotti, C.; Cordero-Erausquin, M.; David, D. J.; Przybylski, C.; Lena, C.; Clementi, F.; Moretti, M.; Rossi, F. M.; Le Novere, N.; McIntosh, J. M.; Gardier, A. M.; Changeux, J. P., Subunit composition of functional nicotinic receptors in dopaminergic neurons investigated with knock-out mice. The Journal of neuroscience, 2003, 23 (21), 7820-9. Pons, S.; Fattore, L.; Cossu, G.; Tolu, S.; Porcu, E.; McIntosh, J. M.; Changeux, J. P.; Maskos, U.; Fratta, W., Crucial role of alpha4 and alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunits from ventral tegmental area in systemic nicotine self-administration. The Journal of neuroscience, 2008, 28 (47), 12318-27）。α６^* ｎＡＣｈＲはまた、カテコールアミン作動性核と網膜でも発現される（Le Novere, N.; Zoli, M.; Changeux, J. P., Neuronal nicotinic receptor alpha 6 subunit mRNA is selectively concentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain. The European journal of neuroscience 1996,8 (11), 2428-39. Vailati, S.; Hanke, W.; Bejan, A.; Barabino, B.; Longhi, R.; Balestra, B.; Moretti, M.; Clementi, F.; Gotti, C., Functional alpha6-containing nicotinic receptors are present in chick retina. Molecular pharmacology 1999,56 (1), 11-9.)。α６β２^* ｎＡＣｈＲは、ドーパミン放出を制御する機能を示し、及びα６β２^* ｎＡＣｈＲは１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロ高リスクの霊長類モデル及びヒトパーキンソン病モデルにおいて顕著に低下する（Champtiaux, N.; Han, Z. Y.; Bessis, A.; Rossi, F. M.; Zoli, M.; Marubio, L.; McIntosh, J. M.; Changeux, J. P., Distribution and pharmacology of alpha 6-containing nicotinic acetylcholine receptors analyzed with mutant mice. The Journal of neuroscience, 2002, 22 (4), 1208-17. Quik, M.; Polonskaya, Y.; Kulak, J. M.; McIntosh, J. M., Vulnerability of 125I-alpha-conotoxin MII binding sites to nigrostriatal damage in monkey. The Journal of neuroscience, 2001, 21 (15), 5494-500. Quik, M.; Bordia, T.; Forno, L.; McIntosh, J. M., Loss of alpha-conotoxin MII- and A85380-sensitive nicotinic receptors in Parkinson's disease striatum. Journal of neurochemistry 2004, 88 (3), 668-79）。従って、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲ特異的遮断剤は、異なる組織におけるα６^* ｎＡＣｈＲ（依存症、パーキンソン病などの関連疾患の治療のための医薬）の生理学的機能を研究し説明するのに貴重なツールであるか、又はそのような医薬をスクリーニングするためのツール薬剤である。

【0009】

新しい研究は、α３β４を含有するｎＡＣｈＲを遮断することが、喫煙依存症とモルフィン及びコカイン依存症の発症を効果的に防止することができ、喫煙と薬物に対する欲求を有意に抑制することができることを示す（Brunzell DH, Boschen KE, Hendrick ES, Beardsley PM, McIntosh JM. Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors in the nucleus accumbens shell regulate progressive ratio responding maintained by nicotine, Neuropsychopharmacology, 2010, 35(3):665-73）。

【0010】

研究は、人口の約６分の１が、関節炎、神経痛、ひりひりした痛みを含む疼痛（このうち、人の口４〜８％が関節炎に罹患する）に苦しみ、神経痛が、アルコール依存症、座骨神経痛、癌及び癌化学療法、糖尿病、顔面痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷によって発生する可能性があることを示している。α３β２及びα３β４サブタイプを含むα３サブユニットを含むｎＡＣｈＲは主に末梢神経系で発現され、中枢神経系にも分布しており、神経痛薬の作用のための標的である。α３β２又はα３β４を遮断することができるα−コノトキシンは、診療で多くの慢性の痛みに優れた鎮痛活性を示し、依存症は無い。慢性の疼痛は世界的に健康問題であり、新しい治療薬に対する緊急の必要性がある（Napier, I. A.; Klimis, H.; Rycroft, B. K.; Jin, A. H.; Alewood, P. F.; Motin, L.; Adams, D. J.; Christie, M. J., Intrathecal α-conotoxins Vc1.1, AuIB and MII acting on distinct nicotinic receptor subtypes reverse signs of neuropathic pain. Neuropharmacology 2012,62 (7), 2202-2207. Blyth, F. M.; March, L. M.; Brnabic, A. J.; Jorm, L. R.; Williamson, M.; Cousins, M. J., Chronic pain in Australia: a prevalence study. PAIN 2001,89 (2-3), 127-34. Cousins, M. J.; Brennan, F.; Carr, D. B., Pain relief: a universal human right. PAIN 2004,112 (1-2), 1-4. Eisenberg, E.; McNicol, E. D.; Carr, D. B., Efficacy and safety of opioid agonists in the treatment of neuropathic pain of nonmalignant origin: systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. JAMA : the journal of the American Medical Association 2005,293 (24), 3043-52.）。

【0011】

α３β４ ｎＡＣｈＲは、感覚神経及び自律神経中心の主要なアセチルコリン受容体サブタイプである。α３β４ ｎＡＣｈＲはまた、中心髄と背面髄に延長している手綱などの中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの分岐であり、ニコチンやその他の乱用薬物の依存症に関連する（Millar, N. S.; Gotti, C., Diversity of vertebrate nicotinic acetylcholine receptors. Neuropharmacology 2009,56 (1), 237-46; Tapper, A. R.; McKinney, S. L.; Nashmi, R.; Schwarz, J.; Deshpande, P.; Labarca, C.; Whiteaker, P.; Marks, M. J.; Collins, A. C.; Lester, H. A., Nicotine activation of alpha4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science 2004,306 (5698), 1029-32.）。α３β４ ｎＡＣｈＲは、辺縁系ドーパミン経路に関し、乱用物質（薬物など）によって生成された報われ感に対して非常に重要な役割を果たしている。β４サブユニットノックアウトマウスでは、運動と報われ感は有意に低下し、これは、ＣＮＳにおけるニコチン依存症に対するα３β４ ｎＡＣｈＲの重要な作用を示唆している（Salas, R., Sturm, R., Boulter, J., and De Biasi, M. (2009) Nicotinic receptors in the habenulo-interpeduncular system are necessary for nicotine withdrawal in mice. J. Neurosci. 29, 3014-3018）。α３β４ ｎＡＣｈＲはまた、脅迫応答において非常に重要な役割を果たし、グルタミン酸の制御とノルアドレナリンの放出に顕著に影響を与える（Zhu, P. J.; Stewart, R. R.; McIntosh, J. M.; Weight, F. F., Activation of nicotinic acetylcholine receptors increases the frequency of spontaneous GABAergic IPSCs in rat basolateral amygdala neurons. Journal of neurophysiology 2005, 94 (5), 3081-91. Alkondon, M.; Albuquerque, E. X., A non-alpha7 nicotinic acetylcholine receptor modulates excitatory input to hippocampal CA1 interneurons. Journal of neurophysiology 2002, 87 (3), 1651-4. Luo, S.; Kulak, J. M.; Cartier, G. Jacobsen, R. B.; Yoshikami, D.; Olivera, B. M.; McIntosh, J. M., alpha-conotoxin AuIB selectively blocks alpha3 beta4 nicotinic acetylcholine receptors and nicotine-evoked norepinephrine release. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 1998, 18 (21), 8571-9. Kulak, J. M.; McIntosh, J. M.; Yoshikami, D.; Olivera, B. M., Nicotine-evoked transmitter release from synaptosomes: functional association of specific presynaptic acetylcholine receptors and voltage-gated calcium channels. Journal of neurochemistry 2001, 77 (6), 1581-9.）。

【0012】

ｎＡＣｈＲの特定のサブタイプに対して顕著な選択性を有するα−ＣＴｘは、種々のサブタイプの分布と機能、及び関連疾患の治療のための医薬を研究するための必要なツールである（Kasheverov, I. E., Utkin, Y. N., and Tsetlin, V. I. (2009) Naturally Occurring and Synthetic Peptides Acting on Nicotinic Acetylcholine Receptors. Current Pharmaceutical Design 15, 2430-2452; Nicke, A., Wonnacott, S., and Lewis, R. J. (2004) alpha-Conotoxins as tools for the elucidation of structure and function of neuronal nicotinic acetylcholine receptor subtypes. Eur. J. Biochem. 271, 2305-2319）。α３β２サブタイプを特異的に遮断することができるが、非常によく似たα６β２^*サブタイプを遮断する活性は非常に小さいか又は全く活性の無いα−ＣＴｘは非常に貴重であり、これは、α３β２及びα６β２^*サブタイプを区別することができる非常に重要な科学的及び適用価値を有するリガンドである。その理由は、α６β２^*サブタイプがドーパミン作動性領域を支配するためである。この重要な生理学的領域における受容体の組成、特性及び生理学的機能は、α−ＣＴｘ ＭＩＩの適用のみからであるが、α−ＣＴｘ ＭＩＩはα３β２及びα６β２^*サブタイプに対して選択性が乏しく、これらを区別することができない；又はこれらは、α６β２^*サブタイプの選択性遮断剤を使用して研究される（Dowell, C., Olivera, B. M., Garrett, J. E., Staheli, S. T., Watkins, M., Kuryatov, A., Yoshikami, D., Lindstrom, J. M., and McIntosh, J. M. (2003) a-Conotoxin PIA Is Selective for 6 Subunit-Containing Nicotinic Acetylcholine Receptors. The Journal of Neuroscience 23, 8445-8452; McIntosh, J. M., Azam, L., Staheli, S., Dowell, C., Lindstrom, J. M., Kuryatov, A., Garrett, J. E., Marks, M. J., and Whiteaker, P. (2004) Analogs of alpha-conotoxin MII are selective for alpha 6-containing nicotinic acetylcholine receptors. Molecular pharmacology 65, 944-952; Quik, M., Perez, X. A., and Grady, S. R. (2011) Role of alpha 6 nicotinic receptors in CNS dopaminergic function: relevance to addiction and neurological disorders. Biochemical pharmacology 82, 873-882; Letchworth, S. R., and Whiteaker, P. (2011) Progress and challenges in the study of alpha 6-containing nicotinic acetylcholine receptors. Biochemical pharmacology 82, 862-872; Champtiaux, N., Gotti, C., Cordero-Erausquin, M., David, D. J., Przybylski, C., Lena, C., Clementi, F., Moretti, M., Rossi, F. M., Le Novere, N., McIntosh, J. M., Gardier, A. M., and Changeux, J. P. (2003) Subunit composition of functional nicotinic receptors in dopaminergic neurons investigated with knock-out mice. Journal of Neuroscience 23, 7820-7829). しかし、α３β２^* ｎＡＣｈＲの発現は通常、α６β２^* ｎＡＣｈＲの発現重複を引き起こす（Whiteaker, P., McIntosh, J. M., Luo, S. Q., Collins, A. C., and Marks, M. J. (2000) I-125-alpha-conotoxin MII identifies a novel nicotinic acetylcholine receptor population in mouse brain. Molecular pharmacology 57, 913-925; Whiteaker, P., Peterson, C. G., Xu, W., McIntosh, J. M., Paylor, R., Beaudet, A. L., Collins, A. C., and Marks, M. J. (2002) Involvement of the alpha 3 subunit in central nicotinic binding populations. Journal of Neuroscience 22, 2522-2529; McClure-Begley, T. D., Wageman, C. R., Grady, S. R., Marks, M. J., McIntosh, J. M., Collins, A. C., and Whiteaker, P. (2012) A novel alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptor modulates H-3 -GABA release in the superficial layers of the mouse superior colliculus. J Neurochem 122, 48-57）。さらに、脊椎中のα３β２^* ｎＡＣｈＲはまた、疼痛刺激の伝達に重要な役割を果たし、鎮痛作用の標的である（Young, T., Wittenauer, S., McIntosh, J. M., and Vincler, M. (2008) Spinal α3β2* nicotinic acetylcholine receptors tonically inhibit the transmission of nociceptive mechanical stimuli. Brain research 1229, 118-124）。すなわち、α３β２^*対α６β２^* ｎＡＣｈＲ選択性遮断剤を見つけることは、正常状態及び疾患状態におけるサブタイプの機能と意味を総合的に研究し理解するのに重要な価値を有する。

【0013】

α−コノトキシンは、疼痛の治療、禁煙、リハビリテーション、パーキンソン病、認知症、うつ病及び統合失調症の治療のための新薬を開発するための、及び関連疾患の機序を研究するための、大きな可能性を有することがわかっており、特定のｎＡＣｈＲサブタイプを区別するための分子プローブツール薬剤並びに神経痛や依存症の治療のための発明薬剤もまた、疼痛、喫煙依存症及び薬剤依存症により引き起こされる傷害や深刻な社会問題を緩和するために、緊急の必要性がある。現在では、高い特異性を有する新しいｎＡＣｈＲ遮断剤を開発する緊急の必要性がまだある。

【発明の概要】

【0014】

精力的な研究及び創造的な努力の結果、本発明の発明者らは、アセチルコリン受容体を特異的に遮断することができ、特に、神経痛薬標的であるα３β２ ｎＡＣｈＲ、α３β４ ｎＡＣｈＲ又はα６／α３β４ ｎＡＣｈＲと、依存症薬標的であるα６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲ又はα３β４ ｎＡＣｈＲと、を遮断する強力な活性を有し、そして動物モデルにおける強力鎮痛活性を示し、従って、鎮痛、禁煙及びリハビリテーション用の医薬の製造の面で、及びうつ病、認知症、統合失調症、パーキンソン病の予防と治療の面で、又は神経科学的ツール薬剤としての使用の面で、優れた応用の見込みがある、新しい種類のα−コノトキシンペプチドを発見した。従って、以下の発明が提供される。

【0015】

本発明の１つの態様は、式Ｉ：

【化1】

［式中、
Ｘ₁は、Ｄ又はＨであり、
Ｘ₂は、Ｐ、Ａ又はＶであり、
Ｘ₃は、Ｒ、Ｎ又はＳであり、
Ｘ₄は、Ｎ、Ｖ又はＡであり、
Ｘ₅は、Ｋ、Ｄ、Ｍ又はＡであり、
Ｘ₆は、Ｈ又はＳであり、
Ｘ₇は、Ｄ、Ｅであるか、又は存在せず、
Ｘ₈は、Ｌ又はＩであり、
Ｘ₉は、Ｇであるか、又は存在しない］；
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに関し、
任意に、式ＩのポリペプチドのＣ末端はアミド化されている。

【0016】

上記アミノ酸Ｄ、Ｈ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｒ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ｉ、Ｇは、アミノ酸の略語であり、当業者に公知の意味を有する。

【0017】

式ＩのポリペプチドのＣ末端のアミド化はまた、＃により示すこともでき、すなわち、ＧＣＣＳＸ₁ＰＸ₂ＣＸ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆ＰＸ₇Ｘ₈ＣＸ₉＃で示すことができる。

【0018】

本発明はさらに、以下の項目（１）〜（３）：
（１）配列番号３、４、６、１１〜１５、２６〜２８又は３０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列；
（２）前記（１）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
（３）１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加において前記（１）又は（２）の配列と異なるアミノ酸配列
のいずれか１つのアミノ酸配列であるか、又はいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに関する。

【0019】

本発明の１つの目的のために、２又は複数のアミノ酸配列の同一性は、以下のパラメーター：ｂｌａｓｔａｌｌ −ｐ ｂｌａｓｔｐ−ａ４− ｅ１０−Ｅ０−ｖ５００−ｂ２５０−Ｉ ［ｑｕｅｒｙ ｄｏｃｕｍｅｎｔ］−ｄ ｐｒｏｔ＿ａｌｌ（−ｐはプログラムの名称を表し、−ａはサーバーの名称を表し、−ｅは予測値を表し、−Ｅはエクステンションギャップのコストを表し、−ｖはオンラインディスクリプションの数を表し、−ｂは表示される比較数を表し、−Ｉはクエリードキュメントを表し、−ｄはクエリーのために用いられるデータベースを表す）を用いて、ＢＬＡＳＴ２．０タンパク質データベースクエリープログラム（Aaltschul et al., 1997, Nuculeic Acid Research 25: 3389-3402）により決定される。

【0020】

相同なポリペプチドのアミノ酸配列と、配列番号３、４、６、１１〜１５、２６〜２８又は３０のいずれか１つで示されるアミノ酸配列との違いは、１又は複数の、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、特に最も好ましくは１〜２、最も好ましくは１アミノ酸残基の置換、挿入付加及び／又は欠失にあってもよい。好ましくは、アミノ酸の変更は、特性にほとんど影響のない変更であり、即ち、これは従来のアミノ酸置換、通常１〜約５、好ましくは１〜３、より好ましくは１アミノ酸の欠失である小さい断片の欠失；小さいアミノ又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端に付加されるメチオニン残基、最大約２０〜２５残基を有する小さいリンカーペプチド；又は、電荷、又はポリヒスチジン断片、エピトープ、結合ドメイン（これらのすべては、タンパク質のフォールディング及び／又は活性に有意な影響を与えない）などの他の機能を変更することにより精製に寄与する小さい伸長である。

【0021】

保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）の中での置換、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）の中での置換、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）の中での置換、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）の中での置換、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）の中での置換及び小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の中での置換である。通常、特定の活性を変化させないアミノ酸置換は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、"Proteins", H.Neurath and R.L.Hill, 1979, Academic Press, New Yorkに記載されている。最も一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ等及びその逆に行われた置換である。

【0022】

本発明は、α−コノトキシンのＮ末端及び／又はＣ末端が他のペプチド／ポリペプチドと融合された、融合ポリペプチド又は溶解可能な（lysable）融合ポリペプチドをさらに含む。融合ポリペプチドを作成するための技術は、当該技術分野において知られており、それらが１つのリーディングフレーム中に存在し、そして融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーター及びターミネーターにより制御されるように、本発明のペプチドをコードするコーディング配列を他のペプチド／ポリペプチドをコードするコーディング配列と連結させることを含む。

【0023】

本発明の項目の任意の１つに記載のポリペプチドは、好ましくは配列番号４（α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１）又は配列番号３（このペプチドは実際にはα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１のプロペプチドである）で示されるアミノ酸配列を有する。

【0024】

本発明の項目のいずれか１つに記載のポリペプチドにおいて、ポリペプチドのＣ末端は、好ましくはアミド化されている。アミド化は、人工的化学合成又はインビボもしくはインビトロのアミド化酵素により行うことができる。

【0025】

本発明の項目のいずれか１つに記載のポリペプチドにおいて、好ましくはポリペプチドのＮ末端の１番目のシステインと３番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして２番目のシステインと３番目のシステインがジスルフィド結合を形成するか；あるいはポリペプチドのＮ末端の１番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして２番目のシステインと３番目のシステインがジスルフィド結合を形成するか；あるいはポリペプチドのＮ末端の１番目のシステインと２番目のシステインがジスルフィド結合を形成し、そして３番目のシステインと４番目のシステインがジスルフィド結合を形成する。

【0026】

本発明のポリペプチドは、コノトキシンであり；具体的には、α−コノトキシンである。

【0027】

コノトキシンは、中国の海南省において産生されるイボシマイモ（Conus lividus）又はタガヤサンミナシ（Conus textile）から抽出してもよく；あるいは化学的合成のアミノ酸（例えば実施例２−（１）〜２−（３）の方法）でもよく；あるいは遺伝子組み換えを介したそのヌクレオチドを発現することにより（前記ヌクレオチド配列は、実施例１−（１）〜１−（３）の方法又は実施例２−（１）〜２−（３）の方法の直接的なポリペプチドの人工的合成により調製することができる）；あるいは以下の方法を参照することにより、得られるポリペプチドでもよい。

【0028】

本発明の別の態様は、以下の工程：
１）Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基はＰｍｃ（Ａｒｇ）、Ｔｒｔ又はＡｃｍ（Ｃｙｓ）、Ｂｕｔ（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）、ＯＢｕｔ（Ａｓｐ）及びＢｏｃ（Ｌｙｓ）である、ABI Prism 433aポリペプチド合成装置又は手動の方法により線形ポリペプチドを合成し、
２）工程１）で合成された線形ポリペプチドをレジンから切り出すこと、
３）工程２）において得られた線形ポリペプチドを氷ジエチルエーテルを使用して沈殿させそして洗浄し、線形ポリペプチドの粗生成物を回収すること、
４）分取用逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を使用して、工程３）において得られた線形ポリペプチドの粗生成物を精製すること、
５）工程４）において得られた生成物を２工程又は１工程の酸化的フォールディングに供すること、
を含む、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチドを調製するための方法に関する。

【0029】

本発明の別の態様は、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに関する。

【0030】

好ましくは、本発明の項目のいずれか１つのポリヌクレオチドは、以下の項目（１）〜（３）：
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１６〜２１、配列番号２２〜２５、配列番号２９又は配列番号３１の配列のいずれか１つに示されるようなヌクレオチド配列；
（２）（１）のヌクレオチド配列の相補的配列；
（３）ストリンゲジェントな条件下で（１）のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列
のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列であるか、又はこのヌクレオチド配列を含む。

【0031】

ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションに関しては、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Edition 2, Sambrook, etc., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, 1989を含む、当該技術分野における多くの文献を参考にすることができる。ハイブリダイゼーションは、様々な程度のストリンジェントな条件、例えば、中程度にストリンジェントな条件、やや高度にストリンジェントな条件、又は高度にストリンジェントな条件を用いることができる。よりストリンジェントな条件は、二重らせんを形成するために要求される、より高度な相補的な程度である。ストリンジェントの程度は、温度、プローブ濃度、プローブ長、イオン強度、時間等により調整することができる。二重鎖ＤＮＡについて、ハイブリダイゼーションは、６Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘ デンハルト液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍ変性ＤＮＡ中で、一晩、ＤＮＡヘテロ接合体の融点［Ｔｍ］より２０〜２５℃低い温度において行なわれる。洗浄は、通常、以下：０．２Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で、Ｔｍ−２０℃において１回、１５分間（中程度にストリンジェントな条件下での洗浄）のように行なわれる。

【0032】

本発明の別の態様は、本発明の項目のいずれか１つのポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトに関する。

【0033】

本発明の別の態様は、本発明の核酸コンストラクトを含む発現ベクターに関する。

【0034】

本発明の別の態様は、本発明の発現ベクターを含む形質転換細胞に関する。

【0035】

本発明の別の態様は、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。

【0036】

本発明の別の態様は、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド、又は本発明の融合タンパク質を含み；任意で、医薬的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関する。

【0037】

本発明の別の態様は、有効量の本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質を用いる工程を含む、アセチルコリン受容体を遮断する方法に関し；具体的には、前記アセチルコリン受容体はα３β２アセチルコリン受容体、α６／α３β２β３アセチルコリン受容体又はα３β４アセチルコリン受容体である。

【0038】

本発明の別の態様は、アセチルコリン受容体のインヒビターをスクリーニングする、あるいはアセチルコリン受容体のサブタイプを決定するための方法であって、前記方法は、候補化合物の存在又は不在下において、アセチルコリン受容体と、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質とを接触させる工程を含み；具体的には、前記アセチルコリン受容体はα３β２アセチルコリン受容体、α６／α３β２β３アセチルコリン受容体又はα３β４アセチルコリン受容体である、方法に関する。前記ポリペプチド又は融合タンパク質が、α３β２アセチルコリン受容体（例えば、α−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１）を特異的に遮断することができる場合、α６／α３β２β３アセチルコリン受容体（例えば、α−コノトキシンＴｘＩＢ／Ｔｘｄ４）を特異的に遮断することができる場合、又はα３β４アセチルコリン受容体（例えば、α−コノトキシンＴｘＩＣ／Ｔｘｄ１）を特異的に遮断することができる場合、アセチルコリン受容体はα３β２サブタイプ、α６β２＊サブタイプ（α６／α３β２β３アセチルコリン受容体）又はα３β４サブタイプアセチルコリン受容体であると決定することができる。

【0039】

本発明の別の態様は、アセチルコリン受容体の遮断における、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質の使用に関し；具体的には、前記アセチルコリン受容体は、α３β２アセチルコリン受容体、α６／α３β２β３アセチルコリン受容体又はα３β４アセチルコリン受容体である。

【0040】

本発明の別の態様は、アセチルコリン受容体を遮断するための医薬又は試薬の製造における、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質の使用に関し、具体的には、前記アセチルコリン受容体は、α３β２アセチルコリン受容体、α６／α３β２β３アセチルコリン受容体又はα３β４アセチルコリン受容体である。

【0041】

本発明の別の態様は、神経系疾患、例えば依存症、神経痛、パーキンソン病又は認知症の治療及び／又は予防のための医薬の製造における、本発明の項目のいずれか１つのポリペプチド又は融合タンパク質の使用、あるいは害虫の殺滅、鎮痛、禁煙又は依存症の治療のための薬剤の製造における使用であって；具体的には、前記神経痛は、以下の因子：癌及び癌の化学療法、アルコール依存症、坐骨神経痛、糖尿病、三叉神経痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷及び外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経麻痺、薬物中毒、産業公害中毒、リンパ神経痛、骨髄腫、マルチポイントモーター神経痛（multipoint motor neuralgia）、慢性先天性感覚神経症、急性自発神経痛、圧迫するような神経痛、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児の胆汁性肝疾患、慢性呼吸器疾患、複合的な神経痛、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、高脂血症、ハンセン病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、アレルギー等により引き起される。

【0042】

本発明の別の態様は、神経系疾患、例えば疼痛、煙草、アルコール及び薬物の依存症、認知症、統合失調症、中枢神経障害、てんかん、パーキンソン病、精神障害、神経筋遮断、重症筋無力症、うつ病、高血圧、不整脈、喘息、筋弛緩、脳卒中、乳癌及び肺癌の治療及び／又は予防及び／又は補助療法のための方法、あるいは害虫の殺滅、鎮痛、禁煙、又は依存症の治療のための方法であって、有効量の本発明のポリペプチド（コノトキシンペプチド若しくはこれらのプロペプチド）若しくは融合タンパク質、又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含み、具体的には、前記依存症は、ニコチン、モルフィン、コカイン、アルコールなどの依存性物質により誘導され、前記神経痛は、以下の理由：癌及び癌の化学療法、アルコール依存症、坐骨神経痛、糖尿病、三叉神経痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷及び外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経麻痺、薬物中毒、産業公害中毒、リンパ神経痛、骨髄腫、マルチポイントモーター神経痛、慢性先天性感覚神経症、急性自発神経痛、圧迫するような神経痛、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児の胆汁性肝疾患、慢性呼吸器疾患、複合的な神経痛、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、高脂血症、ハンセン病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、アレルギー等により誘導される。

【0043】

本発明のコノトキシンペプチドは、α３β２アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）、α６／α３β２β３アセチルコリン受容体又はα３β４アセチルコリン受容体と結合することにより、効果を発揮することができ、そして鎮痛作用を有し、神経系疾患、例えば依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、うつ病の研究、診断及び／又は治療のために、そして研究における有用な分子プローブとして用いることができる。脊椎動物（vertebrate）受容体に対する様々なα ＣＴｘのアフィニティーは、例えば、桁が幾つか異なるなど、大変に多様である。生殖細胞系におけるかかる多様性により、α−ＣＴｘは、脊椎動物の系統発生を研究するためのプローブとして有用であり、あるいはｎＡｃｈＲの異なるサブタイプを決定するための分子プローブとして有用である。これらは、新規薬物の開発における、候補薬物、基礎的な薬物、及び治療薬である。

【0044】

本発明に用いられる用語を、以下に説明する。

【0045】

神経痛
本発明のポリペプチドは、様々な神経痛の治療のための使用に関する。神経痛は、末梢若しくは中枢神経系の一次若しくは二次疾患、又は機能性疾患、又は一過性疾患により引き起され、自発性疼痛、感覚過敏性等として現れる。神経痛は、癌及び癌の化学療法、アルコール依存症、坐骨神経痛、糖尿病、三叉神経痛、硬化症、帯状疱疹、機械的損傷及び外科的損傷、ＡＩＤＳ、頭部神経麻痺、薬物中毒、産業公害中毒、リンパ神経痛、骨髄腫、マルチポイント神経痛、慢性先天性感覚神経症、急性自発神経痛、圧迫するような神経痛、血管炎、脈管炎、虚血、尿毒症、小児の胆汁性肝疾患、慢性呼吸器疾患、複合的な神経痛、多臓器不全、敗血症／膿血症、肝炎、ポルフィリン症、ビタミン欠乏症、慢性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、高脂血症、ハンセン病、ライム関節炎、感覚神経周囲炎、アレルギー等を含む、多くの疾患より引き起される疼痛である。

【0046】

依存症
本発明のポリペプチドは、種々の依存性物質により引き起こされる依存症の治療に関する。依存症は、精神活性物質を繰り返し使用する対象の周期的又は慢性の中毒状態を指す。精神活性物質は、ニコチン、アヘン、ヘロイン、メチルアンフェタミン（氷）、モルフィン、マリファナ、コカイン、及び他の麻酔薬、及びヒトで依存症を引き起こし、国の規制により管理されている精神活性物質を指す。依存症は、ドーパミンの多量の生成に関し、お気に入りの物質の我慢できない使用、又は抑制も矯正もできない使用行動を示し、そしていい気分を得るか又は禁断症状を回避するための向精神物質を得るためにいかなる手段も使用することを指す。典型的な状況は、抵抗の増加と禁断症状の発生である。依存症者の生活は依存性の物質によって完全に支配され、従って大きな影響を受け、さらには、他の重要な行動とすべての責任を拒否する。従って、依存症物質の使用は、個人と社会の両方にダメージをもたらすだろう。アルコールとともに使用する場合は、依存症は慢性アルコール中毒と同等である。用語「依存症」はまた、肉体的及び心理的な内容の両方をカバーする。精神的依存症は、アルコール飲酒や薬物投与における調節損傷経験を制御強調し、一方、肉体的な依存症は抵抗と禁断症状を指す。

【0047】

核酸コンストラクト
本発明は、さらに、本発明の核酸配列、及びそれに作動式に連結される１又は複数の制御配列を含み、前記制御配列は、これらの適合する条件下で、好適な宿主細胞中で発現するためのコーディング配列を導く、核酸コンストラクトに関する。前記発現は、限定することなく、転写、転写後修飾、翻訳、修飾、及び翻訳後分泌を含むポリペプチドの生産に関する任意の工程を含むことは理解されるべきである。

【0048】

本明細書において、「核酸コンストラクト」は、天然の遺伝子から分離された一本鎖又は二本鎖核酸分子として定義され、修飾により非天然の態様において組み合わされ、且つ配置された核酸断片を含む。前記核酸コンストラクトが本発明のコーディング配列を発現するために必要な全ての制御配列を含む場合、用語「核酸コンストラクト」は、発現カセットと同一の意味を有する。本明細書において、用語「コーディング配列」は、タンパク質生成物のアミノ酸配列を直接的に決定するための核酸配列の一部として定義される。コーディング配列の境界は、通常、ｍＲＮＡ５’末端のオープンリーディングフレーム上流に密接する（原核細胞に対応する）リボソーム結合部位、及びｍＲＮＡ３’末端のオープンリーディングフレーム下流に密接する転写終結配列により決定される。コーディング配列は、限定することなく、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組み換え核酸配列を含むことができる。

【0049】

本発明のペプチドをコードする分離された核酸配列は、ペプチドを発現するように多くの方法で操作することができる。発現ベクターに依存して、前記核酸配列は、必要であれば、ベクターへの挿入の前に処理され得る。組み換えＤＮＡ法を用いた核酸配列を修飾する技術は、当該技術分野においてよく知られている。

【0050】

本明細書において、用語「制御配列」は、本発明のペプチドの発現に必須の全ての要素、あるいは貢献する全ての要素として定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列中に生来存在する、あるいは外来的に付加される。これらの制御配列としては、限定することなく、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写終結因子が挙げられる。最低限度、制御配列は、転写及び翻訳のためのプロモーター及び終結因子を含むべきである。制御配列と連結するための特異的な制限酵素認識部位を、ポリペプチドをコードする核酸配列のコーディング領域に導入するために、コネクターを有する制御配列が提供されてもよい。本明細書において、用語「作動式に連結される」とは、制御配列がポリペプチドの発現を導くように、前記制御配列が、ＤＮＡ配列に対応するコーディング配列の好適な位置に存在する配置を意味する。

【0051】

前記制御配列は、任意の好適なプロモーター配列、即ち、核酸配列を発現する宿主細胞により認識され得る核酸配列であってもよい。前記プロモーター配列は、ポリペプチド発現を調整する転写制御配列を含む。前記プロモーターは、例えば突然変異誘発された、切断された、及びハイブリダイズされたプロモーターを含む、選択された宿主細胞中で転写活性を有する任意の核酸配列でもよく、宿主細胞と同種の又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られてもよい。

【0052】

前記制御配列は、さらに、好適な転写終結配列、即ち、転写を終結させるように、宿主細胞において認識され得る配列でもよい。前記終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動式に連結される。選択された宿主細胞においてかかる機能を有する任意の終結因子を、本発明において用いることができる。

【0053】

前記制御配列は、さらに、好適なリーダー配列、即ち、宿主細胞の翻訳に大変重要なｍＲＮＡ非翻訳領域でもよい。前記リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動式に連結される。選択された宿主細胞において機能を発揮することができる任意のリーダー配列を、本発明において用いることができる。

【0054】

前記制御配列は、さらに、シグナルペプチドのコーディング領域でもよく、そして前記領域は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞分泌経路に導くことができる。核酸配列のコーディング領域の５’末端は、翻訳リーディングフレームに一致したシグナルペプチドコーディング領域を本来含み、そして分泌されたポリペプチドのコーディング領域に本来連結される。あるいは、コーディング領域の５’末端は、コーディング配列に対して、外来のシグナルペプチドコーディング領域を含んでもよい。コーディング配列が通常の条件下でシグナルペプチドコーディング領域を含まない場合、外来のシグナルペプチドコーディング領域が付加されてもよい。あるいは、外来のシグナルペプチドコーディング領域は、ポリペプチドの分泌を増大させるように、生来のシグナルペプチドコーディング領域を単に置換するために用いられてもよい。しかしながら、発現されたポリペプチドを、用いられる宿主細胞の分泌経路への移行を導くことができる任意のシグナルペプチドコーディング領域を、本発明において用いることができる。

【0055】

前記制御配列は、さらに、プロペプチドコーディング領域でもよく、前記領域はポリペプチドのアミノ末端におけるアミノ酸配列をコードする。得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチドと称される。前記プロポリペプチドは、通常、活性を有さず、触媒又は自己触媒によりプロポリペプチドからプロペプチドを切断することにより、成熟活性ポリペプチドに変換される。

【0056】

ポリペプチドのアミノ末端がシグナルペプチド及びプロペプチドの両者を有する場合、プロペプチドは、ポリペプチドのアミノ末端に隣接する一方で、シグナルペプチドは、プロペプチドのアミノ末端に隣接する。

【0057】

宿主細胞の増殖条件に従ってポリペプチド発現を制御することができる制御配列を付加することが必要であってもよい。制御系の例としては、遺伝子発現を開始又は終了するために、（制御化合物を有する条件において誘導される）化学的又は物理的刺激に応答することができる系である。制御配列の他の例は、遺伝子を増幅することができる制御配列である。これらの例において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列に作動式に連結されるべきである。

【0058】

発現ベクター
本発明は、さらに、本発明の核酸配列、並びに転写及び翻訳のためのプロモーター及びターミネーターを含む組み換え発現ベクターに関する。上記核酸及び制御配列は、組み換え発現ベクターを調製するために一緒に連結され得、そして前記ベクターは、前記ポリペプチドをコードする核酸配列をこれらの部位において挿入又は置換することができるような、１又は複数の便利な制限酵素部位を含んでもよい。あるいは、核酸配列又は前記配列を含む核酸コンストラクトは、本発明の核酸配列を発現するために、好適な発現ベクターに挿入されてもよい。前記発現ベクターが調製される場合、前記コーディング配列は、好適な発現制御配列に作動式連結されるように、ベクター中に存在してもよい。

【0059】

前記組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ操作を行なうことができ、核酸を発現することができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）でもよい。ベクターの選択は、通常、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞の適合性に依存する。前記ベクターは、線形又は環状プラスミドでもよい。

【0060】

前記ベクターは、自己複製することができるベクター（即ち、染色体から独立して複製することができる染色体外の完全なコンストラクト）、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体又は人工染色体でもよい。前記ベクターは、自己複製を確実にする任意の機序を含んでもよい。あるいは、前記ベクターは、前記ベクターが宿主細胞に導入される場合、ゲノムに統合され、それに統合される染色体と一緒に複製されるベクターである。加えて、用いられるベクターは、１つのベクター又はプラスミドでもよく、あるいは、一般的に、２又はそれ以上の宿主細胞ゲノム又はトランスポゾンに導入される全ＤＮＡのベクター又はプラスミドを含んでもよい。

【0061】

好ましくは、本発明のベクターは、形質転換細胞を選択するのに簡便な１又は複数の選択マーカーを含む。前記選択マーカーは、殺生物剤に対する抵抗性、重金属に対する抵抗性を提供するか、あるいは栄養素要求株原栄養性（auxotroph prototrophy）を提供する、かかる遺伝子である。細菌の選択マーカーの例は、バチルス・サブチリス（bacillus subtilis）又はバチラス・リケニホルミス（bacillus licheniformis）のｄａｌ遺伝子であり、耐性マーカーとしてはアンピシリン、カナマイシン、クロロマイシン又はテトラサイクリンが挙げられる。

【0062】

好ましくは、本発明のベクターは、宿主細胞のゲノムに安定的に統合されるベクターを確実にする、あるいは細胞中の細胞ゲノムから独立して自己複製されるベクターを確実にする要素を含む。

【0063】

自己複製に関して、前記ベクターが宿主細胞において自己複製できるように、前記ベクターは、さらに複製起源を含む。前記複製起源は、宿主細胞において、温度感受性タイプとなる、突然変異を有してもよい（例えば，fEhrlich, 1978, National Academy of Sciences, 75:1433を参照のこと）。

【0064】

本発明の核酸配列の１超のコピーは、遺伝子産物の生産を増加させるために、宿主細胞に挿入されてもよい。核酸配列のコピー数は、少なくとも１つの更なる配列のコピーを宿主細胞のゲノムに挿入することにより、あるいは増幅選択マーカーとともに核酸配列を挿入し、好適な選択的な試薬の存在下で細胞を培養し、コピー増幅のための選択マーカー遺伝子を有し、それにより核酸の更なるコピーを有する細胞を選択することにより、増加させることができる。

【0065】

本発明の組み換え発現ベクターを構築するための上記要素と連結するための工程は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Edition 2, Sambrook, etc., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, 1989を参照のこと）。

【0066】

宿主細胞
本発明はさらに、ポリペプチドの組み換え産物のための、本発明の核酸配列を含む組み換え宿主細胞に関する。本発明の核酸配列を含むベクターは、前記ベクターが上記の染色体の統合された体（body）又は自己複製可能な染色体外ベクターの形態において維持されるように、宿主細胞に導入することができる。用語「宿主細胞」は、複製期間の突然変異により、親細胞と異なる任意の子孫（offspring）を網羅する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドコーディング遺伝子及びそれらの起源に主に依存する。

【0067】

前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞、例えば細菌又は酵母菌でもよい。前記ベクターは、当該技術分野においてよく知られている技術により、宿主細胞に導入することができる。

【0068】

調製方法
本発明はさらに、本発明のペプチドの組み換え生産のための方法であって、（ａ）ペプチドを生産するのに好適な条件下で核酸コンストラクトを有する宿主細胞を培養すること、ここで前記核酸コンストラクトは前記ペプチドをコードする核酸配列を含む；及び前記ペプチドを回収することを含む、方法に関する。

【0069】

本発明の調製方法において、前記細胞は、当該技術分野において知られている方法により、ポリペプチド生産に好適な栄養培地中で培養される。例えば、前記細胞は、ポリペプチド発現及び／又は分離を可能にする条件下で、好適な培養培地中で、振盪フラスコ培養、実験室培養、工業的な発酵タンク中での小又は大スケール発酵（連続型、バッチ型、バッチ投入型、又は固相発酵型を含む）により培養される。前記培養は、炭素源及び窒素源及び無機塩類を含む好適な培養培地中で、当該技術分野において知られている工程により行なうことができる。好適な培養培地は、供給者から提供されてもよく、あるいは当該技術分野において知られている組成（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中のもの）に従って調製されてもよい。前記ポリペプチドが培養中に分泌される場合、前記ポリペプチドを、培養培地から直接回収することができる。前記ポリペプチドが外側に分泌されない場合、これを、細胞溶解液から回収することができる。

【0070】

生産されたポリペプチドは、当該技術分野において知られている方法により回収することができる。例えば、前記ポリペプチドは、従来の工程（限定することなく、遠心分離、濾過、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含む）により培養培地から回収することができる。

【0071】

本発明のポリペプチドは、当該技術分野において知られている工程により精製することができ、これらの工程としては、限定することなく、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、クロマト分画（chromatofocusing）及びサイズ排除クロマトグラフィー）、ＨＰＬＣ、電気泳動（例えば、分取用等電点電気泳動分画）、異なる溶解性（例えば硫酸アンモニュウム沈殿法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Protein Purification, edited by J.C.Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）が挙げられる。

【0072】

トランスジェニック動物と植物
本発明はさらに、形質転換された宿主に新しい特性（例えば、害虫に対する抵抗性）を与えるように、本発明の核酸配列により形質転換された動物細胞又は植物細胞、好ましくは小麦、トウモロコシの植物細胞に関する。これは、動物細胞又は植物細胞を本明細書に開示のコンストラクトを用いて当該分野で公知の方法により行うことができる。

【0073】

害虫駆除のための方法及び調製物
当業者によりよく知られている多くの方法は、本発明のコノトキシンペプチド又はポリヌクレオチドで害虫を駆除するために用いることができる。これらの方法としては、例えば、害虫（又はこれらの場所）に組み換え微生物を施用すること、及び本発明のコノトキシンペプチドをコードする遺伝子で植物を形質転換することを含む。形質転換は、当業者に知られる従来の方法により行なうことができる。かかる形質転換のために必要な物質は、本明細書において開示されるか、あるいは当業者による他の経路により容易に得ることができる。

【0074】

コノトキシンペプチド又は本発明のポリヌクレオチドの組み換え微生物を含む調製物を、土壌に施用することができる。調製された生成物を、植物増殖サイクルの後期において、種子被覆、又は根の処理、又は植物全体への施用のためにさらに用いることができる。前記調製物は、散布濃縮アジュバンド（diffusion-thickening adjuvant）、安定化剤、他の殺虫剤添加物、又は界面活性剤を含んでもよい。液体調製物は、水性、又は非水性でもよく、泡状、ゲル、懸濁液、乳化可能な濃縮物の形態において用いてもよい。成分は、レオロジー剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤、又はポリマーを含んでもよい。

【0075】

当業者は、前記殺虫剤は、特定の調製物の性質のために、広く変化する濃度を有しうること、特に、それが濃縮物であってもよく、あるいは直接用いられてもよいことを理解する。殺虫剤は、少なくとも１重量％、又は１００重量％の量でもよい。乾燥調製物は、通常、殺虫剤の約１〜９５重量％を有する一方で、液体調製物は、通常、液相中の約１〜６０重量％の固体含量を有する細胞を含有する。調製物は、通常約１０²〜約１０⁴細胞／ｍｇを有する。これらの調製物は、１へクタールあたり、５０ｍｇ（液体又は乾燥）〜１ｋｇ／へクタールの量で施用され得る。前記調製物は、害虫環境、例えば土壌及び植物に、噴霧、散布又は飛沫により施用することができる。

【0076】

医薬組成物
本発明は、さらに、本発明のペプチド、並びに医薬的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、依存症、神経痛、精神遅滞、疼痛、パーキンソン病、精神疾患、うつ病、重症筋無力症、癌等に関する疾患又は障害の研究、診断、緩和又は治療するために用いることができる。１つの実施形態においては、治療的有効量の本発明のペプチドを含む医薬組成物は、調製され、そして医薬適用を容易にする方法において投与され、一方患者個人の臨床状態、送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医者により知られている他の要因は考慮されるべきである。従って、本明細書における目的のための「有効量」とは、これらの態様において考慮しつつ決定される。

【0077】

本発明の治療的有効量のペプチドを含む医薬組成物を、非経口、経口、嚢内、髄腔内に投与することができる。「医薬的に許容される担体」とは、非毒性固体、半固体若しくは液体充填剤、希釈剤、カプセル剤又は任意の種類の製剤アシスタントを意味する。本明細書において、用語「非経口的に」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、皮下、髄腔内及び関節内注射又は注入を含む投与方法を意味する。本発明のポリペプチドが、持続放出系により投与されてもよい。

【0078】

本発明はさらに、ｎＡＣｈＲを特異的に遮断するための医薬組成物に関する。

【0079】

本発明のコノトキシンペプチドは、動物のｎＡＣｈＲの系統発生を研究するためのプローブとして；ｎＡＣｈＲの様々なサブタイプを決定するためのプローブとして；新規薬物を設計するための分子モデルとして；神経疾患、例えば依存症、パーキンソン病、統合運動障害、総合失調症の研究及び／又は診断のためのツール薬物及び治療薬物して；乳癌、肺癌、小細胞肺癌の治療のための候補薬物として；又は新しい種類のバイオ殺虫剤を開発するためのポリペプチド殺虫剤として用いることができる。

【0080】

本発明の有効な作用
本発明のα−コノトキシンペプチドは、アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）を特異的に遮断することができ、鎮痛と依存症離脱の強力な活性を有し、パーキンソン病、乳癌及び肺癌細胞の治療のために機能し、並びに依存症、認知症、統合失調症、うつ病などの疾患の治療のために機能する。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1】図１は、α−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１（ＬｖＩＡ）のプロペプチド遺伝子配列、及びこれをコードすることにより産生されるプロペプチド、並びに翻訳後修飾により産生される成熟ペプチドを示す。矢印は、翻訳後修飾のためのプロセッシング部位を示す。推定されるプロテイナーゼ加水分解プロセッシング部位１（プロセッシング１）は、アルカリ性アミノ酸であるアルギニン（Ｒ）の後であり；Ｃ末端アミド化プロセッシング部位は、矢印で示されるグリシンの位置であり、これは、文字の影つき（すなわちプロセッシング２）で記載されている。システイン（Ｃｙｓ）と密接に隣接している成熟ペプチドのＣ末端のグリシンは、通常アミド化翻訳後修飾のプロセッシング部位であり、プロセッシング部位２のアミド化により産生される成熟ペプチドは、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１（又はＬｖＩＡ）と命名され、この配列は、ＧＣＣＳＨＰＡＣＮＶＤＨＰＥＩＣ＃（＃はＣ末端アミド化を示す）である。プロペプチド領域はイタリック体で示され、ここでシステイン（Ｃ）は太字で示され、終止コドンは＊で示される。

【図2(A)】図２は、合成された線形ペプチドと成熟ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１（配列番号４）の配列を示し、そしてジスルフィド結合連結方法、並びに対応するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２Ａは、合成された線形ペプチド配列、並びにＣｙｓ１とＣｙｓ３の遊離−ＳＨ、及びＣｙｓ２とＣｙｓ４の保護基Ｓ−Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）を示す。

【図2(B)】図２は、合成された線形ペプチドと成熟ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１（配列番号４）の配列を示し、そしてジスルフィド結合連結方法、並びに対応するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２Ｂは、酸化的フォールディング後の成熟ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１配列、並びに含有されるＩ−ＩＩＩ及びＩＩ−ＩＶジスルフィド結合連結方法を示す。

【図2(C)】図２は、合成された線形ペプチドと成熟ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１（配列番号４）の配列を示し、そしてジスルフィド結合連結方法、並びに対応するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２Ｃは、図２Ａの合成された線形ペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示し、その保持時間は２７．７１３分である。

【図2(D)】図２は、合成された線形ペプチドと成熟ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１（配列番号４）の配列を示し、そしてジスルフィド結合連結方法、並びに対応するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２Ｄは、図２Ｂの酸化ペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示し、その保持時間は２７．９４７分である。

【図3(A)】図３Ａは、α３β２ ｎＡＣｈＲの電流に関する１００ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響を示し、ここで、制限電圧は７０ｍＶであり、図３Ａ中の「Ｃ」とは、対照電流を表し、矢印は、１００ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１を５分間インキュベート後に最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道（〜０ｎＡ）を示し、２つの電流軌道間の時間間隔は１分である。図３中の値は、３〜９のアフリカツメガエル卵母細胞から得られた電流の平均値である。

【図3(B)】図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄは、ｎＡＣｈＲの種々のサブタイプ（ラットの１１、及びヒトの２）に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量応答曲線を別々に示し、ここで、横軸は、使用されたα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１のモル濃度（Ｍ）の対数値（Ｌｏｇ［ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１］Ｍ）を表し；縦軸は、用量応答パーセンテージ（％）を表し、これは、対応する濃度を有する毒素下での対照電流に対するアセチルコリン受容体電流のパーセンテージである。図３Ｂは、α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１高度選択性ブロッキングラットα３β２対α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの用量応答曲線を示す。図３中の値は、３〜９のアフリカツメガエル卵母細胞から得られた電流の平均値である。

【図3(C)】図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄは、ｎＡＣｈＲの種々のサブタイプ（ラットの１１、及びヒトの２）に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量応答曲線を別々に示し、ここで、横軸は、使用されたα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１のモル濃度（Ｍ）の対数値（Ｌｏｇ［ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１］Ｍ）を表し；縦軸は、用量応答パーセンテージ（％）を表し、これは、対応する濃度を有する毒素下での対照電流に対するアセチルコリン受容体電流のパーセンテージである。図３Ｃは、他のラット神経サブタイプとマウス筋肉ｎＡＣｈＲに対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量応答曲線を示す。図３中の値は、３〜９のアフリカツメガエル卵母細胞から得られた電流の平均値である。

【図3(D)】図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄは、ｎＡＣｈＲの種々のサブタイプ（ラットの１１、及びヒトの２）に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量応答曲線を別々に示し、ここで、横軸は、使用されたα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１のモル濃度（Ｍ）の対数値（Ｌｏｇ［ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１］Ｍ）を表し；縦軸は、用量応答パーセンテージ（％）を表し、これは、対応する濃度を有する毒素下での対照電流に対するアセチルコリン受容体電流のパーセンテージである。図３Ｄは、α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１高度選択性ブロッキングヒトα３β２対α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの用量応答曲線を示す。図３中の値は、３〜９のアフリカツメガエル卵母細胞から得られた電流の平均値である。

【図4(A)】図４は、種々のｎＡＣｈＲの電流に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の異なる用量の影響を示す。図４Ａは、ラットα３β２ ｎＡＣｈＲの電流に対する１００ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響を示す。図４において、「Ｃ」は対照電流を指し、「Ｃ」の後に密接に従うのはα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の毒素濃度を指す。矢印は、５分間のインキュベート後に、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１遮断対応受容体サブタイプとして、最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道を示す。図４は、１００ｎＭのα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１がα３β２ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断するが、１０μＭは、α２β２（Ｂ）及びＭα１βδε（Ｃ） ｎＡＣｈＲサブタイプを完全には遮断しないことを示す。

【図4(B)】図４は、種々のｎＡＣｈＲの電流に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の異なる用量の影響を示す。図４Ｂは、α２β２ ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１を示す。図４において、「Ｃ」は対照電流を指し、「Ｃ」の後に密接に従うのはα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の毒素濃度を指す。矢印は、５分間のインキュベート後に、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１遮断対応受容体サブタイプとして、最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道を示す。図４は、１００ｎＭのα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１がα３β２ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断するが、１０μＭは、α２β２（Ｂ）及びＭα１βδε（Ｃ） ｎＡＣｈＲサブタイプを完全には遮断しないことを示す。

【図4(C)】図４は、種々のｎＡＣｈＲの電流に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の異なる用量の影響を示す。図４Ｃは、マウス筋肉型（Ｍα１βδε）ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響を示す。図４において、「Ｃ」は対照電流を指し、「Ｃ」の後に密接に従うのはα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の毒素濃度を指す。矢印は、５分間のインキュベート後に、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１遮断対応受容体サブタイプとして、最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道を示す。図４は、１００ｎＭのα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１がα３β２ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断するが、１０μＭは、α２β２（Ｂ）及びＭα１βδε（Ｃ） ｎＡＣｈＲサブタイプを完全には遮断しないことを示す。

【図5(A)】図５は、α３β２ ｎＡＣｈＲとその７つのβ２変異体に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量応答曲線を示す。図５Ａ中の変異体は、α３β２［Ｆ１１９Ｑ］、α３β２［Ｖ１１１Ｉ］である。

【図5(B)】図５は、α３β２ ｎＡＣｈＲとその７つのβ２変異体に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量応答曲線を示す。図５Ｂ中の変異体は、α３β２［Ｆ１１９Ｑ］、α３β２［Ｔ５９Ｋ］、α３β２［Ｔ５９Ｌ］である。

【図5(C)】図５は、α３β２ ｎＡＣｈＲとその７つのβ２変異体に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量応答曲線を示す。図５Ｃ中の変異体は、α３β２［Ｔ５９Ｉ］、α３β２［Ｋ７９Ａ］、α３β２［Ｑ３４Ａ］である。

【図6(A)】図６は、ラットα３β２ ｎＡＣｈＲ野生型（Ａ）、変異体α３β２［Ｆ１１９Ｑ］（Ｂ）、α３β２［Ｔ５９Ｋ］（Ｃ）及びα３β２［Ｖ１１１ｌ］（Ｄ）の電流に対する１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響、並びに遮断後の異なる溶出速度を示す。図６Ａは、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１がα３β２ ｎＡＣｈＲ野生型の約５０％の電流を遮断することを示し、ここで、溶出速度は比較的大きく、電流は溶出の２分以内に完全に回復していることを示す。図６において「Ｃ」は対照電流を指し、矢印は、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１を用いて５分間インキュベート後に、最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道（〜０ｎＡ）を示す。「ウォッシュアウト」は溶出を指し、２つの電流軌道間の時間間隔は１分である。

【図6(B)】図６は、ラットα３β２ ｎＡＣｈＲ野生型（Ａ）、変異体α３β２［Ｆ１１９Ｑ］（Ｂ）、α３β２［Ｔ５９Ｋ］（Ｃ）及びα３β２［Ｖ１１１ｌ］（Ｄ）の電流に対する１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響、並びに遮断後の異なる溶出速度を示す。図６Ｂは、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１が変異体α３β２［Ｆ１１９Ｑ］のすべての電流を遮断することを示し、ここで、溶出速度は小さく、電流は溶出の１２分以内に完全に回復していることを示す。図６において「Ｃ」は対照電流を指し、矢印は、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１を用いて５分間インキュベート後に、最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道（〜０ｎＡ）を示す。「ウォッシュアウト」は溶出を指し、２つの電流軌道間の時間間隔は１分である。

【図6(C)】図６は、ラットα３β２ ｎＡＣｈＲ野生型（Ａ）、変異体α３β２［Ｆ１１９Ｑ］（Ｂ）、α３β２［Ｔ５９Ｋ］（Ｃ）及びα３β２［Ｖ１１１ｌ］（Ｄ）の電流に対する１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響、並びに遮断後の異なる溶出速度を示す。図６Ｃは、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１が変異体α３β２［Ｔ５９Ｋ］のすべての電流を遮断することを示し、ここで、溶出速度は非常に小さく、電流は溶出の２０分後に対照電流の２７％まで回復していることを示す。図６において「Ｃ」は対照電流を指し、矢印は、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１を用いて５分間インキュベート後に、最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道（〜０ｎＡ）を示す。「ウォッシュアウト」は溶出を指し、２つの電流軌道間の時間間隔は１分である。

【図6(D)】図６は、ラットα３β２ ｎＡＣｈＲ野生型（Ａ）、変異体α３β２［Ｆ１１９Ｑ］（Ｂ）、α３β２［Ｔ５９Ｋ］（Ｃ）及びα３β２［Ｖ１１１ｌ］（Ｄ）の電流に対する１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響、並びに遮断後の異なる溶出速度を示す。図６Ｄは、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１が変異体α３β２［Ｖ１１１ｌ］ののすべての電流は遮断しないことを示す。図６において「Ｃ」は対照電流を指し、矢印は、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１を用いて５分間インキュベート後に、最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道（〜０ｎＡ）を示す。「ウォッシュアウト」は溶出を指し、２つの電流軌道間の時間間隔は１分である。

【図7】図７は、ＣＣＩモデルにおいて１〜２４時間の腹腔内投与（ＩＰ）後のα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の鎮痛作用を示す。この図において、陰性対照である食塩水は生理食塩水（Saline）であり、陽性対照はモルフィン（Morphine）であり、その用量はラット体重１ｋｇ当たり１ｍｇである；α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量はラット体重１ｋｇ当たり１ｎｍｏｌである。この図において、横軸時間（時間）は投与後の時間数であり；縦軸の機械的閾値は、基礎的疼痛閾値（１００）に対して観察された疼痛閾値のパーセンテージ（基礎の％）であり、図中の点の縦軸の値は平均値と標準誤差（平均±ＳＤ）である。有意差の比較確率は＃ｐ＜０．０５であり、各群のラットの数は８である（ｎ＝８）。

【図8】図８は、ＣＣＩモデルにおいて７〜１４日間の腹腔内投与（ＩＰ）後のα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の鎮痛作用を示す。この図において、陰性対照である食塩水は生理食塩水（Saline）であり、陽性対照はモルフィン（Morphine）であり、その用量はラット体重１ｋｇ当たり１ｍｇである；α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量はラット体重１ｋｇ当たり１ｎｍｏｌである。この図において、横軸の時間（日数）は投与後の時間数であり；縦軸の機械的閾値は、基礎的疼痛閾値（１００）に対して観察された疼痛閾値のパーセンテージ（基礎の％）であり、図中の点の縦軸の値は平均値と標準誤差（平均±ＳＤ）である。有意差の比較確率は＃ｐ＜０．０５であり、各群のラットの数は８である（ｎ＝８）。

【図9】図９は、マウスホットプレート試験モデルにおいて１２０分の脳室内投与（ＩＣＶ）後のα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の鎮痛作用を示す。この図において、陰性対照である食塩水は生理食塩水（Saline）であり、陽性対照はモルフィン（Morphine）であり、その用量はマウス体重１ｋｇ当たり１００μｇである；α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量はマウス体重１ｋｇ当たり０．１ｎｍｏｌである。この図において、横軸の時間（分）は投与後の時間数であり；縦軸の閾値（秒）は、１単位の秒数で観察された疼痛閾値である。図中の点の縦軸の値は平均値と標準誤差（平均±ＳＤ）である。有意差の比較確率は＃ｐ＜０．０５であり、各群のマウスの数は１０である（ｎ＝１０）。

【図10】図１０は、α−コノトキシンＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（ＴｘｌＢ）プロペプチド遺伝子配列、これをコードすることにより産生されるプロペプチド、及び翻訳後修飾により産生される成熟ペプチドを示す。矢印は、翻訳後修飾のためのプロセッシング部位を示す。推定されるプロテイナーゼ加水分解プロセッシング部位１（プロセッシング部位１）は、アルカリ性アミノ酸であるアルギニン（Ｒ）の後であり；Ｃ末端アミド化プロセッシング部位は、矢印で示される２つのグリシンの部位でもよく、これは、文字の影つき（すなわちプロセッシング２）又はプロセッシング部位３で示される。システインと密接に隣接している成熟ペプチドのＣ末端の第１及び第２のグリシン残基は、通常アミド化翻訳後修飾のプロセッシング部位であり、プロセッシング部位２のアミド化により産生される成熟ペプチドは、ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（又はＴｘｌＢ）と命名され、この配列は、ＧＣＣＳＤＰＰＣＲＮＫＨＰＤＬＣ＃（＃はＣ末端アミド化を示す）である；プロセッシング部位３のアミド化により産生される成熟ペプチドは、ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（Ｇ）（又はＴｘｌＢ（Ｇ））と命名され、この配列は、ＧＣＣＳＤＰＰＣＲＮＫＨＰＤＬＣＧ＃（＃はＣ末端アミド化を示す）である。ＴｘｌＢ（Ｇ）のＣ末端は、ＴｘｌＢのそれより１つ多いグリシン（Ｇ）を有し、従ってＴｘｌＢの類似体である。プロペプチド領域はイタリック体で示され、成熟ペプチドは下線で示され、ここでシステインは太字で示され、終止コドンは＊で示される。

【図11(A)】図１１は、ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（図１１Ａ）及びＴｘｌＢ（Ｇ）（図１１Ｂ）の成熟ペプチド配列とこれらのジスルフィド結合連結方法Ｉ−ＩＩＩ、ＩＩ−ＩＶを示す。

【図11(B)】図１１は、ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（図１１Ａ）及びＴｘｌＢ（Ｇ）（図１１Ｂ）の成熟ペプチド配列とこれらのジスルフィド結合連結方法Ｉ−ＩＩＩ、ＩＩ−ＩＶを示す。

【図12(A)】α−ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）は、高度選択性α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲを有する特異的遮断剤である。図１２Ａは、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの電流に対する１μＭのα−ＴｘｌＢの影響を示す。「Ｃ」は対照電流を指し、矢印は、１μＭのα−ＴｘｌＢで５分間のインキュベート後に、最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道（〜０ｎＡ）を示す。図において、値は３〜５のアフリカツメガエル卵母細胞から得られる電流の平均値である。

【図12(B)】α−ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）は、高度選択性α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲを有する特異的遮断剤である。図１２Ｂは、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲに対するα−ＴｘｌＢとＴｘｌＢ（Ｇ）の用量応答曲線を示し、図において横軸は、使用されたα−ＴｘｌＢとＴｘｌＢ（Ｇ）のモル濃度（Ｍ）の対数値（Ｌｏｇ［ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）］Ｍ）であり；縦軸は、用量応答パーセンテージ（％応答）であり、これは、毒素の対応する濃度の作用下の対照電流に対するアセチルコリン受容体電流の比パーセンテージである。図において、値は３〜５のアフリカツメガエル卵母細胞から得られる電流の平均値である。

【図12(C)】α−ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）は、高度選択性α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲを有する特異的遮断剤である。図１２Ｃは、種々のｎＡＣｈＲサブタイプに対するα−ＴｘｌＢの用量応答曲線を示し、α−ＴｘｌＢはα６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断し、この半遮断用量（ＩＣ５０）は２８ｎＭであり、そして１０μＭの毒素下で、ＴｘｌＢは他のサブタイプに対して遮断効果が無く、このＩＣ５０＞１０μＭである。図において、値は３〜５のアフリカツメガエル卵母細胞から得られる電流の平均値である。

【図13(A)】図１３は、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの電流に対する１μＭのα−ＴｘｌＢの影響（図１３Ａ）、及び非常に近いα３β２（図１３Ｂ）、α６／α３β４（図１３Ｃ）、α３β４（図１３Ｄ）ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭのα−ＴｘｌＢの影響を示す。図において「Ｃ」は対照電流を指し、「Ｃ」に密接に従うのはα−ＴｘｌＢの毒素濃度である。矢印は、５分間のインキュベート後に、対応する受容体サブタイプをＴｘｌＢが遮断する最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道を示す。１μＭのα−ＴｘｌＢは、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断する（図１３Ａ）が、１０μＭは、α３β２（図１３Ｂ）、α６／α３β４（図１３Ｃ）及びα３β４（図１３Ｄ）ｎＡＣｈＲサブタイプを完全には遮断しない。

【図13(B)】図１３は、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの電流に対する１μＭのα−ＴｘｌＢの影響（図１３Ａ）、及び非常に近いα３β２（図１３Ｂ）、α６／α３β４（図１３Ｃ）、α３β４（図１３Ｄ）ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭのα−ＴｘｌＢの影響を示す。図において「Ｃ」は対照電流を指し、「Ｃ」に密接に従うのはα−ＴｘｌＢの毒素濃度である。矢印は、５分間のインキュベート後に、対応する受容体サブタイプをＴｘｌＢが遮断する最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道を示す。１μＭのα−ＴｘｌＢは、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断する（図１３Ａ）が、１０μＭは、α３β２（図１３Ｂ）、α６／α３β４（図１３Ｃ）及びα３β４（図１３Ｄ）ｎＡＣｈＲサブタイプを完全には遮断しない。

【図13(C)】図１３は、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの電流に対する１μＭのα−ＴｘｌＢの影響（図１３Ａ）、及び非常に近いα３β２（図１３Ｂ）、α６／α３β４（図１３Ｃ）、α３β４（図１３Ｄ）ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭのα−ＴｘｌＢの影響を示す。図において「Ｃ」は対照電流を指し、「Ｃ」に密接に従うのはα−ＴｘｌＢの毒素濃度である。矢印は、５分間のインキュベート後に、対応する受容体サブタイプをＴｘｌＢが遮断する最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道を示す。１μＭのα−ＴｘｌＢは、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断する（図１３Ａ）が、１０μＭは、α３β２（図１３Ｂ）、α６／α３β４（図１３Ｃ）及びα３β４（図１３Ｄ）ｎＡＣｈＲサブタイプを完全には遮断しない。

【図14】図１４は、α−コノトキシンＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１（ＴｘｌＣ）プロペプチド遺伝子配列、これをコードすることにより産生されるプロペプチド、及び翻訳後修飾により産生される成熟ペプチドを示す。矢印は、翻訳後修飾のためのプロセッシング部位を示す。推定されるプロテイナーゼ加水分解プロセッシング部位１（プロセッシング部位１）は、アルカリ性アミノ酸であるアルギニン（Ｒ）の後であり；Ｃ末端アミド化プロセッシング部位は、矢印で示されるグリシンの位置であり、これは、文字の影つき（すなわちプロセッシング部位２）で記載されている。システイン（Ｃｙｓ）と密接に隣接している成熟ペプチドのＣ末端のグリシンは、通常アミド化翻訳後修飾のプロセッシング部位であり、プロセッシング部位２のアミド化により産生される成熟ペプチドは、ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１（又はＴｘｌＣ）と命名され、この配列は、ＧＣＣＳＨＰＶＣＳＡＭＳＰＩＣ＃（＃はＣ末端アミド化を示す）である。プロペプチド領域はイタリック体で示され、成熟ペプチドは下線で示され、ここでシステイン（Ｃ）は太字で示され、終止コドンは＊で示される。

【図15(A)】図１５（Ａ）は、成熟ペプチドα−ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１（配列番号２８）配列、及びそのジスルフィド結合連結方法Ｉ−ＩＩＩ、ＩＩ−ＩＶを示す。

【図15(B)】図１５（Ｂ）は、ジスルフィド結合連結方法Ｉ−ＩＩＩ、ＩＩ−ＩＶを含有するα−ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、ここで、この毒素ペプチドのクロマトグラフィー分析条件は以下の通りである：Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ ＨＰＬＣ逆相分析カラムを使用して、４０分以内に、Ｂ溶液について１５％〜５０％へ、Ａ溶液について８５％〜５０％へ線形勾配溶出を行い、ここで、Ａ溶液は０．６５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、Ｂは０．５％ＴＦＡと９０％アセトニトリルの水溶液である。紫外線分析光学波長は２１４ｎｍであり、ＴｘｌＣはピーク時間、すなわち２３．３６６分の保持時間を有する。

【図16(A)】図１６は、α−ＴｘｌＣがα３β４ ｎＡＣｈＲに対して選択性の強力な遮断剤であることを示す。Ａは、α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１μＭのα−ＴｘｌＣの影響を示す。図Ａにおいて「Ｃ」は対照電流を指し、矢印は、１μＭのα−ＴｘｌＣで５分間のインキュベート後に、最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道（〜０ｎＡ）を示す。図中の値は３〜８のアフリカツメガエル卵母細胞から得られる電流の平均値である。

【図16(B)】図１６は、α−ＴｘｌＣがα３β４ ｎＡＣｈＲに対して選択性の強力な遮断剤であることを示す。図１６（Ｂ）は、他の１０のｎＡＣｈＲサブタイプに対するα−ＴｘｌＣの用量応答曲線を示し、ここで横軸は、使用されたα−ＴｘｌＣのモル濃度（Ｍ）の対数値（Ｌｏｇ［ＴｘｌＣ］Ｍ）であり；縦軸は、用量応答パーセンテージ（％応答）であり、これは、毒素の対応する濃度の作用下の対照電流に対するアセチルコリン受容体電流の比パーセンテージである。α−ＴｘｌＣはα３β４ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断し、この半遮断用量（ＩＣ₅₀）はわずかに１２．５ｎＭであり；α−ＴｘｌＣはまた、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対してある程度遮断活性を示し、この半遮断用量（ＩＣ₅₀）は９４ｎＭであり；α−ＴｘｌＣはα２β４ ｎＡＣｈＲに対して非常に弱い遮断活性を示し、この半遮断用量は最大４５５０ｎＭである。１０μＭの毒素濃度下では、ＴｘｌＣは他のサブタイプに対して遮断活性を示さず、これはＩＣ₅₀＞１０μＭである。図中の値は３〜８のアフリカツメガエル卵母細胞から得られる電流の平均値である。

【図17(A)】図１７は、α３β４ ｎＡＣｈＲ（Ａ）の電流に対する１μＭのα−ＴｘｌＣの影響、及び非常に近いα４β４（Ｂ）、α７（Ｃ）ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭのα−ＴｘｌＣの影響を示す。図において「Ｃ」は、対照電流を指し、「Ｃ」に密接に従うのはα−ＴｘｌＣの毒素濃度である。矢印は、５分間のインキュベート後に、対応する受容体サブタイプをＴｘｌＣが遮断する最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道を示す。１μＭのα−ＴｘｌＣは、α３β４ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断するが、１０μＭは、α４β４（Ｂ）及びα７（Ｃ）ｎＡＣｈＲサブタイプを完全には遮断しない。

【図17(B)】図１７は、α３β４ ｎＡＣｈＲ（Ａ）の電流に対する１μＭのα−ＴｘｌＣの影響、及び非常に近いα４β４（Ｂ）、α７（Ｃ）ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭのα−ＴｘｌＣの影響を示す。図において「Ｃ」は、対照電流を指し、「Ｃ」に密接に従うのはα−ＴｘｌＣの毒素濃度である。矢印は、５分間のインキュベート後に、対応する受容体サブタイプをＴｘｌＣが遮断する最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道を示す。１μＭのα−ＴｘｌＣは、α３β４ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断するが、１０μＭは、α４β４（Ｂ）及びα７（Ｃ）ｎＡＣｈＲサブタイプを完全には遮断しない。

【図17(C)】図１７は、α３β４ ｎＡＣｈＲ（Ａ）の電流に対する１μＭのα−ＴｘｌＣの影響、及び非常に近いα４β４（Ｂ）、α７（Ｃ）ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭのα−ＴｘｌＣの影響を示す。図において「Ｃ」は、対照電流を指し、「Ｃ」に密接に従うのはα−ＴｘｌＣの毒素濃度である。矢印は、５分間のインキュベート後に、対応する受容体サブタイプをＴｘｌＣが遮断する最初のＡｃｈパルスにより形成される電流軌道を示す。１μＭのα−ＴｘｌＣは、α３β４ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断するが、１０μＭは、α４β４（Ｂ）及びα７（Ｃ）ｎＡＣｈＲサブタイプを完全には遮断しない。

【発明を実施するための形態】

【0082】

本発明を実施するための特定の態様
本発明の実施形態は、以下の実施例と組み合わせて説明される。当業者は、以下の実施例が、本発明の範囲を限定するためというよりはむしろ、単に本発明を説明するために用いられることを理解するであろう。本明細書に与えられない特定の技術又は条件は、参考文献又は明細書に対応する当該技術分野における文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Edition 3, J. Sambrook, etc., translated by HUANG Peitang, etc., Science Press）に記載される技術又は条件に従って実施される。製造者が与えない全ての試薬又は装置は、市販されている従来品である。

【実施例】

【0083】

実施例１−（１）：α−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１遺伝子のクローニングと配列解析
１．タガヤサンミナシ（C. textile Linnaeus）のゲノムＤＮＡの抽出
タガヤサンミナシ（C. textile Linnaeus）の生きた身を海南島と西沙諸島の沿岸地域から収集し、スタンバイ使用のために−８０℃で保存した。コーンシェルの毒腺を解剖し、秤量した。毒腺のゲノムＤＮＡを海洋動物のゲノムＤＮＡ抽出キット（中国北京天根生化学科学技術有限公司から購入）を用いて抽出し、ここで、具体的な工程はキットの仕様を参照して実行され；又は、参考文献、例えばZheng Xiaodong, Gao Bingsen, Li Baozhu, Peng Chao, Wu Aiying, Zhu Xiaopeng, Chen Xin, Zhangsun Dongting, Luo Sulan, Screening primer for novel type α-conotoxin genetic clone, Chinese Journal of Biotechnologies, 2011, 21(4): 40-44を参照して実行された。

【0084】

抽出された毒腺ゲノムの全ＤＮＡを１００μＬのＴＥに溶解し、５μＬを１．０％アガロースゲル電気泳動のために使用し、ここで、λ−ＥｃｏＴ１４ Ｉ消化物ＤＮＡマーカーを標準物質とし、得られたＤＮＡの完全性及びサイズを測定した。ＯＤ₂₆₀、ＯＤ₂₈₀、及びＤＮＡ溶液のＯＤ₂₆₀／ＯＤ₂₈₀比を測定するために、核酸／タンパク質用分析機を使用し、ＤＮＡの濃度（μｇ・ｍｌ^-1）、純度及びＤＮＡ収率（μｇ・ｇ^-1）を計算した。

【0085】

抽出されたＤＮＡを、コノトキシンの遺伝子クローニングと以下のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。

【0086】

２．ＰＣＲ反応、及びその生成物のクローニング、配列決定及び配列解析
α−ＣＴｘ前駆体遺伝子のイントロン配列とその３’−末端非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）配列に従って、α−ＣＴｘ特異的プライマーが設計される。
上流イントロンプライマー配列：

【化2】

下流３’−ＵＴＲプライマー配列：

【化3】

各プライマーは、１８塩基を有するオリゴヌクレオチド断片であった。

【0087】

抽出されたゲノムＤＮＡの原料溶液を希釈し、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。以下のＰＣＲ増幅系と反応条件が使用された。

【0088】

【化4】

【0089】

ＰＣＲ特異的増幅産物を回収し、Ｔ−ｅａｓｙベクター（Promega）に連結し、次に大腸菌ＸＬ１株（他の市販のコンピタントな大腸菌を使用することもできる）を形質転換するのに使用し、青−白コロニーとアンピシリン耐性を使用して組み換え体を取り上げ、組み換えプラスミドを抽出し、精製し、そして配列解析に使用した。以下の配列決定結果が得られた：

【化5】

【0090】

上記配列において、イタリック体はイントロンであり、プライマーに対応する。

【0091】

得られたＰＣＲ特異的増幅産物配列をＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを使用して解析して、これにコードされるタンパク質配列である３’−非翻訳（ＵＴＲ）領域を得た。配列解析と比較により、本発明の新規α４／７−ＣＴｘ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の前駆体遺伝子（すなわち、配列番号１の下線部分）が得られ、これは、以下のようにＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１コノトキシンプロペプチドをコードするヌクレオチド配列であった（１１４アミノ酸）：

【化6】

【0092】

前駆体遺伝子とコノトキシンの特徴に従って、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１コノトキシンプロペプチドが配列番号２に示されるアミノ酸配列（３７アミノ酸）中にあると推定され、これはまた以下のように、以下の本明細書でα−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１前駆体、又はα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１前駆体、又はＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１前駆体、又はＬｖＩＡもしくはＬｖＤ２１前駆体とも呼ばれた：

【化7】

【0093】

コノトキシンプロタンパク質のシグナルペプチド、プロペプチド及び成熟ペプチドの予測を、オンラインＰｒｏＰ １．０サーバーを使用して行った（Duckert, P.; Brunak, S.; Blom, N., Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Protein engineering, design & selection : PEDS 2004, 17 (1), 107-12.）。予測のための方法と機序は、Luo S, Zhangsun D, Zhang B, Quan Y, Wu Y. Novel alpha-conotoxins identified by gene sequencing from cone snails native to Hainan, and their sequence diversity. J Pept Sci. 2006,12 (11):693-704に見いだされる。誘導プロセスと結果もまた図１に示される。

【0094】

プロペプチド配列に従って、成熟ペプチドＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１もまた誘導され、これは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有した（１６アミノ酸、以後、α−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１、又はα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１、又はＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１、又はＬｖＩＡ又はＬｖＤ２１として引用される）：

【化8】

【0095】

ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、ジスルフィド結合連結方法がＩ−ＩＩＩ、ＩＩ−ＩＶ（図２Ａ〜Ｂ）であるα−ＣＴｘ特異的ＣＣ−Ｃ−Ｃを有し、すなわち２つのジスルフィド結合は第１のシステインと第３のシステインとの間、及び第２のシステインと第４のシステインとの間に別々に形成された。ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は４／７型α−ＣＴｘである（図１及び図２Ａ〜Ｂ）。

【0096】

実際、本発明の成熟ペプチドＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１はまた、インビボ又はインビトロでプロペプチド（配列番号３又は６）を対応して処理することにより；任意には、アミド化酵素を使用してインビボ又はインビトロのＣ末端のアミド化により、得られるであろう。

【0097】

ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１をコードするヌクレオチド配列は以下の通りである（４８塩基対）：

【化9】

【0098】

本発明はさらに、第２のプロセッシング部位（プロセッシング２）に供されていない成熟ペプチドの配列（１７アミノ酸）：

【化10】

に関し、その対応するヌクレオチド配列は以下の通りである（５４塩基対）：

【化11】

【0099】

実施例１−（２）：α−コノトキシンＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４遺伝子のクローニングと配列解析
１．タガヤサンミナシ（C. textile Linnaeus）のゲノムＤＮＡの抽出
海南島と西沙諸島の沿岸地域から収集されたタガヤサンミナシ（C. textile Linnaeus）の生きた身を試験材料として使用し、スタンバイ使用のために−８０℃で保存した。コーンシェルの毒腺をまず解剖して収集し、秤量した。海洋動物のゲノムＤＮＡ抽出キット（中国北京天根生化学科学技術有限公司から購入）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、ここで、具体的な操作はキットの仕様を参照して実行された。コーンシェルの抽出されたゲノムの全ＤＮＡを１００μＬのＴＥに溶解し、５μＬを取って１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、λ−ＥｃｏＴ１４ Ｉ消化物ＤＮＡマーカーを標準物質として使用して、得られたＤＮＡの完全性及びサイズを検出した。核酸／タンパク質用分析機を使用して、ＯＤ２６０、ＯＤ２８０、及びＤＮＡ溶液のＯＤ２６０／ＯＤ２８０比を測定し、ＤＮＡの濃度（μｇ・ｍｌ^-1）、純度及びＤＮＡ収率（μｇ・ｇ^-1）を計算した。抽出された完全なＤＮＡを、コノトキシン遺伝子の次のＰＣＲ増幅で鋳型として使用した。

【0100】

２．ＰＣＲ反応とクローニング、及びその生成物の配列決定と配列解析
ＰＣＲ反応に使用される方法、システム、条件及びプライマーは実施例１−（１）のものと同じであるが、鋳型は、実施例１で抽出されたゲノムＤＮＡの未加工液体の希釈された液体であった。

【0101】

回収されたＰＣＲ特異的増幅産物をＴ−ｅａｓｙベクター（Promega）に連結し、次に大腸菌ＸＬ１株（他の市販のコンピタントな大腸菌を使用することもできる）を形質転換するのに使用し、青−白コロニーとアンピシリン耐性を使用して組み換え体を取り上げ、組換えプラスミドを抽出し、精製し、そして配列解析に使用して、ＰＣＲ特異的増幅産物の配列を得た。

【0102】

得られたＰＣＲ特異的増幅産物配列を、ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを使用して解析して、そのコーディング配列、３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）配列を得た。配列解析により、本発明の新規α−ＣＴｘ ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４の前駆体遺伝子が得られた（配列番号２１）（図１０）。

【0103】

コノトキシン前駆体タンパク質のシグナルペプチド、プロペプチド及び成熟ペプチドの予測を、オンラインＰｒｏＰ １．０サーバーを使用して行った（Duckert, P.; Brunak, S.; Blom, N., Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Protein engineering, design & selection : PEDS 2004, 17 (1), 107-12.）。

【0104】

前駆体遺伝子とコノトキシンの特徴に従って、ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４コノトキシンプロペプチドが推定され、これは、配列番号１５に示されるように４１アミノ酸を含むタンパク質配列を有した。

【0105】

プロペプチド配列に従って、成熟ペプチドＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４又はＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（Ｇ）が推定され、これらは、配列番号１１又は配列番号１２に示されるように別々にアミノ酸配列を有し、ことからなる推定のための方法と原理は、Luo S, Zhangsun D, Zhang B, Quan Y, Wu Y. Novel alpha-conotoxins identified by gene sequencing from cone snails native to Hainan, and their sequence diversity. J Pept Sci. 2006,12 (11):693-704、及びオンラインソフトウェアＰｒｏＰ １．０サーバーに見ることができるであろう。

【0106】

この推定の結果の詳細は、図１０に見ることができるであろう。

【0107】

すべての成熟ペプチドはＣＣ−Ｃ−Ｃのシステインパターンを有する。ＴｘｌＢ（Ｇ）はＣ末端にＴｘｌＢより１つ多いグリシン（Ｇ）を有し、従ってＴｘｌＢの類似体である。ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４又はＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（Ｇ）は、ジスルフィド結合連結方法がＩ−ＩＩＩ、ＩＩ−ＩＶ（図１１、Ａ〜Ｂ）であるα−ＣＴｘ特異的ＣＣ−Ｃ−Ｃの特異的システインパターンを有し、すなわち２つのジスルフィド結合対は、第１のシステインと第３のシステインとの間、及び第２のシステインと第４のシステインとの間に別々に形成されることができる。ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４及びＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（Ｇ）は４／７型α−ＣＴｘである（図１０及び図１１）。

【0108】

（１）配列番号１１に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）（本明細書では、α−コノトキシンＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４又はα−ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４又はＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４又はＴｘｌＢとも呼ばれる）：

【化12】

好ましくは、Ｃ末端システイン（Ｃ）はアミド化されており、すなわちＧＣＣＳＤＰＰＣＲＮＫＨＰＤＬＣ ＃（ここで、＃はＣ末端アミド化を示す）で表される。

【0109】

（２）配列番号１２に示されるアミノ酸配列（成熟ペプチド）（本明細書では、α−コノトキシンＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（Ｇ）、又はα−ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（Ｇ）、又はＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（Ｇ）、又はＴｘｌＢ（Ｇ）とも呼ばれる）：

【化13】

好ましくは、Ｃ末端グリシン（Ｇ）はアミド化されており、すなわちＧＣＣＳＤＰＰＣＲＮＫＨＰＤＬＣ Ｇ ＃（ここで、＃はＣ末端アミド化を示す）で表される。

【0110】

理論に拘束されないが、グリシンに密接に隣接したシステイン（Ｃ、１６番目の部位）のアミド化を与えるように、配列番号１２の非アミド化Ｃ末端グリシン（１７番目の部位）はアミド化酵素（細胞内又は細胞外）の認識部位でもよく、この場合、アミド化された配列番号１１（ＧＣＣＳＤＰＰＣＲＮＫＨＰＤＬＣ ＃）が得られるであろう。

【0111】

（３）配列番号１３に示されるアミノ酸配列：

【化14】

【0112】

理論に拘束されないが、グリシンに密接に隣接した１７番目の部位のグリシン（Ｇ）のアミド化を与えるように、配列番号１３の１８番目の部位のグリシンはアミド化酵素（細胞内又は細胞外）の認識部位でもよく、この場合、アミド化された配列番号１２（ＧＣＣＳＤＰＰＣＲＮＫＨＰＤＬＣ Ｇ ＃）が得られるか、
又は、
グリシンに密接に隣接した１６番目の部位のシステイン（Ｃ）のアミド化を与えるように、配列番号１３の１７番目の部位のグリシンはアミド化酵素（細胞内又は細胞外）の認識部位でもよく、この場合、アミド化された配列番号１１（ＧＣＣＳＤＰＰＣＲＮＫＨＰＤＬＣ ＃）が得られるであろう。

【0113】

（４）配列番号１４に示されるアミノ酸配列：

【化15】

【0114】

理論に拘束されないが、グリシンに密接に隣接した１７番目の部位のグリシン（Ｇ）のアミド化を与えるように、配列番号１４の１８番目の部位のグリシンはアミド化酵素（細胞内又は細胞外）の認識部位でもよく、この場合、アミド化された配列番号１２（ＧＣＣＳＤＰＰＣＲＮＫＨＰＤＬＣ Ｇ ＃）が得られるか、
又は、
グリシンに密接に隣接した１６番目の部位のシステイン（Ｃ）のアミド化を与えるように、配列番号１４の１７番目の部位のグリシンはアミド化酵素（細胞内又は細胞外）の認識部位でもよく、この場合、アミド化された配列番号１１（ＧＣＣＳＤＰＰＣＲＮＫＨＰＤＬＣ ＃）が得られるであろう。

【0115】

（５）配列番号１５に示されるアミノ酸配列（本明細書において、α−コノトキシンＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４前駆体又はα−ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４前駆体又はＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４前駆体又はＴｘｌＢ前駆体とも呼ばれる）（前駆体ペプチド）：

【化16】

【0116】

（６）配列番号１６に示されるヌクレオチド配列（コーディングＴｘＩＢ／Ｔｘｄ４成熟ペプチド）：

【化17】

【0117】

（７）配列番号１７に示されるヌクレオチド配列（コーディングＴｘＩＢ／Ｔｘｄ４成熟ペプチド又はコーディングＴｘＩＢ（Ｇ）成熟ペプチド）:

【化18】

【0118】

（８）配列番号１８に示されるヌクレオチド配列（コーディングＴｘＩＢ／Ｔｘｄ４成熟ペプチド又はコーディングＴｘＩＢ（Ｇ）成熟ペプチド）:

【化19】

【0119】

（９）配列番号１９に示されるヌクレオチド配列（コーディングＴｘＩＢ／Ｔｘｄ４成熟ペプチド又はコーディングＴｘＩＢ（Ｇ）成熟ペプチド）:

【化20】

【0120】

（１０）配列番号２０に示されるヌクレオチド配列（コーディングＴｘＩＢ／Ｔｘｄ４又はＴｘｌＢ（Ｇ）前駆体タンパク質配列）:

【化21】

【0121】

（１１）配列番号２１に示されるヌクレオチド配列:

【化22】

【0122】

実施例１−（３）：α−コノトキシンＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１遺伝子のクローニングと配列解析
１．タガヤサンミナシ（C. textile Linnaeus）の毒腺のゲノムＤＮＡの抽出
海南島と西沙諸島の沿岸地域から収集されたタガヤサンミナシ（C. textile Linnaeus）の生きた身を試験材料として使用し、スタンバイ使用のために−８０℃で保存した。コーンシェルの毒腺をまず解剖して収集し、秤量した。海洋動物のゲノムＤＮＡ抽出キット（中国北京天根生化学科学技術有限公司から購入）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、ここで、具体的な操作はキットの仕様を参照して実行し、毒腺のゲノムＤＮＡを得た。

【0123】

抽出された毒腺のゲノムＤＮＡを１００μＬのＴＥに溶解し、５μＬを取って１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、λ−ＥｃｏＴ１４ Ｉ消化物ＤＮＡマーカーを標準物質として使用して、得られたＤＮＡの完全性及びサイズを検出した。核酸／タンパク質用分析機を使用して、ＯＤ₂₆₀、ＯＤ₂₈₀、及びＤＮＡ溶液のＯＤ₂₆₀／ＯＤ₂₈₀比を測定し、ＤＮＡの濃度（μｇ・ｍｌ^-1）、純度及びＤＮＡ収率（μｇ・ｇ^-1）を計算した。抽出されたＤＮＡを、次のＰＣＲ増幅でコノトキシン遺伝子をクローニングするための鋳型として使用した。

【0124】

２．ＰＣＲ反応とクローニング、及びその生成物の配列決定と配列解析
ＰＣＲ反応に使用される方法、システム、条件及びプライマーは実施例１−（１）のものと同じであるが、鋳型は、実施例１で抽出されたゲノムＤＮＡの未加工液体の希釈された液体であり、これは、３μｇ／ｍｌの最終濃度を有した。

【0125】

８μｌの増幅産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動（９０Ｖの電圧で２０分）に供して、ＤＬ２０００ ＤＮＡマーカーを標準物質として使用して増幅産物のサイズを検出した。

【0126】

ＰＣＲ増幅産物を回収し、Ｔ−ｅａｓｙベクター（Promega）に連結し、次に大腸菌ＸＬ１株（他の市販のコンピタントな大腸菌を使用することもできる）を形質転換するのに使用し、青−白コロニーとアンピシリン耐性を使用して組み換え体を取り上げ、組換えプラスミドを抽出し、精製し、そして配列解析した。２つの配列決定結果（すなわち、配列番号２２と配列番号２３）（図１４、１６８塩基対）が得られ、これらはそれぞれ以下のように示される：

【化23】

【0127】

上記２つの配列は、７７番目の部位の塩基のみで異なり、これは枠で印を付けた。

【0128】

得られたＰＣＲ特異的増幅産物配列をＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを使用して解析して、これにコードされるタンパク質配列である３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）を得た。配列解析と比較により、本発明の新規α４／６−ＣＴｘ ＴｖｌＣ／Ｔｘｄ１の前駆体遺伝子（すなわち、配列番号２２と配列番号２３の下線部分）が得られ、これらは、以下のようにＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１コノトキシンプロペプチドをコードするヌクレオチド配列であった（１１４アミノ酸）：

【化24】

【0129】

前駆体遺伝子とコノトキシンの特徴に従って、ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１コノトキシンプロペプチドが配列番号２６又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列（３７アミノ酸）中にあると推定され、これはまた以下のように、以下の本明細書でα−コノトキシンＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１前駆体、又はα−ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１前駆体、又はＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１前駆体、又はＴｘｌＣ前駆体とも呼ばれた：

【化25】

【0130】

コノトキシン前駆体タンパク質のシグナルペプチド、プロペプチド及び成熟ペプチドの予測を、オンラインＰｒｏＰ １．０サーバーを使用して行った（Duckert, P.; Brunak, S.; Blom, N., Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Protein engineering, design & selection : PEDS 2004, 17 (1), 107-12.）。予測のための方法と機序は、Luo S, Zhangsun D, Zhang B, Quan Y, Wu Y. Novel alpha-conotoxins identified by gene sequencing from cone snails native to Hainan, and their sequence diversity. J Pept Sci. 2006,12 (11):693-704に見いだされる。誘導プロセスと結果もまた図１４に示される。

【0131】

プロペプチド配列に従って、成熟ペプチドＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１もまた誘導され、これは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有した（以後、α−コノトキシンＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１、又はα−ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１、又はＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１、又はＴｘｌＣとして引用される）：

【化26】

【0132】

ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１は、ジスルフィド結合連結方法がＩ−ＩＩＩ、ＩＩ−ＩＶ（図１５Ａ）であるα−ＣＴｘ特異的ＣＣ−Ｃ−Ｃシステインパターンを有し、すなわち２つのジスルフィド結合は第１のシステインと第３のシステインとの間、及び第２のシステインと第４のシステインとの間に別々に形成された。ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１は４／６型α−ＣＴｘである（図１４及び図１５Ａ）。ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１は新しいα−コノトキシンであり、他のα−ＣＴｘとの配列と活性の比較は表６に示される。

【0133】

実際、本発明の成熟ペプチドＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１はまた、インビボ又はインビトロでプロペプチド（配列番号２６又は２７又は３０）を対応して処理することにより得られる（例えば、図１４に示されるもの）；任意には、アミド化酵素を使用してインビボ又はインビトロのＣ末端のアミド化により、得られるであろう。

【0134】

ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１をコードするヌクレオチド配列は以下の通りである（４５塩基対）：

【化27】

【0135】

本発明はさらに、第２のプロセッシング部位（プロセッシング２）に供されていない成熟ペプチドの配列（１６アミノ酸）：

【化28】

に関し、その対応するヌクレオチド配列は以下の通りである（５１塩基対）：

【化29】

【0136】

実施例２−（１）：α−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の人工合成
α−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１成熟ペプチドのアミノ酸配列（配列番号４、Ｃ末端はアミド化されている）に従って、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１線形ペプチド（図２）をＦｍｏｃ法により人工的に合成した。具体的な方法は、以下の通りである。

【0137】

レジンペプチドは、Ｆｍｏｃ化学法により人工的に合成され、例えばポリペプチド合成装置又は手動の合成法により合成された。システインを除いて、残るアミノ酸は、標準的な側鎖保護基を用いて保護された。ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１に関して、２つ一組で、その１番目及び３番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ｔｒｔ（Ｓ−トリチル）により保護され、そして２番目及び４番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）により保護された。前記合成工程は、固相合成方法のＦｍｏｃ及びＦａｓｔＭｏｃ法を用いること、ABI Prism 433aポリペプチド合成装置により３つの異性体線形ペプチドを合成することを含む。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基は、Ｐｍｃ（Ａｒｇ）、Ｔｒｔ（Ｃｙｓ）、Ｂｕｔ（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）、ＯＢｕｔ（Ａｓｐ）、Ｂｏｃ（Ｌｙｓ）である。Ｆｍｏｃ ＨＯＢＴ ＤＣＣ法、Ｒｉｎｋアミド化レジン及びＦｍｏｃアミノ酸が用いられ、合成工程は、装置の合成マニュアルに従って行なわれた。合成を完了するために、ピペリジン脱保護時間及びカップリング時間はそれぞれ適切に延長され、二重結合は、結合することが困難なアミノ酸に用いられ、このようにしてレジンペプチドを得た。線形ペプチドを試薬Ｋ（トリフルオロ酢酸／水／エタンジチオール／フェノール／チオアニソール；９０：５：２．５：７．５：５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いてレジンから切断し、そして氷ジエチルエーテル沈殿及び洗浄に供し、そして線形ペプチドの粗生成物を回収し、分取用逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を、精製のために用い、そして溶出線形勾配は０〜４０分で０〜４０％ Ｂ９０、４０〜４５分で４０〜１００％ Ｂ９０であった。溶液Ｂ９０は９０％ＡＣＮ（アセトニトリル）、１０％ Ｈ₂０、０．０５％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；溶液Ａは０．０７５％ ＴＦＡ水溶液である。２１４ｎｍで紫外線吸収分析を行った。精製された線形ペプチドを、ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）での純度検出に供し（図２Ｃ）、ここで、ＨＰＬＣ条件は、調製と精製のものと同じであり、流速は０．７５ｍｌ／分であり、α−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１線形ペプチドは、２７．７１３分の出現時間を有した。

【0138】

ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の線形ペプチドを、文献（Dowell, C.; Olivera, B. M.; Garrett, J. E.; Staheli, S. T.; Watkins, M.; Kuryatov, A.; Yoshikami, D.; Lindstrom, J. M.; McIntosh, J. M., Alpha-conotoxin PIA is selective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors. The Journal of neuroscience 2003, 23 (24), 8445-52.）に従って、２工程の酸化フォールディング反応に供し、そしてこれらの方法は手短に、以下のように記載される。

【0139】

まず、Ｔｒｔ保護基を有する２つのシステイン間のジスルフィド結合の一つ目の対をフェリシアン化カリウム法（２０ｍＭ フェリシアン化カリウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、３０分）により形成させた。一環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）で精製後、ヨウ素酸化を行い（Ｈ₂Ｏ中１０ｍＭ ヨウ素：トリフルオロ酢酸：アセトニトリル（容量で７８：２：２０、１０分）、別の２つのシステインのＡｃｍを除去し、そして同時に２つのシステイン間のジスルフィド結合の２つ目の対を形成させた（図２Ｂ）。二環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）で精製し、ジスルフィド結合がＮ末端からＣ末端の順番に対応するシステイン間で指向的に形成される、α○−コノトキシンを得て、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の出現時間が２７．９４７分（図２Ｄ）であり、質量分析（ＭＳ）により確認した。ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである：Ｖｙｄａｃ Ｃ１８分取用逆相ＨＰＬＣカラムを用い、線形勾配溶出は４０分以内に行い、ここで、溶液Ｂは０〜４０％、そして溶液Ａは１００〜６０％であり；溶液Ａは０．０７５％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）であり、溶液Ｂは０．０５％ＴＦＡ及び９０％ＡＣＮ（アセトニトリル）であり、流速は０．７５ｍｌ／分である。２１４ｎｍで紫外線吸収分析を行った。

【0140】

酸化フォールディング後のＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の理論的な分子量（モノアイソトピック質量）は、測定された分子量に一致した：ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１のモノアイソトピック質量は１６７８．９１Ｄａであり、一方ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の測定された分子量は１６７８．７９７７Ｄａであり、これは１６７８．９１Ｄａの線形ペプチド分子量より４Ｄａ小さかった。比色分析アッセイを、２８０ｎｍの波長下でポリペプチド濃度を検出するために用い、そしてポリペプチド濃度及び質量を、ランベルト・ベール（方程式）に従って、計算した。定量され、充分に折り畳まれたこれらの毒素ペプチドは、以後の実施例でその後の活性アッセイに用いた。

【0141】

実施例２−（２）：α−コノトキシンＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）の人工合成
α○−コノトキシンＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）成熟ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１１及び１２、両方Ｃ末端はアミド化されている）に従って、ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）線形ペプチド（図１１）をＦｍｏｃ法により人工的に合成した。具体的な方法は、以下の通りである。

【0142】

レジンペプチドは、Ｆｍｏｃ化学法により人工的に合成され、例えばポリペプチド合成装置又は手動の合成法により合成された。システインを除いて、残るアミノ酸は、標準的な側鎖保護基を用いて保護された。ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）に関して、２つ一組で、その１番目及び３番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ｔｒｔ（Ｓ−トリチル）により保護され、そして２番目及び４番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）により保護された。前記合成工程は、固相合成方法のＦｍｏｃ及びＦａｓｔＭｏｃ法を用いること、ABI Prism 433aポリペプチド合成装置により３つの異性体線形ペプチドを合成することを含む。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基は、Ｐｍｃ（Ａｒｇ）、Ｔｒｔ（Ｃｙｓ）、Ｂｕｔ（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）、ＯＢｕｔ（Ａｓｐ）、Ｂｏｃ（Ｌｙｓ）である。Ｆｍｏｃ ＨＯＢＴ ＤＣＣ法、Ｒｉｎｋアミド化レジン及びＦｍｏｃアミノ酸が用いられ、合成工程は、装置の合成マニュアルに従って行なわれた。合成を完了するために、ピペリジン脱保護時間及びカップリング時間はそれぞれ適切に延長され、二重結合は、結合することが困難なアミノ酸に用いられ、このようにしてレジンペプチドを得た。線形ペプチドを試薬Ｋ（トリフルオロ酢酸／水／エタンジチオール／フェノール／チオアニソール；９０：５：２．５：７．５：５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いてレジンから切断し、そして氷ジエチルエーテル沈殿及び洗浄に供し、線形ペプチドの粗生成物を回収し、分取用逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を、精製のために用い、そして溶出線形勾配は０〜４０分で２〜４２％ Ｂ６０、４２〜４７分で４２〜１００％ Ｂ６０であった。溶液Ｂ６０は６０％ＡＣＮ（アセトニトリル）、４０％ Ｈ₂０、０．０５％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；溶液Ａは０．０７５％ ＴＦＡ水溶液である。

【0143】

精製された線形ペプチドを、ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）での純度検出に供し、ここで、溶出勾配は０〜４０分で２〜４２％ Ｂ６０、４２〜４７分で４２〜１００％ Ｂ６０であり、流速は１ｍｌ／分であった。これは、最大９５％以上の純度を有し、酸化フォールディングのために使用した。

【0144】

ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）の線形ペプチドを、文献（Dowell, C.; Olivera, B. M.; Garrett, J. E.; Staheli, S. T.; Watkins, M.; Kuryatov, A.; Yoshikami, D.; Lindstrom, J. M.; McIntosh, J. M., Alpha-conotoxin PIA is selective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors. The Journal of neuroscience 2003, 23 (24), 8445-52.）に従って、２工程の酸化フォールディング反応に供し、そしてこれらの方法は手短に、以下のように記載される。

【0145】

まず、Ｔｒｔ保護基を有する２つのシステイン間のジスルフィド結合の一つ目の対をフェリシアン化カリウム法（２０ｍＭ フェリシアン化カリウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、３０分）により形成させた。一環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）で精製後、ヨウ素酸化を行い（Ｈ₂Ｏ中１０ｍＭ ヨウ素：トリフルオロ酢酸：アセトニトリル（容量で７８：２：２０、１０分））、別の２つのシステインのＡｃｍを除去し、そして同時に２つのシステイン間のジスルフィド結合の２つ目の対を形成させた。二環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）で精製し、ジスルフィド結合がＮ末端からＣ末端の順番に対応するシステイン間で指向的に形成される、α○−コノトキシンを得て、質量分析（ＭＳ）により確認した。

【0146】

酸化フォールディング後のＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）の理論的な分子量（モノアイソトピック質量）は、測定された分子量に一致した：ＴｘｌＢのモノアイソトピック質量は１７３８．７Ｄａであり、一方ＴｘｌＢの測定された分子量は１７３８．６Ｄａであった；ＴｘｌＢ（Ｇ）のモノアイソトピック質量は１７９５．７Ｄａであり、一方ＴｘｌＢ（Ｇ）の測定された分子量は１７９５．６Ｄａであった。比色分析アッセイを、２８０ｎｍの波長下でポリペプチド濃度を検出するために用い、そしてポリペプチド濃度及び質量を、ランベルト・ベール方程式に従って、計算した。定量され、充分な折り畳まれたこれらの毒素ペプチドは、以後の実施例でその後の活性アッセイに用いた。

【0147】

実施例２−（３）：α−コノトキシンＴｘｌＣの人工合成
α○−コノトキシンＴｘｌＣ成熟ペプチドのアミノ酸配列（配列番号２８、Ｃ末端はアミド化されている）に従って、ＴｘｌＣ線形ペプチド（図１５Ａ）をＦｍｏｃ法により人工的に合成した。具体的な方法は、以下の通りである。

【0148】

レジンペプチドは、Ｆｍｏｃ化学法により人工的に合成され、例えばポリペプチド合成装置又は手動の合成法により合成された。システインを除いて、残るアミノ酸は、標準的な側鎖保護基を用いて保護された。ＴｘｌＣに関して、２つ一組で、その１番目及び３番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ｔｒｔ（Ｓ−トリチル）により保護され、そして２番目及び４番目のシステイン（Ｃｙｓ）の−ＳＨ基は、Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）により保護された。前記合成工程は、固相合成方法のＦｍｏｃ及びＦａｓｔＭｏｃ法を用いること、ABI Prism 433aポリペプチド合成装置により３つの異性体線形ペプチドを合成することを含む。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖保護基は、Ｐｍｃ（Ａｒｇ）、Ｔｒｔ（Ｃｙｓ）、Ｂｕｔ（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ）、ＯＢｕｔ（Ａｓｐ）、Ｂｏｃ（Ｌｙｓ）である。Ｆｍｏｃ ＨＯＢＴ ＤＣＣ法、Ｒｉｎｋアミド化レジン及びＦｍｏｃアミノ酸が用いられ、合成工程は、装置の合成マニュアルに従って行なわれた。合成を完了するために、ピペリジン脱保護時間及びカップリング時間はそれぞれ適切に延長され、二重結合は、結合することが困難なアミノ酸に用いられ、このようにしてレジンペプチドを得た。線形ペプチドを試薬Ｋ（トリフルオロ酢酸／水／エタンジチオール／フェノール／チオアニソール；９０：５：２．５：７．５：５、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いてレジンから切断し、そして氷ジエチルエーテル沈殿及び洗浄に供し、そして線形ペプチドの粗生成物を回収し、分取用逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）を、精製のために用い、そして溶出線形勾配は０〜４０分で１５〜５０％ Ｂ９０、４０〜４５分で５０〜１００％ Ｂ９０であった。溶液Ｂ９０は９０％ＡＣＮ（アセトニトリル）、１０％ Ｈ₂０、０．５％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；溶液Ａは０．６５％ ＴＦＡ水溶液である。

【0149】

２１４ｎｍで紫外線吸収分析を行った。精製された線形ペプチドを、ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）での純度検出に供し、ここで、溶出勾配は０〜４０分で２〜４２％ Ｂ６０、４２〜４７分で４２〜１００％ Ｂ６０であり、流速は１ｍｌ／分であった。これは、最大９５％以上の純度を有し、酸化フォールディングのために使用した。

【0150】

ＴｘｌＣの線形ペプチドを、文献（Dowell, C.; Olivera, B. M.; Garrett, J. E.; Staheli, S. T.; Watkins, M.; Kuryatov, A.; Yoshikami, D.; Lindstrom, J. M.; McIntosh, J. M., Alpha-conotoxin PIA is selective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors. The Journal of neuroscience 2003, 23 (24), 8445-52.）に従って、２工程の酸化フォールディング反応に供し、そしてこれらの方法は手短に、以下のように記載される。

【0151】

まず、Ｔｒｔ保護基を有する２つのシステイン間のジスルフィド結合の一つ目の対をフェリシアン化カリウム法（２０ｍＭ フェリシアン化カリウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、３０分）により形成させた。一環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）で精製後、ヨウ素酸化を行い（Ｈ₂Ｏ中１０ｍＭ ヨウ素：トリフルオロ酢酸：アセトニトリル（容量で７８：２：２０、１０分）、別の２つのシステインのＡｃｍを除去し、そして同時に２つのシステイン間のジスルフィド結合の２つ目の対を形成させた。二環式ペプチドを逆相ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）で精製し、ここで、線形勾配は０〜４０分で１５〜５０％ Ｂ９０、４０〜４５分で５０〜１００％ Ｂ９０であり、溶媒Ｂ９０は９０％ＡＣＮ（アセトニトリル）、１０％ Ｈ₂０、０．０５％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；溶液Ａは０．６５％ ＴＦＡ水溶液である。２１４ｎｍで紫外線吸収分析を行った。ジスルフィド結合がＮ末端からＣ末端の順番に対応するシステイン間で指向的に形成される、αＯ−コノトキシンを得て、ＴｘｌＣの出現時間は２３．３６６分（図１５Ｂ）であり、質量分析（ＭＳ）により確認した。

【0152】

酸化フォールディング後のＴｘｌＣの理論的な分子量（モノアイソトピック質量）は、測定された分子量に一致した：ＴｘｌＣのモノアイソトピック質量は１４８８．８１Ｄａであり、一方ＴｘｌＣの測定された分子量は１４８８．４２６６Ｄａであり、これは、線形ペプチド分子量の１４９２．８１５Ｄａより４Ｄａ小さかった。比色分析アッセイを、２８０ｎｍの波長下でポリペプチド濃度を検出するために用い、そしてポリペプチド濃度及び質量を、ランベルト・ベール方程式に従って、計算した。定量され、充分に折り畳まれたこれらの毒素ペプチドを、以後の実施例でその後の活性アッセイに用いた。

【0153】

実施例３−（１）：α−コノトキシンＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）の実験
文献（Azam L, Yoshikami D, McIntosh JM. Amino resudues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A]. J Biol Chem. 2008;283(17):11625-32.）の方法、インビトロ転写キット（mMessage mMachine in vitro transcription kit (Ambion, Austin, TX)）の取扱説明書は、様々なラット神経型ｎＡＣｈＲサブタイプ（α３β２、α６／α３β２β３、α６／α３β４、α９α１０、α４β２、α４β４、α３β４、α２β２、α２β４、α７）、ヒトα３β２、α６／α３β２β３、α３β４、及びマウス筋肉型ｎＡＣｈＲ（α１β１δε）のｃＲＮＡを調製するために参照され、これらの濃度は、ＵＶ ２６０ｎｍにおいてＯＤ値により測定及び計算された。カエル（Xenopus）（アフリカツメガエル（Xenopus laveis））の卵母細胞（カエルの卵）を回収及び解剖し、ｃＲＮＡをカエルの卵に注入し、各サブタイプについての注入容量は５ｎｇ ｃＲＮＡであった。筋肉型ｎＡＣｈＲについて、各サブタイプを、０．５〜２．５ｎｇ ＤＮＡ注入した。カエルの卵を、ＮＤ−９６中で培養した。回収されたカエルの卵に、１〜２日間、ｃＲＮＡを注入し、そしてｎＡＣｈＲ電圧クランプを用い、注入後１〜４日間記録した。

【0154】

ｃＲＮＡが注入されたカエルの卵の１つは、３０ｕＬのＳｙｌｇａｒｄレコードタンク（直径４ｍｍ×深さ２ｍｍ）中に置かれ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＮＤ９６潅流液（９６．０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１〜７．５）、又は１ｍＭアトロピンを含有するＮＤ９６（ＮＤ９６Ａ）で重力潅流し、流速は１ｍｌ／分であった。全てのコノトキシン溶液は、毒素の非特異的吸着を減少させるために０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含み、切換弁（SmartValve, Cavro Scientific Instruments, Sunnyvale, CA）を、毒素及びアセチルコリン（ＡＣｈ）の潅流の間に自由に切り替えるために用いることができ、一組みの三方電磁弁（solenoid valves, model 161TO31, Neptune Research, Northboro, MA）を、ＮＤ９６及びＡＣｈの潅流の間に、自由に切り替えるために用いた。二電極式電圧クランプ増幅器（model OC-725B, Warner Instrument Corp., Hamden, CT）を用いて、Ａｃｈ依存性電流（Ach gating current）を「slow」クランプに設定し、最大値（×２０００）配置（position）においてクランプ上昇（clamp gain）のオンライン記録を行った。ガラス電極を、外径１ｍｍｘ内径０．７５ｍｍのガラスキャピラリー（fiber-filled borosilicate capillaries, WPI Inc., Sarasota, FL）から引き出し、電圧及び電流電極において３Ｍ ＫＣｌを充填した。膜電圧を、−７０ｍＶにおいて保った。全システム及びデータ記録の制御を、コンピューターで行った。ＡＣｈパルスを５分間隔で１秒間、自動的にＡＣｈを潅流した。ＡＣｈは筋肉型ｎＡＣｈＲ及び神経型α９α１０ ｎＡＣｈＲの卵母細胞に対して１０μＭ；神経型のｎＡＣｈＲのα７に対して２００μＭ、及び他のサブタイプに対して１００μＭの濃度を有した。少なくとも４つの卵母細胞を、様々な毒素濃度下において、サブタイプの電流応答及び電流軌道の刺激を記録するために用いた。

【0155】

測定された電流データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（San Diego, CA）を用いて統計的解析に供し、用量反応曲線はプロットし、コノトキシンの半数遮断濃度（ＩＣ₅₀）及び毒素が遮断するｎＡＣｈＲに関連する多くの他のパラメーターを計算した。

【0156】

結果は、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１（実施例２−（１）において調製される）が、ラットα３β２ ｎＡＣｈＲに対して遮断効果を示し、そして早い溶出の特徴を有したことを示す（図３）。ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、α３β２ ｎＡＣｈＲに対して最も強力な作用を示し、その半数遮断用量ＩＣ₅₀はわずかに８．６９ｎＭであり、誤差範囲は６．９−１１．０ｎであった（表１）。１００ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、Ａｃｈ依存性のラットα３β２ ｎＡＣｈＲオープンにより発生する電流を完全に遮断し、２分以内に完全に溶出され、この遮断は可逆的であった（図３Ａ）。α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対するＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の遮断活性は２位を占め、半数遮断用量（ＩＣ₅₀）と誤差範囲は１２０．９（８６．１−１６９．８）ｎＭであり；３位はα３β４であり、半数遮断用量ＩＣ₅₀と誤差範囲は１４８．４（１０３．２−２１３．２）ｎＭを示した。α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲに対するＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の遮断活性は非常に弱く、半数遮断用量ＩＣ₅₀と誤差範囲は８５２（５９０−１２３０）ｎＭを示し；α７、α２β４に対する極度に弱い遮断活性が観察され、その半数遮断用量（ＩＣ₅₀）と誤差範囲は、それぞれ最大３０００（１７９７−４９９７）ｎＭと１５５２０（１１６００−２０７７０）ｎＭであった。これは、他のサブタイプ（α９α１０、α２β２、α４β２、α４β４及びＭα１β１δε）に対して遮断活性を示さず、そのＩＣ₅₀＞１０μＭであった（表１）。種々のｎＡＣｈＲサブタイプに対するＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の用量応答曲線は、図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄに示される。

【0157】

比較して、α３β２に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の遮断活性は、α６／α３β２β３に対するそれより１００倍以上高く、すなわち、ラットで約１００倍、ヒトで約３０５倍高かった（図３Ｂ、３Ｄ、及び表１）。すなわち、α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、α３β２対α６／α３β２β３について最適の選択性と識別能を有する最初のリガンドであった。当該分野で開示されているすべてのコノトキシンはほとんど同時にα６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲを遮断する。従って、α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、α３β２^＊対α６β２^* ｎＡＣｈＲについて高い選択性を有する最初の真の新規遮断剤であり、従って、正常状態及び疾患状態において前記サブタイプの機能と意味を研究し理解するための非常に重要な価値を有する。

【0158】

α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、α３β２ ｎＡＣｈＲの遮断において、より高い選択性を示した。

【0159】

α３β２ ｎＡＣｈＲの電流に対する１００ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響（図４Ａ）、及び同様のα２β２（図４Ｂ）とＭα１βδεα７（図４Ｃ）ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響（図４）から、１００ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１はα３β２ ｎＡＣｈＲ（図４Ａ）を完全に遮断し、一方、１００倍高い濃度を有する毒素は、α２β２及びＭα１βδε ｎＡＣｈＲサブタイプに対して遮断活性を示さないことがわかる（図４Ｂ−Ｃ）。

【0160】

従って、α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は本発明者らにより開示された神経α−コノトキシンであり、これは、α３β２ ｎＡＣｈＲに対して非常に強い活性を示し、α３β２対α６／α３β２β３について最適の選択性と識別能を有する最初のリガンドである。

【0161】

【表1】

【0162】

α３β２、α６／α３β４及びα３β４ ｎＡＣｈＲが、神経心理学的疾患、例えば神経痛、依存症、パーキンソン病、認知症、統合失調症、うつ病、不安などの治療の薬物作用標的であることが、いくつかの研究で示された（背景技術中の関連文献を参照）。従って、本発明の新規α−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、上記疾患の機序の研究、診断及び治療の分野で極めて有望である。

【0163】

実施例３−（２）：α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの特異的遮断におけるα−コノトキシンＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）の実験
文献（Azam L, Yoshikami D, McIntosh JM. Amino resudues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A]. J Biol Chem. 2008;283(17):11625-32.）の方法、インビトロ転写キット（mMessage mMachine in vitro transcription kit (Ambion, Austin, TX)）の取扱説明書は、様々なラット神経型ｎＡＣｈＲサブタイプ（α３β２、α６／α３β２β３（すなわち、α６β２*−ｎＡＣｈＲ）、α６／α３β４、α９α１０、α４β２、α４β４、α３β４、α２β２、α２β４、α７）、ヒトα６／α３β２β３、及びマウス筋肉型ｎＡＣｈＲ（α１β１δε）のｃＲＮＡを調製するために参照され、これらの濃度は、ＵＶ ２６０ｎｍにおいてＯＤ値により測定及び計算された。カエル（Xenopus）（アフリカツメガエル（Xenopus laveis））の卵母細胞（カエルの卵）を回収及び解剖し、ｃＲＮＡをカエルの卵に注入し、各サブタイプについての注入容量は５ｎｇ ｃＲＮＡであった。筋肉型ｎＡＣｈＲについて、各サブタイプを、０．５〜２．５ｎｇ ＤＮＡ注入した。カエルの卵を、ＮＤ−９６中で培養した。回収されたカエルの卵に、１〜２日間、ｃＲＮＡを注入し、そしてｎＡＣｈＲ電圧クランプを用い、注入後１〜４日間記録した。

【0164】

ｃＲＮＡが注入されたカエルの卵の１つは、３０ｕＬのＳｙｌｇａｒｄレコードタンク（直径４ｍｍ×深さ２ｍｍ）中に置かれ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＮＤ９６潅流液（９６．０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１〜７．５）、又は１ｍＭアトロピンを含有するＮＤ９６（ＮＤ９６Ａ）で重力潅流し、流速は１ｍｌ／分であった。全てのコノトキシン溶液は、毒素の非特異的吸着を減少させるために０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含み、切換弁（SmartValve, Cavro Scientific Instruments, Sunnyvale, CA）を、毒素及びアセチルコリン（ＡＣｈ）の潅流の間に自由に切り替えるために用いることができ、一組みの三方電磁弁（solenoid valves, model 161TO31, Neptune Research, Northboro, MA）を、ＮＤ９６及びＡＣｈの潅流の間に、自由に切り替えるために用いた。二電極式電圧クランプ増幅器（model OC-725B, Warner Instrument Corp., Hamden, CT）を用いて、Ａｃｈ依存性電流（Ach gating current）を「slow」クランプに設定し、最大値（×２０００）配置（position）においてクランプ上昇（clamp gain）のオンライン記録を行った。ガラス電極を、外径１ｍｍｘ内径０．７５ｍｍのガラスキャピラリー（fiber-filled borosilicate capillaries, WPI Inc., Sarasota, FL）から引き出し、電圧及び電流電極において３Ｍ ＫＣｌを充填した。膜電圧を、−７０ｍＶにおいて保った。全システム及びデータ記録の制御を、コンピューターで行った。ＡＣｈパルスを５分間隔で１秒間、自動的にＡＣｈを潅流した。ＡＣｈは筋肉型ｎＡＣｈＲ及び神経型α９α１０ ｎＡＣｈＲの卵母細胞に対して１０μＭ；神経型のｎＡＣｈＲのα７に対して２００μＭ、及び他のサブタイプに対して１００μＭの濃度を有した。少なくとも４つの卵母細胞を、様々な毒素濃度下において、サブタイプの電流応答及び電流軌道の刺激を記録するために用いた。

【0165】

測定された電流データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（San Diego, CA）を用いて統計的解析に供し、用量反応曲線はプロットし、コノトキシンの半数遮断濃度（ＩＣ₅₀）及び毒素が遮断するｎＡＣｈＲに関連する多くの他のパラメーターを計算した。

【0166】

結果は、α−ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）（実施例２−（２）において調製される）が、ラットα６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲに対して遮断効果を示し、そして早い溶出の特徴を有したことを示す（図１２）。１μＭ α−ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４は、Ａｃｈ依存性のラットα６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲオープンにより発生する電流をほとんど完全に遮断し、迅速に溶出され、この遮断は可逆的であった（図１２Ａ）。比較して、α−ＴｘｌＢの活性はＴｘｌＢ（Ｇ）の活性より８．７倍高く（図１２Ｂ）、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲについてその半数遮断用量（ＩＣ₅₀）及び誤差範囲は、それぞれ：α−ＴｘｌＢ、２８．４（１８．６−４３．４）ｎＭ；α−ＴｘｌＢ（Ｇ）、２４７．４（１８６．２−３２８．８）ｎＭであった。用量反応曲線の傾き及び誤差範囲は、それぞれ、α−ＴｘｌＢ、０．５１（０．４１−０．６０）ｎＭ及びα−ＴｘｌＢ（Ｇ）、０．７８（０．６３−０．９３）ｎＭであった。従って、α−ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）は、他のｎＡＣｈＲサブタイプに対して遮断活性を示さず、そのＩＣ５０＞１０μＭであった（図１２Ｃ、表２）。

【0167】

【表2】

【0168】

表２において、ａは、信頼度９５％の信頼限界である。ｂは、ＴｘｌＢ（Ｇ）及びＴｘｌＢの間の半数遮断用量（ＩＣ５０）の比を指す。ｃは、１０μＭ下で遮断活性が無いことを示す。

【0169】

α−ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４は、α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの遮断において高い選択性を示す。α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの電流に対する１μＭ α−ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４の作用、及び非常によく似たα３β２（Ｂ）、α６／α３β４（Ｃ）、α３β４（Ｄ） ｎＡＣｈＲ（図１３）の電流に対する１０μＭ α−ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４の作用から、１μＭ α−ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４がα６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断し（図１３Ａ）、一方、１０倍高い濃度を有する毒素は、α３β２（図１３Ｂ）、α６／α３β４（図１３Ｃ）及びα３β４（図１３Ｄ） ｎＡＣｈＲサブタイプに対する遮断活性を示さなかった。ヒトα６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲについて、α−ＴｘｌＢ及びＴｘｌＢ（Ｇ）は、ラットα６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲの遮断活性と似た遮断活性を有した。従って、α−ＴｘｌＢはα６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲに対して最適な選択性を有するα−コノトキシンであり、活性の比較は表３に示される。

【0170】

α６／α３β２β３ ｎＡＣｈＲが、神経心理学的疾患、例えばニコチン、モルフィン及びコカインに対する依存症、パーキンソン病、認知症、統合失調症、うつ病などの治療の薬物作用標的であることが、いくつかの研究で示された（背景技術中の関連文献を参照）。従って、本発明の新規α−コノトキシンＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４及びＴｘｌＢ（Ｇ）は、上記疾患の機序の研究、診断及び治療の分野で極めて有望である。

【0171】

ＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４及びＴｘｌＢ／Ｔｘｄ４（Ｇ）と他のα−ＣＴｘの配列と活性の比較は、表３に示される。

【0172】

【表3】

【0173】

実施例３−（３）：α−コノトキシンＴｘｌＣを用いてα３β４及びα６／α３β４ ｎＡＣｈＲを特異的に遮断する実験
文献（Azam L, Yoshikami D, McIntosh JM. Amino resudues that confer high selectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxin MII[S4A,E11A,L15A]. J Biol Chem. 2008;283(17):11625-32.）の方法、インビトロ転写キット（mMessage mMachine in vitro transcription kit (Ambion, Austin, TX)）の取扱説明書は、様々なラット神経型ｎＡＣｈＲサブタイプ（α３β４、α６／α３β４、α９α１０、α４β２、α４β４、α３β４、α２β２、α２β４、α７）、ヒトα３β４、及びマウス筋肉型ｎＡＣｈＲ（α１β１δε）のｃＲＮＡを調製するために参照され、これらの濃度は、ＵＶ ２６０ｎｍにおいてＯＤ値により測定及び計算された。カエル（Xenopus）（アフリカツメガエル（Xenopus laveis））の卵母細胞（カエルの卵）を回収及び解剖し、ｃＲＮＡをカエルの卵に注入し、各サブタイプについての注入容量は５ｎｇ ｃＲＮＡであった。筋肉型ｎＡＣｈＲについて、各サブタイプを、０．５〜２．５ｎｇ ＤＮＡ注入した。カエルの卵を、ＮＤ−９６中で培養した。回収されたカエルの卵に、１〜２日間、ｃＲＮＡを注入し、そしてｎＡＣｈＲ電圧クランプを用い、注入後１〜４日間記録した。

【0174】

ｃＲＮＡが注入されたカエルの卵の１つは、３０ｕＬのＳｙｌｇａｒｄレコードタンク（直径４ｍｍ×深さ２ｍｍ）中に置かれ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＮＤ９６潅流液（９６．０ｍＭ ＮａＣｌ、２．０ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１〜７．５）、又は１ｍＭアトロピンを含有するＮＤ９６（ＮＤ９６Ａ）で重力潅流し、流速は１ｍｌ／分であった。全てのコノトキシン溶液は、毒素の非特異的吸着を減少させるために０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含み、切換弁（SmartValve, Cavro Scientific Instruments, Sunnyvale, CA）を、毒素及びアセチルコリン（ＡＣｈ）の潅流の間に自由に切り替えるために用いることができ、一組みの三方電磁弁（solenoid valves, model 161TO31, Neptune Research, Northboro, MA）を、ＮＤ９６及びＡＣｈの潅流の間に、自由に切り替えるために用いた。二電極式電圧クランプ増幅器（model OC-725B, Warner Instrument Corp., Hamden, CT）を用いて、Ａｃｈ依存性電流（Ach gating current）を「slow」クランプに設定し、最大値（×２０００）配置（position）においてクランプ上昇（clamp gain）のオンライン記録を行った。ガラス電極を、外径１ｍｍｘ内径０．７５ｍｍのガラスキャピラリー（fiber-filled borosilicate capillaries, WPI Inc., Sarasota, FL）から引き出し、電圧及び電流電極において３Ｍ ＫＣｌを充填した。膜電圧を、−７０ｍＶにおいて保った。全システム及びデータ記録の制御を、コンピューターで行った。ＡＣｈパルスを５分間隔で１秒間、自動的にＡＣｈを潅流した。ＡＣｈは筋肉型ｎＡＣｈＲ及び神経型α９α１０ ｎＡＣｈＲの卵母細胞に対して１０μＭ；神経型のｎＡＣｈＲのα７に対して２００μＭ、及び他のサブタイプに対して１００μＭの濃度を有した。少なくとも４つの卵母細胞を、様々な毒素濃度下において、サブタイプの電流応答及び電流軌道の刺激を記録するために用いた。

【0175】

測定された電流データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（San Diego, CA）を用いて統計的解析に供し、用量反応曲線はプロットし、コノトキシンの半数遮断濃度（ＩＣ₅₀）及び毒素が遮断するｎＡＣｈＲに関連する多くの他のパラメーターを計算した。

【0176】

結果は、ＴｘｌＣ（実施例２−（３）において調製される）が、α３β４ ｎＡＣｈＲに対して遮断効果を示し、そして迅速に溶出された（図１６）。ＴｘｌＣは、α３β４ ｎＡＣｈＲに対して最も強力な遮断剤であり、その半数遮断用量ＩＣ₅₀はわずかに１２．５ｎＭであり、他の既知のコノトキシンとの活性の比較は表４に示した。

【0177】

１μＭ α−ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１は、Ａｃｈ依存性のラットα３β２ ｎＡＣｈＲオープンにより発生する電流を完全に遮断し、迅速に溶出され、この遮断は可逆的であった（図１６Ａ）。ＴｘｌＣは、α３β４ ｎＡＣｈＲに対して最も強い遮断活性を示し、その半数遮断用量と誤差範囲は１２．５（９．４−１６．５ｎＭ）を示し、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対するＴｘｌＣの遮断活性は２位を占め、半数遮断用量（ＩＣ₅₀）と誤差範囲は９４．１（７３−１２１ｎＭ）であり；α２β４ ｎＡＣｈＲに対するＴｘｌＣの遮断活性は非常に弱く、半数遮断用量ＩＣ₅₀と誤差範囲は４５５０（３９５０−５２３０ｎＭ）を示した。ＴｘｌＣの用量応答曲線の傾き及び誤差範囲のそれぞれ：α３β４ ｎＡＣｈＲ、０．１９（０．６６−１．４４）；α６／α３β４ ｎＡＣｈＲ ０．２６（０．７３−１．８７）；α２β４ ｎＡＣｈＲ、０．２０（１．４８−２．４２）であった。α−ＴｘｌＣは、他のｎＡＣｈＲサブタイプ（α４β４、α４β２、α６／α３β２β３、α２β２、α９α１０、α７、α１β１δε）に対して遮断活性を示さず、そのＩＣ₅₀＞１０μＭであった（図１６Ｂ、表５）であり、比較して、α−ＴｘｌＣは、α３β４に対して、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性より７．５倍高い活性、及びα２β４に対する活性より５２４倍高い活性を示した（図１６Ｂ、表５）。

【0178】

α−ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１は、α３β４ ｎＡＣｈＲの遮断において高い選択性を示した。α３β４ ｎＡＣｈＲの電流に対する１μＭ α−ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１の影響、及び非常によく似たα４β４（Ｂ）、α７（Ｃ）ｎＡＣｈＲの電流に対する１０μＭ α−ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１の影響から、１μＭ α−ＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１はα３β４ ｎＡＣｈＲ（図１７Ａ）を完全に遮断し、一方、１０倍高い濃度を有する毒素は、α４β４（図１７Ｂ）及びα７（図１７Ｃ）ｎＡＣｈＲサブタイプに対して遮断活性を示さないことがわかる。ヒトα３β４ ｎＡＣｈＲについては、α−ＴｘｌＣは、ラットα３β４ ｎＡＣｈＲについての遮断活性と同様の遮断活性を示した。

【0179】

従って、α−ＴｘｌＣは、これまで発見されているようにα３β４ ｎＡＣｈＲに対して最も強い活性を有するα−コノトキシンであり、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲに対して比較的強い遮断活性を示し、これらの活性の比較を表４に示した。

【0180】

【表4】

【0181】

【表5】

【0182】

α３β４、α６／α３β４ ｎＡＣｈＲが、神経心理学的疾患、例えばニコチン、モルフィン及びコカインに対する依存症、神経痛、パーキンソン病、認知症、統合失調症、うつ病、不安などの治療の薬物作用標的であることが、いくつかの研究で示された（背景技術中の関連文献を参照）。従って、本発明の新規α−コノトキシンＴｘｌＣ／Ｔｘｄ１は、上記疾患の機序の研究、診断及び治療の分野で極めて有望である。

【0183】

実施例４：α−コノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１を用いてα３β２ ｎＡＣｈＲ変異体を遮断する実験
α−ＣＴｘ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、α３β２ ｎＡＣｈＲの７つのβ２変異体：α３β２［Ｔ５９Ｋ］、α３β２［Ｔ５９Ｌ］、α３β２［Ｔ５９Ｉ］、α３β２［Ｖ１１１Ｉ］、α３β２［Ｆ１１９Ｑ］、α３β２［Ｑ３４Ａ］、α３β２［Ｋ７９Ａ］（図６−７；図５−６）に対する遮断活性において大きな多様性を示し、これらの７つの変異体において、主要なアミノ酸残基は、ｎＡＣｈＲのβ２サブユニットと、β４サブユニット（α−ＣＴｘ ＭＩＩを含む）中の対応するアミノ酸残基中へ変異されるリガンドを結合する部位にある。変異体を調製するための方法は、文献（Shiembob DL, Roberts RL, Luetje CW, McIntosh JM. Determinants of alpha-conotoxin BuIA selectivity on the nicotinic acetylcholine receptor beta subunit. Biochemistry. 2006 Sep 19;45(37):11200-7.）に従って行われた。

【0184】

前の５つのα３β２ ｎＡＣｈＲ変異体の詳細は、文献（Shiembob DL, Roberts RL, Luetje CW, McIntosh JM. Determinants of alpha-conotoxin BuIA selectivity on the nicotinic acetylcholine receptor beta subunit. Biochemistry. 2006 Sep 19;45(37):11200-7; and Dutertre S, Nicke A, Lewis RJ. β2 subunit contribution to 4/7 α-conotoxin binding to the nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem 2005;280:30460-8.）中に見いだされるであろう。

【0185】

α３β２受容体へのα−ＣＴｘ ＬｔｌＡ結合の主要なアミノ酸に関連する、後の２つのα３β２ ｎＡＣｈＲ変異体（α３β２ Ｑ３４Ａ、α３β２ Ｋ７９Ａ）（Luo, S., Akondi, K. B., Zhangsun, D., Wu, Y., Zhu, X., Hu, Y., Christensen, S., Dowell, C., Daly, N. L., Craik, D. J., Wang, C. I., Lewis, R. J., Alewood, P. F., and Michael McIntosh, J. (2010) Atypical alpha-conotoxin LtIA from Conus litteratus targets a novel microsite of the alpha3beta2 nicotinic receptor.Biol. Chem.285, 12355-12366）。

【0186】

具体的な実験方法は実施例３−（１）と同じであり、結果は表６〜７及び図５〜６に示した。

【0187】

表２と図５から、α−ＣＴｘ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は変異体α３β２［Ｖ１１１ｌ］に対して最小の遮断活性（ＩＣ₅₀は１２６ｎＭであった）を有し、その活性は野生型α３β２ ｎＡＣｈＲに対する活性（ＩＣ₅₀は１４．５ｎＭであった）より８．７倍低かった。変異体α３β２［Ｆ１１９Ｑ］、α３β２［Ｔ５９Ｋ］、α３β２［Ｔ５９Ｌ］に対するその遮断活性は非常に強く、そのＩＣ₅₀値はそれぞれ０．５８、０．９６及び２．０３であり、その活性は、野生型α３β２ ｎＡＣｈＲに対する活性より、それぞれ２５倍、１５倍及び７倍高かった。α−ＣＴｘ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、変異体α３β２［Ｑ３４Ａ］、α３β２［Ｔ７９Ｋ］及び［Ｔ５９ｌ］に対して８．６４、１０．８及び１５．２ｎＭのＩＣ₅₀を示し、その遮断活性は、野生型α３β２ ｎＡＣｈＲに対する遮断活性の０．６〜１．０５倍であり、これは、野生型α３β２ ｎＡＣｈＲの遮断活性からの有意差を示さなかった。α−ＣＴｘ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、変異体α３β２［Ｆ１１９Ｑ］に対して、α３β２［Ｖ１１１ｌ］に対する活性の２１７倍の活性を示した。これは、β２サブユニットの１１１番目の部位のバリン、１１９番目の部位のフェニルアラニン、及び５９番目の部位のスレオニンが、ＬｖｌＡをα３β２に結合させるのに重要な役割を果たすことを意味し、ここで、活性の変化は２つの傾向（上昇と下降）を含み、これは、すでに開示された、α３β２ ｎＡＣｈＲにα−ＣＴｘを結合させたＭＩＩ、ＬｔｌＡ及び他の部位とは異なっていた。

【0188】

【表6】

【0189】

α−ＣＴｘ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、α３β２ ｎＡＣｈＲのいくつかの変異体の遮断活性（ＩＣ₅₀）に大きな影響を有するのみでなく、その溶出速度に顕著な影響を有した（図６及び表７）。研究結果は、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１がα３β２ ｎＡＣｈＲの野生型の電流の約５０％を遮断し、溶出が迅速に行われ、電流が２分以内に完全に回復され（図６Ａ）；一方、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は変異体α３β２［Ｆ１１９Ｑ］のすべての電流を遮断し、溶出はゆっくり行われ、電流は１２分溶出後に回復され（図６Ｂ）；より有意な差は、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１が変異体α３β２［Ｔ５９Ｋ］のすべての電流を遮断し、溶出は非常にゆっくり行われ、電流は２０分溶出後に対照電流の２７％まで回復（図６Ｃ）することにあったが；しかし、１０ｎＭ α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は変異体α３β２［Ｖ１１１ｌ］の電流を完全には遮断しなかった（図６Ｄ）。種々の変異体受容体の溶出速度に対するα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の影響を表７に示した。α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１で遮断された後の４つの変異体、α３β２［Ｋ７９Ａ］、α３β２［Ｖ１１１ｌ］、α３β２［Ｑ３４Ａ］及びα３β２［Ｔ５９ｌ］では、溶出速度に対する影響は小さく、すなわち、１０〜１００００ｎＭのような非常に広範囲の濃度では、その溶出はいつも迅速に行われ、その電流はすべて、１〜３分以内に対照レベル（すなわち１００％）まで回復した。変異体α３β２［Ｔ５９Ｌ］については、その溶出は比較的ゆっくり行われ、その電流は５〜８分後に対照レベルまで回復した。変異体α３β２［Ｆ１１９Ｑ］について、その溶出はさらにゆっくり行われ、その電流は１０〜１２分後に対照レベルまで回復した。変異体α３β２［Ｔ５９Ｋ］については、その溶出は最もゆっくり行われ、１０ｎＭ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１はその電流を完全に遮断し、これは２０分溶出後に、対照電流の２８±３．５％まで回復し、１００ｎＭ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１で遮断された後は、その電流は２０分溶出後に、対照電流の１３±２％まで回復した。変異体α３β２［Ｔ５９Ｋ］がＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の結合方法に対して最も大きな影響を示したことがわかる。従って、α−ＣＴｘ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の構造と機能は、α−ＣＴｘとｎＡＣｈＲとの相互作用の機序を研究するための重要な基礎を与え、そのための優れたツールとモデルとを与える。

【0190】

【表7】

【0191】

実施例５：α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の鎮痛活性の実験
１．ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の鎮痛活性を試験するためにラットＣＣＩモデルを使用
（１）試験動物と試験材料
ＳＤ（スプラーグドーレイ）ラットを使用して、虚血神経の慢性狭窄損傷モデル（慢性狭窄損傷モデル、ＣＣＩモデル）を調製し、試験したコノトキシンの鎮痛活性を圧痛テスター（Rat 800G, このモデルはUS IITC 2391である）を用いて測定した。ＳＤ（スプラーグドーレイ）ラットは、広東省の医療実験動物センター（Medical Experimental Animal Center of Guangdong Province）から購入した。Bennett et al.の方法（Bennett G J, Xie Y K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man [J]. Pain, 1988, 33(1): 87）を使用して、ＣＣＩモデルを調製した。

【0192】

（２）実験方法
ペントバルビタールナトリウム８０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射により麻酔した後、右下肢に無菌条件下で切開して坐骨神経の幹を露出させ、これを１ｍｍ間隔で４−０クロム縫合糸を使用して緩く結合させ、縫合糸は神経上膜の血液供給に影響を与えない気密性を有し、次にステッチを層ごとに行った。左下肢を切開して坐骨神経の幹を露出させたが、これは結紮せず、従って偽手術側として使用した。ペニシリン粉末を局所的に両側創傷に塗布した。ペニシリンの腹腔内注射は、１日に１回、８０，０００単位／時間で連続３日間行った。カテーテル挿入前に５匹のラットを１つのケージで飼育し、カテーテル挿入後に１匹のラットを１つのケージで飼育した。予備選抜後の有資格ラットを無作為に５群、すなわち、生理食塩水陰性対照群、モルフィン陽性対照群、及び毒素ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１試験群、モルフィン陽性対照群、及び毒素ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１試験群（ここで、毒素ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１試験群は２回繰り返した）（すなわち、毒素ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１試験群は３回行われた）、に分けた。ラットの影響を受けた足と偽手術足の機械的疼痛刺激値を、手術前、手術の３日後、１週間後と２週間後に、測定した。有資格慢性狭窄損傷モデル（ＣＣＩモデル）を、神経痛に対するＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の治療効果を試験するための全体の動物モデルとして使用した。

【0193】

ＣＣＩモデルにおけるＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の鎮痛作用を腹腔内注射により試験した。生理食塩水（Saline）をブランク対照、すなわち陰性対照として使用し；モルフィンを陽性対照として、ラット体重１ｋｇ当たり１ｍｇの用量で使用した。試験群は毒素ペプチドα−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１を１ｎｍｏｌ／ｋｇ（約１．７μｇ／ｋｇ）ラット体重の用量で使用し、各群は８匹を有した（ｎ＝８）。鎮痛活性は機械的閾値で示され、これは、基礎的疼痛閾値（１００）に対して観察された疼痛閾値の比パーセンテージ（基礎の％）であり、この比が大きいほど、鎮痛作用が良好である。

【0194】

（３）試験結果
結果は図７〜８に示される。
図７は、α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１を１〜２４時間腹腔内注射（ＩＰ）後の、ＣＣＩモデルにおける鎮痛作用を示す。ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は１時間投与後に、神経痛に対して強力な鎮痛作用を示し、一方モルフィンの陽性対照は１時間の投与後に鎮痛作用を示さなかった；ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、３時間投与後に神経痛に対して最大の鎮痛作用を示し、平均鎮痛値は１６０％であり、ある場合には最大２００％であり、一方モルフィンの陽性対照は３時間の投与後に１２０％の平均鎮痛値を示し；そして、２４時間後でさえ、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１はモルフィンよりはるかに高い鎮痛値を示した（図７）。

【0195】

連続７日間投与後に、１週間の休薬（７日目〜１４日目）後に鎮痛値を試験し、結果を図８に示す。７日目〜１４日目には、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１はモルフィン群より有意に高い機械的閾値を示し、１２日目に最大の鎮痛作用が観察され、平均鎮痛値は最大２００％であり、モルフィン群は、生理食塩水対照群と比較して、鎮痛値の有意差を示さなかった。これは、モルフィンの鎮痛作用が休薬後に消失し、一方ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は休薬後も鎮痛作用を保持したこと（図８）を示し、これは、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１が鎮痛作用を有するのみでなく、神経痛に対して治療効果も有することを示唆する。

【0196】

上記結果は、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１がモルフィンより強力な鎮痛作用を有することを示し、同じ重量と用量で表すと、ＣＣＩモデルにおけるＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の鎮痛作用はモルフィンの作用より８２３〜１１７６倍高い。ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の腹腔内注射は、ラットＣＣＩモデルにおいて強力な鎮痛作用と良好な持続性を示し、コノトキシン自体は依存症を誘導しない。

【0197】

２．マウスホットプレートｓｋｎを使用するＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の鎮痛活性
（１）試験動物
５秒未満または３０秒超の応答潜伏期を有するマウスを除去し、１８±２ｇの体重を有する５０匹のメスの昆明マウスを使用した。投与前に、マウスを５５±０．５℃のホットプレート痛覚閾値検出器（タイプはＵＳ ＩＩＴＣ ３９であった）の金属板上に乗せ、後肢をなめるか又はジャンプする応答の潜伏期（秒）を算出した。

【0198】

（２）試験方法
マウスを、ランダム割り当て記数テーブルに従って３群、すなわち、陰性対照生理食塩水（Saline）、陽性対照モルフィン群（モルフィン）、及びαコノトキシンＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１に、１群１０匹で分けた。各群について、１匹のマウスあたり１０μＬの注入容量で脳室内注入を行った。陽性対照モルフィンの投与量は、１００μｇ／ｋｇマウス体重であった；α−ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の投与量は、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ（約０．１７μｇ／ｋｇ）マウス体重であった。同じ重量と用量で表すと、陽性対照モルフィンの投与量は、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１よりも５８８倍高かった。投与前に、マウスを５５±０．５℃のホットプレート疼痛閾値検出器（タイプはＵＳ ＩＩＴＣ ３９であった）の金属板上に乗せ、マウスの後肢をなめるか又はジャンプする（秒）単位の応答の潜伏期を疼痛閾値とした。各マウスを２回測定し、その平均値を基礎疼痛閾値として使用し、２回の測定間の間隔を５分とした。足の火傷を避けるために、終了時間を６０秒とし、６０秒超の疼痛閾値は６０秒として記録した。投与後、疼痛閾値を、別々に１５、３０、４５、６０、９０、１２０分に測定し、結果をｘ±ｓとして表した。

【0199】

（３）試験結果
結果を図９に示す。

【0200】

α−ＣＴｘ ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は、ホットプレート試験モデルで非常に強力な鎮痛作用を示した（図９）。投与前に、３群のマウスはすべて約１４秒〜約１７秒の基礎疼痛閾値を有した。投与後、全ての時点で、陽性対照の生理食塩水（Saline）の疼痛閾値は約１４〜１７秒で維持され、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の疼痛閾値は、投与後１５分で３０秒に急速に上昇し、モルフィンの疼痛閾値も急速に３２秒（図９）に上昇し、その間、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１は強力な鎮痛活性を示し、これは、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１ＬｖｌＡが鎮痛活性の非常に急速な出現を示すことを示した。投与後３０〜９０分以内に、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の疼痛閾値はわずかに低下し、次に連続的に上昇し、一方モルフィンの疼痛閾値は連続して低下し、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の疼痛閾値は、モルフィンの疼痛閾値と比較して１．３〜１．５倍上昇した。投与後１２０分に、ＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の疼痛閾値はわずかに低下したが、それでもモルフィンの疼痛閾値より１．３倍高かった。同じ重量と用量で表されると、ホットプレートモデルにおけるＬｖＩＡ／ＬｖＤ２１の鎮痛作用は、モルフィンの作用より７６４〜８８２倍高かった。

【0201】

本発明の実施形態は詳細に記載されるが、当業者は、これらの詳細が、開示される教示に従って、改変及び変更され得ることを理解し、これらの全ての変更は、本発明の保護範囲内である。本発明の全体の範囲は、添付の特許請求の範囲及びこれらの任意の等価物により与えられる。

【図1】

【図2(A)】

【図2(B)】

【図2(C)】

【図2(D)】

【図3(A)】

【図3(B)】

【図3(C)】

【図3(D)】

【図4(A)】

【図4(B)】

【図4(C)】

【図5(A)】

【図5(B)】

【図5(C)】

【図6(A)】

【図6(B)】

【図6(C)】

【図6(D)】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11(A)】

【図11(B)】

【図12(A)】

【図12(B)】

【図12(C)】

【図13(A)】

【図13(B)】

【図13(C)】

【図13(D)】

【図14】

【図15(A)】

【図15(B)】

【図16(A)】

【図16(B)】

【図17(A)】

【図17(B)】

【図17(C)】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]