特許 6338375 腸球菌病原体の新規の抗原、並びに治療法及び／又は予防法のためのワクチン成分としてのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6338375

(24)【登録日】2018年5月18日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】腸球菌病原体の新規の抗原、並びに治療法及び／又は予防法のためのワクチン成分としてのその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20180528BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20180528BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180528BHJP

   C07K 14/315 20060101ALN20180528BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20180528BHJP

   C07K 14/31 20060101ALN20180528BHJP

   C07K 14/33 20060101ALN20180528BHJP

   C07K 16/12 20060101ALN20180528BHJP

   G01N 33/15 20060101ALN20180528BHJP

   G01N 33/50 20060101ALN20180528BHJP

   G01N 33/53 20060101ALN20180528BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 R

   A61K39/02

   A61P31/04

   A61P1/00

   A61P13/02

   A61P7/00

   A61P9/00

   A61P17/00 101

   A61P11/00

   A61P43/00 121

   !C07K14/315ZNA

   !C07K14/195

   !C07K14/31

   !C07K14/33

   !C07K16/12

   !G01N33/15 Z

   !G01N33/50 Z

   !G01N33/53 D

【請求項の数】8

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2013-537136(P2013-537136)

(86)(22)【出願日】2011年11月3日

(65)【公表番号】特表2014-505016(P2014-505016A)

(43)【公表日】2014年2月27日

(86)【国際出願番号】EP2011069363

(87)【国際公開番号】WO2012059556

(87)【国際公開日】20120510

【審査請求日】2014年10月20日

(31)【優先権主張番号】10190167.6

(32)【優先日】2010年11月5日

(33)【優先権主張国】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】511268085

【氏名又は名称】ウニベルシタットスクリニクム フライベルク

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(72)【発明者】

【氏名】ヒューブナー，ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】グローマン，エリザベス

(72)【発明者】

【氏名】クロペク−ヒューブナー，アンドレア

【審査官】 田中 耕一郎

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−０８９４２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５０５５３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０９−５０９５６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０７−２３８０２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 GenBank, 14-NOV-2006, ACCESSION AJ505823.1, [retrieved on 1.Dec.2015]，ＵＲＬ，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/aj505823

【文献】 谷本弘一他、２００７、モダンメディア、５３（６）、１４０−１４７

【文献】 河村好章他、２００５、モダンメディア、５１（１２）、３１３−３２７

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−Ｃ１２Ｎ １５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−Ｃ０７Ｋ １９／００

Ａ６１Ｋ ３８／００−Ａ６１Ｋ ３８／５８

Ａ６１Ｋ ３９／００−Ａ６１Ｋ ３９／４４

Ａ６１Ｋ ４１／００−Ａ６１Ｋ ４５／０８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ４９／００−Ａ６１Ｋ ４９／２２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

疾患の治療に使用される単離ペプチドと、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物であって、
ここで、前記単離ペプチドが、
ａ）配列番号１に表されるアミノ酸配列からなるＯｒｆ１３タンパク質に結合する抗体又はその断片
から選択される、医薬組成物。

【請求項2】

前記単離ペプチドが、チャネル形成成分である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記抗体又はその断片がｓｃＦＶ断片又はＦａｂ断片から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

ワクチンである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項5】

少なくとも１つのサイトカインを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

ワクチンが筋肉内経路、皮下経路又は吸入経路による投与のために配合される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

細菌感染症、腸球菌感染症、尿路感染症、菌血症、細菌性心内膜炎、腹膜炎、創傷感染症及び軟部組織感染症、髄膜炎、並びに肺炎から選択される細菌性疾患又は細菌性病態の予防的治療又は治療的治療のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記細菌が腸球菌、ブドウ球菌又は連鎖球菌、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、スタフィロコッカス・アウレウス、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌若しくはストレプトコッカス・ピオゲネス、又はそれらの抗生物質耐性株から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は抗原、より具体的には治療法及び／又は予防法のためのワクチン成分として有用な腸球菌病原体のタンパク質抗原に関する。

【背景技術】

【0002】

腸球菌は入院患者の感染症に関連する最も重要な病原体の一つである。とりわけ、最も臨床的に関連する分離株における多抗生物質耐性決定因子（multiple antibiotic resistance determinants）の存在は、場合によっては治療不可能なこれらの感染症に対抗する代替的な治療戦略及び予防戦略の開発を促している。腸球菌はＤＮＡを獲得し、水平に伝達する特異的機構を発現しており、これらの特性は病院内での多数の集団発生（outbreaks）の原因となる。

【0003】

細菌接合は、抗生物質耐性遺伝子の伝播を含む、細菌の環境条件の変化への適応を可能にする最も重要な遺伝子送達手段であり、それにより多抗生物質耐性病原体が発生する。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）及びスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）等の多剤耐性病原体は、入院患者及び免疫抑制患者の抗生物質治療に対して深刻な脅威となっている（非特許文献１）。

【0004】

細菌接合系は、細菌性病原体から哺乳動物宿主へのタンパク質（例えば毒性因子、毒素）の輸送を専門とする特殊化したタイプのＩＶ型分泌系（Ｔ４ＳＳ）である。接合性Ｔ４ＳＳは、タンパク質に加えてＤＮＡ基質を細胞内輸送するよう進化している（非特許文献２、非特許文献１）。

【0005】

ｐＩＰ５０１は、敗血症及び髄膜炎の原因物質である、ヒト病原体ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）から初めて単離された広宿主域接合性プラスミドである（非特許文献３）。ｐＩＰ５０１は、糸状多細胞ストレプトミセス及びグラム陰性エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）にまで及ぶ、研究されているほぼ全てのグラム陽性菌を含むグラム陽性菌に由来する任意の既知の可動遺伝要素の接合性プラスミド導入について最も広い宿主域を示す（非特許文献４）。プラスミド導入には、１５個の輸送タンパク質をコードする完全なＴ４ＳＳを含む、プラスミドにコードされる１５ｋｂの導入領域が必要とされる。これらのタンパク質の幾つかは、酵素について幾らか詳しく特性化されており、例えばＴ４ＳＳ ＡＴＰアーゼＯｒｆ５及びＯｒｆ１０はＡＴＰの加水分解によるＤＮＡ輸送過程のエネルギーを供給する。

【0006】

Ｏｒｆ７タンパク質は、グラム陽性エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）及びグラム陰性エシェリヒア・コリ（E. coli）から単離された、ペプチドグリカンに対する切断活性を有する溶菌性トランスグリコシラーゼであることが実証されている。

【0007】

完全なタンパク質間相互作用図が、酵母ツーハイブリッドアッセイ及びプルダウンによって、１５個のＴ４ＳＳタンパク質について確立されている。これらのデータに基づいて、グラム陽性病原体に由来するＴ４ＳＳの最初の分子モデルが開発された（非特許文献５）。

【0008】

Ｔ４ＳＳタンパク質は、導入過程におけるそれらの機能に関してエネルギー供給ファミリー、チャネル成分ファミリー、及び推定表面タンパク質又は付着因子という３つのファミリーに分けることができる（非特許文献６）。Ｏｒｆ５及びＯｒｆ１０はエネルギー成分ファミリーのメンバーであり、Ｏｒｆ１５は表面タンパク質ファミリーの推定メンバーであり、溶菌性トランスグリコシラーゼＯｒｆ７及びＯｒｆ１３はチャネル成分ファミリーに属する。

【0009】

Ｏｒｆ１３については、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＴ−ＤＮＡ導入系のＴ４ＳＳサブユニットＶｉｒＢ８及びＶｉｒＢ１０について示されているように、膜から遠位に伸びるＴ４ＳＳチャネルの一部に対する足場機能が提唱されている（非特許文献６）。Ｏｒｆ１３は１つの予測膜貫通ヘリックスを有する（非特許文献７）。エンテロコッカス・フェカリスのＪＨ２−２細胞画分中では、Ｏｒｆ１３は抗Ｏｒｆ１３抗体による免疫ブロット法を用いて細胞エンベロープに位置付けられた。他のＴ４ＳＳタンパク質とのタンパク質間相互作用は同定することができなかった。

【0010】

特許文献１は、Ｔ４ＳＳと相互作用するポリペプチド、特にリケッチア・シビリカ（Rickettsia sibirica）ｒｓｉｂ＿ｏｒｆ．１２６６ポリペプチドをコードする単離核酸を記載している。

【0011】

腸球菌によって引き起こされる感染症が世界的にますます重大な問題となっているため、これらの病原体に対する新たな治療戦略の開発に多大な労力が費やされている。腸球菌に対するヒト免疫系の主要な保護防御機構は貪食であり、これは或る特定の腸球菌の表面構造の直接認識、又は抗体及び補体によるオプソニン化によって起こり得る。

【0012】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫応答をシミュレートし、腸球菌の毒性因子を同定するためにオプソニン化貪食アッセイが用いられている。しかしながら、防御免疫応答を誘導する可能性をもたらすことができ、したがって有望なワクチン標的であり得る抗原は、これまでに数個しか同定されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００５−０２６２１８号

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Grohmann 2006

【非特許文献2】Grohmann et al., 2003

【非特許文献3】Schaberg et al., 1982

【非特許文献4】Kurenbach et al., 2003

【非特許文献5】Abajy et al., 2007

【非特許文献6】Alvarez-Martinez and Christie, 2009

【非特許文献7】Abajy 2007

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

したがって、本発明の目的は細菌、特に腸球菌の能動免疫療法又は受動免疫療法のための新たな有望なワクチン標的を提供することである。本発明の別の目的は、上記標的をベースとする新規の有効なワクチンを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0016】

その第１の態様によると、これらの目的は、疾患の治療に使用される単離ペプチドであって、ａ）配列番号１によるＯｒｆ１３配列を含むタンパク質、ｂ）上記タンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも８０％同一なＯｒｆ１３の相同体、ｃ）ａ）又はｂ）に記載の上記タンパク質に由来する免疫原性ペプチド、及び、ｄ）ａ）〜ｃ）のいずれかに特異的に結合する抗体又はその抗原断片から選択される、単離ペプチドを提供することによって本発明により解決される。

【0017】

エンテロコッカス・フェカリスプラスミドｐＩＰ５０１から単離されるＯｒｆ１３は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ５０５８２３．１による以下のアミノ酸配列を有する：
ＭＳＹＹＦＥＩＲＩＩＬＰＥＥＥＮＱＦＬＮＲＫＬＳＫＳＥＬＳＥＶＴＨＹＬＱＱＫＴＳＲＧＩＰＶＫＦＲＶＧＩＦＲＶＥＤＱＴＫＩＭＳＶＴＬＮＴＫＮＴＫＥＴＤＶＩＮＬＬＬＮＲＶＴＤＱＨＶＬＶＹＬＮＥＰＴＥＰＴＬＮＴＱＥＬＮＲＱＥＬＫＴＳＮＥＲＱＥＩＰＱＴＥＩＰＴＥＴＶＮＥＰＳＶＩＫＫＩＳＫＫＮＱＡＫＱＴＮＳＲＫＥＳＬＳＥＳＩＴＫＫＮＶＰＫＩＨＬＦＩＳＩＬＴＬＦＩＶＬＬＩＧＩＳＶＩＱＱＶＱＬＱＳＶＫＫＥＳＥＬＬＥＥＱＩＥＲＶＫＥＴＤＩＳＱＳＫＩＤＴＦＧＲＹＦＬＴＹＹＦＳＱＥＫＮＱＥＮＹＱＳＳＬＲＴＹＶＳＥＫＶＤＩＳＤＷＫＡＬＧＫＴＬＫＳＶＮＹＹＧＳＥＱＴＫＫＧＹＳＶＥＹＬＬＮＶＳＶＤＮＲＳＫＭＱＫＩＴＦＥＶＥＰＴＫＮＧＦＬＶＴＴＱＰＫＬＴＤＦＳＦＮ（配列番号１）

【0018】

加えて、Ｏｒｆ１３相同体が以下のように、２つのエンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）株：Ｅ１６７９（カテーテル先端分離株）及びエンテロコッカス・フェシウム（正：E. faecium）プラスミドｐＶＥＦ３（タンパク質ｐ５１）、５つのエンテロコッカス・フェカリス株：ＨＩＰ１１７０４（無名のプラスミド）、エンテロコッカス・フェカリスＤＳ５（無名のプラスミド）、エンテロコッカス・フェカリスＲＥ２５（プラスミドｐＲＥ２５、ｐＩＰ５０１とほぼ同一のＴ４ＳＳ）、エンテロコッカス・フェカリスＤＳ５（プラスミドｐＡＭβ１）、及びエンテロコッカス・フェカリスＡＤＭ２４８１８、並びに１つのストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）株（プラスミドｐＳＭ１９０３５）で同定されている。

【0019】

【表1】

【0020】

したがって、ＯＲＦ１３は例えばエンテロコッカス・フェカリス株及びエンテロコッカス・フェシウム株等の幾つかの病原性細菌に存在すると考えられるため、例えば腸球菌の能動免疫療法又は受動免疫療法のための有望なワクチン標的である。

【0021】

細菌の毒性因子に対する免疫原性及び防御効率の有効な分析に適切な動物モデルは存在しないため、代わりにオプソニン化貪食アッセイが、哺乳動物のｉｎ ｖｉｖｏ免疫応答をｉｎ ｖｉｔｒｏでシミュレートし、例えば有効な抗細菌ワクチンとすることのできる腸球菌の毒性因子を同定するために用いられる（Markus Hufnagel, Steffi Koch, Andrea Kropec, Johannes Huebner: Opsonophagocytic assay as a potentially useful tool for assessing safety of enterococcal preparations. International Journal of Food Microbiology 88 (2003) 263-267）。

【0022】

Ｏｒｆ１３については、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴ−ＤＮＡ導入系のＴ４ＳＳサブユニットＶｉｒＢ８及びＶｉｒＢ１０について示されているように、膜から遠位に伸びるＴ４ＳＳチャネルの一部に対する足場機能が提唱されている（非特許文献６）。Ｏｒｆ１３は１つの予測膜貫通ヘリックスを有する（非特許文献７）。エンテロコッカス・フェカリスのＪＨ２−２細胞画分中では、Ｏｒｆ１３は抗Ｏｒｆ１３抗体による免疫ブロット解析を用いて細胞エンベロープに位置付けられた。したがって、本発明によるペプチドは好ましくはチャネル形成成分であり、Ｔ４ＳＳチャネルの一部を構築する活性を有するのが好ましい。

【0023】

また、本発明の別の態様は、本発明との関連で疾患の治療に使用されるＯｒｆ１３ペプチドのいずれかに特異的に結合する抗体又はその抗原断片に関する。上記抗体又はその抗原断片がモノクローナル抗体、ｓｃＦＶ断片及びＦａｂ断片から選択される、本発明によるペプチドが好ましい。抗体は更にヒトの又はヒト化した抗体又は断片であってもよい。抗体を産生する方法は当業者に既知であり、それぞれの文献中に記載されている。

【0024】

本発明は、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、及びクロストリジウム、リステリア又はストレプトコッカス・ピオゲネスの株によって引き起こされる感染症等の細菌感染症、特に複数の抗生物質に対して耐性を示す株、例えば多剤耐性のエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス及びコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、及びクロストリジウム又はリステリアの株によって引き起こされる細菌感染症を治療するために新たな治療的アプローチを提供する。それぞれの多剤耐性株は文献中にも記載されている。したがって、本発明の更なる態様は、特に（正：particularly）かかる株の治療を提供することである。これに関連して、上記Ｏｒｆ１３の相同体がエンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス又はストレプトコッカス・ニューモニエ（正：S. pneumoniae）のかかる抗生物質耐性株から単離されたプラスミドによってコードされるのが特に好ましい。

【0025】

また、本発明の別の態様は、本発明によるペプチド（すなわち、配列番号１によるＯｒｆ１３配列を含むタンパク質、上記タンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも８０％同一なＯｒｆ１３の相同体、配列番号１による上記タンパク質若しくは上記相同体に由来する免疫原性ペプチド、又は配列番号１若しくは上記相同体のいずれかに特異的に結合する抗体若しくはその抗原断片の少なくとも１つ）と、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び／又は希釈剤とを含む医薬組成物に関する。好ましくは、上記医薬組成物は細菌感染症、特に腸球菌感染症の予防に効果的である。

【0026】

好ましくは、本発明による医薬組成物はワクチンである。このため、本発明の別の態様によると、本発明による１つ又は複数のペプチド（すなわち、配列番号１によるＯｒｆ１３配列を含むタンパク質、上記タンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも８０％同一なＯｒｆ１３の相同体、配列番号１による上記タンパク質若しくは上記相同体に由来する免疫原性ペプチド、又は配列番号１若しくは上記相同体のいずれかに特異的に結合する抗体若しくはその抗原断片の少なくとも１つ）を薬学的に許容可能な担体、希釈剤又はアジュバントと混合して含むワクチン組成物が提供される。薬学的に許容可能な担体には破傷風トキソイド又はジフテリアトキソイドも含まれる。本発明による医薬組成物は、少なくとも１つのサイトカインを更に含んでいてもよい。

【0027】

好適なアジュバントとしては油、すなわちフロイント完全アジュバント又はフロイント不完全アジュバント；塩、すなわちＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２、シリカ、カオリン、炭素；ポリヌクレオチド、すなわちポリＩＣ及びポリＡＵが挙げられる。好ましいアジュバントとしては、ＱｕｉｌＡ及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌが挙げられる。

【0028】

また、本発明の別の態様は、ペプチドが莢膜多糖類等の免疫担体（immunocarrier）に共有結合又はコンジュゲートした医薬組成物に関する。

【0029】

本発明のワクチンは、注射、急速注入、鼻咽頭吸収（nasopharyngeal absorption）、皮膚吸収（dermoabsorption）によって非経口投与するか、又は口腔（正：buccally）投与若しくは経口（正：orally）投与することができる。上記ワクチンは筋肉内経路、皮下経路又は吸入経路による投与のために配合することもできる。

【0030】

また、本発明の別の態様は、細菌によって引き起こされる疾患若しくは病態、及び／又は細菌感染症によって媒介される疾患及び症状、例えば腸球菌感染症、尿路感染症、菌血症、細菌性心内膜炎、腹膜炎、創傷感染症又は軟部組織感染症、肺炎及び髄膜炎等の予防的治療又は治療的治療のための本発明によるペプチド又は医薬組成物に関する。好ましくは、上記細菌は腸球菌、ブドウ球菌又は連鎖球菌、例えばエンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）又はストレプトコッカス・ピオゲネス等、特にそれらの抗生物質耐性株、更に好ましくは複数の抗生物質に対して耐性を示す株、例えば多剤耐性のエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・ニューモニエ及びスタフィロコッカス・アウレウスから選択される。また、本発明の別の態様は、本明細書に記載の疾患又は病態の予防的治療又は治療的治療のための本発明によるペプチド又は医薬組成物の使用に関する。

【0031】

特に好ましい実施の形態では、細菌感染症、特に腸球菌感染症の危険性がある個体、例えば乳児、高齢者及び免疫不全者にワクチンを投与する。

【0032】

本願で使用される場合、「個体」という用語は哺乳動物を含む。更なる実施の形態では、哺乳動物はヒトである。

【0033】

ワクチン組成物は、好ましくは約０．００１Ｐｇ／ｋｇ〜１００Ｐｇ／ｋｇ（ペプチド／体重）、より好ましくは０．０１Ｐｇ／ｋｇ〜１０Ｐｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１Ｐｇ／ｋｇ〜１Ｐｇ／ｋｇの単位剤形で、免疫化間に約１週間〜６週間の間隔をおいて１回〜３回投与される。

【0034】

また、本発明の別の態様は本発明による医薬組成物、好ましくはワクチンを作製する方法であって、配列番号１によるＯｒｆ１３配列を含むタンパク質、上記タンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも８０％同一なＯｒｆ１３の相同体、配列番号１による上記タンパク質若しくは上記相同体に由来する免疫原性ペプチド、又は配列番号１若しくは上記相同体のいずれかに特異的に結合する抗体若しくはその抗原断片の少なくとも１つを、上記に記載の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又はアジュバントと混合することを含む、方法に関する。

【0035】

また、本発明の別の態様は、個体における細菌によって引き起こされる疾患若しくは病態、及び／又は細菌感染症によって媒介される疾患及び症状、例えば細菌感染症、腸球菌感染症、尿路感染症、菌血症、細菌性心内膜炎、腹膜炎、創傷感染症及び軟部組織感染症、及び髄膜炎又は肺炎等の治療的治療又は予防的治療のための方法であって、上記個体に治療的又は予防的な量の本発明による医薬組成物、好ましくはワクチンを投与することを含む、方法に関する。好ましくは、上記疾患又は症状は腸球菌、ブドウ球菌又は連鎖球菌、例えばエンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス、スタフィロコッカス・アウレウス又はストレプトコッカス・ピオゲネス等、特にそれらの抗生物質耐性株、更に好ましくは複数の抗生物質に対して耐性を示す株、例えば多剤耐性のエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・ニューモニエ及びスタフィロコッカス・アウレウス、又はコアグラーゼ陰性ブドウ球菌から選択される細菌によって引き起こされる。

【0036】

また、本発明の別の態様は細菌感染症、特に腸球菌感染症に対する免疫応答を脊椎動物において誘導する方法であって、上記脊椎動物に免疫学的に有効な量の本発明による医薬組成物、好ましくはワクチンを投与することを含む、方法に関する。

【0037】

筋肉内に、皮下に、又は吸入によって治療的に有効な量の本発明による医薬組成物、好ましくはワクチンを上記脊椎動物に投与することを含む、本明細書に記載の治療及び／又は予防法のための方法が好ましい。

【0038】

個体の免疫系の活性を改善する付加的な抗生物質及び／又は調製物から選択される活性物質の投与を更に含む、本明細書に記載の治療及び／又は予防法のための方法が更に好ましい。

【0039】

また、本発明の別の態様は、抗菌物質をスクリーニングする方法であって、ａ）本発明による単離ペプチド（すなわち、配列番号１によるＯｒｆ１３配列を含むタンパク質、上記タンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも８０％同一なＯｒｆ１３の相同体、配列番号１による上記タンパク質又は上記相同体に由来する免疫原性ペプチド）と、抗菌物質を含有すると推測されるサンプルとを混合する工程と、ｂ）上記単離ペプチドと抗菌候補物質との結合について混合物をモニタリングする工程とを含む、方法に関する。

【0040】

抗菌物質を単離及び合成するための好ましい一戦略は、（例えば蛍光標識、酵素標識、質量標識（mass label）等を用いて）本発明による単離ペプチドを標識し、抗菌候補物質と上記ペプチドとの相互作用（例えば結合）による標識の変化を測定することである。別の代替形態は、例えばＯＲＦ１３のチャネル形成活性を阻害するために使用され得る、ＯＲＦ１３に結合するペプチドを同定することができるファージディスプレイアッセイである。

【0041】

したがって、上記に記載のＯｒｆ１３又はその相同体によるチャネル形成に対する上記抗菌候補物質の効果を判定する工程を更に含む、本発明による抗菌物質をスクリーニングする方法が好ましい。

【0042】

また、本発明の更に別の態様は、サンプルにおける本発明によるＯｒｆ１３ペプチド（抗原）又はその相同体（抗原）の存在を検出する診断アッセイであって、ａ）本発明による抗体又はその断片と、Ｏｒｆ１３を含有すると推測されるサンプルとを混合する工程と、ｂ）上記サンプルにおける上記Ｏｒｆ１３抗原と上記抗体又はその断片との結合について混合物をモニタリングする工程とを含む、診断アッセイに関する。

【0043】

上記抗体又はその断片を固体マトリクスに固定化する、本発明による診断アッセイが好ましい。抗体若しくはその断片、又はＯｒｆ１３ペプチド（抗原）若しくはその相同体（抗原）の両方又は一方を、（例えば蛍光標識、酵素標識、質量標識等を用いて）診断のために標識することができる。

【0044】

多耐性グラム陽性菌は、世界的に院内における継続的で高まりつつある脅威となっている。複雑な機構によってこれらの病原体が遺伝情報を交換することが可能となり、とりわけ耐性決定因子の分布が、それらの院内集団発生及び地方的な蔓延を引き起こす傾向につながる。本発明で提示したように、遺伝子交換に関与する非常に重要な要因の１つである、いわゆるＩＶ型分泌系の特異的タンパク質は、多くの場合に治療不可能なこれらの感染症に対抗するために現在利用することのできる弱点である。

【0045】

原型的なグラム陽性ＩＶ型分泌系はプラスミドｐＩＰ５０１上に存在し、導入領域の幾つかのタンパク質がエシェリヒア・コリにおいて発現されている。ウサギ血清をＡＴＰアーゼ及び推定チャネル成分をコードする２つのタンパク質、すなわちＯＲＦ１０及びＯＲＦ１３に対して産生させた。このウサギ血清をオプソニン化貪食アッセイに使用したが、ＯＲＦ１３に対して産生させた血清は、１０倍の希釈率で相同株に対して９９．２％の致死を示した。漸増量の精製タンパク質による血清の吸着を用いると、この致死を最大４４．５％まで阻害することができた。種々の種に由来する株のより大きなコレクションの試験から、１つのバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス株及びＵＳＡ３００ ＣＡ−ＭＲＳＡを含む、２／２（１００％）のエンテロコッカス・フェカリス、２／４（５０％）のエンテロコッカス・フェシウム、及び５／５（１００％）のスタフィロコッカス・アウレウスが、抗ＯＲＦ１３によって１０倍の希釈率で効果的に死滅することが明らかとなった。ウエスタンブロット分析によって、試験した３つのうち２つのエンテロコッカス・フェカリス株、４つのうち３つのエンテロコッカス・フェシウム株、及び５つ全てのスタフィロコッカス・アウレウス株のそれぞれにおける交差反応性タンパク質バンドが実証され、これにより上記株における同様の状況が示される。相同株エンテロコッカス・フェカリスＪＨ２−２ｐＩＰ５０１（Ｏｒｆ１３タンパク質を発現する）は、３７．５ｋＤａにバンドを示した。対照株とは異なり、全てのスタフィロコッカス・アウレウス株が５０ｋＤａにバンドを示し、他の腸球菌株は５５ｋＤａのバンドを示した。マウス菌血症モデルを用いた場合、ＯＲＦ１０に対する抗血清を与え、相同エンテロコッカス・フェカリス（正：E. faecalis）、並びにエンテロコッカス・フェシウム及びＣＡ−ＭＲＳＡ株でチャレンジした動物と比較して、抗ＯＲＦ１３を与えた動物においてコロニー数の顕著な減少が見られた。これらのデータから、ＯＲＦ１３がオプソニン抗原及び防御抗原の標的であり、したがって多耐性グラム陽性病原体を標的とする広く交差防御性の有望なワクチン候補となることが実証される。

【0046】

他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。抵触の場合には、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法及び実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】下記実施例によるオプソニン化貪食アッセイの結果を示す図である。白色のバー：ＯＲＦ１３に対して産生させた未吸着の血清；黒色のバー：精製ＯＲＦ１３タンパク質で吸着させた抗ＯＲＦ１３血清。図面訳% Killing 致死率（％）anti-Orf13 抗Ｏｒｆ１３

【0048】

配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ５０５８２３．１による、エンテロコッカス・フェカリスプラスミドｐＩＰ５０１から単離されたＯｒｆ１３のアミノ酸配列を示す。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0049】

材料及び方法：
Ｏｒｆ１３は３２２個のアミノ酸からなり（分子量３７４７９．７６Ｄａ）、ｐＩは８．８６である。ｏｒｆ１３を、アミノ末端７×Ｈｉｓタグを有するエシェリヒア・コリ発現ベクターにクローニングし（非特許文献５）、過剰発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した（Goessweiner-Mohr, N., Grohmann, E., and Keller, W.、未発表データ）。精製タンパク質を使用してウサギを免疫化した。ＯＲＦ７及びＯＲＦ１０に対して同様に（正：similarly）調製した血清を対照として使用した。

【0050】

高度免疫ウサギ血清を、ヒトボランティアから調製した白血球、及び補体源として仔ウサギ血清を用いてオプソニン化貪食アッセイによって検査した（Theilacker et al. Mol Microbiol 2009）。未希釈の血清を使用する場合、抗ＯＲＦ７血清を用いると３７．７％の致死が見られ、抗ＯＲＦ８血清及び抗ＯＲＦ１１血清を用いると致死は見られなかった。しかしながら、ＯＲＦ１３に対する血清は８２．９％の致死をもたらした。エンテロコッカス・フェカリス９型を対照として使用する場合（この株はＴ４ＳＳを含有しないことが既知であるため）、抗ＯＲＦ１３血清を用いても僅か１４％の致死しか観察されなかった。

【0051】

特異性を確認するために、１０倍の血清希釈率を用い、様々な量の精製抗原を特異的阻害剤として使用した。１００ｕｇの精製タンパク質による抗ＯＲＦ１３血清の前吸着（Preabsorption）は４５％の阻害をもたらしたが、より少量の阻害タンパク質は、より低い致死の阻害をもたらした（図１を参照されたい）。これらのデータから、ＯＲＦ１３がオプソニン抗体の標的であり、この精製タンパク質による吸着によってＯＲＦ１３に対して産生させた高度免疫血清の致死能を排除可能であることが確認される。

【0052】

加えて、Ｏｒｆ１３は、２つのエンテロコッカス・フェシウム株：Ｅ１６７９（カテーテル先端分離株）及びエンテロコッカス・フェシウムプラスミドｐＶＥＦ３（タンパク質ｐ５１）、５つのエンテロコッカス・フェカリス株：ＨＩＰ１１７０４（無名のプラスミド）、エンテロコッカス・フェカリスＤＳ５（無名のプラスミド）、エンテロコッカス・フェカリスＲＥ２５（プラスミドｐＲＥ２５、ｐＩＰ５０１とほぼ同一のＴ４ＳＳ）、エンテロコッカス・フェカリスＤＳ５（プラスミドｐＡＭβ１）、並びに１つのストレプトコッカス・ピオゲネス株（プラスミドｐＳＭ１９０３５）に相同体を有する（上記も参照されたい）。したがって、ＯＲＦ１３は幾つかのエンテロコッカス・フェカリス株及びエンテロコッカス・フェシウム株に存在すると考えられるため、例えば腸球菌等の病原性細菌の能動免疫療法又は受動免疫療法のための有望なワクチン標的である。

【0053】

引用文献
1. Abajy, M. Y. Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zum Typ IV Sekretion-aehnlichen System (T4SLS) des konjugativen Antibiotikaresistenzplasmids pIP501 in Enterococcus faecalis. (2007). PhD Thesis, TU Berlin, Berlin.
2. Abajy, M. Y., Kopec, J., Schiwon, K., Burzynski, M., Doering, M., Bohn, C., and Grohmann, E. (2007). A type IV-secretion-like system (T4SLS) is required for conjugative DNA transport of plasmid pIP501 with broad host range in Gram-positive bacteria J. Bacteriol. 189: 2487-2496.
3. Alvarez-Martinez, C. E., and Christie, P. J. (2009). Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73: 775-808.
4. Grohmann, E., Muth, G., and Espinosa, M. (2003). Conjugative plasmid transfer in Gram-positive bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 277-301.
5. Grohmann, E. (2006). Mating cell-cell channels in conjugating bacteria. In Cell-Cell Channels (eds. Baluska, F., Volkmann, D., and Barlow, P.W.), Landes Biosciences, Georgetown, Texas, pp. 21-38. ISBN: 1-58706-065-5.
6. Kurenbach, B., Bohn, C., Prabhu, J., Abudukerim, M., Szewzyk, U., and Grohmann, E. (2003). Intergeneric transfer of the Enterococcus faecalis plasmid pIP501 to Escherichia coli and Streptomyces lividans and sequence analysis of its tra region. Plasmid 50: 86-93.
7. Schaberg, D.R., Clewell, D. B., and Glatzer, L. 1982. Conjugative transfer of R-plasmids from Streptococcus faecalis to Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 22:204-207.
8. Zhu, W., Murray, P.R., Huskins, W.C., Jernigan, J.A., McDonald, L.C., Clark, N.C., Anderson, K.F., McDougal, L.K., Hageman, J.C., Olsen-Rasmussen, M., Frace, M., Alangaden, G.J., Chenoweth, C., Zervos, M.J., Robinson-Dunn, B., Schreckenberger, P.C., Reller, L.B., Rudrik, J.T. and Patel, J.B. Dissemination of an Enterococcus Inc18-Like vanA Plasmid Associated with Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus, Antimicrob. Agents Chemother. 54 (10), 4314-4320 (2010).
9. Theilacker C, Sanchez-Carballo P, Toma I, Fabretti F, Sava I, Kropec A, Holst O, Huebner J. Glycolipids are involved in biofilm accumulation and prolonged bacteraemia in Enterococcus faecalis. Mol Microbiol. 2009 Feb;71(4):1055-69.

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]