特許 6338766 非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用したマイクロ粒子分離及び洗浄方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6338766

(24)【登録日】2018年5月18日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用したマイクロ粒子分離及び洗浄方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/10 20060101AFI20180528BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20180528BHJP

   G01N 1/34 20060101ALI20180528BHJP

   G01N 1/28 20060101ALI20180528BHJP

   B03B 5/00 20060101ALI20180528BHJP

【ＦＩ】

   G01N1/10 A

   G01N37/00 101

   G01N1/34

   G01N1/28 J

   B03B5/00 Z

【請求項の数】16

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2017-507417(P2017-507417)

(86)(22)【出願日】2016年6月30日

(65)【公表番号】特表2018-513348(P2018-513348A)

(43)【公表日】2018年5月24日

(86)【国際出願番号】KR2016006991

(87)【国際公開番号】WO2017126755

(87)【国際公開日】20170727

【審査請求日】2017年2月8日

(31)【優先権主張番号】10-2016-0008170

(32)【優先日】2016年1月22日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】515162224

【氏名又は名称】コリア アドバンスド インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】スン，ヒョン−ジン

(72)【発明者】

【氏名】ハ，ビョン−ハン

【審査官】 渡▲辺▼ 純也

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−２２４７７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０００−５１２５４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００３／００８９８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／１１６９９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／００６５６８８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Byunghang Ha et. al.，Transfer of Microparticles across Laminar Streams from Non-Newtonian to Newtonian Fluid，Analytical Chemistry，米国，ACS Publications，２０１６年 ３月２８日，Vol. 88，p4205 - p4210

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ １／００ 〜 １／４４

Ｇ０１Ｎ ３７／００

Ｂ０３Ｂ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｓｃｏｐｕｓ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

流体チャネル内に非ニュートン流体とニュートン流体を並行層流状に流動させて、前記流体チャネルの内部に作用する力の平衡をなす粒子集束位置の変化によって、前記非ニュートン流体内に含まれている微小粒子の中から目標粒子を前記ニュートン流体内へ分離または移動させることを特徴とする、非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項2】

前記非ニュートン流体は、
緩和時間が十分に大きいポリマーを含有して、前記目標粒子に対する弾性揚力が慣性揚力よりもさらに大きく、
前記ポリマー含有濃度が高いため、前記目標粒子の流線を横切る移動速度を十分に有するようにする、請求項１に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項3】

前記非ニュートン流体は、
血液、血球が粉砕された血液、血清またはリンパを含む天然生体液の中から選択された少なくとも一つからなる、請求項２に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項4】

前記非ニュートン流体は、人為的に粘弾性を持つように人工ポリマーが加えられて作成される、請求項２に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項5】

前記人工ポリマーが、
緩和時間が１ｍｓ以上の水溶性ポリマーを含む、請求項４に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項6】

前記人工ポリマーが、
λ−ＤＮＡ、ペアレント・エッセンシャル・オイル及びポリビニルピロリドンの中から選択された少なくとも一つからなる、請求項５に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項7】

前記ニュートン流体は、前記目標粒子に対する慣性揚力が弾性揚力よりもさらに大きい流体からなる、請求項２に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項8】

前記ニュートン流体は、水、グリセリン水溶液またはリン酸緩衝生理食塩水を含む、請求項７に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項9】

前記流体チャネル内の前記非ニュートン流体と前記ニュートン流体がそれぞれ占める断面積の面積比が約１：１である、請求項１に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項10】

前記流体チャネルの大きさが前記目標粒子の有効直径に比例して形成される、請求項１に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項11】

前記流体チャネルの断面積に対するアスペクト比が１以上である、請求項１０に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項12】

前記流体チャネルの長さが、前記非ニュートン流体の流速または弾性数に反比例して形成される、請求項１０に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項13】

前記流体チャネルの長さが１Ｌ〜１０Ｌの範囲以内で形成され、
ここで、前記流体チャネルの最小長さＬが、

【数1】

を満足する（式中、Ｕ_ｍａｘは最大チャネル速度であり、ｆ_Ｌは経験比例定数であり、ｗは流体チャネルの幅であり、ｄは目標粒子の有効径であり、μは流体の粘度であり、ρは流体の密度である。）、請求項１２に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項14】

前記流体チャネルの最小長さＬ以内で慣性集束がなされるための最小流量Ｑが、

【数2】

を満足する（式中、ｈは前記流体チャネルの高さであり、ｗは流体チャネルの幅であり、ｆ_Ｌは経験比例定数である）、請求項１３に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項15】

前記流体チャネルが流体チップの内部に形成され、
前記流体チップがシリコーン系ポリマー、プラスティック、ガラス、シリコン及び金属の中から選択されるいずれか一つからなる、請求項１に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【請求項16】

前記流体チップが、前記ニュートン流体の流入する第１入口と前記非ニュートン流体の流入する第２入口とが所定の角度を成して前記流体チャネルの先端部に互いに合岐されるように形成され、
前記流体チャネルの後端部から、前記目標粒子の含まれた前記ニュートン流体を排出する第１出口と前記非ニュートン流体を排出する第２出口とが所定の角度を成して分岐されて形成され、
前記第１出口及び第２出口の流動抵抗が、流路の断面設計変更またはバルブ活用を介して、前記非ニュートン流体と前記ニュートン流体が分かれる流線の位置を調節する、請求項１５に記載の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法に係り、さらに詳しくは、非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用して、非ニュートン流体内に含まれている微小粒子の中から所望の粒子をニュートン流体側へ分離し、或いは、非ニュートン流体内に含まれている微小粒子を洗浄のためにニュートン流体側へ移動させる、非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法に関する。

【背景技術】

【0002】

微小粒子、すなわち、マイクロ以下の粒子や細胞などの分離及び洗浄は、生物学研究及び臨床で広く使われる重要な実験過程である。微小粒子の効果的な分析と診断のために、サンプルは、互いに異なる試料に移す過程によって分離され、洗浄され、ラベル付け（ｌａｂｅｌｉｎｇ）される。

【0003】

代表的な例として、生物学研究において最も広く使われるプロトコルである細胞の蛍光染色を挙げることができる（非特許文献１、２）。細胞を蛍光染料が溶けている試料に取り込ませて蛍光染料と十分に結合した後、次の研究のための新しい培地溶液に移される。このとき、細胞は、新しい培地溶液によって洗浄されて蛍光染料残渣が除去される。この洗浄過程は染色結果の最適化のために必要であるが、その理由は、蛍光染料残渣が細胞に有害であるか、或いは細胞内小器官と望ましくない反応を引き起こすおそれがあるからである（非特許文献３）。

【0004】

別の例として、全血中の白血球のみを分離する免疫学研究の前処理が挙げられる（非特許文献４）。免疫学において最も大きな研究対象である末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ；Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ）を分離する作業は、高密度のショ糖溶液を血液と混ぜた後、密度勾配遠心分離法（Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によって行われる。

【0005】

そして、赤血球を粉砕するライシスバッファー（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を混ぜて赤血球を破壊した後、必要に応じて好中球（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）と好酸球（Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｅｓ）の追加分離を行う。

【0006】

ここで、遠心分離（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）による分離作業が完了すると、サンプルからショ糖溶液と溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を除去しなければならない。これはこれらの溶液に細胞が長く晒されると細胞にとって致命的であるからである。また、白血球サンプルの純度を高めて調査精度を高めるためには、ライシス（ｌｙｓｉｓ）に由来した残渣（Ｄｅｂｒｉｓ）とその他の細胞由来物も除去されなければならない。

【0007】

血球洗浄は臨床においても広く使われる。代表的な例として、心臓手術時に行われる自己輸血法（Ａｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）において悪玉コレステロール（Ｌｉｐｉｄ Ｍｉｃｒｏｅｍｂｏｌｉ）などの汚染物質をフィルタリングし、血液を患者の身体に再流入させる場合を挙げることができる（非特許文献５）。時には薬、凝固、活性化された白血球（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｓ）と血小板（Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）のため血漿が除去されなければならないこともある（非特許文献６、７）。微小粒子、すなわち、細胞だけでなく、マイクロ粒子の分離及び洗浄も、これを用いた実験ではサンプル準備及び抽出のための必須過程となる（非特許文献８）。

【0008】

微小粒子、すなわち、マイクロ粒子や細胞などの分離及び洗浄を行う通常の方法は遠心分離（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）である。

【0009】

ところが、遠心分離の際に、細胞は、非常に大きいせん断応力（Ｓｈｅａｒ Ｓｔｒｅｓｓ）に晒されるため、容易に損傷してしまう（非特許文献９）。さらに、ピペッティングを介してサンプル採取を行わなければならないため、高効率かつ高純度のサンプル採取が不可能である。

【0010】

また、遠心分離法は、全過程が自動でも連続的方式でも行われないので、高効率のサンプル採取のために、熟練した専門家のノウハウが必要であり、１回あたりの処理量が制限される点に欠点を持つ。遠心分離を複数回繰り返すと欠点が緩和される可能性があるが、時間とお金がたくさんかかる。

【0011】

上述した遠心分離法の欠点を克服するために、様々なマイクロ流体技術が開発されてきた（非特許文献１０、１１）。

【0012】

マイクロ流体技術は能動的方法と受動的方法に大別される。受動的方法は、マイクロ流体の流動に内在している水力学的な力だけを利用する。したがって、粒子と流体の動きは、マイクロチャネルの形状、粒子と流体の性質、流動条件などによって予め決定される。

【0013】

受動的方法としては、Ｐｉｎｃｈｅｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（非特許文献１２、１３）、Ｉｎｅｒｔｉａ及び／又はＤｅａｎ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（非特許文献１４〜１６）、Ｍｉｃｒｏ Ｖｏｒｔｅｘ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ（非特許文献１７）、Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ（非特許文献１８）、Ｚｗｅｉｆａｃｈ−Ｆｕｎｇ ｅｆｆｅｃｔ（非特許文献１９）、Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（非特許文献２０〜２３）、Ｍｉｃｒｏ Ｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｎｅ（非特許文献２４）などが学界に報告されている。

【0014】

一方、能動的方法は、外力をさらに活用して粒子が流線を行き来するように制御する方法である。音響（非特許文献２５、２６）、磁気（非特許文献２７、２８）、光（非特許文献２９、３０）、誘電泳動力（Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｆｏｒｃｅ）（非特許文献３１〜３３）を利用した方法が学界に報告されている。

【0015】

これらの方法はいずれもそれぞれの利点と欠点を持つ。一般に、受動的方法は、実現及び駆動が容易であるが、適応性及び効率性に劣るという欠点を持つ。これに対し、能動的方法は、適応性と効率性に優れるが、実現が複雑で難しいという欠点を持つ（非特許文献１０）。

【0016】

現在までに開発された微小粒子（マイクロ粒子／細胞）を取り扱うほとんどのマイクロ流体技法は、高効率を得るためにサンプルを希釈しなければならないという限界がある。高流量を処理することにより、かかる問題を多少解決することはできるが、膨大な量の培地溶媒を消耗するという欠点を持つ。

【0017】

Ｉｎｅｒｔｉａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｅｔｈｏｄ（非特許文献３４）を一例として挙げると、例えば、その高流量を処理する革新的な能力でマイクロ粒子を分離／洗浄することができるが、低い粒子密度を持つサンプルに対してのみ効果がある。結局、現実的な研究環境または臨床に適用するためには、高粒子密度を有する液体サンプルを処理する能力が不可欠である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0018】

【非特許文献1】Eugene C. Butcher, I.L.W., Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. Journal of Immunological Methods, 1980. 37: p. 97-108.

【非特許文献2】Darzynkiewicz, Z., H.A. Crissman, and Z. Darynkiewicz, Flow Cytometry. Methods in Cell Biology. 1990: Elsevier Science & Technology.

【非特許文献3】De Clerck, L.S., et al., Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of immunological methods, 1994. 172(1): p. 115-124.

【非特許文献4】Bossuyt, X., G.E. Marti, and T.A. Fleisher, Comparative analysis of whole blood lysis methods for flow cytometry. Cytometry, 1997. 30(3): p. 124-133.

【非特許文献5】Pugsley, W., et al., The impact of microemboli during cardiopulmonary bypass on neuropsychological functioning. Stroke, 1994. 25(7): p. 1393-1399.

【非特許文献6】Reents, W., et al., Influence of different autotransfusion devices on the quality of salvaged blood. The Annals of thoracic surgery, 1999. 68(1): p. 58-62.

【非特許文献7】Petersson, F., et al., Carrier medium exchange through ultrasonic particle switching in microfluidic channels. Analytical chemistry, 2005. 77(5): p. 1216-1221.

【非特許文献8】Sista, R., et al., Development of a digital microfluidic platform for point of care testing. Lab Chip, 2008. 8(12): p. 2091-104.

【非特許文献9】Peterson, B.W., et al., Bacterial cell surface damage due to centrifugal compaction. Appl Environ Microbiol, 2012. 78(1): p. 120-5.

【非特許文献10】Sajeesh, P. and A.K. Sen, Particle separation and sorting in microfluidic devices: a review. Microfluidics and Nanofluidics, 2013. 17(1): p. 1-52.

【非特許文献11】Shields, C.W.t., C.D. Reyes, and G.P. Lopez, Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip, 2015. 15(5): p. 1230-49.

【非特許文献12】Yamada, M., M. Nakashima, and M. Seki, Pinched flow fractionation: continuous size separation of particles utilizing a laminar flow profile in a pinched microchannel. Analytical chemistry, 2004. 76(18): p. 5465-5471.

【非特許文献13】Lu, X. and X. Xuan, Continuous Microfluidic Particle Separation via Elasto-Inertial Pinched Flow Fractionation. Anal Chem, 2015. 87(12): p. 6389-96.

【非特許文献14】Park, J.-S. and H.-I. Jung, Multiorifice flow fractionation: Continuous size-based separation of microspheres using a series of contraction/expansion microchannels. Analytical chemistry, 2009. 81(20): p. 8280-8288.

【非特許文献15】Kuntaegowdanahalli, S.S., et al., Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip, 2009. 9(20): p. 2973-80.

【非特許文献16】Hur, S.C., et al., Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip, 2011. 11(5): p. 912-20.

【非特許文献17】Hsu, C.H., et al., Microvortex for focusing, guiding and sorting of particles. Lab Chip, 2008. 8(12): p. 2128-34.

【非特許文献18】Huang, L.R., et al., Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science, 2004. 304(5673): p. 987-990.

【非特許文献19】Yang, S., A. Undar, and J.D. Zahn, A microfluidic device for continuous, real time blood plasma separation. Lab Chip, 2006. 6(7): p. 871-80.

【非特許文献20】Crowley, T.A. and V. Pizziconi, Isolation of plasma from whole blood using planar microfilters for lab-on-a-chip applications. Lab Chip, 2005. 5(9): p. 922-9.

【非特許文献21】Murthy, S.K., et al., Size-based microfluidic enrichment of neonatal rat cardiac cell populations. Biomed Microdevices, 2006. 8(3): p. 231-7.

【非特許文献22】Chen, X., et al., Microfluidic chip for blood cell separation and collection based on crossflow filtration. Sensors and Actuators B: Chemical, 2008. 130(1): p. 216-221.

【非特許文献23】Yamada, M. and M. Seki, Hydrodynamic filtration for on-chip particle concentration and classification utilizing microfluidics. Lab Chip, 2005. 5(11): p. 1233-9.

【非特許文献24】Bhardwaj, P., P. Bagdi, and A.K. Sen, Microfluidic device based on a micro-hydrocyclone for particle-liquid separation. Lab Chip, 2011. 11(23): p. 4012-21.

【非特許文献25】Lenshof, A., C. Magnusson, and T. Laurell, Acoustofluidics 8: applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab Chip, 2012. 12(7): p. 1210-23.

【非特許文献26】Li, S., et al., Standing surface acoustic wave (SSAW)-based cell washing. Lab Chip, 2015. 15(1): p. 331-8.

【非特許文献27】Zborowski, M. and J.J. Chalmers, Rare cell separation and analysis by magnetic sorting. Anal Chem, 2011. 83(21): p. 8050-6.

【非特許文献28】Hoshino, K., et al., Microchip-based immunomagnetic detection of circulating tumor cells. Lab Chip, 2011. 11(20): p. 3449-57.

【非特許文献29】MacDonald, M., G. Spalding, and K. Dholakia, Microfluidic sorting in an optical lattice. Nature, 2003. 426(6965): p. 421-424.

【非特許文献30】Wang, X., et al., Enhanced cell sorting and manipulation with combined optical tweezer and microfluidic chip technologies. Lab Chip, 2011. 11(21): p. 3656-62.

【非特許文献31】Gascoyne, P.R. and J. Vykoukal, Particle separation by dielectrophoresis. Electrophoresis, 2002. 23(13): p. 1973.

【非特許文献32】Park, S., et al., Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab Chip, 2011. 11(17): p. 2893-900.

【非特許文献33】Hu, X., et al., Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(44): p. 15757-61.

【非特許文献34】Gossett, D.R., et al., Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small, 2012. 8(17): p. 2757-64.

【非特許文献35】Yang, S., et al., Sheathless elasto-inertial particle focusing and continuous separation in a straight rectangular microchannel. Lab Chip, 2011. 11(2): p. 266-73.

【非特許文献36】Bhagat, A.A.S., S.S. Kuntaegowdanahalli, and I. Papautsky, Enhanced particle filtration in straight microchannels using shear-modulated inertial migration. Physics of Fluids, 2008. 20(10): p. 101702.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0019】

本発明は、上述した問題点を解決するためのもので、その目的は、非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用して遠心分離器を使用せずに天然生体液（Ｎａｔｉｖｅ Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）から直接所望の微小粒子のみをクリーンなニュートン流体側へ移動させるようにするが、特に手動注射器のポンピングのみで高効率の分離及び洗浄を行うことができる、非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0020】

上記の目的を達成するために、本発明の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法は、流体チャネル内に非ニュートン流体とニュートン流体を並行層流状に流動させて、前記流体チャネルの内部に作用する力の平衡をなす粒子集束位置の変化によって、前記非ニュートン流体内に含まれている微小粒子の中から目標粒子を前記ニュートン流体内へ分離または移動させることを特徴とする。

【0021】

ここで、前記非ニュートン流体は、緩和時間（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）が十分に大きいポリマーを含有し、前記目標粒子に対する弾性揚力が慣性揚力よりもさらに大きく、前記ポリマー含有濃度が高いため、前記目標粒子の流線を横切る移動速度を十分に有することが好ましい。

【0022】

また、前記非ニュートン流体は、血液（Ｂｌｏｏｄ）、血球が粉砕された血液（ＢＣ−ｌｙｓｅｄ ｂｌｏｏｄ）、血清（Ｓｅｒｕｍ）またはリンパ（Ｌｙｍｐｈ）を含む天然生体液の中から選択された少なくとも一つからなってもよい。

【0023】

また、前記非ニュートン流体は、人為的に粘弾性を持つように人工ポリマーを加えることによって作られてもよい。

【0024】

ここで、前記人工ポリマーは、緩和時間（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）が１ｍｓ（ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ）以上の水溶性ポリマーであることが好ましく、λ−ＤＮＡ、ペアレント・エッセンシャル・オイル（ＰＥＯ：Ｐａｒｅｎｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｏｉｌ）及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ＰｏｌｙＶｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）の中から選択された少なくとも一つからなってもよい。

【0025】

また、前記ニュートン流体は、前記目標粒子に対する慣性揚力が弾性揚力よりもさらに大きい流体からなってもよい。

【0026】

ここで、前記ニュートン流体は、目標粒子を含もうとするいずれの水溶液も使用可能である。水、グリセリン水溶液（Ａｑｕｅｏｕｓ Ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）が例示される。

【0027】

また、前記内で前記非ニュートン流体と前記ニュートン流体がそれぞれ占めるチャネル断面の面積比は約１：１であることが好ましい。それぞれの流体が占める断面の面積比率は流量比と粘性比によって決定されるのが一般的である。

【0028】

また、前記流体チャネルの大きさは前記目標粒子の有効径に比例して形成されることが好ましい。

【0029】

また、前記流体チャネルの断面積に対するアスペクト比（Ａｓｐｅｃｔ Ｒａｔｉｏ、縦／横）は１以上であってもよい。

【0030】

また、前記流体チャネルの長さは、前記非ニュートン流体の流速または弾性数に反比例して形成されることが好ましい。

【0031】

また、前記流体チャネルの長さは１Ｌ〜１０Ｌの範囲以内で形成され、ここで、前記流体チャネルの最小長さＬは、

【0032】

【数1】

【0033】

を満足することが好ましい。ここで、Ｕ_ｍａｘはチャネル内の最大流速であり、ｆ_Ｌは経験比例定数であり、ｗは流体チャネルの幅であり、ｄは目標粒子の有効径であり、μは流体の粘性であり、ρは流体の密度である。

【0034】

また、前記流体チャネルの最小長さＬ以内で慣性集束（Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ）が行われるための最小流量Ｑは、

【0035】

【数2】

【0036】

を満足することが好ましい。ここで、ｈは前記流体チャネルの高さであり、ｗは流体チャネルの幅であり、ｆ_Ｌは経験比例定数である。

【0037】

また、流体チップの内部で前記流体チャネルが直線状に貫通形成され、前記ニュートン流体の流入する第１入口及び前記非ニュートン流体の流入する第２入口とが所定の夾角を成して前記流体チャネルの先端部に互いに合岐されるように形成され、前記流体チャネルの後端部から、前記目標粒子の含まれた前記ニュートン流体を排出する第１出口及び前記非ニュートン流体を排出する第２出口とが所定の夾角を成して分岐されて形成できる。

【0038】

ここで、前記流体チップは、シリコーン系ポリマー（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ−ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）、プラスティック（Ｐｌａｓｔｉｃｓ）、ガラス（Ｇｌａｓｓ）、シリコン（Ｓｉ）及び金属（Ｍｅｔａｌ）の中から選択されるいずれか一つからなってもよい。

【0039】

また、前記シリコーン系ポリマー（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ−Ｂａｓｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ）は、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）からなってもよい。

【0040】

また、前記プラスティック（ｐｌａｓｔｉｃ）は、ＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌ Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＰ（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ＣＯＣ（ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｅｆｉｎ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）またはＰＥＴＥ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）、並びにポリ塩化ビニル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂及びアクリル樹脂の中から選択されたいずれかの一つ以上からなってもよい。

【0041】

また、前記第１及び第２流動抵抗は、流路の断面設計変更またはバルブ活用を介して、前記非ニュートン流体と前記ニュートン流体が分かれる流線の位置を調節することができる。

【発明の効果】

【0042】

上述した本発明の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法によれば、非ニュートン流体内に含まれている所望の目標粒子の有効径に合わせて、流体チップ内に形成された流体チャネル内に前記非ニュートン流体と共にニュートン流体を所定の流量比で流し、前記流体チャネル内に形成されたこれらの並行層流内で目標粒子に対する集束位置の変化によって、別個の装置と人力を使用することなく、より容易に非ニュートン流体内に含まれた微小粒子の中から所望の目標粒子のみをニュートン流体側へ分離し、或いは非ニュートン流体内に含まれた目標粒子を洗浄のためにニュートン流体側へ移動させることができるという効果を持つ。

【0043】

また、本発明の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法によれば、研究と臨床で使われる天然生体液（Ｎａｔｉｖｅ Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）はほとんどが非ニュートン流体であるから、実験のために、細胞／粒子を含む溶液の交替または別途の希釈を必要とすることなくそのまま目標粒子の分離及び洗浄が可能であり、もし非ニュートン流体である天然生体液（Ｎａｔｉｖｅ Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）の緩和時間（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）が足りなければ、これを高めることが可能な人工ポリマーをさらに混合さえすれば済むので、時間当たりの処理量が他の方法に比べて非常に高く、広い範囲の流量で高効率の作業能率を示すため、精巧なポンピング装置なしで単に注射器を押してポンピングする手作業のみで高効率の分離及び洗浄作業を行えるようにするという効果を持つ。

【0044】

また、本発明の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法によれば、流体チャネルが形成する流体チップを安価なプラスティックまたはポリマー材質を用いて使い捨て用に製作することができるため、これらの製造コストを下げ、低コストで様々な分野にわたって汎用的に使用することができるという効果を持つ。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】本発明の一実施例に係る非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄のための流体チャネルが形成された流体チップに対する３次元模式図である。

【図2】図１の流体チップの平面図である。

【図3】図２のII−II線に沿って切り取って見た流体チャネルの断面積内で非ニュートン流体または／及びニュートン流体が流動するときに微小粒子が受動的に集束される力の平衡点を説明するための概略図である。

【図4】粒子が流線を横切って移動する比率が非ニュートン流体内のＤＮＡ濃度によって異なることを示す蛍光顕微鏡写真である。

【図5】マイクロ流体チャネルの長さ分率（Ｌｅｎｇｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１６）に該当する粒子密度を持つ非ニュートン流体のサンプル流体内の粒子を分離した結果を示す蛍光顕微鏡合成写真である。

【図6】第１出口で捕集されたサンプル内の両粒子の相対的な個数比率をフローサイトメトリー技法で測定した結果を示すグラフである。

【図7】第２出口で捕集されたサンプル内の両粒子の相対的な個数比率をフローサイトメトリー技法で測定した結果を示すグラフである。

【図8】流体チャネル内の長さ分率（Ｌｅｎｇｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）及びチャネルレイノルズ数（Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｎｕｍｂｅｒ）の変化による粒子分離効率を測定して示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0046】

以下に添付図面を参照しながら、本発明の実施例について、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施し得るように詳細に説明するが、本発明は、様々な異なる形態で実現することができ、ここで説明する実施例に限定されない。図面において、本発明を明確に説明するために、説明と関係のない部分は省略し、明細書全体にわたって同一または類似の構成要素については同一の参照符号を付した。

【0047】

図１は本発明の一実施例に係る非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄のための流体チャネルが形成された流体チップに対する３次元模式図である。

【0048】

図１を参照すると、 本発明の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法は、流体チャネル１０内に非ニュートン流体とニュートン流体を並行層流状に流動させて、前記流体チャネルの内部に作用する力の平衡をなす粒子集束点の位置変化によって、前記非ニュートン流体内に含まれている微小粒子の中から目標粒子を前記ニュートン流体内へ分離または移動させるようにする。

【0049】

ここで、非ニュートン流体は、緩和時間（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）が十分に大きいポリマーを含有して前記目標粒子に対する弾性揚力が慣性揚力よりもさらに大きく、前記ポリマー含有濃度が高いため、前記目標粒子の流線を横切る移動速度を十分に有することを意味する。

【0050】

したがって、非ニュートン流体は、血液（ｂｌｏｏｄ）、血球が粉砕された血液（ＢＣ−ｌｙｓｅｄ ｂｌｏｏｄ）、血清（ｓｅｒｕｍ）またはリンパ（ｌｙｍｐｈ）を含む天然生体液からなるだけでなく、サンプル流体に人為的に粘弾性を持つように人工ポリマーを加えて作ることもできる。

【0051】

ここで、前記人工ポリマーは、緩和時間（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ）が１ｍｓ（ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ）以上の全種類の水溶性ポリマーからなることが好ましく、一例として、λ−ＤＮＡ、ペアレント・エッセンシャル・オイル（ＰＥＯ：Ｐａｒｅｎｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｏｉｌ）、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ＰｏｌｙＶｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）の中から選択されたいずれか一つ以上からなってもよい。

【0052】

ここで、前記ニュートン流体は、前記目標粒子に対する慣性揚力が弾性揚力よりもさらに大きい流体を意味し、目標粒子を含もうとするいずれの水溶液も使用可能である。水、グリセリン水溶液（Ａｑｕｅｏｕｓ Ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）が例示できる。

【0053】

しかし、非ニュートン流体とニュートン流体が必ずしも前述のものに限定されるのではなく、前述したように流体チャネル１０内に並行層状に流動させて、前記流体チャネル１０の内部に作用する力の平衡をなす粒子集束点の位置変化によって、前記非ニュートン流体内に含まれている目標粒子を前記ニュートン流体内へ分離または移動させることができるかぎりさらに様々な種類の流体が非ニュートン流体及びニュートン流体に適用できるのは当然のことである。

【0054】

一方、本実施例において、非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄を行うための流体チャネル１０が流体チップ１内に貫通形成され、流体チャネル１０の先端部には、前記ニュートン流体の流入する第１入口１１及び前記非ニュートン流体の流入する第２入口１２とが所定の夾角Θを成して互いに合岐されるように形成され、流体チャネル１０の後端部には、前記目標粒子が含まれている前記ニュートン流体を排出する第１出口及び前記非ニュートン流体を排出する第２出口とが所定の夾角を成して分岐されて形成されることを例示する。

【0055】

ここで、本実施例において、前記流体チップは、シリコーン系ポリマー（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ−Ｂａｓｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ）であるＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）からなることを例示する。

【0056】

しかし、本発明は、これに限定されず、前記流体チップが前述のシリコーン系ポリマー（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ−ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）以外にも、プラスティック（Ｐｌａｓｔｉｃｓ）、ガラス（Ｇｌａｓｓ）シリコン（Ｓｉ）及び金属（Ｍｅｔａｌ）の中から選択されたいずれか一つからなるのは当然のことである。

【0057】

ここで、前記プラスティック（ｐｌａｓｔｉｃ）は、ＰＭＭＡ（Ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌ Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＰ（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ＣＯＣ（ｃｙｃｌｉｃ ｏｌｅｆｉｎ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）またはＰＥＴＥ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）、並びにポリ塩化ビニル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂及びアクリル樹脂の中から選択されたいずれかの一つ以上にからなることもできる。

【0058】

また、本実施例において、前記流体チャネル１０は３０μｍの幅、５４μｍの高さ及び２０ｍｍの長さを有し、第１入口１１と第２入口１２、第１出口１５と第２出口１６はそれぞれ略６０°の夾度Θを成して互いに合岐及び分岐されることを例示する。

【0059】

このように、本実施例において、流体チャネル１０は、非ニュートン流体内に含まれているマイクロスケールの粒子または細胞などを含む微小粒子を分離及び移動させるのに適するようにマイクロスケールで形成されることを例示するが、本発明は必ずしもこれに限定されるものではなく、後述する微小粒子の分離及び移動メカニズムが適用できるかぎり様々なスケールで製作して使用することができるのは当然のことである。

【0060】

また、流体チャネル１０の大きさは、後述するように、非ニュートン流体内に含まれている目標粒子の有効直径だけでなく、非ニュートン流体の弾性数（Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ、ＥＩ ＥＩ）及び流量Ｑに応じて多様に変形させて適用することができ、第１入口１１と第２入口１２及び第１出口１５と第２出口１６との夾角Θをより多様に変形させて適用できるのは当然のことである。

【0061】

したがって、非ニュートン流体内に含まれている所望の目標粒子の有効径に合わせて、流体チップ内に形成されている流体チャネル１０内に前記非ニュートン流体と共ともにニュートン流体を所定の流量比で流し、前記流体チャネル内に形成されたこれらの並行層流内で目標粒子に対する集束位置の変化によって、別個の装置と人力を使用することなく、より容易に非ニュートン流体内に含まれている微小粒子の中から所望の目標粒子のみをニュートン流体側へ分離し、或いは非ニュートン流体内に含まれている目標粒子を洗浄のためにニュートン流体側へ移動させることができるようにする。

【0062】

以下、図２及び図３を参照して、本発明の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法についての理論的背景を説明する。

【0063】

図２は図１の流体チップの平面図、図３は図２のII−II線に沿って切り取って見た流体チャネルの断面積内で非ニュートン流体または／及びニュートン流体が流動するとき、微小粒子が受動的に集束される力の平衡点を説明するための概略図である。

【0064】

図２及び図３を参照して説明すると、流体チャネル内で弾性流体内に含まれている目標粒子に作用する力のバランスは、次のとおりである。

【0065】

ここで、Ｒｅはチャネル流動のレイノルズ数（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｎｕｍｂｅｒ）であり、Ｗ_ｉはチャネル流動のワイセンベルグ数（Ｗｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇ ｎｕｍｂｅｒ）である。

【0066】

図３の（ａ）に示すように、流体チャネル（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｈａｎｎｅｌ）が微小粒子を含む非ニュートン流体のみで満たされるならば（Ｒｅ＞０、Ｗ_ｉ＞０）、弾性揚力（Ｅｌａｓｔｉｃ Ｌｉｆｔ Ｆｏｒｃｅｓ；Ｆ_Ｅ）のみが主導的に微小粒子に影響を及ぼして流体チャネルの中央（幅方向中心）に微小粒子を移動させる（非特許文献３５）。

【0067】

図３の（ｂ）に示すように、流体チャネル（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｈａｎｎｅｌ）が微小粒子含有のニュートン流体のみで満たされるならば

【0068】

【数3】

【0069】

慣性揚力（Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｌｉｆｔ Ｆｏｒｃｅ；Ｆ_Ｌ）と壁面揚力（Ｗａｌｌ Ｌｉｆｔ Ｆｏｒｃｅ；Ｆ_Ｗ）が主導的に微小粒子に影響を及ぼし、面の広いチャネル壁の中央付近の両側に形成された二平衡点へ微小粒子を移動させる（非特許文献３４）。

【0070】

図３の（ｃ）に示すように、微小粒子を一緒に含有した非ニュートン流体とニュートン流体が並行層流を成して流体チャネル（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｈａｎｎｅｌ）の内部を流れるならば、微小粒子はすべてニュートン流体内に形成された唯一の力の平衡点へ移動するようになる。

【0071】

流体チャネルの入口から流体チャネルの出口まで続く微小粒子の漸進的な動きは、図２のように示すことができる。

【0072】

ここで、微小粒子の移動は、４つの力、すなわち、弾性揚力Ｆ_Ｅ、慣性揚力Ｆ_Ｌ、壁面揚力Ｆ_Ｗ及びストークス抗力Ｆ_Ｄの作用によって決定される。
前述したストークス抗力Ｆ_Ｄは、下記式４で表すことができる。

【0073】

【数4】

【0074】

ここで、η_ｓは流体の粘度であり、ｄは微小粒子の有効直径であり、Ｖ_ｐは微小粒子の側方移動速度である。

【0075】

したがって、第１入口及び第２入口を介して流体チャネルの先端部に入ったばかりの微小粒子は壁から離れる力を受けるが、これは弾性揚力Ｆ_Ｅと壁面揚力Ｆ_Ｗの和が慣性揚力Ｆ_Ｌとストークス抗力Ｆ_Ｄの和よりも大きいからである。

【0076】

微小粒子が両流体、すなわち、非ニュートン流体とニュートン流体の境界線上に到達したときには弾性揚力Ｆ_Ｅと慣性揚力Ｆ_Ｌが合力して目標粒子をさらにニュートン流体の内部に押し込む。

【0077】

最終的に、微小粒子は、慣性揚力Ｆ_Ｌが壁面揚力Ｆ_Ｗとバランスを取る平衡点に導かれてニュートン流体内に集束される。

【0078】

つまり、非ニュートン流体内で弾性揚力Ｆ_Ｅとストークス抗力Ｆ_Ｄが流線を横切る方向の粒子動きを主導するという仮定の下に、流動の平均速度Ｕ_ｆによって正規化された粒子の移動速度Ｖ_ｐは下記式５で表すことができる。

【0079】

【数5】

【0080】

ここで、β_ｐは経験比例定数であり、ｗは流体チャネルの幅であり、Ｗ_ｉは非ニュートン流体のワイセンベルグ数である。また、ｃはポリマー濃度であり、ｃ^＊は重複濃度である。

【0081】

したがって、非ニュートン流体からニュートン流体側への目標粒子の分離及び移動を成功させるには、前述したように、非ニュートン流体内に含まれているポリマーの緩和時間が一定の大きさ、すなわち、前述したように１ｍｓ（ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ）以上でなければならず、ポリマーの濃度も十分に高くなければならない。これは図４に示した下記実験例１の実験結果によって立証できる。

【実施例】

【0082】

実験例１
実験例１では、粒子が流線を横切って移動する比率が非ニュートン流体内に含まれているＤＮＡ濃度によって異なることを示すための実験を行った。

【0083】

図４は粒子が流線を横切って移動する比率が非ニュートン流体内に含まれているＤＮＡ濃度によって異なることを示す蛍光顕微鏡写真である。

【0084】

図４を参照すると、微細粒子を含有した非ニュートン流体（Ａｑｕｅｏｕｓ λ−ＤＮＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とニュートン流体（Ａｑｕｅｏｕｓ Ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）がそれぞれ第１入口１１及び第２入口１２を介して１：１の流量比をもって流体チャネル１０（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｈａｎｎｅｌ）内に並行層状に流動させる（８．３μＬ／ｍｉｎ ｆｏｒ ｉ−ｖ、６６．７μＬ／ｍｉｎ ｆｏｒ vi）。

【0085】

このとき、微細粒子の移送率（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｒａｔｅ）は、図４のｉ乃至viに示すように、非ニュートン流体内のλ−ＤＮＡの濃度が高くなるほど高くなることが分かる。

【0086】

このような微細粒子の分離または移送メカニズムは、サイズに応じた粒子の活動的分離（ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）に応用できる。
非ニュートン流体の流動内に属した粒子の流線を横切る方向への移動速度は有効直径の二乗に比例する（式５参照）。

【0087】

したがって、有効直径の大きい微細粒子は、小さな微細粒子よりも流線方向に沿って同じ距離を移動する間に一層速くチャネルの中央部分に移動することになり、これと類似に、有効直径の大きい微細粒子は、ニュートン流体の流動内で小さな微細粒子よりも遥かに速く唯一の平衡集束点へ移動することになる。なぜなら、この場合、移動速度は微細粒子の有効直径の三乗に比例するからである（非特許文献３６）。

【0088】

一方、流体チャネ１０及び流動の設計条件は次のとおりである。慣性揚力及び壁面揚力（Ｉｎｅｒｔｉａｌ／ｗａｌｌ ｌｉｆｔ ｆｏｒｃｅｓ）が十分に発生して高効率の分離または洗浄を実現するには、粒子レイノルズ数（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｎｕｍｂｅｒ（Ｒ_ｐ＝Ｒｅ（ｄ／ｗ）^２＝ρＵｄ^２／μｗ）が１次数或いはそれ以上でなければならない。

【0089】

本実施例の場合、Ｒ_ｐは１．２〜１２の範囲に属することが好ましい。言い換えれば、微小粒子の大きさが小さくなるほど、流体チャネルの大きさも小さく設計されなければならず、流速は十分に速くなければならない。

【0090】

一方、Ｒ_ｐが１以下である場合、慣性揚力による効果は微々たるものである。しかし、非ニュートン流体の深い拡散（Ｉｎ−ｄｅｐｔｈ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）に起因した弾性揚力によって効果的な分離または洗浄が行われることになる。

【0091】

本実施例では、主にＲ_ｐが１以上である場合に高効率の分離または洗浄を行うが、Ｒ_ｐが１以下である場合の原理も含むことができるのは当然のことである。

【0092】

一方、流体チャネルのアスペクト比（高さ／幅）が１以上の値を持つことにより、流体チャネル内の集束点が２箇所に絞られなければならない。

【0093】

もし、流体チャネルのアスペクト比が１未満である場合、集束点の位置と数が変わるため、本発明で意図する、集束点が圧縮的変化を実現することができなくなる。

【0094】

非ニュートン流体とニュートン流体の流量比は、非ニュートン流体の流動が占める面積が十分に大きいため、２集束点のいずれか一つをなくす程度の範囲であれば十分である。両流動が占める面積比は流量比と粘性比によって大きく決定される。非ニュートン流体とニュートン流体の平均粘性がほぼ同じであれば、非ニュートン流体に対するニュートン流体の流量比が１：１〜１：２の範囲以内であることが高効率分離のために望ましい。

【0095】

ここで、非ニュートン流体とニュートン流体の平均粘度がほぼ同じであるという仮定の下に、非ニュートン流体に対するニュートン流体の流量比が１：１未満である場合、非ニュートン流体が占める面積が大きいため、目標粒子の集束位置とその他の粒子の位置との距離が狭くなって効率が減少するという欠点を持つ。一方、非ニュートン流体に対するニュートン流体の流量比が１：２を超える場合、非ニュートン流体が占める面積が小さくて所望の集束点の変化を十分に得ることができないため、効率の減少をもたらすおそれがあるという欠点を持つ。

【0096】

また、目標粒子が目標集束点に到達するための十分な時間を持つためには、流体チャネルは所定以上の長さをもって形成されなければならない。

【0097】

つまり、相対的に小さい不要な粒子が集束点に集まる時間を与えないためには、流体チャネルの長さが長すぎてもいけない。

【0098】

したがって、流体チャネルの長さは１Ｌ〜１０Ｌの範囲以内であることが好ましく、最小流体チャネル長さＬは下記式６によって求めることができる。

【0099】

【数6】

【0100】

ここで、Ｕ_ｍａｘはチャネル内の最大流速であり（〜１．５Ｕ、平均流速）、ｆ_Ｌは経験比例定数であり、チャネルアスペクト比（Ａｓｐｅｃｔ Ｒａｔｉｏ；高さ／幅）が０．５から２まで変わるときに０．０２〜０．０５の値を有することが知られている。本発明の場合、非ニュートン流体内の粒子の移動時間も必要なので、これよりもさらに長い流体チャネル長さ以上の長さが要求される。

【0101】

したがって、流体チャネルの長さが１Ｌ未満である場合、目標粒子の分離及び洗浄のための移動が円滑に行われなくなり、流体チャネルの長さが１０Ｌ超過である場合、目標粒子分離過程で目標粒子よりもさらに小さい微細粒子が無駄に分離されて回収率及び純度を低めるという欠点を持つ。

【0102】

一方、流体チャネルの長さＬ以内で慣性集束が行われるための最小流量は、下記式７によって求めることができる。

【0103】

【数7】

【0104】

非ニュートン流体流動の場合、慣性揚力を乗り越えて目標粒子をニュートン流体の流動内に移すためには、弾性揚力と慣性揚力の相手強さを代弁する弾性数（Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ、ＥＩ）が一定以上大きくならなければならない。ここで、弾性数（Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ、ＥＩ）は下記式８で表すことができる。

【0105】

【数8】

【0106】

式８は、粘性値が流動全域にわたって一定の値を持つときに有効である。しかし、非ニュートン流体は、ずり流動化（Ｓｈｅａｒ ｔｈｉｎｎｉｎｇ）またはずり粘稠化（Ｓｈｅａｒ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ）されるため、粘性値が一定ではない。よって、前記式８は参考程度のものである。

【0107】

本実施例において、粘性値をグリセリン水溶液（Ａｑｕｅｏｕｓ Ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に該当する１．８８ｃＰを使用したとき、ＥＩは約４００程度に計算される。

【0108】

実験例２
本実験例２では、非ニュートン流体内に含まれている直径９．９μｍのポリスチレン（ＰＳ；Ｐｏｌｙｄｓｔｙｒｅｎｅ）マイクロ粒子（球状）を、同じ流体内の直径２．０μｍの粒子から分離してニュートン流体内に移す実験を行った。

【0109】

ここで、ＰＤＭＳ−ｇｌａｓｓ材質からなる流体チップ１は、ＳＵ−８ Ｒｅｐｌｉｃａ Ｍｏｌｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌによる既存のソフトリソグラフィー（Ｓｏｆｔ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）方式で製作できる。

【0110】

ここで、前述したＰＤＭＳ流体チップ１の製造過程は、まず、ＰＤＭＳ Ｂａｓｅ（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４Ａ、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＩ、ＵＳＡ）と硬化剤（Ｃｕｒｉｎｇ Ａｇｅｎｔ；Ｓｙｌｇａｒｄ １８４Ｂ、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＩ、ＵＳＡ）を１０：１の比率で混合した後、ＳＵ−８モールドに注ぎ、９５℃のオーブンで２時間以上固める。

【0111】

このとき、ＰＤＭＳ流体チップ１内に流体流動のための流体チャネル１０は、前述したように、閉鎖水路（Ｃｌｏｓｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌ）からなるようにする。よって、流体チャネル１０の底面になるスライドガラス（図示せず）を用意する。酸素プラズマ処理（Ｏｘｙｇｅｎ Ｐｌａｓｍａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を介して流体チャネルとガラスを付ける。

【0112】

図５は流体チャネル１０の長さ分数（Ｌｅｎｇｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１６）に該当する粒子密度を持つ非ニュートン流体サンプルの流動内から目標粒子を分離した結果を示す蛍光顕微鏡合成写真であり、図６は第１出口１５で捕集されたサンプル内の両粒子の相対的な個数比率をフローサイトメトリー技法で測定した結果を示すグラフであり、図７は第２出口１６で捕集されたサンプル内の両粒子の相対的な個数比率をフローサイトメトリー技法で測定した結果を示すグラフである。

【0113】

図５の蛍光顕微鏡写真はマイクロ流体チャネル１０内の流動を示す。λ−ＤＮＡをニュートン流体に溶かして作った非ニュートン流体は、９．９μｍの緑色蛍光粒子と２．０μｍの赤色蛍光粒子を含んだ状態で入口に流入する。ニュートン流体（Ａｑｕｅｏｕｓ Ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は別の入口に流入する。ここで、流量はそれぞれ４０μＬ／ｍｉｎと８０μＬ／ｍｉｎである。

【0114】

前述した原理に従って、９．９μｍの緑色蛍光粒子は２．０μｍの赤色蛍光粒子よりも遥かに速い速度で流線を横切ってニュートン流体流動内の平衡集束点へ移動する。

【0115】

第１出口１５及び第２出口１６を介して抜け出す両流体の流動は、出口圧力比率の調節のためのクランプタイプのバルブを介して流動比率が調節されることにより最大効率を持つように制御することができる。

【0116】

このように、前記第１出口及び第２出口の流動抵抗は、流路の断面設計変更またはバルブ活用を介して、前記非ニュートン流体と前記ニュートン流体が分かれる流線の位置調節が可能である。

【0117】

ここで、緑色蛍光粒子は上方の第１出口（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、赤色蛍光粒子は下方の第２出口（Ｗａｓｔｅ）から出るように誘導された。

【0118】

前記第１及び第２出口で捕集された粒子の相互個数比はフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）方法を用いて測定した（図６及び図７）。

【0119】

ここで、目標粒子である緑色蛍光粒子の分離効率は回収率（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）９９．７％、純度（Ｐｕｒｉｔｙ）９７．５％と集計された。

【0120】

また、本実験例２では、非ニュートン流体サンプル内の目標粒子の密度を異ならせて実験を行った。流動内の目標粒子の密度は、下記式９のように長さ分数（Ｌｅｎｇｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎ；Ｌ_ｆ）で代弁できる：

【0121】

【数9】

【0122】

ここで、Ａは流体チャネルの断面積であり、Ｖ_ｆは粒子の容積率（Ｖｏｌｕｍｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）であり、Ｖ_ｓｐは単一粒子の平均体積であり、ｈはチャネルの高さである。長さ分数（Ｌｅｎｇｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎ；Ｌ_ｆ）は粒子がギッシリと単一流線内に集束されるときに有用に記述可能な用語であり、この場合、Ｌ_ｆ値は流体チャネル内で平均的にどれほど粒子が離隔距離を持つかに対する直観的な理解を提供することができる。

【0123】

図８は流体チャネル内の長さ分数（Ｌｅｎｇｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）及びチャネルレイノルズ数（Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｎｕｍｂｅｒ）の変化による粒子分離効率を測定して示すグラフである。

【0124】

ここで、図８の（ａ）は長さ分数（Ｌｅｎｇｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）が０．０１から０．１６まで変わる場合による回収率（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）と純度（Ｐｕｒｉｔｙ）を示し、図８の（ｂ）はチャネルレイノルズ数（Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｎｕｍｂｅｒ）が０．２８から２８まで変わる場合による回収率（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ）と純度（Ｐｕｒｉｔｙ）を示す。

【0125】

したがって、様々な範囲の長さ分数（Ｌｅｎｇｔｈ Ｆｒａｃｔｉｏｎ；L_f）に対する粒子分離効率の測定結果は、図８の（ａ）から分かることができる。

【0126】

本実施例の流体チャネルが形成された流体チップを介した目標粒子の分離または移動効率は、粒子の密度が増加しても低下しなかった。

【0127】

つまり、目標粒子の密度が最も高い場合（Ｌ_ｆ＝０．１６）の処理量は６７００ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓｅｃで計算されるが、これは通常の「Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ」（非特許文献３４）の１６倍に達し、最近開発された「Ａｃｏｕｓｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ」（非特許文献２６）に比べるとほぼ１３０００倍もの数値である。

【0128】

また、流量の変化に対する粒子分離効率の変化を調査した結果、高流量でだけでなく、極低流量の条件でも高効率で粒子が分離されることを図８の（ｂ）から分かる。

【0129】

但し、Ｒｅ＝０．２８の条件は、これまで説明した目標粒子の分離または移動メカニズムとは異なる。つまり、慣性揚力Ｆ_Ｌ及び壁面揚力Ｆ_Ｗが非常に微弱だからである。したがって、Ｒｅ＝０．２８の条件での成功は、非ニュートン流体内のλ−ＤＮＡがニュートン流体の奥深く拡散（Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）して非常にユニークな弾性揚力（Ｅｌａｓｔｉｃ Ｌｉｆｔ Ｆｏｒｃｅ）の分布をなすため、大きな粒子を遥かに速くニュートン流体側の壁に押し出したことを類推することができる。

【0130】

しかし、高流量の場合でのように、目標粒子の分離と集束を促進する慣性揚力の効果が微弱なので、分離効率は低かった。この結果に基づいて、流体チャネルが形成された装置の駆動のために、非常にタイトな駆動条件を一定に維持させることなく手で注射器をポンピングするだけでも高効率の分離が可能と分かる。

【0131】

したがって、本発明の非ニュートン流体とニュートン流体の並行層流を利用した微小粒子分離及び洗浄方法によれば、慣性揚力（Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｌｉｆｔ Ｆｏｒｃｅｓ）と弾性揚力（Ｅｌａｓｔｉｃ Ｌｉｆｔ Ｆｏｒｃｅｓ）を制御して、マイクロ粒子が流線を横切って体非ニュートン流体からニュートン流体へ移されるようにすることにより、研究と臨床で使われる血液、血清、リンパなどの天然生体液（Ｎａｔｉｖｅ Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）をそのまま受け入れて細胞などの粒子を直接分離することができるので、培地交換（Ｍｅｄｉｕｍ Ｅｘｃｈａｎｇｅ）またはサンプル希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を必要としなくなる。

【0132】

また、高粒子密度のサンプルを高流量条件で取り扱うため、処理量が非常に大きい。時間あたり処理する粒子の数を見ると、通常の「Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ」（非特許文献３４）よりも１６倍大きく、最近開発された「Ａｃｏｕｓｔｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ」（非特許文献２６）よりも１３０００倍も大きい。それにも拘らず、回収率（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）９９％と純度（Ｐｕｒｉｔｙ）９７％以上の分離または移動効率を持つ。

【0133】

また、本発明は、２桁倍数（Ｔｗｏ Ｏｒｄｅｒｓ Ｏｆ Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）を行き来する広い流量範囲で効果的に作動するため、従来の遠心分離作業を少なくとも４回連続的に行わなければならないＰＢＭＣ分離の場合にしても、遠心分離作業を全く行うことなく、１回の手動注射器のポンピングのみでも高効率で白血球を血液から分離することができるようにして、手作業だけで高効率の分離及び洗浄作業を可能にする。

【0134】

以上、本発明の好適な実施例について説明したが、本発明は、これに限定されるものではなく、特許請求の範囲、発明の詳細な説明及び添付図面の範囲内で様々に変形または変更して実施することが可能であり、それらも本発明の範囲に属するのは当然のことである。

【符号の説明】

【0135】

１ 流体チップ
１０ 流体チャネル
１１ 第１入口
１２ 第２入口
１５ 第１出口
１６ 第２出口

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】