特許 6338900 Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6338900

(24)【登録日】2018年5月18日

(45)【発行日】2018年6月6日

(54)【発明の名称】Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20180528BHJP

   C12P 7/06 20060101ALI20180528BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20180528BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/19ZNA

   C12P7/06

   !C12N15/00 A

【請求項の数】4

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2014-57028(P2014-57028)

(22)【出願日】2014年3月19日

(65)【公開番号】特開2015-177765(P2015-177765A)

(43)【公開日】2015年10月8日

【審査請求日】2016年8月30日

(73)【特許権者】

【識別番号】000003207

【氏名又は名称】トヨタ自動車株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】000003609

【氏名又は名称】株式会社豊田中央研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】304020177

【氏名又は名称】国立大学法人山口大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000004444

【氏名又は名称】ＪＸＴＧエネルギー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100169579

【弁理士】

【氏名又は名称】村林 望

(72)【発明者】

【氏名】上村 毅

(72)【発明者】

【氏名】牟田口 梢栄

(72)【発明者】

【氏名】赤田 倫治

(72)【発明者】

【氏名】星田 尚司

(72)【発明者】

【氏名】志佐 倫子

(72)【発明者】

【氏名】徳弘 健郎

(72)【発明者】

【氏名】片平 悟史

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−２１０１６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−０２１９４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−０３０３６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Microbiology, 1998, Vol.144, p.3437-3446

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する遺伝子を減弱化した変異体酵母であって、前記変異体酵母がクルイベロマイセス(Kluyveromyces)属に属する酵母であり、前記遺伝子が、ALD2遺伝子及びALD2-2遺伝子並びにこれらの遺伝子に機能的に等価な遺伝子から成る群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子であり、
(a)前記ALD2遺伝子又はその機能的に等価な遺伝子が、配列番号２記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号２記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、
(b)前記ALD2-2遺伝子又はその機能的に等価な遺伝子が、配列番号４記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号４記載のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、
前記変異体酵母。

【請求項2】

上記クルイベロマイセス属に属する酵母は、クルイベロマイセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)であることを特徴とする、請求項１記載の変異体酵母。

【請求項3】

請求項１又は２記載の変異体酵母をキシロース含有培地にて培養する工程と、
その後、培地よりエタノールを回収する工程と、
を含む、エタノールの製造方法。

【請求項4】

上記培養する工程を、上記変異体酵母とリグノセルロースを含むバイオマスと糖化酵素とを含む反応系で実施することを特徴とする、請求項３記載のエタノールの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Kluyveromyces属酵母を利用した変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

リグノセルロースを含むバイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。リグノセルロースを含むバイオマスには、木質系バイオマス及び草本系バイオマスが含まれる。木質系バイオマスなどのリグノセルロースを含むバイオマスは、主としてセルロース、ヘミセルロース及びリグニンから構成されている。リグノセルロースを含むバイオマスからエタノール等液体燃料を製造するためには、セルロースやヘミセルロースを構成単糖にまで加水分解(糖化)し、発酵によって単糖をエタノールに変換する。セルロースはグルコースから構成され、ヘミセルロースは主としてアラビノースとキシロースから構成されている。従って、リグノセルロースを含むバイオマスを利用してエタノールを製造する際には、グルコースのみではなくキシロースも発酵の基質として有効に利用されることが望ましい。

【0003】

また、リグノセルロースを含むバイオマスからエタノールを製造する場合、上述した糖化反応と発酵反応とを同時に(各反応工程を区別することなく)行うことができれば製造コストの低減に繋がる。これを同時糖化発酵方法と称する。同時糖化発酵には、糖化酵素の反応温度領域(約40℃以上)で発酵が可能な耐熱性を有し、基質としてグルコースのみでなく5炭糖のキシロースを利用できる微生物が必要となる。

【0004】

耐熱性を有する酵母としては、Kluyveromyces marxianus等のKluyveromyces属酵母が知られている。このKluyveromyces属酵母は、キシロースを利用してエタノール発酵を行うことができるが、その収率は不十分であった。

【0005】

一方、特許文献１は、Kluyveromyces属酵母におけるアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(ADH1遺伝子又はADH4遺伝子)を減弱化することで当該酵母におけるキシロースからのエタノール収率が大幅に向上したことを開示する。また、特許文献２は、Kluyveromyces属酵母におけるトリオースホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子(TDH1遺伝子又はTDH2遺伝子)を減弱化することで当該酵母におけるキシロースからのエタノール収率が大幅に向上したことを開示する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開2012-210169号公報

【特許文献2】特開2013-21947号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上述したように、Kluyveromyces属酵母は、キシロース資化性を有し、且つ耐熱性を有するため、上述した同時糖化発酵法等に有用な微生物として大きく期待されている。しかしながら、Kluyveromyces属酵母についてはキシロースからのエタノール収率が非常に悪い。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、キシロースからのエタノール収率を向上するように改変されたKluyveromyces属に属する変異体酵母、及び当該変異体酵母を用いたエタノールの製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、Kluyveromyces属酵母において、キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する特定の遺伝子を減弱化することで当該酵母におけるキシロースからのエタノール収率が大幅に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。

【0009】

（１）Kluyveromyces属に属する酵母における、キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する遺伝子を減弱化した変異体酵母。
（２）上記Kluyveromyces属に属する酵母は、Kluyveromyces marxianusであることを特徴とする、（１）記載の変異体酵母。
（３）上記遺伝子が、Kluyveromyces marxianus由来ALD2遺伝子、ALD2-2遺伝子、ALD5遺伝子、ALD6遺伝子及びPDA1遺伝子並びにこれらの遺伝子に機能的に等価な遺伝子から成る群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子であることを特徴とする、（１）又は（２）記載の変異体酵母。
（４）上記ALD2遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、（３）記載の変異体酵母。
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c) 配列番号２のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（５）上記ALD2-2遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、（３）記載の変異体酵母。
(a) 配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c) 配列番号４のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（６）上記ALD5遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、（３）記載の変異体酵母。
(a) 配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号６のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c) 配列番号６のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（７）上記ALD6遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、（３）記載の変異体酵母。
(a) 配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号８のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
(c) 配列番号８のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含み、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（８）上記PDA1遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母に由来し、以下(a)〜(c)いずれかのタンパク質をコードすることを特徴とする、（３）記載の変異体酵母。
(a) 配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号１０のアミノ酸配列に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニットタンパク質
(c) 配列番号１０のアミノ酸配列に対して1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入したアミノ酸配列を含むピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニットタンパク質
（９）（１）〜（８）のいずれか１記載の変異体酵母をキシロース含有培地にて培養する工程と、その後、培地よりエタノールを回収する工程とを含む、エタノールの製造方法。
（１０）上記培養する工程を、上記変異体酵母とリグノセルロースを含むバイオマスと糖化酵素とを含む反応系で実施することを特徴とする、（９）記載のエタノールの製造方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明に係る変異体酵母は、キシロースからのエタノール収率が大幅に向上している。従って、本発明に係る変異体酵母は、例えば、木質系バイオマス等のリグノセルロースを含むバイオマスに由来するキシロースを含む培地において、高収率にエタノールを製造することができる。

【0011】

本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロースからのエタノール収率が大幅に向上した変異体酵母を利用することで、エタノール製造効率を大幅に向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Kluyveromyces属に属する酵母における、キシロースからのエタノールへの代謝経路を含む代謝経路の模式図である。

【図2】キシロース含有培地において、各遺伝子破壊株を培養した際のエタノール収率(野生株に対する相対値)を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明に係る変異体酵母は、Kluyveromyces属酵母におけるキシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する特定の遺伝子を減弱化したものであり、キシロースからのエタノール収率が向上した特徴を有している。

【0014】

ここで、Kluyveromyces属酵母とは、K. aestuarii、K. africanus、K. bacillisporus、K. blattae、K. dobzhanskii、K. hubeiensis、K. lactis、K. lodderae、K. marxianus、K. nonfermentans、K. piceae、K. sinensis、K. thermotolerans、K. waltii、K. wickerhamii及びK. yarrowii等の酵母を含む意味である。すなわち、本発明に係る変異体酵母は、これらの具体的なKluyveromyces属酵母及びその変異体に対して、キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する特定の遺伝子を減弱化することで作製することができる。Kluyveromyces属酵母としては、特に、耐熱性酵母として知られているKluyveromyces marxianusを使用することが好ましい。Kluyveromyces marxianusとしては、特に限定されず、寄託機関に分譲可能に保存された公知の株を使用することができるし、また公知の株から派生した変異株を使用することもできる。Kluyveromyces marxianusの公知株としては、Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株を挙げることができる。公知の株から派生した変異株とは、例えば、Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株に対して栄養要求性を付与するためにura3遺伝子やleu2遺伝子を破壊した株を例示することができる。

【0015】

本発明に係る変異体酵母は、キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する特定の遺伝子を減弱化したものである。ここで「遺伝子の減弱化」とは、当該遺伝子の発現量を低減すること、当該遺伝子がコードする酵素の活性を低減することの両者を含む意味である。例えば、キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する特定の遺伝子を破壊又は欠失させる方法、当該遺伝子の発現制御領域(プロモーター等)を破壊又は欠失させる方法、当該遺伝子に対するアンチセンスRNAを発現する方法等により、当該遺伝子の発現量を低減することができる。また、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰(Nonsense mediated decay, NMD)法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を適用し、当該遺伝子の発現量を低減することができる。さらに、キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する特定の遺伝子によりコードされるタンパク質(酵素)の阻害剤を作用させる手法等により、当該遺伝子がコードするタンパク質(酵素)の活性を低減することができる。なお、これらの方法を組み合わせて、キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する特定の遺伝子を減弱化しても良い。

【0016】

また、本発明に係る変異体酵母は、キシロースからのエタノール収率が向上した特徴を有している。言い換えると、本発明に係る変異体酵母は、キシロース代謝能が向上した特徴を有している。ここで、キシロース代謝能とは、培地に含まれるキシロースを代謝してアルコールとする発酵反応における効率を意味する。従って、キシロース代謝能の向上とは、当該発酵反応における反応効率を向上させることと同義となる。酵母におけるキシロース代謝能は、キシロース含有培地にて培養し、産生されたアルコールを定量することによって評価できる。また、酵母におけるキシロース代謝能は、例えば、培地に含まれるキシロースの取り込み速度（消費速度）を指標にして評価することもできる。キシロースの取り込み速度は、培養開始時における既知濃度のキシロースの減少量を経時的に測定することで算出することができる。

【0017】

本発明において、減弱化する遺伝子は、キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する特定の遺伝子である。換言すれば、当該遺伝子は、エタノール生産以外に代謝の流れを向かわせる遺伝子ということもできる。図１は、Kluyveromyces属に属する酵母における、キシロースからのエタノールへの代謝経路を含む代謝経路の模式図である。図１に示すように、当該遺伝子としては、例えばKluyveromyces marxianusに存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(ALD2遺伝子、ALD2-2遺伝子(ALD3遺伝子とも称される)、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子)、並びに、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット遺伝子(PDA1遺伝子)が挙げられる。

【0018】

Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母において減弱化する、キシロース利用時にエタノール生産以外の代謝に関与する特定の遺伝子は、上述のKluyveromyces marxianusに存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(ALD2遺伝子、ALD2-2遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子)及び/又はピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット遺伝子(PDA1遺伝子)に機能的に等価な遺伝子である。

【0019】

Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母において、Kluyveromyces marxianus由来の遺伝子に機能的に等価な遺伝子は、従来公知の方法により同定することができる。例えば、先ず、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母においてアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を特定する。そして、これら遺伝子がコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼのなかから、Kluyveromyces marxianus由来の遺伝子がコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列に対して最も配列同一性が高いアミノ酸配列を有するものを特定する。このように特定したアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、Kluyveromyces marxianus由来の遺伝子と機能的に等価な遺伝子であると特定できる。

【0020】

また、例えば、先ず、Kluyveromyces marxianus以外のKluyveromyces属酵母においてピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット遺伝子を特定する。そして、これら遺伝子がコードするピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニットのなかから、Kluyveromyces marxianus由来の遺伝子がコードするピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニットのアミノ酸配列に対して最も配列同一性が高いアミノ酸配列を有するものを特定する。このように特定したピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット遺伝子は、Kluyveromyces marxianus由来の遺伝子と機能的に等価な遺伝子であると特定できる。ここで、配列同一性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。

【0021】

ここで、Kluyveromyces marxianus由来のALD2遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。Kluyveromyces marxianus由来のALD2-2遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。Kluyveromyces marxianus由来のALD5遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５及び６に示す。Kluyveromyces marxianus由来のALD6遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７及び８に示す。Kluyveromyces marxianus由来のPDA1遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニットのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。

【0022】

なお、Kluyveromyces marxianusに存在する、これら遺伝子は、以上の具体的な塩基配列及びアミノ酸配列に限定されるものではない。すなわち、各アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性(すなわち、アセトアルデヒドを酢酸に分解する活性)を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ配列番号２、４、６及び８に示すアミノ酸配列に対して80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするものも含まれる。同様に、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット(すなわち、ピルビン酸をアセチル-CoAに変換するピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のE1αサブユニット)をコードする限り、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするものも含まれる。ここで、配列同一性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。

【0023】

また、各アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ配列番号２、４、６及び８に示すアミノ酸配列に対して1又は複数個(例えば2〜35個、好ましくは2〜30個、より好ましくは2〜20個、更に好ましくは2〜10個)のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするものも含まれる。同様に、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニットをコードする限り、配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して1又は複数個(例えば2〜35個、好ましくは2〜30個、より好ましくは2〜20個、更に好ましくは2〜10個)のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするものも含まれる。

【0024】

さらに、各アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、それぞれ配列番号１、３、５及び７に示す塩基配列に相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチドの一部又は全部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。同様に、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニットをコードする限り、配列番号９に示す塩基配列に相補的な塩基配列から成るポリヌクレオチドの一部又は全部に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、90％程度、好ましくは95％、更に好ましくは98％の同一性を有する一対のポリヌクレオチドが特異的なハイブリダイズを形成する条件(温度条件、塩濃度条件)を意味する。

【0025】

＜エタノール製造＞
以上で説明した変異体酵母を利用することで、キシロース等の糖を基質としたエタノール発酵を行うことができる。特に、上述した本発明に係る変異体酵母は、優れたキシロース代謝能、すなわちキシロースからのエタノール収率が優れているため、キシロース含有培地を利用したエタノール発酵に好適である。キシロース含有培地とは、Kluyveromyces属酵母が生育しうる培地であってエタノール合成の基質となる糖成分として少なくともキシロースを含有する培地を意味する。なお、キシロース含有培地は、キシロース以外の糖成分、例えばグルコースを含有していても良い。

【0026】

キシロース含有培地は、特に限定されないが、SD培地、YPD培地、YPAD培地、YM培地及びYeast Nitrogen Baseを含む各種合成培地にキシロースを添加するか、これら公知の培地に含まれる糖成分をキシロースに代替することで調製することができる。

【0027】

また、木質系バイオマスや草本系バイオマスといったリグノセルロースを含むバイオマスからキシロース含有培地を調製しても良い。すなわち、リグノセルロースを含むバイオマスに含まれるセルロースやヘミセルロースを糖化処理し、得られた処理物をキシロース含有培地として使用することもできる。糖化処理としては、特に限定されず従来公知の手法をなんら限定されることなく利用することができる。糖化方法としては、例えば、希硫酸又は濃硫酸を利用する硫酸法、セルラーゼやヘミセルラーゼを利用する酵素法等を挙げることができる。また、糖化処理に先立って、木質系バイオマスや草本系バイオマスに対して従来公知の前処理を施しても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、木質系バイオマスや草本系バイオマスの粉砕処理、イオン液体やアルカリ溶液に浸漬して構造を緩和する処理、高温の水で蒸煮する水熱処理、アンモニアによる処理等を挙げることができる。

【0028】

特に、Kluyveromyces marxianusから作製した変異体酵母では、特に耐熱性に優れるため、例えば40℃以上、好ましくは35〜48℃、より好ましくは40〜42℃といった比較的に高温度でエタノール発酵を行うことができる。このような温度領域は、セルラーゼやヘミセルラーゼといった糖化酵素も活性を示す温度領域である。したがって、当該変異体酵母は、糖化酵素を利用した所謂、同時糖化発酵に好適である。ここで同時糖化発酵とは、糖化酵素による木質系バイオマスの糖化処理と、キシロースからのエタノール発酵処理とを同一反応系で実施する処理を意味する。より具体的には、木質系バイオマスと糖化酵素と変異体酵母とを含む溶液を例えば40℃といった温度条件にてインキュベートする。これにより、木質系バイオマスの糖化と、糖化によって得られたキシロースやグルコースからのエタノール発酵が進行し、エタノールを製造することができる。また、このとき溶液を攪拌しても良いし、振とうしてもよい。

【0029】

また、培地に含まれるキシロース等の炭素源から発酵生産されたエタノールを回収する際には、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、変異体酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。

【実施例】

【0030】

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

【0031】

〔実施例１〕
本実施例では、Kluyveromyces属酵母としてKluyveromyces marxianusを使用し、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(ALD2遺伝子、ALD2-2(ALD3)遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子)並びにピルビン酸デヒドロゲナーゼE1αサブユニット遺伝子(PDA1遺伝子)の各遺伝子の破壊株を作製し、キシロースからのエタノール収率を比較検討した。

【0032】

＜株の作製＞
接合、胞子形成によるura3- leu2-変異株の作製
Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042株のura3-株であるRAK3605株(Nonklang, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 74: 7514-7521, 2008)を基準株として使用した。K. marxianus DMKU3-1042株由来の栄養要求性変異株は、低頻度で2倍体になることを明らかにしている。紫外線変異により、多重栄養要求性変異株を取得することは可能であるが、その結果、染色体DNAに変異が入る確率が上昇する。より安定な株を作製するために、接合と胞子形成により、2倍体から簡単に多重栄養要求性株を作製する（Yarimizu, T. et al., Yeast 30: 485-500, 2013）ために以下の株を作製した。

【0033】

先ず、RAK3605株に紫外線照射し、lys-株(RAK3896株:ura3- lys2-)、ade-株(RAK3919株:ura3- ade2-)及びleu-株(RAK3966株:ura3- leu2-)を取得した。これらの株にSaccharomyces cerevisiaeのURA3をランダムに染色体へ形質転換した株、RAK4088株（ura3- leu2- ScURA3）、RAK4152株(ura3- ade2- ScURA3)、RAK4153株(ura3- lys2- ScURA3)を作製した。RAK4152とRAK4153株をYPD培地(1% w/v Yeast extract, 2% w/v peptone, 2% glucose, 2% w/v agar)上で混ざるようにストリークし、MM培地（0.17% w/v yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate, 0.5% w/v ammonium sulfate, 2% w/v glucose, 2% w/v agar）へレプリカした。MM培地で生えた株、RAK4154株(ura3-/ura3- ade2-/ADE2, lys2-/LYS2 ScURA3/ScURA3)をS. cerevisiaeで使用されるSPO培地(1% w/v potassium acetate, 0.1% w/v yeast extract, 0.05% w/v glucose)に植菌し、胞子形成させた。

【0034】

作製した胞子を分離し、ura- lys- ade-の3重栄養要求性株を取得するために、-A培地(MM+uracil, tryptophan, histidine HCl, methionine, leucine, lysine HCl), -K培地(MM+ uracil, tryptophan, histidine HCl, methionine, leucine, adenine hemisulfate), -U培地(MM+ tryptophan, histidine HCl, methionine, leucine, lysine HCl, adenine hemisulfate)へレプリカし、3つの培地で増殖できない株をRAK4154株の胞子から3株取得することに成功した。その株をRAK4155株(ura3- lys2- ade2-)と命名した。同様の方法でRAK4088株とRAK4155株を接合させ、RAK4156株(ura3-/ura3- lys2-/LYS2 ade2-/ADE2 leu2-/LEU2 ScURA3/ScURA3)を作製した。この株を胞子形成させ、RAK4174株(leu2- ura3-)株を作製した。

【0035】

Ku70破壊株の作製
K. marxianusは非相同末端結合修復が高頻度で起こることから、S. cerevisiaeのように相同組換え修復を利用して遺伝子破壊を容易に行うことができない(Nonklang, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 74: 7514-7521, 2008)。そこで、非相同末端結合修復に必須のKU70遺伝子を破壊することで相同組換えを高頻度に起こさせる株の作製を行った。RAK4174株からKU70を破壊したRAK4736株(ura3-1 leu2-2 ku70Δ::ScLEU2)を作製した(Abdel-Banat, B. M. et al., Yeast 27: 29-39, 2010)。

【0036】

Ku70破壊株をホスト株とした遺伝子破壊株の取得
使用したプライマーを以下の表１に示す。

【表1】

【0037】

Ku70破壊株をホスト株として形質転換を行う方法で遺伝子を破壊した。fragmentとして、URA3マーカーの両端に目的遺伝子(破壊遺伝子)のORF内の相同配列を持たせたDNA断片を作製し、形質転換に用いた。

【0038】

具体的には、S. cerevisiaeのBY4702株(MATa ade2Δ::hisG his3Δ200 leu2Δ0 lys2Δ0 met15Δ0 trp1Δ63, Brachmann, C. B. et al., Yeast 14: 115-132, 1998)の染色体DNAをテンプレートとして、9C-URA3-223及び3CG9-URA3+880cの2つのプライマーでKOD Plusを用いてPCRを行い、次いで、その産物をURA3テンプレート(50 ng/μl)とし、以下の表２のプライマーセットでURA3マーカーの両端に破壊遺伝子のORF内の相同配列を付けたDNA断片をPCRにより作製した。次いで、得られた各DNA断片を、RAK4736株へ形質転換し、相同組換えにより各破壊遺伝子を破壊した。

【0039】

【表2】

【0040】

当該形質転換に使用した培地は、YPD(1% yeast extract, 2% polypepton, 2% glucose)とウラシル欠損培地(0.17% yeast nitrogen base without amino acids and without ammonium sulfate, 0.5% ammonium sulfate, 2% glucose,及び必要なアミノ酸類)である。

【0041】

DNAの抽出は、細胞壁溶解酵素を用いた方法とコロニーPCRを行った。コロニーPCR法は、20 mM NaOHをPCRチューブに5μlいれ、そこに酵母コロニーの一部を混ぜ、100℃に10分間置いたのち15℃で冷却した。冷却後、水を15μl入れて調整した。

【0042】

PCRにはKOD Plus (TOYOBO)及びKOD FX Neo (TOYOBO)を使用した。KOD Plusは形質転換用のDNA Fragmentを作製するために、KOD FX NeoはコロニーPCRに利用した。PCR産物の濃度測定はInvitrogen Quant iT^TMdsDNA BRキットを用い，蛍光光度計(Invitrogen Quant iT^TM fluorometer)で測定した。

【0043】

酵母の形質転換は、以下のように行った。YPD液体培地3 mlに酵母を植えて28℃、150 rpmで18〜24時間振とう培養した。その酵母培養液1 mlとYPD液体培地9 mlを混合し、28℃、150 rpmで5時間振とう培養した。全量を15 mlチューブに移して8000 rpmで3分間遠心して上清を捨てた。その後、60 % ポリエチレングリコール3350 784μl、4 M 酢酸リチウム59μl、滅菌した脱イオン水157μlを混ぜた形質転換液200μlを、さきほど上清を捨てた15 mlチューブにいれてよく撹拌し、8000 rpmで3分間遠心して上清を捨てた。そして、形質転換液180μlを加えてよく撹拌した。この状態の細胞を81μl、キャリアDNA(salmon testes DNA, Sigma D-1626, 10 mg/ml) 10μl、PCRしたDNA断片3〜5μlを混ぜて42℃、30分間インキュベートした。その後、液体の選択培地を100μl加えて、選択培地プレート上にまいた。28℃のインキュベータで4〜5日培養した。

【0044】

このようにして、ALD2破壊株(RAK9791株：ura3-1 leu2-2 ku70Δ::ScLEU2 ald2Δ::ScURA3)、ALD2-2破壊株(RAK9793株：ura3-1 leu2-2 ku70Δ::ScLEU2 ald3Δ::ScURA3)、ALD5破壊株(RAK9795株：ura3-1 leu2-2 ku70Δ::ScLEU2 ald5Δ::ScURA3)、ALD6破壊株(RAK8838株：ura3-1 leu2-2 ku70Δ::ScLEU2 ald6Δ::ScURA3)、及びPDA1破壊株(RAK9912株：ura3-1 leu2-2 ku70Δ::ScLEU2 pda1Δ::ScURA3)を作製した。

【0045】

なお、各遺伝子破壊株における遺伝子破壊は、以下の表３に示すプライマーセットを使用して確認した。

【0046】

【表3】

【0047】

＜エタノール発酵試験＞
以上のように作製されたALD2破壊株、ALD2-2破壊株、ALD5破壊株、ALD6破壊株及びPDA1破壊株についてキシロースを利用したエタノール発酵試験を行った。

【0048】

前培養
YPX（キシロース20g/L）培地20mlを加えた50mlアシストチューブに上記破壊株を一白金耳植菌し、30℃、140rpmで6〜8時間振とう培養した。次に、その菌液2.5％を、YPX培地（キシロース:20g/L）200mlが入った500ml三角フラスコで、30℃、140rpm、一晩振とう培養した。培養後の酵母を遠心回収、滅菌水で3回洗浄し、OD600=30の酵母懸濁液を調製した。

【0049】

本培養
表４に示す条件で培養し、エタノール生産を確認した。初発の糖濃度は、キシロース20g/Lとした。

【表4】

【0050】

また、培地中のエタノール濃度は島津製作所社製のHPLC（検出器:RI）を用いて測定した。

【0051】

＜結果＞
糖成分としてキシロースを含有する培地にて上記破壊株を培養した際の「培地中のエタノール収率」を図２に示す。図２に示すように、各遺伝子破壊株では、野生株(DMKU3-1042株)と比較し、キシロースからのエタノール収率が1.8〜3.5倍に向上していた。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]