特許 6337013 テルペノイドを調製するための組換え微生物、及び組換え微生物の構築方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6337013

(24)【登録日】2018年5月11日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】テルペノイドを調製するための組換え微生物、及び組換え微生物の構築方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20180528BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20180528BHJP

   C12P 5/00 20060101ALN20180528BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   !C12N15/00 A

   !C12P5/00

【請求項の数】9

【全頁数】53

(21)【出願番号】特願2015-555561(P2015-555561)

(86)(22)【出願日】2014年1月28日

(65)【公表番号】特表2016-504917(P2016-504917A)

(43)【公表日】2016年2月18日

(86)【国際出願番号】CN2014000130

(87)【国際公開番号】WO2014117639

(87)【国際公開日】20140807

【審査請求日】2015年12月17日

(31)【優先権主張番号】201310039787.8

(32)【優先日】2013年2月1日

(33)【優先権主張国】CN

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515210950

【氏名又は名称】ティエンジン インスティテュート オブ インダストリアル バイオテクノロジー， チャイニーズ アカデミー オブ サイエンスィズ

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(74)【代理人】

【識別番号】100163038

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 武志

(72)【発明者】

【氏名】チャン・シュエリー

(72)【発明者】

【氏名】リ・チンイェン

(72)【発明者】

【氏名】ヂャオ・ジン

(72)【発明者】

【氏名】スン・タオ

(72)【発明者】

【氏名】ダイ・グァンピン

(72)【発明者】

【氏名】シュ・ホンタオ

(72)【発明者】

【氏名】タン・ジンレイ

(72)【発明者】

【氏名】マ・イェンフー

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０９９８６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Chinese Journal of Biotechnology, 2013年1月 ，Vol.29, No.1，p.41-55

【文献】 Metabolic Engineering, 2006年，Vol.8，p.79-90

【文献】 Appl. Environ. Microbiol., 2010年，Vol.76, No.10，p.3097-3105

【文献】 FEMS Microbiol. Lett., 2006年，Vol.254，p.245-250

【文献】 Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012年，Vol.93，p.2455-2462

【文献】 Metabolic Engineering, 2008年，Vol.10，p.352-359

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ １５／００−１９／００

Ｃ１２Ｐ ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

大腸菌内でのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を改善して組換え菌株１を得る工程を含む方法により構築される組換え菌株１であり、
前記組換え菌株１は、組換え菌株１−２、又は組換え菌株１−３であり、
前記組換え菌株１−２は、大腸菌変異体Ａのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−４６、人工調節領域Ｍ１−３７、及び人工調節領域Ｍ１−９３のいずれかで置換することにより得られ、
前記大腸菌変異体Ａは、
１）β−カロテン合成遺伝子クラスター、及びｔｒｃ調節領域を大腸菌に導入して組換え大腸菌を得る工程と；
２）前記組換え大腸菌の前記β−カロテン合成遺伝子クラスターの前記ｔｒｃ調節領域、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域について、
前記β−カロテン合成遺伝子クラスターの前記ｔｒｃ調節領域を、前記人工調節領域Ｍ１−９３で置換し、
前記１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域を、前記人工調節領域Ｍ１−３７で置換し、
前記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域を、前記人工調節領域Ｍ１−４６で置換して、
前記大腸菌変異体Ａを得る工程と；を含む方法により構築され、
前記組換え菌株１−３は、大腸菌変異体Ｂのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、前記人工調節領域Ｍ１−４６で置換することにより得られ、
前記大腸菌変異体Ｂは、前記組換え菌株１−２のカロテン合成遺伝子クラスターのβ−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ及びリコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹを欠失させて前記大腸菌変異体Ｂを得る工程を含む方法により構築され、
前記β−カロテン合成遺伝子クラスターは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ、前記β−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ、前記リコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ、及びフィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢからなる遺伝子クラスターであり、
前記β−カロテン合成遺伝子クラスターの前記ｔｒｃ調節領域は、配列表中の配列番号：６のヌクレオチド配列を有し、
前記１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：８のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−３７は、配列表中の配列番号：１０のヌクレオチド配列を有し、
前記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１２のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−９３は、配列表中の配列番号：１１のヌクレオチド配列を有し、
前記α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１５のヌクレオチド配列を有することを特徴とする大腸菌のリコピン及びβ−カロテンの少なくともいずれかの産生能力を改善できる組換え菌株１。

【請求項2】

前記β−カロテン合成遺伝子クラスターは、前記大腸菌の染色体のｌｄｈＡサイトに挿入され、前記大腸菌はＡＴＣＣ８７３９である請求項１に記載の組換え菌株１。

【請求項3】

組換え菌株２のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域、及びトランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域の少なくともいずれかを、人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株３を得る工程を含む方法により構築され、
前記組換え菌株２は、
１）β−カロテン合成遺伝子クラスター、及びｔｒｃ調節領域を大腸菌に導入して組換え大腸菌を得る工程と；
２）前記組換え大腸菌の前記β−カロテン合成遺伝子クラスターの前記ｔｒｃ調節領域、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域について、
前記β−カロテン合成遺伝子クラスターの前記ｔｒｃ調節領域を、人工調節領域Ｍ１−９３で置換し、
前記１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−３７で置換し、
前記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−４６で置換して、
前記組換え菌株２を得る工程と；を含む方法により構築され、
前記β−カロテン合成遺伝子クラスターは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ、β−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ、リコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ、及びフィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢからなる遺伝子クラスターであり、
前記β−カロテン合成遺伝子クラスターの前記ｔｒｃ調節領域は、配列表中の配列番号：６のヌクレオチド配列を有し、
前記１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：８のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−３７は、配列表中の配列番号：１０のヌクレオチド配列を有し、
前記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１２のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−９３は、配列表中の配列番号：１１のヌクレオチド配列を有し、
前記α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１５のヌクレオチド配列を有し、
前記コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１６のヌクレオチド配列を有し、
前記トランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１７のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有することを特徴とする大腸菌のリコピン及びβ−カロテンの少なくともいずれかの産生能力を改善できる組換え菌株３。

【請求項4】

前記β−カロテン合成遺伝子クラスターは、大腸菌の染色体のｌｄｈＡサイトに挿入され、前記大腸菌はＡＴＣＣ８７３９である請求項３に記載の組換え菌株３。

【請求項5】

前記組換え菌株３は、組換え菌株３−１、組換え菌株３−２、組換え菌株３−３又は組換え菌株３−４であり、
前記組換え菌株３−１は、前記組換え菌株２のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＳｕｃＡＢの本来の調節領域、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域、及びトランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域の各々を、人工調節領域Ｍ１−４６で置換して前記組換え菌株３−１を得る工程を含む方法により構築され、
前記組換え菌株３−２は、前記組換え菌株２の前記α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、前記人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株３−２を得る工程を含む方法により構築され、
前記組換え菌株３−３は、前記組換え菌株２の前記α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、及び前記コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域の各々を、前記人工調節領域Ｍ１−４６で置換して前記組換え菌株３−３を得る工程を含む方法により構築され、
前記組換え菌株３−４は、前記組換え菌株２の前記α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、及び前記トランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域の各々を、前記人工調節領域Ｍ１−４６で置換して前記組換え菌株３−４を得る工程を含む方法により構築される請求項３又は４に記載の組換え菌株３。

【請求項6】

組換え菌株４のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、トランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域、及びコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域の少なくともいずれかを、人工調節領域Ｍ１−４６で置換する工程を含む方法により構築される組換え菌株５であって、
前記組換え菌株４は、組換え菌株２のβ−カロテン合成遺伝子クラスターのβ−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ及びリコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹを欠失させて組換え菌株を得る工程を含む方法により構築され、
前記組換え菌株２は、
１）β−カロテン合成遺伝子クラスター、及びｔｒｃ調節領域を大腸菌に導入して組換え大腸菌を得る工程と；
２）前記組換え大腸菌の前記β−カロテン合成遺伝子クラスターの前記ｔｒｃ調節領域、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域について、
前記β−カロテン合成遺伝子クラスターの前記ｔｒｃ調節領域を、前記人工調節領域Ｍ１−９３で置換し、
前記１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域を、前記人工調節領域Ｍ１−３７で置換し、
前記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域を、前記人工調節領域Ｍ１−４６で置換して、
前記組換え菌株２を得る工程と；を含む方法により構築され、
前記β−カロテン合成遺伝子クラスターは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ、前記β−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ、前記リコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ、及びフィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢからなる遺伝子クラスターであり、
前記β−カロテン合成遺伝子クラスターの前記ｔｒｃ調節領域は、配列表中の配列番号：６のヌクレオチド配列を有し、
前記１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：８のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−３７は、配列表中の配列番号：１０のヌクレオチド配列を有し、
前記イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１２のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−９３は、配列表中の配列番号：１１のヌクレオチド配列を有し、
前記α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１５のヌクレオチド配列を有し、
前記トランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１７のヌクレオチド配列を有し、
前記コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１６のヌクレオチド配列を有し、
前記人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有することを特徴とする大腸菌のリコピン及びβ−カロテンの少なくともいずれかの産生能力を改善できる組換え菌株５。

【請求項7】

前記β−カロテン合成遺伝子クラスターは、大腸菌の染色体のｌｄｈＡサイトに挿入され、前記大腸菌はＡＴＣＣ８７３９である請求項６に記載の組換え菌株５。

【請求項8】

前記組換え菌株５は、組換え菌株５−１、組換え菌株５−２、又は組換え菌株５−３であり、
前記組換え菌株５−１は、前記組換え菌株４の前記α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、前記人工調節領域Ｍ１−４６で置換して前記組換え菌株５−１を得る工程を含む方法により構築され、
前記組換え菌株５−２は、前記組換え菌株４の前記α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、及び前記トランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域の各々を、前記人工調節領域Ｍ１−４６で置換して前記組換え菌株５−２を得る工程を含む方法により構築され、
前記組換え菌株５−３は、前記組換え菌株４の前記α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、前記コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域、及び前記トランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域の各々を、前記人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株５−３を得る工程を含む方法により構築される請求項６又は７に記載の組換え菌株５。

【請求項9】

リコピン及びβ−カロテンの少なくともいずれかの製造における請求項１又は２に記載の前記組換え菌株１の使用、
β−カロテンの製造における、請求項３から５のいずれかに記載の前記組換え菌株３の使用、又は
リコピンの製造における、請求項６から８のいずれかに記載の前記組換え菌株５の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー分野、特にテルペノイドを製造するための組換え菌株、及びその構築方法に関する。

【背景技術】

【0002】

テルペノイドは、自然界において、高等植物、菌類、微生物、昆虫、及び海洋生物の中に広く存在している。現在までに５万を超えるテルペノイドが発見されており、その殆どが医薬品及びヘルスケア製品において生物学的に活性な成分であり、例えば、モノテルペン（Ｃ１０）であるメントール、リナロール、セスキテルペン（Ｃ１５）であるアルテミシニン、ジテルペン（Ｃ２０）であるタキソール、タンシノンＩＩＡ、トリテルペン（Ｃ３０）であるギンセノシド類、ノトギンセノシド類、グリチルリチン、テトラテルペン（Ｃ４０）であるリコピン、β−カロテン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン及びアスタキサンチン、カロテノイド類等、ポリテルペンであるコエンザイムＱ１０、テルペノイドアルカロイドであるデンドロビン、ゲンチアニン、アコニチン及びレセルピン等が挙げられる。

【0003】

テルペノイドは、幅広い用途が期待でき、大きな市場の需要がある点から、テルペノイドを効率的に製造する方法は、現在盛んに研究されている。現在、テルペノイドを製造する主に３つの方法として、化学合成、植物の抽出、及び微生物発酵がある。化学合成は、工程が複雑であり、エネルギー消費が大きく、重大な汚染を生じる一方、テルペノイドは植物中に低量であることが多く、植物からの抽出は、野生植物資源に重大な被害を引き起こす可能性があるが、対照的に、微生物発酵は、原料からの制限がなく、扱い易くクリーンな製造工程であるため、非常に有益となり得る。

【0004】

微生物発酵には２種類あり、その１つは、野生株を使用するものである。しかしながら、現在のところ、テルペノイドを産生することができるのはごく僅かな野生型微生物株のみであり、発酵の生産能力は比較的低い。従来の突然変異誘発育種法は、菌株の発酵能力をある程度向上させることができるが、よりランダムで効果的でなく、不安定な変異株をもたらす。もう１つは、構築された組換え菌株を用いた発酵である。近年の代謝工学及び合成生物学的技術の継続的な開発として、組換え菌株を用いて、より多くの種類のテルペノイドが高収量で合成されている。最も一般的に使用される組換え菌株は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ））である。そのゲノム配列が完全に開示されており、遺伝的背景及び代謝経路が明らかであり、培地の要求が単純で成長が早い等の多くの利点を有しているため、多くの研究では、操作のための出発菌株として大腸菌が選択される（非特許文献１〜４）。

【0005】

β−カロテン及びリコピンは、２種類の代表的なテルペノイドである。β−カロテンは、抗酸化作用、解毒作用、抗がん作用、心血管疾患の予防効果、白内障の予防効果及び治療効果、及び肝臓の保護作用等を有する。更に、β−カロテンは、「ビタミンＡ源」とも呼ばれ、ヒトにおいて重要な生理機能活性物質であり、ビタミンＡの欠乏により引き起こされる上皮細胞角質化、眼球乾燥症、及び夜盲症等を治療することができる（非特許文献４及び２）。リコピンは、トマトの赤色顔料の主成分であり、優れた抗酸化剤である。リコピンは、「フリーラジカル」の代謝産物によるヒトの組織及び器官の損傷を防止することができ、自然健康食品又は医薬品に使用することができる。リコピン含有健康食品は、視力の加齢性低下を防止し、老化に抵抗し、心血管疾患を防止することが可能であり、また、消化管がん、子宮頸部がん、乳房がん、皮膚がん、及び膀胱がん等の各々に、ある程度の阻害作用を発揮する。リコピンは、無毒かつ無害であり、その栄養価を向上させるために、例えば、β−カロテンのように、アイスクリーム、フルーツシロップ、飴玉、パン、クッキー、ケーキ等の食品に添加することができる。リコピンは、ヘルスケア効果においては、ビタミンＥ及びβ−カロテンよりも優れている。

【0006】

例えば、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ等の多くの天然の微生物が、β−カロテン及びリコピンを合成することができる（非特許文献５）。ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）シンターゼの作用下、ＤＭＡＰＰが２分子のＩＰＰと順次反応してＦＰＰを形成し、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼの作用下、ＦＰＰとＩＰＰとが反応してＧＧＰＰを形成する。フィトエンは、フィトエンシンターゼ（ＣｒｔＢ）の作用下で２分子のＧＧＰＰからｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄで合成され、リコピンは、フィトエンデサチュラーゼ（ＣｒｔＩ）の作用下でフィトエンから形成され、β−カロテンは、β−リコピンシクラーゼ（ｃｒｔＹ）の作用下でリコピンから形成される。

【0007】

イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、全てのテルペノイド化合物の前駆体化合物である。これまでに、２つの合成経路が知られている（非特許文献４）。一方は、主に真菌及び植物の細胞質ゾル又は小胞体に見られるメバロン酸経路（ＭＶＡ経路）である。この経路により、３分子のアセチルコエンザイムＡが縮合して３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成し、二段階のキナーゼ反応を受けてメバロン酸二リン酸（ＭＶＡ）を形成し、最終的に多段階のリン酸化反応及び脱炭酸反応を受けてＩＰＰを生成する。もう一方は、主にバクテリア、緑藻及び植物のプラスミドに見られるＭＥＰ経路である。この経路は、３−ホスホグリセルアルデヒド及びピルビン酸を出発物質として開始し、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（Ｄｘｓ）及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（Ｄｘｒ）により触媒されて２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）を形成する。ＭＥＰは、次いで、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＩｓｐＤ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、及び２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）により触媒されて３つの連続反応を介し、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸（ＭＥＣ）を形成する。ＭＥＣは、次いで、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−２−メチル−２−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）の作用により、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）を形成する。次いで、ＨＭＢＰＰは、ＨＭＢＰＰレダクターゼ（１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＩｓｐＨ））により触媒され、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの５：１の混合物を形成する。ＩＰＰは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Ｉｄｉ）で触媒されてジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に異性化される。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、これを基に種々のテルペノイドを合成することができる、テルペノイドの基本のＣ５ユニットである。

【0008】

大腸菌からテルペノイドを産生するためには、まず大腸菌にテルペノイドを合成するための遺伝子を導入する必要がある。但し、大腸菌はＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを合成する能力が乏しいことにより、テルペノイドの産生量は常に少ない。組換え大腸菌によるテルペノイドの合成能力を改善するためには、組換え大腸菌のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの合成能力を向上させる必要がある。現在、組換え大腸菌のＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの合成能力を高める解決策は、主に２つある。１つは、外部のＭＶＡ経路（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＶＡ経路）を導入することであり（非特許文献６〜８）、もう１つは、ＭＥＰ経路における重要な遺伝子の発現強度を増加させること、及びＭＥＰ経路における前駆体化合物である３−ホスホグリセルアルデヒド及びピルビン酸の供給を増加させることにより、大腸菌自体のＭＥＰ経路の効率を改善することである（非特許文献９〜１４）。

【0009】

ＭＥＰ経路における重要な遺伝子の発現強度を高める以前の試みは全て、強力なプロモーター（例えば、Ｔ５プロモーター等）の使用に焦点を当てたものであった（非特許文献１４）。ＭＥＰ経路における、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子（ｄｘｓ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ遺伝子（ｉｓｐＤ）及び４− ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ遺伝子（ｉｓｐＦ）、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ遺伝子（ｉｓｐＥ）、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子（ｉｄｉ）の過剰発現が、大腸菌のβ−カロテンの産生能力を改善できることが、研究から示されている。しかしながら、ＭＥＰ経路における、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ遺伝子（ｄｘｒ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ遺伝子（ｉｓｐＧ）、及び１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ遺伝子（ｉｓｐＨ）の発現強度の増加は、組換え大腸菌のβ−カロテンの産生能力を低下させる（非特許文献１４）。

【0010】

別の態様では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、ＭＥＰ経路における重要な補因子である。補因子の供給不足により、ＭＥＰ経路の効率が低下する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ａｊｉｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２００８年

【非特許文献2】Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２００７年

【非特許文献3】Ｋｅａｓｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８年

【非特許文献4】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２年

【非特許文献5】Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．，２００３年

【非特許文献6】Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３年

【非特許文献7】Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７年

【非特許文献8】Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９年

【非特許文献9】Ａｊｉｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０年

【非特許文献10】Ａｌｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５年（ａ）

【非特許文献11】Ａｌｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５年（ｂ）

【非特許文献12】Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０年

【非特許文献13】Ｊｉｎ及びＳｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ，２００７年

【非特許文献14】Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６年

【発明の概要】

【0012】

本発明の目的は、組換え菌株１を提供することにある。

【0013】

本発明は、大腸菌又はその変異体におけるα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を改善して組換え菌株１を得る工程を含む方法により構築されることを特徴とする組換え菌株１を提供する。

【0014】

上記組換え菌株１において、大腸菌又はその変異体におけるα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を改善する方法は、大腸菌又はその変異体におけるα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−４６、人工調節領域Ｍ１−３７、及び人工調節領域Ｍ１−９３のいずれかで置換することであり、
人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有し、
人工調節領域Ｍ１−３７は、配列表中の配列番号：１０のヌクレオチド配列を有し、
人工調節領域Ｍ１−９３は、配列表中の配列番号：１１のヌクレオチド配列を有し、
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの調節領域は、配列表中の配列番号：１５の配列を有する。

【0015】

上記組換え菌株１は、以下の組換え菌株１−１、組換え菌株１−２、又は組換え菌株１−３である。

【0016】

上記組換え菌株１−１は、大腸菌のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を改善したものであり、大腸菌のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性の改善は、特に大腸菌のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、特に相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−４６で置換することにより達成される（詳細については、実施例１６、Ｉ．１を参照）。

【0017】

上記組換え菌株１−２は、大腸菌変異体Ａのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を改善したものであり、大腸菌変異体Ａのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性の改善は、特に大腸菌変異体Ａのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−４６、人工調節領域Ｍ１−３７、及び人工調節領域Ｍ１−９３のいずれかで置換することにより達成され、大腸菌変異体Ａ（ＣＡＲ００１）のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域の、特に相同組換えによる人工調節領域Ｍ１−４６での上記置換の結果、実施例３のパート１に示すように、ＳｕｃＡＢ４６−ＦＫＦが得られる。

【0018】

大腸菌変異体ＣＡＲ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域の、特に相同組換えによる人工調節領域Ｍ１−３７での上記置換の結果、実施例３のパート１に示すように、ＳｕｃＡＢ３７−ＦＫＦが得られる。

【0019】

大腸菌変異体ＣＡＲ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域の、特に相同組換えによる人工調節領域Ｍ１−９３での上記置換の結果、実施例３のパート１に示すように、ＳｕｃＡＢ９３−ＦＫＦが得られる。

【0020】

大腸菌変異体Ａ（ＣＡＲ００１）は、
１）β−カロテン合成遺伝子クラスター、及びｔｒｃ調節領域を大腸菌に導入して組換え大腸菌（ＱＬ００２）を得る工程と；
２）組換え大腸菌のβ−カロテン合成遺伝子クラスターのｔｒｃ調節領域、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域について、
β−カロテン合成遺伝子クラスターのｔｒｃ調節領域を、人工調節領域Ｍ１−９３で置換し、
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子の本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−３７で置換し、
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−４６で置換して、
大腸菌変異体Ａ（ＣＡＲ００１）を得る工程と；を含む方法により構築され、
上記の組換え大腸菌のβ−カロテン合成遺伝子クラスターのｔｒｃ調節領域、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域の置換は、特に、
１）β−カロテン合成遺伝子クラスターのｔｒｃ調節領域を、人工調節領域Ｍ１−１２で置換してＱＬ１０５を得る工程；
２）ＱＬ１０５の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−３７で置換してＤｘｓ３７を得る工程；
３）Ｄｘｓ３７のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−４６で置換してＤｘｓ３７−ｉｄｉ４６を得る工程；及び
４）Ｄｘｓ３７−ｉｄｉ４６のβ−カロテン合成遺伝子クラスターの調節領域（Ｍ１−１２）を、人工調節領域Ｍ１−９３で置換してＣＡＲ００１を得る工程；
の順に行われる（詳細については、実施例２を参照）。

【0021】

上記組換え菌株１−３は、大腸菌変異体Ｂのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を改善したものであり、大腸菌変異体ＢＥＴＡのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性の改善は、特に大腸菌変異体Ｂのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、特に相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−４６で置換することにより達成され、上記大腸菌変異体Ｂ（ＬＹＣ００１）は、特に相同組換えにより組換え菌株１−２のカロテン合成遺伝子クラスターからβ−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ及びリコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹを欠失させて大腸菌変異体Ｂを得る工程を含む方法により構築される（実施例１１、ＬＹＣ００１の構築を参照）。

【0022】

β−カロテン合成遺伝子クラスターは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ、β−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ、リコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ、及びフィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢからなる遺伝子クラスターである。

【0023】

β−カロテン合成遺伝子クラスターのｔｒｃ調節領域は、配列表中の配列番号：６のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−１２は、配列表中の配列番号：７のヌクレオチド配列を有し、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子の本来の調節領域は、配列表中の配列番号：８のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−３７は、配列表中の配列番号：１０のヌクレオチド配列を有し、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１２のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−９３は、配列表中の配列番号：１１のヌクレオチド配列を有し、上記組換え菌株１において、β−カロテン合成遺伝子クラスターは、大腸菌の染色体のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）サイトに挿入され、これは特に、相同組換えにより達成される（詳細な方法については、実施例１、ＩＩ．１を参照。大腸菌は、特にＡＴＣＣ８７３９である。）。

【0024】

本発明の別の目的は、組換え菌株１−１−Ａ又は組換え菌株１−１−Ｂを提供することにある。

【0025】

本発明は、上記組換え菌株１−１にβ−カロテン合成遺伝子クラスターを導入して組換え菌株１−１−Ａを得る工程を含み、β−カロテン合成遺伝子クラスターの上記組換え菌株１−１への導入は、（実施例１、１、２に示す方法で構築された）組換えベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔの、上記組換え菌株１−１への導入であり、組換えベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔは、特にβ−カロテン合成遺伝子クラスターを含む組換えベクターである方法により構築される組換え菌株１−１−Ａを提供する。

【0026】

本発明は、上記組換え菌株１−１にリコピン合成遺伝子クラスターを導入して組換え菌株１−１−Ｂを得る工程を含み、リコピン合成遺伝子クラスターの上記組換え菌株１−１への導入は、（実施例１１、パート１に示す方法で構築された）組換えベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢの、上記組換え菌株１−１への導入であり、組換えベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢは、特にリコピン合成遺伝子クラスターを含む組換えベクターである方法により構築される組換え菌株１−１−Ｂを提供する。

【0027】

リコピン合成遺伝子クラスターは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ、及びフィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢからなる遺伝子クラスターである。

【0028】

本発明の第３の目的は、組換え菌株２を提供することにある。

【0029】

本発明は、
１）β−カロテン合成遺伝子クラスター、及びｔｒｃ調節領域を大腸菌に導入して組換え大腸菌（ＱＬ００２）を得る工程と；
２）組換え大腸菌のβ−カロテン合成遺伝子クラスターのｔｒｃ調節領域、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域について、
β−カロテン合成遺伝子クラスターのｔｒｃ調節領域を、人工調節領域Ｍ１−９３で置換し、
１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−３７で置換し、
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−４６で置換して、
大腸菌変異体（ＣＡＲ００１）を得る工程と；を含む方法により構築され、
上記の組換え大腸菌のβ−カロテン合成遺伝子クラスターのｔｒｃ調節領域、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域の置換は、上記の大腸菌変異体Ａ（ＣＡＲ００１）を得る工程と同一の工程順に行われる組換え菌株２（ＣＡＲ００１）を提供する（詳細については、実施例２を参照）。

【0030】

β−カロテン合成遺伝子クラスターは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ、β−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ、リコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ、及びフィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢからなる遺伝子クラスターであり、β−カロテン合成遺伝子クラスターのｔｒｃ調節領域は、配列表中の配列番号：６のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−１２は、配列表中の配列番号：７のヌクレオチド配列を有し、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ遺伝子ｄｘｓの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：８のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−３７は、配列表中の配列番号：１０のヌクレオチド配列を有し、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子ｉｄｉの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１２のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−９３は、配列表中の配列番号：１１のヌクレオチド配列を有する。

【0031】

上記組換え菌株２において、β−カロテン合成遺伝子クラスターの大腸菌への導入は、大腸菌の染色体のｌｄｈＡサイトへのβ−カロテン合成遺伝子クラスターの導入であり、特に、相同組換えにより達成される（詳細な方法については、実施例１、ＩＩ．１を参照。大腸菌は、特にＡＴＣＣ８７３９である。）。

【0032】

本発明の第４の目的は、組換え菌株３を提供することにある。

【0033】

本発明は、上記組換え菌株２のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｓｄｈＡＢＣＤ）の本来の調節領域、及びトランスアルドラーゼ遺伝子（トランスアルドラーゼＢ；ｔａｌＢ）の本来の調節領域を、人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株３を得る工程を含み、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１５のヌクレオチド配列を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１６のヌクレオチド配列を有し、トランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１７のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有する方法により構築される組換え菌株３を提供する。

【0034】

上記組換え菌株３は、組換え菌株３−１、組換え菌株３−２、組換え菌株３−３、又は組換え菌株３−４である。

【0035】

組換え菌株３−１（ＣＡＲ００５）は、組換え菌株２（ＣＡＲ００１）のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域、及びトランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域の各々を、特に相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株３−１を得る工程を含む方法により構築される（詳細については、実施例９、パート１の方法を参照）。

【0036】

組換え菌株３−２（ＣＡＲ００２／ＳｕｃＡＢ４６）は、組換え菌株２のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、特に相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株３−２を得る工程を含む方法により構築される（詳細については、実施例８、パート１を参照）。

【0037】

組換え菌株３−３（ＣＡＲ００４／ＳｕｃＡＢ４６−ｓｄｈＡＢＣＤ４６）は、上記組換え菌株２（ＣＡＲ００１）のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、及びコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域の各々を、特に相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株３−３を得る工程を含む方法により構築される（詳細については、実施例８、パート１を参照）。

【0038】

組換え菌株３−４（ＣＡＲ００３）は、上記組換え菌株２（ＣＡＲ００１）のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、及びトランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域の各々を、特に相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株３−４を得る工程を含む方法により構築される（詳細については、実施例９、パート１を参照）。

【0039】

本発明の第５の目的は、組換え菌株４又は組換え菌株５を提供することにある。

【0040】

本発明は、特に相同組換えにより上記組換え菌株２（ＣＡＲ００１）のβ−カロテン合成遺伝子クラスターからβ−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ及びリコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹを欠失させて組換え菌株を得る工程を含む方法により構築される組換え菌株４（ＬＹＣ００ｌ）を提供する（詳細な方法については、実施例１１、パート１を参照）。

【0041】

本発明は、上記組換え菌株４（ＬＹＣ００ｌ）のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、トランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域、及びコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域の少なくともいずれかを、人工調節領域Ｍ１−４６で置換する工程を含む方法により構築され、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１５のヌクレオチド配列を有し、トランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１７のヌクレオチド配列を有し、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域は、配列表中の配列番号：１６のヌクレオチド配列を有し、人工調節領域Ｍ１−４６は、配列表中の配列番号：１４のヌクレオチド配列を有する組換え菌株５を提供する。

【0042】

組換え菌株５は、組換え菌株５−１、組換え菌株５−２、又は組換え菌株５−３である。

【0043】

上記組換え菌株５−１は、上記組換え菌株４（ＬＹＣ００ｌ）のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域を、相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株５−１（ＬＹＣ００２）を得る工程を含む方法により構築される（詳細については、実施例１２、パート１を参照）。

【0044】

上記組換え菌株５−２は、上記組換え菌株４（ＬＹＣ００ｌ）のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、及びトランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域の各々を、相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株５−２（ＬＹＣ００３）を得る工程を含む方法により構築される（詳細については、実施例１３、パート１を参照）。

【0045】

上記組換え菌株５−３は、上記組換え菌株４（ＬＹＣ００ｌ）のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの本来の調節領域、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの本来の調節領域、及びトランスアルドラーゼ遺伝子ｔａｌＢの本来の調節領域の各々を、相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−４６で置換して組換え菌株５−３（ＬＹＣ００５）を得る工程を含む方法により構築される（詳細については、実施例１４、パート１を参照）。

【0046】

リコピン及びβ−カロテンの少なくともいずれかの生成における上記組換え菌株１の使用もまた、本発明の保護範囲内であり、リコピンの生成における上記組換え菌株１−３の使用もまた、本発明の保護範囲内であり、β−カロテンの生成における上記組換え菌株１−１−Ａの使用もまた、本発明の保護範囲内であり、リコピンの生成における上記組換え菌株１−１−Ｂの使用もまた、本発明の保護範囲内であり、β−カロテンの生成における組換え菌株２又は組換え菌株３の使用もまた、本発明の保護範囲内であり、又はリコピンの生成における組換え菌株４又は組換え菌株５の使用もまた、本発明の保護範囲内である。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】図１は、β−カロテンの濃度に対するＯＤ_{４５３ｎｍ}の検量線である。

【図2】図２は、組換え大腸菌ＣＡＲ００１における、ＴＣＡ回路における重要な遺伝子であるクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）、アコニターゼ遺伝子（ａｃｎＡ）、ｉｃｄ、ｓｕｃＡＢ、ｓｕｃＣＤ、ｓｄｈＡＢＣＤ、フマラーゼＡ（ｆｕｍＡ）、フマラーゼＣ（ｆｕｍＣ）、及びｍｄｈ遺伝子の調節後のβ−カロテンの産生量の変化を示す。

【図3】図３は、組換え大腸菌ＣＡＲ００１における、ペントースリン酸回路における重要な遺伝子であるトランスケトラーゼ（トランスケトラーゼＩ，ｔｋｔＡ）、ｔａｌＢ、及びグルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）遺伝子の調節後のβ−カロテンの産生量の変化を示す。

【図4】図４は、組換え大腸菌ＣＡＲ００１における、遺伝子ｓｕｃＡＢ、遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤ、及びこれらの組合せの調整後のβ−カロテンの産生量の変化を示す。

【図5】図５は、組換え大腸菌ＣＡＲ００５の高密度発酵によるβ−カロテンの産生量を示す。

【図6】図６は、組換え大腸菌ＬＹＣ００５の発酵によるリコピンの産生量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0048】

以下の実施例に用いられる実験方法は、特に断りのない限り、従来の方法である。以下の実施例に用いられる全ての材料、薬剤等は、特に断りのない限り、公的に入手可能なものである。

【実施例】

【0049】

実施例１：組換え大腸菌を得るための、β−カロテン合成遺伝子の大腸菌への導入

【0050】

Ｉ．組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ）を構築するための、プラスミドを介するβ−カロテン合成遺伝子の導入

【0051】

ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ及びＦＰＰは、ＭＥＰ経路及びＦＰＰシンターゼにより、大腸菌が自ら合成することができる。しかしながら、大腸菌は、自らβ−カロテンを合成することができない。β−カロテン合成遺伝子のクラスターは、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｗｅｒａｎｓにおいて同一のオペロン下に存在する。β−カロテン合成遺伝子クラスターは、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼ遺伝子（ｃｒｔＥ，配列番号：１）、β−カロテンシクラーゼ遺伝子（ｃｒｔＸ，配列番号：２）、リコピンβ−シクラーゼ遺伝子（ｃｒｔＹ，配列番号：３）、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子（ｃｒｔＩ，配列番号：４）、及びフィトエンシンターゼ遺伝子（ｃｒｔＢ，配列番号：５）で構成されている。

【0052】

１．組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ）の構築

【0053】

具体的には以下のように、β−カロテン合成遺伝子クラスターを大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（Ｇｕｎｓａｌｕｓ ＩＣ，Ｈａｎｄ ＤＢ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ．（総ビタミンＣの化学分析における細菌の使用）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９４１，１４１：８５３−８５８；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）に導入し、組換え菌株ＡＴＣＣ８７３９（ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ）を得た。

【0054】

１）β−カロテン合成遺伝子クラスターを含むＤＮＡ断片ｃｒｔＥＸＹＩＢのＰＣＲ増幅

【0055】

プライマーの配列は、以下の通りであった。
ｃｒｔ−クラスター−ｆ：ＣＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＣＴＧＴＧＣＡＧＡＡ
ｃｒｔ−クラスター−ｒ：ＴＴＧＣＡＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＣＧＴＣＡ

【0056】

上記プライマーの下線部は、それぞれＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩの消化サイトであり、ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡは、人工ＲＢＳであった。

【0057】

ｃｒｔ−クラスター−ｆ及びｃｒｔ−クラスター−ｒをプライマーとし、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓのゲノム（ＣＧＭＣＣ ＮＯ．：１．２２４４，Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒから公的に入手可能）をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、約５８００ｂｐのＰＣＲ産物、即ちｃｒｔＥＸＹＩＢのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ産物は、遺伝子ｃｒｔＥ、遺伝子ｃｒｔＸ、遺伝子ｃｒｔＹ、遺伝子ｃｒｔＩ及び遺伝子ｃｒｔＢを含む。

【0058】

２）組換えベクターｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔの構築

【0059】

Ａ．中間体ベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ及びｐＡＣＹＣ １８４−Ｍの構築

【0060】

約１７００ｂｐのＤＮＡ断片１を、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍａｎｎ，Ｅ．，Ｏｃｈｓ，Ｂ．及びＡｂｅｌ，Ｋ．Ｊ．Ｔｉｇｈｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｕｎｆｕｓｅｄ ａｎｄ ｆｕｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．（大腸菌における非融合タンパク質及び融合タンパク質の発現に有用な、密に調節されたｔａｃプロモーターベクター）Ｇｅｎｅ．１９８８，６９：３０１−１５．；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）のＤＮＡをテンプレートとし、ＰａｃＩ消化サイト、ＳｐｅＩ消化サイト、及びＮｄｅＩ消化サイトが、プラスミドｐＴｒｃ９９ＡのｌａｃＩ遺伝子の前に配置され、ＰａｃＩ消化サイトが、ターミネーターｒｒｎＢの後に配置されるように、プライマー９９Ａ−Ｆ１−ＰａｃＩ−ＳｐｅＩ−ＮｄｅＩ／９９Ａ−Ｒ１−ＰａｃＩを用いて増幅した。断片１を更にＤｐｎＩで消化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。約２０００ｂｐのＤＮＡ断片２を、プラスミドｐＴｒｃ９９ＡのＤＮＡをテンプレートとし、プライマー９９Ａ−Ｆ２／９９Ａ−Ｒ２を用いて増幅し、ＤｐｎＩで消化し、ｑｕｉｃｋ−ｌｉｇａｓｅ（クイックリガーゼ）でリン酸化されたＤＮＡ断片１に連結し、次いで大腸菌のｔｒａｎｓ１０コンピテントセルに形質転換した。細胞を、アンピシリンを最終濃度５０μｇ／ｍＬで含有するＬＢ寒天プレートで一晩培養した。５つのクローンを採取し、それらのプラスミドＤＮＡを抽出してＰａｃＩ及びＢａｍＨＩの消化を用いて検証した。正しい陽性クローンを、ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍと命名した。

【0061】

約２１００ｂｐのＤＮＡ断片３を、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｍｏｋ，Ｙ．Ｋ．，Ｃｌａｒｋ，Ｄ．Ｒ．，Ｋａｍ，Ｋ．Ｍ．及びＳｈａｗ，Ｐ．Ｃ．ＢｓｉＹ Ｉ，ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ５’ＣＣＮＮＮＮＮＮＮＧＧ３’ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｗｒｏｎｇｌｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｓｉｔｅ ｉｎ ｐＡＣＹＣ１７７．（５’ＣＣＮＮＮＮＮＮＮＧＧ３’を認識する新規の好熱性制限エンドヌクレアーゼ、及びｐＡＣＹＣ１７７における誤ってシークエンスされたサイトの発見）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１，１９：２３２１−２３２３；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）のＤＮＡをテンプレートとし、プライマー１８４−Ｆ２／１８４−Ｒ２を用いて同一の方法で増幅し、ＤｐｎＩで消化し、クイックリガーゼでリン酸化されたＤＮＡ断片１に連結し、次いでＰａｃＩ及びＢａｍＨＩの消化を用いて検証を行った。正しい陽性クローンを、ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍと命名した。

【0062】

プライマーの配列は、以下の通りであった。
９９Ａ−Ｆ１−ＰａｃＩ−ＳｐｅＩ−ＮｄｅＩ：ＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＣＡ
９９Ａ−Ｒ１−ＰａｃＩ：ＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡＡＧＧＣＣＡＴＣ
９９Ａ−Ｆ２：ＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡ
９９Ａ−Ｒ２：ＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧ
１８４−Ｆ２：ＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＴ
１８４−Ｒ２：ＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡ

【0063】

Ｂ．中間体ベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔの構築：１で得られた５８００ｂｐのＤＮＡ断片ｃｒｔＥＸＹＩＢを、ＥｃｏＲＩ消化サイトとＳａｌＩ消化サイトとの間でプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍに挿入し、中間体ベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔを得た。

【0064】

具体的な方法は、以下の通りであった。即ち、ＤＮＡ断片ｃｒｔＥＸＹＩＢを、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、同様に消化したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍプラスミド骨格（３７１６ｂｐ）に連結して組換えベクターを取得し、組換えベクターを、配列決定のために送り、その結果、組換えベクターは、遺伝子ｃｒｔＥ、遺伝子ｃｒｔＸ、遺伝子ｃｒｔＹ、遺伝子ｃｒｔＩ及び遺伝子ｃｒｔＢがＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩの間でｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍに挿入されたベクターであることが示され、これをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔと命名した。

【0065】

Ｃ．組換えベクターｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔの構築：ＤＮＡ断片ｃｒｔＥＸＹＩＢを、ＰａｃＩ消化サイトでｐＡＣＹＣ１８４−Ｍプラスミドに挿入し、組換えベクターｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔを得た。

【0066】

詳細は以下の通りである。即ち、Ｂで得られた中間体ベクターｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔをＰａｃＩで消化し、ゲル抽出により約７．８ｋｂの断片を回収し、回収した断片を、Ａから得られた同様に消化したｐＡＣＹＣ１８４−Ｍベクターに連結して組換えベクターを取得し、組換えベクターを、配列決定のために送り、その結果、ＤＮＡ断片ｃｒｔＥＸＹＩＢが、ＰａｃＩ消化サイトでｐＡＣＹＣ１８４−Ｍに挿入されていることが示され、これをｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔと命名した。

【0067】

３）組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ）の構築

【0068】

Ｃから得られたｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔを、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９に電気的に形質転換し、組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ）を得た。

【0069】

具体的には、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９の電気的に形質転換した５０μＬのコンピテントセルを氷上に置き、１μＬのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ（約５０ｎｇ／μＬ）を添加し、氷上に２分間放置し、次いで０．２ｃｍのＢｉｏ−Ｒａｄのキュベットに移し、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）エレクトロポレーション装置で電圧２．５ｋＶの電気ショック設定値で電気ショックを与えた。ショック後直ちに、１ｍＬのＬＢ培地をキュベットに移し、５回振り、それをチューブに移した後、７５ｒｐｍ、３０℃で２時間インキュベートした。５０μＬの菌株溶液を、クロロマイセチンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートし、その後５つの陽性の単一コロニーを採取し、液体培養を行い、次いで陽性の単一コロニーのプラスミドをＰａｃＩ消化で抽出し、７．８ｋｂの陽性プラスミドを得た。陽性プラスミドを含む組換え菌株を、ＡＴＣＣ８７３９（ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ）と命名した。

【0070】

２．組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ）によるβ−カロテンの産生

【0071】

組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ）の単一コロニーを、４ｍＬのＬＢ培地（最終濃度３４μｇ／ｍＬのクロロマイセチンを含む）の入ったチューブに採取し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し、次いで、１％（体積％）の量の菌株溶液、即ちチューブからの１００μＬの菌株溶液を、１００ｍＬのＴｒｉフラスコ（Ｔｒｉ Ｆｌａｓｋ）内の１０ｍＬの培地（対応する抗生物質を含む）に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで培養し、ＯＤ_６００＝０．１のとき、即ち、約３時間後、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを誘導のために添加し、更に２４時間培養し、菌株溶液の色が白色から黄色になった。

【0072】

２ｍＬの菌株溶液を１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を捨て、菌株細胞を滅菌水で洗浄し、抽出のために１ｍＬのアセトンを暗所にて５５℃で１５分間添加した。１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を回収し、紫外分光光度計を用い、４５３ｎｍでそのβ−カロテンの吸収値を測定した。測定値を対応する細胞の濁度（ＯＤ_６００ｎｍ）と比較し、β−カロテンの相対的な産生量を得た。

【0073】

ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの高速液体クロマトグラフ：１２６０インフィニティ）を用いて、上清のβ−カロテンの含有量を測定した。

【0074】

標準品のβ−カロテンは、米国のＳｉｇｍａから購入し（カタログ番号：Ｃ４５８２）、標準品を受領した際に直ちに検量線を求めた。濾過には０．４５μｍのミリポアフィルター（Ｍｉｌｌｐｏｒ）を使用し、アセトン、メタノール、ジクロロメタン、石油エーテル、及びアセトニトリルは、Ｍｅｒｋより供給されるクロマトグラフィー用の純粋な薬剤であった。

【0075】

５ｍｇのβ−カロテン標準品を正確に秤量し、１ｍＬのジクロロメタンに溶解し、アセトンで１０ｍＬに希釈し、５００μｇ／ｍＬの標準溶液を得た。使用の際に、それをアセトンで段階的に希釈し（２×、４×、８×、１６×、３２×）、ＨＰＬＣバイアル中に濾過し、ＨＰＬＣ検出を行った。対称性のＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ，５μｍ）、カラム温度：３０℃、移動相：メタノール：アセトニトリル：ジクロロメタン＝２１：２１：８、負荷量：２０μＬ、負荷時間：２０分、ＤＡＤ光検出、及び４５０ｎｍの検出波長を採用し、標準品のピーク面積と、β−カロテンの濃度との関係からβ−カロテンの検量線を得た。

【0076】

上清からの抽出後直ちに、β−カロテンの含有量をＨＰＬＣで測定し、上清は黄色であり、アセトンでの抽出後、菌株は黄色から白色になった。ＨＰＬＣでの試験では、試料は標準品と同一のβ−カロテンの出現時間（１７．２分の出現時間）を有していた。

【0077】

その結果、図１に示すように、ＯＤ_４５３ｎｍはβ−カロテン濃度と優れた線形相関を示した。２４時間の培養後、ＡＴＣＣ８７３９（ｐＡＣＹＣ１８４−Ｍ−ｃｒｔ）は、乾燥細胞重量１．５５ｇ／Ｌ、０．８７ｍｇ／Ｌのβ−カロテンの収量、及び乾燥細胞重量で０．５６ｍｇ／ｇのβ−カロテン量が得られた。

【0078】

従って、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓのβ−カロテンの触媒産生に関連する一連のｃｒｔ遺伝子を、プラスミドの形態での大腸菌へ導入することにより、β−カロテン産生能を有する大腸菌が可能となった。

【0079】

ＩＩ．組換え大腸菌ＱＬ００２の構築するための、相同組換えによる大腸菌ＡＴＣＣ ８７３９染色体へのβ−カロテン合成遺伝子の統合

【0080】

１．相同組換えによる組換え大腸菌ＱＬ００２の構築

【0081】

組換え大腸菌ＱＬ００２は、β−カロテン合成遺伝子クラスターｃｒｔＥＸＹＩＢ（ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ、β−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ、リコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ、及びフィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢからなる遺伝子クラスター）を相同組換えによって大腸菌ＡＴＣＣ８７３９の染色体にｌｄｈＡサイトで統合したものである。

【0082】

この方法は、Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００８年）、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７年）を参照することができ、詳細は以下の通りである。

【0083】

工程１では、テンプレートとして大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のゲノムＤＮＡ、プライマーとしてｌｄｈＡ−ｕｐ／ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎを用いて大腸菌ＡＴＣＣ８７３９の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）を増幅した。プライマーは、以下の配列を有していた。
ｌｄｈＡ−ｕｐ：ＧＡＴＡＡＣＧＧＡＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＧ
ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎ：ＣＴＴＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＡ

【0084】

得られた１７５０ｂｐの増幅産物は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＡである。ＰＣＲ増幅産物を次いで、クローニングベクターｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔにクローニングして組換えベクターを取得し、これを配列決定のために送った。その結果、ベクターｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔに乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＡが挿入されたことが示され、プラスミドの構築が正しいことが実証された。得られた組換えプラスミドを、ｐＸＺ００１と命名した。

【0085】

工程２では、テンプレートとしてｐＸＺ００１プラスミドＤＮＡ、プライマーとしてｌｄｈＡ−１／ｌｄｈＡ−２を用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマーは、以下の配列を有していた。
ｌｄｈＡ−１：ＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＣＴ
ｌｄｈＡ−２：ＴＴＴＧＴＧＣＴＡＴＡＡＡＣＧＧＣＧＡＧＴ

【0086】

得られた約４７７８ｂｐのＰＣＲ増幅産物は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の上流及び下流の約４００塩基の配列、及びｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクターの配列を含んでいた。

【0087】

工程３では、テンプレートとしてｐＬＯＩ４１６２プラスミド（Ｊａｎｔａｍａ Ｋ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｍｏｏｒｅ ＪＣ，Ｓｈａｎｍｕｇａｍ ＫＴ，Ｓｖｏｒｏｎｏｓ ＳＡ，Ｉｎｇｒａｍ ＬＯ．Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｉｄｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｙｉｅｌｄｓ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ．（操作された大腸菌Ｃ株における、副生物の除去及びコハク酸収量の増加）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００８，１０１（５）：８８１−８９３；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）、プライマーとして４１６２−Ｆ／４１６２−Ｒを用いてＰＣＲ増幅を行い、クロロマイセチン耐性遺伝子（Ｃａｍ）及びレバンスクローストランスフェラーゼ遺伝子（レバンスクラーゼ，ｓａｃＢ）を含む約３０００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【0088】

プライマーは、以下の配列を有していた。
４１６２−Ｆ：ＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧ
４１６２−Ｒ：ＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡ

【0089】

工程２で得られた４７７８ｂｐのＰＣＲ増幅産物を、ＰＣＲクリーニングキットで洗浄し、次いでＤｐｎＩで処理し、工程３で得られた約３０００ｂｐのＰＣＲ増幅産物を、ＰＣＲクリーニングキットで洗浄し、次いでリン酸化し、２つの断片を連結して連結産物を取得し、これをｔｒａｎｓＴ１に形質転換して形質転換株の溶液を得た。２００μＬの形質転換株の溶液を、カナマイシン及びクロロマイセチンを含むＬＢプレートに塗布し、一晩培養し、次いで５つの陽性の単一コロニーを採取し、陽性クローンを液体培養した。次いで、陽性クローン化プラスミドを消化により検証し、クロロマイセチン遺伝子及びレバンスクローストランスフェラーゼ遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする遺伝子の上流及び下流の４００ｂｐ以内の相同アーム内でｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクターに挿入されたことを証明し、これをｐＸＺ００２と命名した。

【0090】

工程４では、テンプレートとしてｐＸＺ００２プラスミドＤＮＡ、プライマーとしてｌｄｈＡ−ｕｐ／ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎを用いてＰＣＲ増幅を行い、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の上流の約４００塩基、Ｃａｔ−ｓａｃＢＤＮＡ断片、及び乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の下流の約４００塩基を含む約３７００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉを得た。ＤＮＡ断片Ｉを、以下のように最初の相同組換えに使用した。即ち、ｐＫＤ４６プラスミド（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，ｗａｎｎｅｒ．Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．（ＰＣＲ産物を用いた、大腸菌Ｋ−１２の染色体遺伝子の一段階不活性化）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００．９７（１２）：６６４０−６６４５；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）を最初に塩化カルシウム形質転換法で大腸菌ＡＴＣＣ８７３９に形質転換し、次いでＤＮＡ断片Ｉを、ｐＫＤ４６を有する大腸菌ＡＴＣＣ８７３９に電気的に形質転換した。電気ショック後直ちに、１ｍＬのＬＢ培地をキュベットに移し、５回振り、チューブに移した後、７５ｒｐｍ、３０℃で２時間インキュベートした。ｐＫＤ４６プラスミドを除去した。２００μＬの菌株溶液を、クロロマイセチンを含有するＬＢ寒天プレートに塗布し、一晩培養し、その後ＰＣＲでの検証（プライマーｌｄｈＡ−ｕｐ／ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎを使用し、正しく増幅されるコロニー産物は、約３７００ｂｐの断片である）のために５つの単一コロニーを採取した。正しい単一コロニーを採取し、ＱＬ００１と命名した。

【0091】

工程５では、ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔプラスミドをＰａｃＩで消化し、約８ｋｂの断片をゲル抽出により回収し、末端を修復してクレノウ断片で平滑化し、次いで工程２で得られた４７７８ｂｐのＰＣＲ増幅産物に連結した。そのライゲーションをｔｒａｎｓＴ１に形質転換し、２００μＬの形質転換株の溶液を、カナマイシンを含有するＬＢプレート上に広げ、一晩培養した後、５つの陽性の単一コロニーを採取し、陽性クローンを液体培養した。陽性のクローン化したプラスミドを消化（陽性プラスミドとして約８ｋｂの断片を得るＰａｃＩでの消化）のために抽出し、検証のために配列決定した。結果は、ｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする遺伝子の上流及び下流の４００ｂｐ以内の相同アーム内でｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔベクターに挿入されたことを示した。これをｐＸＺ００３−ｃｒｔと命名した。

【0092】

工程６では、ｐＸＺ００３−ｃｒｔプラスミドのＤＮＡをテンプレートとし、ｌｄｈＡ−ｕｐ／ｌｄｈＡ−ｄｏｗｎをプライマーとし、約９０００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩ（乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする遺伝子の上流約４００塩基、ｔｒｃプロモーター、ｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子、ｒｒｎＢのＴ２転写ターミネーター、及び乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする遺伝子の下流約４００塩基を含む）を増幅した。ＤＮＡ断片ＩＩを、以下のように第二の相同組換えに使用した。即ち、ｐＫＤ４６プラスミドを最初に塩化カルシウム形質転換法によりＱＬ００１に形質転換し、次いでＤＮＡ断片ＩＩを、ｐＫＤ４６プラスミドを有するＱＬ００１に電気的に形質転換し、ここで、電気的形質転換は、以下の条件で行った。まず、ｐＫＤ４６プラスミドを有するＱＬ００１の、電気的形質転換のコンピテントセルを調製し、５０μＬのコンピテントセルを氷上に置き、５０ｎｇのＤＮＡ断片ＩＩを添加し、氷上に２分間放置し、次いで０．２ｃｍのＢｉｏ−Ｒａｄのキュベットに移した。ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） エレクトロポレーション装置を用い、電圧２．５ｋＶの電気ショック設定値で電気ショックを与えた。その後、直ちに１ｍＬのＬＢ培地をキュベットに移し、５回振り、次いでそれをチューブに移した後、７５ｒｐｍ、３０℃で４時間インキュベートした。ｐＫＤ４６プラスミドを除去した。菌株溶液を、ショ糖を１０％含有し、塩化ナトリウムを含有しないＬＢ液体培地（５０ｍＬの培地を充填した２５０ｍＬのＴｒｉフラスコ（Ｔｒｉ Ｆｌａｓｋ））に移し、２４時間培養し、次いでスクロースを６％含有し、塩化ナトリウムを含有しないＬＢ固体培地で画線培養した。ＰＣＲでの検証（プライマーｌｄｈＡ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−ｒを使用し、正しいコロニーの増幅産物は、約４５００ｂｐの断片である）により、正しい単一のコロニーを採取し、ＱＬ００２と命名した。

【0093】

ｃｒｔＥ−ｒプライマーは、以下の配列を有する。
ｃｒｔＥ−ｒ：ＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＴ

【0094】

２．組換え大腸菌ＱＬ００２によるβ−カロテンの産生

【0095】

組換え大腸菌ＱＬ００２の単一コロニーを、４ｍＬのＬＢ培地入りのチューブに採取し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し、次いで、１％（体積％）の量の菌株溶液、即ちチューブ内の１００μＬの菌株溶液を、１００ｍＬのＴｒｉフラスコ（Ｔｒｉ Ｆｌａｓｋ）内の１０ｍＬの培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで培養し、ＯＤ_６００＝０．１のとき、即ち、約３時間後、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを誘導のために添加し、更なる２４時間の培養後、試料を採取してβ−カロテンの収量を測定した。

【0096】

上記実験Ｉに示す測定法の結果、ＱＬ００２は、最大０．５９ｍｇ／Ｌのβ−カロテンの収量、及び乾燥細胞重量で最大０．４１ｍｇ／ｇのβ−カロテンの含有量であった。

【0097】

実施例２：組換え大腸菌ＣＡＲ００１の構築及び発酵

【0098】

組換え大腸菌ＣＡＲ００１の構築及びそれによる発酵は、以下の８段階に分けられた。

【0099】

１．組換え大腸菌ＱＬ００２のβ−カロテン合成遺伝子クラスターの発現強度の改善、及び組換え大腸菌ＱＬ１０５の構築

【0100】

組換え大腸菌ＱＬ１０５は、ＱＬ００２のβ−カロテン合成遺伝子クラスターｃｒｔＥＸＹＩＢのｔｒｃ調節領域（配列表中の配列番号：６）を、二段階の相同組換えにより人工調節領域Ｍ１−１２（配列表中の配列番号：７）で置換したものであった。

【0101】

二段階の相同組換えにより、調節される遺伝子の前に人工調節領域が挿入され、耐性遺伝子又はＦＲＴマーカーは、操作後に全く残らなかった。第一段階の相同組換えにおいて、遺伝子の本来の調節領域をｃａｔ−ｓａｃＢ断片で置換し、第二段階の相同組換えにおいて、ｃａｔ−ｓａｃＢ断片を種々の強度の人工調節領域で置換した。二段階の相同組換えに使用される断片は、一般的な２対のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。遺伝子−ｃａｔ−ｕｐ（人工調節領域挿入サイトの前の５０ｂｐの塩基、及びｃａｔ−ｓａｃＢ遺伝子の２０ｂｐの相同断片を含む）、及び遺伝子−ｃａｔ−ｄｏｗｎ（人工調節領域挿入サイトの後の５０ｂｐの塩基、及びｃａｔ−ｓａｃＢ遺伝子の別の相同断片を含む）を使用し、ＤＮＡ断片Ｉを増幅し、第一段階の相同組換えを行った。プライマーとして、遺伝子−ｕｐ−Ｐ（人工調節領域挿入サイトの前の５０ｂｐの塩基、及び人工調節領域の２０ｂｐの相同断片を含む）、及び遺伝子−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ（人工調節領域挿入サイトの後の５０ｂｐの塩基、及び人工調節領域の別の相同断片を含む）を用い、ＤＮＡ断片ＩＩを増幅し、第二段階の相同組換えを行った。

【0102】

これは、具体的には以下に詳述する。

【0103】

工程１では、出発ベクターはｐＸＺ００２プラスミドであり、増幅用プライマーはｌｄｈＡ−ｃａｔ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、形質転換される菌株は組換え大腸菌ＱＬ００２であり、同定用プライマーはｌｄｈＡ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−３４０−ｄｏｗｎであり、具体的には以下の通りであった。

【0104】

増幅用プライマーとしてｌｄｈＡ−ｃａｔ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ、テンプレートとして出発ベクターのｐＸＺ００２プラスミドを用いてＰＣＲ増幅を行い、ｌｄｈＡ遺伝子の上流の約５０塩基、ＤＮＡ断片Ｃａｔ−ｓａｃＢ、及びｃｒｔＥの上流の約５０塩基を含む、約３８００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉ（ｌｄｈＡ−ｃａｔｓａｃＢ−ｃｒｔＥ）を得た。

【0105】

ｌｄｈＡ−ｃａｔ−ｕｐ：ＡＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＣＴＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ｃｒｔＥ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＧＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴＴＧ

【0106】

工程１で得られたＤＮＡ断片ＩのＰＣＲ増幅産物を、ＰＣＲクリーニングキットで洗浄し、ＤｐｎＩで処理し、次いで以下のように第一の相同組換えに使用した。即ち、ｐＫＤ４６プラスミドを最初に塩化カルシウム形質転換法により組換え大腸菌ＱＬ００２に形質転換し、次いでｐＫＤ４６を有する大腸菌ＱＬ００２にＤＮＡ断片Ｉを電気的に形質転換した。電気ショック後、直ちに１ｍＬのＬＢ培地をキュベットに移し、５回振り、次いでそれをチューブに移し、７５ｒｐｍ、３０℃で２時間インキュベートした。２００μＬの菌株溶液を、クロロマイセチンアミノベンジルを含有するＬＢプレートに塗布し、一晩培養した後、クロロマイセチンアミノベンジルを含有するＬＢプレート、及びカナマイシンを含有するＬＢプレートでそれぞれスクリーニングし、カナマイシンでは生育しないがクロロマイセチンアミノベンジルを含有するＬＢプレートでは生育するクローンを取得し、これをＰＣＲ（正しいコロニーの増幅産物が約４０００ｂｐの断片となる同定用プライマーのｌｄｈＡ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−３４０−ｄｏｗｎを使用）で検証し、第二段階の相同組換えのための中間体陽性クローンを得た。

【0107】

ｃｒｔＥ−３４０−ｄｏｗｎ：ＧＣＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧ

【0108】

工程２では、出発菌株は組換え菌株Ｍ１−１２であり、増幅用プライマーはｌｄｈＡ−ｕｐ−ｐ及びｃｒｔＥ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、形質転換される菌株は中間体陽性クローンであり、同定用プライマーは上記と同一（ｌｄｈＡ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−３４０−ｄｏｗｎ）であり、具体的には以下の通りであった。

【0109】

増幅用プライマーとしてｌｄｈＡ−ｕｐ−ｐ及びｃｒｔＥ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ、テンプレートとして組換え菌株Ｍ１−１２（Ｌｕ Ｊ，Ｔａｎｇ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｔ，Ｚｈａｎｇ Ｘ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌＰ ａｎｄ ｇｌｋ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．（改善した代替グルコース利用のための、ｇａｌＰ遺伝子及びｇｌｋ遺伝子の発現の組合せ調節）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，９３：２４５５−２４６２；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅を行い、ｌｄｈＡ遺伝子の下流の約５０塩基、人工調節領域断片Ｍ１−１２、及びｃｒｔＥの上流の約５０塩基含む、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0110】

ｌｄｈＡ−ｕｐ−Ｐ：ＡＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＣＴＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｃｒｔＥ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＧＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0111】

ＤＮＡ断片ＩＩを、工程１から得られた中間体陽性クローンに電気的に形質転換した。電気ショック後、直ちに１ｍＬのＬＢ培地をキュベットに移し、５回振り、次いでそれをチューブに移し、７５ｒｐｍ、３０℃で４時間培養し、その後、フラスコ内の５０ｍＬの塩を含有しないスクロース１０％添加ＬＢ培地に移した。２４時間後、それを、塩を含有しないスクロース６％添加寒天プレート上に画線し、ｐＫＤ４６プラスミドを除去するために４１℃で一晩培養した。菌株を、クロロマイセチンを含有するＬＢプレート、及び抗生物質を含まないＬＢプレート上でスクリーニングした。クロロマイセチンを含有するＬＢプレートで成長しなかったクローンを、同定用プライマーｌｄｈＡ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−３４０−ｄｏｗｎを用いてＰＣＲにより検証した。正しいコロニー増幅産物は、約１０００ｂｐの断片であった。正しい配列を有する菌株を、組換え大腸菌ＱＬ１０５と命名した。

【0112】

２．組換え大腸菌ＱＬ１０５によるβ−カロテンの産生

【0113】

組換え大腸菌ＱＬ１０５の単一コロニーを、チューブの内の４ｍＬのＬＢ培地に採取し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し、次いで、１％（体積％）の量の菌株溶液、即ちチューブ内の１００μＬの菌株溶液を、１００ｍＬのＴｒｉフラスコ（Ｔｒｉ Ｆｌａｓｋ）内の１０ｍＬの培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。その後、β−カロテンの収量を測定するために試料を採取した。その測定法は、実施例１に示す方法であった。

【0114】

その結果、ＱＬ１０５のβ−カロテンの収量は、最大２．１７ｍｇ／Ｌ、β−カロテンの含有量は乾燥細胞重量で最大１．５３ｍｇ／ｇであった。

【0115】

３．組換え大腸菌ＱＬ１０５のｄｘｓ遺伝子の発現強度の改善、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ６４、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ９３の構築

【0116】

組換え大腸菌Ｄｘｓ６４、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ９３はそれぞれ、実施例２の二段階の相同組換え法により調製し、ここでは、組換え大腸菌ＱＬ１０５のｄｘｓ遺伝子の本来の調節領域（配列番号：８）を、人工調節領域Ｍ１−６４（配列番号：９）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換した。

【0117】

組換え大腸菌Ｄｘｓ６４の構築（二段階の相同組換え）：

【0118】

工程１：出発ベクターがｐＬＯＩ４１６２プラスミドであり、増幅用プライマーがｄｘｓ−ｃａｔ−ｕｐ／ｄｘｓ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ であり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌ＱＬ１０５である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同一の方法で、中間体陽性クローンを得た。

【0119】

ｄｘｓ−ｃａｔ−ｕｐ：ＡＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＴＡＡＧＴＡＴＴＡＡＴＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧ
ｄｘｓ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＧＴＧＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＧＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡ

【0120】

工程２：出発菌株が組換え菌株Ｍ１−６４（Ｌｕ Ｊ，Ｔａｎｇ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｙ， Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｔ，Ｚｈａｎｇ Ｘ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌＰ ａｎｄ ｇｌｋ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．（改善した代替グルコース利用のための、ｇａｌＰ遺伝子及びｇｌｋ遺伝子の発現の組合せ調節）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，９３：２４５５−２４６２；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）であり、増幅用プライマーがｄｘｓ−ｕｐ−Ｐ及びｄｘｓ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである組換え大腸菌ＱＬ１０５である点以外は、実施例２のパート１の工程２と同一の方法で、組換え大腸菌Ｄｘｓ６４を得た。

【0121】

上記２つの工程の両方において、同定用プライマーは、ｄｘｓ−ｕｐ−４８０Ｆ及びｄｘｓ−ｄｏｗｎ−３８１Ｒであった（正しいＰＣＲ断片は、約９００ｂｐであった）。

【0122】

ｄｘｓ−ｕｐ−４８０Ｆ：ＡＧＴＧＧＴＡＴＴＧＣＣＧＧＡＡＴＧ
ｄｘｓ−ｄｏｗｎ−３８１Ｒ：ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＡＡＴＧＣ

【0123】

組換え大腸菌Ｄｘｓ３７の構築（二段階の相同組換え）：工程２における出発菌株が組換え菌株Ｍ１−３７（Ｌｕ Ｊ，Ｔａｎｇ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｔ，Ｚｈａｎｇ Ｘ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌＰ ａｎｄ ｇｌｋ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．（改善した代替グルコース利用のための、ｇａｌＰ遺伝子及びｇｌｋ遺伝子の発現の組合せ調節）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，９３：２４５５−２４６２；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）である点以外は、組換え大腸菌Ｄｘｓ６４と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0124】

組換え大腸菌Ｄｘｓ９３の調製（二段階の相同組換え）：工程２における出発菌株が組換え菌株Ｍ１−９３（Ｌｕ Ｊ，Ｔａｎｇ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｔ，Ｚｈａｎｇ Ｘ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌＰ ａｎｄ ｇｌｋ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．（改善した代替グルコース利用のための、ｇａｌＰ遺伝子及びｇｌｋ遺伝子の発現の組合せ調節）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，９３：２４５５−２４６２；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）である点以外は、組換え大腸菌Ｄｘｓ６４と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0125】

配列が正しいことを検証の上、ＱＬ１０５のｄｘｓ遺伝子の調節領域が人工調節領域Ｍ１−６４、人工調節領域Ｍ１−３７、及び人工調節領域Ｍ１−９３でそれぞれ置換された菌株を、組換え大腸菌Ｄｘｓ６４、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ９３とそれぞれ命名した。

【0126】

４．組換え大腸菌Ｄｘｓ６４、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ９３によるβ−カロテンの産生

【0127】

実施例１と同一の方法で組換え大腸菌ＱＬ１０５、組換え大腸菌Ｄｘｓ６４、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７、組換え大腸菌Ｄｘｓ９３の発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0128】

表１に示す結果から分かるように、ｄｘｓの調節により、β−カロテンの収量が１．８倍〜２．３倍に改善し、最大のβ−カロテン収量はＭ１−３７調節領域由来であり、最小はＭ１−９３調節領域由来であった。

【0129】

【表1】

（表１：遺伝子ｄｘｓ、遺伝子ｉｄｉ、及び遺伝子ｃｒｔの調節によるβ−カロテン産生量の改善）

【0130】

５．組換え大腸菌Ｄｘｓ３７のｉｄｉ遺伝子の発現強度の調節、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３０、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ４６、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３７の構築

【0131】

組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３０、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ４６、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３７はそれぞれ、実施例２、パート１の二段階の相同組換え法により調製し、ここでは、上記パート３で調製したＤｘｓ３７のｉｄｉ遺伝子の本来の調節領域（配列番号：１２）を、人工調節領域Ｍ１−３０（配列番号：１３）、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、及び人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）でそれぞれ置換した。

【0132】

組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３０の構築（二段階の相同組換え）：

【0133】

工程１：出発ベクターがｐＬＯＩ４１６２プラスミドであり、増幅用プライマーがｉｄｉ−ｃａｔ−ｕｐ／ｉｄｉ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌Ｄｘｓ３７である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0134】

ｉｄｉ−ｃａｔ−ｕｐ：ＴＣＡＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＡＴＣＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ｉｄｉ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＣＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴＴＧ

【0135】

工程２：出発菌株が組換え菌株Ｍ１−３０（Ｌｕ Ｊ，Ｔａｎｇ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｔ，Ｚｈａｎｇ Ｘ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌＰ ａｎｄ ｇｌｋ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．（改善した代替グルコース利用のための、ｇａｌＰ遺伝子及びｇｌｋ遺伝子の発現の組合せ調節）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，９３：２４５５−２４６２；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）であり、増幅用プライマーがｉｄｉ−ｕｐ−ｐ及びｉｄｉ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３０を得た。

【0136】

ｉｄｉ−ｕｐ−ｐ：ＴＣＡＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＡＴＣＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｉｄｉ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＣＣＣＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0137】

上記２つの工程の両方において、同定用プライマーは、Ｉｄｉ−ｕｐ及びｉｄｉ−ｄｏｗｎであった（正しいＰＣＲ断片は、約９００ｂｐであった）。

【0138】

Ｉｄｉ−ｕｐ：ＡＴＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡ
ｉｄｉ−ｄｏｗｎ：ＣＧＴＧＧＣＡＴＣＡＡＴＡＣＣＧＴＧＴＡ

【0139】

組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ４６の構築方法（二段階の相同組換え）：工程２における出発菌株が組換え菌株Ｍ１−４６（Ｌｕ Ｊ，Ｔａｎｇ ＪＬ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｔ，Ｚｈａｎｇ Ｘ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌＰ ａｎｄ ｇｌｋ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．（改善した代替グルコース利用のための、ｇａｌＰ遺伝子及びｇｌｋ遺伝子の発現の組合せ調節）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２，９３：２４５５−２４６２；天津工業生物技術研究所から公的に入手可能）である点以外は、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３０と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0140】

組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３７の構築方法（二段階の相同組換え）：工程２における出発菌株が組換え菌株Ｍ１−３７である点以外は、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３０と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0141】

配列が正しいことを検証した後、Ｄｘｓ３７のｉｄｉ遺伝子の本来の調節領域が人工調節領域Ｍ１−３０、人工調節領域Ｍ１−４６、及び人工調節領域Ｍ１−３７でそれぞれ置換された菌株を、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３０、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ４６、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３７とそれぞれ命名した。

【0142】

６．組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３０、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ４６、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３７によるβ−カロテンの産生

【0143】

実施例１における方法と同様の方法で、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３０、組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ４６、及び組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ３７の発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0144】

結果を、表１に示す。ｄｘｓ及びｉｄｉの組合せの調節により、β−カロテンの収量は２．７倍〜３．５倍改善し、β−カロテンの収量の最大値はＤｘｓ３７−Ｉｄｉ４６株由来であった。

【0145】

７．組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ４６のβ−カロテン合成遺伝子クラスターの発現が改善した組換え菌株ＣＡＲ００１の構築

【0146】

組換え菌株ＣＡＲ００１は、β−カロテン合成遺伝子クラスターｃｒｔＥＸＹＩＢの調節領域Ｍ１−１２（配列番号：７）が人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）で置換された組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ４６から構築したものであり、具体的な方法は以下の通りである。

【0147】

組換え大腸菌ＣＡＲ００１の構築（二段階の相同組換え）：

【0148】

工程１：出発ベクターがｐＸＺ００２プラスミドであり、増幅用プライマーがｌｄｈＡ−ｃａｔ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３８００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌Ｄｘｓ３７−Ｉｄｉ４６であり、同定用プライマーがｌｄｈＡ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−３４０−ｄｏｗｎである点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0149】

ｌｄｈＡ−ｃａｔ−ｕｐ：ＡＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＣＴＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ｃｒｔＥ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＧＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴＴＧ

【0150】

工程２：出発菌株がＭ１−９３であり、増幅用プライマーが増幅用プライマーｌｄｈＡ−ｕｐ−ｐ及びｃｒｔＥ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌ＣＡＲ００１を得た。

【0151】

ｌｄｈＡ−ｕｐ−Ｐ：ＡＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＣＴＴＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｃｒｔＥ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＧＣＡＴＣＧＣＴＧＴＧＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0152】

上記２つの工程において、同定用プライマーは、ｌｄｈＡ−ｕｐ／ｃｒｔＥ−３４０−ｄｏｗｎであり、正しい増幅バンドは、約９００ｂｐであった。

【0153】

ｌｄｈＡ−ｕｐ：ＧＡＴＡＡＣＧＧＡＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＧ
ｃｒｔＥ−３４０−ｄｏｗｎ：ＧＣＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＡＣＴＧ

【0154】

８．組換え菌株ＣＡＲ００１によるβ−カロテンの産生

【0155】

実施例１と同様の方法で、組換え大腸菌ＣＡＲ００１の発行培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0156】

表１に示す結果から分かるように、組換え大腸菌ＱＬ１０５と比較して、ｃｒｔ遺伝子を調節して得られた菌株ＣＡＲ００１は、β−カロテンの含有量が１２倍増加した。β−カロテンの収量は最大２５．６７ｍｇ／Ｌであり、β−カロテンの含有量は乾燥細胞重量で最大１８．４ｍｇ／ｇであった。

【0157】

実施例３：組換え大腸菌ＣＡＲ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0158】

１．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善、及び組換え菌株ＳｕｃＡＢ４６−ＦＫＦ、組換え菌株ＳｕｃＡＢ３７−ＦＫＦ、及び組換え菌株ＳｕｃＡＢ９３−ＦＫＦの構築

【0159】

組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ９３−ＦＫＦはそれぞれ、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｓｕｃＡＢ）の本来の調節領域（配列番号：１５）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換したものであった。

【0160】

大腸菌の染色体上の遺伝子の本来の調節領域を、一段階の相同組換えを用いた一般的な一対のプライマーにより、種々の強度を有する人工調節領域で置換した。上流プライマーは、調節される遺伝子の本来の調節領域外の５０塩基、及びＦＲＴ配列との相同２０塩基を含むｇｅｎｅ−ｕｐ−ＦＲＴであった。下流プライマーは、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のリボソーム結合部位との相同１５塩基、及び調節される遺伝子の開始コドンの後の５０塩基を含む、ｇｅｎｅ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであった。

【0161】

ｓｕｃＡＢ−ｕｐ−ＦＲＴ及びｓｕｃＡＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎをプライマーとし、組換え菌株Ｍ１−４６、Ｍ１−３７、及びＭ１−９３をテンプレートとして、１８００ｂｐのＤＮＡ断片ｓｕｃＡＢ−Ｍ１−４６、ｓｕｃＡＢ−Ｍ１−３７、及びｓｕｃＡＢ−Ｍ１−９３を増幅し、ｓｕｃＡＢ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の一段階の相同組換えの後、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ＦＫＦを取得した。具体的には以下の通りであった。

【0162】

まず、ｐＫＤ４６を、塩化カルシウム形質転換法により大腸菌ＣＡＲ００１に形質転換した。次に、ＤＮＡ断片ｓｕｃＡＢ−Ｍ１−４６を、ｐＫＤ４６を有する大腸菌ＣＡＲ００１に電気的に形質転換した。電気的形質転換は、以下の条件で行った。まず、電気的に形質転換されるｐＫＤ４６プラスミドを有する大腸菌ＣＡＲ００１のコンピテント細胞を調製し、５０μＬのコンピテントセルを氷上に置き、５０ｎｇのＤＮＡ断片を添加し、氷上に２分間放置し、次いで０．２ｃｍのＢｉｏ−Ｒａｄのキュベットに移した。ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）エレクトロポレーション装置を用い、電圧２．５ｋＶの電気ショック設定値で電気ショックを行った後、直ちに１ｍＬのＬＢ培地をキュベットに移し、５回振り、次いでそれをチューブに移し、７５ｒｐｍ、３０℃で２時間培養した。１００μＬの菌株溶液を、カナマイシンを含有するＬＢプレートにそれぞれ塗布し、４１℃で一晩培養した。ｐＫＤ４６プラスミドを除去した。組換え菌株ＳｕｃＡＢ４６−ＦＫＦを得た。

【0163】

一段階の相同組換えと同一の方法で、ｓｕｃＡＢ−Ｍ１−３７及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えにより、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ＦＫＦを取得し、ｓｕｃＡＢ−Ｍ１−９３及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えにより、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ９３−ＦＫＦを得た。

【0164】

上記の組換え大腸菌株を、ｋａｎ−ｆ及びｓｕｃＡＢ−ｒを用いて直ちにＰＣＲで同定し、正しいＰＣＲ断片は約９００ｂｐであった。

【0165】

プライマーは、以下の配列を有していた。
ｓｕｃＡＢ−ｕｐ−ＦＲＴ：ＣＡＧＴＧＴＡＴＧＴＣＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣＣＣＧＡＣＧＣＧＣＧＣＣＡＴＣＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｓｕｃＡＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0166】

ＰＣＲでの検証用のプライマーは、以下の配列を有していた。
ｋａｎ−ｆ：ＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧ
ｓｕｃＡＢ−ｒ：ＧＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＣＧＴＴＴＧＡＧ

【0167】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＣＡＲ００１のｓｕｃＡＢ遺伝子の本来の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６、人工調節領域Ｍ１−３７、及び人工調節領域Ｍ１−９３でそれぞれ置換された菌株を、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ９３−ＦＫＦとそれぞれ命名した。

【0168】

２．β−カロテンの産生

【0169】

実施例１と同様の方法で組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ＦＫＦ（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ＦＫＦ（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ９３−ＦＫＦ（Ｍ１−９３）の発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0170】

結果を、図２に示す。組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ＦＫＦ（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ＦＫＦ（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ９３−ＦＫＦ（Ｍ１−９３）のβ−カロテンの収量は、それぞれ、２４．４７ｍｇ／ｇ、２５．５８ｍｇ／ｇ、及び２３．９２ｍｇ／ｇであり、ｓｕｃＡＢの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−３７がβ−カロテンの収量を３９％改善した。

【0171】

実施例４：組換え大腸菌ＣＡＲ００１のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0172】

１．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善、及び組換え菌株の構築

【0173】

組換え大腸菌Ｓｄｈ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌Ｓｄｈ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌Ｓｄｈ９３−ＦＫＦは、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｓｄｈＡＢＣＤ）の本来の調節領域（配列番号：１６）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換したものであった。

【0174】

ｓｄｈＡＢＣＤ−ｕｐ−ＦＲＴ及びｓｄｈＡＢＣＤ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎをプライマーとし、組換え菌株Ｍ１−４６、組換え菌株Ｍ１−３７、及び組換え菌株Ｍ１−９３をテンプレートとして、１８００ｂｐのＤＮＡ断片ｓｄｈＡＢＣＤ−Ｍ１−４６、ＤＮＡ断片ｓｄｈＡＢＣＤ−Ｍ１−３７、及びＤＮＡ断片ｓｄｈＡＢＣＤ−Ｍ１−９３を、実施例３、パート１の一段階の相同組換え法でそれぞれ増幅し、ｓｄｈＡＢＣＤ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌Ｓｄｈ４６−ＦＫＦを取得し、ｓｄｈＡＢＣＤ−Ｍ１−３７及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌Ｓｄｈ３７−ＦＫＦを取得し、ｓｄｈＡＢＣＤ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌Ｓｄｈ４６−ＦＫＦを取得し、これらを、ｋａｎ−ｆ及びｓｄｈＡＢＣＤ−ｒを用いてＰＣＲで同定し、正しいＰＣＲ断片は約９００ｂｐであった。

【0175】

ｓｄｈＡＢＣＤ−ｕｐ−ＦＲＴ：ＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＴＴＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｓｄｈＡＢＣＤ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0176】

ＰＣＲでの検証用のプライマーは、以下の配列を有していた。
ｋａｎ−ｆ：ＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧ
ｓｄｈＡＢＣＤ−ｒ：ＡＡＴＴＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣ

【0177】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＣＡＲ００１のｓｄｈＡＢＣＤ遺伝子の本来の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６、人工調節領域Ｍ１−３７、及び人工調節領域Ｍ１−９３でそれぞれ置換された菌株を、組換え大腸菌Ｓｄｈ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌Ｓｄｈ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌Ｓｄｈ９３−ＦＫＦとそれぞれ命名した。

【0178】

２．組換え大腸菌Ｓｄｈ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌Ｓｄｈ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌Ｓｄｈ９３−ＦＫＦによるβ−カロテンの産生

【0179】

実施例１と同様の方法で組換え大腸菌Ｓｄｈ４６−ＦＫＦ（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌Ｓｄｈ３７−ＦＫＦ（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌Ｓｄｈ９３−ＦＫＦ（Ｍ１−９３）の発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0180】

結果を、図２に示す。組換え大腸菌Ｓｄｈ４６−ＦＫＦ（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌Ｓｄｈ３７−ＦＫＦ（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌Ｓｄｈ９３−ＦＫＦ（Ｍ１−９３）のβ−カロテンの収量は、それぞれ、２３ｍｇ／ｇ、２０．０６ｍｇ／ｇ、及び１７．４８ｍｇ／ｇであり、ｓｄｈＡＢＣＤの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−４６がβ−カロテンの収量を２５％改善した。

【0181】

実施例５：組換え大腸菌ＣＡＲ００１のトランスアルドラーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0182】

１．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のトランスアルドラーゼ遺伝子（ｔａｌＢ）の発現強度の改善、及び組換え菌株ｔａｌＢ４６、ｔａｌＢ３７、及びｔａｌＢ９３の構築

【0183】

組換え菌株ｔａｌＢ４６、組換え菌株ｔａｌＢ３７、及び組換え菌株ｔａｌＢ９３は、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のトランスアルドラーゼ遺伝子（ｔａｌＢ）の本来の調節領域（配列番号：１７）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換したものであった。

【0184】

組換え菌株ｔａｌＢ４６の構築（二段階の相同組換え）：

【0185】

工程１：出発ベクターがｐＬＯＩ４１６２プラスミドであり、増幅用プライマーがｔａｌＢ−ｃａｔ−ｕｐ及びｔａｌＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌ＣＡＲ００１である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0186】

工程２：出発菌株がＭ１−４６であり、増幅用プライマーがｔａｌＢ−ｕｐ−Ｐ及びｔａｌＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌ｔａｌＢ４６を得た。

【0187】

工程１における増幅用プライマーは、以下の配列を有していた。
ｔａｌＢ−ｃａｔ−ｕｐ：ＡＧＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡＡＣＣＧＴＣＴＴＧＴＣＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ｔａｌＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＴＣＡＴＧＡＴＡＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＴＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＡＡＣＣＧＧＴＣＴＧＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴ
工程２における増幅用プライマーｔａｌＢ−ｕｐ−Ｐ／ｔａｌＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎは、以下の配列を有していた。
ｔａｌＢ−ｕｐ−Ｐ：ＡＧＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡＡＣＣＧＴＣＴＴＧＴＣＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｔａｌＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＡＧＴＧＴＣＧＧＣＣＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡＣＴＧＡＣＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0188】

上記２つの工程において、同定用プライマーは、以下の配列を有するｔａｌＢ−ｕｐ／ｔａｌＢ−ｄｏｗｎであった（正しいＰＣＲ断片は、約９００ｂｐであった）。
ｔａｌＢ−ｕｐ：ＣＧＧＡＴＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡＣ
ｔａｌＢ−ｄｏｗｎ：ＧＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＧＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＧ

【0189】

組換え大腸菌ｔａｌＢ３７の構築：工程２における出発菌株を組換え菌株Ｍ１−３７で置き換えた点以外は、組換え大腸菌ｔａｌＢ４６と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0190】

組換え大腸菌ｔａｌＢ９３の構築：工程２における出発菌株を組換え菌株Ｍ１−９３で置き換えた点以外は、組換え大腸菌ｔａｌＢ４６と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0191】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＣＡＲ００１のｔａｌＢ遺伝子の本来の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６、人工調節領域Ｍ１−３７、及び人工調節領域Ｍ１−９３でそれぞれ置換された菌株を、組換え大腸菌ｔａｌＢ４６、組換え大腸菌ｔａｌＢ３７、及び組換え大腸菌ｔａｌＢ９３とそれぞれ命名した。

【0192】

２．組換え大腸菌ｔａｌＢ４６、組換え大腸菌ｔａｌＢ３７、及び組換え大腸菌ｔａｌＢ９３によるβ−カロテンの産生

【0193】

実施例１と同様の方法で組換え大腸菌ｔａｌＢ４６（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌ｔａｌＢ３７（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌ｔａｌＢ９３（Ｍ１−９３）の発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0194】

結果を、図３に示した。組換え大腸菌ｔａｌＢ４６（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌ｔａｌＢ３７（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌ｔａｌＢ９３（Ｍ１−９３）のβ−カロテンの収量は、それぞれ、２１．５３ｍｇ／ｇ、１８．２２ｍｇ／ｇ、及び１８．５８ｍｇ／ｇであり、ｔａｌＢの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−４６がβ−カロテンの収量を１７％改善した。

【0195】

実施例６：組換え大腸菌ＣＡＲ００１のクエン酸シンターゼ遺伝子、アコニターゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、スクシニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子、フマラーゼ遺伝子、及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0196】

１．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のクエン酸シンターゼ遺伝子の発現強度の改善

【0197】

実施例３のパート１における一段階の相同組換え法と同様に、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のクエン酸シンターゼ遺伝子（ｇｌｔＡ）の本来の調節領域（配列番号：１８）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）で置換し、組換え体ＧｌｔＡ４６−ＦＫＦ、組換え体ＧｌｔＡ３７−ＦＫＦ、及び組換え体ＧｌｔＡ９３−ＦＫＦをそれぞれ得た。

【0198】

具体的には、以下の通りであった。ｇｌｔａ−ｕｐ−ＦＲＴ及びｇｌｔａ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎをプライマーとし、組換え菌株Ｍ１−４６、組換え菌株Ｍ１−３７、及び組換え菌株Ｍ１−９３をテンプレートとして、１８００ｂｐのＤＮＡ断片ｇｌｔＡ−Ｍ１−４６、ＤＮＡ断片ｇｌｔＡ−Ｍ１−３７、及びＤＮＡ断片ｇｌｔＡ−Ｍ１−９３をそれぞれ増幅し、ｇｌｔＡ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｇｌｔＡ４６−ＦＫＦを取得し、ｇｌｔＡ−Ｍ１−３７及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｇｌｔＡ３７−ＦＫＦを取得し、ｇｌｔＡ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｇｌｔＡ４６−ＦＫＦを取得し、これらを、ｋａｎ−ｆ及びｇｌｔＡ−ｒを用いてＰＣＲで同定し、正しいＰＣＲ断片は約９００ｂｐであった。

【0199】

使用したプライマーは、以下の通りであった。
ｇｌｔａ−ｕｐ−ＦＲＴ：ＴＧＴＴＣＣＧＧＡＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＴＡＴＡＧＧＣＣＧＴＴＣＡＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＣＡＡＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｇｌｔａ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＴＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0200】

ＰＣＲでの検証用のプライマーは、以下の配列を有していた。
ｋａｎ−ｆ：ＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧ
ｇｌｔＡ−ｒ：ＴＣＣＡＧＧＴＡＧＴＴＡＧＡＡＴＣＧＧＴＣ

【0201】

実施例１の方法で組換え大腸菌ＧｌｔＡ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＧｌｔＡ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌ＧｌｔＡ９３−ＦＫＦの発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0202】

結果を、図２に示す。ｇｌｔＡの調節後、組換え大腸菌ＧｌｔＡ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＧｌｔＡ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌ＧｌｔＡ９３−ＦＫＦのβ−カロテンの収量は、それぞれ、２３．７４ｍｇ／ｇ、２４．６６ｍｇ／ｇ、及び２４．８４ｍｇ／ｇであり、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−９３がβ−カロテンの収量を３５％改善した。

【0203】

２．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のアコニターゼ遺伝子（アコニット酸ヒドラターゼ）の発現強度の改善

【0204】

実施例３のパート１における一段階の相同組換えの工程と同様に、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のアコニターゼ遺伝子（ａｃｎＡ）の本来の調節領域（配列番号：１９）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換し、ＡｃｎＡ４６−ＦＫＦ、ＡｃｎＡ３７−ＦＫＦ、及びＡｃｎＡ９３−ＦＫＦを得た。

【0205】

具体的には、以下の通りであった。ａｃｎＡ−ｕｐ−ＦＲＴ及びａｃｎＡ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎをプライマーとし、組換え菌株Ｍ１−４６、組換え菌株Ｍ１−３７、及び組換え菌株Ｍ１−９３をテンプレートとして、１８００ｂｐのＤＮＡ断片ａｃｎＡ−Ｍ１−４６、ａｃｎＡ−Ｍ１−３７、及びａｃｎＡ−Ｍ１−９３をそれぞれ増幅し、ａｃｎＡ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ａｃｎＡ４６−ＦＫＦを取得し、ａｃｎＡ−Ｍ１−３７及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ａｃｎＡ３７−ＦＫＦを取得し、ａｃｎＡ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ａｃｎＡ４６−ＦＫＦを取得し、これらを、ｋａｎ−ｆ及びａｃｎＡ−ｒを用いてＰＣＲで同定し、正しいＰＣＲ断片は約９００ｂｐであった。

【0206】

使用したプライマーは、以下の通りであった。
ａｃｎＡ−ｕｐ−ＦＲＴ：ＴＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ａｃｎＡ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＴＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＧＴＡＧＧＧＴＴＧＡＣＧＡＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0207】

ＰＣＲでの検証用のプライマーは、以下の配列を有していた。
ｋａｎ−ｆ：ＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧ
ａｃｎＡ−ｒ：ＧＴＡＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣ

【0208】

実施例１の方法で組換え大腸菌ＡｃｎＡ４６−ＦＫＦ、ＡｃｎＡ３７−ＦＫＦ、及びＡｃｎＡ９３−ＦＫＦの発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0209】

結果を、図２に示す。組換え大腸菌ＡｃｎＡ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＡｃｎＡ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌ＡｃｎＡ９３−ＦＫＦのβ−カロテンの収量は、それぞれ、２０．６１ｍｇ／ｇ、１９．８７ｍｇ／ｇ、及び１８．９５ｍｇ／ｇであり、ａｃｎＡの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−４６がβ−カロテンの収量を１２％改善した。

【0210】

３．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0211】

実施例３のパート１の方法で、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｉｃｄ）の本来の調節領域（配列番号：２０）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換し、Ｉｃｄ４６−ＦＫＦ、Ｉｃｄ３７−ＦＫＦ、及びＩｃｄ９３−ＦＫＦを得た。

【0212】

具体的には、以下の通りであった。ｉｃｄ−ｕｐ−ＦＲＴ及びｉｃｄ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎをプライマーとし、組換え菌株Ｍ１−４６、組換え菌株Ｍ１−３７、及び組換え菌株Ｍ１−９３をテンプレートとして、１８００ｂｐのＤＮＡ断片ｉｃｄ−Ｍ１−４６、ＤＮＡ断片ｉｃｄ−Ｍ１−３７、及びＤＮＡ断片ｉｃｄ−Ｍ１−９３をそれぞれ増幅し、ｉｃｄ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｉｃｄ４６−ＦＫＦを取得し、ｉｃｄ−Ｍ１−３７及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｉｃｄ３７−ＦＫＦを取得し、ｉｃｄ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｉｃｄ４６−ＦＫＦを取得し、これらを、ｋａｎ−ｆ及びｉｃｄ−ｒを用いてＰＣＲにより同定し、正しいＰＣＲ断片は約９００ｂｐであった。

【0213】

使用したプライマーは、以下の通りであった。
ｉｃｄ−ｕｐ−ＦＲＴ：ＡＴＡＧＣＣＴＡＡＴＡＡＣＧＣＧＣＡＴＣＴＴＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＴＡＧＧＧＴＡＧＴＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｉｃｄ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＴＴＧＴＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＡＣＴＴＴＣＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0214】

ＰＣＲでの検証用のプライマーは、以下の配列を有していた。
ｋａｎ−ｆ：ＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧ
ｉｃｄ−ｒ：ＡＣＣＧＧＴＧＴＡＡＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣ

【0215】

実施例１の方法で組換え大腸菌Ｉｃｄ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌Ｉｃｄ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌Ｉｃｄ９３−ＦＫＦの発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0216】

結果を、図２に示す。組換え大腸菌Ｉｃｄ４６−ＦＫＦ（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌Ｉｃｄ３７−ＦＫＦ（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌Ｉｃｄ９３−ＦＫＦ（Ｍ１−９３）のβ−カロテンの収量は、それぞれ、２１．１６ｍｇ／ｇ、１６．９３ｍｇ／ｇ、及び１９．８７ｍｇ／ｇであり、ｉｃｄの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−４６がβ−カロテンの収量を１５％改善した。

【0217】

４．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のスクシニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子の発現強度の改善

【0218】

実施例３のパート１における一段階の相同組換えの工程と同様に、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のスクシニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子（ＳｕｃＣＤ）の本来の調節領域（配列番号：２１）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換し、ＳｕｃＣＤ４６−ＦＫＦ、ＳｕｃＣＤ３７−ＦＫＦ、及びＳｕｃＣＤ９３−ＦＫＦを得た。

【0219】

具体的には、以下の通りであった。ｓｕｃＣ−ｕｐ−ＦＲＴ及びｓｕｃＣ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎをプライマーとし、組換え菌株Ｍ１−４６、組換え菌株Ｍ１−３７、及び組換え菌株Ｍ１−９３をテンプレートとして、１８００ｂｐのＤＮＡ断片ｓｕｃＣ−Ｍ１−４６、ＤＮＡ断片ｓｕｃＣ−Ｍ１−３７、及びＤＮＡ断片ｓｕｃＣ−Ｍ１−９３をそれぞれ増幅し、ｓｕｃＣ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｓｕｃＣ４６−ＦＫＦを取得し、ｓｕｃＣ−Ｍ１−３７及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｓｕｃＣ３７−ＦＫＦを取得し、ｓｕｃＣ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｓｕｃＣ４６−ＦＫＦを取得し、これらを、ｋａｎ−ｆ及びｓｕｃＣ−ｒを用いてＰＣＲで同定し、正しいＰＣＲ断片は約９００ｂｐであった。

【0220】

使用したプライマーは、以下の通りであった。
ｓｕｃＣ−ｕｐ−ＦＲＴ：ａ
ＴＴＣＧＧＴＣＴＡＣＧＧＴＴＴＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＧＡＴＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＡＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｓｕｃＣ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＡＡＧＣＣＡＴＡＧＣＧＧＧＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＡＴＴＣＡＴＧＴＡＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0221】

ＰＣＲでの検証用のプライマーは、以下の配列を有していた。
ｋａｎ−ｆ：ＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧ
ｓｕｃＣ−ｒ：ＴＧＡＴＡＣＧＴＴＡＣＣＡＧＡＣＧＣＴＴ

【0222】

実施例１の方法で組換え大腸菌ＳｕｃＣＤ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＳｕｃＣＤ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌ＳｕｃＣＤ９３−ＦＫＦの発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0223】

結果を、図２に示す。組換え大腸菌ＳｕｃＣＤ４６−ＦＫＦ（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌ＳｕｃＣＤ３７−ＦＫＦ（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌ＳｕｃＣＤ９３−ＦＫＦ（Ｍ１−９３）のβ−カロテンの収量は、それぞれ、１９．３２ｍｇ／ｇ、２０．４２ｍｇ／ｇ、及び２０．０６ｍｇ／ｇであり、ｓｕｃＣＤの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−３７がβ−カロテンの収量を１１％改善した。

【0224】

５．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のフマラーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0225】

実施例３のパート１における一段階の相同組換えの工程と同様に、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のフマラーゼＡ遺伝子（フマラーゼＡ，ｆｕｍＡ）の本来の調節領域（配列番号：２２）、及びフマラーゼＣ遺伝子（フマラーゼＣ，ｆｕｍＣ）の本来の調節領域（配列番号：２３）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換し、ＦｕｍＡ４６−ＦＫＦ、ＦｕｍＡ３７−ＦＫＦ、ＦｕｍＡ９３−ＦＫＦ、ＦｕｍＣ４６−ＦＫＦ、ＦｕｍＣ３７−ＦＫＦ、及びＦｕｍＣ９３−ＦＫＦを得た。

【0226】

具体的には、以下の通りであった。即ち、ｆｕｍＡ−ｕｐ−ＦＲＴ及びｆｕｍＡ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎをプライマーとし、組換え菌株Ｍ１−４６、組換え菌株Ｍ１−３７、及び組換え菌株Ｍ１−９３をテンプレートとして、１８００ｂｐのＤＮＡ断片ｆｕｍＡ−Ｍ１−４６、ＤＮＡ断片ｆｕｍＡ−Ｍ１−３７、及びＤＮＡ断片ｆｕｍＡ−Ｍ１−９３をそれぞれ増幅し、ｆｕｍＡ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｆｕｍＡ４６−ＦＫＦを取得し、ｆｕｍＡ−Ｍ１−３７及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｆｕｍＡ３７−ＦＫＦを取得し、ｆｕｍＡ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｆｕｍＡ４６−ＦＫＦを取得し、これらを、ｋａｎ−ｆ及びｆｕｍＡ−ｒを用いてＰＣＲで同定し、正しいＰＣＲ断片は約９００ｂｐであった。

【0227】

ｆｕｍＣ−ｕｐ−ＦＲＴ及びｆｕｍＣ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎをプライマーとし、組換え菌株Ｍ１−４６、組換え菌株Ｍ１−３７、及び組換え菌株Ｍ１−９３をテンプレートとして、１８００ｂｐのＤＮＡ断片ｆｕｍＣ−Ｍ１−４６、ＤＮＡ断片ｆｕｍＣ−Ｍ１−３７、及びＤＮＡ断片ｆｕｍＣ−Ｍ１−９３をそれぞれ増幅し、ｆｕｍＣ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｆｕｍＣ４６−ＦＫＦを取得し、ｆｕｍＣ−Ｍ１−３７及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｆｕｍＣ３７−ＦＫＦを取得し、ｆｕｍＣ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｆｕｍＣ４６−ＦＫＦを取得し、これらを、ｋａｎ−ｆ及びｆｕｍＣ−ｒを用いてＰＣＲで同定し、正しいＰＣＲ断片は約９００ｂｐであった。

【0228】

使用したプライマーは、以下の通りであった。
ｆｕｍＡ−ｕｐ−ＦＲＴ：ＧＧＡＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧＴＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｕｍＡ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＴＣＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ
ｆｕｍＣ−ｕｐ−ＦＲＴ：ＣＴＣＡＣＡＣＡＧＴＧＣＡＣＴＣＧＣＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＡＡＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｆｕｍＣ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＧＧＧＡＣＡＴＣＡＡＴＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＡＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＴＡＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0229】

ＰＣＲでの検証用のプライマーは、以下の配列を有していた。
ｋａｎ−ｆ：ＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧ
ｆｕｍＡ−ｒ：ＣＧＡＧＴＡＧＣＧＣＡＡＡＴＴＡＴＣＴＴ
ｆｕｍＣ−ｒ：ＡＴＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＧＣＴＧＴＣ

【0230】

実施例１の方法で組換え大腸菌ＦｕｍＡ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＦｕｍＡ３７−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＦｕｍＡ９３−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＦｕｍＣ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌ＦｕｍＣ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌ＦｕｍＣ９３−ＦＫＦの発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0231】

結果を、図２に示す。組換え大腸菌ＦｕｍＡ４６−ＦＫＦ（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌ＦｕｍＡ３７−ＦＫＦ（Ｍ１−３７）、組換え大腸菌ＦｕｍＡ９３−ＦＫＦ（Ｍ１−９３）、組換え大腸菌ＦｕｍＣ４６−ＦＫＦ（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌ＦｕｍＣ３７−ＦＫＦ（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌ＦｕｍＣ９３−ＦＫＦ（Ｍ１−９３）のβ−カロテンの収量は、それぞれ、１８．９５ｍｇ／ｇ、２０．２４ｍｇ／ｇ、１６．０１ｍｇ／ｇ、１９．５０ｍｇ／ｇ、１８．４ｍｇ／ｇ、及び１９．８７ｍｇ／ｇであり、ｆｕｍＡの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−３７がβ−カロテンの収量を１０％改善し、ｆｕｍＣの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−９３がβ−カロテンの収量を８％改善した。

【0232】

６．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0233】

実施例３のパート１における一段階の相同組換えの工程と同様に、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｍｄｈ）の本来の調節領域（配列番号：２４）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換し、Ｍｄｈ４６−ＦＫＦ、Ｍｄｈ３７−ＦＫＦ、及びＭｄｈ９３−ＦＫＦを得た。

【0234】

具体的には、以下の通りであった。即ち、ｍｄｈ−ｕｐ−ＦＲＴ及びｍｄｈ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎをプライマーとし、組換え菌株Ｍ１−４６、組換え菌株Ｍ１−３７、及び組換え菌株Ｍ１−９３をテンプレートとして、１８００ｂｐのＤＮＡ断片ｍｄｈ−Ｍ１−４６、ＤＮＡ断片ｍｄｈ−Ｍ１−３７、及びＤＮＡ断片ｍｄｈ−Ｍ１−９３をそれぞれ増幅し、ｍｄｈ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｍｄｈ４６−ＦＫＦを取得し、ｍｄｈ−Ｍ１−３７及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｍｄｈ３７−ＦＫＦを取得し、ｍｄｈ−Ｍ１−４６及び大腸菌ＣＡＲ００１の相同組換えの後、組換え大腸菌ｍｄｈ４６−ＦＫＦを取得し、これらを、ｋａｎ−ｆ及びｍｄｈ−ｒを用いてＰＣＲで同定し、正しいＰＣＲ断片は約９００ｂｐであった。

【0235】

使用したプライマーは、以下の通りであった。
ｍｄｈ−ｕｐ−ＦＲＴ：ＡＧＡＡＡＣＡＴＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＣＧＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
ｍｄｈ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＧＣＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＴＧＣＧＡＣＴＴＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0236】

ＰＣＲでの検証用のプライマーは、以下の配列を有していた。
ｋａｎ−ｆ：ＣＣＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＧ
ｍｄｈ−ｒ：ＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＧＡＡＡＴＡ

【0237】

実施例１の方法で組換え大腸菌Ｍｄｈ４６−ＦＫＦ、組換え大腸菌Ｍｄｈ３７−ＦＫＦ、及び組換え大腸菌Ｍｄｈ９３−ＦＫＦの発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0238】

結果を、図２に示す。組換え大腸菌Ｍｄｈ４６−ＦＫＦ（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌Ｍｄｈ３７−ＦＫＦ（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌Ｍｄｈ９３−ＦＫ（Ｍ１−９３）Ｆのβ−カロテンの収量は、それぞれ、１８．７７ｍｇ／ｇ、１８．９５ｍｇ／ｇ、及び１８．７７ｍｇ／ｇであり、ｍｄｈの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−３７がβ−カロテンの収量を３％改善した。

【0239】

実施例７：組換え大腸菌ＣＡＲ００１のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ遺伝子及びトランスケトラーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0240】

１．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0241】

実施例５と同様の方法で、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）の本来の調節領域（配列番号：２５）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換し、組換え大腸菌ｚｗｆ４６、ｚｗｆ３７、及びｚｗｆ９３を得た。

【0242】

組換え大腸菌ｚｗｆ４６の構築（二段階の相同組換え）：

【0243】

工程１：出発ベクターがｐＸＺ００２プラスミドであり、増幅用プライマーがｚｗｆ−ｃａｔ−ｕｐ及びｚｗｆ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌ＣＡＲ００１である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0244】

工程２：出発菌株がＭ１−４６であり、増幅用プライマーがｚｗｆ−ｕｐ−Ｐ及びｚｗｆ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌ｚｗｆ４６を得た。

【0245】

組換え大腸菌ｚｗｆ３７の構築：工程２における出発菌株を組換え菌株Ｍ１−３７で置き換えた点以外は、組換え大腸菌ｚｗｆ４６と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。組換え大腸菌ｚｗｆ９３の構築：工程２における出発菌株を組換え菌株Ｍ１−９３で置き換えた点以外は、組換え大腸菌ｚｗｆ４６と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0246】

使用したプライマーは、以下の通りであった。
ｚｗｆ−ｃａｔ−ｕｐ：ＡＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴＡＡＴＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ｚｗｆ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＣＣＡＧＧＧＴＡＴＡＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＴＴＡＣＧＧＴＧＣＡＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＧＣＴＴＧＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴ
ｚｗｆ−ｕｐ−Ｐ：ＡＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＣＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＴＡＡＴＣＧＣＡＣＧＧＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｚｗｆ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＧＣＧＴＴＡＣＣＧＣＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0247】

上記２つの工程において、同定用プライマーは、以下の配列を有するｚｗｆ−ｕｐ及びｚｗｆ−ｄｏｗｎであった（正しいＰＣＲ断片は、約９００ｂｐであった）。

【0248】

ＡｐＩ−ｕｐ：ＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｚｗｆ−ｄｏｗｎ：ＣＧＧＴＴＴＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＣＣ

【0249】

実施例１の方法で組換え大腸菌ｚｗｆ４６、組換え大腸菌ｚｗｆ３７、及び組換え大腸菌ｚｗｆ９３の発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0250】

結果を、図３に示した。組換え大腸菌ｚｗｆ４６（Ｍ１−４６）、組換え大腸菌ｚｗｆ３７（Ｍ１−３７）、及び組換え大腸菌ｚｗｆ９３（Ｍ１−９３）のβ−カロテンの収量は、それぞれ、１９．３２ｍｇ／ｇ、１８．４ｍｇ／ｇ、及び１９．１４ｍｇ／ｇであり、ｚｗｆの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−４６がβ−カロテンの収量を５％改善した。

【0251】

２．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のトランスケトラーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0252】

実施例５と同様の方法で、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のトランスケトラーゼ遺伝子（ｔｋｔＡ）の本来の調節領域（配列番号：２６）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）、人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）、及び人工調節領域Ｍ１−９３（配列番号：１１）でそれぞれ置換し、組換え菌株ｔｋｔＡ４６、組換え菌株ｔｋｔＡ３７、及び組換え菌株ｔｋｔＡ９３を得た。

【0253】

組換え大腸菌ｔｋｔＡ４６の構築（二段階の相同組換え）：

【0254】

工程１：出発ベクターがｐＸＺ００２プラスミドであり、増幅用プライマーがｔｋｔＡ−ｃａｔ−ｕｐ及びｔｋｔＡ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌ＣＡＲ００１である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0255】

工程２：出発菌株がＭ１−４６であり、増幅用プライマーがｔｋｔＡ−ｕｐ−Ｐ及びｔｋｔＡ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得た中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌ｚｗｆ４６を得た。

【0256】

上記２つの工程において、同定用プライマーは、以下の配列を有するｔｋｔＡ−ｕｐ及びｔｋｔＡ−ｄｏｗｎであった（正しいＰＣＲ断片は、約９００ｂｐであった）。

【0257】

ｔｋｔＡ−ｕｐ：ＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡ
ｔｋｔＡ−ｄｏｗｎ：ＡＴＣＣＧＴＣＡＴＣＡＴＡＴＣＣＡＴＣＡ

【0258】

組換え大腸菌ｔｋｔＡ３７の構築：工程２における出発菌株を組換え菌株Ｍ１−３７で置き換えた点以外は、組換え大腸菌ｔｋｔＡ４６と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0259】

組換え大腸菌ｔｋｔＡ９３の構築：工程２における出発菌株を組換え菌株Ｍ１−９３で置き換えた点以外は、組換え大腸菌ｔｋｔＡ４６と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0260】

使用したプライマーは、以下の通りであった。
ｔｋｔＡ−ｃａｔ−ｕｐ：ＡＡＡＴＧＣＧＣＣＧＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＡＴＡＡＧＧＡＡＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡ
ｔｋｔＡ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＡＴＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧ
ｔｋｔＡ−ｕｐ−Ｐ：ＡＡＡＴＧＣＧＣＣＧＴＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＡＴＡＡＧＧＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｔｋｔＡ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＴＣＣＡＴＧＣＴＣＡＧＣＧＣＡＣＧＡＡＴＡＧＣＡＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＡＣＧＴＧＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0261】

実施例１の方法で組換え大腸菌ｔｋｔＡ４６、組換え大腸菌ｔｋｔＡ３７、及び組換え大腸菌ｔｋｔＡ９３の発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0262】

結果を、図３に示した。組換え大腸菌ｔｋｔＡ４６、組換え大腸菌ｔｋｔＡ３７、及び組換え大腸菌ｔｋｔＡ９３のβ−カロテンの収量は、それぞれ、２０．９８ｍｇ／ｇ、２０．２４ｍｇ／ｇ、及び２１．３４ｍｇ／ｇであり、ｔｋｔＡの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−９３がβ−カロテンの収量を１６％改善した。

【0263】

実施例８：組換え大腸菌ＣＡＲ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の組合せの発現強度の改善

【0264】

組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６及び組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｓｕｃＡＢ）の本来の調節領域（配列番号：１５）が人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）及び人工調節領域Ｍ１−３７（配列番号：１０）でそれぞれ置換された組換え大腸菌ＣＡＲ００１に由来したものである。

【0265】

組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６の構築（二段階の相同組換え）：

【0266】

工程１：出発ベクターがｐＬＯＩ４１６２プラスミドであり、増幅用プライマーがＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｕｐ及びＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、形質転換される菌株が組換え大腸菌ＣＡＲ００１であり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られる点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0267】

工程２：出発菌株がＭ１−４６であり、増幅用プライマーがＳｕｃＡＢ−ｕｐ−Ｐ及びＳｕｃＡＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６を得た。

【0268】

工程１における増幅用プライマーは、以下の通りであった。
ＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｕｐ：ＧＧＴＡＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＴＡＡＧＧＧＡＴＣＡＣＧＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴ

【0269】

工程２における増幅用プライマーは、以下の配列を有するＳｕｃＡＢ−ｕｐ−Ｐ／ＳｕｃＡＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであった。
ＳｕｃＡＢ−ｕｐ−Ｐ：ＧＧＴＡＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡ

【0270】

上記２つの工程において、同定用プライマーは、以下の通りであった（約４００ｂｐの増幅断片が陽性であった）。
ＡｐＩ−ｕｐ：ＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｓｕｃＡＢ−ｒ：ＧＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＣＧＴＴＴＧＡＧ

【0271】

組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７の構築：工程２における出発菌株がＭ１−３７であった点以外は、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６と実質的に同一の方法で、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0272】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＣＡＲ００１のｓｕｃＡＢ遺伝子の本来の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６及び人工調節領域Ｍ１−３７でそれぞれ置換された菌株を、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６及び組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７と命名した。組換え菌株ｓｄｈＡＢＣＤ４６及び組換え菌株ｓｄｈＡＢＣＤ３７は、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｓｄｈＡＢＣＤ）の本来の調節領域（配列番号：１６）を、人工調節領域Ｍ１−４６及び人工調節領域Ｍ１−３７でそれぞれ置換したものであった。

【0273】

同様の方法で工程１における増幅に用いたプライマーは以下の通りであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られた。
ＳｄｈＡＢＣＤ−ｃａｔ−ｕｐ：ＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＴＴＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ＳｄｈＡＢＣＤ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＣＣＣＡＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴ

【0274】

工程２における増幅用プライマーは、以下の配列を有するＳｄｈＡＢＣＤ−ｕｐ−Ｐ／ＳｄｈＡＢＣＤ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られた。
ＳｄｈＡＢＣＤ−ｕｐ−Ｐ：ＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＴＴＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ＳｄｈＡＢＣＤ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0275】

ＰＣＲでの検証用プライマーは、以下の配列を有していた（約４００ｂｐの増幅断片が陽性であった）。
ＡｐＩ−ｕｐ：ＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｓｄｈＡＢＣＤ−ｒ：ＡＡＴＴＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣ

【0276】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＣＡＲ００１のｓｄｈＡＢＣＤ遺伝子の本来の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６及び人工調節領域Ｍ１−３７でそれぞれ置換された菌株を、組換え大腸菌ｓｄｈＡＢＣＤ４６及び組換え大腸菌ｓｄｈＡＢＣＤ３７と命名した。

【0277】

工程１で形質転換される菌株がＳｕｃＡＢ４６又はＳｕｃＡＢ３７である以外は、組換え大腸菌ｓｄｈＡＢＣＤ４６及び組換え大腸菌ｓｄｈＡＢＣＤ３７と実質的に同一の方法で、ＳｕｃＡＢ４６及びＳｕｃＡＢ３７のｓｄｈＡＢＣＤ遺伝子の発現を、人工調節領域Ｍ１−４６及び人工調節領域Ｍ１−３７でそれぞれ調節した。配列決定により正しいクローンを検証した後、ＳｕｃＡＢ４６及びＳｕｃＡＢ３７のｓｄｈＡＢＣＤ遺伝子の本来の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６及び人工調節領域Ｍ１−３７でそれぞれ置換された菌株を、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ｓｄｈＡＢＣＤ４６、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ｓｄｈＡＢＣＤ３７、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ｓｄｈＡＢＣＤ４６、及び組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ｓｄｈＡＢＣＤ３７と命名した。

【0278】

２．β−カロテンの産生

【0279】

実施例１の方法で組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７、組換え大腸菌ｓｄｈＡＢＣＤ４６、組換え大腸菌ｓｄｈＡＢＣＤ３７、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ｓｄｈＡＢＣＤ４６、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ｓｄｈＡＢＣＤ３７、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ｓｄｈＡＢＣＤ４６、及び組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ｓｄｈＡＢＣＤ３７の発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0280】

結果を、図４に示した。組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７、組換え大腸菌ｓｄｈＡＢＣＤ４６、組換え大腸菌ｓｄｈＡＢＣＤ３７、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ｓｄｈＡＢＣＤ４６、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６−ｓｄｈＡＢＣＤ３７、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ｓｄｈＡＢＣＤ４６、及び組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ３７−ｓｄｈＡＢＣＤ３７のβ−カロテンの収量は、それぞれ、２３．７７ｍｇ／ｇ、２２．５９ｍｇ／ｇ、２２．７６ｍｇ／ｇ、２０．７２ｍｇ／ｇ、２７．７８ｍｇ／ｇ、２２．４５ｍｇ／ｇ、２４．４７ｍｇ／ｇ、及び１１．９６ｍｇ／ｇであり、分かるように、ｓｕｃＡＢの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＭ１−４６がβ−カロテンの収量を２９％改善し、これをＣＡＲ００２（ＳｕｃＡＢ４６）と再命名し、ｓｕｃＡＢ及びｓｄｈＡＢＣＤの組合せの調節後、ＣＡＲ００１と比較して、最大でＳｕｃＡＢ４６−ｓｄｈＡＢＣＤ４６がβ−カロテンの収量を５１％改善し、これをＣＡＲ００４と再命名した。

【0281】

実施例９：β−カロテンの産生量を改善するための、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のＴＣＡ機能モジュール及びＰＰＰ機能モジュールの組合せの組換え

【0282】

１．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のＴＣＡ機能モジュール及びＰＰＰ機能モジュールの組合せの組換え

【0283】

組換え大腸菌ＣＡＲ００３は、組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６（実施例８から得られた）のｔａｌＢ遺伝子の本来の調節領域（配列番号：１７）を、人工調節領域Ｍ１−４６で置換したものであった。

【0284】

具体的には、以下の通りであった。

【0285】

工程１：出発ベクターがｐＬＯＩ４１６２プラスミドであり、増幅用プライマーがｔａｌＢ−ｃａｔ−ｕｐ及びｔａｌＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌ＳｕｃＡＢ４６である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0286】

工程２：出発菌株がＭ１−４６であり、増幅用プライマーがｔａｌＢ−ｕｐ−ｐ及びｔａｌＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌ＣＡＲ００３を得た。

【0287】

２つの工程において、同定用プライマーは、ｔａｌＢ−ｕｐ及びｔａｌＢ−ｄｏｗｎであった（得られる約９００ｂｐの断片が陽性であった）。

【0288】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＳｕｃＡＢ４６のｔａｌＢ遺伝子の本来の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６で置換された菌株を、組換え大腸菌ＣＡＲ００３と命名した。

【0289】

組換え大腸菌ＣＡＲ００５は、工程１における出発菌株をＣＡＲ００４で置換した以外は、組換え大腸菌ＣＡＲ００３と実質的に同一に方法で、組換え大腸菌ＣＡＲ００４（実施例８から得られた）のｔａｌＢ遺伝子の本来の調節領域（配列番号：１７）を、人工調節領域Ｍ１−４６で置換したものであった。

【0290】

２．β−カロテンの産生

【0291】

実施例１の方法で組換え大腸菌ＣＡＲ００５の発酵培養を行い、β−カロテンの収量を測定した。

【0292】

結果を、表２に示す。ＣＡＲ００１と比較して、ＣＡＲ００５のβ−カロテンの収量は、６４％改善した。

【0293】

【表2】

（表２：組換え大腸菌ＣＡＲ００１のＴＣＡ機能モジュール及びＰＰＰ機能モジュールの組合せの組換え、及びβ−カロテンの産生量の改善）

【0294】

実施例１０：組換え大腸菌ＣＡＲ００５の高密度発酵

【0295】

組換え大腸菌ＣＡＲ００５の高密度発酵を、７Ｌの発酵タンク（Ｌａｂｆｏｒｓ ４；Ｉｎｆｏｒｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）中で、以下の方法により行った。即ち、単一コロニーをチューブ内の４ｍＬのＬＢ培地に採取し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し、次いで、菌株溶液の１％の量、即ち、チューブからの３００μＬの菌株溶液を、２５０ｍＬのＴｒｉフラスコ（Ｔｒｉ Ｆｌａｓｋ）内の５０ｍＬの培地に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した後、その菌株容器を、即ち高密度発酵用のシードとした。その高密度発酵は、合成培地を用いて行った。７Ｌの発酵タンクを、３Ｌの発酵培地、及び３００ｍＬのシード溶液で充填した。

【0296】

発酵培地の成分（ｇ／Ｌ）は、１０ｇのグリセロール、１．７ｇのクエン酸、１０．５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ、６ｇの（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、３．４４ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、及び１０ｍＬの微量元素溶液であった。微量元素溶液の成分（ｇ／Ｌ）は、１０ｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５．２５ｇのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３．０ｇのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ のＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ、０．２３ｇのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ、２．０ｇのＣａＣｌ_２、及び０．１ｇの（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４であった。

【0297】

発酵は、３７℃で、空気流量５Ｌ／分間、溶存酸素を３０％に制御し、溶存酸素との関連で回転速度６００ｒｐｍ〜１２００ｒｐｍで行った。ｐＨは、５Ｍのアンモニアで７．０に調整した。補充培地の成分（ｇ／Ｌ）は、５００ｇのグリセロール、１５ｇのペプトン、３０ｇの酵母エキス、及び３０ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏであった。

【0298】

発酵は、シミュレートされた指数的流加モードで行い、発酵を通して、グリセロールの濃度を０．５ｇ／Ｌ未満に維持し、酢酸の収量を０．２ｇ／Ｌ未満に維持し、平均供給速度を２０ｍＬ／ｈとした。

【0299】

９時間の発酵後、２ｍＬの菌株溶液を４時間毎に採取し、１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、滅菌水で洗浄し、上清を廃棄し、−２０℃の冷凍庫に保存した。使用前に、試料にアセトンを１ｍＬ加え、５５℃で暗所にて１５分間抽出し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの高速液体クロマトグラフ：１２６０インフィニティ）によりβ−カロテンの含有量を測定するために、その上清を使用した。

【0300】

標準品のβ−カロテン（米国のＳｉｇｍａ（カタログ番号：Ｃ４５８２））を−８０℃で維持し、受領後直ちに検量線を求めるために使用し、β−カロテンを上清から抽出したときに、その含有量を直ちにＨＰＬＣで（上記の方法で）測定し、β−カロテンの含有を実証した（上清は黄色を示したが、菌株はアセトンで抽出後に黄色から白色となり、ＨＰＬＣアッセイでは、試料は標準品と同一のβ−カロテンの出現時間を有しており（出現時間１７．２分）、β−カロテンの含有を確認した）。

【0301】

発酵の結果を、図５に示した。高密度発酵は１００時間であり、７０時間で細胞が安定期に入り、最終的なＯＤ_６００は１４６であり、乾燥細胞重量で４７．１６ｇ／Ｌの乾燥重量であった。β−カロテンの収量は、最初の５６時間は増加し続け、最大収量２．１６ｇ／Ｌ、細胞当たりの乾燥細胞重量で最大収量６０ｍｇ／ｇであった。

【0302】

実施例１１：組換え大腸菌ＣＡＲ００１のｃｒｔＸＹ遺伝子の欠失、及びリコピンの産生

【0303】

１．組換え大腸菌ＣＡＲ００１のｃｒｔＸＹ遺伝子の欠失、及び組換え菌株ＬＹＣ００１の構築

【0304】

組換え菌株ＬＹＣ００１は、具体的には以下のようにして、相同組換えにより、組換え大腸菌ＣＡＲ００１のβ−カロテン合成遺伝子クラスターからのβ−カロテンシクラーゼ遺伝子ｃｒｔＸ及びリコピンβ−シクラーゼ遺伝子ｃｒｔＹの欠失により得た。

【0305】

実施例１のパートＩＩと同様の手順：

【0306】

工程１：ｐＬＯＩ４１６２のプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、プライマーＣｒｔＥ−ｔａａ−ｃａｔ−ｆ／ＣｒｔＩ−ａｔｇ−ｃａｔ−ｒを用い、クロロマイセチン遺伝子及びレバンスクローストランスフェラーゼ遺伝子を含む断片である４０００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉを増幅した。

【0307】

ＣｒｔＥ−ｔａａ−ｃａｔ−ｆ：ＡＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣＡＧＴＴＡＡＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ＣｒｔＩ−ａｔｇ−ｃａｔ−ｒ：ＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴ

【0308】

工程２：工程１で得られたＤＮＡ断片Ｉを、ｐＫＤ４６を有する大腸菌ＣＡＲ００１に電気的に形質転換し、菌株ＪＺ００１を得た。

【0309】

工程３：ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、プライマーｃｒｔＥ−ｒ／ｃｒｔＩ−ＲＢＳ−Ｆを用いて増幅し、約７０００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。

【0310】

ＣｒｔＥ−ｒ：ＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＴ
ＣｒｔＩ−ＲＢＳ−Ｆ：ＣＴＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＧＡＡＣＴＡＣＡＧＴＡＡＴＴＧＧＣＧＣ

【0311】

工程４：工程３の増幅で得られた約７０００ｂｐのＰＣＲ産物を、リン酸化及び自己連結し、第二の相同組換えにおいて用いるためのプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢを得た。このプラスミドは、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子ｃｒｔＥ、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子ｃｒｔＩ、及びフィトエンシンターゼ遺伝子ｃｒｔＢからなる遺伝子クラスターであるリコピン合成遺伝子クラスターを含む組換えベクターである。

【0312】

工程５：ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢのプラスミドＤＮＡをテンプレートとし、プライマーｃｒｔＥ−ｆ／ｃｒｔＩ−４８４−ｒを用いて増幅し、約１５００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを得た。

【0313】

ＣｒｔＥ−ｆ：ａｔｇａｔｇａｃｇｇｔｃｔｇｔｇｃａｇａａ
ｃｒｔＩ−４８４−ｒ：ＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＴ

【0314】

工程６：工程５で得られた約１５００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩを、ｐＫＤ４６プラスミドを有するＪＺ００１に電気的に形質転換し、ｃｒｔＸＹ遺伝子を欠失した菌株を取得し、これをＬＹＣ００１と命名した。

【0315】

２．組換え大腸菌ＬＹＣ００１の発酵によるリコピンの産生

【0316】

組換え大腸菌ＬＹＣ００１の単一コロニーを、チューブ内の４ｍＬのＬＢ培地に採取し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し、次いで、１％の量の一晩培養したシード溶液を、１００ｍＬのＴｒｉフラスコ（Ｔｒｉ Ｆｌａｓｋ）内の１０ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで暗所にて２４時間培養後、リコピンの収量を測定するために、各試料につき３つずつ試料を採取した。

【0317】

リコピンの検量線の決定：リコピンの標準品（Ｐ／Ｎ：Ｌ９８７９）はＳｉｇｍａにより供給され、これを受領後直ちに、検量線を決意するために使用し、濾過に使用したフィルターは、０．４５μｍのミリポアフィルター（Ｍｉｌｌｐｏｒ）であり、アセトン、メタノール、ジクロロメタン、石油エーテル、及びアセトニトリルは、Ｍｅｒｋにより供給されるクロマトグラフィー用の純粋な薬剤であった。

【0318】

５０ｍｇのリコピン標準品を正確に秤量し、１ｍＬのジクロロメタンに溶解し、次いで２５０ｍＬの褐色メスフラスコに移し、石油エーテルで２５０ｍＬにメスアップして２００μｇ／ｍＬのストック溶液を調製した（−８０℃の冷凍庫に保存した）。使用の際に、それをアセトンで段階的に希釈し（２×、４×、８×、１６×、３２×）、ＨＰＬＣバイアル中に濾過してＨＰＬＣ検出を行い（対称性のＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）を用い、カラム温度：３０℃、移動相：メタノール：アセトニトリル：ジクロロメタン＝２１：２１：８、負荷量：２０μＬ、負荷時間：２０分、ＤＡＤ光検出、検出波長４８０ｎｍで行った）、標準品のピーク面積と、リコピンの濃度との関係から、リコピンの検量線を得た。

【0319】

工程２：組換え大腸菌ＬＹＣ００１の単一コロニーを、チューブ内の４ｍＬのＬＢ培地に採取し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し、次いで、１％の量の一晩培養したシード溶液を、１００ｍＬのＴｒｉフラスコ（Ｔｒｉ Ｆｌａｓｋ）内の１０ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで暗所にて２４時間培養後、リコピンの収量を測定するために、各試料につき３つずつ試料を採取した。

【0320】

リコピンを上清から抽出後、その含有量を直ちにＨＰＬＣで測定し、上清は赤色を示したが、菌株はアセトンで抽出後に赤色から白色となった。ＨＰＬＣアッセイでは、試料は標準品と同一のリコピンの出現時間を有していた（出現時間１１．３分）。

【0321】

結果を、表４に示す。ＬＹＣ００１のリコピンの収量は最大１０．４９ｍｇ／Ｌであり、ＬＹＣ００１のリコピンの含有量は乾燥細胞重量で最大６．５２ｍｇ／ｇであった。

【0322】

実施例１２：組換え大腸菌ＬＹＣ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善

【0323】

１．組換え大腸菌ＬＹＣ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の改善、及び組換え菌株ＬＹＣ００２の構築

【0324】

組換え菌株ＬＹＣ００２は、ＬＹＣ００１から、ｓｕｃＡＢ遺伝子の本来の調節領域（配列番号：１５）を、人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）で置換することにより得られた。

【0325】

具体的な方法は、以下の通りである（二段階の相同組換え）：

【0326】

工程１：出発ベクターがｐＬＯＩ４１６２プラスミドであり、増幅用プライマーがＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｕｐ／ＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌ＬＹＣ００１である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0327】

工程２：出発菌株が組換え菌株Ｍ１−４６であり、増幅用プライマーがＳｕｃＡＢ−ｕｐ−Ｐ／ＳｕｃＡＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌ＬＹＣ００２を得た。

【0328】

工程１における増幅用プライマーは、以下の通りであった。
ＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｕｐ：ＧＧＴＡＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＴＡＡＧＧＧＡＴＣＡＣＧＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴ

【0329】

工程２における増幅用プライマーは、以下の配列を有するＳｕｃＡＢ−ｕｐ−Ｐ／ＳｕｃＡＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであった。
ＳｕｃＡＢ−ｕｐ−Ｐ：ＧＧＴＡＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡ

【0330】

上記２つの工程において、ＰＣＲの同定用プライマーは、以下の通りであった（約４００ｂｐの増幅断片が陽性である）。
ＡｐＩ−ｕｐ：ＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｓｕｃＡＢ−ｒ：ＧＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＣＧＴＴＴＧＡＧ

【0331】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＬＹＣ００１のｓｕｃＡＢ遺伝子の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６で置換された菌株を、組換え大腸菌ＬＹＣ００２と命名した。

【0332】

２．組換え大腸菌ＬＹＣ００２によるリコピンの産生

【0333】

実施例１１の方法で組換え大腸菌ＬＹＣ００２の発酵培養を行い、リコピンの収量を測定した。結果を、表４に示す。組換え大腸菌ＬＹＣ００２により１０．６７ｍｇ／ｇのリコピンが産生され、ｓｕｃＡＢの調節後、リコピンの収量はＬＹＣ００１に対して６４％改善した。

【0334】

実施例１３：組換え大腸菌ＬＹＣ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子の発現強度の組合せの調節

【0335】

１．組換え大腸菌ＬＹＣ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子の発現強度の組合せの調節

【0336】

組換え大腸菌ＬＹＣ００３は、ＬＹＣ００２のｔａｌＢ遺伝子の本来の調節領域（配列番号：１７）が人工調節領域Ｍ１−４６で置換されたものである。

【0337】

詳細な方法は、以下の通りであった（二段階の相同組換え）：

【0338】

工程１：出発ベクターがｐＬＯＩ４１６２プラスミドであり、増幅用プライマーがｔａｌＢ−ｃａｔ−ｕｐ／ｔａｌＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌ＬＹＣ００２である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0339】

工程２：出発菌株が組換え菌株Ｍ１−４６であり、増幅用プライマーがｔａｌＢ−ｕｐ−Ｐ／ｔａｌＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌ＬＹＣ００３を得た。

【0340】

工程１における増幅用プライマーは、以下の通りであった。
ｔａｌＢ−ｃａｔ−ｕｐ：ＡＧＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡＡＣＣＧＴＣＴＴＧＴＣＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ｔａｌＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＴＣＡＴＧＡＴＡＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＴＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＡＡＣＣＧＧＴＣＴＧＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴ

【0341】

工程２における増幅用プライマーは、以下の配列を有するｔａｌＢ−ｕｐ−Ｐ／ｔａｌＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであった。
ｔａｌＢ−ｕｐ−Ｐ：ＡＧＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡＡＣＣＧＴＣＴＴＧＴＣＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｔａｌＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＡＧＴＧＴＣＧＧＣＣＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡＣＴＧＡＣＧＡＡＧＧＧＡＧＧＴＣＡＡＴＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0342】

上記２つの工程において、同定用プライマーは、以下の配列を有するｔａｌＢ−ｕｐ／ｔａｌＢ−ｄｏｗｎであった（正しいＰＣＲ断片は、約９００ｂｐであった）。
ｔａｌＢ−ｕｐ：ＣＧＧＡＴＧＴＡＧＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡＣ
ｔａｌＢ−ｄｏｗｎ：ＧＡＣＧＣＴＴＣＧＧＴＧＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＧ

【0343】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＬＹＣ００２のｔａｌＢ遺伝子の本来の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６で置換された菌株を、組換え大腸菌ＬＹＣ００３と命名した。

【0344】

２．組換え大腸菌ＬＹＣ００３によるリコピンの産生

【0345】

実施例１１の方法で組換え大腸菌ＬＹＣ００３の発酵培養を行い、リコピンの収量を測定した。

【0346】

結果を、表４に示す。組換え大腸菌ＬＹＣ００３により１１．０３ｍｇ／ｇのリコピンが産生され、ｓｕｃＡＢ及びｔａｌＢの組合せの調節後、リコピンの収量はＬＹＣ００１に対して７０％改善した。

【0347】

実施例１４：組換え大腸菌ＬＹＣ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、トランスアルドラーゼ遺伝子、及びコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の組合せの調節

【0348】

Ｉ．組換え大腸菌ＬＹＣ００１のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、トランスアルドラーゼ遺伝子、及びコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現強度の組合せの調節

【0349】

１．組換え大腸菌ＬＹＣ００５の構築

【0350】

組換え大腸菌ＬＹＣ００５は、組換え大腸菌ＬＹＣ００３のｓｄｈＡＢＣＤ遺伝子の本来の調節領域（配列番号：１６）が人工調節領域Ｍ１−４６で置換されたものであった。

【0351】

詳細な方法は、以下の通りであった（二段階の相同組換え）：

【0352】

工程１：出発ベクターがｐＬＯＩ４１６２プラスミドであり、増幅用プライマーがＳｄｈＡＢＣＤ−ｃａｔ−ｕｐ／ＳｄｈＡＢＣＤ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株が組換え大腸菌ＬＹＣ００２である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様にして、中間体陽性クローンを得た。

【0353】

工程２：出発菌株が組換え菌株Ｍ１−４６であり、増幅用プライマーがＳｄｈＡＢＣＤ−ｕｐ−Ｐ／ＳｄｈＡＢＣＤ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌ＬＹＣ００５を得た。

【0354】

工程１の増幅用プライマーは、以下の通りであった。
ＳｄｈＡＢＣＤ−ｃａｔ−ｕｐ：ＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＴＴＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ＳｄｈＡＢＣＤ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＣＣＣＡＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴ

【0355】

工程２における増幅用プライマーは、以下の配列を有するＳｄｈＡＢＣＤ−ｕｐ−Ｐ／ＳｄｈＡＢＣＤ−ＲＢＳであった。
ＳｄｈＡＢＣＤ−ｕｐ−Ｐ：ＡＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＴＴＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ＳｄｈＡＢＣＤ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＴＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0356】

上記２つの工程における同定用プライマーＡｐＩ−ｕｐ及びｓｄｈＡＢＣＤ−ｒは、以下の通りであった（得られる約４００ｂｐの断片が陽性であった）。
ＡｐＩ−ｕｐ：ＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｓｄｈＡＢＣＤ−ｒ：ＡＡＴＴＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣ

【0357】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＬＹＣ００３のｓｄｈＡＢＣＤ遺伝子の調節領域が人工調節領域Ｍ１−４６で置換された菌株を、組換え大腸菌ＬＹＣ００５と命名した。

【0358】

２．組換え大腸菌ＬＹＣ００５による産生

【0359】

実施例１１の方法で組換え大腸菌ＬＹＣ００５の発酵培養を行い、リコピンの収量を測定した。

【0360】

結果を、表３に示す。組換え大腸菌ＬＹＣ００５により１１．５３ｍｇ／ｇのリコピンが産生され、遺伝子ｓｕｃＡＢ、遺伝子ｔａｌＢ、及び遺伝子ｓｄｈＡＢＣＤの調節後、リコピンの収量はＬＹＣ００１に対して７６％改善した。

【0361】

【表3】

（表３：組換え大腸菌ＬＹＣ００１のＴＣＡ機能モジュール及びＰＰＰ機能モジュールの組合せの組換え、及びβ−カロテンの産生量の改善）

【0362】

実施例１５：組換え大腸菌ＬＹＣ００５の高密度発酵

【0363】

組換え大腸菌ＬＹＣ００５の高密度発酵を、７Ｌの発酵タンク（Ｌａｂｆｏｒｓ ４；Ｉｎｆｏｒｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）中で、以下の方法により行った。即ち、単一コロニーをチューブ内の４ｍＬのＬＢ培地に採取し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し、次いで、菌株溶液の１％の量、即ち、チューブ内の３００μＬの菌株溶液を、２５０ｍＬのＴｒｉフラスコ（Ｔｒｉ Ｆｌａｓｋ）内の５０ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで１２時間培養し、得られた菌株溶液を、高密度発酵用のシードとした。その高密度発酵は、合成培地を用いて行った。７Ｌの発酵タンクを、３Ｌの発酵培地、及び３００ｍＬのシード溶液で充填した。

【0364】

発酵培地の成分（ｇ／Ｌ）は、１０ｇのグリセロール、１．７ｇのクエン酸、１０．５ｇのＫＨ_２ＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ、６ｇの（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、３．４４ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、及び１０ｍＬの微量元素溶液であった。微量元素溶液の成分（ｇ／Ｌ）は、１０ｇのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５．２５ｇのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３．０ｇのＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．５ｇのＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ、０．２３ｇのＮａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ、２．０ｇのＣａＣｌ_２、及び０．１ｇの（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４であった。

【0365】

発酵は、温度３０℃、空気流量４Ｌ／分間、溶存酸素を３０％に制御して行った。溶存酸素を３０％に制御するためには、回転速度を４００ｒｐｍ〜１２００ｒｐｍで維持して、回転速度を溶存酸素と関連させる必要があり、溶存酸素が回復した（当初の炭素源が枯渇した）後は、常に１２００ｒｐｍで維持した。ｐＨは、５Ｍのアンモニアで７．０に調整した。補充培地の成分（ｇ／Ｌ）は、５００ｇのグリセロール、１５ｇのペプトン、３０ｇの酵母エキス、及び３０ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏであった。

【0366】

発酵は、シミュレートされた指数的流加モード行い、発酵を通して、グリセロールの濃度を０．５ｇ／Ｌ未満に維持し、酢酸の収量を０．２ｇ／Ｌ未満に維持し、平均供給速度を１８ｍＬ／ｈとした。１０時間の発酵後、２ｍＬの菌株溶液をを６時間毎に採取し、１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、滅菌水で洗浄し、上清を廃棄し、−２０℃の冷凍庫に保存した。含有量の測定前に、試料にアセトンを１ｍＬ加え、５５℃で暗所にて１５分間抽出し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清を採取してＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの高速液体クロマトグラフ：１２６０インフィニティ）を用いてリコピンの含有量を測定した。

【0367】

発酵の結果を、図６に示した。高密度発酵は８８時間であり、７２時間で細胞が安定期に入り、最終的なＯＤ_６００は１４９であり、乾燥細胞重量で５６．５５ｇ／Ｌの重量であった。β−カロテンの収量は、最初の８２時間は増加し続け、最大収量０．９５ｇ／Ｌであった。

【0368】

実施例１６：大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のｓｕｃＡＢ遺伝子の発現強度の改善、及びβ−カロテン及びリコピンの改善

【0369】

Ｉ．組換え菌株の大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）、大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）、及び大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）の構築

【0370】

１．組換え菌株８７３９−ＳｕｃＡＢ４６の構築

【0371】

１）組換え菌株８７３９−ＳｕｃＡＢ４６の構築

【0372】

組換え大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６は、ＡＴＣＣ８７３９のｓｕｃＡＢ遺伝子の本来の調節領域（配列番号：１５）が人工調節領域Ｍ１−４６（配列番号：１４）で置換された菌株である。

【0373】

詳細な方法は、以下の通りである（二段階の相同組換え）：

【0374】

工程１：出発ベクターがｐＬＯＩ４１６２プラスミドであり、増幅用プライマーがＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｕｐ／ＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎであり、約３４００ｂｐのＤＮＡ断片Ｉが得られ、形質転換される菌株がＡＴＣＣ８７３９である点以外は、実施例２のパート１の工程１と同様であった。

【0375】

工程２：出発菌株が組換え菌株Ｍ１−４６であり、増幅用プライマーがＳｕｃＡＢ−ｕｐ−Ｐ／ＳｕｃＡＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであり、約２００ｂｐのＤＮＡ断片ＩＩが得られ、形質転換される菌株が工程１で得られた中間体陽性クローンである点以外は、実施例２のパート１の工程２と同様にして、組換え大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６を得た。

【0376】

工程１における増幅用プライマーは、以下の通りであった。
ＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｕｐ：ＧＧＴＡＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＴＡＡＧＧＧＡＴＣＡＣＧＴＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＣＡ
ＳｕｃＡＢ−ｃａｔ−ｄｏｗｎ：ＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴ

【0377】

工程２における増幅用プライマーは、以下の配列を有するＳｕｃＡＢ−ｕｐ−Ｐ／ＳｕｃＡＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎであった。
ＳｕｃＡＢ−ｕｐ−Ｐ：ＧＧＴＡＧＴＡＴＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＧＴＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡ
ｓｕｃＡＢ−ＲＢＳ−ｄｏｗｎ：ＣＣＡＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＴＧＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＴＴ

【0378】

上記２つの工程における同定用プライマーは、以下の通りであった（約４００ｂｐの増幅断片が陽性であった）。
ＡｐＩ−ｕｐ：ＴＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣ
ｓｕｃＡＢ−ｒ：ＧＡＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＣＧＴＴＴＧＡＧ

【0379】

配列決定により正しいクローンを検証した後、ＡＴＣＣ８７３９のｓｕｃＡＢ遺伝子のプロモーターが人工調節領域Ｍ１−４６で置換された菌株を、組換え大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６と命名した。

【0380】

２）α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＳｕｃＡＢ）の酵素活性アッセイ

【0381】

ＡＴＣＣ８７３９及び組換え大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６の単一コロニーを、それぞれ、チューブ内の４ｍＬのＬＢ培地（アンピシリンの最終濃度１００μｇ／ｍＬ）に採取し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し、次いで、１％の量の菌株溶液、即ちチューブ内の１００μＬの菌株溶液を、１００ｍＬの小型振とうフラスコ内の１０ｍＬの培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで培養した。対数増殖の中期後期における発酵溶液３０ｍＬを５０ｍＬの遠心管に入れ、４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液５ｍＬで２回洗浄した後、細胞を１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液３ｍＬに懸濁し、氷タンク内に配置して２０分間超音波処理した。４℃、１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上清を酵素活性アッセイに使用した。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性アッセイ用の反応溶液は、表４に示す組成を有していた。

【0382】

【表4】

（表４：α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性アッセイ用の反応溶液の組成）

【0383】

超音波処理し、遠心分離した１０μＬの上記の上清を添加し、よく混合し、比色計セルに入れ、Ａ_３４０の変化を記録した。１０μＬのｄｄＨ_２Ｏを添加した反応バッファー溶液を、対照とした。

【0384】

酵素活性単位は、１分間にタンパク質１ｍｇ当たりで消費されるＮＡＤＨのμｍｏｌと定義した。

【0385】

大腸菌ＡＴＣＣ８７３９のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性は、０．０５７Ｕ／ｍｇタンパク質であり、組換え大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性は、０．１２Ｕ／ｍｇタンパク質であった。ｓｕｃＡＢ遺伝子の本来の調節領域を人工調節領域Ｍ１−４６で置換することで、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が１１１％改善した。

【0386】

２．大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）、大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）、大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）

【0387】

プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ（プラスミドがβ−カロテン合成遺伝子クラスターｃｒｔＥＸＹＩＢを含む）、及びプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ（実施例１１の工程により構築されたように、プラスミドがリコピン合成遺伝子クラスターｃｒｔＥＩＢを含む）を、ＡＴＣＣ８７３９及び８７３９−ＳｕｃＡＢ４６にそれぞれ電気的に形質転換した。電気的形質転換は、以下の条件で行った。まず、電気的に形質転換される大腸菌ＡＴＣＣ８７３９及び８７３９−ＳｕｃＡＢ４６のコンピテントセルを調製し、５０μＬのコンピテントセルを氷上に置き、１μＬの対応するプラスミド（約５０ｎｇ／μＬ）を添加し、氷上に２分間維持し、次いで０．２ｃｍのＢｉｏ−Ｒａｄのキュベットに移し、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）エレクトロポレーション装置を用い、電圧２．５ｋＶの電気ショック設定値で電気ショックを与えた。電気ショックの後、直ちに１ｍＬのＬＢ培地をキュベットに移し、５回振り、次いでそれをチューブに移し、７５ｒｐｍ、３０℃で２時間インキュベートした。５０μＬの菌株溶液を、アンピシリンを含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、液体培養のために５つの陽性の単一コロニーを採取し、消化による検証のために陽性のクローン化されたプラスミドを抽出した。結果から、各々のプラスミドが正常に対応する菌株に形質転換され、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）、大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）、大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）、及び大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）を得たことが示された。

【0388】

ＩＩ．β−カロテン及びリコピンの産生

【0389】

組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）、組換え大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）、組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）、及び組換え大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）の単一コロニーを、それぞれ、チューブ内の４ｍＬのＬＢ培地（アンピシリンの最終濃度１００μｇ／ｍＬ）に採取し、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養し、次いで、１％の量の菌株溶液、即ちチューブ内の１００μＬの菌株溶液を、それぞれ、１００ｍＬの小型振とうフラスコ内の１０ｍＬの培地に接種し、３０℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した。次いで、試料を採取してβ−カロテン及びリコピンの収量を測定した。β−カロテンの収量は、実施例１に示す方法で測定し、リコピンの収量は、実施例１１に示す方法で測定した。

【0390】

組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）のβ−カロテンの収量は０．５８ｍｇ／ｇであり、組換え大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔ）のβ−カロテンの収量は０．７５ｍｇ／ｇであった。ｓｕｃＡＢの調節後、β−カロテンの収量は２９％改善した。

【0391】

組換え大腸菌ＡＴＣＣ８７３９（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）のリコピンの収量は０．１２ｍｇ／ｇであり、組換え大腸菌８７３９−ＳｕｃＡＢ４６（ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ−ｃｒｔＥＩＢ）のリコピンの収量は０．３８ｍｇ／ｇであった。ｓｕｃＡＢの調節後、リコピンの収量は２１７％改善した。

【産業上の利用可能性】

【0392】

本発明が、従来使用されたものとは異なる遺伝子発現調節戦略を用いて、ＭＥＫ経路における重要な遺伝子の発現を調節することは、本発明の実験、及びそのβ−カロテンの生産能力への影響の研究から確認されている。複数の異なる強度の人工調節領域が、それらの重要な遺伝子を調節して各々の遺伝子の最適な発現強度を見出すために使用される。本発明においては、細胞のＮＡＤＰＨ及びＡＴＰの合成能を改善して、ＭＥＰ経路の効率及びテルペノイドの産生能を改善するために、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、及びトランスアルドラーゼの活性が改善した複数の組換え菌株が構築される。特に、β−カロテン及びリコピンの生産を改善するために、大腸菌において相同組換えによりα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｓｕｃＡＢの発現強度が改善された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]