特許 6337262 耐塩性乳酸菌、耐塩性乳酸菌の培養方法、及び免疫賦活剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6337262

(24)【登録日】2018年5月18日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】耐塩性乳酸菌、耐塩性乳酸菌の培養方法、及び免疫賦活剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20180528BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20180528BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20180528BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 AZNA

   A61K35/744

   A61P37/04

【請求項の数】6

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2017-175169(P2017-175169)

(22)【出願日】2017年9月12日

(65)【公開番号】特開2018-42557(P2018-42557A)

(43)【公開日】2018年3月22日

【審査請求日】2017年9月12日

(31)【優先権主張番号】特願2016-178072(P2016-178072)

(32)【優先日】2016年9月12日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02318

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02319

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02320

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02321

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02322

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02323

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02324

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】591175332

【氏名又は名称】イチビキ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504179255

【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学

(74)【代理人】

【識別番号】100088616

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邉 一平

(74)【代理人】

【識別番号】100154829

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 成

(74)【代理人】

【識別番号】100132403

【弁理士】

【氏名又は名称】永岡 儀雄

(72)【発明者】

【氏名】熊澤 利彦

(72)【発明者】

【氏名】西村 篤寿

(72)【発明者】

【氏名】浅井 紀之

(72)【発明者】

【氏名】安達 貴弘

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１１−００４７３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０２８０４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−２０８０７１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ａ６１Ｋ ３５／００−３５／７６８；３６／０６−３６／０６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有する、免疫賦活作用を有するテトラジェノコッカス・ハロフィラスである耐塩性乳酸菌。

【請求項2】

味噌の醸造工程で単離される請求項１に記載の耐塩性乳酸菌。

【請求項3】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１８の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１９の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２０の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２１の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２２の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２３の耐塩性乳酸菌、または受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２４の耐塩性乳酸菌である請求項１または２に記載の耐塩性乳酸菌。

【請求項4】

インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生を誘導する請求項１〜３のいずれか一項に記載の耐塩性乳酸菌。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の耐塩性乳酸菌を、塩分濃度１１〜１８ｗ／ｖ％である培地で培養する耐塩性乳酸菌の培養方法。

【請求項6】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の耐塩性乳酸菌を含有する免疫賦活剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、耐塩性乳酸菌、耐塩性乳酸菌の培養方法、及び免疫賦活剤に関する。更に詳しくは、食品適性が高く、製造し易く、更に、免疫賦活作用を有する耐塩性乳酸菌、耐塩性乳酸菌の培養方法、及び免疫賦活剤に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、乳酸菌は、様々な作用があることが知られており、整腸作用・腸内細菌叢改善、コレステロール低減、抗肥満効果、認知機能改善効果、美容効果などが報告されている。更に、乳酸菌は、免疫改善（アレルギー改善、がん予防、感染防御）効果の報告例も多い。

【0003】

このような乳酸菌による健康効果を期待して、食品分野では、ドリンク（飲料）、ヨーグルト、サプリメント、菓子など様々な形態で乳酸菌が配合された商品が販売されている。なお、乳酸菌は、生菌、殺菌菌体、乳酸菌生産物質などの様々な形状で効果を発揮するため、上記様々な形態の商品が存在している。

【0004】

そして、現在、免疫に関与する乳酸菌としては、具体的には、（１）プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）を直接活性化し、抗ウイルス効果等を発揮する「プラズマ乳酸菌（ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ５８０５株）」、（２）ＮＫ活性増強効果があり、風邪罹患リスクを低減することが実証されている「１０７３Ｒ−１株（ラクトバチルス・ブルガリカスＯＬＬ１０７３Ｒ−１）」、（３）マクロファージを活性化し、腸管免疫に働くことが知られている「ＦＫ−２３菌（エンテロコッカス・フェカリスＦＫ−２３）」、（４）Ｔｈ１とＴｈ２細胞に直接働きかけ、ＩｇＥ抗体を制御する働きがあり、アレルギー症状への有効性が実証されている「Ｌ−９２乳酸菌（ラクトバチルス・アシドフィルスＬ−９２株）」（例えば、特許文献１参照）などが報告されている。

【0005】

また、例えば、日本の伝統的発酵食品である味噌には、その発酵に乳酸菌が関わっている。この乳酸菌は、食塩に対して耐性のある乳酸菌であり、その主な乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラスである。日本人は、古くから味噌を食すことで耐塩性乳酸菌も摂取してきた。

【0006】

そして、耐塩性乳酸菌であるテトラジェノコッカス・ハロフィラスは、味噌の他にも、醤油、魚醤油、塩辛、古漬けなどの炭水化物を含む食塩濃度の高い食品から、広く一般に分離されている。また、特に醤油の醸造において、テトラジェノコッカス・ハロフィラスは、スターターとして用いられている。このように、テトラジェノコッカス・ハロフィラスを主とする耐塩性乳酸菌は日本の食生活に古くから関わりがある。

【0007】

この耐塩性乳酸菌に関しては、当該耐塩性乳酸菌を塩分によるストレス条件下で培養することによって二本鎖ＲＮＡを産生する。そして、この二本鎖ＲＮＡは、トル様受容体３（ＴＲＬ３）を介して樹状細胞に作用し、免疫細胞を活性化することが報告されている（特許文献２、３参照）。

【0008】

また、耐塩性乳酸菌の一種として、Ｔｈ１型サイトカインであるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）及びインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）の産生誘発能を有し、且つＩｇＥの産生抑制能を有するものが報告されている（特許文献４参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開２００４−０２６７２９号公報

【特許文献2】特許第５０９９６４９号公報

【特許文献3】特許第５３１２３２２号公報

【特許文献4】特開２０１１−００４７３１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

しかしながら、特許文献１に記載の乳酸菌は、生育環境を十分に整える必要があったり、多量に製造する際に殺菌できる大規模タンクなどの設備が必要であったり、培養液の処理が必要であったりするなど製造に手間やコストがかかるという問題がある。

【0011】

また、特許文献２，３に記載の二本鎖ＲＮＡは、加熱や乳酸菌の死滅により壊れやすいため、工業レベルでの製造においては高度な技術（例えば、製造段階において加熱されないように十分な温度管理が必要になり、また、乳酸菌の死滅による二本鎖ＲＮＡの損傷を和らげるための制御装置が必要になるなど）が必要となる。

【0012】

特許文献４に記載の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−１２及びインターフェロン−γの産生誘発能などを有するものである。この耐塩性乳酸菌は、味噌由来のものであるため食品適性が高く、殺菌と保温ができる設備があればよいので培養が簡単であることから製造し易いと考えられる。

【0013】

このように耐塩性乳酸菌は、食品適性が高く、製造し易いものであるため、耐塩性乳酸菌の更なる効能、効果を見出すことができれば、当該効能、効果を有する乳酸菌を、容易に製造できることになる。

【0014】

本発明は、Ｂ細胞に直接作用することによってＢ細胞の生存能と活性化能を向上させることで免疫賦活効果を発揮する耐塩性乳酸菌を提供するものである。

【0015】

そして、本発明の耐塩性乳酸菌は、食品適性が高く（即ち、安全性が高く）、培養が簡単であるため製造し易いものでもある。

【0016】

更には、本発明は、耐塩性スタフィロコッカス属細菌よりも増菌（増殖）速度が速い耐塩性乳酸菌を提供するものである。

【0017】

具体的には、商業的な乳酸菌製造においては、１８ｗ／ｖ％超の塩分濃度で培養すると、汚染菌が増菌しないことになるが、培養日数が長くなり、また、最終収量も低くなる（例えば、１．０×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ程度）。そのため、１８ｗ／ｖ％超の塩分濃度で培養する方法は、必ずしも、安価で且つ効率的という条件ではない。一方で、培養日数を短縮し、収量を上げることを目的として、塩分濃度を１８ｗ／ｖ％超から１２〜１４ｗ／ｖ％に下げると、耐塩性の高い汚染菌（特に、スタフィロコッカス属細菌の一部のもの（耐塩性スタフィロコッカス属細菌））が増殖してしまうという問題点がある。

【0018】

そこで、１２〜１４ｗ／ｖ％のような１８ｗ／ｖ％以下の塩分濃度において、耐塩性スタフィロコッカス属細菌よりも増菌速度が速い耐塩性乳酸菌（テトラジェノコッカス属）を見出すことが望まれていた。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明によれば、以下に示す耐塩性乳酸菌、耐塩性乳酸菌の培養方法、及び免疫賦活剤が提供される。

【0020】

［１］ Ｂ細胞の生存能を向上させる能力及びＢ細胞の活性化能を有する、免疫賦活作用を有するテトラジェノコッカス・ハロフィラスである耐塩性乳酸菌。

【0021】

［２］ 味噌の醸造工程で単離される前記［１］に記載の耐塩性乳酸菌。

【0022】

［３］ 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１８の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１９の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２０の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２１の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２２の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２３の耐塩性乳酸菌、または受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２４の耐塩性乳酸菌である前記［１］または［２］に記載の耐塩性乳酸菌。

【0023】

［４］ インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生を誘導する前記［１］〜［３］のいずれかに記載の耐塩性乳酸菌。

【0024】

［５］ 前記［１］〜［４］のいずれかに記載の耐塩性乳酸菌を、塩分濃度１１〜１８ｗ／ｖ％である培地で培養する耐塩性乳酸菌の培養方法。

【0025】

［６］ 前記［１］〜［４］のいずれかに記載の耐塩性乳酸菌を含有する免疫賦活剤。

【発明の効果】

【0026】

本発明の耐塩性乳酸菌は、食品適性（例えば味噌由来の乳酸菌とすることができる）が高く（即ち、安全性が高く）、培養が簡単であるため製造し易く、更に、免疫賦活作用を有するものである。

【0027】

本発明の耐塩性乳酸菌の培養方法によれば、本発明の耐塩性乳酸菌を簡単且つ良好に培養することができる。

【0028】

本発明の免疫賦活剤は、食品適性（例えば味噌由来の乳酸菌とすることができる）が高く（即ち、安全性が高く）、培養が簡単であるため製造し易く、更に、免疫賦活作用を有するものである。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】実施例１における脾臓Ｂ細胞の生存能の結果を示すグラフである。

【図2】実施例１における脾臓Ｂ細胞の活性化能の結果を示すグラフである。

【図3】実施例２における全脾臓細胞の生存能の結果を示すグラフである。

【図4】実施例２における脾臓Ｂ細胞の生存能の結果を示すグラフである。

【図5】実施例２における脾臓Ｔ細胞の生存能の結果を示すグラフである。

【図6】実施例２における脾臓Ｂ細胞の活性化能の結果を示すグラフである。

【図7】実施例２における脾臓Ｔ細胞の活性化能の結果を示すグラフである。

【図8】実施例５におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。

【図9】実施例５におけるインターロイキン−２２の測定試験の結果を示すグラフである。

【図10】実施例５におけるインターロイキン−２２の測定試験の結果を示すグラフである。

【図11】実施例５におけるインターロイキン−１０の測定試験の結果を示すグラフである。

【図12】実施例５におけるインターロイキン−１０の測定試験の結果を示すグラフである。

【図13】実施例５におけるインターフェロン−γの測定試験の結果を示すグラフである。

【図14】実施例５におけるインターフェロン−γの測定試験の結果を示すグラフである。

【図15】実施例５におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。

【図16】実施例５におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。

【図17】実施例５におけるフローサイトメトリーの結果を示す図である。

【図18】実施例６におけるマウスの血清ＩｇＡの測定結果を示すグラフである。

【図19】実施例６におけるマウスの血清ＩｇＡの測定結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明は以下の実施の形態に限定されるものではない。即ち、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、当業者の通常の知識に基づいて、以下の実施の形態に対し適宜変更、改良等が加えられたものも本発明の範囲に属することが理解されるべきである。

【0031】

［１］耐塩性乳酸菌：
本発明の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能を向上させる能力（以下、「Ｂ細胞の生存能」と記す場合がある）及びＢ細胞の活性化能を有するものである。本発明の耐塩性乳酸菌は、例えば、味噌の醸造工程で単離されたものとすることができる。なお、本発明における耐塩性乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラスである。

【0032】

このような耐塩性乳酸菌は、安全性が高く（即ち、食品適性が高く）、培養が簡単であるため製造し易く、Ｂ細胞に直接作用することによってＢ細胞における生存能及び活性化能を向上させることができ、免疫系を賦活化することができる（即ち、免疫賦活作用を有する）。なお、従来、耐塩性乳酸菌の中には、リンパ球Ｔ細胞や樹状細胞に作用するものが知られている。

【0033】

ここで、Ｂ細胞は、液性免疫に中心的な役割を果たし、病原体など異物（抗原）に対して抗体を産生できる唯一の細胞であるが、乳酸菌による作用に関してはほとんど知られていない。また、Ｂ細胞は、Ｔ細胞に抗原を提示する細胞で、活性化Ｔ細胞の維持に必要不可欠な細胞であることが知られている。そのため、Ｂ細胞の働きを強めることは、Ｔ細胞の働きをも補強することとなり、免疫賦活効果を免疫系の細胞全体で強めることにもなる。本発明において「Ｂ細胞の活性化能」とは、抗体産生の能力と抗原提示の能力の両方が活性化することをいう。

【0034】

そして、抗体を産生して異物を攻撃できるＢ細胞の働きを人為的に強化するなど直接コントロールできることができれば、抗体による働きが影響するアレルギー疾患や感染症、自己免疫疾患などの免疫系疾患の予防や緩和、治療につながっていくことが期待できる。

【0035】

本明細書において「Ｂ細胞の生存能を有する」とは、実験用マウス脾臓細胞から単離したＢ細胞（脾臓Ｂ細胞）を用い、乳酸菌を添加していない試料中における、総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合を基準（基準値１００）としたとき、乳酸菌を添加した試料中における、総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合の値（測定値）が、１００超となることをいう（但し、上記基準値及び測定値は、それぞれ、平均値から標準誤差を差し引いた値である）。抗Ｂ２２０抗体に反応する細胞をＢ細胞とし、その「総細胞の数」は、フローサイトメトリーにより定量して求められる。「生存するＢ細胞（生細胞）の数」は、総細胞の数から、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液で染色された細胞（死細胞）の数を差し引いた値である。

【0036】

なお、「Ｂ細胞の生存能を有する」とは、上記の通りであるが、具体的には、実施例１に示す方法（即ち、（２）Ｂ細胞の調製、（３）細胞培養、（４）Ｂ細胞の生存能及び活性化能の測定の「Ｂ細胞の生存能」の手順）によって得られる値（測定値）が、１００超となることをいう。

【0037】

本明細書において「Ｂ細胞の活性化能を有する」とは、脾臓細胞から単離したＢ細胞（脾臓Ｂ細胞）を用い、乳酸菌を添加していない試料中における、活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比を基準（基準値１００）としたとき、乳酸菌を添加した試料中における、活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比の値（測定値）が、１００超となることをいう（但し、上記基準値及び測定値は、それぞれ、平均値から標準誤差を差し引いた値である）。なお、「活性化しているＢ細胞の数」は、抗Ｂ２２０抗体と抗ＣＤ８６抗体の両方に反応した細胞の数をフローサイトメトリーにより測定して求められる。「活性化していないＢ細胞の数」は、抗ＣＤ８６抗体とは反応せずに、抗Ｂ２２０抗体と反応した細胞の数をフローサイトメトリーにより測定して求められる。なお、これらの細胞は、生細胞（ＰＩで染色されない細胞）であることを前提としている。

【0038】

なお、「Ｂ細胞の活性化能を有する」とは、上記の通りであるが、具体的には、実施例１に示す方法（即ち、（２）Ｂ細胞の調製、（３）細胞培養、（４）Ｂ細胞の生存能及び活性化能の測定の「Ｂ細胞の活性化能」の手順）によって得られる値（測定値）が、１００超となることをいう。

【0039】

また、「味噌の醸造工程で単離される」耐塩性乳酸菌とは、味噌醸造工程における「蔵」、「室（ムロ）」、「桶」などに定着している耐塩性乳酸菌のことをいう。更には、味噌の仕込みから熟成工程において増殖可能な菌のことをいう。この「味噌の醸造工程で単離される」耐塩性乳酸菌は、味噌に含まれる耐塩性の乳酸菌（即ち、味噌乳酸菌）ということもでき、別言すれば、味噌由来の耐塩性の乳酸菌（即ち、味噌を起源とする耐塩性の乳酸菌）のことである。なお、本発明において、「味噌の醸造工程で単離される」耐塩性乳酸菌とは、味噌の醸造工程で単離したそのものに限らず、味噌の醸造工程で単離され、その後に培養（継代培養）されたものも含む。

【0040】

従来、乳酸菌は、死菌体であっても免疫賦活作用を有することが知られており、この作用（免疫賦活化機能）を活用した商品が広く開発されている。

【0041】

この乳酸菌は、遠心分離や乾燥などで濃縮しやすく、菌数も安定させやすく、ハンドリングも比較的容易であること等の利点がある。

【0042】

実際に免疫賦活効果を得るには多量の菌体を摂取する必要があるが、多量の菌体を調製するには、その培養のための大規模タンクが必須となってくるため、高額な設備投資が必要となる。また、菌体の濃縮や精製、オートクレーブ相当の殺菌など培養液の処理も必要であるなどの課題がある。

【0043】

そこで、発明者らは、食品適性が高く、製造しやすく、免疫を刺激し得る乳酸菌について鋭意研究を行った。そして、耐塩性乳酸菌（例えば味噌の醸造工程で単離されるもの）は、食品適性が高く、簡易な培養設備で多量に製造可能であり簡単に製造することができるため有用であることに着目した。

【0044】

また、発明者らは、耐塩性乳酸菌を用いて、生体防御に必要な抗体を産生するＢ細胞の生存能及び活性化能を向上させることができれば、免疫系を賦活化することができ、更に、免疫応答に有効に働き、非常に有用であることに着目した。

【0045】

つまり、耐塩性乳酸菌は、味噌や醤油などの食品に含まれているものであるため、食品適性が高い。そして、本発明の耐塩性乳酸菌としては、例えば、味噌の醸造工程で単離されたもの（味噌乳酸菌）を用いることができ、この味噌乳酸菌も食品適性が高いものである。また、本発明の耐塩性乳酸菌は、後述する培養方法で示すように塩分濃度が高い培地で培養可能であり、汚染菌が増殖し難い環境下で簡単に生育することができる。更に好ましくは、耐塩性スタフィロコッカス属細菌よりも増菌速度が速い耐塩性乳酸菌であれば、塩分濃度を高くする場合（塩分濃度１８ｗ／ｖ％超）に比べて、培養日数を短縮でき、かつ、最終収量が上がる。その結果、簡易な培養設備でより効率的に且つ多量に耐塩性乳酸菌を製造することができ、一般の乳酸菌の培養と比べて培養装置に対する設備投資を抑えることができる。

【0046】

本発明の耐塩性乳酸菌は、より具体的には、耐塩性スタフィロコッカス属細菌（ＳＮ−２８２０株）の増殖倍率よりも大きな増殖倍率であるものとすることができる。このような場合、培養日数を短縮でき、かつ、最終収量が高くなる。その結果、簡易な培養設備でより効率的に且つ多量に耐塩性乳酸菌を製造することができ、一般の乳酸菌の培養と比べて培養装置に対する設備投資を抑えることができる。なお、本明細書において「増殖倍率」は、実施例４の条件で培養した場合において、式：「２０時間培養後の菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）／初発菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）」で算出される値を意味する。

【0047】

ここで、免疫細胞は、外部からの病原体に対抗する身体の防御システム、免疫系の働きを担っている。そして、免疫細胞の主体は、白血球であり、白血球は、マクロファージ、リンパ球、顆粒球から構成されている。これらの中で、リンパ球細胞は、免疫機能の中心的役割を果たしており、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）とそれぞれ重要な役割を果たす細胞で構成されている。リンパ球細胞のうち、Ｂ細胞は、体内に侵入した病原体を排除するために必要な抗体を産生する唯一の細胞であり、体液性免疫において中心的な役割を果たす。また、Ｂ細胞は、Ｔ細胞に抗原の情報伝達をする抗原提示細胞の１つとしても知られている。

【0048】

本発明の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能及び活性化能を有するものであればどのような菌でも良い。例えば、本発明の耐塩性乳酸菌は、味噌の醸造工程で単離されるテトラジェノコッカス・ハロフィラスとすることができる。

【0049】

本発明の耐塩性乳酸菌は、ヒスタミン産生能が低い乳酸菌であることが好ましい。

【0050】

また、本発明の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生を誘導するものであることが好ましい。このような耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２の産生を誘導するため、角化細胞を増殖し、皮膚のターンオーバーを促進させることができることから、美肌素材、抗菌素材などの用途に好適に用いることが期待できる。インターロイキン−２２は、インターロイキン−１０ファミリーに属するサイトカインであり、皮膚や腸管の粘膜バリア防御、組織修復、細胞生存・増殖に関わるものであり、アトピー性皮膚炎などの皮膚疾患や、脂肪肝疾患、Ｃ．Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））などによる感染症の予防・治療などの用途が期待できる。

【0051】

特に、本発明の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞からの、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生を誘導するものであることが好ましい。インターフェロン−γは、ウイルス等を攻撃するキラーＴ細胞やマクロファージの細胞性免疫能を増大させることが知られており、免疫賦活化に作用することが知られている。インターロイキン−１０は、強力な抗炎症作用を有するサイトカインであり、Ｂ細胞のうち、制御性Ｂ細胞により産生される。この制御性Ｂ細胞は、炎症や自己免疫疾患、感染免疫などに対する抑制能があることが報告されており、不適切な免疫反応を抑制する機能（免疫寛容）がある。このように、本発明の耐塩性乳酸菌によってＢ細胞を刺激することで、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γのような様々なサイトカインの産生が誘導され、その結果、適切な免疫応答が亢進するため、生体防御が増強されるという利点がある。

【0052】

［１−１］好ましい耐塩性乳酸菌：
本発明の耐塩性乳酸菌は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１８（以下、「Ｎｏ．１の菌株」または単に「Ｎｏ．１」と記す場合がある）の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１９（以下、「Ｎｏ．３の菌株」または単に「Ｎｏ．３」と記す場合がある）の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２０（以下、「Ｎｏ．１３の菌株」または単に「Ｎｏ．１３」と記す場合がある）の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２１（以下、「Ｎｏ．１５の菌株」または単に「Ｎｏ．１５」と記す場合がある）の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２２（以下、「Ｎｏ．１９の菌株」または単に「Ｎｏ．１９」と記す場合がある）の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２３（以下、「Ｎｏ．３０の菌株」または単に「Ｎｏ．３０」と記す場合がある）の耐塩性乳酸菌、及び受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２４（以下、「Ｎｏ．３１の菌株」または単に「Ｎｏ．３１」と記す場合がある）の耐塩性乳酸菌からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。更には、本発明の耐塩性乳酸菌は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１８の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１９の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２０の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２１の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２２の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２３の耐塩性乳酸菌、または受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２４の耐塩性乳酸菌である。

【0053】

これらの耐塩性乳酸菌は、例えば味噌由来の乳酸菌（即ち、味噌乳酸菌）であるため安全性が高く、生育が簡単であるため製造し易く、更に、Ｂ細胞に直接作用してＢ細胞における生存能及び活性化能を実現することができ、良好に免疫系を賦活化することができる（即ち、良好な免疫賦活作用を有する）。上記の耐塩性乳酸菌は、Ｔ細胞にも作用することができ、更に、樹状細胞などにも作用することが考えられる。更に、上記の耐塩性乳酸菌は、血清中のＩｇＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ）濃度を増大させることができ、免疫賦活化能を向上させることができる。なお、上述のＮｏ．１、３、１３、１５、１９、３０、３１の菌株の耐塩性乳酸菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラスである。

【0054】

なお、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１８の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１９の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２０の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２１の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２２の耐塩性乳酸菌、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２３の耐塩性乳酸菌、及び受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２４の耐塩性乳酸菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託されている。

【0055】

「好ましい耐塩性乳酸菌」の中でも、Ｎｏ．１の菌株、Ｎｏ．１３の菌株、Ｎｏ．１９の菌株、及びＮｏ．３０の菌株の耐塩性乳酸菌は、各細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞を含む）の生存能が総じて優れる（実施例２参照）。そのため、Ｎｏ．１の菌株、Ｎｏ．１３の菌株、Ｎｏ．１９の菌株、及びＮｏ．３０の菌株の耐塩性乳酸菌によれば、免疫細胞全体が増えることにより免疫賦活作用が発揮され、免疫賦活剤の有効成分として好適に用いることができる。

【0056】

「好ましい耐塩性乳酸菌」のうち、Ｎｏ．１の菌株、Ｎｏ．３１の菌株の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能及びＢ細胞の活性化能が優れる。特に、Ｎｏ．３１の菌株の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞の活性化能が非常に高い。そして、Ｎｏ．１の菌株、Ｎｏ．３１の菌株の耐塩性乳酸菌は、効率性の高い免疫賦活剤の有効成分として用いることができる。

【0057】

本発明の耐塩性乳酸菌は、Ｎｏ．１の菌株、Ｎｏ．３の菌株、Ｎｏ．１３の菌株、Ｎｏ．１５の菌株、Ｎｏ．３０の菌株、及びＮｏ．３１の菌株の耐塩性乳酸菌から選択されるいずれか一種であることも好ましい。これらの耐塩性乳酸菌は、培養日数が短く、かつ、最終収量が高い。より具体的には、これらの耐塩性乳酸菌は、耐塩性スタフィロコッカス属細菌（ＳＮ−２８２０株）の増殖倍率よりも大きな増殖倍率であるものとする。そのため、Ｎｏ．１９の菌株の耐塩性乳酸菌に比べて、培養日数を短縮でき、かつ、最終収量が高くなる。その結果、より簡易な培養設備でより効率的に且つ多量に製造することができる。なお、Ｎｏ．１、３、１３、１５、１９、３０、３１の菌株の耐塩性乳酸菌のうち、非常に優れた免疫賦活効果を有し、且つ、簡易な培養設備での製造が適している菌は、Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌である。

【0058】

［１−１ａ］受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１８の耐塩性乳酸菌：
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１８（Ｎｏ．１の菌株）の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能及びＢ細胞の活性化能の両方が非常に優れる。そのため、Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌によれば、非常に優れた免疫賦活作用が発揮される。

【0059】

また、Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生誘発能に優れている。このＮｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２の産生誘発能に優れているため、上述の通り、角化細胞を増殖し、皮膚のターンオーバーを促進させることができる。そのため、Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌は、美肌素材、抗菌素材などの用途に好適に用いることができる。なお、Ｎｏ．３、１３、１５、１９、３０、３１の菌株の耐塩性乳酸菌についてもインターロイキン−２２の産生誘発能に優れており、Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌と同様に、美肌素材、抗菌素材などの用途に好適に用いることができる。

【0060】

特に、Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γのうち、インターロイキン−１０の産生誘発能に優れ、一方で、これらのうち、インターフェロン−γの産生誘発能は弱い（図９〜図１４参照）。そのため、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの中でも、インターロイキン−１０を多く産生させたい場合に、Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌を利用することが非常に有効であると考えられる。ここで、免疫系においては、免疫賦活機能と免疫寛容機能との両方がバランス良く働くことが１つの重要な要素である。このような観点から、Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌によれば、インターフェロン−γによる免疫賦活化能が向上し、一方で、インターロイキン−１０ファミリーに属するインターロイキン−１０及びインターロイキン−２２によって不適切な免疫反応を抑制する機能（免疫寛容）を発揮させることができ、全体として免疫賦活機能と免疫寛容機能との両方がバランス良く働くことになる。このようにＮｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌を用いると、インターロイキン−２２及びインターフェロン−γだけでなく、強力な抗炎症性を有するサイトカインであるインターロイキン−１０も十分に作用することになり、免疫系を成熟させ、その結果、免疫系全体がバランス良く機能し、病原体などに対する適切な免疫応答機能を高めることが期待できる。

【0061】

Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌は、血清中のＩｇＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ）濃度を増大させることができる（表７、図１８参照）。このＩｇＡは、粘膜面での局所免疫に関与するため、例えばＮｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌を利用することで、ＩｇＡ濃度も併せて増大させ、免疫賦活化能を向上させることができる。

【0062】

Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−１２の発現にはＢ細胞を介して直接的に影響を与えないものである。即ち、Ｎｏ．１の菌株の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞を介するインターロイキン−１２の産生誘発能を有しない（表３参照）。

【0063】

［１−１ｂ］受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１９〜ＢＰ−０２３２２の耐塩性乳酸菌：
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１９〜ＢＰ−０２３２２（Ｎｏ．３の菌株、Ｎｏ．１３の菌株、Ｎｏ．１５の菌株、Ｎｏ．１９の菌株）の耐塩性乳酸菌についても、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生誘発能に優れている。特に、これらの耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γのうち、インターフェロン−γの産生誘発能に優れている。そのため、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの中でも、インターフェロン−γを多く産生させたい場合に、これらの耐塩性乳酸菌を利用することが有効である。インターフェロン−γは、ＮＫ細胞の増殖を促進したり、ＮＫ細胞の攻撃力を高めたりする作用があるので、このようなインターフェロン−γの働きも強めたい場合にこれらの菌株の耐塩性乳酸菌を利用することができる。

【0064】

［１−１ｃ］受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２３の耐塩性乳酸菌：
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２３（Ｎｏ．３０の菌株）の耐塩性乳酸菌についても、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生誘発能に優れている。特に、Ｎｏ．３０の菌株の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γのうち、インターフェロン−γの産生誘発能に優れている。

【0065】

更に、このＮｏ．３０の菌株の耐塩性乳酸菌は、血清中のＩｇＡ濃度を増大させることができる（表８、図１９参照）。例えばＮｏ．３０の菌株の耐塩性乳酸菌を利用することで、ＩｇＡ濃度も併せて増大させ、免疫賦活化能を向上させることができる。

【0066】

Ｎｏ．３０の菌株の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの中でも、インターフェロン−γを多く産生させるとともに、血清中のＩｇＡ濃度を増大させたい場合に利用することが有効であると考えられる。

【0067】

［１−１ｄ］受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２４の耐塩性乳酸菌：
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２４（Ｎｏ．３１の菌株）の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生誘発能に非常に優れている。つまり、Ｎｏ．３１の菌株の耐塩性乳酸菌は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの全てをより多く産生させたい場合に利用することが有効であると考えられる。

【0068】

［２］耐塩性乳酸菌の培養方法：
本発明の耐塩性乳酸菌の培養方法は、本発明の耐塩性乳酸菌を、塩分濃度が１１〜１８ｗ／ｖ％である培地で培養する。なお、「ｗ／ｖ％」は、（質量（ｇ）／体積（１００ｍＬ））％を意味する。

【0069】

このような条件で培養することにより、本発明の耐塩性乳酸菌を簡単且つ良好に培養することができる。具体的には、商業的な乳酸菌製造においては、１８ｗ／ｖ％超の塩分濃度で培養すると、汚染菌が増菌しないことになるが、培養日数が長くなり、また、最終収量も低くなる（例えば、１．０×１０^９ｃｆｕ／ｍｌ程度）。そのため、１８ｗ／ｖ％超の塩分濃度で培養する方法は、必ずしも、安価で且つ効率的という条件ではない。一方で、培養日数を短縮し、収量を上げることを目的として、培地の塩分濃度を１８ｗ／ｖ％超から１２〜１４ｗ／ｖ％に下げると、耐塩性の高い汚染菌（特に、スタフィロコッカス属細菌の一部のもの（耐塩性スタフィロコッカス属細菌））が増殖してしまうという問題点がある。

【0070】

そこで、本発明の耐塩性乳酸菌を上記塩分濃度の培地で培養することで、耐塩性を有さない汚染菌については増菌を防止し、一方で、耐塩性スタフィロコッカス属細菌よりも増菌速度が速くなるため、耐塩性を有する汚染菌が増菌する前に培養を終了させることができる。そのため、本発明の培養方法によれば、簡易な培養設備でより効率的に且つ多量に耐塩性乳酸菌を製造することができ、一般の乳酸菌の培養と比べて培養装置に対する設備投資を抑えることができる。

【0071】

培地としては、窒素源及び炭素源を含有するものを用いることができる。

【0072】

窒素源としては、特に制限はなく、例えば、醤油、味噌、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等を挙げることができる。また、炭素源としては、特に制限はなく、例えば、グルコース、麹消化液、米の糖化液、スクロース、澱粉、粉飴、グリセリン等を挙げることができる。更に、窒素源および炭素源の他に、無機質として、例えば、酢酸ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄等の無機塩などを含有していてもよく、ビタミン類などを含有していてもよい。

【0073】

培地の塩分濃度は、１１〜１８ｗ／ｖ％とすることが好ましく、１１〜１６ｗ／ｖ％とすることが更に好ましく、１２〜１４ｗ／ｖ％とすることが特に好ましい。培地の塩分濃度は、１８ｗ／ｖ％超であると、雑菌（汚染菌）よりも耐塩性乳酸菌が旺盛に増殖する。しかし、塩分濃度が１８ｗ／ｖ％超であると、耐塩性乳酸菌の増殖速度が他の塩分濃度の場合に比して遅くなり、かつ、最終収量が低くなるという不具合がある。

【0074】

培養温度は、２０〜４０℃が好ましく、２８〜３７℃が更に好ましい。培養時間は、２４〜１２０時間程度であり、培養中に攪拌してもよい。また、培地のｐＨは、５〜９が好ましく、６〜７が更に好ましい。

【0075】

本方法によれば、培地に食塩が高濃度に含まれるため、大腸菌や土壌細菌などの汚染菌が増菌し難い。ここで、培養時間を短縮し、最終収量を上げるために、培地の塩分濃度を、１８ｗ／ｖ％から１２〜１４ｗ／ｖ％に下げると、耐塩性スタフィロコッカス属細菌が増菌する可能性がある。しかし、塩分濃度を下げたとしても、耐塩性スタフィロコッカス属細菌よりも増菌速度が速ければ、汚染菌の影響を受けないことになる。本発明の方法によれば、耐塩性を有さない汚染菌を制御しつつ、耐塩性を有する汚染菌に対しては、その増菌速度が速い耐塩性乳酸菌を採用することで、容易且つ良好に耐塩性乳酸菌を培養することができる。

【0076】

本発明の培養方法によれば、本発明の耐塩性乳酸菌を、密閉系の無菌培養装置を用いることなく、開放系の培養装置（但し、殺菌・保温ができるもの）でも十分に培養することができる。

【0077】

［３］耐塩性乳酸菌の調製方法：
本発明の耐塩性乳酸菌は、培養後、殺菌などの処理を行って調製することができる。具体的には、培養終了後、遠心分離などの手段により食塩を含む培地成分を取り除き、洗浄・精製する。そして、加熱殺菌を行い、その後、凍結乾燥・減圧乾燥・熱風乾燥などの手段により乾燥・濃縮する。このようにして、本発明の耐塩性乳酸菌を調製することができる。

【0078】

なお、加熱殺菌は、特に制限はないが、具体的にはオートクレーブ殺菌（１２１℃、２０分）または同程度の殺菌（１０５℃、３０分）が好ましい。

【0079】

［４］免疫賦活剤：
本発明の免疫賦活剤は、本発明の耐塩性乳酸菌を含有するものである。この免疫賦活剤は、耐塩性乳酸菌（例えば味噌由来の耐塩性乳酸菌）を含有することから安全性が高く（食品適性が高く）、耐塩性乳酸菌を用いるために製造し易い。そして、本発明の耐塩性乳酸菌を含有することによって、免疫賦活作用が発揮される。

【0080】

本発明の免疫賦活剤は、本発明の耐塩性乳酸菌を有効成分として含有する限りその含有割合は特に制限はない。なお、本発明の免疫賦活剤は、本発明の耐塩性乳酸菌以外にその他の成分として、難消化性デキストリン、オリゴ糖、デキストリン、二酸化ケイ素などを含有することができる。

【0081】

なお、本発明の免疫賦活剤は、本発明の耐塩性乳酸菌の培養方法で得られる培養物、菌体または菌体成分を含有してもよい。

【0082】

なお、本発明の免疫賦活剤は、そのもの自体を、飲食品、サプリメント、医薬品などとしてもよいし、飲食品、サプリメント、医薬品などに添加して用いることもできる。飲食品としては、特に制限はなく、例えば、味噌、即席味噌汁、調理味噌（味噌加工品）、金山寺味噌などのなめ味噌、醤油、つゆ、調味ソース、調味たれ、漬物（浅漬け）の素などの加工調味料、ご飯の素などの調味食品、惣菜、あま酒（糀飲料）、ぜんざい等が挙げられる。

【実施例】

【0083】

以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0084】

（実施例１）
＜Ｂ細胞の生存能及び活性化能の測定試験＞
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓由来のＢ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）に、殺菌処理を施した、味噌の醸造工程で単離された（即ち、味噌由来のものである）テトラジェノコッカス・ハロフィラス（即ち、耐塩性乳酸菌）の菌体を添加して細胞培養し、脾臓Ｂ細胞の生存能及び脾臓Ｂ細胞の活性化能を調査した。以下、本実施例では「脾臓Ｂ細胞」を単に「Ｂ細胞」と記す場合がある。

【0085】

（１）乳酸菌懸濁液の調製：
味噌の醸造工程から単離した乳酸菌の５６株について、それぞれ、「１０ＳＧ１０Ｎ培地」を用いて、３０℃、４〜７日間培養した。その後、上記５６株の全てについて１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌処理をして菌株毎の培養液を得た。

【0086】

なお、「１０ＳＧ１０Ｎ培地」は、醤油（イチビキ社製の商品名「こいくちしょうゆ」）１０ｖ／ｖ％、ぶどう糖１．０ｗ／ｖ％、酵母エキス１．０ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酢酸ナトリウム３水和物０．２ｗ／ｖ％、塩化ナトリウム１０ｗ／ｖ％、「Ｔｗｅｅｎ８０（ポリ(オキシエチレン)ソルビタンモノオレアート）」０．００２５ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２ｗ／ｖ％、硫酸マンガン４水和物０．００１ｗ／ｖ％、及び硫酸鉄７水和物０．００１ｗ／ｖ％を混合し、ｐＨ６．８に調整してオートクレーブしたものである。なお、「ｖ／ｖ％」は、（体積／体積）％を示す。

【0087】

次に、滅菌処理して得られた各培養液を、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。その後、それぞれ集菌して、蒸留水で３回洗浄した後、蒸留水で懸濁して凍結乾燥して菌体（５６株分）を得た。その後、凍結乾燥した菌体のそれぞれについて、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で０．１ｍｇ／ｍＬになるように懸濁して、５６株分の乳酸菌懸濁液を調製した。

【0088】

（２）Ｂ細胞の調製：
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に集め、０．５ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加えて細胞を懸濁した。その後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を０．５ｍＬ加えて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１回洗浄した。

【0089】

基本培地で懸濁後、ビオチン−抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えて、冷蔵（５℃）して３０分間静置した。なお、基本培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（培地中に１００Ｕ／ｍＬ−１００μｇ／ｍＬ、ナカライテスク社製）及び２−メルカプトエタノール（培地中に５０μＭ、ナカライテスク社製）を加えた、Ｌ−グルタミン酸（０．３ｇ／Ｌ）加ＲＰＭＩ １６４０（ナカライテスク社製）に、５５℃で３０分間加熱して非働化した牛胎児血清（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を培地中で９（ｗ／ｖ）％になるように添加したものを用いた。

【0090】

静置後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で懸濁した。その後、磁気ビーズであるＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｌｕｓ・ＤＭ（日本ＢＤ社製）を加えて、冷蔵（５℃）して３０分間静置した。

【0091】

その後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再度懸濁して、ラウンドチューブに移した。

【0092】

その後、ＢＤ ＩＭａｇ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（日本ＢＤ社製）にて細胞分離を行い、磁石に引き寄せられている細胞をポジティブフラクションとして回収した。回収したポジティブフラクションを、「Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）」として、再度基本培地に懸濁して、Ｂ細胞浮遊液を調製した。なお、得られたＢ細胞浮遊液は、血球計算板を用いて細胞数を計測した。

【0093】

（３）細胞培養：
２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＢ細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後のＢ細胞浮遊液を、４８ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に０．５ｍＬずつ播種して、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ／ｗｅｌｌとした。その後、各乳酸菌懸濁液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を５μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２日間培養した。なお、調整後のＢ細胞浮遊液に菌体（乳酸菌懸濁液）を添加せずに、菌体を添加した水準と同一条件（３７℃、５％ＣＯ_２の条件）で２日間培養したものをコントロールとした。

【0094】

（４）Ｂ細胞の生存能及び活性化能の測定：
培養後、フローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製 ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、各試料（細胞培養液）について生存能及び活性化能の測定を行った。

【0095】

まず、４８ｗｅｌｌマイクロプレートで培養していた細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．２ｍＬに懸濁し、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１μＬずつ加え、冷蔵（５℃）で６０分間静置した。

【0096】

静置後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ｍＬに懸濁した。その後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液（コスモバイオ社製）を０．５μＬ加えて測定用試料を得た。この測定用試料についてフローサイトメトリーを用いた測定を行った。なお、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト ＦｌｏｗＪｏ （ＦｌｏｗＪｏ， ＬＬＣ社製）を用いた。なお、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液を用いたのは、この染色液は、生細胞の細胞膜を透過しない試薬であり、死細胞を染色できるためである。

【0097】

（Ｂ細胞の生存能）
測定用試料中において、カウントされた細胞数から、添加した乳酸菌の数（乳酸菌懸濁液中の菌体の数）を差し引いた数を総細胞の数とした。また、測定用試料のうち、ＰＩ検出された細胞（即ち、ＰＩ核染色液で染色された細胞）を死細胞とみなし、その数をカウントし、総細胞の数と死細胞の数との差を生細胞の数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合（生細胞の数／総細胞の数×１００）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の生存能（細胞生存能）の値とした。なお、細胞生存能の試験は、繰り返して行い、Ｂ細胞の生存能の値について平均値（Ｘ⁻）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を図１及び表１に示す。なお、図１〜図７、図９〜図１４中、「ＣＴＬ」は、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。本実施例において「平均値（Ｘ⁻）」は、６回の試験（ｎ＝６）による平均値である。

【0098】

Ｂ細胞の生存能について、以下の基準で評価を行った。式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が、１００超で１１０未満の場合を「Ａ」とし、１１０以上で１３０未満の場合を「ＡＡ」とし、１３０以上の場合を「ＡＡＡ」とする。結果を表１に示す。

【0099】

（Ｂ細胞の活性化能）
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体と、Ｂ細胞の活性化マーカーであるＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体によって、Ｂ２２０及びＣＤ８６を発現するＢ細胞を検出し、その数を数えた。そして、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）のうち、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６^＋，Ｂ２２０^＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６⁻，Ｂ２２０^＋）の商（活性化しているＢ細胞の数と活性化していないＢ細胞の数との比）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６^＋，Ｂ２２０^＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６⁻，Ｂ２２０^＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の活性化能の値とした。なお、Ｂ細胞の活性化能の試験は、繰り返して行い、Ｂ細胞の活性化能の値について平均値（Ｘ⁻）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を図２及び表１に示す。

【0100】

Ｂ細胞の活性化能について、以下の基準で評価を行った。式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が、１００超で１１０未満の場合を「Ａ」とし、１１０以上で１３０未満の場合を「ＡＡ」とし、１３０以上の場合を「ＡＡＡ」とする。結果を表１に示す。

【0101】

なお、表１、表２中、「評価」の欄の「−」は、式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が１００以下であることを意味する。また、表１中、「評価」の欄の「ＯＫ／ＮＧ」は、式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が１００超である場合（即ち、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡのいずれかの評価である場合）を「ＯＫ」とし、式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が１００以下である場合を「ＮＧ」とした。また、表１中、「総合評価」の欄の「ＯＫ／ＮＧ」は、Ｂ細胞の生存能及び活性化能の評価がいずれも「ＯＫ」である場合を「ＯＫ」とし、それ以外を「ＮＧ」とした。「総合評価」の欄において「ＯＫ」である菌株は、Ｂ細胞の生存能及びＢ細胞の活性化能を有することが分かる。

【0102】

「ＣＤ８６^＋，Ｂ２２０^＋」は、ＣＤ８６及びＢ２２０の両方が細胞表面に発現していることを示す。また、「ＣＤ８６⁻，Ｂ２２０^＋」は、ＣＤ８６は発現せず、Ｂ２２０が発現していることを示す。

【0103】

【表1】

【0104】

味噌の醸造工程から単離した乳酸菌の５６株のうち、Ｎｏ．１、３、１３、１５、１９、３０、３１の７つの菌株（以下、「代表菌株」と記す場合がある）は、Ｂ細胞の生存能が高く、且つ、Ｂ細胞の活性化能も高い結果であった（表１参照）。これらの耐塩性乳酸菌は、表１に示すように、Ｂ細胞に直接作用することによってＢ細胞の生存能及び活性化能を向上させていると考えられる。また、これらの耐塩性乳酸菌は、味噌由来のものであるため食品適性が高い（即ち、安全性が高い）。更に、汚染菌が繁殖し難い高い塩分濃度で生育可能であるため、培養が簡単である。そのため、これらの耐塩性乳酸菌は、製造し易い。

【0105】

本実施例では、Ｂ２２０陽性細胞に着目してＢ細胞について解析したが、Ｂ２２０陽性細胞に代えてＣＤ１９陽性細胞で解析した場合にも同様の結果が得られた。このことからも、所定の菌株によってＢ細胞の生存能及び活性化能が向上されていることが確認できた。

【0106】

なお、Ｎｏ．１の菌株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１８の耐塩性乳酸菌であり、Ｎｏ．３の菌株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１９の耐塩性乳酸菌であり、Ｎｏ．１３の菌株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２０の耐塩性乳酸菌であり、Ｎｏ．１５の菌株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２１の耐塩性乳酸菌であり、Ｎｏ．１９の菌株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２２の耐塩性乳酸菌であり、Ｎｏ．３０の菌株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２３の耐塩性乳酸菌であり、Ｎｏ．３１の菌株は、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２４の耐塩性乳酸菌である。

【0107】

（実施例２）
Ｂ細胞の生存能及び活性化能の両方が高い菌株（Ｎｏ．１、３、１３、１５、１９、３０、３１）と、その他の任意の菌株（Ｎｏ．２、２０、２６、２８、３４、４９）とを試験菌株として、脾臓細胞全体（全脾臓細胞）に対する影響を調べた。

【0108】

＜細胞の生存能及び活性化能の測定試験＞
各試験菌株を殺菌処理し、殺菌処理後の菌体を実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓細胞に添加して培養し、培養後における、脾臓細胞全体の生存能、脾臓Ｂ細胞と脾臓Ｔ細胞の生存能、及び脾臓Ｂ細胞と脾臓Ｔ細胞の活性化能を調査した。以下、本実施例では、「脾臓Ｂ細胞」を単に「Ｂ細胞」と記すことがあり、「脾臓Ｔ細胞」を単に「Ｔ細胞」と記す場合がある。なお、本実施例２は、実施例１とは異なり、Ｂ細胞を単離していない。即ち、試験に用いた細胞（全脾臓細胞）の中には、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞等が含まれていた。

【0109】

（１）乳酸菌懸濁液の調製：
実施例１で調製した乳酸菌懸濁液と同様のものを使用した。

【0110】

（２）脾臓細胞浮遊液の調製：
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に集め、０．５ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加えて脾臓細胞を懸濁した。その後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ｍＬを加えて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。

【0111】

基本培地で懸濁して、脾臓細胞浮遊液を調製した。なお、基本培地は、実施例１と同じものを使用した。得られた脾臓細胞浮遊液は、血球計算板を用いて細胞数を計測した。

【0112】

（３）細胞培養：
２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように脾臓細胞浮遊液を基本培地で調整し、調整後の脾臓細胞浮遊液を、４８ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に０．５ｍＬずつ播種して、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／０．５ｍＬ／ｗｅｌｌとした。その後、各乳酸菌懸濁液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を５μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２日間培養した。なお、調整後の脾臓細胞浮遊液に菌体（乳酸菌懸濁液）を添加せずに、菌体を添加した水準と同一条件（３７℃、５％ＣＯ_２の条件）で２日間培養したものをコントロールとした。

【0113】

（４）細胞の生存能及び活性化能の測定：
培養後、フローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製 ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、各試料（細胞培養液）について細胞の生存能及び活性化能の測定を行った。

【0114】

まず、４８ｗｅｌｌマイクロプレートで培養していた細胞培養液を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞をｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．２ｍＬに懸濁し、以下の４つの抗体を１μＬずつ加え、冷蔵（５℃）で６０分間静置した。

【0115】

添加した４つの抗体は、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、及びＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）であった。

【0116】

静置後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収して、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ｍＬに懸濁した。その後、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）核染色液（コスモバイオ社製）を０．５μＬ加えて測定用試料を得た。この測定用試料についてフローサイトメトリーを用いた測定を行った。なお、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト ＦｌｏｗＪｏ （ＦｌｏｗＪｏ， ＬＬＣ社製）を用いた。

【0117】

（細胞の生存能）
測定用試料中において、カウントされた細胞数から、添加した乳酸菌の数（乳酸菌懸濁液中の菌体の数）を差し引いた数を総細胞の数とした。また、測定用試料のうち、ＰＩ検出された細胞（ＰＩ核染色液で染色された細胞）を死細胞とみなし、その数をカウントし、総細胞の数と死細胞の数との差を生細胞の数とした。そして、総細胞中の生細胞の割合（生細胞の数／総細胞の数×１００）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出して細胞の生存能（細胞生存能）の値とした。なお、細胞生存能の試験は、繰り返して行い、細胞の生存能の値について平均値（Ｘ⁻）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を図３及び表２に示す。本実施例において「平均値（Ｘ⁻）」は、８回の試験（ｎ＝８）による平均値である。

【0118】

細胞の生存能について、以下の基準で評価を行った。式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が、１００超で１２０未満の場合を「Ａ」とし、１２０以上で１５０未満の場合を「ＡＡ」とし、１５０以上の場合を「ＡＡＡ」とする。結果を表２に示す。

【0119】

（Ｂ細胞の生存能）
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にてＢ細胞を検出した。生細胞のうちのＢ細胞の数と、総細胞の数との商（総細胞の数に対する生存するＢ細胞の数の割合）を算出した。なお、本実施例では、測定用試料中において、カウントされた細胞数から、添加した乳酸菌の数（乳酸菌懸濁液中の菌体の数）を差し引いた数を「総細胞の数」とした。また、測定用試料のうち、ＰＩ検出された細胞（ＰＩ核染色液で染色された細胞）を死細胞とみなし、その数をカウントし、総細胞の数と死細胞の数との差を「生細胞の数」とした。そして、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の生存能の値とした。なお、Ｂ細胞の生存能の試験は、繰り返して行い、Ｂ細胞の生存能の値について平均値（Ｘ⁻）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を図４及び表２に示す。

【0120】

Ｂ細胞の生存能について、以下の基準で評価を行った。式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が、１００超で１２０未満の場合を「Ａ」とし、１２０以上で１５０未満の場合を「ＡＡ」とし、１５０以上の場合を「ＡＡＡ」とする。結果を表２に示す。

【0121】

（Ｔ細胞の生存能）
Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）にてＴ細胞を検出した。生細胞のうちのＴ細胞の数と、総細胞の数との商（総細胞の数に対する生存するＴ細胞の数の割合）を算出した。そして、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、総細胞中の生細胞の割合を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＴ細胞の生存能の値とした。なお、Ｔ細胞の生存能の試験は、繰り返して行い、Ｔ細胞の生存能の値について平均値（Ｘ⁻）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を図５及び表２に示す。

【0122】

Ｔ細胞の生存能について、以下の基準で評価を行った。式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が、１００超で１２０未満の場合を「Ａ」とし、１２０以上で１５０未満の場合を「ＡＡ」とし、１５０以上の場合を「ＡＡＡ」とする。結果を表２に示す。

【0123】

（Ｂ細胞の活性化能）
Ｂ細胞の細胞表面マーカーであるｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体と、Ｂ細胞の活性化マーカーであるＡＰＣ標識抗ＣＤ８６抗体によって、Ｂ２２０及びＣＤ８６を発現するＢ細胞を検出し、その数を数えた。そして、Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）のうち、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６^＋，Ｂ２２０^＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６⁻，Ｂ２２０^＋）の商（活性化しているＢ細胞／活性化していないＢ細胞の比の値）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６^＋，Ｂ２２０^＋）と活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６⁻，Ｂ２２０^＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＢ細胞の活性化能の値とした。なお、Ｂ細胞の活性化能の試験は、繰り返して行い、Ｂ細胞の活性化能の値について平均値（Ｘ⁻）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を図６及び表２に示す。

【0124】

Ｂ細胞の活性化能について、以下の基準で評価を行った。式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が、１００超で１２０未満の場合を「Ａ」とし、１２０以上で１５０未満の場合を「ＡＡ」とし、１５０以上の場合を「ＡＡＡ」とする。結果を表２に示す。

【0125】

（Ｔ細胞の活性化能）
Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と、Ｔ細胞の活性化マーカーであるＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）によって、ＣＤ４及びＣＤ６９を発現する細胞を検出し、その数を数えた。そして、Ｔ細胞（ＣＤ４陽性（ＣＤ４^＋）細胞）のうち、活性化しているＴ細胞（ＣＤ６９^＋，ＣＤ４^＋）と活性化していないＴ細胞（ＣＤ６９⁻，ＣＤ４^＋）の商（活性化しているＴ細胞／活性化していないＴ細胞の比の値）を算出した。同様に、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加しなかったもの）における、活性化しているＴ細胞（ＣＤ６９^＋，ＣＤ４^＋）と活性化していないＴ細胞（ＣＤ６９⁻，ＣＤ４^＋）の商を算出した。その後、これらの値を比較し、コントロールを基準（１００）としたときの比の値を算出してＴ細胞の活性化能の値とした。なお、Ｔ細胞の活性化能の試験は、繰り返して行い、Ｔ細胞の活性化能の値について平均値（Ｘ⁻）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。結果を図７及び表２に示す。

【0126】

Ｔ細胞の活性化能について、以下の基準で評価を行った。式：「平均値（Ｘ⁻）−標準誤差（Ｓ．Ｅ．）」により算出される値が、１００超で１２０未満の場合を「Ａ」とし、１２０以上で１５０未満の場合を「ＡＡ」とし、１５０以上の場合を「ＡＡＡ」とする。結果を表２に示す。

【0127】

表２に示すように、代表菌株（Ｎｏ．１、３、１３、１５、１９、３０、３１）は、脾臓細胞中でも同様にＢ細胞の生存能及び活性化能が高く、また、Ｔ細胞においても生存能及び活性化能が高かった。即ち、これらの耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞に直接的に作用することによってＢ細胞の生存能及び活性化能を高め、更に、Ｔ細胞の生存能及び活性化能も高めていると考えられる。そのため、これらの代表菌株は、免疫賦活作用を発揮させる免疫賦活剤の有効成分として採用できると考えられる。

【0128】

また、より具体的には、表２から明らかなように、Ｎｏ．１の菌株、Ｎｏ．１３の菌株、Ｎｏ．１９の菌株、及びＮｏ．３０の菌株の耐塩性乳酸菌は、細胞生存能の評価及びＢ細胞の生存能の評価がいずれも「ＡＡＡ」であり、更に、Ｔ細胞の生存能が「Ａ」以上であった。この結果から、各細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞を含む）の生存能が総じて優れることが分かる。また、Ｎｏ．１の菌株、Ｎｏ．３１の菌株の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞の生存能及び活性化能のいずれもが非常に高く（Ｂ細胞の生存能の評価が「ＡＡＡ」であり、Ｂ細胞の活性化能の評価が「ＡＡ」であった）、特に、Ｎｏ．３１の菌株の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞の活性化能における平均値（Ｘ⁻）が他の菌株に比べて高く、Ｂ細胞の活性化能が非常に高いことが分かる。

【0129】

【表2】

【0130】

表２中、「Ｂ２２０^＋生細胞数／総細胞数」は、総細胞の数に対する「ＰＩ検出されず、ｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体と反応したＢ細胞の数」の割合を算出していることを示す。「ＣＤ４^＋生細胞数／総細胞数」は、総細胞の数に対する「ＰＩ検出されず、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ５１０標識抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と反応したＴ細胞の数」の割合を算出していることを示す。「ＣＤ８６^＋，Ｂ２２０^＋／ＣＤ８６⁻，Ｂ２２０^＋」は、活性化しているＢ細胞（ＣＤ８６^＋，Ｂ２２０^＋）／活性化していないＢ細胞（ＣＤ８６⁻，Ｂ２２０^＋）の比の値を算出していることを示す。「ＣＤ４^＋，ＣＤ６９^＋／ＣＤ４^＋，ＣＤ６９⁻」は、活性化しているＴ細胞／活性化していないＴ細胞の比の値を算出していることを示す。

【0131】

なお、本実施例では、Ｂ２２０陽性細胞に着目してＢ細胞について解析したが、Ｂ２２０陽性細胞に代えてＣＤ１９陽性細胞で解析した場合にも同様の結果が得られた。このことからも、所定の菌株によってＢ細胞の生存能及び活性化能が向上されていることが確認できた。

【0132】

（実施例３）
代表菌株のうちＮｏ．１の菌株と、その他の菌株（Ｎｏ．２、２０）について、マイクロアレイ解析を行い、遺伝子発現の状態を調べた。

【0133】

＜ＤＮＡマイクロアレイ解析による遺伝子発現パターンの調査＞
（１）ＲＮＡの調製：
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を基本培地中で、５×１０^６ｃｅｌｌｓ／５ｍＬ／ｗｅｌｌになるように、６ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）へ播種した。その後、乳酸菌懸濁液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２４時間培養した。なお、脾臓細胞浮遊液に菌体（乳酸菌懸濁液）を添加しないで、菌体を添加した水準と同一条件（３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２４時間）で培養したものをコントロールとした。

【0134】

培養した細胞は、ビオチン−抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）及び磁気ビーズであるＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｐｌｕｓ・ＤＭ（日本ＢＤ社製）と反応させた後、ＢＤ ＩＭａｇ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（日本ＢＤ社製）にて細胞分離を行い、磁石に引き寄せられている細胞（ポジティブフラクション）を、「Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性細胞）」として回収した。

【0135】

なお、脾臓細胞の調製は、実施例２と同様の方法で行い、乳酸菌懸濁液の調製及びＢ細胞の回収は、実施例１と同様の方法で行った。

【0136】

ＲＮＡ抽出は、ＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（ニッポン・ジーン社製）を用い、培養した脾臓細胞から分離したＢ細胞からトータルＲＮＡを抽出した。その後、抽出したトータルＲＮＡを鋳型とし、ラベリングしたｃＤＮＡを調製し、ＤＮＡマイクロアレイ解析に供した。

【0137】

ＤＮＡマイクロアレイ解析は、アジレント社製の「ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ８×６０Ｋ」を用いた。その後、遺伝子発現ソフトウェア「Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１５．１（Ｔｈｅ Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ．）」によって解析した。

【0138】

「コントロールにおける遺伝子発現量」に対する「乳酸菌懸濁液を添加した場合における遺伝子発現量」を算出した。結果を表３に示す。なお、表３中、「２．０」以上である場合にコントロールに対して有意差があることになる。

【0139】

【表3】

【0140】

ＤＮＡマイクロアレイ解析の結果、Ｂ細胞にＮｏ．１の菌株を添加することで、ＣＤ８６遺伝子やＣＤ７０遺伝子の発現が増加していることが確認できた。これらの遺伝子発現が増加していることから、Ｂ細胞が活性化していることが分かる。また、ＣＤ８６やＣＤ７０は、Ｔ細胞上のそれぞれＣＤ２８、ＣＤ２７を介した補助シグナルを誘導し、Ｔ細胞の活性化に重要であることが知られている。Ｎｏ．１の菌株を添加することで、Ｔ細胞の活性化にも影響を与えると考えられる。

【0141】

ＤＮＡマイクロアレイ解析の結果から、Ｎｏ．１の菌株は、遺伝子レベルでもＢ細胞及びＴ細胞の両方を活性していること（即ち、Ｂ細胞の生存能及び活性化能を向上させ、更に、Ｔ細胞の生存能及び活性化能を向上させること）が分かった。

【0142】

また、本発明の耐塩性乳酸菌を添加することにより、インターフェロン−γの発現量が増加しており、インターフェロン−γの産生を誘導することによる免疫賦活作用も有することが分かった。インターフェロン−γは、抗ウイルス効果を持つサイトカインであることが知られている。

【0143】

また、本発明の耐塩性乳酸菌を添加することにより、インターロイキン−１０の発現量も増加していた。インターロイキン−１０は、強力な抗炎症作用を有するサイトカインであり、様々な細胞で炎症作用のあるサイトカインの放出を抑制する。よって、本発明の耐塩性乳酸菌によれば、免疫賦活作用だけでなく、免疫寛容にも作用し、免疫機能を成熟させると考えられる。

【0144】

更に、本発明の耐塩性乳酸菌を添加することにより、インターロイキン−２２の発現が増加していた。インターロイキン−２２は、組織修復、細胞生存・増殖、粘膜バリア防御に関与するものである。

【0145】

なお、Ｎｏ．１の菌株は、インターロイキン−１２とインターフェロン−βの発現にはＢ細胞を介して直接的に影響を与えないことが分かった。インターロイキン−１２は、キラーＴ細胞やＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）に対する活性化作用を特徴とするサイトカインである。インターフェロン−βは、免疫細胞が抗ウイルス機能を作用させる上で最初に産生される生理活性物質である。

【0146】

Ｎｏ．１の菌株を添加することで得られた遺伝子発現パターンは従来知られておらず、未知の作用機構で免疫賦活作用を示すものと推測される。

【0147】

また、インターロイキン−２２は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞等の免疫細胞より産生されることが知られているが、Ｂ細胞からの産生については知られておらず、Ｂ細胞に基づいてインターロイキン−２２の発現量を上げる乳酸菌についても報告がない。

【0148】

（比較例１）
＜培地の塩分濃度の検討＞
醤油醸造で使用している代表的な耐塩性乳酸菌（テトラジェノコッカス・ハロフィラス ＤＡ−２９７株）について、培地の塩分濃度を６段階（６サンプル）用意し、各段階における培養速度を比較した。なお、耐塩性乳酸菌（テトラジェノコッカス・ハロフィラス ＤＡ−２９７株）と同時に雑菌も添加して共培養を行い、これらの培養速度を比較した。

【0149】

雑菌としては、耐塩性スタフィロコッカス属細菌を用いた。なお、食中毒菌を含め、一般的な菌（細菌）は、食塩に対する耐性がなく、塩分を８ｗ／ｖ％より高くすると、十分に増殖を抑えることができるが、スタフィロコッカス属細菌の一部は、耐塩性であることが知られている。そのため、テトラジェノコッカス・ハロフィラス菌の培養において、最もコンタミネーションのリスクのある微生物の１種といえる。

【0150】

なお、使用したスタフィロコッカス属細菌は、醤油製造工程において、醤油乳酸菌を培養する工程で、培地に３５℃で混入してくる菌であり、その中で最も耐塩性の高い菌株（ＳＮ−２８２０株）である。なお、培地には、醤油（イチビキ社製の商品名「こいくちしょうゆ」）２０ｗ／ｖ％、ぶどう糖１．７ｗ／ｖ％を含み、塩分濃度１４ｗ／ｖ％になるように食塩を添加し、ｐＨ６．８に調整したものを用いた。この菌株は、食塩の濃度が最も高い培地（塩分濃度１８ｗ／ｖ％）でもわずかに増殖可能であった。

【0151】

なお、配列表に、耐塩性スタフィロコッカス属細菌ＳＮ−２８２０株の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列を示す。配列表に示す塩基配列を既知の塩基配列データベースから相動性の高い塩基配列を検索した結果、スタフィロコッカス・サプロフィチカス・サブスピーシーズ・サプロフィチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列と一致した。この結果から、ＳＮ−２８２０株は、スタフィロコッカス・サプロフィチカス・サブスピーシーズ・サプロフィチカスと同定した。

【0152】

（培地）
窒素源及び微量ミネラル分として、こいくちしょうゆ（イチビキ社製）、炭素源として、ぶどう糖（関東化学社製）を使用し、その他の原料としては、食塩（関東化学社製）と水を使用した。このように、簡素でかつ食品原料のみからなる培地で検討した。

【0153】

こいくちしょうゆは、全てのサンプルにおいて２０ｖ／ｖ％とし、ぶどう糖は全てのサンプルにおいて１．７ｗ／ｖ％とした。更に、培地の塩分濃度が、８、１０、１２、１４、１６、１８ｗ／ｖ％の６段階となるように、食塩の添加量を調整した。そして、全てのサンプルにおいてｐＨが７．０になるように食品添加物の水酸化ナトリウム（関東化学社製）で調整した。

【0154】

培地は、試験管（直径１８ｍｍ×１８０ｍｍ）に１０ｍＬずつ入れ、シリコセン（信越ポリマー社製、登録商標）で栓をした後、１２１℃、１５分間オートクレーブで滅菌をした。

【0155】

（培養）
継代培養を想定して、同培地で前培養しておいたテトラジェノコッカス・ハロフィラスＤＡ−２９７株を１ｖ／ｖ％添加して初発菌数が１．５×１０^７ｃｆｕ／ｍＬになるように植菌した。また、スタフィロコッカス属細菌は、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＤＡ−２９７株に対して０．１ｖ／ｖ％混入することを想定して、前培養しておいたスタフィロコッカス属細菌ＳＮ−２８２０株を添加した。このときのスタフィロコッカス属細菌の初発菌数は１．１×１０^４ｃｆｕ／ｍＬであった。その後、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＤＡ−２９７株について３０℃の恒温器の中で２４時間、及び７２時間静置培養した。

【0156】

（菌数の測定）
２４時間静置培養した後のテトラジェノコッカス・ハロフィラスＤＡ−２９７株の生菌数は、「１０ＳＧ１０Ｎ平板培地」に希釈菌液を塗布して培養（３０℃で４日間、嫌気培養）した後にコロニー数を計測した。また、スタフィロコッカス属細菌は、標準寒天培地（ＳＡ）平板培養法にて培養した後、菌数（生菌）を測定した。

【0157】

「１０ＳＧ１０Ｎ平板培地」は、醤油（イチビキ社製の商品名「こいくちしょうゆ」）１０ｖ／ｖ％、ぶどう糖１．０ｗ／ｖ％、酵母エキス１．０ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酢酸ナトリウム３水和物０．２ｗ／ｖ％、塩化ナトリウム１０ｗ／ｖ％、「Ｔｗｅｅｎ８０」０．００２５ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２ｗ／ｖ％、硫酸マンガン４水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸鉄７水和物０．００１ｗ／ｖ％を含有する、ｐＨ６．８、寒天２％のものであった。

【0158】

そして、２４時間後の菌数（生菌）を初発菌数で割った値（２４時間後の菌数／初発菌数）を２４時間の増殖倍率（倍／２４時間）として算出した。結果を表４に示す。

【0159】

なお、７２時間後のテトラジェノコッカス・ハロフィラスＤＡ−２９７株の菌数を「総菌数」とし、この総菌数（生菌と死菌の合計（最終収量））については、顕微鏡下で血球計算板を用いて菌数を計測した。

【0160】

【表4】

【0161】

表４に示すように、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＤＡ−２９７株は、塩分濃度８〜１４ｗ／ｖ％で旺盛に増殖し、１８ｗ／ｖ％でも十分に増殖できることが分かった。一方、スタフィロコッカス属細菌は、塩分濃度８〜１８ｗ／ｖ％の範囲では、塩分濃度が低い程、良好に増殖した。また、塩分濃度１０ｗ／ｖ％以下では、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＤＡ−２９７株よりも増殖倍率が高く、塩分濃度８ｗ／ｖ％では、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＤＡ−２９７株よりも約８倍の速度で増菌した。

【0162】

以上の結果から、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＤＡ−２９７株では、培地の塩分濃度を１４ｗ／ｖ％以上にすることが良いことが分かった。一方で、耐塩性乳酸菌の最終収量は、塩分濃度が高いほど低くなる。そのため、塩分１２ｗ／ｖ％でも耐塩性スタフィロコッカス属細菌よりも生育速度が速い味噌由来の耐塩性乳酸菌について以下の実施例４で検討した。

【0163】

（実施例４）
＜耐塩性乳酸菌の選抜＞
本実施例では、培地の塩分濃度を１２ｗ／ｖ％とした場合において、Ｎｏ．１、３、１３、１５、１９、３０、３１の７つの菌株（７つのサンプル）を対象として、耐塩性スタフィロコッカス属細菌ＳＮ−２８２０株よりも増菌速度が速い耐塩性乳酸菌の選抜を行った。

【0164】

（培地）
窒素源及び微量ミネラル分として、こいくちしょうゆ（イチビキ社製）、炭素源として、ぶどう糖（関東化学社製）を使用し、その他の原料としては、食塩（関東化学社製）と水を使用した。このように、簡素でかつ食品原料のみからなる培地で検討した。

【0165】

上記培地は、具体的には、こいくちしょうゆが２０ｖ／ｖ％、ぶどう糖が１．７ｗ／ｖ％、塩分濃度が１２ｗ／ｖ％となるように、こいくちしょうゆ、ぶどう糖、及び食塩を水と混ぜ、その後、食品添加物の水酸化ナトリウム（関東化学社製）でｐＨが７．０になるように調整したものを用いた。

【0166】

作製した培地を試験管（直径１８ｍｍ×１８０ｍｍ）に１０ｍＬずつ入れ、シリコセン（登録商標）で栓をした後、１２１℃、１５分間オートクレーブで滅菌処理した。

【0167】

（培養）
継代培養を想定して、同培地で前培養しておいた各耐塩性乳酸菌を１ｖ／ｖ％添加した。このとき初発菌数は３．７×１０^６〜１．５×１０^７ｃｆｕ／ｍＬであった。また、耐塩性乳酸菌に対してスタフィロコッカス属細菌が１ｖ／ｖ％混入することを想定して、前培養しておいたスタフィロコッカス属細菌ＳＮ−２８２０株を添加した。このときのスタフィロコッカス属細菌の初発菌数は１．８×１０^５〜５．７×１０^５ｃｆｕ／ｍＬであった。その後、全てのサンプル（７つの菌株と耐塩性スタフィロコッカス属細菌ＳＮ−２８２０株）を３０℃の恒温器の中で２０時間静置培養した。

【0168】

（菌数の測定）
次に、菌数の測定を行った。菌数の測定は、比較例１と同様の方法で行った。

【0169】

２０時間培養後の菌数を初発菌数で割った値（２０時間後の菌数／初発菌数）を２０時間の増殖倍率（倍／２０時間）として算出した。結果を表５に示す。

【0170】

【表5】

【0171】

表５に示すように、Ｎｏ．１９の菌株以外の菌株（Ｎｏ．１、Ｎｏ．３、Ｎｏ．１３、Ｎｏ．１５、Ｎｏ．３０、Ｎｏ．３１）については、塩分濃度１２ｗ／ｖ％で旺盛に増殖し、耐塩性スタフィロコッカス属細菌よりも優位に増殖することが分かった。また、同様の結果は、塩分濃度１４〜１８ｗ／ｖ％でも得られた。このように、本発明の耐塩性乳酸菌は、塩分濃度１２〜１８ｗ／ｖ％でも耐塩性乳酸菌を良好に培養でき、耐塩性乳酸菌に対して１ｖ／ｖ％程度の耐塩性スタフィロコッカス属細菌が混入したとしても耐塩性乳酸菌を優先的に培養できることが分かった。

【0172】

培地の塩分濃度は、塩分濃度１１ｗ／ｖ％以上であれば、雑菌（汚染菌）として想定される耐塩性スタフィロコッカス属細菌などの菌よりも旺盛に増殖するため好ましい。一方で、塩分濃度１８ｗ／ｖ％では耐塩性乳酸菌自体の増殖速度が他の塩分濃度の場合に比して遅くなる傾向がある。そのため、本発明の耐塩性乳酸菌は、塩分濃度１１〜１６ｗ／ｖ％で培養することが好ましく、塩分濃度１２〜１６ｗ／ｖ％で培養することが更に好ましく、塩分濃度１２〜１４ｗ／ｖ％とすることが最も好ましい。

【0173】

なお、この実験で用いた前培養液の上清についてヒスタミン量を測定した。測定には、「チェックカラーヒスタミン（キッコーマンバイオケミファ社製）」を用いた。測定の結果、全ての乳酸菌培養液でヒスタミン濃度が２０ｐｐｍ未満となり、ヒスタミン産生能はないことが分かった。なお、測定方法は、「チェックカラーヒスタミン」に添付の取扱説明書に従った。

【0174】

（実施例５）
＜サイトカイン産生細胞の測定試験＞
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓細胞に殺菌処理後の試験菌体を添加して共培養し、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、インターフェロン−γの各種サイトカインの産生細胞の割合を測定した。試験菌株としては、代表菌株（Ｎｏ．１、３、１３、１５、１９、３０、３１）と、その他の任意の菌株（Ｎｏ．２、２０）とを用いた。

【0175】

（１）乳酸菌懸濁液の調製：
ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように懸濁したこと以外は、実施例１で調製した乳酸菌懸濁液と同様にして調製した。

【0176】

（２）脾臓細胞浮遊液の調製：
実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の脾臓から採取した細胞を１．５ｍＬリアクションチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）に集め、０．５ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ，０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を加えて脾臓細胞を懸濁した。その後、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ｍＬを加えて１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。

【0177】

その後、基本培地で懸濁して、脾臓細胞浮遊液を調製した。なお、基本培地は、実施例１と同じものを使用した。得られた脾臓細胞浮遊液は、血球計算板を用いて細胞数を計測した。

【0178】

（３）細胞培養：
上記脾臓細胞浮遊液を２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように基本培地で調整し、６ｗｅｌｌマイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に３ｍＬずつ播種して、６×１０^６ｃｅｌｌｓ／３ｍＬ／ｗｅｌｌとした。その後、各乳酸菌懸濁液（１ｍｇ／ｍＬ）を３０μＬずつ加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２日間培養して、乳酸菌添加培養物を得た。なお、上記脾臓細胞浮遊液に菌体（乳酸菌懸濁液）を添加せずに、菌体を添加した水準と同一条件（３７℃、５％ＣＯ_２の条件）で培養したものをコントロールとした。

【0179】

（４）サイトカインの測定：
上記２日間培養のうち４２時間の培養後の段階で各培養液にＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ^ＴＭ（ＢＤ社製）を２μＬ加え、混合し、その後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で更に６時間培養した（培養時間の合計４８時間）。その後、培養した細胞培養液を１５ｍＬコニカルチューブ（ＢＤ社製）に移し、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を回収した。その後、回収した細胞について、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ^ＴＭ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて固定・透過の操作を行った。操作は添付の説明書に従った。

【0180】

ここで、使用する抗体の都合上、インターロイキン−２２を産生する細胞とインターフェロン−γを産生する細胞の確認を行う第１の群と、インターロイキン−１０を産生する細胞の確認を行う第２の群との２つの群に分けて細胞染色を行った。

【0181】

第１の群では、ＰＥ標識抗インターロイキン−２２抗体（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ａｌｅｘａ６４７標識抗インターフェロン−γ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、及びｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。

【0182】

第２の群では、ＰＥ標識抗インターロイキン−１０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、Ａｌｅｘａ６４７標識抗インターフェロン−γ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、及びｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。

【0183】

なお、図１５に示すように、インターロイキン−２２を産生する細胞とインターロイキン−１０を産生する細胞とを同時に検出する際には、ＰＥ標識抗インターロイキン−２２抗体（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ａｌｅｘａ６４７標識抗インターロイキン−１０抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、及びｖｉｏｌｅｔＦｌｕｏｒ４５０標識抗Ｂ２２０抗体（ＴＯＮＢＯ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した（第３の群）。図１５〜図１７では、染色前の細胞を３つの群（上記第１の群から第３の群）に分けてそれぞれについて細胞染色を行った結果を示している。

【0184】

染色後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収し、ｐＨ６．８のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ｍＬに懸濁して測定用試料とした。

【0185】

サイトカインの測定は、フローサイトメトリー（ミルテニーバイオテク社製 ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて行った。なお、解析は、ＦＣＳデータ解析ソフト ＦｌｏｗＪｏ （ＦｌｏｗＪｏ， ＬＬＣ社製）を用いた。

【0186】

（５）サイトカイン産生細胞量の測定：
（５−１）インターロイキン−２２の産生細胞量：
フローサイトメトリーで得られた乳酸菌添加培養物の解析結果について、全脾臓細胞のリンパ球中のインターロイキン−２２陽性細胞の割合を求めた。併せて、Ｂ２２０陽性細胞（脾臓Ｂ細胞）中のインターロイキン−２２陽性細胞の割合を求めた。

【0187】

更に、フローサイトメトリーで得られたコントロール（乳酸菌懸濁液を添加せずに培養したもの）の解析結果について、上記乳酸菌添加培養物の場合と同様にして、全脾臓細胞中のインターロイキン−２２陽性細胞の割合を求めた。更に、コントロールにおけるＢ２２０陽性細胞中のインターロイキン−２２陽性細胞の割合を求めた。なお、図８では、フローサイトメトリーにおける測定の一例を示し、縦軸がＢ２２０の発現を示し、横軸がインターロイキン−２２の発現を示している。図８中の上段にはコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）、下段にはＮｏ．１の菌株を添加した場合（「＋Ｎｏ．１」と記す）について示しており、更に、図８中の左側には全脾臓細胞のリンパ球中のインターロイキン−２２陽性細胞の割合を示し、右側にはＢ２２０陽性細胞（脾臓Ｂ細胞）中のインターロイキン−２２陽性細胞の割合を示す。

【0188】

そして、コントロールで算出された値を基準（１００）としたときの上記「全脾臓細胞中のインターロイキン−２２陽性細胞の割合」を算出し、この算出値を、全脾臓細胞中のインターロイキン−２２の産生細胞量（ＩＬ−２２^＋／全脾臓細胞）とした。同様に、コントロールで算出された値を基準（１００）としたときの上記「Ｂ２２０陽性細胞中のインターロイキン−２２陽性細胞の割合」を算出し、この算出値を、脾臓Ｂ細胞中のインターロイキン−２２の産生細胞量（ＩＬ−２２^＋／脾臓Ｂ細胞）とした。なお、試験は、繰り返して行い、平均値（Ｘ⁻）と標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を求めた。本実施例において「平均値（Ｘ⁻）」は、６回の試験（ｎ＝６）による平均値である。

【0189】

脾臓Ｂ細胞のインターロイキン−２２の産生細胞量（ＩＬ−２２^＋／脾臓Ｂ細胞）について、結果を図９、及び表６（「ＩＬ−２２産生量」の「脾臓Ｂ細胞」の欄）に示す。なお、図９中、「ＩＬ−２２^＋／脾臓Ｂ細胞」は、脾臓細胞のＢ細胞のうちのインターロイキン−２２の産生細胞量（ＩＬ−２２^＋／脾臓Ｂ細胞）を示す。

【0190】

脾臓細胞のうちのインターロイキン−２２の産生細胞量（ＩＬ−２２^＋／全脾臓細胞）について、結果を図１０、及び表６（「ＩＬ−２２産生量」の「全脾臓細胞」の欄）に示す。図１０中、「ＩＬ−２２^＋／全脾臓細胞」は、脾臓細胞のうちのインターロイキン−２２の産生細胞量（ＩＬ−２２^＋／全脾臓細胞）を示す。

【0191】

【表6】

【0192】

（５−２）インターロイキン−１０の産生細胞量：
インターロイキン−１０の産生細胞量についても上記「インターロイキン−２２の産生細胞量」の測定試験と同様にして算出した。脾臓細胞のＢ細胞のうちのインターロイキン−１０の産生細胞量の結果については、図１１及び表６に示し、脾臓細胞のうちのインターロイキン−１０の産生細胞の量の結果については、図１２及び表６に示す。なお、表６中、脾臓細胞のＢ細胞のうちのインターロイキン−１０の産生細胞の量の結果は、「ＩＬ−１０産生量」の「脾臓Ｂ細胞」の欄に示し、脾臓細胞のうちのインターロイキン−１０の産生細胞の量の結果は、「ＩＬ−１０産生量」の「全脾臓細胞」の欄に示す。

【0193】

なお、図１１中、「ＩＬ−１０^＋／脾臓Ｂ細胞」は、脾臓細胞のＢ細胞のうちのインターロイキン−１０の産生細胞の量を示す。図１２中、「ＩＬ−１０^＋／全脾臓細胞」は、脾臓細胞のうちのインターロイキン−１０の産生細胞の量を示す。

【0194】

（５−３）インターフェロン−γの産生細胞量：
インターフェロン−γの産生細胞量についても上記「インターロイキン−２２の産生細胞量」の測定試験と同様にして算出した。なお、脾臓細胞のＢ細胞のうちのインターフェロン−γの産生細胞の量の結果については、図１３及び表６に示し、脾臓細胞のうちのインターフェロン−γの産生細胞の量の結果については、図１４及び表６に示す。なお、表６中、脾臓細胞のＢ細胞のうちのインターロイキン−２２の産生細胞の量の結果は、「ＩＦＮ−γ産生量」の「脾臓Ｂ細胞」の欄に示し、脾臓細胞のうちのインターロイキン−２２の産生細胞の量の結果は、「ＩＦＮ−γ産生量」の「全脾臓細胞」の欄に示す。

【0195】

図１３中、「ＩＦＮ−γ^＋／脾臓Ｂ細胞」は、脾臓細胞のＢ細胞のうちのインターフェロン−γの産生細胞の量を示す。図１４中、「ＩＦＮ−γ^＋／全脾臓細胞」は、脾臓細胞のうちのインターフェロン−γの産生細胞の量を示す。

【0196】

以上の結果より、代表菌株（Ｎｏ．１、３、１３、１５、１９、３０、３１）と脾臓細胞とを共培養すると、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γを産生するＢ細胞の割合がコントロール（乳酸菌懸濁液を添加せずに培養したもの）に比べて増大することが分かった（図９、図１１、図１３参照）。また、Ｂ細胞のみに限定されず、脾臓細胞全体でもこれらの代表菌株により、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γを産生する細胞の割合が増大することが分かった（図１０，図１２，図１４参照）。

【0197】

なお、実施例３のＤＮＡマイクロアレイ解析では、代表菌株のＮｏ．１の菌株によって、Ｂ細胞においてインターロイキン−２２、インターロイキン−１０、インターフェロン−γの産生が誘導されることが示された。更に、本実施例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養におけるサイトカインの測定試験を行った。その結果、Ｎｏ．１の菌株に限らず代表菌株の全てにおいて、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、インターフェロン−γの産生が誘導されることが確認できた。具体的には、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、インターフェロン−γは、Ｂ細胞を含む脾臓細胞中で産生が誘導され、耐塩性乳酸菌である上記代表菌株との共培養によって、上記サイトカインを産生する細胞の量が１．１〜５倍程度に増大することが分かった（図９〜図１４、表６参照）。

【0198】

（Ｂ細胞のサブセット）
図１５〜図１７には、全脾臓細胞のリンパ球、及び脾臓Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性（Ｂ２２０^＋）細胞のサイトカイン産生をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。具体的には、図１５は、インターロイキン−２２とインターロイキン−１０で展開した結果を示し、図１６は、インターロイキン−２２とインターフェロン−γで展開した結果を示し、図１７は、インターロイキン−１０とインターフェロン−γで展開した結果を示す。

【0199】

図１５〜図１７から分かるように、全脾臓細胞及び脾臓Ｂ細胞（Ｂ２２０陽性（Ｂ２２０^＋）細胞）のいずれの場合においても、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、インターフェロン−γのうちの２種以上を産生する細胞は確認できなかった。つまり、一個の細胞は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、インターフェロン−γのうちの一種のみを産生していることが分かった。

【0200】

なお、図１５〜図１７には、Ｎｏ．１の菌株を添加した結果を示しているが、代表菌株を含むいずれの検体においても、Ｎｏ．１の菌株と同様の結果が得られた。

【0201】

ここで、ヘルパーＴ細胞には、サイトカイン産生の特徴によって分類されるサブセット（亜集団）が存在することが知られている。具体的には、ヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ１細胞（インターフェロン−γを産生することを特徴とするもの）や、Ｔｈ２細胞（インターロイキン−４を産生することを特徴とするもの）、Ｔｈ９細胞（インターロイキン−９を産生することを特徴とするもの）、Ｔｈ１７細胞（インターロイキン−１７を産生することを特徴とするもの）、Ｔｈ２２細胞（インターロイキン−２２を産生することを特徴とするもの）などのように、別々のサイトカインを産生する役割を持つものが存在することが知られている。

【0202】

一方で、Ｂ細胞については、サブセットが存在することは知られていなかったが、図１５〜図１７の結果からすると、Ｂ細胞についてもヘルパーＴ細胞のようにサブセットが存在することが分かった。つまり、Ｂ細胞には、「インターロイキン−２２を産生するＢ細胞」、「インターロイキン−１０を産生するＢ細胞」、「インターフェロン−γを産生するＢ細胞」が別々に存在することが分かった。Ｂ細胞のうちの制御性Ｂ細胞は、インターロイキン−１０を産生することが知られている。この中で「インターロイキン−１０を産生するＢ細胞」とは制御性Ｂ細胞であると考えられ、これらの乳酸菌により制御性Ｂ細胞も増加または活性化されると考えられる。

【0203】

なお、コントロール（乳酸菌懸濁液を添加せずに培養したもの）においても、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、インターフェロン−γを産生するＢ細胞が微量ながら検出された。その結果、通常の条件（乳酸菌を含まない培養条件）下でもＢ細胞が上記サイトカイン（インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、インターフェロン−γ）を産生することが分かった。

【0204】

本実施例では、Ｂ２２０陽性細胞を検出してＢ細胞について解析したが、Ｂ２２０陽性細胞に代えてＣＤ１９陽性細胞で解析した場合にも同様にインターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γを産生する細胞が検出された。この結果からもＢ細胞が上記サイトカインを産生し、代表菌株により上記サイトカインの産生が誘導されることが分かった。

【0205】

（実施例６）
＜乳酸菌の給餌試験＞
殺菌処理した乳酸菌の菌体を実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に給餌し、その後のマウスの血液中の血清ＩｇＡを測定した。乳酸菌としては、代表菌株のうちの、Ｎｏ．１及びＮｏ．３０の菌株を使用した。

【0206】

（１）乳酸菌配合飼料の調製：
通常のマウス用飼料に、殺菌処理しその後凍結乾燥した乳酸菌の菌体を１（ｗ／ｗ）％量含有した飼料を調製した。なお、通常のマウス用飼料としては、マウス飼育繁殖用飼料ＣＥ−２（日本クレア社製）を用いた。

【0207】

（２）給餌試験：
通常の実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）（８週齢・雌）６匹を２群に分け、一方に乳酸菌配合飼料を与え（乳酸菌投与群）、もう一方に乳酸菌の菌体を含まない通常のマウス用飼料を与えて飼育した（コントロール群（乳酸菌非投与群））。試験開始より１４日間後にそれぞれ血液を採取し、遠心分離により血清を回収して調製した。

【0208】

（３）ＩｇＡの測定：
調製した血清中の総ＩｇＡ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。

【0209】

測定には、ＭＩＣＲＯＬＯＮ ９６ウェル マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）を用いた。抗原として、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ−ＵＮＬＢ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）、２次抗体として、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ−ＡＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）を使用し、発色基質にＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。また、吸光度（４０５ｎｍ）の測定は、Ｖｍａｘ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いた。ここで、段階希釈したコントロール群の検体を用いて、吸光度とＩｇＡ濃度の検量線を作成した。そして、この検量線を用いて、乳酸菌投与群の検体とコントロール群（乳酸菌非投与群）の検体についてのＩｇＡ濃度を算出した。その後、コントロール群（乳酸菌非投与群）におけるＩｇＡ濃度の平均値を基準値（１００）として、各検体のＩｇＡ濃度の相対値を求めた。

【0210】

乳酸菌投与群とコントロール群（乳酸菌非投与群）の各数値について、Ｆ検定を実施し分散に有意差があるか否か確認を行った。その後、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定（これは、等分散を仮定した２標本による検定である）を行った。

【0211】

その結果、表７、表８、図１８及び図１９に示すように、Ｎｏ．１菌、Ｎｏ．３０菌の乳酸菌投与群は、コントロール群（乳酸菌非投与群）と比較して血清中のＩｇＡ濃度がそれぞれ約２５％、約２２％上昇していた。そして、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定の結果は、それぞれｐ＜０．０５（ｐ＝０．０３８）、ｐ＜０．０１（ｐ＝０．０００１）となり、有意水準５％及び１％で有意差が認められた。これらの結果から、本発明の耐塩性乳酸菌の摂取によって、血清中の総ＩｇＡ濃度が増大し、本発明の耐塩性乳酸菌により免疫賦活化能が増大することが分かった。

【0212】

【表7】

【0213】

【表8】

【0214】

以上のことから、表１〜表３に示すように、本発明の耐塩性乳酸菌は、Ｂ細胞に直接作用することによってＢ細胞の生存能及び活性化能を向上させ、更に、Ｔ細胞の生存能及び活性化能を向上させることが分かった。このようなことから、本発明の耐塩性乳酸菌は、免疫賦活作用を有することが分かる。更に、本発明の耐塩性乳酸菌のうちのＮｏ．１の菌株は、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生を誘導することが分かった。更に、表６に示すように、Ｎｏ．１の菌株以外に、Ｎｏ．３、１３、１５、１９、３０、３１の菌株についても、インターロイキン−２２、インターロイキン−１０、及びインターフェロン−γの産生を誘導することが分かった。そして、代表菌株の耐塩性乳酸菌は、血清中の総ＩｇＡ濃度を増大させ、これらの乳酸菌により免疫賦活化能が増大すると考えられる（表７、表８、図１８及び図１９参照）。また、表４、表５に示すように、塩分濃度１１〜１８ｗ／ｖ％であれば、本発明の耐塩性乳酸菌を選択的に良好に培養でき、汚染菌の増殖を抑えることができることが分かった。

【産業上の利用可能性】

【0215】

本発明の耐塩性乳酸菌は、飲食品、サプリメント、医薬品などに添加して免疫賦活作用を発揮させる免疫賦活剤の有効成分として採用したり、そのものを飲食品、サプリメント、医薬品などとしたりすることができる。本発明の耐塩性乳酸菌の培養方法は、本発明の耐塩性乳酸菌の培養方法として採用することができる。本発明の免疫賦活剤は、飲食品、サプリメント、医薬品などに添加して免疫賦活作用を発揮させる免疫賦活剤として用いたり、そのものを飲食品、サプリメント、医薬品などとしたりすることができる。飲食品としては、例えば、味噌、即席味噌汁、調理味噌（味噌加工品）、金山寺味噌などのなめ味噌、醤油、つゆ、調味ソース、調味たれ、漬物（浅漬け）の素などの加工調味料、ご飯の素などの調味食品、惣菜、あま酒（糀飲料）、ぜんざい等が挙げられる。

【受託番号】

【0216】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１８、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３１９、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２０、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２１、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２２、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２３、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２３２４

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]